WO2011007876A1 - Ｈｍｇｂ１結合核酸分子およびその用途 - Google Patents

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洋美 竹中
穣 秋冨
信太郎 加藤
祥太郎 辻
敬 大津
巌 和賀
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Ｎｅｃソフト株式会社
地方独立行政法人神奈川県立病院機構
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid molecule that binds to HMGB1 protein and its use.
  • HMGB1 High-mobility group box 1 protein
  • Non-patent Document 1 HMGB1 protein
  • Non-patent Document 2 HMGB1 protein essential for survival
  • Non-patent Document 3 HMGB1 protein essential for survival
  • Non-patent Document 4 HMGB1 becomes a target substance and a diagnostic marker for the treatment of these diseases.
  • HMGB1 expression level is increased as compared with normal tissues because it is involved in proliferation and metastasis invasion of breast cancer, colon cancer, melanoma, prostate cancer, pancreatic cancer, lung cancer and the like.
  • An object of the present invention is to provide, for example, a nucleic acid molecule capable of binding to HMGB1 as a substance that can be used for elucidating the onset mechanism of a disease caused by HMGB1 and for diagnosing and treating the disease, and uses thereof. It is in.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is a binding nucleic acid molecule capable of binding to HMGB1, characterized by having a dissociation constant of HMGB1 protein (hereinafter referred to as HMGB1) of 5 ⁇ 10 ⁇ 7 or less.
  • composition of the present invention is a composition comprising the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection reagent of the present invention is an HMGB1 detection reagent for detecting HMGB1, characterized in that it comprises the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention can bind to HMGB1. For this reason, according to the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention, for example, by binding to HMGB1 and inhibiting its function, the above-mentioned diseases caused by HMGB1 can be prevented and treated. In addition, according to the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention, for example, HMGB1 can be detected by confirming the presence or absence of binding to HMGB1, thereby enabling early diagnosis of the disease.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention by expressing the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention in cultured cells, gene transcription inhibition experiments can be performed, and the HMGB1 binding nucleic acid molecule of the present invention and its receptor are used.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention can also be used for elucidating the function of HMGB1, such as allowing binding inhibition experiments with the body. Therefore, the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is also useful as a new research tool.
  • FIG. 1 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to HMGB1 in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to the His-tag-added MIF protein in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to HMGB1 under physiological conditions in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 1 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to HMGB
  • FIG. 6 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 4 of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 5 of the present invention.
  • FIG. 9 is a photograph of a pull-down assay showing binding between HMGB1 and TLR-2 in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 10 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 7 of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing the predicted secondary structures of RNA aptamers R8c6_1 and R8c6_18 in the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 9 of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 9 of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 10 of the present invention.
  • FIG. 15 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 11 of the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 9 of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing the binding ability of each RNA
  • FIG. 16 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 12 of the present invention.
  • FIG. 17 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to His-tag-added HMGB1 in Example 12 of the present invention.
  • FIG. 18 is a diagram showing a predicted secondary structure of RNA aptamer R8c6_1 in the present invention.
  • FIG. 19 is a diagram showing a predicted secondary structure of RNA aptamer R8c6_1-18 in the present invention.
  • FIG. 20 is a diagram showing a predicted secondary structure of RNA aptamer R8c6_1-25-S6 in the present invention.
  • FIG. 21 is a graph showing the interaction between HMGB1 and RNA aptamer in Example 13 of the present invention.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule capable of binding to HMGB1, which has a dissociation constant of 5 ⁇ 10 ⁇ 7 or less with HMGB1.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is also referred to as, for example, an HMGB1 aptamer.
  • “possible to bind to HMGB1” means, for example, having a binding ability to HMGB1 or having a binding activity to HMGB1 (HMGB1 binding activity).
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to, for example, HMGB1.
  • the binding between the HMGB1-binding nucleic acid molecule and HMGB1 can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction analysis. For the analysis, for example, Biacore X (trade name, GE Healthcare UK Ltd.) can be used.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may have a dissociation constant of 5 ⁇ 10 ⁇ 7 or less with HMGB1, and other configurations are not limited.
  • the dissociation constant for HMGB1 is not particularly limited, but the upper limit thereof is, for example, 10 ⁇ 8 order, more preferably 10 ⁇ 10 order, and further preferably 10 ⁇ 12 order.
  • the range of the dissociation constant is, for example, on the order of 10 ⁇ 14 to 10 ⁇ 8 , preferably on the order of 10 ⁇ 14 to 10 ⁇ 10 , and more preferably on the order of 10 ⁇ 14 to 10 ⁇ 12 .
  • the structural unit of the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited.
  • the structural unit is, for example, a nucleotide residue, and examples of the nucleotide residue include a ribonucleotide residue and a deoxyribonucleotide residue.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, RNA composed of ribonucleotide residues or DNA composed of deoxyribonucleotide residues, preferably RNA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, both deoxyribonucleotides, which are constituent units of DNA, and ribonucleotides, which are constituent units of RNA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, RNA containing deoxyribonucleotide residues or RNA containing ribonucleotide residues.
  • the nucleotide residue may be, for example, a modified nucleotide residue.
  • the modified nucleotide residue include those in which a sugar residue in the nucleotide residue is modified.
  • examples of the sugar residue include a ribose residue and a deoxyribose residue.
  • the modification site in the nucleotide residue is not particularly limited, and examples thereof include the 2 'position and / or the 4' position of the sugar residue. Examples of the modification include methylation, fluorination, amination, and thiolation.
  • the modified nucleotide residue is, for example, a modified nucleotide residue having a pyrimidine base (pyrimidine nucleus) as a base, or a modified nucleotide residue having a purine base (purine nucleus) as a base.
  • the former is preferred.
  • a nucleotide residue having a pyrimidine base is referred to as a pyrimidine nucleotide residue
  • a modified pyrimidine nucleotide residue is referred to as a modified pyrimidine nucleotide residue
  • a nucleotide residue having a purine base is referred to as a purine nucleotide residue.
  • the purified purine nucleotide residue is referred to as a modified purine nucleotide residue.
  • the pyrimidine nucleotide residues include uracil nucleotide residues having uracil, cytosine nucleotide residues having cytosine, thymine nucleotide residues having thymine, and the like.
  • the modified nucleotide residue when the base is a pyrimidine base, for example, the 2'-position and / or the 4'-position of the sugar residue is preferably modified.
  • modified nucleotide residue examples include, for example, 2′-methyluracil (2′-methylated-uracil nucleotide residue), 2′-methylcytosine (2′-modified ribose residue) 2'-methylated-cytosine nucleotide residues), 2'-fluorouracil (2'-fluorinated-uracil nucleotide residues), 2'-fluorocytosine (2'-fluorinated-cytosine nucleotide residues), 2'- Aminouracil (2′-aminated uracil-nucleotide residue), 2′-aminocytosine (2′-aminated-cytosine nucleotide residue), 2′-thiouracil (2′-thiolated-uracil nucleotide residue), 2'-thiocytosine (2'-thiolated-cytosine nucleotide residue) and the like.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention includes monomer residues such as PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (2′-O, 4′-C-Ethylenebridged Nucleic Acids) and the like as the structural unit. Can be given.
  • Examples of the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention include RNA or DNA containing at least one monomer residue of PNA, LNA and ENA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention contains the monomer residue, the number is not particularly limited.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
  • the single-stranded nucleic acid include single-stranded RNA and single-stranded DNA.
  • the double-stranded nucleic acid include double-stranded RNA, double-stranded DNA, and double-stranded nucleic acid of RNA and DNA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is a double-stranded nucleic acid, it may be made into a single strand by denaturation or the like prior to use, for example.
  • each base may be a natural base (non-artificial nucleic acid) of, for example, adenine (a), cytosine (c), guanine (g), thymine (t), and uracil (u).
  • An artificial base (unnatural base) may be used.
  • the artificial base include a modified base and a modified base, and preferably have the same function as the natural base (a, c, g, t, or u).
  • the artificial base having the same function is, for example, an artificial base capable of binding to cytosine (c) instead of guanine (g), an artificial base capable of binding to guanine (g) instead of cytosine (c), Instead of adenine (a), an artificial base capable of binding to thymine (t) or uracil (u), instead of thymine (t), an artificial base capable of binding to adenine (a), instead of uracil (u) And an artificial base capable of binding to adenine (a).
  • the modified base include a methylated base, a fluorinated base, an aminated base, and a thiolated base.
  • the modified base include, for example, 2′-methyluracil, 2′-methylcytosine, 2′-fluorouracil, 2′-fluorocytosine, 2′-aminouracil, 2′-aminocytosine, 2-thiouracil, 2-thiocytosine and the like.
  • the bases represented by a, g, c, t and u include the meaning of the artificial base having the same function as each of the natural bases in addition to the natural base.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is preferably resistant to nucleases, for example.
  • the nuclease is not particularly limited, and examples thereof include exonuclease and endonuclease. Specific examples include, for example, ribonuclease (RNase) that is an RNA-degrading enzyme, deoxyribonuclease (DNase) that is a DNA-degrading enzyme, RNA and Examples include nucleases that act on both DNA.
  • RNase ribonuclease
  • DNase deoxyribonuclease
  • RNA examples include nucleases that act on both DNA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is preferably RNA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is RNA, it is preferably resistant to, for example, RNase, that is, RNase.
  • the method for making the nuclease resistant is not particularly limited, and examples thereof include a method of modifying nucleotide residues constituting the nucleic acid molecule.
  • the nucleotide residue or a part of the nucleotide residues constituting the nucleic acid molecule is preferably a modified nucleotide residue.
  • the modified nucleotide residue include the aforementioned modified nucleotide residues.
  • modified nucleotide residue examples include the methylated nucleotide residue, the fluorinated nucleotide residue, the aminated nucleotide residue, the thiolated nucleotide residue, and the like. preferable.
  • the modified nucleotide residue is, for example, the pyrimidine nucleotide residue having a pyrimidine base as a base, and the sugar residue (ribose residue or deoxyribose residue) is preferably modified.
  • the method for making the nuclease resistant includes, for example, a method of converting a nucleotide residue constituting the nucleic acid molecule into LNA.
  • the method of making the nuclease resistant includes, for example, a method of converting nucleotide residues constituting RNA, which is the nucleic acid molecule, into DNA.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is RNA
  • all or part of nucleotide residues having uracil are converted to nucleotide residues having thymine. Specifically, it may be substituted with a deoxyribonucleotide residue having the thymine.
