WO2011035550A1 - Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物 - Google Patents

Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物 Download PDF

Info

Publication number
WO2011035550A1
WO2011035550A1 PCT/CN2010/001480 CN2010001480W WO2011035550A1 WO 2011035550 A1 WO2011035550 A1 WO 2011035550A1 CN 2010001480 W CN2010001480 W CN 2010001480W WO 2011035550 A1 WO2011035550 A1 WO 2011035550A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
hla
amplification
amplified
sequencing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/CN2010/001480
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
李剑
瞿京辉
王莉萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical BGI Shenzhen Co Ltd
Publication of WO2011035550A1 publication Critical patent/WO2011035550A1/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology, and in particular to amplification and typing of HLA-A, HLA-B and HLA-C genes. Methods, and specific primers used in the methods. BACKGROUND OF THE INVENTION
  • HLA human leukocyte antigen
  • HLA human leukocyte ant igen
  • the HLA system plays an important role in antigen recognition, antigen presentation, immune response and regulation, and destruction of foreign antigen target cells, and is the main material basis for causing immune rejection.
  • Both type I and class II antigens on the surface of graft cells are strongly transplanted antigens.
  • Humoral immunity and cellular immunity are involved in the rejection of grafts. Whether it is transplantation of allogeneic organs, tissues or cells, HLA matching between receptors is the key to success.
  • PCR-SSP sequence-specific primer polymerase chain reaction
  • PCR-SS0 polymerase chain reaction oligonucleotide probe hybridization
  • PCR-SBT polymerase chain reaction
  • the principle of SSP is to design a set of allele-specific primers, and obtain HLA-type specific amplification products by PCR, and determine the HLA type by electrophoresis analysis.
  • the disadvantage is that it is not easy to automate; new alleles cannot be detected; the kit needs to be continuously upgraded; the detection signal is an analog signal.
  • the principle of SS0 is to design an HLA-specific oligonucleotide sequence as a probe, label the PCR product, and hybridize the PCR product (the DNA to be detected) to the probe.
  • the HLA genotype was determined by the detection signal.
  • the disadvantage is that the new allele cannot be detected and the resolution is not high enough; the detection signal is an analog signal.
  • SBT is a method for determining the HLA type by performing nucleic acid sequence determination on the amplified DNA. For the analysis of gene structure, SBT is the most intuitive and accurate method. Identification of new alleles by PCR-SSP or PCR-SS0 methods must be confirmed by sequencing. However, there are still some technical problems in the existing SBT method. For example, most of the PCR primers are amplified by exons 2, 3, and 4 of HLA-A, B, and C loci, when some alleles are nuclear. When the glycosidic acid is distinguished from the amplified region, it cannot be distinguished; the PCR reaction is excessive, the cost is high, and the time is too long.
  • the present invention provides a novel HLA gene amplification method, characterized in that PCR amplification is performed using the amplification primer pair of the present invention, and the sequence of the amplification primer pair is And the sequence number (SEQ ID NO: ) is shown in Table 1 below:
  • primer pairs AF and AR are used to amplify HLA-A segments
  • primer pairs BF and BR are used to amplify HLA-B segments
  • primer pairs CF and CR are used to amplify HLA-C segments.
  • the full-length gene of HLA-A, HLA-B or HLA-C can be amplified by a PCR reaction.
  • the method of the present invention is particularly advantageously used for HLA genotyping. Compared with the existing PCR-SBT method, since the full-length gene can be amplified by using the method of the present invention and the amplification primer pair, when further typing, it can be avoided when a certain number of allele nucleotides are located The problem of effective typing cannot be performed outside the amplified area.
  • the present invention provides an improved HLA genotyping method, the method comprising: (1) amplifying a HLA-A, HLA-B and/or HLA- to be tested using the PCR amplification primer pair of the present invention. C full-length gene, (2) Amplification of the PCR product using the sequencing primer of the present invention, respectively amplifying each exon of HLA-A, HLA-B and/or HLA-C, and then sequencing each amplified exon , and the sequencing results are compared with the standard sequences in the database to determine the genotyping results.
  • the invention provides novel amplification primer pairs and sequencing primers for HLA gene amplification and/or typing as shown in Tables 1 and 2 above, which have SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO : The polynucleotide sequence shown in any one of the two.
  • the present invention provides a kit for performing HLA genotyping, which comprises the PCR amplification primer pair of the present invention and a sequencing primer.
  • FIG. 1 is an electropherogram of an HLA-A amplification product.
  • Figure 2 is an electropherogram of the HLA-B amplification product.
  • Figure 3 is an electropherogram of HLA-C amplification products.
  • Figure 4 is an exemplary sequencing map of HLA-A exons 2, 3, 4.
  • Figure 5 shows the sequencing map of the detected new genotype.
  • the present inventors conducted bioinformatic analysis of HLA-A, HLA-B and HLA-C gene sequences, and searched for conserved sequences of various gene loci in the 5' and 3' untranslated regions, and designed a number of expandable sequences. Specific PCR primers that increase the HLA full-length gene. Using the amplification primer pair of the present invention, the full-length gene of HLA-A, HLA-B or HLA-C can be amplified by a PCR reaction.
