WO2011027916A1 - アレルギー性疾患治療薬 - Google Patents

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WO2011027916A1
WO2011027916A1 PCT/JP2010/065689 JP2010065689W WO2011027916A1 WO 2011027916 A1 WO2011027916 A1 WO 2011027916A1 JP 2010065689 W JP2010065689 W JP 2010065689W WO 2011027916 A1 WO2011027916 A1 WO 2011027916A1
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WO
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peptide
amino acid
acid sequence
ige
mast cells
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PCT/JP2010/065689
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English (en)
French (fr)
Inventor
岡山吉道
羅智靖
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学校法人日本大学
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
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    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
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    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
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    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a peptide phosphorylated on the tyrosine residue of the ITAM motif of the human high affinity IgE receptor ⁇ chain, and an allergic disease therapeutic agent containing the same.
  • Mast cells not only provoke immediate allergic reactions, but also mobilize inflammatory cells such as basophils and T cells to local allergic inflammation by mediators such as chemokines, cytokines and leukotrienes produced and released by mast cells .
  • Mast cells interact directly with B cells, T cells, dendritic cells, etc. in allergic inflammation areas of nasal mucosa such as hay fever, and proliferation of Ig cells (Immunoglobulin E) ) Increase in production.
  • the produced IgE enhances the expression of human high-affinity IgE receptor (Fc ⁇ RI) in mast cells and dendritic cells, increasing the sensitivity of these cells to antigens, ie hypersensitivity and excessive reactivity.
  • a path to be amplified is formed.
  • mast cell activation inhibitors such as cromoglycic acid and adrenergic ⁇ 2-stimulants
  • rodents such as mice
  • mast cell activation inhibitors such as cromoglycic acid and adrenergic ⁇ 2-stimulants
  • rodents such as mice
  • a humanized anti-human IgE antibody (omalizumab) has already been put to practical use as a drug for inhibiting the binding between IgE and Fc ⁇ RI, and has been shown to be effective in the treatment of severe bronchial asthma.
  • omalizumab a humanized anti-human IgE antibody
  • histamine receptor antagonists for histamine histamine
  • leukotriene receptor antagonists for leukotrienes steroids for cytokine production, and other mediators.
  • Inhibitors have been used (see, for example, “Cohn L, Elias JA, Chupp GL. Asthma: machinery of disease persistence and progression. Annu Rev Immunol 22: 789-815, 2004”).
  • antiallergic drugs such as cromoglycic acid suppress rodent mast cell degranulation at low concentrations, but their effects are very limited and have little effect on the activation of human mast cells. unacceptable.
  • Adrenergic ⁇ 2-stimulators suppress degranulation of human mast cells, but they easily desensitize and lose their effects when used for a long time.
  • humanized anti-human IgE antibody (omalizumab) is very expensive, its application is limited to specific diseases such as severe bronchial asthma that is not effective with ordinary allergic diseases. Yes. Furthermore, even if each mediator such as histamine or leukotriene was inhibited, its therapeutic effect was limited.
  • the peptide of the present invention is, for example, at least Y of Y 1 , Y 2 and Y 3 in the amino acid sequence represented by the formula (I). 1 and Y 3 may be a phosphorylated tyrosine residue.
  • the peptide (a) or (b) may have a cell membrane-permeable peptide at the N-terminus.
  • a mast cell IgE-dependent activation inhibitor comprising the following peptide (a) or (b), a derivative thereof, or a salt thereof:
  • (I) (Y 1 , Y 2 and Y 3 are all tyrosine residues and at least one of them is phosphorylated tyrosine.
  • X represents any amino acid residue.
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by (B) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by the above formula (I) and having IgE-dependent activation inhibitory activity of mast cells.
  • the inhibitor of the present invention may be, for example, a tyrosine residue in which at least Y 1 and Y 3 are phosphorylated among Y 1 , Y 2 and Y 3 in the amino acid sequence represented by the formula (I). Good.
  • the peptide (a) or (b) may have a cell membrane-permeable peptide at the N-terminus.
  • the mast cell may be a human mast cell.
  • a method for inhibiting IgE-dependent activation of mast cells comprising a step of allowing the following peptide (a) or (b), a derivative thereof or a salt thereof to act on mast cells.
  • the step of acting may be a step of introducing the peptide (a) or (b), a derivative thereof, or a salt thereof into mast cells.
  • the suppression method of the present invention may be, for example, a tyrosine residue in which at least Y 1 and Y 3 are phosphorylated among Y 1 , Y 2 and Y 3 in the amino acid sequence represented by the formula (I). Good.
  • the peptide (a) or (b) may have a cell membrane-permeable peptide at the N-terminus.
  • the mast cell may be a human mast cell.
  • a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of allergic diseases comprising the inhibitor of (2) above.
  • examples of the allergic disease include at least one selected from the group consisting of allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic asthma and atopic dermatitis.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of confirming introduction of each peptide into human mast cells by flow cytometry (FACS).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of confirming introduction of each peptide into human mast cells using a confocal laser microscope.
  • FIG. 3 is a diagram showing the analysis results of the inhibitory effect of histamine release from human mast cells.
  • Figure 4 is a graph showing the results of an analysis of inhibitory effect of prostaglandin D 2 producing human mast cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the analysis results of the suppression mechanism of IgE-dependent human mast cell activation.
  • the human high affinity IgE receptor (Fc ⁇ RI) is expressed on the cell membrane in the form of a tetramer consisting of an ⁇ chain, a ⁇ chain, and two ⁇ chains, of which the Fc ⁇ RI ⁇ chain is an IgE receptor signal. It has already been reported by the present inventors in a mouse mast cell (mouse mast cell) experimental system. When the gene expression of Fc ⁇ RI ⁇ chain is suppressed using a viral vector for human mast cells (human mast cells), degranulation due to IgE-dependent stimulation, production of arachidonic acid metabolites, and production of cytokines are suppressed. The inventor confirmed.
  • the present inventor has sought the responsible region of the Fc ⁇ RI ⁇ chain and found it to be an ITAM motif of the Fc ⁇ RI ⁇ chain. Furthermore, when the present inventor binds a peptide obtained by phosphorylating a specific amino acid residue (specifically, tyrosine residue) in the ITAM motif to a cell membrane-permeable peptide and introduces the peptide into a human mast cell, It was confirmed that the IgE-dependent activation of the protein was almost completely suppressed and allergic reactions such as degranulation (release of specific granules such as histamine) were effectively suppressed. The present invention has been found based on such novel findings.
  • a conventionally known mast cell activation inhibitor suppresses IgE-dependent activation of rodent (mice, etc.) mast cells, but no inhibitory effect on human mast cell activation has been observed.
  • the only human mast cell activation inhibitor known is a humanized anti-human IgE antibody (inhibiting the binding of IgE to Fc ⁇ RI), but it is extremely expensive and therefore is used for daily use. Was not suitable and lacked practicality.
  • a specific phosphorylated peptide that is, a peptide having an ITAM motif of Fc ⁇ RI ⁇ chain phosphorylated on a tyrosine residue is activated by IgE in human mast cells, and thus degranulated, etc.
  • the peptide of the present invention can be obtained by chemical synthesis, can be easily produced as compared with the above-mentioned anti-human IgE antibody, and can be kept at a very low cost.
  • the mast cell IgE-dependent activation inhibitor and the pharmaceutical composition for treatment and / or prevention of allergic diseases are extremely practical and suitable for daily use.
  • the IgE-dependent inhibitor of mast cell activation according to the present invention is the peptide (a) below ( A phosphorylated peptide).
  • Tyrosine residues preferably Y 1 , Y 2 and Y 3 are phosphorylated tyrosine residues, more preferably Y 1 , Y 2 and Y 3 are at least Y 1 and Y 3 are phosphorous
  • the oxidized tyrosine residue, more preferably Y 1 , Y 2 and Y 3 are all phosphorylated tyrosine residues.
  • Preferred examples of the amino acid sequence of the formula (I) include the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 below, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is more preferable.
  • KVPEDRV-Y 1 -EELNI-Y 2 -SAT-Y 3 -SELEDPG SEQ ID NO: 2 (However, in the amino acid sequence, Y 1 and Y 3 are phosphorylated tyrosine residues, and Y 2 represents an unphosphorylated tyrosine residue.)
  • KVPEDRV-Y 1 -EELNI-Y 2 -SAT-Y 3 -SELEDPG SEQ ID NO: 3 (However, in the amino acid sequence, Y 1 , Y 2 and Y 3 all represent phosphorylated tyrosine residues.)