  • the nucleic acid molecule is RNA
  • all or some of the nucleotide residues constituting the RNA may be deoxyribonucleotide residues and the LNA residues.
  • the method for making the nuclease resistant includes, for example, a method in which polyethylene glycol (PEG) or deoxythymidine is bonded to the 5 'end and / or the 3' end.
  • PEG polyethylene glycol
  • the PEG is preferably tens of kDa, for example.
  • the length of the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, but the total length is, for example, 20 to 160 bases, preferably 30 to 120 bases, more preferably 40 to 100 bases. is there.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention examples include any one of the following (A1), (A2), (B1) and (B2) nucleic acid molecules.
  • A1 Nucleic acid molecule comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 42 (A2) In the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-42, one or more bases are substituted, deleted, Any of nucleic acid molecules (B2) comprising a base sequence represented by any one of nucleic acid molecules (B1) SEQ ID NOs: 45 to 81, which contain an added or inserted base sequence and can bind to HMGB1
  • the nucleic acid molecule (A1) will be described.
  • the nucleic acid molecule (A1) is referred to as HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1).
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1-42 are also referred to as base sequences (A1).
  • the nucleotide sequence (A1) represented by SEQ ID NOs: 1-42 and the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) containing the nucleotide sequence (A1) are represented by the names shown before the sequence numbers as shown below. There is also.
  • (A1) a nucleic acid molecule comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-42
  • SEQ ID NO: 1 “m” is adenine or cytosine, “h” is adenine, cytosine, thymine, or uracil, and “b” is guanine, cytosine, thymine, or uracil.
  • Examples of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 include the base sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 5.
  • uracil (u) may be thymine (t).
  • one or more uracils may be thymine and all uracils may be thymine.
  • the nucleic acid molecule which consists of a base sequence containing thymine or the nucleic acid molecule which contains the said base sequence can be illustrated as a nucleic acid molecule of (A2) mentioned later, for example.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) may be a nucleic acid molecule consisting of the base sequence (A1) represented by any one of the sequence numbers 1 to 42, or a nucleic acid molecule containing the base sequence (A1). .
  • the base sequence (A1) may be an X region, and may further have a Y region and / or a Y ′ region.
  • the X region, the Y region, and the Y ′ region are as described later, for example.
  • the Y region is not particularly limited, and examples thereof include a sequence containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 43 or 115 and a sequence consisting of the base sequence.
  • the Y ′ region is not particularly limited, and examples thereof include a sequence containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 44 and a sequence consisting of the base sequence. These sequences are merely examples, and do not limit the present invention.
  • the Y region is preferably bound to the 5 ′ side of the base sequence (A1), for example.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) includes the Y ′ region, the Y ′ region is preferably bound to the 3 ′ side of the base sequence (A1), for example.
  • the base sequence (A1), the Y region, and the Y ′ region may be directly bonded or may be bonded via an intervening sequence, for example.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) includes any one of the base sequences (A1) of SEQ ID NOs: 1-42, for example, the nucleic acid molecule comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 45-81 or the above Examples include nucleic acid molecules containing a base sequence.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 45 to 81 shown below each include the base sequence (A1) of SEQ ID NOs: 6 to 42, and the regions represented by the underlined portions are the base sequences of SEQ ID NOs: 6 to 42, respectively. Equivalent to.
  • the base sequence of SEQ ID NOs: 45 to 81 and the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) containing the base sequence may be represented by names shown before the sequence numbers as shown below.
  • # 04 (SEQ ID NO: 45) gggacgcucacguacgcuca ucccaugauuguucaggcacggccuuucgguucccucaau ucagugccuggacgugcagu # 08 (SEQ ID NO: 46) gggacgcucacguacgcuca agucccuugacacguccguuuucuaacuggaauagaggcc ucagugccuggacgugcagu # 12 (SEQ ID NO: 47) gggacgcucacguacgcuca gggcugcaccucuccgcuacguugucguuggaggcaccau ucagugccuggacgugcagu # 43 (SEQ ID NO: 48) ggga
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) is, for example, a nucleic acid consisting of a base sequence from the fourth base on the 5 ′ side to the terminal base on the 3 ′ side in any one of the base sequences (A1) of SEQ ID NOs: 45 to 81 It may be a molecule or a nucleic acid molecule containing the base sequence. That is, the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) may have, for example, the 5 ′ terminal ggg deleted in any one of the nucleotide sequences (A1) of SEQ ID NOs: 45 to 81.
  • the base sequence (A1) may include a motif sequence represented by SEQ ID NO: 114, for example.
  • n is adenine (a), cytosine (c), guanine (g), uracil (u), thymine (t), and the fifth base n is adenine (a), the 13th base n is preferably cytosine (c), and n at the 17th base is preferably adenine (a).
  • Examples of the base sequence (A1) containing the motif sequence include # 47 (SEQ ID NO: 65), # 80 (SEQ ID NO: 67), R8c6_1 (SEQ ID NO: 74), and R8c6_14 (SEQ ID NO: 75).
  • Motif sequence (SEQ ID NO: 114) uaagncacguagnaccng
  • each base is the same as described above, for example. That is, the base may be, for example, the natural base (non-artificial base) of adenine (a), cytosine (c), guanine (g), thymine (t) and uracil (u), or the artificial base (non-artificial base) Natural base).
  • the artificial base is, for example, as described above.
  • the bases represented by a, g, c, t and u mean the artificial base having the same function as each of the natural bases in addition to the natural bases. Including.
  • the structural unit of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) is not particularly limited, and is the same as described above. That is, the structural unit is, for example, a nucleotide residue, and examples of the nucleotide residue include a ribonucleotide residue and a deoxyribonucleotide residue.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) may be, for example, RNA composed of ribonucleotide residues or DNA composed of deoxyribonucleotide residues, and is preferably RNA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) may include both deoxyribonucleotides, which are DNA constituent units, and ribonucleotides, which are RNA constituent units.
  • the base sequences of SEQ ID NO: 1-42 and SEQ ID NO: 45-81 may be any sequence as long as the bases are continuous as described above, for example, may be RNA composed of ribonucleotide residues, or deoxyribonucleotides It may be DNA composed of residues, RNA containing deoxyribonucleotide residues, or RNA containing ribonucleotide residues.
  • examples of the structural unit include monomer residues such as PNA, LNA, and ENA.
  • examples of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) include RNA or DNA containing at least one monomer residue of PNA, LNA and ENA.
  • the number is not particularly limited.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) is preferably resistant to nucleases as described above, for example.
  • the method for making the nuclease resistant is not particularly limited, and is the same as described above.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) is preferably RNA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) is RNA, it is preferably resistant to RNase, for example.
  • the technique for making the RNase resistant is not particularly limited and is the same as described above.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) is RNA
  • the modified nucleotide residue include the aforementioned modified nucleotide residues.
  • all or some of the nucleotide residues constituting the RNA may be the deoxyribonucleotide residue and / or the LNA residue. It is preferably a group.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) is RNA, for example, among the nucleotide residues constituting the RNA, all or part of the nucleotide residues having uracil are left as nucleotide residues having thymine. It may be substituted with a group, specifically, it may be substituted with a deoxyribonucleotide residue having the thymine.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) is RNA, for example, it is preferable that the PEG or the deoxythymidine is present at the 5 'end and / or the 3' end as described above.
  • the nucleic acid molecule which consists of a base sequence substituted by thymine or the nucleic acid molecule containing the said base sequence can be illustrated as a nucleic acid molecule of (A2) mentioned later, for example.
  • the length of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) is not particularly limited, but the total length thereof is, for example, 20 to 160 bases, preferably 30 to 120 bases, more preferably 40 to 100 bases. It is.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule A2
  • A2 a nucleic acid molecule comprising one or a plurality of bases substituted, deleted, added or inserted in the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-42 and capable of binding to HMGB1
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A2) may be a nucleic acid molecule containing the substituted base sequence or a nucleic acid molecule composed of the substituted base sequence.
  • the substituted base sequence is also referred to as a base sequence (A2).
  • “One or more” is not particularly limited. “One or more” is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, in any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 42, One or two is preferable, and one is particularly preferable. Further, “one or more” is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, in the full-length sequence of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1). More preferably, it is one or two, and particularly preferably one.
  • the base used for the substitution, addition or insertion is not particularly limited, and may be, for example, the natural base or the artificial base. For the substitution, addition or insertion of the base, for example, the nucleotide residue may be used, or the monomer residue may be used.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the following nucleic acid molecule (A3).
  • the nucleic acid molecule (A3) is referred to as HMGB1-binding nucleic acid molecule (A3).
  • A3) a nucleic acid molecule comprising a base sequence having 60% or more homology in the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-42 and capable of binding to HMGB1
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A3) may be a nucleic acid molecule containing the homologous base sequence or a nucleic acid molecule consisting of the homologous base sequence.
  • the base sequence having the homology is also referred to as a base sequence (A3).
  • the homology is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A3) may be, for example, a nucleic acid molecule that includes a base sequence having 60% or more homology in the full-length sequence of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) and can bind to HMGB1.
  • the homology is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the homology can be calculated, for example, by calculating under default conditions using BLAST or the like.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the following (A4) nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule (A4) is referred to as HMGB1-binding nucleic acid molecule (A4).
  • Nucleic acid comprising a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-42 under stringent conditions or a base sequence complementary to the base sequence and capable of binding to HMGB1 molecule
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A4) may be a nucleic acid molecule consisting of the hybridizing base sequence or a nucleic acid molecule containing the base sequence.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A4) may be a nucleic acid molecule comprising the complementary base sequence or a nucleic acid molecule comprising the complementary base sequence.
  • the hybridizing base sequence and the complementary base sequence are also referred to as a base sequence (A4).
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule “hybridizes under stringent conditions” is, for example, well-known experimental conditions for hybridization by those skilled in the art.
  • stringent conditions refers to, for example, hybridization at 60 to 68 ° C. in the presence of 0.7 to 1 mol / L NaCl, and then 0.1 to 2 times the SSC solution. Used refers to conditions that can be identified by washing at 65-68 ° C. 1 ⁇ SSC consists of 150 mmol / L NaCl and 15 mmol / L sodium citrate.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A4) includes, for example, a nucleic acid molecule that includes a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the full-length base of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) and is capable of binding to HMGB1. But you can.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecules (A2) to (A4) are the same as the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) unless otherwise indicated, for example, base, constitutional unit, length, nuclease resistance and the like.
  • the nucleic acid molecule (B1) is referred to as HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1).
  • the base sequence represented by SEQ ID NOs: 45 to 81 is also referred to as a base sequence (B1).