  • the full length gene of HLA-A is amplified using amplification primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the full length gene of HLA-B is amplified using the amplification primer pairs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the full length gene of HLA-A is amplified using amplification primer pairs of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the method of the present invention is particularly advantageously used for HLA genotyping. Compared with the existing PCR-SBT method, since the full-length gene can be amplified by using the method of the present invention and the amplification primer pair, when further typing, it can be avoided when a certain number of allele nucleotides are located The problem of effective typing cannot be performed outside the amplified area.
  • an improved HLA genotyping method comprising:
  • the primers 1-7 of HLA-A are amplified using the sequencing primers of SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO:
  • the sequencing primers of 18 amplify the exons 1-7 of HLA-B; - the exon 1-7 of HLA-C was amplified using the sequencing primers of SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 24.
  • each of the primers for amplification and/or typing of an HLA gene having the polynucleoside sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 24 is also provided.
  • kits for performing HLA genotyping which comprises the PCR amplification primer pair of the present invention and a sequencing primer.
  • instructions for use are also included in the kit.
  • test procedure is as follows:
  • the genomic DM extracted in step 1 was amplified using different primer pairs.
  • Amplification of HLA-B typing was performed; amplification of HLA-C typing was performed using the CF (SEQ ID NO: 5) and CR (SEQ ID NO: 6) primer pairs.
  • the amplification process and reaction system when using different primer pairs were similar.
  • the PCR amplification process is:
  • the PCR reaction system is 25 ⁇ 1, the composition of which is listed in the following table, where 2 x GC Buf er I (Mg 2+ plus) and LA Taq enzyme All purchased from Takara Bioengineering (Dalian) Co., Ltd. ( Takara):
  • the amplified fragments are all about 3200 bp in length. If only exons 2, 3, and 4 of HLA-A, B, and C are amplified, the fragment size is approximately 1. 3 KB. Thus, it can be demonstrated that the full length of the HLA-A, HLA-B and HLA-C genes can be amplified using the methods and primers of the present invention.
  • the PCR product to be purified was centrifuged at 4000 rpm x l minutes. 100 ⁇ l of ultrapure water was added to each PCR reaction system. Then, the purification plate to which the PCR product to be purified is added is connected to the suction filtration system, and the vacuum degree is adjusted to a barometer display of _10 ⁇ lPa, and suction-filtered to the microporous regenerated fiber membrane at the bottom of the purification plate without residual liquid, and in the light The lower observation is that there is no complete liquid surface reflection gloss, usually 10 to 15 minutes.
  • the purified PCR product is recovered by ultrapure water or hydrazine as needed.
  • the product to be subjected to the sequencing reaction can only be recovered by ultrapure water.
  • the recovered volume is determined by electrophoresis of the PCR product before purification, and is usually 20-50 ⁇ l.
  • A1F SEQ ID NO: 7
  • A2F SEQ ID NO: 8
  • A3F SEQ ID NO: 9
  • A4F SEQ ID NO: 10
  • A5F SEQ ID NO: 11
  • A6F SEQ ID NO: 12
  • Exons 3, 4, 5 and 6, 7 (where B6F can simultaneously amplify the 6th and 7th exons); use C1F (SEQ ID NO: 19), C2F (SEQ ID NO: 20), C3F (SEQ ID NO: 21), C4F (SEQ ID NO: 22), C5F (SEQ ID NO: 23), and C6F (SEQ ID 10: 24) amplify 111 ⁇ -(1, 2, 3, 4, respectively, Exons 5 and 6, 7 (where C6F can simultaneously amplify the 6th and 7th exons); the conditions and reaction system of each sequencing amplification reaction are the same.
  • the conditions for the sequencing amplification reaction are:
  • the reaction system was 5 ⁇ 1, and its composition is listed in the following table, of which 2.5 X Bigdye and 5 X Buffer were purchased from Applied Biosystems (ABI):
  • the basic steps are: Remove the sequencing reaction plate and trim, centrifuge 3000gx for 1 minute. Add 0.125 mol/L EDTA-Na 2 solution 2 ⁇ l, 85% ethanol 33 ⁇ l per 5 ⁇ l reaction system to a 96-well reaction plate, cover with a silica gel pad, shake well for 3 minutes, and centrifuge 3000gx for 30 minutes at 4TC. After the completion of the centrifugation, the reaction plate was taken out, the silica gel pad was opened, the reaction plate was inverted on a blotting paper, and the mixture was centrifuged, and the centrifugation was stopped immediately when the centrifugal force reached 185 g.
  • the purified sequencing amplified products were sequenced using an ABI 3720 Solexa sequencer.
  • An exemplary sequencing result is shown in Figure 4.
  • Tiercy J M Molecular basis of HLA polymorphism: impl icat ions in cl inical transplantat ion.
  • J Transpl Immunol, 2002, 9: 173-180.
