JPH07177874A

JPH07177874A - マイクロキャリア

Info

Publication number: JPH07177874A
Application number: JP5323988A
Authority: JP
Inventors: Masato Yamaguchi; 正人山口; Toshio Shimizu; 寿夫清水
Original assignee: Shimizu Chemical Corp; Kurita Water Industries Ltd
Current assignee: Shimizu Chemical Corp; Kurita Water Industries Ltd
Priority date: 1993-12-22
Filing date: 1993-12-22
Publication date: 1995-07-18

Abstract

(57)【要約】【目的】付着依存性動物細胞の効率的大量培養を可能
とするマイクロキャリアを提供する。【構成】グルコマンナンゲル又はその乾燥物を含んで
なるマイクロキャリア。【効果】柔らかく、弾力性があるため、攪拌による衝
撃で細胞やマイクロキャリア自身が損傷等を受けること
がない。生体適合性が良く、低毒性である。非特異的吸
着がなく、培地の血清成分の吸着によるロスがない。親
水性で、比重も水より少し大きいのみであるため、培養
時の攪拌速度は小さくて足りる。低ランニングコストに
て細胞の効率的培養が行える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はマイクロキャリアに係
り、特に、付着依存性動物細胞の効率的大量培養を可能
とするマイクロキャリアに関する。

【０００２】

【従来の技術】動物細胞大量培養技術は、従来、ワクチ
ン用ウイルスを増やすための手段として用いられてきた
が、動物細胞は、インターフェロン、リンフォカイン、
抗原、抗体、酵素、ホルモン、細胞増殖因子などを生産
しており、これらの中には学問的にも臨床的にも重要な
生理活性物質が含まれていることから、近年、これらの
生理活性物質を生産する手段として動物細胞大量培養技
術が注目を集めるようになった。従来、これらの生理活
性物質は、臓器又は血液からしか採ることができなかっ
たが、動物細胞培養技術の応用により効率的に生産する
ことが可能となった。

【０００３】動物細胞培養技術の一種として、動物細胞
培養担体としてのマイクロキャリアを用いる方法があ
る。マイクロキャリアは、壁付着性細胞の培養表面積を
増大する目的で開発され、現在、マイクロキャリアを用
いて大量培養が行われている。また、マイクロキャリア
を多孔質にすることにより、培養表面積を更に増大でき
ること、浮遊細胞も培養できること、三次元的培養が可
能になること、剪断力の影響が少ないことなどの長所が
得られることも報告されている。

【０００４】従来、マイクロキャリアとしては、多孔質
ガラス（ＣＰＧ）よりなるもの、或いは、各種合成品や
天然品、その他、陰イオン交換基を導入したものなどが
市販されている。

【０００５】なお、理想的なマイクロキャリアに要求さ
れる基本的な条件として、次のような条件が挙げられて
いる（Develop. Biol. Standard, 37, 143$147, 1977。
(vanWezelら））。

【０００６】マイクロキャリアの表面特性は細胞が
接着し、増殖できる程度に伸展すること。また、細胞が
均質に生育するためには、マイクロキャリアの表面は平
滑な外面であり、培養中のマイクロキャリアの全表面は
均一な特性を持つ必要がある。

【０００７】マイクロキャリアの比重は周りの培地
より多少重いこと。マイクロキャリアの比重が周りの培
地より多少重くないと、細胞と培地との分離が困難であ
る。同時にまた、穏やかな攪拌でマイクロキャリアが浮
遊状態を保てる程度に軽いこと。一般的な培養条件で
は、マイクロキャリアの最適な比重は１．０３０〜１．
０４５ｇ／ｍｌである。

【０００８】マイクロキャリアが全部均一に浮遊
し、どのマイクロキャリア上でもほぼ同じ時期に細胞が
飽和状態になるために、その粒子径の分布範囲が狭いこ
とが必要とされる。細胞が最もよく増殖するのは、マイ
クロキャリアの粒子径が培養液に湿潤した状態で１００
〜２３０μｍの範囲に分布しているときである。マイクロキャリアの光学特性は、普通の顕微鏡でマ
イクロキャリア上の細胞の連続的観察が行えるようなも
のである必要がある。また、日常的な細胞学的手法を使
えるものでなくてはならない。

【０００９】細胞のより良い生存、増殖のためだけ
でなく、細胞培養の生成物を獣医学や臨床医学の目的に
使用する場合のためにも、マイクロキャリアは毒性がな
いことが必要である。