  • B1 a nucleic acid molecule comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 45 to 81
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 45 to 81 are as described above.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) containing the base sequence represented by SEQ ID NOs: 45 to 81 may be represented by the names shown before the aforementioned SEQ ID NOs.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) may be, for example, a nucleic acid molecule consisting of the base sequence (B1) represented by any one of SEQ ID NOs: 45 to 81, or a nucleic acid molecule containing the base sequence (B1). Good.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is, for example, a nucleic acid comprising a base sequence from the 4th base on the 5 ′ side to the terminal base on the 3 ′ side in any one of the base sequences (B1) of SEQ ID NOs: 45 to 81 It may be a molecule or a nucleic acid molecule containing the base sequence. That is, the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) may lack, for example, the 5 ′ terminal ggg in any one of the base sequences (A1) of SEQ ID NOs: 45 to 81.
  • the base sequence (B1) may include a motif sequence represented by SEQ ID NO: 114, for example.
  • n is adenine (a), cytosine (c), guanine (g), uracil (u), thymine (t), and the fifth base n is adenine (a), the 13th base n is preferably cytosine (c), and n at the 17th base is preferably adenine (a).
  • Examples of the base sequence (B1) including the motif sequence include # 47 (SEQ ID NO: 65), # 80 (SEQ ID NO: 67), R8c6_1 (SEQ ID NO: 74), and R8c6_14 (SEQ ID NO: 75).
  • Motif sequence (SEQ ID NO: 114) uaagncacguagnaccng
  • the predicted secondary structure of R8c6_1 (SEQ ID NO: 74) is shown in FIG.
  • the circled base corresponds to the motif sequence.
  • the base corresponding to “n” in the motif sequence is omitted from the circle.
  • each base is the same as described above, for example. That is, the base may be, for example, the natural base (non-artificial base) of adenine (a), cytosine (c), guanine (g), thymine (t) and uracil (u), or the artificial base (non-artificial base) Natural base).
  • the artificial base is, for example, as described above.
  • the bases represented by a, g, c, t and u mean the artificial base having the same function as each of the natural bases in addition to the natural bases. Including.
  • the structural unit of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is not particularly limited, and is the same as described above. That is, the structural unit is, for example, a nucleotide residue, and examples of the nucleotide residue include a ribonucleotide residue and a deoxyribonucleotide residue.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) may be, for example, RNA composed of ribonucleotide residues or DNA composed of deoxyribonucleotide residues, and is preferably RNA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (A1) may include both deoxyribonucleotides, which are DNA constituent units, and ribonucleotides, which are RNA constituent units.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 45 to 81 may be any sequence as long as the bases are continuous as described above, for example, may be RNA composed of ribonucleotide residues, or composed of deoxyribonucleotide residues. It may be DNA, RNA containing deoxyribonucleotide residues, or RNA containing ribonucleotide residues.
  • examples of the structural unit include monomer residues such as PNA, LNA, and ENA.
  • examples of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) include RNA or DNA containing at least one monomer residue of PNA, LNA and ENA.
  • the number is not particularly limited.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is preferably resistant to nucleases as described above, for example.
  • the method for making the nuclease resistant is not particularly limited, and is the same as described above.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is preferably RNA.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is RNA, it is preferably resistant to RNase, for example.
  • the technique for making the RNase resistant is not particularly limited and is the same as described above.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is RNA
  • the modified nucleotide residue include the aforementioned modified nucleotide residues.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is RNA, for example, as described above, all or some of the nucleotide residues constituting the RNA are the deoxyribonucleotide residues and / or the LNA residues. It is preferably a group.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is RNA, as described above, for example, among nucleotide residues constituting RNA, all or part of nucleotide residues having uracil have nucleotide residues having thymine. It may be substituted with a group, specifically, it may be substituted with a deoxyribonucleotide residue having the thymine.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is RNA, for example, it is preferable that the PEG or the deoxythymidine is present at the 5 'end and / or 3' end, as described above.
  • the nucleic acid molecule which consists of a base sequence substituted by thymine or the nucleic acid molecule containing the said base sequence can be illustrated as a nucleic acid molecule of (B2) mentioned later, for example.
  • the length of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is not particularly limited, but the total length is, for example, 20 to 160 bases, preferably 30 to 120 bases, more preferably 40 to 100 bases. It is.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) is preferably the nucleic acid molecule (b1) below.
  • the nucleic acid molecule (b1) is also referred to as HMGB1-binding nucleic acid molecule (b1).
  • the HMGB1 nucleic acid molecule (b1) may be, for example, a nucleic acid molecule having the base sequence of SEQ ID NO: 74 or a nucleic acid molecule having the base sequence.
  • (B1) a nucleic acid molecule comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 74
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule B2
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule B2
  • a nucleic acid molecule comprising a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 45 to 81 and capable of binding to HMGB1
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B2) may be a nucleic acid molecule containing the substituted base sequence or a nucleic acid molecule composed of the substituted base sequence.
  • the substituted base sequence is also referred to as a base sequence (B2).
  • “One or more” is not particularly limited as long as the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B2) can bind to HMGB1.
  • the number of the substituted bases is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, in any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 45 to 81, More preferably, it is one or two, and particularly preferably one.
  • the number of added or inserted bases is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, in any of the base sequences of SEQ ID NOs: 45 to 81. Yes, more preferably one or two, and particularly preferably one.
  • the number of deleted bases is not particularly limited. For example, in the base sequence of any of SEQ ID NOs: 45 to 81, 1 to 46, 1 to 43, 1 to 21 and ⁇ 1 to 18 1 to 4, 1 to 3, 2 or 1.
  • the length of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B2) is not particularly limited, but the total length thereof is, for example, 20 to 160 bases, preferably 30 to 120 bases, more preferably 40 to 100 bases. It is.
  • the nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule obtained by downsizing the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1).
  • the miniaturized nucleic acid molecule is also referred to as a miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (B2).
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule has not only one or more bases deleted in the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 45 to 81, but also, for example, 1 Alternatively, it may be a nucleic acid molecule containing a base sequence in which a plurality of bases are substituted, added or inserted, and capable of binding to HMGB1.
  • the miniaturized HMGB1 binding nucleic acid molecule (B2) may be a nucleic acid molecule containing the deleted base sequence, or a nucleic acid molecule consisting of the deleted base sequence.
  • the deleted base sequence is also referred to as a miniaturized base sequence.
  • the number of bases deleted is not particularly limited, and is as described above, for example.
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (B2) is, for example, a nucleic acid molecule consisting of a base sequence from the 4 ′ base on the 5 ′ side to the terminal base on the 3 ′ side in the base sequence of SEQ ID NOs: 45 to 81 or the base sequence And nucleic acid molecules containing. That is, the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (B2) is, for example, a nucleic acid molecule comprising a base sequence in which the 5 ′ terminal ggg is deleted in the base sequence (B1) of any of SEQ ID NOs: 45 to 81 Examples include nucleic acid molecules that contain sequences.
  • the length of the miniaturized HMGB1 binding nucleic acid molecule (B2) is not particularly limited, but the total length is, for example, 20 to 160 bases, preferably 30 to 120 bases, more preferably 40 to 100. Base length.
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (B2) for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 74, one or a plurality of bases contains a deleted base sequence and can be bound to HMGB1 A molecule is preferable, and specifically, a nucleic acid molecule of the following (b2) is preferable.
  • the nucleic acid molecule (b2) is also referred to as a miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2).
  • (B2) a nucleic acid molecule comprising a partial sequence of 11 or more consecutive bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 74 and capable of binding to HMGB1
  • the continuous partial sequence of 11 bases or more is hereinafter also referred to as a continuous partial sequence.
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2) may be a nucleic acid molecule composed of the continuous partial sequence or a nucleic acid molecule containing the continuous partial sequence.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule for example, as described above, in the base sequence of SEQ ID NO: 74, not only one or more bases are deleted, but also one or more bases are It may be a nucleic acid molecule comprising a substituted, added or inserted nucleotide sequence and capable of binding to HMGB1.
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2) may include, for example, one sequence of the continuous partial sequence of 11 or more bases in the base sequence of SEQ ID NO: 74, or two or more sequences.
  • the length of the continuous partial sequence is 11 bases or more as described above.
  • the length of the continuous partial sequence is not particularly limited, and may be, for example, 12 bases or more, 14 bases or more, or 16 bases or more.
  • the upper limit of the length of the continuous partial sequence is not particularly limited, and is 80 bases or less, preferably 79 bases or less.
  • the continuous partial sequence is not particularly limited, and examples thereof include the following y sequence, x sequence, and y ′ sequence.
  • Examples of the y sequence include the first to twentieth and fourth to twentieth regions in the base sequence of SEQ ID NO: 74.
  • the x sequence is, for example, 21st to 60th, 22nd to 60th, 24th to 60th, 25th to 60th, 29th to 60th, 34th to 60th in the base sequence of SEQ ID NO: 74.
  • the y ′ sequence is, for example, the 61st to 80th, the 61st to 79th, the 61st to 77th, the 61st to 76th, the 61st to 78th, the 64th to the 64th sequence in the base sequence of SEQ ID NO: 74.
  • Examples include the 80th, 65th to 80th, 70th to 80th, and 64th to 77th areas.
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2) may be, for example, a nucleic acid molecule consisting of the base sequence (b2) or a nucleic acid molecule containing the base sequence (b2).
  • Examples of the base sequence (b2) include a base sequence including the x sequence and the y ′ sequence, and a base sequence including the y sequence, the x sequence, and the y ′ sequence.
  • the base sequence (b2) preferably includes, for example, the y sequence on the 5 'side of the x sequence and the y' sequence on the 3 'side of the x sequence.
  • the base sequence (b2) may have, for example, the 5 'terminal ggg in the y sequence deleted.
  • Examples of the base sequence (b2) include base sequences represented by SEQ ID NOs: 83 to 113. These base sequences are shown in Table 1 below. In Table 1 below, each base sequence is shown to correspond to the base sequence of SEQ ID NO: 74. For each base sequence, as compared with the base sequence of SEQ ID NO: 74, the deleted portion is indicated by a blank, and different bases are underlined.
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2) containing the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 83 to 113 may be represented by names shown in Table 1 below, respectively.
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2) may be, for example, a nucleic acid molecule having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 83 to 113, or any one of SEQ ID NOs: 83 to 113. It may be a nucleic acid molecule containing the represented base sequence.