  • Ant igens 2000, 55: 71-73.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

HLA基因扩增和基因分型方法及其相关引物 技术领域 本发明涉及分子生物学领域， 具体而言， 本发明涉及用于 HLA-A、 HLA-B和 HLA-C基因的扩增和分型方法，以及所述方法中使用的特异性引 物。 背景技术 人类白细胞抗原， 即 HLA ( human leukocyte ant igen ), 是调控人 体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统， 与同种 异体器官移植的排斥反应密切相关。
HLA系统在抗原识别、抗原递呈、免疫应答与调控、破坏外来抗原靶 细胞等方面发挥重要的作用， 是引起免疫排斥反应的主要物质基础。 移 植物细胞表面 I类和 I I类抗原都是强移植抗原，体液免疫和细胞免疫都 参与了对移植物的排斥反应， 无论是异基因器官、 组织或细胞的移植， 供受体间 HLA相配是成功的关键。
目前国际标准的 HLA分型技术为 PCR-SSP (序列特异引物聚合酶链式 反应）， PCR-SS0 (聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交）和 PCR-SBT (聚合 酶链式反应产物直接测序分型）。
SSP的原理是设计出一整套等位基因組特异性引物，借助 PCR技术获 得 HLA型别特异的扩增产物， 通过电泳分析决定 HLA型别。 其缺点是不 易自动化； 不能检测新的等位基因； 试剂盒需不断升级； 检测信号是模 拟信号。
SS0的原理是设计 HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针， 对 PCR 产物进行标记， 以 PCR产物（待检测基因 DNA )与探针杂交。 通过检测信 号判断 HLA基因型别。 缺点是不能检测新的等位基因， 分辨率不够高； 检测信号是模拟信号。
SBT是一种通过对扩增后的 DNA进行核酸序列测定， 从而判断 HLA 型别的方法。 对于基因结构的分析， SBT是最直观、 最准确的方法。 用 PCR-SSP或 PCR-SS0方法鉴别出新的等位基因， 必须通过测序加以证实。 但是目前现有的 SBT法尚存在一些技术问题， 例如其 PCR引物大多是对 HLA-A，B，C位点的外显子 2、 3、 4进行扩增， 当某几个等位基因核苷酸区 别在扩增区域之外时， 就无法进行区分； PCR反应过多， 成本较高， 时间 过长等。
综上所述， 本领域仍需要改进的 HLA基因扩增和分型方法， 以便对 HLA基因进行全长基因扩增， 实现更准确、 分辨率更高的分型。 发明内容 为解决上述现有技术中的问题， 本发明提供了一种新的 HLA基因扩 增方法， 其特征在于使用本发明的扩增引物对进行 PCR扩增， 所述扩增 引物对的序列以及序列编号（SEQ ID NO: )示于下表 1:
表 1 : PCR扩增引物对
Figure imgf000003_0001
在本发明方法中， 引物对 A-F与 A-R用于扩增 HLA-A区段， 引物对 B-F与 B-R用于扩增 HLA-B区段，引物对 C-F与 C-R用于扩增 HLA-C区段。 使用本发明的扩增引物对， 可以通过 PCR反应扩增出 HLA-A、 HLA-B或 HLA-C的全长基因。
由于能够通过 PCR反应扩增出 HLA-A、 HLA-B或 HLA-C的全长基因， 因此， 本发明的方法特别有利地可用于进行 HLA基因分型。 与现有的 PCR-SBT方法相比，由于使用本发明的方法和扩增引物对能够扩增全长基 因， 因此在进一步进行分型时， 能够避免当某几个等位基因核苷酸位于 扩增区域之外时无法进行有效分型的问题。
另外， 本发明提供了一种改进的 HLA基因分型方法， 所述方法包括： (1)使用本发明的 PCR扩增引物对扩增待测的 HLA-A、 HLA-B和 /或 HLA-C全长基因， (2) 使用本发明的测序引物对 PCR产物进行扩增， 分别扩增 HLA-A、 HLA-B和 /或 HLA- C的各外显子， 然后对扩增出的各外显子进行测序， 并 将测序结果与数据库中的标准序列进行比较， 从而确定基因分型结果。
其中所述各测序引物的序列以及序列编号（ SEQ ID NO: )示于下表 2。 表 2: 测序引物
Figure imgf000004_0001
另一方面， 本发明提供了如上表 1和表 2所示的用于 HLA基因扩增 和 /或分型的新的扩增引物对和测序引物， 它们具有 SEQ ID N0: 1至 SEQ ID NO: 24任一项所示的多核苷酸序列。
另一方面， 本发明还提供了一种用于进行 HLA基因分型的试剂盒， 所述试剂盒中包括本发明的 PCR扩增引物对和测序引物。
应用本发明提供的扩增引物对和测序引物以及基因分型方法， 能够 在扩增全长基因的基础上进行基因分型。 因此相对于现有技术而言， 分 型的准确率和分辨率更高， 同时还节省了时间和成本。 附图说明 图 1为 HLA-A扩增产物电泳图。
图 2为 HLA- B扩增产物电泳图。
图 3为 HLA-C扩增产物电泳图。
图 4为 HLA-A外显子 2、 3、 4的示例性测序图谱。
