MIKROSKOP ZUR MESSUNG VON TOTALREFLEXIONS-FLUORESZENZ
Die Erfindung betrifft Mikroskope mit einem Beleuchtungsstrahlengang, der zur Beleuchtung einer Probe mit Beleuchtungslicht eine Lichtquelle, ein Objektiv und eine Optik, die das Beleuchtungslicht in eine Pupillenebene des Objektivs fokussiert, aufweist, und mit einem Detektionsstrahlengang, der zur Aufnahme von
Fluoreszenzlicht der Probe einen Detektor, insbesondere einen zweidimensional ortsauflösenden Detektor, aufweist, sowie Betriebsverfahren für derartige
Mikroskope.
Ein solches Mikroskop kann aufgrund der (punktförmigen) Fokussierung in die Pupillenebene als Weitfeldmikroskop im engeren Sinne bezeichnet werden.
Hingegen ist der Beleuchtungsstrahlengang in der Pupillenebene bei abtastenden (engl,„scanning") Mikroskopen nur entweder linienförmig fokussiert (Linienabtastung, engl,„line scanning")) oder gar kollimiert (Punktabtastung, engl,„point scanning").
Die Mikroskopie unter Anwendung der sogenannten Totalreflexions-Fluoreszenz (engl,„total internal reflection fluorescence", TIRF) ist eine besondere Form der Fluoreszenzmikroskopie. Sie ist beispielsweise in WO 2006/127692 A2 (dort beispielsweise in Fig. 9 und 10C) offenbart. Fig. 1 erläutert die Zusammenhänge. Die Fluorophore F0 Probe 5 werden mittels eines evaneszenten Beleuchtungsfelds E ausschließlich in einer dünnen Schicht hinter der Grenzfläche zwischen Deckglas 16 und Probe 5 zur Fluoreszenz F1 angeregt. Das evaneszente Beleuchtungsfeld E in der Probe 5 wird erzeugt, in dem die Anregungsstrahlung T innerhalb des
Deckglases 16 unter einem Winkel θ>θc, der zur Totalreflexion führt, auf die
Grenzfläche Deckglas-Probe geleitet wird. Dabei ist θc der Grenzwinkel, ab dem Totalreflexion auftritt. Indem nur die dünne Schicht zur Fluoreszenz angeregt wird, kann eine besonders hohe axiale Auflösung erzielt werden. Die optische axiale Auflösung eines TIRF-Mikroskops ergibt sich aus der Eindringtiefe d des
evaneszenten Feldes in die Probe. In Abhängigkeit des Einfallswinkels θ ergibt sich die axiale Auflösung aus
λ
d = -
4π-Jn 2 sin2 θ- nl
wobei λ die Anregungswellenlänge, n-i die Brechzahl des Deckglases und n2 die Brechzahl des Mediums der Probe ist.
Die Beleuchtung erfolgt typischerweise wie in Fig. 2 schematisch dargestellt durch das Mikroskopobjektiv 4 hindurch in dessen Randbereich so, dass das
Beleuchtungslicht nach Verlassen des Objektivs 4 die optische Achse des
Objektivs 4 unter einem Winkel kreuzt, der größer oder gleich dem
Totalreflexionsgrenzwinkel θc ist. Um die notwendigen großen Einfallswinkel für das Anregungslicht T zu ermöglichen, muss das Mikroskopobjektiv 4 eine hohe
numerische Apertur aufweisen. Die entstehende Fluoreszenz wird durch dasselbe Objektiv 4 gesammelt und auf eine Kamera (nicht dargestellt), beispielsweise ein ladungsgekoppeltes Bauteil (engl.„Charge coupled device"; CCD), abgebildet.
Ebenfalls aus WO 2006/127692 A2 ist zur Erhöhung des mikroskopischen
Auflösungsvermögens die Verwendung photoschaltbarer Fluoreszenzfarbstoffe bekannt (engl.„Photo-activated Localization Microscopy"; PALM, auch PAL-M).