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2) is, for example, from the fourth base on the 5 ′ side to the terminal base on the 3 ′ side in any one of the base sequences (b2) of SEQ ID NO: 74 and SEQ ID NOS: 83 to 113 Or a nucleic acid molecule comprising the base sequence. That is, in the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2), for example, the 5 ′ terminal ggg may be deleted in any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 74 and SEQ ID NOs: 83 to 113.
  • the base sequence (b2) may include a motif sequence represented by SEQ ID NO: 114, for example.
  • n is adenine (a), cytosine (c), guanine (g), uracil (u), thymine (t), and the fifth base n is adenine (a), the 13th base n is preferably cytosine (c), and n at the 17th base is preferably adenine (a).
  • the base sequence (b2) containing the motif sequence is, for example, R8c6_1-1 (SEQ ID NO: 83), R8c6_1-3 (SEQ ID NO: 84), R8c6_1-4 (SEQ ID NO: 85), R8c6_1-15 (SEQ ID NO: 86), R8c6_1-18 (SEQ ID NO: 87), R8c6_1-20 (SEQ ID NO: 88), R8c6_1-21 (SEQ ID NO: 89), R8c6_1-25 (SEQ ID NO: 90), R8c6_1-18-S2 (SEQ ID NO: 93), R8c6_1-18 -S4 (SEQ ID NO: 94), R8c6_1-18-S6 (SEQ ID NO: 95), R8c6_1-21-S6 (SEQ ID NO: 96), R8c6_1-22-S6 (SEQ ID NO: 97), R8c6_1-23-S6 (SEQ ID NO: 98)
  • the base sequence (B1) including a part of the motif sequence is, for example, R8c6_1-30 (SEQ ID NO: 91), R8c6_1-34CC (SEQ ID NO: 92), R8c6_1-26-S6 (SEQ ID NO: 101), R8c6_1- 25-S6A2 (SEQ ID NO: 104), R8c6_1-25-S6C (SEQ ID NO: 106) and the like.
  • Motif sequence (SEQ ID NO: 114) uaagncacguagnaccng
  • the predicted secondary structure of R8c6_1-18 (SEQ ID NO: 74) is shown in FIG.
  • the circled base corresponds to the motif sequence.
  • the base corresponding to “n” in the motif sequence is omitted from the circle.
  • the predicted secondary structure of R8c6_1-25-S6 (SEQ ID NO: 100) is shown in FIG.
  • the circled base corresponds to the motif sequence.
  • the base corresponding to “n” in the motif sequence is omitted from the circle.
  • the length of the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2) is not particularly limited, but the total length is, for example, 20 to 160 bases, preferably 30 to 120 bases, more preferably 40 to 100. Base length.
  • the base sequence (b2) is not particularly limited in the total length, but the lower limit thereof is, for example, 20 base length or more, 30 base length or more, 34 base length As mentioned above, it is 37 base length or more and 40 base length or more, The upper limit is 160 bases or less, 120 bases or less, 100 bases or less, 80 bases or less, for example, Preferably it is 79 bases or less.
  • the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (B2) is, for example, a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added or inserted in the continuous partial sequence of the miniaturized HMGB1-binding nucleic acid molecule (b2). And a nucleic acid molecule capable of binding to HMGB1.
  • the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 83 to 113 one or a plurality of bases includes a base sequence in which substitution, deletion, addition or insertion is included, and binds to HMGB1 Possible nucleic acid molecules are mentioned.
  • the number of bases for the substitution and the like is not particularly limited, and in the base sequence of any of SEQ ID NOs: 83 to 113, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to The number is 3, more preferably 1 or 2, and particularly preferably 1.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the following (B3) nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule (B3) is referred to as HMGB1-binding nucleic acid molecule (B3).
  • (B3) a nucleic acid molecule comprising a base sequence having 60% or more homology in the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 45 to 81 and capable of binding to HMGB1
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B3) may be a nucleic acid molecule containing the homologous base sequence or a nucleic acid molecule consisting of the homologous base sequence.
  • the homology is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B3) may be, for example, a nucleic acid molecule that includes a base sequence having 60% or more homology in the full-length sequence of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) and can bind to HMGB1.
  • the homology is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the homology can be calculated, for example, by calculating under default conditions using BLAST or the like.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the following nucleic acid molecule (B4).
  • the nucleic acid molecule (B4) is referred to as HMGB1-binding nucleic acid molecule (B4).
  • (B4) a nucleic acid comprising a base sequence that hybridizes with the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 45 to 81 under stringent conditions or a base sequence complementary to the base sequence and capable of binding to HMGB1 molecule
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B4) may be a nucleic acid molecule consisting of the hybridizing base sequence or a nucleic acid molecule containing the base sequence. Further, the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B4) may be a nucleic acid molecule composed of the complementary base sequence or a nucleic acid molecule containing the complementary base sequence.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule B4
  • “hybridizes under stringent conditions” is, for example, well-known experimental conditions for hybridization by those skilled in the art.
  • stringent conditions refers to, for example, hybridization at 60 to 68 ° C. in the presence of 0.7 to 1 mol / L NaCl, and then 0.1 to 2 times the SSC solution. Used refers to conditions that can be identified by washing at 65-68 ° C. 1 ⁇ SSC consists of 150 mmol / L NaCl and 15 mmol / L sodium citrate.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B4) includes, for example, a nucleic acid molecule that includes a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the full-length base of the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) and is capable of binding to HMGB1. But you can.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecules (B2) to (B4) are the same as the HMGB1-binding nucleic acid molecule (B1) unless otherwise indicated, for example, base, constitutional unit, length, nuclease resistance and the like.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is the double-stranded nucleic acid, for example, one single strand is any one of the nucleic acid molecules (A1) to (A4) and (B1) to (B4).
  • the MGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be further combined with a linker sequence such as polyadenine within the range that does not affect the binding property to HMGB1.
  • a linker sequence such as polyadenine within the range that does not affect the binding property to HMGB1.
  • the production method of the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is not limited at all, and can be synthesized by a known method such as a nucleic acid synthesis method using chemical synthesis.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a nucleic acid molecule consisting of the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 42 as described above, or a nucleic acid molecule containing the base sequence. . In the latter case, the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, a base sequence other than the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1-42.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention includes, for example, a Y region, an X region and a Y ′ region, and the Y region, the X region and the Y ′ region are linked from the 5 ′ end.
  • the X region includes a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 42, and the Y region and the Y ′ region each have an arbitrary base sequence. Preferably it consists of.
  • the number of bases in the X region is not particularly limited, but is, for example, 10 to 60 bases, preferably 15 to 50 bases, and more preferably 20 to 40 bases.
  • the number of bases in the Y region and Y ′ region is not particularly limited, but is, for example, 10 to 50 bases, preferably 15 to 40 bases, and more preferably 20 to 30 bases.
  • the total number of bases of the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 20 to 160 bases, preferably 30 to 120 bases, and more preferably 40 to 100 bases.
  • the base sequence of the Y region and the base sequence of the Y ′ region are not particularly limited, but preferably include, for example, a primer binding sequence that can be annealed by a primer, a polymerase recognition sequence that can be recognized by a polymerase, and the like.
  • a primer binding sequence that can be annealed by a primer
  • a polymerase recognition sequence that can be recognized by a polymerase, and the like.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention when amplified by a nucleic acid amplification method, includes, for example, a primer binding sequence that can hybridize with a primer and a polymerase recognition sequence that can be recognized by a polymerase. Is preferred.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention has, for example, the primer binding to at least one of 5 ′ upstream of the X region, that is, the Y region, and 3 ′ downstream of the X region, that is, the Y ′ region. It preferably includes a sequence and a polymerase recognition sequence.
  • the polymerase recognition region can be appropriately determined according to, for example, the type of polymerase used in nucleic acid amplification.
  • the polymerase recognition sequence is preferably, for example, a DNA-dependent RNA polymerase recognition sequence (hereinafter also referred to as “RNA polymerase recognition sequence”), and specific examples include T7 RNA. Examples include the T7 promoter which is a recognition sequence for polymerase.
  • the 5′-side Y region comprises the RNA polymerase recognition sequence and the primer-binding sequence (hereinafter also referred to as “5′-side primer region”).
  • the X region is preferably connected to the 3 'side of the Y region. Furthermore, it is preferable that the Y ′ region is linked to the 3 ′ side of the X region, and the Y ′ region includes a primer binding sequence (hereinafter also referred to as “3 ′ side primer region”).
  • the 5 ′ primer region in the RNA is capable of binding to a sequence complementary to the 3 ′ side of a DNA antisense strand synthesized using, for example, the RNA, that is, the 3 ′ side of the antisense strand.
  • the sequence is preferably the same as that of the primer.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may further have a region that assists binding to HMGB1, for example.
  • the Y region and the X region, and the X region and the Y ′ region may be directly adjacent to each other, or indirectly via an intervening sequence. May be adjacent to
  • the method for preparing the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention by nucleic acid amplification is not particularly limited.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is RNA, for example, it can be prepared using DNA as a template.
  • a DNA strand that is a template for RNA is also referred to as an antisense strand
  • a DNA strand that includes a sequence in which uracil (u) of RNA is replaced with thymine (t) is also referred to as a sense strand.
  • the template DNA includes, for example, DNA (antisense strand) in which uracil (u) of the complementary region of the X region in the RNA is replaced with thymine (t), and uracil (u) of the X region is converted to thymine (t). It is preferable to include any one of DNAs (sense strands) containing the sequence substituted in (). Using these DNAs as templates and performing nucleic acid amplification using DNA-dependent DNA polymerase, using the obtained DNA amplification products as templates, and further using the DNA-dependent RNA polymerase to transcribe RNA, RNA can be amplified.
  • RNA is prepared by reverse transcription using an RNA-dependent DNA polymerase, DNA is amplified by PCR using the cDNA as a template, and the resulting DNA amplification product is used as a template.
  • the RNA may be amplified by transcribing the RNA using a DNA-dependent RNA polymerase.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is DNA
  • the DNA can be amplified by a polymerase chain reaction (PCR) method or the like.
  • the X region can be exemplified by the x sequence described above, for example.
  • the base sequences of the Y region and Y ′ region are not particularly limited and can be arbitrarily determined.
  • the sequence of the Y region include, for example, a sequence including the base sequence represented by any of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 115 and a sequence consisting of the base sequence.
  • the Y region can be exemplified by the above-described y arrangement, for example. These sequences are merely examples, and do not limit the present invention.
  • sequence of the Y ′ region examples include, for example, a sequence containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 44 and a sequence consisting of the base sequence.