图 5为检测到的新基因型的测序图谱。 具体实施方式 本发明人通过对 HLA-A、 HLA-B和 HLA-C基因序列进行生物信息学分 析， 在 5' 和 3' 非翻译区寻找各基因位点保守序列， 设计出了若干能够 扩增 HLA全长基因的特异性 PCR引物。 使用本发明的扩增引物对， 可以 通过 PCR反应扩增出 HLA- A、 HLA-B或 HLA-C的全长基因。
在本发明的一个实施方案中， 使用 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2 的扩增引物对扩增 HLA- A的全长基因。 在本发明的另一个实施方案中， 使用 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4的扩增引物对扩增 HLA-B的全长基 因。 在本发明的另一个实施方案中， 使用 SEQ ID N0: 5和 SEQ ID N0: 6 的扩增引物对扩增 HLA-A的全长基因。
由于能够通过 PCR反应扩增出 HLA-A、 HLA-B或 HLA-C的全长基因， 因此， 本发明的方法特别有利地可用于进行 HLA基因分型。 与现有的 PCR-SBT方法相比，由于使用本发明的方法和扩增引物对能够扩增全长基 因， 因此在进一步进行分型时， 能够避免当某几个等位基因核苷酸位于 扩增区域之外时无法进行有效分型的问题。
因此根据本发明的另一方面，提供了一种改进的 HLA基因分型方法， 所述方法包括：
(1)使用本发明的 PCR扩增引物对扩增待测的 HLA- A、 HLA-B和 /或 HLA-C全长基因，
(2) 使用本发明的测序引物对 PCR产物进行扩增， 分别扩增 HLA-A、 HLA- B和 /或 HLA-C的各外显子， 然后对扩增出的各外显子进行测序， 并 将测序结果与数据库中的标准序列进行比较， 从而确定基因分型结杲， 其中所述各测序引物的序列以及序列编号（ SEQ ID NO: )示于上表 2。 在本发明的一个实施方案中， 其中使用 SEQ ID NO: 7至 SEQ ID NO: 12的测序引物扩增 HLA-A的第 1-7外显子；使用 SEQ ID N0: 13至 SEQ ID NO: 18的测序引物扩增 HLA-B的第 1-7外显子;—使用 SEQ ID NO: 19至 SEQ ID NO: 24的测序引物扩增 HLA-C的第 1-7外显子。
根据本发明的另一方面，还提供了用于 HLA基因扩增和 /或分型的各 个引物， 它们具有 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 24任一项所示的多核苷 列。
根据本发明的另一方面， 还提供了一种用于进行 HLA基因分型的试 剂盒， 所述试剂盒中包括本发明的 PCR扩增引物对和测序引物。 任选地， 所述试剂盒中还包括使用说明书。 实施例
提出以下实施例， 以便使本领域普通技术人员更好地理解本发明， 所述实施例仅出于示例性目的， 并非意在限制本公开的范围。 已经努力 确保有关数字 （如数量、 温度等）的准确性， 但应该考虑到会存在一些 误差和偏差。 除非另有说明， 否则份数为重量份数， 温度以 C为单位或 者为环境温度， 压力接近或等于大气压。 实施例 1.使用本发明的 HLA分型系统对已知基因型的样本进行分型 检测。
在本实施例中， 采用本发明的 PCR扩增引物对和测序引物， 对 20例 已知 HLA基因型的 J6L样进行 HLA-A，B，C位点的高分辨率基因分型。 试 验的具体步骤如下：
1.利用盐析法提取基因组 DNA。
试验步骤如下：
( 1 )在生物安全拒中进行操作， 吸取 200μ1混匀全血到 2ml EP管 中， 操作结束按流程关闭生物安全拒。
( 2 )在所述 EP管中加入 700μ1红细胞裂解液，振荡 15秒， 14， OOOrpm 离心 1 min。 ( 3)弃去上清液， 将所述 EP管开口向下放吸水纸上， 尽量排出剩 余液体。
( 4 )在所述 EP管中加入 ΙΟμΙ ( 10mg/ml )蛋白酶 K和 300μ1核裂 解液， 振荡 15秒， 再加入 20μ1 SDS (20%), 振荡 15秒。
( 5 )将 ΕΡ管在 56Ό孵育 30 min, 然后以 14， 000 rpm离心 3 min。
(6)在所述 EP管中加 1ml无水乙醇（_20* 预冷）， 颠倒 Ep管 15 至 20次， 直到线性 DNA形成。
( 7 )以 14， 000 rpm离心 2 min, 弃去上清。
(8)在所述 EP管中加 1ml 70%乙醇，反复颠 Ep管，然后以 14， 000 rpm离心 2 min, 弃去上清。
(9)打开所述 Ep管， 室温放置 10至 15 min, 待管壁的乙醇挥发干 燥后， 加入 ΙΟΟμΙ左右蒸馏水。
2. PCR扩增
分别使用不同的引物对扩增步骤 1 中提取的基因组 DM。 使用 A-F (SEQ ID NO: 1)和 A-R (SEQ ID NO: 2) 引物对进行 HLA-A分型的扩增； 使用 B-F (SEQ ID NO: 3)和 B-R (SEQ ID NO: 4)引物对进行 HLA-B分型的扩 增； 使用 C-F (SEQ ID NO: 5)和 C-R (SEQ ID NO: 6)引物对进行 HLA-C分型 的扩增。 使用不同的引物对进行扩增时的扩增过程和反应体系均是相似 的。
所述 PCR扩增过程为：
96" 2min