  • “peptide” means a peptide composed of at least two amino acids bonded by peptide bonds, and includes oligopeptides, polypeptides, and the like.
  • a polypeptide in which a certain three-dimensional structure is formed is called a protein.
  • a protein is also included in the “peptide”. Therefore, the peptide contained in the inhibitor of the present invention can mean any of oligopeptides, polypeptides, and proteins.
  • the inhibitor of this invention may contain the peptide of the following (b) as stated above.
  • B A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by the formula (I) and having IgE-dependent activation inhibitory activity of mast cells.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is, for example, about 1 to 5 amino acids, preferably about 1 to 2 amino acids deleted or substituted. Or an added amino acid sequence, and is not limited.
  • the 8th, 14th, and 17th amino acid residues (Y 1 , Y 2 , Y 3 , respectively) in the amino acid sequence represented by the formula (I) are deleted or substituted. Or what is not added is preferable.
  • deletion, substitution, introduction of a mutation such as addition, mutagenesis kit utilizing site-directed mutagenesis, e.g., GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System ( Invitrogen), and TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.
  • site-directed mutagenesis e.g., GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System ( Invitrogen), and TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.
  • mutagenesis kit utilizing site-directed mutagenesis e.g., GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System ( Invitrogen), and TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-
  • the IgE-dependent activation inhibitory activity of mast cells, degranulation of mast cells by IgE dependent stimulation, production and cytokine production of arachidonic acid metabolites (prostaglandins D 2, etc.) is suppressed Activity (preferably, degranulation of mast cells by IgE-dependent stimulation), for example, histamine assay kit (for example, manufactured by Immunotech A Beckman Coulter, product name: histamine EIA kit), arachidon acid metabolite assay kit (e.g., Cayman Chemical Co., product name: PGD 2 MOX EIA kit), cytokine assay kit (e.g., R & D Systems, Inc., product name: TNF-alpha ELISA kit) can be measured by such Kill.
  • histamine assay kit for example, manufactured by Immunotech A Beckman Coulter, product name: histamine EIA kit
  • arachidon acid metabolite assay kit e.g., Cayman Chemical Co., product name
  • the mast cell is not limited, but is preferably a human mast cell.
  • the peptide of (a) or (b) contained in the inhibitor of the present invention is a peptide containing the amino acid sequence of the formula (I), or a peptide containing the deleted, substituted or added amino acid sequence
  • the number of residues of the constituent amino acids is not limited and is preferably 17 residues or more (in the case of the deleted amino acid, etc.), more preferably 25 residues or more, for example, 25 to 100 residues. Alternatively, it may be 25 to 50 residues, 25 to 40 residues, or 25 to 30 residues.
  • the peptide of (a) or (b) may be a peptide derived from a natural product or may be obtained by artificial chemical synthesis, and is not limited. Peptides obtained by artificial chemical synthesis are preferred because they are easy to produce and can be prepared in large quantities at a low cost. A peptide derived from a natural product is preferred because it often has no adverse effects such as cytotoxicity on cells other than cells (mast cells) targeted for suppression of IgE-dependent activation.
  • the method for phosphorylating the aforementioned tyrosine residues of Y 1 , Y 2 and Y 3 is not limited, and a known method can be adopted. For example, when a peptide is obtained by chemical synthesis, phosphorylation is performed in advance.
  • a desired tyrosine residue in the peptide can be phosphorylated.
  • Chemically synthesized peptides can be obtained using known peptide synthesis methods. Examples of the synthesis method include an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, a carboimidazole method, and a redox method.
  • the solid phase synthesis method and the liquid phase synthesis method can be applied to the synthesis.
  • a commercially available peptide synthesizer may be used.
  • the peptide can be purified by combining known purification methods such as chromatography.
  • known purification methods such as chromatography.
  • peptides derived from natural products include naturally occurring oligopeptides, polypeptides and proteins, or fragments of these.
  • a peptide derived from a natural product may be obtained directly from a natural product by a known recovery method and purification method, or a gene encoding the peptide is incorporated into various expression vectors by a known gene recombination technique. After being introduced into cells and expressed, they may be obtained by known recovery and purification methods.
  • the peptide may be produced by a system and obtained by a known recovery method and purification method, and is not limited.
  • the peptide (a) or (b) contained in the inhibitor of the present invention preferably has a cell membrane permeable peptide at the N-terminus.
  • the cell membrane-permeable peptide is preferably a signal peptide having cell membrane permeability of mast cells, and examples thereof include a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 below. Any peptide having cell membrane permeability of mast cells is included in the cell membrane-permeable peptide referred to in the present invention.
  • AAVLLPVLLAAP (SEQ ID NO: 4)
  • the peptide in which the cell membrane-permeable peptide (SEQ ID NO: 4) is bound to the N-terminus of the peptide (SEQ ID NO: 1) consisting of the amino acid sequence of formula (I) described above includes the amino acid sequence of the following formula (I ′) A peptide consisting of (SEQ ID NO: 5).
  • the amino acid description especially Y 1 , Y 2 , Y 3
  • the description described above for the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is applicable.
  • the inhibitor of the present invention can contain a derivative of the peptide together with or instead of the peptide of (a) or (b).
  • the derivatives are meant to include all those that can be prepared from the peptide of (a) or (b), for example, those in which some of the constituent amino acids are replaced with non-natural amino acids, Examples include amino acids (mainly their side chains) partially chemically modified.
  • the inhibitor of the present invention can contain the peptide of (a) or (b) and / or a salt of the peptide together with or instead of the peptide derivative.
  • the salt is preferably a physiologically acceptable acid addition salt or basic salt.
  • Acid addition salts include, for example, salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, or acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, apple Examples thereof include salts with organic acids such as acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • salts examples include salts with inorganic bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, and magnesium hydroxide, and salts with organic bases such as caffeine, piperidine, trimethylamine, and pyridine.
  • Salts can be prepared using a suitable acid such as hydrochloric acid or a suitable base such as sodium hydroxide. For example, it can be prepared by treatment using standard protocols in water or in a liquid containing an inert water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol or dioxane.
  • the inhibitor of the present invention may be composed of the above-mentioned peptide (a) or (b), a derivative thereof, or a salt thereof, or the peptide, a derivative thereof, or a salt thereof and another component. It may be included and is not limited. Examples of other components include buffers such as PBS and Tris-HCl, and additives such as sodium azide and glycerol. When other components are included, the content ratio can be appropriately set within a range in which the activity of increasing IgE-dependent activation suppression efficiency of mast cells by the peptide, derivative thereof, or salt thereof is not significantly hindered.
  • the peptide concentration is not limited, but is preferably 100 nM or more, more preferably 100 to 500 nM, still more preferably 500 to 1,000 nM, and even more preferably. It is 1,000 to 2,000 nM, particularly preferably 2,000 to 5,000 nM, and most preferably 5,000 nM.
  • the cells targeted for IgE-dependent activation inhibition by the inhibitor of the present invention may be any mast cells that can be involved in the development of allergic diseases, and are not particularly limited. Particularly, human-derived mast cells (human mast cells) Cell). In the present invention, a method for suppressing IgE-dependent activation of mast cells using the inhibitor of the present invention can also be provided.
  • the induction method is a method including a step of causing the inhibitor of the present invention to act on mast cells, and may include any other step, and is not limited.
  • the step of causing the inhibitor of the present invention to act preferably means a step of introducing the inhibitor of the present invention into the mast cell.
  • the aforementioned peptide (a) or (b), which is an active ingredient of the inhibitor of the present invention may be directly introduced into the cell. Alternatively, it may be introduced (gene transfer) in the state of DNA encoding the peptide (expressing the peptide), and is not limited.
  • DNA can be introduced using various known gene introduction methods such as liposome method (lipoplex method), polyplex method, peptide method, electroporation method (electroporation method), and viral vector method.
  • DNA, recombinant vector, transformant (1) DNA
  • DNA containing a base sequence encoding the amino acid sequence constituting the peptide of (a) or (b) is also included (however, in considering the DNA, phosphorylated tyrosine in the peptide Residues are treated as non-phosphorylated tyrosine residues.)
  • the DNA may be a DNA consisting of a base sequence encoding the peptide of (a) or (b), or may be a known base necessary for gene expression, including the base sequence in part.
  • the type of codon is not limited, and for example, it uses a codon generally used in mammals such as humans after transcription. It may be one using a codon generally used in microorganisms such as Escherichia coli and yeast, plants and the like, and can be appropriately selected or designed.
  • a DNA encoding a protein having suppression of IgE-dependent activation of mast cells is also included.