  • the Y ′ region can be exemplified by the y ′ sequence described above, for example. These sequences are merely examples, and do not limit the present invention. ucagugccuggacgugcagu (SEQ ID NO: 44)
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention may have a secondary structure by self-annealing, for example.
  • the secondary structure include a stem loop structure.
  • the stem loop structure may be formed, for example, by forming any of the Y region, the X region, and the Y ′ region into a double strand.
  • a part of the Y region may form a stem-loop structure by forming a double strand with a part of the X region, or a part of the Y ′ region may A stem loop structure may be formed by forming a double strand with a part of the X region.
  • a part of the Y region and a part of the Y ′ region may form a stem-loop structure by forming a double strand with a part of the X region, respectively.
  • a stem loop structure may be formed by forming a double strand inside the Y region, or a stem loop structure may be formed by forming a double strand inside the Y ′ region.
  • a stem loop structure may be formed inside the Y region and the Y ′ region.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention can bind to HMGB1, it can be used, for example, as a neutralizing agent that neutralizes the function of HMGB1 by binding to HMGB1.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention can bind to HMGB1 as described above, it can be used, for example, as an inhibitor that inhibits the function of HMGB1 by binding to HMGB1.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention can bind to HMGB1 as described above, it can be used as a pharmaceutical for preventing or treating a disease caused by the expression of HMGB1.
  • the medicament of the present invention can be used as, for example, an anticancer agent, an anti-inflammatory agent, an anti-stroke agent and the like.
  • the neutralizing agent of the present invention, the inhibitor of the present invention, and the pharmaceutical agent of the present invention only need to contain the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations are not limited at all.
  • the neutralizing agent of the present invention, the inhibitor of the present invention, and the pharmaceutical agent of the present invention may each contain, for example, a carrier.
  • a carrier for example, the same as the composition shown below Can be used in the same manner.
  • composition of the present invention comprises the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the composition of this invention should just contain the HMGB1 binding nucleic acid molecule of the said this invention, and another structure is not restrict
  • composition of the present invention can bind to HMGB1 as described above, it can be used, for example, as a neutralizing agent that neutralizes the function of HMGB1 by binding to HMGB1.
  • composition of the present invention can bind to HMGB1 as described above, it can be used, for example, as an inhibitor that inhibits the function of HMGB1 by binding to HMGB1.
  • composition of the present invention can bind to HMGB1 as described above, it can be used as a pharmaceutical for preventing or treating a disease caused by the expression of HMGB1.
  • the medicament of the present invention can be used as, for example, an anticancer agent, an anti-inflammatory agent, an anti-stroke agent and the like.
  • the application target of the composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the use.
  • Examples of the application target include cells, tissues, and living bodies.
  • the origin of the cells and tissues and the type of living body are not particularly limited.
  • Examples of the living body include organisms having the HMGB1 gene and / or the HMGB1 ortholog gene, and specific examples include animals such as humans, non-human mammals other than humans, birds, and fish.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include oral administration and parenteral administration.
  • the parenteral administration include intravenous administration, arterial administration, administration to lymphatic vessels, intramuscular administration, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration, intraperitoneal administration, and local administration.
  • composition of the present invention may contain, for example, various additives in addition to the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the additive is not particularly limited, and can be appropriately determined depending on the use of the composition of the present invention, for example.
  • the composition of the present invention preferably further contains a carrier as the additive.
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include nanoparticles, liposomes, micelles, reverse micelles, polycations, cell membrane permeable peptides, magnetic particles, and calcium phosphate.
  • the nanoparticles are not particularly limited, and examples thereof include nanocarbons such as carbon nanohorns and carbon nanotubes. Any one kind of these carriers may be used, or two or more kinds may be used in combination.
  • the additive include a buffer, a metal salt, and a surfactant.
  • the detection reagent of the present invention is the HMGB1 detection reagent for detecting HMGB1, comprising the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the present invention is not limited as long as it contains the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the HMGB1 binding nucleic acid molecule of the present invention can bind to HMGB1. Therefore, for example, HMGB1 in a sample can be qualitatively or quantified by confirming the presence or absence of binding between the HMGB1 binding nucleic acid molecule of the present invention and HMGB1 using the detection reagent of the present invention.
  • the method for confirming the presence or absence of binding between the HMGB1-binding nucleic acid molecule and HMGB1 is not particularly limited, and a known method for detecting binding between a nucleic acid and a protein can be used. Thus, if the detection reagent of this invention is used, since HMGB1 can be detected easily, it is useful, for example in the field of biochemistry or clinical.
  • the therapeutic method of the present invention comprises a step of administering the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention to a subject having a disease associated with the HMGB1.
  • the disease involving HMGB1 is not particularly limited, and examples thereof include at least one disease selected from the group consisting of cancer, inflammation, and stroke. Examples of the cancer include breast cancer, colon cancer, melanoma, prostate cancer, pancreatic cancer and lung cancer.
  • the treatment method of the present invention for example, prevention of the disease, suppression of progression of the disease, treatment of the disease, and the like are possible.
  • the treatment method of the present invention includes the meaning of a prevention method, and may include a step of administering the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention to a subject at risk of the disease.
  • the administration method, administration conditions, etc. of the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention are not particularly limited and are as described above.
  • the administration subject for example, patient
  • the living body include organisms having the HMGB1 gene and / or the HMGB1 ortholog gene, and specific examples include animals such as humans, non-human mammals other than humans, birds, and fish.
  • the composition of the present invention may be administered.
  • the present invention is characterized in that it is a nucleic acid molecule for use in the treatment of a disease involving HMGB1.
  • the nucleic acid molecule is the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is as described above.
  • the present invention is also characterized in that it is a composition for use in the treatment of a disease involving HMGB1.
  • the composition is the composition of the present invention comprising the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the composition of the present invention is as described above.
  • RNA aptamers capable of binding to HMGB1 were prepared, and the binding ability to HMGB1 was confirmed for each RNA aptamer.
  • RNA aptamer # 47 (SEQ ID NO: 65), # 80 (SEQ ID NO: 67), # 06 (SEQ ID NO: 56), # 36 (SEQ ID NO: 60), # 34 (SEQ ID NO: 63), # 08 (SEQ ID NO: 46), each RNA aptamer of # 10 (SEQ ID NO: 58) was prepared by a known nucleic acid synthesis method and used as an RNA aptamer in the examples.
  • An RNA library (40N) containing a plurality of RNAs consisting of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 82 including a 40-base long random sequence was used as a comparative RNA (hereinafter the same).
  • n is adenine, guanine, cytosine, thymine or uracil.
  • 40N SEQ ID NO: 82
  • a BIACORE dedicated sensor chip (trade name Sensor Chip SA, manufactured by GE Healthcare) was set on the BIACORE (registered trademark) X. 5 ⁇ mol / L of biotinylated deoxythymidine was injected into the flow cell 2 of the sensor chip using a running buffer and allowed to bind until the signal intensity (RU: Resonance Unit) was about 1000 RU.
  • RU Resonance Unit
  • the biotinylated deoxythymidine a 20-base deoxythymidine having a biotinylated 5 ′ end was used.
  • RNA aptamer was injected into the flow cells 1 and 2 of the chip for 1 minute at a flow rate of 20 ⁇ L / min using a running buffer, and was bound until the signal intensity reached about 1000 RU.
  • 675 nmol / L of the His-tag-added HMGB1 was injected with the running buffer at a flow rate of 20 ⁇ L / min for 30 seconds, followed by washing with the running buffer flowing under the same conditions.
  • the signal intensity was measured.
  • the composition of the running buffer was 20 mmol / L HEPES, 500 mmol / L NaCl, 0.1 mmol / L MgCl 2 , 0.1% Triton X-100 (registered trademark), and its pH was 7.2. Further, tRNA was used at a concentration of 1 mg / mL as a blocking agent for suppressing nonspecific binding.
  • the signal intensity was measured in the same manner except that the RNA of the comparative example was used instead of the RNA aptamer of the above example.
  • FIG. 1 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to the His-tag added HMGB1.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (second).
  • -10 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the injection start time of the His-tag added HMGB1
  • 0 seconds to 30 seconds is the His- The tag addition HMGB1 injection time
  • after 30 seconds is the washing time with the running buffer.
  • the dissociation constant between each RNA aptamer and the His-tag added HMGB1 was determined from the obtained signal intensity.
  • Table 2 the RNA of the comparative example has a dissociation constant of 1.04 ⁇ 10 ⁇ 6
  • each RNA aptamer of the above example has a dissociation constant of 10 ⁇ 13 to 10 ⁇ .
  • An excellent value of 7 orders was shown, and it was found that the binding ability to the His-tag added HMGB1 was excellent.
  • the # 06 and # 08 RNA aptamers have dissociation constants on the order of 10 ⁇ 10 and 10 ⁇ 11 , respectively, which are well below the general order of antibodies (10 ⁇ 9 order). High binding ability was shown.
  • the # 47 and # 80 RNA aptamers show 10 ⁇ 12 and 10 ⁇ 13 orders, respectively, which are orders not reported at the time of filing.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to HMGB1.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (seconds).
  • -10 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the HMGB1 injection start time
  • 0 to 60 seconds is the HMGB1 injection time.
  • the time after 60 seconds is the time for washing with the running buffer.
  • each RNA aptamer of the Example also showed high binding ability for HMGB1 to which no His-tag was added. From this result, it was found that the RNA aptamer of Example was not an His-tag but an RNA aptamer that binds to HMGB1.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to the His-tag added MIF protein.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (seconds).
  • -10 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the injection start time of the His-tag added MIF protein
  • 0 seconds to 30 seconds is the His.
  • -Injection time of tag-added MIF protein, and after 30 seconds is the time for washing with the running buffer.
  • each RNA aptamer of the example showed a slight increase in signal intensity during the injection of His-tag-added MIF protein (0 to 30 seconds), but it increases with time. However, after 30 seconds of washing, a rapid decrease in signal intensity was observed, and the signal intensity eventually became zero. From this, it was confirmed that each RNA aptamer of Example does not bind to His-tag.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to HMGB1 under physiological conditions.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (seconds).
  • -20 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the HMGB1 injection start time
  • 0 seconds to 45 seconds is the HMGB1 injection time.
  • the time after 45 seconds is the time for washing with the running buffer.
  • each RNA aptamer of the Example showed high binding ability to the HMGB1 even under physiological conditions. From this result, it was found that the RNA aptamer of Example was an aptamer that binds to HMGB1 even under physiological conditions. Therefore, it can be said that the RNA aptamer of the present invention can bind to HMGB1 in the living body with excellent binding ability even when administered to the living body, for example.