Durch Licht sehr geringer Intensität bei einer Aktivierungswellenlänge wird eine äußerst geringe Anzahl zufällig verteilter Fluorophore in einen anregbaren Zustand transformiert (aktiviert) und anschließend auf bekannte Weise durch Licht einer Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt. Die übrigen, nichtaktivierten Fluorophore lassen sich durch die Anregungswellenlänge nicht zur Fluoreszenz anregen. Aufgrund der zufälligen Verteilung liegen die aktivierten und angeregten Fluorophore in der Regel räumlich soweit auseinander, dass die aus den
Fluoreszenzereignissen entstehenden, beugungsbegrenzt verbreiterten
Intensitätsverteilungen der Punktquellenabbilder einander nicht überlappen. In der PAL-Mikroskopie wird eine Vielzahl von Einzelbildern mit einer jeweils geringen Anzahl von derartigen nichtüberlappenden Fluoreszenzereignissen aufgenommen. Während der Aufnahme der Einzelbilder kann eine andere Gruppe von Fluorophoren so aktiviert werden, dass sie zuvor gebleichte Fluorophore ersetzt. Die
Intensitätsverteilungen der Fluoreszenzereignisse erstrecken sich in den
Einzelbildern aufgrund der Beugungsverbreiterung über mehrere Bildelemente (engl, „picture elements"; Pixel). Die Ursprünge der einzelnen Fluoreszenzereignisse werden in den Einzelbildern anhand der beugungsverbreiterten
Intensitätsverteilungen mittels einer Ausgleichsrechnung mit Subpixelauflösung lokalisiert und in ein hochauflösendes Ergebnisbild eingetragen.
In modernen Weitfeldmikroskopen im engeren Sinne werden, im Gegensatz zu den Laser-Scanning-Mikroskopen (dort insbesondere bei nichtlinearer
Fluoreszenzanregung), nur relativ schwache Lichtquellen mit nur geringen
Lichtintensitäten verwendet. Die Fokussierung in die Pupillenebene führt dabei zwangsläufig zu geringen Lichtintensitäten in der Probe, da die Leistung der
Lichtquelle auf einen sehr großen Probenbereich verteilt wird. Geringe Intensitäten sind aber in der Regel aus mehreren Gründen durchaus erwünscht. Einerseits sind Fluorophore mit hoher Quantenausbeute verfügbar, zum anderen soll die
Strahlenbelastung der Probe so gering wie möglich gehalten werden. Bei direkter Beobachtung durch ein Okular besteht bei hoher Lichtintensität zudem die Gefahr der Schädigung der Augen des Beobachters. Geringe Beleuchtungslichtintensitäten sind insbesondere in der TIRF-Mikroskopie erwünscht, da hohe Intensitäten zu einer Sättigung der Farbstoffe im deckglasnahen Bereich führen würden, wodurch die Farbstoffe aus den tieferen Bereichen der Probe einen stärkeren Beitrag zum Bild lieferten. Allerdings ist es in der TIRF-Mikroskopie ohnehin schwierig, hohe
Intensitäten in der Probe zu erreichen, da ein Großteil der Leistung aufgrund der Totalreflexion gar nicht in die Probe hineingelangt.
Es gibt jedoch auch Weitfeldtechniken, die sehr hohe Intensitäten benötigen.
Beispielsweise müssen bei PAL-Mikroskopen die bereits beobachteten Fluorophore sehr schnell in einen Dunkelzustand überführt werden, um die Messdauer zu verringern, was durch Bleichen geschehen kann. Je höher dabei die
Beleuchtungslichtintensität ist, desto schneller werden die aktivierten Fluorophore ausgebleicht.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mikroskope und Verfahren der eingangs genannten Arten zu verbessern, so dass die Beleuchtungslichtintensität in der Probe mit geringem Aufwand flexibel einstellbar ist.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Mikroskop, welches die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, und durch ein Betriebsverfahren, welches die in Anspruch 10 angegebenen Merkmale aufweist.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Lichtquelle ein Laser ist und dass in dem Beleuchtungsstrahlengang eine variable Optik angeordnet ist, die eine veränderliche Einstellung eines Strahlquerschnitts des Beleuchtungslichts in einer
Zwischenbildebene ermöglicht, wobei eine Divergenz des Beleuchtungslichts für unterschiedliche Strahlquerschnitte identisch ist. Mit anderen Worten, die Divergenz des Beleuchtungslichts, insbesondere beim Auftreffen auf die Probe und in der Zwischenbildebene, ist unabhängig von dem Strahlquerschnitt in der
Zwischenbildebene. Der Strahlquerschnitt ist die von dem Beleuchtungslicht- Strahlenbündel quer zur Ausbreitungsrichtung eingenommene Fläche. Die in den verschiedenen Einstellungen identische Divergenz in der Bildebene kann jeden denkbaren Wert annehmen, insbesondere kann sie Null sein, so dass kollimiertes Licht vorliegt.