  • the stringent conditions are, for example, a salt (sodium) concentration of 150 to 900 mM, a temperature of 55 to 75 ° C., preferably a salt (sodium) concentration of 150 to 200 mM, and a temperature of 60 to 70. Refers to conditions at ° C.
  • a recombinant Vector Containing DNA In the present invention, a recombinant vector obtained by ligating (inserting) the DNA of the present invention into an appropriate vector is also included.
  • the vector for inserting the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA, and virus.
  • plasmid DNA include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, and plasmids derived from yeast.
  • phage DNA include ⁇ phage.
  • viruses include adenoviruses and retroviruses.
  • the recombinant vector of the present invention includes, in addition to a promoter and the DNA of the present invention, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), a selectable marker gene, a reporter gene, and the like.
  • a selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, and a neomycin resistance gene.
  • reporter genes include genes such as green fluorescent protein (GFP) or mutants thereof (fluorescent proteins such as EGFP, BFP, YFP), luciferase, alkaline phosphatase, LacZ and the like.
  • the present invention includes a transformant that can be obtained by introducing the above-described recombinant vector of the present invention into a host so that the target gene can be expressed.
  • the host is not limited as long as it can express the DNA of the present invention, and for example, bacteria and yeasts well known in the art can be used.
  • the recombinant vector of the present invention can autonomously replicate in the bacterium, and can contain a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence.
  • bacteria include Escherichia coli.
  • As the promoter for example, a lac promoter is used.
  • vector introduction methods for bacteria include various known introduction methods such as the calcium ion method.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae is used.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast, and examples thereof include the gal1 promoter.
  • the method for introducing a vector into yeast include an electroporation method and a spheroplast method. 4).
  • Pharmaceutical Composition The inhibitor of the present invention (which can also be considered as the aforementioned peptides (a) and (b), derivatives thereof, or salts thereof themselves) is useful as an active ingredient contained in a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition is useful as a pharmaceutical composition for treating and / or preventing allergic diseases.
  • the inhibitor of the present invention almost completely suppresses IgE-dependent activation of mast cells (particularly human mast cells) and allergic reactions such as degranulation (release of specific granules such as histamine). Therefore, it is preferably used for the treatment and / or prevention of various allergic diseases. That is, the inhibitor of the present invention is useful as an active ingredient contained in a therapeutic and / or prophylactic agent for allergic diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably provided in the form of a pharmaceutical composition comprising the inhibitor of the present invention as an active ingredient and further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, extenders, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners, taste masking Agents, solubilizers or other additives.
  • pharmaceutical compositions in the form of injections, solutions, capsules, suspensions, emulsions or syrups can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are prescribed by conventional methods.
  • an injection it can be produced by dissolving or suspending it in a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection.
  • a colloidal dispersion system can also be used. The colloidal dispersion system is expected to increase the in vivo stability of the peptide or to efficiently transport the compound to a specific organ, tissue or cell.
  • the colloidal dispersion system is not particularly limited as long as it is usually used, but polyethylene glycol, polymer composite, polymer aggregate, nanocapsule, microsphere, bead, and oil-in-water emulsifier, micelle, mixed micelle And lipid-based dispersion systems including liposomes, preferably liposomes or artificial membrane vesicles that are effective in efficiently transporting compounds to specific organs, tissues or cells.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is the patient's age, sex, body weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the inhibitor of the present invention contained in the pharmaceutical composition (the aforementioned (a) and It may be different depending on the type of the peptide (b).
  • a dose of 100 ⁇ g to 100 mg per 1 kg body weight can be administered to a human patient once to several times per day on an average per day.
  • the administration form include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and intraperitoneal injection, and intravenous injection is preferred.
  • injections can be prepared as non-aqueous diluents (eg, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions, and emulsions.
  • Such sterilization of the injection can be performed by filtration sterilization using a filter, blending of a bactericide, and the like.
  • the injection can be produced as a form prepared at the time of use. That is, it can be used as a sterile solid composition by lyophilization, etc., and dissolved in sterile water for injection or other solvent before use.
  • the present invention also relates to the inhibitor of the present invention (or the peptides (a) and (b) described above, derivatives thereof, or the like) for producing a medicament (drug) for treating and / or preventing allergic diseases. Of salt).
  • the present invention also provides the inhibitor of the present invention for treating and / or preventing allergic diseases (or the peptides (a) and (b) described above, derivatives thereof or salts thereof). is there. Furthermore, the present invention is an allergy characterized by using the inhibitor of the present invention (or the peptides (a) and (b) described above, derivatives thereof or salts thereof) (that is, administering to a patient).
  • the present invention provides a method for the treatment and / or prevention of sexual diseases, and also provides the inhibitor of the present invention (or the peptides of (a) and (b) described above) for treating and / or preventing allergic diseases. , Derivatives thereof or salts thereof).
  • the allergic disease that can be treated and / or prevented is not limited, but for example, seasonal allergic rhinitis, perennial allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic asthma, atopic dermatitis
  • Preferable examples include drug allergy such as acute urticaria, chronic urticaria, anaphylaxis, penicillin, insect allergy such as bee allergy, atopic eczema, food allergy, mastocytoma, interstitial cystitis, irritable bowel syndrome, etc.
  • drug allergy such as acute urticaria, chronic urticaria, anaphylaxis, penicillin, insect allergy such as bee allergy, atopic eczema, food allergy, mastocytoma, interstitial cystitis, irritable bowel syndrome, etc.
  • seasonal allergic rhinitis, perennial allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic asthma, acute urticaria, bee allergy and food allergy are more preferred. 5.
  • Kit in the present invention, there is also provided a kit for suppressing IgE-dependent activation of mast cells, which comprises the inhibitor of the present invention as a constituent component. Since the kit of the present invention can be used to suppress IgE-dependent activation easily and effectively against mast cells, it is limited to the fields of treatment and / or prevention of various allergic diseases described above. In addition, it is extremely useful in various fields such as experiments and research. Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • peptide synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation, product name: PSSM-8
  • Peptides A to D are the amino acid sequences of amino acids 212 to 236 of the human high affinity IgE receptor (Fc ⁇ RI) ⁇ chain (SEQ ID NO: 17; 244 amino acid residues in total; GenBank accession number: BAA01440).
  • AAVLLPVLLAAP (SEQ ID NO: 4)
  • the base sequence (GenBank accession number: D10583) containing the cDNA encoding the amino acid sequence of the Fc ⁇ RI ⁇ chain is as shown in SEQ ID NO: 16.
  • peptides A to D the 8th, 14th and 18th tyrosine residues of a total of 25 amino acid residues derived from Fc ⁇ RI ⁇ chain are all non-phosphorylated in peptide A, and in peptide B Only the 14th was phosphorylated, peptide 8 was phosphorylated only at 8th and 18th, and peptide D was all phosphorylated. In peptides B to D, phosphorylated tyrosine residues were denoted as “Y (p)”.
  • phosphorylation of a desired tyrosine residue is carried out using a tyrosine residue phosphorylated in advance (commercially available product, manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd., product name: Fmoc-Tyr ⁇ PO (OBzl) OH ⁇ -OH ) Was subjected to peptide synthesis.
  • Peptides E to G use the first to second amino acid sequences of the Fc ⁇ RI ⁇ chain in peptide E instead of using the 212th to 236th amino acid sequences of the amino acid sequence of the Fc ⁇ RI ⁇ chain (SEQ ID NO: 17) in peptide A.
  • the 25th amino acid sequence (N-terminal) is the amino acid sequence from the 202nd to the 230th amino acid sequence of the Fc ⁇ RI ⁇ chain in peptide F, and the 220th to 244th amino acids of the amino acid sequence of the Fc ⁇ RI ⁇ chain in peptide G. It was synthesized in the same manner as peptide A except that the sequence was used.
  • x500 and x1000 correspond to peptide concentrations of 2 ⁇ M and 1 ⁇ M, respectively, and the numerical values in the histogram are the ratios of the intensity of each peptide to isotype control (MFI). From the results in FIG. 1, it was confirmed that all of peptides A to G were introduced into human mast cells. In the above observation, observation using a confocal laser microscope instead of FACS was performed (peptide concentration: 2 ⁇ M). The results are shown in FIG. From the results of FIG. 2, it was confirmed that all of peptides A to G were introduced into the cytoplasm of human mast cells, particularly in the vicinity of the cell membrane.