  • RNA aptamers capable of binding to HMGB1 were prepared, and the binding ability to HMGB1 was confirmed for each RNA aptamer.
  • RNA aptamer of R8c6_1 SEQ ID NO: 74
  • R8c6_14 SEQ ID NO: 75
  • FIG. 5 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to the His-tag added HMGB1.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (seconds).
  • -20 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the injection start time of the His-tag added HMGB1
  • 0 seconds to 60 seconds is the His- The tag addition HMGB1 injection time
  • 60 seconds is the washing time with the running buffer.
  • RNA aptamer As shown in FIG. 5, according to each RNA aptamer of the Example, since the increase in signal intensity was observed, it was found that the RNA aptamer was bound to the HMGB1. In addition, the dissociation constants of the RNA aptamers R8c6_1 and R8c6_14 were extremely low, 7.52 ⁇ 10 ⁇ 14 and 1.06 ⁇ 10 ⁇ 13 , respectively, indicating very excellent binding ability.
  • RNA aptamer of R8c6_1 (SEQ ID NO: 74) was further miniaturized and the binding ability to HMGB1 was confirmed.
  • RNA aptamer Each RNA aptamer shown in the following Table 3 was prepared by a known nucleic acid synthesis method, and used as an RNA aptamer in Examples.
  • the RNA aptamer had a nucleotide sequence in which the 5 ′ region or the 3 ′ region of R8c6_1 was deleted.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to the His-tag added HMGB1.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (seconds).
  • -20 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the injection start time of the His-tag added HMGB1
  • 0 seconds to 60 seconds is the His- The tag addition HMGB1 injection time
  • 60 seconds is the washing time with the running buffer.
  • each RNA aptamer in which R8c6_1 was miniaturized was bound to the HMGB1 because an increase in signal intensity was observed.
  • R8c6_1-15, R8c6_1-18, R8c6_1-20, and R8c6_1-21, in which the 5 ′ side of R8c6_1 was deleted, showed binding ability superior to R8c6_1.
  • RNA aptamer of R8c6_1 (SEQ ID NO: 74) was fluorinated to confirm the binding ability to HMGB1.
  • RNA aptamer Using 2′-fluoro-CTP and 2′-fluoro-UTP (hereinafter the same) in which the 2 ′ position of the ribose residue is fluorinated, each of those shown in Table 3 of Example 3 is used.
  • An RNA aptamer was prepared by a known nucleic acid synthesis method and used as a fluorinated RNA aptamer in the examples.
  • fluorinated RNA aptamer cytosine nucleotide residues and uracil nucleotide residues are fluorinated in the base sequences shown in Table 3 above.
  • Each fluorinated RNA aptamer is represented by 2'F-R8c6_1, 2'F-R8c6_1-1, 2'F-R8c6_1-4, 2'F-R8c6_1-15, 2'F-R8c6_1-18, 2'F, respectively. This is represented as -R8c6_1-21.
  • N40 the cytosine nucleotide residue and uracil nucleotide residue were fluorinated to produce fluorinated N40 (2′F-N40), which was used as a comparative example (the same applies hereinafter).
  • FIG. 7 is a graph showing the binding ability of each fluorinated RNA aptamer to HMGB1.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (seconds).
  • -20 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the HMGB1 injection start time
  • 0 to 60 seconds is the HMGB1 injection time.
  • the time after 60 seconds is the time for washing with the running buffer.
  • each of the fluorinated RNA aptamers in which R8c6_1 was miniaturized was found to be bound to the HMGB1 because an increase in signal intensity was observed.
  • 2'F-R8c6_1-18 exhibited excellent binding ability equivalent to unmodified R8c6_1.
  • Fluorinated RNA aptamers are generally known to exhibit RNase resistance. For this reason, since the fluorinated RNA aptamer having the binding ability to HMGB1 is difficult to be decomposed even when administered in vivo, for example, it can be said that it is useful for pharmaceuticals and the like.
  • R8c6_1 (SEQ ID NO: 74) and its miniaturized RNA aptamer R8c6_1-18 (SEQ ID NO: 87) were each fluorinated to confirm the binding ability to HMGB1.
  • RNA aptamer Using the 2′-fluoro-CTP and the 2′-fluoro-UTP, the RNA aptamers of R8c6_1 and R8c6_1-18 were prepared by a known nucleic acid synthesis method, and It was used as a modified RNA aptamer.
  • fluorinated RNA aptamer cytosine nucleotide residues and uracil nucleotide residues are fluorinated in the base sequences of R8c6_1 (SEQ ID NO: 74) and R8c6_1-18 (SEQ ID NO: 87).
  • Each fluorinated RNA aptamer is represented as 2'F-R8c6_1, 2'F-R8c6_1-18, respectively.
  • FIG. 8 is a graph showing the binding ability of each fluorinated RNA aptamer to the His-tag added HMGB1.
  • the vertical axis indicates the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis indicates the analysis time (seconds).
  • -20 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the injection start time of the His-tag added HMGB1
  • 0 seconds to 60 seconds is the His- The tag addition HMGB1 injection time
  • 60 seconds is the washing time with the running buffer.
  • each of the fluorinated RNA aptamers was found to be bound to the HMGB1 since an increase in signal intensity was observed.
  • 2'F-R8c6_1-18 exhibited excellent binding ability equivalent to unmodified R8c6_1.
  • FIG. 9 is a photograph of a pull-down assay showing the binding between HMGB1 and TLR-2.
  • tRNA “ ⁇ ” indicates the use of the binding buffer without tRNA added
  • tRNA “+” indicates the use of the binding buffer with tRNA added.
  • lane “M” is a molecular weight marker
  • lane “ ⁇ ” is a result of tRNA not added and RNA aptamer not added
  • lane “+” is a result of tRNA added and RNA aptamer not added
  • lane “40N” indicates the results of addition amounts of 4 ⁇ g, 2 ⁇ g, and 1 ⁇ g, respectively
  • lane “R8c6_1-18” indicates the results of addition amounts of 4 ⁇ g, 2 ⁇ g, and 1 ⁇ g, respectively.
  • the relative value with the detected HMGB1 amount corrected by the TLR-2 amount and the correction value of lane “+” as 100 is shown below each lane.
  • HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention is useful for the treatment of diseases involving HMGB1, for example.
  • RNA aptamer was fluorinated to confirm the binding ability to HMGB1.
  • RNA aptamer Using the 2′-fluoro-CTP and the 2′-fluoro-UTP, each RNA aptamer shown in the following Table 4 was prepared by a known nucleic acid synthesis method, and the fluorinated RNA aptamer of Example Used as. In the fluorinated RNA aptamer, cytosine nucleotide residues and / or uracil nucleotide residues are fluorinated in the base sequences shown in Table 4 below.
  • RNA aptamers in which uracil nucleotide residues and cytosine nucleotide residues are fluorinated are converted into 2′F-CU-R8c6_1, 2′F-CU- # 06, 2′F-CU-CU # 80, 2′F, respectively. This is represented as -CU-R4_9068.
  • RNA aptamers in which only cytosine nucleotide residues are fluorinated are designated as 2'FC-R8c6_1, 2'FC- # 06, 2'FC- # 80, and 2'FC-R4_9068, respectively. Represent.
  • RNA aptamers in which only uracil nucleotide residues are fluorinated are designated as 2′F-U-R8c6_1, 2′F-U- # 06, 2′F-U- # 80, and 2′F-U-R4 — 9068, respectively. Represent.
  • FIG. 10 is a graph showing the binding ability of each fluorinated RNA aptamer to the His-tag added HMGB1.
  • the vertical axis indicates the signal intensity (RU) measured with the BIACORE (registered trademark) X at the end of the injection of the His-tag added HMGB1.
  • the graph shows the results of 40N, # 06, # 80, R8c6_1, and HMGB1R4_9068 from the left.
  • “2′F-CU-modified” is the result of RNA aptamer in which both cytosine nucleotide residues and uracil nucleotide residues are fluorinated
  • “2′F-C-modified” is cytosine.
  • RNA aptamer in which only uracil nucleotide residues are fluorinated
  • non-modified is the result of RNA aptamer in which only nucleotide residues are fluorinated.
  • each fluorinated RNA aptamer showed an increase in signal intensity higher than that of the unmodified 40N of the comparative example, indicating that it was bound to the HMGB1.
  • 2′F-CU-R8c6_1, 2′F-C-R8c6_1 and 2′F-U-R8c6_1 show excellent binding ability, and in particular, 2′F-CU-R8c6_1 is an unmodified R8c6_1 and The binding ability was equivalent.
  • Example 8 The secondary structures of R8c6_1 (SEQ ID NO: 74) and R8c6_1-18 (SEQ ID NO: 87) were estimated. These secondary structures are shown in FIG.
  • RNA aptamer of R8c6_1 (SEQ ID NO: 74) was further miniaturized and the binding ability to HMGB1 was confirmed.
  • RNA aptamer Each RNA aptamer shown in Table 5 and Table 6 below was prepared by a known nucleic acid synthesis method, and used as an RNA aptamer in Examples.
  • the RNA aptamer in Table 5 is an aptamer obtained by miniaturizing R8c6_1.
  • FIG. 18 shows a schematic diagram of a presumed secondary structure of R8c6_1
  • FIG. 19 shows a predicted secondary structure of R8c6_1-18.
  • R8c6_1-25 and R8c6_1-18 have base sequences in which the 5 'region is deleted from R8c6_1.
  • R8c6_1-18-S2, R8c6_1-18-S4 and R8c6_1-18-S6 have their respective 5′-region deleted from R8c6_1 as in R8c6_1-18, and S2 shown in FIG.
  • the nucleotide sequence was deleted from the S4 or S6 region.
  • S2 and S4 are each a base pair region forming a stem structure
  • S6 is a region of a stem loop structure.
  • RNA aptamer in Table 6 is an aptamer obtained by further reducing the size of R8c6_1-25-S6 in Table 5.
  • FIG. 20 shows a schematic diagram of the predicted secondary structure of R8c6_1-25-S6.
  • R8c6_1-25-S6A2, R8c6_1-25-S6C, and R8c6_1-25-S8 each had a nucleotide sequence lacking the regions A2, C, and S8 shown in FIG.
  • R8c6_1-26-S6 was a base sequence in which one base on the 5 'side of R8c6_1-25-S6 was deleted.
  • FIGS. 12 and 13 are graphs showing the binding ability of each RNA aptamer to the His-tag added HMGB1, respectively.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (seconds).
  • -10 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the injection start time of the His-tag added HMGB1
  • 0 seconds to 30 seconds is the His- The tag addition HMGB1 injection time
  • after 30 seconds is the washing time with the running buffer.