Durch das Anordnen einer variablen Optik zur veränderlichen Einstellung des
Strahlquerschnitts in einem Anregungslaserstrahl lässt sich der räumliche Bereich der Probe, in dem eine Fluoreszenzanregung stattfindet, also das Sehfeld des Mikroskops, in seiner Größe flexibel verändern. Da durch eine Optik zur variablen Einstellung des Strahlquerschnitts die übertragene Beleuchtungslichtleistung nicht beeinflusst wird, kann durch die Änderung des Strahlquerschnitts im
Anregungsstrahlengang (und damit des korrespondierenden Bündeldurchmessers auf der Probe) die Intensität (hier als Leistung pro Fläche angenähert) des Laser- Beleuchtungslichts in der Probe in einem großen Wertebereich variiert werden.
Dadurch kann dasselbe Mikroskop mit geringem Aufwand für Messungen mit niedriger und alternativ mit hoher Beleuchtungslichtintensität eingesetzt werden. Verschiedene Stellen der Probe können dabei beispielsweise in bekannter Weise durch Verschieben der Probe quer zum Beleuchtungsstrahlengang und zum
Detektionsstrahlengang beleuchtet und untersucht werden.
Vorzugsweise ist die variable Optik außerhalb des Detektionsstrahlengangs angeordnet. Dadurch kann der Beleuchtungsstrahlengangquerschnitt unabhängig von einem Detektionsstrahlengangquerschnitt eingestellt werden.
Vorteilhafterweise kann der Beleuchtungsstrahlengang derart ausgebildet sein, dass das Beleuchtungslicht nach Verlassen des Objektivs eine optische Achse des Objektivs unter einem Winkel kreuzt, der größer oder gleich einem
Totalreflexionswinkel ist. Dadurch können beispielsweise PALM und TIRF mit variabler Beleuchtungsintensität betrieben werden.
In einer ersten Ausgestaltungsvariante umfasst die variable Optik ein Teleskop, das zwischen mindestens zwei Vergrößerungseinstellungen umschaltbar ist. Dabei weist eine Vergrößerungseinstellung des Teleskops vorzugsweise eine Vergrößerung von weniger als eins auf. Die Bereitstellung einer Umschaltmöglichkeit auf eine
Vergrößerung von weniger als eins führt dazu, dass die gleiche Laserleistung auf einen deutlich kleineren Bereich wirken und so die Intensität in der Probe zu lasten des Sehfeldes erhöht werden kann. Ein Teleskop mit einer 0,5x Vergrößerung sorgt beispielsweise für eine Vervierfachung der Lichtintensität im Bereich der Probe.
In einer zweiten Ausgestaltungsvariante ist die variable Optik in ihrer Vergrößerung stufenlos einstellbar (Zoomoptik). Dabei ist die Zoomoptik vorzugsweise auf eine Vergrößerung von weniger als eins einstellbar. Verwendet man eine Zoomoptik (anstelle eines Teleskops), so lässt sich das Sehfeld und damit die
Beleuchtungsintensität in der Probe kontinuierlich verstellen.