95" 30s 601C 30s ^ 12V 3min ( x 35个循环） 15TC oo 所述 PCR反应体系为 25μ 1，其组成如下表所列，其中 2 x GC Buf f er I (Mg2+ plus)和 LA Taq酶均购自宝生物工程（大连）有限公司 （ Takara ):
Takara 2 χ GC buffer I (Mg2+ plus ) 12.5μ 1 dNTP混合物（各 2.5mM) 4.0μ 1 扩增引物对（F引物和 R引物各 lOpmol/1 ) 1.0μ 1
Takara LA Taq酶（ 5U/ μ 1 ) 0.3μ 1
DNA模板 3. Ομ 1
Figure imgf000008_0001
扩增产物的电泳图示于图 1至图 3。 图 1、 2、 3分别为 HLA-A、 B、 C 的扩增产物电泳图， 图最左边的白色条痕为 Marker标记。从上到下依次为 2000bp. 1000bp、 500bp、 200bp、 lOObp和 50bp。 图中从右至左的各个泳 道分别对应各受试者的样本。
从图 1-3可以看出，应用本发明的引物，所扩增的片段长度均在 3200bp 左右。 若仅扩增 HLA-A、 B、 C的外显子 2、 3和 4, 则片段大小约为 1. 3KB。 因此可以证明，使用本发明的方法和引物能够扩增 HLA-A、 HLA-B和 HLA-C 基因的全长。
3. 利用 mi 1 1 ipore纯化板进行 PCR产物纯化。
用记号笔在 96孔 PCR产物纯化板上标记需要使用的孔， 并向需要使 用的孔中加入 50 μ ΐ超纯水， 剩余孔粘贴封口膜， 室温静置 15分钟或连 接到抽滤系统上， 以 -lOPa抽滤 5分钟，每次从抽滤系统上取下纯化板时 都要在吸水纸上吸干残留在纯化板底部排液口的液体。
待纯化 PCR产物离心， 4000 rpm x l分钟。 在每个 PCR反应体系中加 入 100 μ 1超纯水。然后把加入待纯化 PCR产物的纯化板连接到抽滤系统 上， 调节真空度至气压表显示 _10 ± lPa， 抽滤至纯化板底部的微孔再生 纤维膜上无残留液体为止， 并在光照下观察为无完整液面反射光泽， 通 常 10至 15分钟。
向含有待纯化 PCR产物的孔中加 20-50 μ 1超纯水或 ΤΕ至微孔再生 纤维膜上； 在室温下， 使用微量振荡器的中档速度振荡纯化板 5分钟， 转移相应孔内全部液体至一块新的 96孔 PCR板的对应孔中。
根据需要用超纯水或 ΤΕ回收已纯化的 PCR产物，需进行测序反应的 产物只能用超纯水回收， 回收的体积根据纯化前 PCR产物电泳鉴定情况 决定， 通常为 20-50 μ 1。
4. 使用测序引物进行产物的扩增。
分别使用不同的引物对步骤 3中纯化的 PCR产物进行测序扩增。 使 用 A1F (SEQ ID NO: 7)、 A2F (SEQ ID NO: 8)、 A3F (SEQ ID NO: 9)、 A4F (SEQ ID NO: 10)、 A5F (SEQ ID NO: 11)和 A6F (SEQ ID NO: 12)分别扩增 HLA-A 的 1、 2, 3， 4, 5和 6、 7号外显子（其中使用 A6F可以同时扩增出第 6 和第 7外显子）； 使用 B1F(SEQ IDN0: 13)、 B2F (SEQ ID NO: 14)、 B3F (SEQ ID NO: 15)、 B4F (SEQ ID NO: 16)、 B5F (SEQ ID NO: 17)和 B6F (SEQ ID NO: 18) 分别扩增 HLA-B的 1、 2, 3, 4, 5和 6、 7号外显子（其中使用 B6F可以 同时扩增第 6和第 7外显子）； 使用 C1F(SEQ ID NO: 19)、 C2F (SEQ ID NO: 20)、 C3F (SEQ ID NO: 21)、 C4F (SEQ ID NO: 22)、 C5F (SEQ ID NO: 23) 和 C6F(SEQ ID 10:24)分别扩增111^-(的 1、 2, 3， 4， 5和 6、 7号外显 子（其中使用 C6F可以同时扩增第 6和第 7外显子）； 各测序扩增反应的 条件和反应体系都是相同的。
所述测序扩增反应的条件是：
96Π 2min
96"C 10s - 55 5s ^ 60 2min ( 25个循环）
15C oo
反应的体系为 5μ1, 其组成如下表所列， 其中 2.5 X Bigdye和 5 X Buffer均购自美国应用生物系统公司（Applied Biosystems, ABI)：
Figure imgf000009_0001
5. EDTA/无水乙醇纯化测序扩增的产物。
基本步骤是： 取下测序反应板配平， 离心 3000gx 1分钟。 在 96孔 反应板的每 5 μ 1反应体系加 0.125 mol/L EDTA-Na2溶液 2 μ 1， 85%乙醇 33μ 1, 盖上硅胶垫， 充分振荡 3分钟， 在 4TC离心 3000gx 30分钟。 离 心结束后取出反应板， 打开硅胶垫， 将反应板倒置吸水纸上进行倒离心， 在离心力达到 185g时立即停止离心。 在 96孔板的每孔中加入 70%乙醇 50μ 1, 盖上硅胶垫， 振荡 1.5min， 在 离心 3000g x 15分钟。 将反应 板置于避光通风处 30分钟， 风干至无乙醇气味。 在 96孔板的每孔中加 10μ 1 ( 384孔板每孔加 8 μ 1 ) HI-DI曱酰胺， 盖封口膜， 振荡 5秒后以 1000 ± lOOrpm离心。 6. 在 ABI 3730XL上进行外显子测序。