  • FIG. 3 The results are shown in FIG. In FIG. 3, “Spon” means that incubated for 30 minutes at 37 ° C. without adding anti-IgE antibody or calcium ionophore, “ ⁇ IgE” indicates anti-IgE antibody stimulation, and “A23187” indicates calcium ionophore. A23187 means stimulation. From the results shown in FIG. 3, it was confirmed that peptide D and peptide C statistically significantly suppressed histamine release from IgE-dependent mast cells. Statistical processing used unpaired Student's t-test.
  • Peptides A, D and E synthesized in Example 1 were synthesized (and optionally phosphorylated) by the same method as in Example 1 except for the cell membrane permeable peptide (AAVLLPVLLAAP (SEQ ID NO: 4)) part. And peptides A ′, D ′ and E ′, respectively. Biotin was bound to the N-terminus of these peptides A ′, D ′ and E ′.
  • biotinylated peptides A ′, D ′ and E ′ (each 5 ⁇ M) and 3 ⁇ 10 6 U937 cells and human mast cell lysates were incubated at 4 ° C. for 2 hours, centrifuged, and the precipitate was collected. After washing, this was electrophoresed (Western blot: WB) and reacted with an anti-Lyn monoclonal antibody (anti-Lyn) to detect the association between each peptide and Lyn.
  • WB Western blot
  • anti-Lyn anti-Lyn monoclonal antibody
  • Lyn that is to associate with the endogenous Fc ⁇ RI ⁇ chain and act as a signal transduction molecule in the mast cell is associated with peptide D ′, and peptide D ′ acts as dominant negative, thereby activating IgE-dependent human mast cells. It was shown that
  • mast cell IgE-dependent activation inhibitor preferably human mast cells
  • pharmaceutical composition for treatment and / or prevention of allergic disease and allergic disease treatment and It is possible to provide a prophylactic method and the like, as well as a phosphorylated peptide that can be used in these methods.
  • the phosphorylated peptide of the present invention can almost completely suppress IgE-dependent activation of the cells, and thus allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic properties This is extremely useful in that it can be used as an active ingredient of therapeutic agents for various allergic diseases such as asthma and atopic dermatitis.
  • SEQ ID NO: 1 Peptide SEQ ID NO: 1: Location: 8, 14, 18 tyrosine (Tyr) residues are phosphorylated or non-phosphorylated residues, at least one being a phosphorylated tyrosine residue.
  • SEQ ID NO: 2 Peptide SEQ ID NO: 2: Location: The tyrosine (Tyr) residues at 8, 18 are phosphorylated tyrosine residues.
  • SEQ ID NO: 3 Peptide SEQ ID NO: 3: Location: Tyrosine (Tyr) residues at 8, 14, 18 are phosphorylated tyrosine residues.
  • SEQ ID NO: 4 Peptide SEQ ID NO: 5: Peptide SEQ ID NO: 5: Tyrosine (Tyr) residues at positions 20, 26 and 30 are phosphorylated or non-phosphorylated residues, and at least one is a phosphorylated tyrosine residue is there.
  • SEQ ID NO: 6 Peptide SEQ ID NO: 7: Peptide SEQ ID NO: 7: The tyrosine (Tyr) residue at position 26 is a phosphorylated tyrosine residue.
  • SEQ ID NO: 9 Peptide SEQ ID NO: 9: Tyrosine (Tyr) residues at positions 20, 26 and 30 are phosphorylated tyrosine residues.
  • SEQ ID NO: 10 Peptide SEQ ID NO: 11: Peptide SEQ ID NO: 12: Peptide SEQ ID NO: 13: Peptide SEQ ID NO: 14: Peptide SEQ ID NO: 14: Tyrosine (Tyr) residues at positions 8, 14, 18 are phosphorylated tyrosine residues It is.
  • SEQ ID NO: 15 peptide

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Abstract

　本発明は、マスト細胞のIgE依存性活性化抑制剤、マスト細胞のIgE依存性活性化抑制方法、アレルギー性疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物、及びアレルギー性疾患の治療及び／又は予防方法等、並びにこれらに用いることができるリン酸化ペプチドを提供する。本発明に係るマスト細胞のIgE依存性活性化抑制剤は、以下の(a)又は(b)のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする。(a) 式：KVPEDRV-Y1-EELNI-Y2-SAT-Y3-SELEDPG (Ｉ) で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。(b) 上記式(Ｉ)で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マスト細胞のIgE依存性活性化抑制活性を有するペプチド。

Description

アレルギー性疾患治療薬
　本発明は、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体β鎖のＩＴＡＭモチーフのチロシン残基をリン酸化したペプチド、及びこれを含むアレルギー性疾患治療薬等に関する。
　マスト細胞は、即時型のアレルギー反応を惹起するのみならず、マスト細胞が産生し放出するケモカイン、サイトカイン及びロイコトリエン等のメディエーターにより、好塩基球及びＴ細胞等の炎症細胞をアレルギー炎症局所へ動員する。花粉症等の鼻粘膜のアレルギー炎症局所では、マスト細胞はＢ細胞、Ｔ細胞及び樹状細胞等と直接の相互作用を行い、鼻粘膜局所におけるＢ細胞及びＴ細胞の増殖並びにＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）の産生亢進が惹起さる。その産生されたＩｇＥにより、マスト細胞や樹状細胞におけるヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）の発現が増強し、これらの細胞の抗原に対する感受性、すなわち過敏性と過剰な反応性が、ますます増幅される経路が形成される。従って、炎症のコンダクターとしてのマスト細胞の制御が、アレルギー性疾患治療の一つの鍵となる。
　そこで、げっ歯類（マウス等）のマスト細胞の活性化を抑制する多くのマスト細胞活性化阻害剤（クロモグリク酸及びアドレナリンβ２刺激薬等）が開発され、抗アレルギー薬として臨床に用いられている（“Ｏｋａｙａｍａ　Ｙ，Ｂｅｎｙｏｎ　ＲＣ，Ｒｅｅｓ　ＰＨ，Ｌｏｗｍａｎ　ＭＡ，Ｈｉｌｌｅｒ　Ｋ，Ｃｈｕｒｃｈ　ＭＫ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ　ａｎｄ　ｎｅｄｏｃｒｏｍｉｌ　ｓｏｄｉｕｍ　ｏｎ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｍａｓｔ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｓｋｉｎ，ｌｕｎｇ，ｔｏｎｓｉｌ，ａｄｅｎｏｉｄ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ａｌｌｅｒｇｙ　２２（３）：４０１−４０９，１９９２．”等を参照）。また、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの結合阻害を目的とした薬剤として、既にヒト化された抗ヒトＩｇＥ抗体（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）が実用化されており、重症気管支喘息の治療に有効であることが示されている（“Ｈｏｌｇａｔｅ，Ａ．
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
ａｎｄ　ｓａｆｅｔｙ　ｏｆ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｎｔｉ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎ　ｓｅｖｅｒｅ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ａｓｔｈｍａ，Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ａｌｌｅｒｇｙ　３４：６３２−６３８，２００４．”等を参照）。さらに、アレルギー性疾患治療薬として、ヒスタミンに対してはヒスタミン受容体拮抗薬、ロイコトリエンに対してはロイコトリエン受容体拮抗薬、サイトカイン産生に対してはステロイドといった、それぞれのメディエーターの阻害剤が用いられている（“Ｃｏｈｎ　Ｌ，Ｅｌｉａｓ　ＪＡ，Ｃｈｕｐｐ　ＧＬ．Ａｓｔｈｍａ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２２：７８９−８１５，２００４．”等を参照）。