Die Einschränkung des Sehfeldes durch Verkleinerung des Strahlquerschnitts des Beleuchtungsstrahlengangs stört bei Techniken wie PALM nur wenig, da die beobachteten Strukturen im Submikrometerbereich liegen. Um den Nachteil des verkleinerten Sehfeldes zu reduzieren, kann man das System automatisch auf das kleinere Sehfeld anpassen. In einer weitergehenden Ausführungsform umfasst der Detektionsstrahlengang daher vorteilhafterweise eine einstellbare, insbesondere vergrößernd wirkende Tubuslinse, die zwischen einer Position im
Detektionsstrahlengang und einer Position außerhalb des Detektionsstrahlengangs beweglich ist, oder eine entsprechend einstellbare Zoomoptik. Durch eine
vergrößernd wirkende Tubuslinse oder eine entsprechend einstellbare Zoomoptik kann bei verkleinerter Sehfeldeinstellung der gesamte Detektor ausgeleuchtet werden. Alternativ dazu kann eine softwaregestützte Beschneidung des
Detektorbildes in Art einer interessierenden Region (engl,„region of interest"; ROI) erfolgen. Sofern zur Beschneidung nur ein Teilbereich des vom Detektor
aufgenommenen Bildes, also eine echte Untermenge der Detektorpixel, aus dem Detektor ausgelesen wird, kann dies vorteilhafterweise aufgrund der kleineren Datenmenge zu schnelleren Bildaufnahmen führen.
Vorzugsweise verläuft der Detektionsstrahlengang durch dasselbe Objektiv wie der Beleuchtungsstrahlengang. Dies gilt insbesondere im Falle einer TIRF-Beleuchtung.
Der Betrieb des erfindungsgemäßen Mikroskops erfolgt vorzugsweise in folgenden Schritten: Einstellen der variablen Optik in eine von mehreren Stellungen; Einstellen der einstellbaren Tubuslinse im Detektionsstrahlengang zur Abbildung eines mit dem eingestellten Strahlquerschnitt des Beleuchtungslichts korrespondierenden Sehfelds auf den Detektor; Fokussieren des Beleuchtungslichts in die Pupillenebene des Objektivs und Aufnehmen von Fluoreszenzlicht von der Probe mittels des Detektors.
Alternativ dazu kann der Betrieb des erfindungsgemäßen Mikroskops in folgenden Schritten erfolgen: Einstellen der variablen Optik in eine von mehreren Stellungen; Fokussieren des Beleuchtungslichts in die Pupillenebene des Objektivs und
Aufnehmen von Fluoreszenzlicht von der Probe mittels des Detektors, wobei nur eine echte Untermenge von Pixeln des Detektors, die einem Sehfeld entspricht, das mittels des Strahlquerschnitts des Beleuchtungslichts eingestellt ist, in ein Bild aufgenommen wird. Die Aufnahme nur einer Untermenge der Detektorpixel kann dabei bedeuten, dass der Detektor vollständig ausgelesen, aber nur ein Teilbereich davon in ein Speicherabbild aufgenommen wird. Alternativ kann damit ein nur teilweises Auslesen des Detektors gemeint sein.
Die Erfindung umfasst auch Steuereinheiten und Computerprogramme, die zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet sind.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 ein Schema der Funktionsweise von TIRF,
Fig. 2 eine TIRF-Beleuchtungsmöglichkeit nach dem Stand der Technik in
schematische Darstellung,
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops, Fig. 4 ein zweites Mikroskop mit einer Zoomoptik, Fig. 5 ein drittes Mikroskop zur TIRF-Beleuchtung,
Fig. 6 ein Ergebnis einer Beschneidung des Detektorbildes zur Kompensation eines verkleinerten Sehfeldes und
Fig. 7 Bilder einer Aufnahme mit vergrößernder Tubuslinse zur Kompensation eines verkleinerten Sehfeldes.
In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.