  • each RNA aptamer having a reduced R8c6_1 size was found to be bound to the HMGB1 because an increase in signal intensity was observed.
  • R8c6_1-18-S2 and R8c6_1-25 showed binding ability superior to R8c6_1.
  • RNA aptamer was fluorinated to confirm the binding ability to HMGB1.
  • RNA aptamer Using the 2′-fluoro-CTP and the 2′-fluoro-UTP, each RNA aptamer shown in the following Table 7 was prepared by a known nucleic acid synthesis method, and the fluorinated RNA aptamer of Example Used as. In the fluorinated RNA aptamer, cytosine nucleotide residues and uracil nucleotide residues are fluorinated in the base sequences shown in Table 7.
  • RNA aptamers in which uracil nucleotide residues and cytosine nucleotide residues are fluorinated are converted into 2'F-R8c6_1-18-S6, 2'F-R8c6_1-25, 2'F-R8c6_1-25-S6, 2 ', respectively.
  • the N40 was also fluorinated using the 2′-fluoro-CTP and the 2′-fluoro-UTP.
  • FIG. 14 is a graph showing the binding ability of each fluorinated RNA aptamer to the His-tag added HMGB1.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (seconds).
  • -10 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the injection start time of the His-tag added HMGB1
  • 0 seconds to 30 seconds is the His- The tag addition HMGB1 injection time
  • after 30 seconds is the washing time with the running buffer.
  • each of the miniaturized fluorinated RNA aptamers was found to be bound to the HMGB1 because an increase in signal intensity was observed.
  • 2'F-R8c6_1-18-S6 and 2'-R8c6_1-25 showed excellent binding ability.
  • RNA aptamer of R8c6_1 (SEQ ID NO: 74) was further miniaturized and the binding ability to HMGB1 was confirmed.
  • RNA aptamer Each RNA aptamer shown in the following Table 8 was prepared by a known nucleic acid synthesis method, and used as an RNA aptamer in Examples.
  • RNA aptamer in Table 8 is an aptamer obtained by miniaturizing R8c6_1.
  • R8c6_1-21-S6, R8c6_1-22-S6, R8c6_1-23-S6, and R8c6_1-24-S6 each had a nucleotide sequence in which the 5 'region was deleted from R8c6_1-18-S6.
  • R8c6_1-21-S8, R8c6_1-22-S8, R8c6_1-23-S8, R8c6_1-24-S8 are arranged on the 5 ′ side as R8c6_1-21-S6, R8c6_1-22-S6, R8c6_1-, respectively.
  • 23-S6 and R8c6_1-24-S6, and the nucleotide sequence lacking the same region as S8 shown in FIG. 20 was used.
  • FIG. 15 is a graph showing the binding ability of each RNA aptamer to the His-tag added HMGB1.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (second).
  • -10 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the injection start time of the His-tag added HMGB1
  • 0 seconds to 30 seconds is the His- The tag addition HMGB1 injection time
  • after 30 seconds is the washing time with the running buffer.
  • each of the RNA aptamers in which R8c6_1 was miniaturized was found to be bound to the HMGB1 because an increase in signal intensity was observed.
  • RNA aptamer was fluorinated to confirm the binding ability to HMGB1.
  • RNA aptamer Using the 2′-fluoro-CTP and the 2′-fluoro-UTP, each RNA aptamer shown in Table 9 and Table 10 below was prepared by a known nucleic acid synthesis method. Used as fluorinated RNA aptamer. In the fluorinated RNA aptamer, cytosine nucleotide residues and uracil nucleotide residues are fluorinated in the base sequences shown in Table 9 and Table 10.
  • RNA aptamers in which uracil nucleotide residues and cytosine nucleotide residues are fluorinated are converted to 2′F-R8c6_1-21-S6, 2′F-R8c6_1-12-S6, 2′F-R8c6_1-23-S6, respectively.
  • FIGS. 16 and 17 are graphs showing the binding ability of each fluorinated RNA aptamer to the His-tag added HMGB1.
  • the vertical axis represents the signal intensity (RU) measured by the BIACORE (registered trademark) X
  • the horizontal axis represents the analysis time (seconds).
  • -10 seconds to 0 seconds is the pre-washing time with the running buffer
  • 0 seconds is the injection start time of the His-tag added HMGB1
  • 0 seconds to 30 seconds is the His- The tag addition HMGB1 injection time
  • after 30 seconds is the washing time with the running buffer.
  • each of the miniaturized fluorinated RNA aptamers was found to be bound to the HMGB1 because an increase in signal intensity was observed.
  • 2'F-R8c6_1-21-S6 and 2'F-R8c6_1-21-S8 showed excellent binding ability.
  • RNA aptamer R8c6_1-18-S6 SEQ ID NO: 95
  • HMGB1 HMGB1
  • Anti-his antibody (product name: Penta / His Antibody: QIAGEN) was diluted to 4 ug / mL using a carbonate buffer (pH 9.0). 50 ⁇ L of this diluted antibody solution was dispensed into each well of a 96-well plate (product name: 96-well Elisa plate: Asahi Techno Glass) and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Furthermore, 50 ⁇ L of 1% BSA / TBS was dispensed into each well of the plate and allowed to stand overnight. The composition of TBS was 20 mmol / L Tris-HCl (pH 7.6) and 0.9% NaCl. In this way, the plate was blocked.
  • the well of the plate subjected to the blocking treatment was washed with 200 ⁇ L of buffer three times.
  • the composition of the buffer was 10 mmol / L HEPES, 500 mmol / L NaCl, 0.1 mmol / L MgCl 2 , 0.1% Triton X-100 (registered trademark), and the pH was 7.2.
  • HMGB1 (product name: HMG-1: Sigma) was diluted with the buffer containing tRNA to a predetermined concentration (1 ⁇ g / mL, 2 ⁇ g / mL) to prepare the HMGB1 diluted solution.
  • the RNA aptamer was diluted with the buffer, and the RNA aptamer dilution was heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then returned to room temperature.
  • the RNA aptamer dilution was mixed with an RNase inhibitor (product name: RNase Inhibitor: TOYOBO) and biotinylated deoxythymidine to prepare an RNA aptamer mixture.
  • the biotinylated deoxythymidine used was a 20-base deoxythymidine with a biotinylated 5 'end.
  • the concentration of the RNA aptamer was 10 ⁇ g / mL and 20 ⁇ g / mL.
  • the RNA aptamer mixed solution was set so that the RNase inhibitor was 0.2 ⁇ L and the biotinylated deoxythymidine was 0.2 ⁇ L per 50 ⁇ L (that is, per well).
  • HMGB1 diluted solution 50 ⁇ L was dispensed into each well of the washed plate, allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours, and then washed 3 times with 200 ⁇ L of the buffer.
  • 50 ⁇ L of the RNA aptamer mixture was further dispensed into each well and reacted at 4 ° C. for 2 hours.
  • the ratio between the concentration of the HMGB1 diluted solution (50 ⁇ L) added to each well and the concentration of the RNA aptamer mixed solution (50 ⁇ L) was 1:20, 2:20, 1:10, 2:10.
  • FIG. 21 is a graph showing the interaction between HMGB1 and the RNA aptamer, and the vertical axis shows the absorbance.
  • the absorbance indicating the binding between HMGB1 and the RNA aptamer increased, it was confirmed that the RNA aptamer bound to HMGB1.
  • the absorbance increased by increasing the HMGB1 concentration relative to the RNA aptamer concentration. From this, it can be said that HMGB1 can be quantified according to the HMGB1-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • HMGB1 can be detected by confirming the presence or absence of binding to HMGB1, and it can also be used for elucidating the function of HMGB1, so that it is also useful as a new research tool. is there.