【００１０】培養液を攪拌しても細胞がよく生育す
るように、マイクロキャリア素材は硬くないことが必要
である。即ち、攪拌中の培養液の中では、マイクロキャ
リア同志の衝突が起こっているが、この攪拌による衝突
でマイクロキャリアや細胞が損傷するのを防ぐために、
マイクロキャリアは弾力のある素材よりなることが望ま
しい。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従来のマイクロキャリ
アのうち、多孔質ガラス（ＣＰＧ）のように硬い素材よ
りなるマイクロキャリアでは、攪拌中、マイクロキャリ
ア同志の衝突による衝撃や攪拌の剪断力によって、マイ
クロキャリアが破損したり細胞が損傷を受けるなどの問
題がある。また、多孔質ガラスは比重が大きいために、
懸濁（浮遊）状態を保つために攪拌速度を上げなければ
ならず、細胞が付着し難く、付着した細胞が剥離し易い
といった欠点もある。

【００１２】一方、マイクロキャリアが合成品であって
も天然品であっても、一般に、官能基を導入するなどの
化学修飾が行われるが、この化学修飾の割合が多いと毒
性が現れ、多くの細胞が培養初期に死滅する。このた
め、増殖までの誘導期間が長い、細胞の回収率が低いな
どの欠点がある。

【００１３】また、特に、合成品のマイクロキャリア、
例えば、ポリスチレン型マイクロキャリアでは、組織培
養処理（コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン等の
処理）が施されることにより、培地成分の吸着が極めて
少なくなり、高純度細胞生産が可能となるという利点を
備えるが、このものは、マイナスに弱く荷電しているた
め、細胞（一般にマイナスに荷電している。）の付着速
度が遅いという欠点がある。また、この合成マイクロキ
ャリアについても、比重が大きいため、前述の多孔質ガ
ラスよりなるマイクロキャリアと同様、攪拌速度を上げ
る必要があることから、細胞が付着し難く、剥離し易い
という欠点がある。

【００１４】更に、陰イオン交換基を導入したマイクロ
キャリアとしては、セルロースに陰イオン交換基を導入
したものが市販されているが、このものは、比較的多種
類の培地成分を付着ないし吸着するため、高純度細胞を
得ることが難しいという欠点がある。例えば、培地に血
清を用いた場合、多くの血清成分（特にタンパク質）が
マイクロキャリアに吸着される。このため、医薬品目的
での細胞培養の場合には、吸着した培地を完全に除くた
めに、分離、精製工程が必要となる。なお、このような
問題を解決するために、マイクロキャリアの表面に陰イ
オン交換基を集中させた表面荷電型マイクロキャリアも
市販されているが、培地の吸着を完全に防止するもので
はない。

【００１５】なお、マイクロキャリアではなく、カラム
充填用の細胞培養支持体として、グルコマンナンにヒド
ロキシ・カルシウム・アパタイトを分散させた支持体が
開発されている（特開昭６１−２８２０７２号公報）。
この支持体は、比重が大きいことから、攪拌方式とする
ことができず、カラムに充填して通液型の培養方式を採
用する必要がある。しかしながら、カラム充填通液型で
は浮遊細胞には適用できない上に、培養液を循環する必
要があり、細胞の高集積培養ができないといった欠点が
ある。

【００１６】本発明は上記従来の問題点を解決し、前述
のマイクロキャリアの要求特性を満たし、動物細胞の効
率的大量培養を可能とするマイクロキャリアを提供する
ことを目的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明のマイクロキャリ
アは、グルコマンナンゲル又はその乾燥物を含んでなる
ことを特徴とする。

【００１８】以下に本発明を詳細に説明する。グルコマ
ンナンは、モル比約２：１のマンノースとグルコースと
から構成される多糖類の１種であって、種々の起源のも
のがある。本発明において、グルコマンナンの起源につ
いては特に制限はないが、コンニャクマンナンが好適で
ある。このコンニャクマンナンとしては、例えばこんに
ゃくの原料となる製粉を水に溶解し、アルコールなどで
精製することにより得られたものを用いても良いし、市
販品、例えばプロポール［清水化学（株）製、商品名］
などを用いても良い。コンニャクマンナンはこんにゃく
の主成分であって、毒性が全くなく安全性に優れる。