Fig. 3 zeigt ein Mikroskop 1 mit einem Beleuchtungsstrahlengang, in dem unter anderem eine Lichtquelle 2, ein Strahlteiler 3 und ein Mikroskopobjektiv 4 zur
Beleuchtung einer Probe 5 mit Beleuchtungslicht der Lichtquelle 2 angeordnet sind. Die Lichtquelle 2 ist ein Laser, der zur Anregung einer bestimmten Fluorophorsorte wie GFP (engl,„green-fluorescent protein") geeignet ist. Der Strahlteiler 3 koppelt einen Detektionsstrahlengang, der von der Probe 5 durch dasselbe Objektiv 4 bis zu einem Detektor 6 verläuft, aus. Der Strahlteiler 3 kann beispielsweise als
dichroitischer Farbteiler ausgebildet sein, der im von der Probe 5 kommenden Licht die Anregungswellenlänge des Beleuchtungslichts von den Fluoreszenzwellenlängen der Probe 5 trennt. Der reflektierte oder gestreute Anteil des Anregungslichts wird zur Lichtquelle 2, der Fluoreszenzanteil zum Detektor 6 geleitet. Der Detektor 6 ist
beispielsweise ein zweidimensional ortsauflösendes CCD (engl.„Charge coupled device").
Im Beleuchtungsstrahlengang sind dem Laser 2 eine nichtabgebildete Lichtleitfaser und dieser eine Kollimationsoptik 8 nachgeordnet, in alternativen Ausführungsformen ohne Lichtleitfaser (nicht abgebildet) kann gegebenenfalls auf die Kollimationsoptik 8 verzichtet werden. Der Kollimationsoptik 8 ist als Mittel zur veränderlichen Einstellung des Strahlquerschnitts des Beleuchtungslichts ein variables Teleskop 10
nachgeordnet, in dem durch eine erste Optik 9 und eine zweite Optik 10.1 zur Unendlichabbildung eine Zwischenbildebene (nicht abgebildet) erzeugt wird. Das Teleskop ist insofern variabel, als mittels eines Antriebs 11 eine dritte Optik 10.2 anstelle der zweiten Optik 10.1 bewegt werden kann, beispielsweise durch
Einschwenken. Zu einem Zeitpunkt befindet sich stets nur eine der Optiken 10.1/10.2 im Beleuchtungsstrahlengang. Die dritte Optik 10.1 hat eine kleinere Brennweite als die zweite Optik 10.2. Die Optiken 10.1 , 10.2 sind dabei so angeordnet und derart beweglich, dass ihre beleuchtungsseitigen Brennebenen im in den
Beleuchtungsstrahlengang eingeschwenkten Zustand der betreffenden Optik
10.1/10.2 mit der probenseitigen Brennebene der ersten Optik 9 zusammenfallen. Das Teleskop hat beispielsweise mit der zweiten Optik 10.1 wie abgebildet eine Vergrößerung von 0,9, mit der dritten Optik 10.2 hingegen eine Vergrößerung von 0,5. Alternativ kann das Teleskop mit der zweite Optik 10.1 eine Vergrößerung von 1 oder mehr aufweisen.
Im gemeinsamen Abschnitt der Strahlengänge (zwischen Strahlteiler 3 und
Objektiv 4) ist eine beleuchtungsseitige Tubuslinse 7 (Beleuchtungstubuslinse) angeordnet, die den Beleuchtungsstrahlengang punktförmig in die Pupillenebene P des Objektivs 4 oder zumindest in die Nähe der Pupillenebene P fokussiert. Dadurch wird das Beleuchtungslicht vom Mikroskopobjektiv 4 als kollimiertes Bündel auf die Probe 5 geworfen. Die Punkte der Probe, die in der probenseitigen Brennebene des Objektivs 4 liegen, werden über eine Tubuslinse 13A/13B auf den Detektor 6 abgebildet (Weitfeldmikroskop). Bei dem Weitfeldsystem handelt es sich nicht um ein konfokales System.
Die Divergenz des Beleuchtungslichts beim Eintritt in die Beleuchtungstubuslinse 7 ist unabhängig von der Vergrößerungseinstellung des Teleskops 10.
Die Tubuslinsen 13A und 13B sind mittels eines Antriebs 11 alternativ in den
Detektionsstrahlengang beweglich, beispielsweise einschwenkbar. Die zweite Tubuslinse 13B bewirkt im Gegensatz zur ersten Tubuslinse 13A eine stärkere Vergrößerung des Bildes auf dem Detektor 6. Die Brennweite der zweiten
Tubuslinse 13B ist so gewählt, dass das Sehfeld des Mikroskops mit der dritten Teleskopoptik 10.2 (kleineres Sehfeld als mit der zweiten Teleskopoptik 10.1 ) nahezu vollständig auf den Detektor 6 abgebildet wird, wenn sich die zweite Tubuslinse 13B im Detektionsstrahlengang befindet. Entsprechend ist die Brennweite der ersten Tubuslinse 13A so gewählt, dass das größere Sehfeld des Mikroskops mit der zweiten Teleskopoptik 10.1 auf den Detektor 6 abgebildet wird, wenn sich die erste Tubuslinse 13B im Detektionsstrahlengang befindet.