　しかしながら、クロモグリク酸等のいわゆる抗アレルギー薬は、げっ歯類のマスト細胞脱顆粒を低濃度で抑制するが、効果は極めて限定的であり、ヒトのマスト細胞の活性化に対してはほとんど効果が認められない。アドレナリンβ２刺激薬は、ヒトマスト細胞の脱顆粒を抑制するが、容易に脱感作を来たし、長時間使用すると効果は消失する。また、ヒト化された抗ヒトＩｇＥ抗体（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）は、非常に高価であるため、通常のアレルギー性疾患治療薬では効果が認められない重症気管支喘息等の特定の疾患に、適用が限られている。さらに、ヒスタミンやロイコトリエンといった一つ一つのメディエーターを阻害しても、その治療効果には限界があった。
　このような状況下において、ヒトマスト細胞におけるＩｇＥ依存性活性化（脱顆粒等）のアレルギー反応を抑制し、かつ脱感作が見られず、さらに生産が容易でコストを安価に抑えることができるアレルギー性疾患の治療薬及び予防薬の開発が望まれていた。
　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、リン酸化ペプチド、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制剤、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制方法、アレルギー性疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物、及びアレルギー性疾患の治療及び／又は予防方法等を提供するものである。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
　（ａ）下記式（Ｉ）：
　ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ　（配列番号１）　　（Ｉ）
　（Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、いずれもチロシン残基を表し且つこれらの少なくとも１つがリン酸化されたチロシン残基である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
　（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制活性を有するペプチド。
　本発明のペプチド、その誘導体又はこれらの塩（以下、ペプチド等ということがある）は、例えば、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列中、前記Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち少なくともＹ１及びＹ３がリン酸化されたチロシン残基であってもよい。
　本発明のペプチド等は、例えば、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドが、Ｎ末端に細胞膜透過性ペプチドを有するものであってもよい。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制剤。
　（ａ）下記式（Ｉ）：
　ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ　（配列番号１）　　（Ｉ）
　（Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、いずれもチロシン残基を表し且つこれらの少なくとも１つがリン酸化されたチロシン残基である。Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
　（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制活性を有するペプチド。
　本発明の抑制剤は、例えば、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列中、前記Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち少なくともＹ１及びＹ３がリン酸化されたチロシン残基であってもよい。
　本発明の抑制剤は、例えば、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドが、Ｎ末端に細胞膜透過性ペプチドを有するものであってもよい。
　本発明の抑制剤は、例えば、前記マスト細胞がヒトマスト細胞であってもよい。
（３）マスト細胞に対して、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を作用させる工程を含む、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制方法。
　（ａ）下記式（Ｉ）：
　ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ　（配列番号１）　　（Ｉ）
　（Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、いずれもチロシン残基を表し且つこれらの少なくとも１つがリン酸化されたチロシン残基である。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
　（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制活性を有するペプチド。
　本発明の抑制方法は、例えば、前記作用させる工程が、マスト細胞に前記（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を導入する工程であってもよい。
　本発明の抑制方法は、例えば、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列中、前記Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち少なくともＹ１及びＹ３がリン酸化されたチロシン残基であってもよい。
　本発明の抑制方法は、例えば、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドが、Ｎ末端に細胞膜透過性ペプチドを有するものであってもよい。
　本発明の抑制方法は、例えば、前記マスト細胞がヒトマスト細胞であってもよい。
（４）上記（２）の抑制剤を含む、アレルギー性疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
　本発明の医薬組成物において、前記アレルギー性疾患としては、例えば、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息及びアトピー性皮膚炎からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
　図１は、ヒトマスト細胞への各ペプチドの導入をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により確認した結果を示す図である。
　図２は、ヒトマスト細胞への各ペプチドの導入を共焦点レーザー顕微鏡により確認した結果を示す図である。
　図３は、ヒトマスト細胞からのヒスタミン遊離の抑制効果の分析結果を示す図である。
　図４は、ヒトマスト細胞のプロスタグランジンＤ２産生の抑制効果の分析結果を示す図である。
　図５は、ＩｇＥ依存性ヒトマスト細胞活性化の抑制機序の解析結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００９−２０６３２４号明細書（２００９年９月７日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
　ヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）は、α鎖、β鎖及び２つのγ鎖からなる四量体の形で細胞膜上に発現しており、そのうちＦｃεＲＩβ鎖がＩｇＥ受容体シグナルの増幅因子であることは、本発明者らにより既にマウスマスト細胞（マウス肥満細胞）の実験系で報告されていた。ヒトマスト細胞（ヒト肥満細胞）にウイルスベクターを用いてＦｃεＲＩβ鎖の遺伝子発現を抑制させると、ＩｇＥ依存性の刺激による脱顆粒、アラキドン酸代謝物の産生、及びサイトカインの産生が抑制されることを、本発明者は確認した。
　そこで、本発明者は、ＦｃεＲＩβ鎖の責任領域を追求したところ、ＦｃεＲＩβ鎖のＩＴＡＭモチーフであることを見つけ出した。さらに、本発明者は、このＩＴＡＭモチーフ中の特定のアミノ酸残基（具体的にはチロシン残基）をリン酸化させたペプチドを細胞膜透過性ペプチドと結合させて、ヒトマスト細胞に導入すると、当該細胞のＩｇＥ依存性活性化をほぼ完全に抑制し、脱顆粒（ヒスタミン等の特異顆粒の放出）等のアレルギー反応を効果的に抑えることを確認した。本発明はこのような新規な知見に基づき見出されたものである。
　従来知られているマスト細胞活性化阻害薬は、げっ歯類（マウス等）のマスト細胞のＩｇＥ依存性活性化は抑制するが、ヒトのマスト細胞の活性化に対する抑制効果は認められていない。また、ヒトマスト細胞の活性化を阻害するものとしては、唯一、ヒト化抗ヒトＩｇＥ抗体（ＩｇＥとＦｃεＲＩとの結合を阻害）が知られているが、極めて高価であるため、日常的な使用には適さず、実用性に欠けるものであった。
　これに対し、本発明は、上述の通り、特定のリン酸化ペプチド、すなわちチロシン残基をリン酸化させたＦｃεＲＩβ鎖のＩＴＡＭモチーフを有するペプチドが、ヒトマスト細胞におけるＩｇＥ依存性活性化、ひいては脱顆粒等のアレルギー反応を、ほぼ完全に抑制し得るという新規な知見に基づき完成されたものであり、極めて有用性の高いものである。また、本発明のペプチドは、化学合成により得ることができ、前述した抗ヒトＩｇＥ抗体に比べて生産が容易であり且つコストを非常に安価に抑えることができるため、当該ペプチド、並びにこれを用いたマスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制剤、及びアレルギー性疾患治療用及び／又は予防用医薬組成物等は、日常的な使用用途にも適する極めて実用性に優れたものである。
２．マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制剤
　本発明に係るマスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制剤（以下、本発明の抑制剤という。）は、先に述べた通り、下記（ａ）のペプチド（リン酸化ペプチド）を含むものである。
　（ａ）下記式（Ｉ）：
　ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ　（配列番号１）　　（Ｉ）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
　上記（ａ）のペプチド中、式（Ｉ）のアミノ酸配列は、アミノ酸の１文字表記を用いて示したものであり、例えば、Ｋはリジン（Ｌｙｓ）、Ｖはバリン（Ｖａｌ）、Ｅはグルタミン酸（Ｇｌｕ）を意味する。
　ここで、式（Ｉ）のアミノ酸配列中、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、いずれもチロシン（Ｔｙｒ）残基を表すが、これらＹ１、Ｙ２及びＹ３は少なくとも１つがリン酸化されたチロシン残基であり、好ましくはＹ１、Ｙ２及びＹ３は少なくとも２つがリン酸化されたチロシン残基、より好ましくはＹ１、Ｙ２及びＹ３のうち少なくともＹ１及びＹ３がリン酸化されたチロシン残基、さらに好ましくはＹ１、Ｙ２及びＹ３がすべてリン酸化されたチロシン残基である。本明細書では、他のアミノ酸配列を示す場合も、式（Ｉ）と同様に１文字表記で表すことがある。
　前記式（Ｉ）のアミノ酸配列としては、例えば、以下の配列番号２及び配列番号３に示されるアミノ酸配列が好ましく挙げられ、なかでも配列番号２に示されるアミノ酸配列がより好ましい。
　ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ　（配列番号２）
　（但し、当該アミノ酸配列中、Ｙ１及びＹ３はリン酸化されたチロシン残基であり、Ｙ２はリン酸化されていないチロシン残基を表す。）
　ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ　（配列番号３）
　（但し、当該アミノ酸配列中、Ｙ１、Ｙ２及びＹ３はいずれもリン酸化されたチロシン残基を表す。）
　本発明において、「ペプチド」とは、少なくとも２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合して構成されたものを意味し、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。さらに、ポリペプチドが一定の立体構造を形成したものはタンパク質と呼ばれるが、本発明においては、このようなタンパク質も上記「ペプチド」に含まれるものとする。従って、本発明の抑制剤に含まれるペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質のいずれをも意味し得るものである。