使用 ABI 3720solexa测序仪对经过纯化的测序扩增产物进行测序。 一个示例性的测序结果示于图 4。
然后将测序所得结果与国际组织 IMGT数据库（http：〃 www. ebi. ac. uk/imgt/)中公布的 HLA分型中的标准序列进行比对； 通过比对得出样品 序列与标准序列的匹配率； 根据匹配率高低得出样品序列的分型结论。 检测结果与样本原来的分型结果的对比见下表 3 (关于 HLA分型命名的查 询可见于 http: //www. ebi. ac. uk/imgt/hla/al ign. html)。 表 3本次分析结果与样本已知的分型结果对比
Figure imgf000010_0001
从上表 3可以看出， 使用本发明方法进行 HLA-A、 HLA-B和 HLA-C的 基因分型结果与样本原来的分型结果完全相符， 从而证明了本发明的可 靠性。 实施例 2. 利用本发明的系统发现新的等位基因。 在本实施例中， 使用本发明的引物对多个未知基因型的 Ajk样本进行 分型， 所使用的方法如实施例 1所述。 经过测序发现其中一个样本的基因 型与数据库中记载的已有基因型均不相同 （测序结果见图 5 )， 如图中圆圏 所示， 该样本的 HLA-C基因的第 4外显子第 695位置处的核苷酸为 G, 而 数据库中该位置的核苷酸为 T, 因此说明该样本是一个 HLA-C新等位基因。 由此证明， 利用本发明的方法可以发现新的等位基因型。 对于本领域技术人员显而易见的是， 在不背离本发明的范围和精神的 前提下可对本发明进行各种修改和变动。 通过考虑本发明在此所公开的说 明书和实例，本发明的其他实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。 本说明书和实施例应仅看作示例性用途， 本发明真正的范围和精神在所附 的权利要求书中说明。
参考文献
[1] . Tiercy J M. Molecular basis of HLA polymorphism: impl icat ions in cl inical transplantat ion. [J] . Transpl Immunol, 2002, 9: 173—180.
[2] . Gonzalez-Roces, SM. V, Alvarez, S. Gonzalez， et al. HLA-B27 polymorphism and worldwide susceptibi l ity to ankylos ing spondyl itis. [J] . Tissue Antigens, 1997, 49: 116.
[3] - Pera C, Deff ins L, Marabito A, et al. HLA-A typing: Comparison between serology, the ampl ification refractory mutation system wi th polymerase chain react ion and sequencing. [J] . Tissue Ant igens, 1997, 50: 372-379.
[4] Li l lo R, Balas A, Vicario JL， et al. Two new HLA class al lele, DPB1*02014, by sequence-based typing. [J] . Tissue Ant igens, 2002, 59: 47-48.
[5] . Dunn PP, Carter V, Dunn A, et al . Ident ificat ion of an HLA-B7 serological variant and i ts characterizat ion by sequencing based typing. [J] . Tissue
Ant igens, 2000， 55: 71-73.
[6] . Al- Hussein K A, Rama N R, Butt A I， et al. HLA class I I sequence based typing in normal Saudi individuals. [J] . Tissue Antigens, 2002, 60: 259- 261.
[7] - D. C. Sayer, D. M. Goodridge. Pi lot study: assessment of interlaboratory variability of sequencing— based typing DNA sequence data quality. [J] Tissue Antigens, 2007, 69 Suppl. 1 ( 66 68 )
[8] - K. Kotsch, J. Wehling, R. Blasczyk. Sequencing of HLA class II genes based on the conserved diversity of the non-coding regions: sequencing based typing of HLA-DRB genes. [J], Tissue Antigens, 1999: 53: 486 497.