Die Steuereinheit 14 kann über die Antriebe 11 die Vergrößerung des Teleskops 10 und der Detektionstubuslinse 13A/13B einstellen. Durch Umschalten zwischen der zweiten Optik 10.1 und der dritten Optik 10.2 kann der Strahlquerschnitt des
Beleuchtungsstrahlengangs verändert werden. Das hat eine Variation des
ausgeleuchteten Bereichs der Probe 5 und damit eine Variation der
Beleuchtungsintensität in der Probe 5 zur Folge. Außerdem kann die
Steuereinheit 14 die Menge der Pixel des Detektors 6 oder eine echte Untermenge davon auslesen und zur Weiterverarbeitung über eine Schnittstelle (nicht abgebildet) ausgeben.
In Teilfigur 3A ist die zweite Optik 10.1 des Teleskops 10 in den
Beleuchtungsstrahlengang eingeschwenkt. In Teilfigur 3B ist stattdessen die dritte Optik 10.2 des Teleskops 10 in den Beleuchtungsstrahlengang eingeschwenkt. Es ist zu erkennen, dass der Strahlquerschnitt im Beleuchtungsstrahlengang und der Bϋndeldurchmesser in der Probe 5 im Fall der zweiten Optik 10.1 größer sind als im Fall der dritten Optik 10.2. Damit ist das Sehfeld des Mikroskops 1 im erstgenannten Fall größer als im zweitgenannten Fall (angedeutet durch eine Ansicht eines vergrößerten Ausschnitts der Probe 5). Die Beleuchtungslichtintensität in der Probe 5 ist im zweitgenannten Fall höher als im erstgenannten Fall.
Beispielsweise wird der Steuereinheit 14 durch einen Benutzer die Einstellung des kleineren Sehfelds vorgegeben (siehe Fig. 3B). Daraufhin kann die Steuereinheit 14 beispielsweise automatisch die zum kleineren Sehfeld gehörige zweite
Detektionstubuslinse 13B in den Detektionsstrahlengang fahren. Entsprechend kann sie bei Vorgabe des großen Sehfeldes beispielsweise automatisch die zum größeren Sehfeld gehörige erste Detektionstubuslinse 13A in den Detektionsstrahlengang fahren. Zu einem Zeitpunkt befindet sich stets nur eine der
Detektionstubuslinsen 13A/13B im Detektionsstrahlengang.
In alternativen Ausführungsformen (nicht abgebildet) ist das gesamte Teleskop 10 (beispielsweise bestehend aus der ersten Optik 9 und der zweiten Optik 10.1 ) gegen ein anderes Teleskop mit einer anderen Vergrößerung automatisch austauschbar. Es können auch drei und mehr Teleskope gegeneinander automatisch austauschbar sein.
Das in Fig. 4 gezeigte Mikroskop 1 stimmt weitgehend mit dem Mikroskop 1 gemäß Fig. 3 überein. Anstelle eines Teleskops 10 ist im Beleuchtungsstrahlengang jedoch eine hinsichtlich ihres Abbildungsmaßstabs variabel einstellbare Zoomoptik 15 angeordnet. Insbesondere können Vergrößerungen von weniger als eins eingestellt werden. Auch dieses Mikroskop 1 erlaubt die Veränderung des Strahlquerschnitts im Beleuchtungsstrahlengang und damit des Sehfelds. Die so erzielbare
Intensitätsanpassung ist durch eine Zoomoptik stufenlos regelbar. Die Divergenz des Beleuchtungslichts beim Eintritt in die Beleuchtungstubuslinse 7 ist unabhängig von der Vergrößerungseinstellung der Zoomoptik 15.