　また本発明の抑制剤は、先に述べた通り、下記（ｂ）のペプチドを含むものであってもよい。
　（ｂ）前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制活性を有するペプチド。
　ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１個~５個程度、好ましくは１個~２個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられ、限定はされない。ただし本発明においては、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列における第８番目、第１４番目、第１７番目のアミノ酸残基（それぞれ順に、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３）が欠失、置換又は付加されていないものが好ましい。上記欠失、置換、付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、及びＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されたペプチドであるかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにＸ線及びＮＭＲ等による構造解析法などを用いて確認することができる。
　本発明において、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制活性とは、ＩｇＥ依存性の刺激によるマスト細胞の脱顆粒、アラキドン酸代謝物（プロスタグランジンＤ２等）の産生及びサイトカインの産生が抑制される活性（好ましくは、ＩｇＥ依存性の刺激によるマスト細胞の脱顆粒）を意味し、当該活性は、例えば、ヒスタミンアッセイキット（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ　Ａ　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、製品名：ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ＥＩＡ　ｋｉｔ）、アラキドン酸代謝物アッセイキット（例えば、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、製品名：ＰＧＤ２　ＭＯＸ　ＥＩＡ　ｋｉｔ）、サイトカインアッセイキット（例えば、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品名：ＴＮＦ−ａｌｐｈａ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ）等により測定することができる。なお、本発明において、マスト細胞としては、限定はされないが、ヒトマスト細胞であることが好ましい。
　本発明の抑制剤に含まれる前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドは、前記式（Ｉ）のアミノ酸配列を含むペプチド、又は前記欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドである限り、その構成アミノ酸の残基数は限定されず、好ましくは１７残基以上（前記欠失されたアミノ酸の場合等）、より好ましくは２５残基以上であり、例えば２５~１００残基であってもよいし、２５~５０残基であってもよいし、２５~４０残基であってもよいし、２５~３０残基であってもよい。
　前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドは、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされない。人工的に化学合成して得られるペプチドである場合は、生産が容易であり、コストを安価に抑えて大量調製することができるため好ましい。天然物由来のペプチドである場合は、ＩｇＥ依存性活性化抑制の目的とする細胞（マスト細胞）以外の細胞に対する細胞毒性等の悪影響がない場合が多いため好ましい。なお、前述したＹ１、Ｙ２及びＹ３のチロシン残基をリン酸化する方法としては、限定はされず、公知の方法が採用できるが、例えば、化学合成によりペプチドを得る場合は、予めリン酸化したチロシン残基（市販品等）を用いることにより、ペプチド中の所望のチロシン残基をリン酸化した状態にすることもできる。
　化学合成ペプチドは、公知のペプチド合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてペプチドを精製することができる。
　また、天然物由来のペプチドとしては、天然に存在するオリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、又はこれらを断片化した状態のもの等が挙げられる。天然物由来のペプチドは、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該ペプチドをコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）及びＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該ペプチドを産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
　本発明の抑制剤に含まれる前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドは、Ｎ末端に細胞膜透過性ペプチドを有するものであることが好ましい。この細胞膜透過性ペプチドとしては、具体的には、マスト細胞の細胞膜透過性を有するシグナルペプチドであることが好ましく、例えば下記の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられるが、限定はされず、マスト細胞の細胞膜透過性を有するペプチドであれば、いずれも本発明でいう細胞膜透過性ペプチドに含まれるものとする。
　ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号４）
　上記細胞膜透過性ペプチド（配列番号４）が、前述した式（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１）のＮ末端に結合しているペプチドとしては、下記式（Ｉ’）のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号５）が挙げられる。なお、式（Ｉ）のアミノ酸配列からなるペプチド中のアミノ酸表記（特に、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３）に関しては、配列番号１に示されるアミノ酸配列について前述した説明が適用できる。
　ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ
　（配列番号５）
　本発明の抑制剤は、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドとともに又はそれに代えて、当該ペプチドの誘導体を含むことができる。当該誘導体とは、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドに由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸（主にその側鎖）の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。
　本発明の抑制剤は、前記（ａ）或いは（ｂ）のペプチド、及び／又は当該ペプチドの誘導体とともに又はそれに代えて、当該ペプチド及び／又は当該誘導体の塩を含むことができる。当該塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
　塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製することができる。
　本発明の抑制剤は、上述した（ａ）若しくは（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩からなるものであってもよいし、当該ペプチド、その誘導体又はこれらの塩と他の成分とを含むものであってもよく、限定はされない。他の成分としては、例えば、ＰＢＳ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、並びにアジ化ナトリウム及びグリセロール等の添加剤などが挙げられる。他の成分を含む場合、その含有割合は、上記ペプチド、その誘導体又はこれらの塩によるマスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制効率の上昇活性が著しく妨げられない範囲で、適宜設定することができる。具体的には、上記ペプチドの溶液で用いる場合、ペプチド濃度は、限定はされないが、１００ｎＭ以上であることが好ましく、より好ましくは１００~５００ｎＭ、さらに好ましくは５００~１，０００ｎＭ、さらにより好ましくは１，０００~２，０００ｎＭ、特に好ましくは２，０００~５，０００ｎＭ、最も好ましくは５，０００ｎＭである。
　本発明の抑制剤による、ＩｇＥ依存性活性化抑制の対象となる細胞としては、アレルギー性疾患の発症に関与し得るマスト細胞であればよく、限定はされないが、特にヒト由来のマスト細胞（ヒトマスト細胞）であることが好ましい。
　本発明においては、本発明の抑制剤を用いる、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制方法も提供することができる。当該誘導方法は、マスト細胞に対して本発明の抑制剤を作用させる工程を含む方法であり、それ以外に何らかの工程を含むものであってもよく、限定はされない。本発明の抑制剤を作用させる工程とは、マスト細胞の細胞内に本発明の抑制剤を導入する工程ことを意味することが好ましい。なお、マスト細胞内に本発明の抑制剤を導入する場合は、本発明の抑制剤の有効成分である前述した（ａ）又は（ｂ）のペプチドを、当該細胞内に直接導入してもよいし、あるいは当該ペプチドをコードする（当該ペプチドを発現可能な）ＤＮＡの状態で導入（遺伝子導入）してもよく、限定はされない。ＤＮＡの導入は、リポソーム法（リポプレックス法）、ポリプレックス法、ペプチド法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、及びウイルスベクター法などの公知の各種遺伝子導入方法を用いて行うことができる。
３．ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体
（１）ＤＮＡ
　本発明においては、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡも包含される（但し、当該ＤＮＡを考慮するに当たっては、上記ペプチド中のリン酸化チロシン残基は非リン酸化チロシン残基であるとして扱う。）。当該ＤＮＡは、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡであってもよいし、あるいは、当該塩基配列を一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）を含んでなるＤＮＡであってもよく、限定はされない。なお、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする塩基配列では、コドンの種類は限定されず、例えば、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよいし、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよく、適宜選択又は設計することができる。
　また本発明においては、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制を有するタンパク質をコードするＤＮＡも包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、塩（ナトリウム）濃度が１５０~９００ｍＭであり、温度が５５~７５℃、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が１５０~２００ｍＭであり、温度が６０~７０℃での条件をいう。
（２）ＤＮＡを含む組換えベクター
　本発明においては、適当なベクターに上記本発明のＤＮＡを連結（挿入）することにより得られる組換えベクターも包含される。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルス等が挙げられる。
　プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。またウイルスとしてはアデノウイルスやレトロウイルスなどが挙げられる。