[9] . . R. Miao, Q. Q. Pan, R. C. Tang, et al. The polymorphism and haplotype analysis of HLA-A, 一 B and -DRBl genes of population in Jiangsu province of China. [J]. International Journal of Immunogenetics, 2007， 34: 419 424.

Claims

权利 要求
1. 一种 HLA基因扩增方法，其特征在于使用选自 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2， SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4， 和 /或 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6的扩增引物对进行 PCR扩增，扩增 HLA- A、 HLA-B和 /或 HLA-C 基因。
2. 权利要求 1的方法， 其中使用 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2的扩 增引物对扩增 HLA-A基因。
3. 权利要求 1的方法， 其中使用 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4的扩 增引物对扩增 HLA-B基因。
4. 权利要求 1的方法， 其中使用 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6的扩 增引物对扩增 HLA-C基因。
5. 一种 HLA基因分型方法， 所述方法包括：
(1) 使用选自 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2， SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4, 和 /或 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6的扩增引物对 进行 PCR扩增，扩增待测样本的 HLA- A、 HLA-B和 /或 HLA- C的全 长基因，
(2) 使用一种或多种选自 SEQ ID NO: 7至 SEQ ID NO: 24的测序引 物对 PCR产物进行扩增， 分别扩增 HLA-A、 HLA-B和 /或 HLA-C 的各外显子，然后对扩增出的各外显子进行测序，并将测序结果 与数据库中的标准序列进行比较， 从而确定基因分型结果。
6. 权利要求 5的方法， 其中使用 SEQ ID NO: 7至 SEQ ID NO: 12的测 序引物扩增 HLA-A的各外显子； 使用 SEQ ID NO: 13至 SEQ ID NO: 18的测序引物扩增 HLA-B的各外显子；使用 SEQ ID NO: 19至 SEQ ID NO: 24的测序引物扩增 HLA-C的各外显子。
7. 权利要求 5的方法， 其中分别使用 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4， 以及 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6的扩增引物对进行 PCR扩增， 扩增出 HLA-A、 HLA-B以及 HLA-C的 全长基因。
8. 具有 SEQ ID NO: 1至 SEQ ID NO: 24任一项所示序列的多核苷酸。
9. 一种用于进行 HLA基因分型的试剂盒， 所述试剂盒中包括一对或多 对选自 SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 4， 或 SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO: 6的 PCR扩增引物对， 以及一种 或多种选自 SEQ ID NO: 7至 SEQ ID NO: 24的测序引物。
PCT/CN2010/001480 2009-09-23 2010-09-25 Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物 Ceased WO2011035550A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910174203.1 2009-09-23
CN2009101742031A CN101654691B (zh) 2009-09-23 2009-09-23 Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011035550A1 true WO2011035550A1 (zh) 2011-03-31

Family

ID=41709142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2010/001480 Ceased WO2011035550A1 (zh) 2009-09-23 2010-09-25 Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN101654691B (zh)
WO (1) WO2011035550A1 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101654691B (zh) * 2009-09-23 2013-12-04 深圳华大基因健康科技有限公司 Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物
CN101984445B (zh) * 2010-03-04 2012-03-14 深圳华大基因科技有限公司 一种基于聚合酶链式反应产物测序序列分型的实现方法和系统
CN101921842B (zh) * 2010-06-30 2013-08-07 深圳华大基因科技有限公司 Hla-a,b基因分型用pcr引物及其使用方法
WO2012083506A1 (zh) * 2010-12-24 2012-06-28 深圳华大基因科技有限公司 Hla-dqb1基因分型的方法及其相关引物
CN101921841B (zh) * 2010-06-30 2014-03-12 深圳华大基因科技有限公司 基于Illumina GA测序技术的HLA基因高分辨率分型方法
CN101921840B (zh) * 2010-06-30 2014-06-25 深圳华大基因科技有限公司 一种基于dna分子标签技术和dna不完全打断策略的pcr测序方法
CN101962676B (zh) * 2010-08-31 2011-08-31 深圳市血液中心 人类白细胞抗原hla基因测序分型方法
WO2012068701A2 (zh) * 2010-11-23 2012-05-31 深圳华大基因科技有限公司 Hla基因型别一snp连锁数据库、其构建方法、以及hla分型方法
CN103261438B (zh) * 2010-12-24 2015-09-16 深圳华大基因医学有限公司 Hla-c基因分型的方法及其相关引物
CN103617375B (zh) * 2013-12-02 2017-08-25 深圳华大基因健康科技有限公司 聚合酶链式反应产物测序分型的方法及系统
CN105039332B (zh) * 2015-08-19 2019-01-29 深圳市晋百慧生物有限公司 Hla基因的组特异性扩增引物、测序分型方法和试剂盒
CN105296618A (zh) * 2015-10-14 2016-02-03 深圳市血液中心 人类白细胞抗原基因分型的方法及其试剂
CN108192964A (zh) * 2017-12-27 2018-06-22 银丰基因科技有限公司 Hla-c全长基因分型试剂盒
CN108531568B (zh) * 2018-04-13 2019-09-13 北京诺诗康瀛基因技术股份有限公司 一种用于hla-b基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法
CN112126687A (zh) * 2020-11-06 2020-12-25 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 用于检测患者hla缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法