Die Veränderung des Sehfeldes kann im Detektionsstrahlengang automatisch berücksichtigt werden. Dies kann durch die Steuereinheit 14 geschehen, indem sie beispielsweise bei einer Vergrößerung von weniger als eins durch die Zoomoptik 15 nur eine echte Untermenge der Pixel des Detektors 6 verarbeitet, die dem
resultierenden, verkleinerten Sehfeld entspricht. Vorzugsweise liest die
Steuereinheit 14 auch nur diese Untermenge von Pixel aus dem Detektor aus, um die zu übertragende Datenmenge zu minimieren. Dies erlaubt höhere
Bildwiederholfrequenzen bei der Aufnahme mit verkleinertem Sehfeld gegenüber der
Aufnahme mit regulärem Sehfeld (Vergrößerung der Zoomoptik 15 von eins).
Alternativ zu einer Detektionstubuslinse 13 mit fester Brennweite kann eine einstellbare Detektionstubuslinse 13A/13B gemäß Fig. 3 vorgesehen werden.
Fig. 5 zeigt das Mikroskop 1 gemäß Fig. 4 in einer TIRF-Konfiguration, bei der der Beleuchtungsstrahlengang derart ausgebildet ist, dass das Beleuchtungslicht nach Verlassen des Objektivs 4 die optische Achse OA des Objektivs 4 unter einem Winkel kreuzt, der größer oder gleich einem Totalreflexionswinkel ist.
In Fig. 6 ist die Auswahl einer interessierenden Region durch Beschneidung des Detektorbilds angedeutet (vergrößernde Tubuslinse 13B nicht vorhanden oder nicht verwendet). Teilfigur 6A zeigt die Detektorpixel einer regulären Aufnahme mit großem Sichtfeld (zweite Optik 10.1 im Beleuchtungsstrahlengang beziehungsweise Zoomoptik 15 auf Vergrößerung von 1 :1 eingestellt). Teilfigur 6B zeigt die
Detektorpixel einer Aufnahme mit reduziertem Sichtfeld (dritte Optik 10.2 im
Beleuchtungsstrahlengang beziehungsweise Zoomoptik 15 auf Vergrößerung von weniger als eins eingestellt). Die echte Untermenge von Detektorpixel kann beispielsweise auf die Bildgröße des gesamten Detektors umgerechnet werden. Aus Teilfigur 6C ist erkennbar, dass die interessierende Region mit gleicher Auflösung wie im regulären Bild (Fig. 6A) aufgenommen wurde.
Fig. 7 deutet die Kompensation des verkleinerten Sehfelds im Bereich einer interessierenden Region durch Vergrößerung des Abbildungsmaßstabs des
Detektionsstrahlengangs mittels einer vergrößernden Tubuslinse 13B an. Teilfigur 7A zeigt (wie Fig. 6A) die Detektorpixel einer regulären Aufnahme mit großem Sichtfeld. Teilfigur 7B zeigt die Detektorpixel einer Aufnahme mit reduziertem Sichtfeld (dritte Optik 10.2 im Beleuchtungsstrahlengang beziehungsweise Zoomoptik 15 auf Vergrößerung von weniger als eins eingestellt) durch eine vergrößernde
Tubuslinse 13B. Es ist erkennbar, dass die interessierende Region mit höherer Auflösung aufgenommen wurde als im regulären Bild (Fig. 7A).
Bezugszeichenliste
1 Mikroskop
2 Lichtquelle
3 Strahlteiler
4 Mikroskopobjektiv
5 Probe
6 Detektor
7 Beleuchtungstubuslinse
8 Kollimationsoptik
9 Erste Optik
10 Variables Teleskop
10. 1 Zweite Optik
10. 2 Dritte Optik
11 Antrieb
12 Okular
13 A/B Detektionstubuslinse
14 Steuereinheit
15 Zoomoptik
16 Deckglas θ Einfallswinkel
θc Totalreflexionsgrenzwinkel
T Beleuchtungslicht
E Evaneszentes Feld
F0/ 1 Fluorophor
O/ ^ Optische Achse
P Pupillenebene