　本発明の組換えベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子などを連結することができる。なお、選択マーカー遺伝子としては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体（ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ＬａｃＺ等の遺伝子が挙げられる。
（３）形質転換体
　本発明においては、上記本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入して得ることができる形質転換体も包含される。宿主としては、本発明のＤＮＡを発現し得るものであれば限定されず、例えば、当該分野において周知の細菌、酵母等を用いることができる。
　細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含めることができる。細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）などが挙げられる。プロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーターなどが用いられる。細菌へのベクター導入法としては、公知の各種導入方法、例えばカルシウムイオン法等が挙げられる。
　酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。酵母へのベクター導入法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
４．医薬組成物
　本発明の抑制剤（前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩そのものと考えることもできる。）は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。
　当該医薬組成物は、アレルギー性疾患の治療用及び／又は予防用の医薬組成物として有用である。特に、本発明の抑制剤は、マスト細胞（特にヒトマスト細胞）に対して、当該細胞のＩｇＥ依存性活性化をほぼ完全に抑制し、脱顆粒（ヒスタミン等の特異顆粒の放出）等のアレルギー反応を効果的に抑制する活性を有するものであるため、各種アレルギー性疾患の治療用及び／又は予防用に使用されることが好ましい。すなわち、本発明の抑制剤は、アレルギー性疾患の治療剤及び／又は予防剤に含まれる有効成分として有用なものである。
　本発明の医薬組成物は、本発明の抑制剤を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
　「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。また、本発明の抑制剤（前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド）を生体内に投与する場合は、コロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、上記ペプチドの生体内の安定性を高めたり、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞である。
　本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の抑制剤（前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド）の種類などにより異なっていてもよい。通常、成人一人あたり、一回につき１００μｇ~５０００ｍｇの範囲で投与することができるが、限定はされない。
　例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１００μｇ~１００ｍｇの量を、１日平均あたり１回~数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
　なお、本発明は、アレルギー性疾患を治療及び／又は予防する医薬（薬剤）を製造するための、前記本発明の抑制剤（あるいは前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩）の使用を提供するものでもある。また、本発明は、アレルギー性疾患の治療用及び／又は予防用の前記本発明の抑制剤（あるいは前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩）を提供するものでもある。
　さらに、本発明は、前記本発明の抑制剤（あるいは前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩）を用いること（すなわち患者に投与すること）を特徴とする、アレルギー性疾患の治療及び／又は予防方法を提供するものであり、また、アレルギー性疾患を治療及び／又は予防するための、前記本発明の抑制剤（あるいは前述した（ａ）及び（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩）の使用を提供するものでもある。
　本発明において、治療及び／又は予防の対象となり得るアレルギー性疾患としては、限定はされないが、例えば、季節性アレルギー性鼻炎、通年性アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、急性蕁麻疹、慢性蕁麻疹、アナフィラキシー、ペニシリンなどの薬剤アレルギー、蜂アレルギーなどの昆虫アレルギー、アトピー性湿疹、食物アレルギー、肥満細胞腫、間質性膀胱炎、過敏性大腸症候群等が好ましく挙げられ、中でも、季節性アレルギー性鼻炎、通年性アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、急性蕁麻疹、蜂アレルギー、食物アレルギーがより好ましい。
５．キット
　本発明においては、構成成分として本発明の抑制剤を含むことを特徴とする、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制用キットも提供される。本発明のキットは、マスト細胞に対して、簡便に且つ効果的にＩｇＥ依存性活性化抑制を行うために用いることができるため、前述した各種アレルギー性疾患の治療及び／又は予防の分野に限らず、各種実験・研究等の分野においても極めて有用性が高いものである。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜ペプチドの合成＞
　ペプチド合成機（島津製作所製、製品名：ＰＳＳＭ−８）を用いて以下のペプチドＡ~Ｇを合成し、各ペプチドのＣ末端をＦＩＴＣ標識した。
　ペプチドＡ~Ｄは、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）β鎖のアミノ酸配列（配列番号１７；計２４４アミノ酸残基；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＡＡ０１４４０）の第２１２番目~第２３６番目のアミノ酸配列（計２５アミノ酸残基）のＮ末端に、細胞膜透過性ペプチド（ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号４））を結合させたアミノ酸配列からなるペプチドである。なお、上記ＦｃεＲＩβ鎖のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含む塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｄ１０５８３）については配列番号１６に示す通りである。
　但し、ペプチドＡ~Ｄ中、ＦｃεＲＩβ鎖由来の計２５アミノ酸残基からなるペプチド部分の第８番目、第１４番目及び第１８番目のチロシン残基が、ペプチドＡでは全て非リン酸化、ペプチドＢでは第１４番目のみリン酸化、ペプチドＣでは第８番目及び第１８番目のみリン酸化、ペプチドＤではすべてリン酸化されたものとなるようにした。ペプチドＢ~Ｄ中、リン酸化されたチロシン残基は「Ｙ（ｐ）」と表記した。なお、所望のチロシン残基のリン酸化は、予めそのようにリン酸化したチロシン残基（市販品、渡辺化学工業（株）社製、製品名：Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ｛ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ｝−ＯＨ）をペプチド合成に供することにより達成した。
　ペプチドＥ~Ｇは、ペプチドＡにおいてＦｃεＲＩβ鎖のアミノ酸配列（配列番号１７）の第２１２番目~第２３６番目のアミノ酸配列を用いた代わりに、ペプチドＥではＦｃεＲＩβ鎖のアミノ酸配列の第１番目~第２５番目のアミノ酸配列（Ｎ末端）を、ペプチドＦではＦｃεＲＩβ鎖のアミノ酸配列の第２０２番目~第２３０番目のアミノ酸配列を、ペプチドＧではＦｃεＲＩβ鎖のアミノ酸配列の第２２０番目~第２４４番目のアミノ酸配列を用いた以外は、ペプチドＡと同様にして合成した。
　・ペプチドＡ（配列番号６）
　ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＫＶＰＥＤＲＶＹＥＥＬＮＩＹＳＡＴＹＳＥＬＥＤＰＧ−ＦＩＴＣ
　・ペプチドＢ（配列番号７）
　ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＫＶＰＥＤＲＶＹＥＥＬＮＩＹ（ｐ）ＳＡＴＹＳＥＬＥＤＰＧ−ＦＩＴＣ
　・ペプチドＣ（配列番号８）
　ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＫＶＰＥＤＲＶＹ（ｐ）ＥＥＬＮＩＹＳＡＴＹ（ｐ）ＳＥＬＥＤＰＧ−ＦＩＴＣ
　・ペプチドＤ（配列番号９）
　ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＫＶＰＥＤＲＶＹ（ｐ）ＥＥＬＮＩＹ（ｐ）ＳＡＴＹ（ｐ）ＳＥＬＥＤＰＧ−ＦＩＴＣ
　・ペプチドＥ（配列番号１０）
　ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＭＤＴＥＳＮＲＲＡＮＬＡＬＰＱＥＰＳＳＶＰＡＦＥＶ−ＦＩＴＣ
　・ペプチドＦ（配列番号１１）
　ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＣＧＡＧＥＥＬＫＧＮＫＶＰＥＤＲＶＹＥＥＬＮＩＹＳ−ＦＩＴＣ
　・ペプチドＧ（配列番号１２）
　ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ−ＥＥＬＮＩＹＳＡＴＹＳＥＬＥＤＰＧＥＭＳＰＰＩＤＬ−ＦＩＴＣ
＜ヒトマスト細胞への各ペプチドの導入＞
　ヒトマスト細胞（成人末梢血由来培養マスト細胞（以下同様））と実施例１で合成したペプチドＡ~Ｇとを、それぞれ、３７℃で１０分インキュベートした後、パラホルムアルデヒド固定して、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、製品名：ＬＳＲ　ＩＩ）により観察した。陽性コントロールとしてＡＲＦ２−１７（ＡＤＰ−ＲＩＢＯＳＹＬＡＴＩＯＮ　ＦＡＣＴＯＲ２の暫定番号１７番目のペプチド；核周囲に存在することが知られている）を用い、陰性コントロールとしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた。その結果を図１に示した。図１において、×５００及び×１０００はそれぞれペプチド濃度２μＭ及び１μＭに対応し、ヒストグラムの中の数値はｉｓｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｔｒｏｌに対する各ペプチドのｉｎｔｅｎｓｉｔｙの比である（ＭＦＩ）。
　図１の結果から、ペプチドＡ~Ｇはいずれもヒトマスト細胞に導入されていることが認められた。
　上記観察において、ＦＡＣＳに代えて共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察を行った（ペプチド濃度：２μＭ）。その結果を図２に示した。
　図２の結果からも、ペプチドＡ~Ｇはいずれもヒトマスト細胞の細胞質、特に細胞膜付近に導入されていることが認められた。
＜ヒトマスト細胞からのヒスタミン遊離の抑制＞
　ヒトマスト細胞をヒト組換えＩｇＥ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間感作したのち洗浄した。実施例１で合成したペプチドＡ~Ｇ（それぞれ２μＭ）とヒトマスト細胞とを、３７℃で１０分インキュベートした。なお、陰性コントロールとしてＤＭＳＯを用いた。次いで、抗ＩｇＥ抗体又はｃａｌｃｉｕｍ　ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ　Ａ２３１８７により３７℃で３０分インキュベートし、その後、細胞上清中に遊離されたヒスタミンを細胞内の何％に当たるかで表した（各アッセイはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓで行った。Ｎ＝４，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１）。その結果を図３に示した。なお、図３中、「Ｓｐｏｎ」とは抗ＩｇＥ抗体又はｃａｌｃｉｕｍ　ｉｏｎｏｐｈｏｒｅを加えずに３７℃で３０分インキュベートしたものを意味し、また「αＩｇＥ」は抗ＩｇＥ抗体刺激を、「Ａ２３１８７」はｃａｌｃｉｕｍ　ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ　Ａ２３１８７刺激を意味する。