【００１９】本発明で用いるグルコマンナンの好ましい
分子量は５０万以上、より好ましくは１００万〜２００
万であるが、天然に得られるコンニャクマンナンは、通
常、分子量が１００万〜２００万の範囲にあるので、本
発明においては、天然品のコンニャクマンナンをそのま
ま用いることができる。

【００２０】本発明のマイクロキャリアは、一般に、こ
のような分子量を有する架橋グルコマンナンの粒子であ
って、具体的には次のような態様で使用される。

【００２１】(i) グルコマンナンゲル球状粒子。 (ii) グルコマンナンゲルにイオン交換基を導入した球
状粒子。 (iii) グルコマンナンゲルに生理活性物質を化学結合さ
せた球状粒子。 (iv) グルコマンナンゲルを真空乾燥して得られる不溶
性多孔体粒子。

【００２２】上記(i) 〜(iv)のような本発明のマイクロ
キャリアにおいて、細胞の増殖効率の面から、マイクロ
キャリアの粒径はマイクロキャリアが培地（培養液）に
湿潤した状態で１００〜１０００μｍ、特に１００〜３
００μｍであることが望ましい。

【００２３】また、架橋グルコマンナンの三次元網目構
造の網目（ポア）の大きさは、ＰＥＧ換算でＭｌｉｍ
１万〜１億、特に１０万〜１０００万であることが望ま
しい。

【００２４】なお、上記(i) 〜(iv)の態様のうち、(i)
のグルコマンナンゲル球状粒子はエタノール法等で十分
に精製されたグルコマンナンを原料として、泡形成用ゲ
ル粒（例えばゲル化した寒天、ゼラチン又はカラギーナ
ン、ポリビニルアルコールやバブル発生装置を用いるも
のであっても良い。）などと均一に混合し、その中に水
酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、リン酸三カリウ
ム、リン酸三ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウ
ムなどのアルカリを加えてゲル化することにより製造す
ることができる。

【００２５】ここで、泡形成用ゲル粒はグルコマンナン
溶液５０ｋｇに対して３５〜５５ｋｇの割合で使用され
る。また、アルカリとしてはグルコマンナンに対して４
〜９重量％となるように水２０００〜３０００ｍｌにア
ルカリを溶解した液を使用する。

【００２６】また、(ii)のグルコマンナンゲルにイオン
交換基を導入したものは、上記ゲル化工程後、化学修飾
することにより製造することができる。この場合、導入
されるイオン交換基としては、ＤＥＡＥ（ジエチルアミ
ノエチル）、ＱＡＥ（第４級アンモニウムエチル）、Ｐ
ＥＩ（ポリエチレンイミン）等の毒性の少ない陰イオン
交換基等が挙げられ、その導入量は、イオン交換容量で
０．５〜３．５ｍｅｑ／ｇ−ゲル、特に１〜２ｍｅｑ／
ｇ−ゲルであることが好ましい。

【００２７】また、(iii) のグルコマンナンゲルに生理
活性物質を結合させたものは、前記ゲル化工程後、スペ
ーサー等を用いて結合させることにより製造することが
できる。この場合、生理活性物質としてはコラーゲン、
ゼラチン、活性ペプチド等の細胞と親和性のある生理活
性物質が挙げられ、その結合量はグルコマンナンゲルに
対して０．１〜５重量％、特に０．２〜１重量％である
ことが好ましい。

【００２８】更に、(iv)の不溶性多孔体粒子は、前記ゲ
ル化により得られたグルコマンナンゲルを熱湯水中に入
れ、泡形成用ゲル粒などを除去した後、真空凍結乾燥機
又は真空乾燥機などを用いて乾燥し、適当な大きさに粉
砕することにより製造することができる。このようにし
て得られる粒子は、表面に結晶性の高い構造を有する不
溶性多孔体粒子である。

【００２９】本発明のマイクロキャリアを用いる細胞の
培養は、市販の培地を用いて常法に従って行うことがで
きる。

【００３０】

【作用】グルコマンナンゲル又はその乾燥物よりなるマ
イクロキャリアは、次のような特性を有し、細胞を低コ
ストで効率的にマイクロキャリア培養することができ
る。

【００３１】柔らかく、弾力性がある。生体適合性が良く、低毒性である。非特異的吸着がない。親水性である。比重は１．０１〜１．０５であり、
水より少し大きい程度である。均一特性である。一般的な顕微鏡でマイクロキャリア上の細胞の連続
的観察が可能である。一般的なマイクロキャリア培養手段を適用できる。