CN113817725B (zh) * 2021-10-15 2024-05-14 西安浩瑞基因技术有限公司 Hla基因扩增引物、试剂盒、测序文库构建方法及测序方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060078930A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Dynal Biotech Inc. Primers, methods and kits for amplifying or detecting human leukocyte antigen alleles
CN101654691A (zh) * 2009-09-23 2010-02-24 深圳华大基因科技有限公司 Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1451760A (zh) * 2002-04-16 2003-10-29 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 Hla分型用寡核苷酸芯片的制备及用法
KR100608278B1 (ko) * 2003-03-04 2006-08-02 가부시키가이샤 시마즈세이사쿠쇼 Ｈｌａ 타이핑법
CN101353694B (zh) * 2007-07-24 2011-02-09 中山大学达安基因股份有限公司 Hla-a基因分型用微阵列芯片的制备及其用法
CN101353692B (zh) * 2007-07-24 2010-12-29 中山大学达安基因股份有限公司 Hla-b基因分型用微阵列芯片的制备及其用法
CN101487043B (zh) * 2008-01-18 2011-03-23 中山大学达安基因股份有限公司 Hla-c基因分型dna微阵列芯片试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060078930A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-13 Dynal Biotech Inc. Primers, methods and kits for amplifying or detecting human leukocyte antigen alleles
CN101654691A (zh) * 2009-09-23 2010-02-24 深圳华大基因科技有限公司 Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COX, S.T. ET AL.: "Cloning and sequencing full-length HLA-B and -C genes.", TISSUE ANTIGENS., vol. 61, no. 1, January 2003 (2003-01-01), pages 20 - 48 *
CURRAN, M.D. ET AL.: "Long-range PCR amplification as an alternative strategy for characterizing novel HLA-B alleles.", EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOGENETICS., vol. 23, no. 4, August 1996 (1996-08-01), pages 297 - 309 *
DUNN, P.P.J. ET AL.: "Sequencing protocols for detection of HLA class I polymorphism.", METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: MHC PROTOCOLS., 2002, TOTOWA, pages 191 - 222 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101654691A (zh) 2010-02-24
CN101654691B (zh) 2013-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011035550A1 (zh) Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物
JP6308724B2 (ja) Ｈｌａ遺伝子のマルチプレックスｄｎａタイピング方法及びキット
JP6809977B2 (ja) Ｈｌａ遺伝子のｄｎａタイピング方法及びキット
CN103205503B (zh) 用于检测clcn1基因突变的方法、试剂盒及特异性引物
WO2012000445A1 (zh) 新的的pcr测序方法及其在hla基因分型中的应用
WO2012000150A1 (zh) Hla-a，b基因分型用pcr引物及其使用方法
WO2014065410A1 (ja) Ｈｌａ遺伝子のｄｎａタイピング方法及びキット
CN103370456A (zh) 限定母体循环血液中保守的游离浮动胎儿dna的诊断性和治疗性靶物
CN103270170B (zh) Hla-dqb1基因分型的方法及其相关引物
CN105899675B (zh) 主要组织相容性复合体单核苷酸多态性
WO2012083505A1 (zh) Hla-c基因分型的方法及其相关引物
JP6233022B2 (ja) Ｈｌａ−ａ＊２４グループの判定方法
Giovambattista et al. Four Target Resequencing for the Bovine Major Histocompatibility Complex Region. Proof of Concept
Diaz et al. Development of an ELA‐DRA gene typing method based on pyrosequencing technology
Caggiari et al. Identification of novel chimpanzee MHC class I and II alleles using an improved sequence-based typing strategy
Balas et al. Identification of six novel HLA alleles, HLA‐A* 31: 208,‐B* 08: 306,‐C* 03: 582,‐C* 04: 494,‐C* 18: 18 and‐DRB1* 07: 133.
CN109355366A (zh) Hla-b高分辨基因测序试剂盒
Zheng et al. Evidence for association of D1S249 locus on human chromosome 1 with the susceptibility to essential hypertension in Han Chinese
Lin et al. Identification of a novel HLA-A allele, HLA-A* 02: 315.
JP2010162020A (ja) 新規ｈｌａ−ｄｒｂ１遺伝子およびその用途
Class et al. Patent application title: METHOD OF MOLECULAR TYPING Inventors: Cristina Navarrete (Watford, GB) Alina Lemnrau (Watford, GB) Winnie Pui Chee Chong (Watford, GB)
JP2007295844A (ja) ウシ乳房炎の発症抵抗性及び感受性の判定方法
HK1185115B (zh) Hla-dqb1基因分型的方法及其相关引物
JP2011050377A (ja) 新規ｈｌａ−ｄｒｂ１遺伝子およびその用途
JP2014150767A (ja) Ｈｌａ−ａ＊０２グループの判定方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10818244

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10818244

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1