　図３の結果から、ペプチドＤ及びペプチドＣが、ＩｇＥ依存性のマスト細胞からのヒスタミン遊離を統計学的に有意に抑制することが認められた。統計処理はｕｎｐａｉｒｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを用いた。
＜ヒトマスト細胞のプロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）産生の抑制＞
　ヒト組換えＩｇＥ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間感作したのち洗浄した。実施例１で合成したペプチドＡ~Ｇ（それぞれ２μＭ）とヒトマスト細胞とを、３７℃で１０分インキュベートした。なお、陰性コントロールとしてＤＭＳＯを用いた。次いで、抗ＩｇＥ抗体又はｃａｌｃｉｕｍ　ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ　Ａ２３１８７により３７℃で３０分インキュベートし、その後、細胞上清中に産生されたＰＧＤ２を、濃度（／２５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で表した（Ｎ＝３，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１）。その結果を図４に示した。なお、図４中、「Ｓｐｏｎ」とは抗ＩｇＥ抗体又はｃａｌｃｉｕｍ　ｉｏｎｏｐｈｏｒｅを加えずに３７℃で３０分インキュベートしたものを意味し、「αＩｇＥ」は抗ＩｇＥ抗体刺激、「Ａ２３１８７」はｃａｌｃｉｕｍ　ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ　Ａ２３１８７刺激を意味する。
　図４の結果から、ペプチドＤ及びペプチドＣが、ＩｇＥ依存性のマスト細胞からのＰＧＤ２の産生を統計学的に有意に抑制することが認められた。統計処理はｕｎｐａｉｒｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを用いた。
＜ＩｇＥ依存性ヒトマスト細胞活性化の抑制機序の解析＞
　実施例１で合成したペプチドＡ、Ｄ及びＥにおいて、細胞膜透過性ペプチド（ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号４））部分を除いたペプチドを、実施例１と同様の方法により合成（及び必要によりリン酸化）し、それぞれペプチドＡ’、Ｄ’及びＥ’とした。これらペプチドＡ’、Ｄ’及びＥ’のＮ末端にＢｉｏｔｉｎを結合させた。
　・ペプチドＡ’（配列番号１３）
　Ｂｉｏｔｉｎ−ＫＶＰＥＤＲＶＹＥＥＬＮＩＹＳＡＴＹＳＥＬＥＤＰＧ
　・ペプチドＤ’（配列番号１４）
　Ｂｉｏｔｉｎ−ＫＶＰＥＤＲＶＹ（ｐ）ＥＥＬＮＩＹ（ｐ）ＳＡＴＹ（ｐ）ＳＥＬＥＤＰＧ
　・ペプチドＥ’（配列番号１５）
　Ｂｉｏｔｉｎ−ＭＤＴＥＳＮＲＲＡＮＬＡＬＰＱＥＰＳＳＶＰＡＦＥＶ
　上記Ｂｉｏｔｉｎ化ペプチドＡ’、Ｄ’及びＥ’を用いて、Ｕ９３７細胞及びヒトマスト細胞のｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅｓと免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ：ＩＰ）を行い、細胞内情報伝達分子であるＬｙｎタンパク質（Ｌｙｎ）との会合を調べた。具体的には、Ｂｉｏｔｉｎ化ペプチドＡ’、Ｄ’及びＥ’（それぞれ５μＭ）と３ｘ１０６個のＵ９３７細胞及びヒトマスト細胞のｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅｓを、４℃で２時間インキュベートし、遠心し、沈殿を回収、洗浄し、これを電気泳動（ウエスタンブロット：ＷＢ）し、抗Ｌｙｎモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−Ｌｙｎ）と反応させ、各ペプチドとＬｙｎとの会合を検出した。その結果を図５に示した。
　図５の結果から、ペプチドＤ’がマスト細胞内の情報伝達分子であるＬｙｎと会合することが分かった。すなわち、内在性のＦｃεＲＩβ鎖と会合しマスト細胞内の情報伝達分子として働くべきＬｙｎが、ペプチドＤ’と会合してしまい、ペプチドＤ’がｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅとして働くことで、ＩｇＥ依存性ヒトマスト細胞活性化を抑制していることが示された。
　本発明によれば、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制剤、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制方法、アレルギー性疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物、及びアレルギー性疾患の治療及び／又は予防方法等、並びにこれらに用いることができるリン酸化ペプチドを提供することができる。
　本発明のリン酸化ペプチドは、マスト細胞（好ましくはヒトマスト細胞）に導入すると、当該細胞のＩｇＥ依存性活性化をほぼ完全に抑制することができ、ひいては、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息及びアトピー性皮膚炎等の各種アレルギー性疾患の治療薬の有効成分として用いることができる点で、極めて有用なものである。
配列番号１：ペプチド
配列番号１：存在位置：８，１４，１８のチロシン（Ｔｙｒ）残基は、リン酸化又は非リン酸化残基であり、少なくとも１つがリン酸化チロシン残基である。
配列番号２：ペプチド
配列番号２：存在位置：８，１８のチロシン（Ｔｙｒ）残基はリン酸化チロシン残基である。
配列番号３：ペプチド
配列番号３：存在位置：８，１４，１８のチロシン（Ｔｙｒ）残基はリン酸化チロシン残基である。
配列番号４：ペプチド
配列番号５：ペプチド
配列番号５：存在位置２０，２６，３０のチロシン（Ｔｙｒ）残基は、リン酸化又は非リン酸化残基であり、少なくとも１つがリン酸化チロシン残基である。
配列番号６：ペプチド
配列番号７：ペプチド
配列番号７：存在位置２６のチロシン（Ｔｙｒ）残基はリン酸化チロシン残基である。
配列番号８：ペプチド
配列番号８：存在位置２０，３０のチロシン（Ｔｙｒ）残基はリン酸化チロシン残基である。
配列番号９：ペプチド
配列番号９：存在位置２０，２６，３０のチロシン（Ｔｙｒ）残基はリン酸化チロシン残基である。
配列番号１０：ペプチド
配列番号１１：ペプチド
配列番号１２：ペプチド
配列番号１３：ペプチド
配列番号１４：ペプチド
配列番号１４：存在位置：８，１４，１８のチロシン（Ｔｙｒ）残基はリン酸化チロシン残基である。
配列番号１５：ペプチド

Claims (14)

  1. 以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
    　（ａ）下記式（Ｉ）：
    　ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ　　（Ｉ）
    　（Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、いずれもチロシン残基を表し且つこれらの少なくとも１つがリン酸化されたチロシン残基である。）
    で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
    　（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制活性を有するペプチド。
  2. 前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列中、前記Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち少なくともＹ１及びＹ３がリン酸化されたチロシン残基である、請求項１記載のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
  3. 前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドが、Ｎ末端に細胞膜透過性ペプチドを有するものである、請求項１又は２記載のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
  4. 以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制剤。
    　（ａ）下記式（Ｉ）：
    　ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ　　（Ｉ）
    　（Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、いずれもチロシン残基を表し且つこれらの少なくとも１つがリン酸化されたチロシン残基である。）
    で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
    　（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制活性を有するペプチド。
  5. 前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列中、前記Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち少なくともＹ１及びＹ３がリン酸化されたチロシン残基である、請求項４記載の抑制剤。
  6. 前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドが、Ｎ末端に細胞膜透過性ペプチドを有するものである、請求項４又は５記載の抑制剤。
  7. 前記マスト細胞がヒトマスト細胞である、請求項４~６のいずれか１項に記載の抑制剤。
  8. マスト細胞に対して、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を作用させる工程を含む、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制方法。
    　（ａ）下記式（Ｉ）：
    　ＫＶＰＥＤＲＶ−Ｙ１−ＥＥＬＮＩ−Ｙ２−ＳＡＴ−Ｙ３−ＳＥＬＥＤＰＧ　　（Ｉ）
    　（Ｙ１、Ｙ２及びＹ３は、いずれもチロシン残基を表し且つこれらの少なくとも１つがリン酸化されたチロシン残基である。）
    で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
    　（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、マスト細胞のＩｇＥ依存性活性化抑制活性を有するペプチド。
  9. 前記作用させる工程が、マスト細胞に前記（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を導入する工程である、請求項８記載の方法。
  10. 前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列中、前記Ｙ１、Ｙ２及びＹ３のうち少なくともＹ１及びＹ３がリン酸化されたチロシン残基である、請求項８又は９記載の方法。
  11. 前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドが、Ｎ末端に細胞膜透過性ペプチドを有するものである、請求項８~１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記マスト細胞がヒトマスト細胞である、請求項８~１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 請求項４~７のいずれか１項に記載の抑制剤を含む、アレルギー性疾患の治療用及び／又は予防用医薬組成物。
  14. 前記アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息及びアトピー性皮膚炎からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１３記載の組成物。
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