【００３２】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。

【００３３】実施例１エタノール沈殿法で得られた精製グルコマンナン（清水
化学（株）製：商品名「プロポール」，分子量１００万
〜２００万）５０ｋｇを、泡形成用ゲル粒としてゲル化
寒天４０ｋｇと均一に混合し、その中にグルコマンナン
に対して７％となるようにアルカリを溶解した水溶液２
５００ｍｌを加えてゲル化した。その後、熱湯水中に入
れて泡形成用ゲル粒を除去し、真空凍結乾燥機で乾燥さ
せて、乾燥物を平均粒径１６８０μｍ（１０メッシュ）
に粉砕した。得られた粒子はＭｌｉｍが約１０００万
（ＰＥＧ換算）の不溶性多孔体粒子（以下「ＧＭ粒子」
と称す。）であった。

【００３４】この不溶性多孔体粒子を用いて、ヒト子宮
頸部癌由来Hela細胞，アクリカミドリゲル腎由来Vero細
胞の培養を行った。培養条件は両細胞とも全く同一と
し、各々、次の手順で行った。

【００３５】(a) ＧＭ粒子を乾燥重量で７．５ｇ計
り、内容積５０ｍｌのFalconチューブに入れた。その
後、０．１規定塩酸水溶液を４０ｍｌ加え、室温で３０
分間放置して膨潤させた。次に、ＧＭ粒子を大量の超純
水で洗浄し、その後リン酸緩衝液（トリスリン酸塩）で
洗浄した。

【００３６】(b) チューブ内のＧＭ粒子を１２１℃で
２０分間オートクレーブ滅菌処理した後、最小必須培地
（Minimum Essential Medium, MEM)で２回洗浄し、次い
で、１０重量％牛胎児血清（Fetal Calf Serum, FCS)含
有最小必須培地（ＭＥＭ）で懸濁させた。

【００３７】(c) ベルコ社製２５０ｍｌ容量スピナー
フラスコに、１０重量％ＦＣＳ含有ＭＥＭ懸濁ＧＭ粒子
を入れ、接種液を１００ｍｌ添加して、５×１０⁵ cell
s／ｍｌとした。

【００３８】(d) ３７℃のＣＯ₂ インキュベーター内
で培養を開始し、１２ｒｐｍで４時間攪拌を行った。次
に、３０ｒｐｍに攪拌速度を上げて７２時間処理した
後、１０重量％ＦＣＳ含有ＭＥＭを交換した。

【００３９】１６８時間（１週間）後、細胞数を測定し
た結果、いずれの場合も５０〜１００倍の増殖が確認さ
れた。

【００４０】本実施例で用いたＧＭ粒子は、グルコマン
ナン１００％の素材よりなるものであり、全く荷電がな
いものである。しかし、細胞の適合性に優れた素材であ
るため、上記の如く、５０〜１００倍の増殖が達成され
た。

【００４１】この結果から、グルコマンナンゲル球状粒
子に更に第３級アミノ基等のイオン交換基を導入したも
のや、コラーゲン等の細胞との親和性が高い生理活性物
質を結合したものを用いた場合には、より一層高い増殖
倍率を達成できることが明らかである。

【００４２】

【発明の効果】以上詳述した通り、本発明のマイクロキ
ャリアは、マイクロキャリアとしての要求特性をすべて
満たすものであり、本発明のマイクロキャリアによれば
次のような効果が達成される。

【００４３】柔らかく、弾力性があるため、攪拌に
よる衝撃で細胞やマイクロキャリア自身が損傷等を受け
ることがない。このため、攪拌により細胞を効率的に増
殖させることができる。

【００４４】生体適合性が良く、低毒性であるた
め、細胞の死滅等の問題がない。このため、短期間で高
い回収率にて細胞の効率的な培養を行えると共に、増殖
細胞を獣医学や臨床医学等の目的にも有効に使用するこ
とができる。

【００４５】非特異的吸着がなく、培地の血清成分
の吸着の問題がない。このため、血清成分のロスが少な
く、また、後工程の分離、精製工程を省略ないし軽減で
きる。

【００４６】親水性で、比重も水より少し大きいの
みであるため、細胞と培地との分離は容易に行える上
に、培養時の攪拌速度は小さくて足りる。このため、攪
拌に要するエネルギーが低減される。

【００４７】上記〜より、低ランニングコスト
にて細胞の効率的培養が可能とされる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グルコマンナンゲル又はその乾燥物を含
んでなることを特徴とするマイクロキャリア。