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Abstract

　ＨＭＧＢ１タンパク質に結合可能な核酸分子、ならびにその用途を提供する。　ＨＭＧＢ１タンパク質との解離定数が５×１０－７以下である核酸分子が、ＨＭＧＢ１タンパク質に結合可能な核酸分子として使用できる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子は、癌、炎症等の疾患の原因として知られるＨＭＧＢ１タンパク質に結合可能であることから、生体内において、ＨＭＧＢ１タンパク質と結合させることにより、前記疾患の予防効果および治療効果を得ることが可能である。

Description

ＨＭＧＢ１結合核酸分子およびその用途
　本発明は、ＨＭＧＢ１タンパク質に結合する核酸分子およびその用途に関する。
　ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｇｒｏｕｐ　ｂｏｘ　１　ｐｒｏｔｅｉｎ、すなわち、ＨＭＧＢ１タンパク質（以下、「ＨＭＧＢ１」という）は、生存に必須なタンパク質であり（非特許文献１）、細胞核内では、転写開始に必要なクロマチン構造を形成するタンパク質として機能する（非特許文献２）。ＨＭＧＢ１は、細胞外に漏出、分泌されると、炎症反応、細胞の形態変化および細胞の移動を促進するサイトカインとして機能する（非特許文献３）。近年、細胞外におけるＨＭＧＢ１の機能解析が進み、自己免疫疾患、敗血症、外傷性ショック、虚血および虚血再灌流障害が起こる際、炎症反応を悪化させたり、細胞死を誘導することが明らかとなった。このことから、ＨＭＧＢ１が、これら疾患の治療の標的物質および診断マーカーとなることが示されている（非特許文献４）。また、癌に関しても、乳癌、大腸癌、メラノーマ、前立腺癌、膵臓癌および肺癌等の増殖および転移浸潤に関与し、正常組織と比較して、ＨＭＧＢ１発現量が増加することが報告されている（非特許文献５）。このような背景から、ＨＭＧＢ１に結合可能な物質を作製し、その作用を中和することで、前記疾患を予防および治療することが望まれている。しかし、現在までに有効性が示されているものは、単クローン抗ＨＭＧＢ１抗体を利用した診断法および実験動物での脳梗塞モデル治療のみである（特許文献１、２、非特許文献６）。
特許第３８７６３２５号公報 特開２００８－５２０５５２号公報
Ｃａｌｏｇｅｒｏ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．（１９９９）２２，２７６－２８０． Ｂｕｓｔｉｎ，Ｍ．　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　（１９９９）１９，５２３７－５２４６． Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．　（２００２）７２，１０８４－１０９１． Ｋｌｕｎｅ，Ｊ．Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．　（２００８）１４，４７６－４８４． Ｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　（２００７）　１３、２８３６－２８４８． Ｌｉｕ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．　ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　（２００７）２１，３９０４－１６．
　本発明の目的は、例えば、ＨＭＧＢ１が関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、前記疾患の診断および治療に利用可能な物質として、ＨＭＧＢ１に結合可能な核酸分子、ならびにその用途を提供することにある。
　そこで、本発明者らは、市販の精製ＨＭＧＢ１を標的物質として、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法によりＲＮＡを作製した。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１タンパク質（以下、ＨＭＧＢ１という）との解離定数が５×１０－７以下であることを特徴とする、ＨＭＧＢ１に結合可能な結合核酸分子である。
　本発明の組成物は、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含むことを特徴とする組成物である。
　本発明の検出試薬は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含むことを特徴とする、前記ＨＭＧＢ１を検出するためのＨＭＧＢ１検出試薬である。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１に結合可能である。このため、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子によれば、例えば、ＨＭＧＢ１と結合してその機能を阻害することより、ＨＭＧＢ１が原因となる前述のような疾患の予防および治療が可能となる。また、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子によれば、例えば、ＨＭＧＢ１との結合の有無を確認することで、ＨＭＧＢ１を検出でき、疾患の早期診断が可能となる。また、例えば、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を培養細胞内で発現させることで、遺伝子転写の阻害実験が可能となる、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を使用して、細胞外のＨＭＧＢ１とその受容体との結合阻害実験が可能となる等、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１の機能解明にも使用できる。このため、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、新たな研究用ツールとしても有用である。
図１は、本発明の実施例１において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例１において、ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例１において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例１において、生理条件下におけるＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例２において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図６は、本発明の実施例３において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図７は、本発明の実施例４において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図８は、本発明の実施例５において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図９は、本発明の実施例６において、ＨＭＧＢ１とＴＬＲ－２との結合を示すプルダウンアッセイの写真である。 図１０は、本発明の実施例７において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図１１は、本発明におけるＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１およびＲ８ｃ６＿１８の推定二次構造を示す図である。 図１２は、本発明の実施例９において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図１３は、本発明の実施例９において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図１４は、本発明の実施例１０において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図１５は、本発明の実施例１１において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図１６は、本発明の実施例１２において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図１７は、本発明の実施例１２において、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。 図１８は、本発明におけるＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１の推定二次構造を示す図である。 図１９は、本発明におけるＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１－１８の推定二次構造を示す図である。 図２０は、本発明におけるＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６の推定二次構造を示す図である。 図２１は、本発明の実施例１３において、ＨＭＧＢ１とＲＮＡアプタマーとの相互作用を示すグラフである。
＜ＨＭＧＢ１結合核酸分子＞
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＨＭＧＢ１との解離定数が５×１０－７以下であることを特徴とする、ＨＭＧＢ１に結合可能な核酸分子である。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＨＭＧＢ１アプタマーともいう。
　本発明において、「ＨＭＧＢ１に結合可能」とは、例えば、ＨＭＧＢ１に対する結合能を有している、または、ＨＭＧＢ１に対する結合活性（ＨＭＧＢ１結合活性）を有しているともいう。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＨＭＧＢ１に特異的に結合する。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子とＨＭＧＢ１との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ビアコアＸ（商品名、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）が使用できる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１との解離定数が５×１０－７以下であればよく、その他の構成は、制限されない。前記ＨＭＧＢ１に対する解離定数は、特に制限されないが、その上限が、例えば、１０－８オーダーであり、より好ましくは１０－１０オーダーであり、さらに好ましくは１０－１２オーダーである。また、前記解離定数の範囲は、例えば、１０－１４～１０－８オーダーであり、好ましくは１０－１４～１０－１０オーダーであり、より好ましくは１０－１４～１０－１２オーダーである。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、その構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよく、ＲＮＡが好ましい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドの両方を含んでもよい。この場合、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよいし、リボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよい。
　前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化されたヌクレオチド残基でもよい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されているものがあげられる。前記糖残基は、例えば、リボース残基またはデオキシリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されないが、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたもの、または、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチド残基をピリミジンヌクレオチド残基といい、修飾されたピリミジンヌクレオチド残基を修飾化ピリミジンヌクレオチド残基といい、プリン塩基を有するヌクレオチド残基をプリンヌクレオチド残基といい、修飾されたプリンヌクレオチド残基を修飾化プリンヌクレオチド残基という。前記ピリミジンヌクレオチド残基は、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド残基、シトシンを有するシトシンヌクレオチド残基、チミンを有するチミンヌクレオチド残基等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例としては、例えば、リボース残基の２’位が修飾された、２’－メチルウラシル（２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基）、２’－メチルシトシン（２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基）、２’－フルオロウラシル（２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基）、２’－フルオロシトシン（２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基）、２’－アミノウラシル（２’－アミノ化ウラシル－ヌクレオチド残基）、２’－アミノシトシン（２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基）、２’－チオウラシル（２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基）、２’－チオシトシン（２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基）等があげられる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前記構成単位として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）等のモノマー残基があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＥＮＡの少なくともいずれかのモノマー残基を含むＲＮＡまたはＤＮＡがあげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子が、前記モノマー残基を含む場合、その数は、特に制限されない。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記一本鎖核酸は、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡがあげられる。前記二本鎖核酸は、例えば、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡとＤＮＡとの二本鎖核酸があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子が二本鎖核酸の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にしてもよい。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子において、各塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の天然塩基（非人工核酸）でもよいし、人工塩基（非天然塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔまたはｕ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’－メチルウラシル、２’－メチルシトシン、２’－フルオロウラシル、２’－フルオロシトシン、２’－アミノウラシル、２’－アミノシトシン、２－チオウラシル、２－チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼに耐性であることが好ましい。前記ヌクレアーゼは、特に制限されないが、例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ等があげられ、具体例として、例えば、ＲＮＡ分解酵素であるリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮＡ分解酵素であるデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に作用するヌクレアーゼ等があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＲＮＡが好ましい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡ分解酵素、すなわち、ＲＮａｓｅに耐性であることが好ましい。前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、特に制限されず、例えば、前記核酸分子を構成するヌクレオチド残基を修飾する方法があげられる。具体的には、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子について、例えば、前記核酸分子を構成するヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、修飾化ヌクレオチド残基であることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前述の修飾化ヌクレオチド残基があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記メチル化ヌクレオチド残基、前記フルオロ化ヌクレオチド残基、前記アミノ化ヌクレオチド残基、前記チオ化ヌクレオチド残基等があげられ、中でも前記フルオロ化ヌクレオチド残基が好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基を有する前記ピリミジンヌクレオチド残基であり、前記糖残基（リボース残基またはデオキシリボース残基）が修飾されていることが好ましい。
　前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、この他に、例えば、前記核酸分子を構成するヌクレオチド残基をＬＮＡ化する方法があげられる。具体的には、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子について、例えば、前記核酸分子を構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記ＬＮＡ残基であることが好ましい。前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、この他に、例えば、前記核酸分子であるＲＮＡを構成するヌクレオチド残基をＤＮＡ化する方法があげられる。具体的には、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基のうち、ウラシルを有するヌクレオチド残基の全てまたは一部が、チミンを有するヌクレオチド残基に置換されてもよく、具体的には、前記チミンを有するデオキシリボヌクレオチド残基に置換されてもよい。また、前記核酸分子がＲＮＡの場合、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド残基および前記ＬＮＡ残基であってもよい。
　前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、この他に、例えば、５’末端および／または３’末端に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはデオキシチミジンを結合させる方法があげられる。前記ＰＥＧは、例えば、数十ｋＤａであることが好ましい。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０～１６０塩基長であり、好ましくは３０～１２０塩基長であり、より好ましくは４０～１００塩基長である。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ｂ１）および（Ｂ２）のいずれかの核酸分子があげられる。
（Ａ１）配列番号１～４２のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
（Ａ２）配列番号１～４２のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
（Ｂ１）配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
（Ｂ２）配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
　前記（Ａ１）の核酸分子について説明する。以下、前記（Ａ１）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）という。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）において、配列番号１～４２で表わされる塩基配列を、塩基配列（Ａ１）ともいう。前記配列番号１～４２で表わされる塩基配列（Ａ１）および前記塩基配列（Ａ１）を含むＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、それぞれ、以下に示すように、配列番号の前に示す名称で表わすこともある。
（Ａ１）配列番号１～４２のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
C_0（配列番号１）
mmhbuaagmcacguagmaccag
C_1（配列番号２）
accguaagacacguagaaccag
C_2（配列番号３）
aauuuaagccacguagaaccag
C_3（配列番号４）
acaguaagacacguagcaccag
C_4（配列番号５）
cauguaagccacguagaaccag
#04（配列番号６）
ucccaugauuguucaggcacggccuuucgguucccucaau
#08（配列番号７）
agucccuugacacguccguuuucuaacuggaauagaggcc
#12（配列番号８）
gggcugcaccucuccgcuacguugucguuggaggcaccau
#43（配列番号９）
gguauuaaaacucccucguaggucauccgcccggccuagc
#49（配列番号１０）
cauccuuaucacauggucauccgcccggccaugcaauguu
#32（配列番号１１）
cauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggcccgcau
#58（配列番号１２）
cauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggccgcgcucgccaguca
#01（配列番号１３）
uggcauccuugcucacuccaggcuaaaccucucgguuccc
#26（配列番号１４）
ccaagcacuucaucgucuaggcaauugccucucgguaccc
#73（配列番号１５）
ccacaagcucgcacuaguuccaggcuuccucucgguaccc
#77（配列番号１６）
cauguauuucugcacguuccagagaauccucucgguaccc
#06（配列番号１７）
uacacugcacgcuccgcuuugaacaucaauggaggcccug
#22（配列番号１８）
gcgcucgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacu
#10（配列番号１９）
uagucaaggugaaaacccccauagagacu
#21（配列番号２０）
ggccugugcuaacaugagucauccguccggcucgcaacuc
#36（配列番号２１）
ccuagcacguccguuucuggaucugucaguuagaggccua
#15（配列番号２２）
gcaucaaccucuguaagagcgcgcuuugcuucaccaaaaa
#23（配列番号２３）
acgguccuuaaaaucuuccuuaaccacgcccaggaucuua
#34（配列番号２４）
auucaccucagcauguccgcuugugacgauggaggcaccu
#40（配列番号２５）
gguccuuaaaaucuuccaaucuaaacgauccagacacggc
#47（配列番号２６）
aaaaacuacugccgaaccguaagacacguagaaccaggca
#79（配列番号２７）
gaccagguuccugacaucucugaacuauaccuccaaaacg
#80（配列番号２８）
caucugaauuuaagccacguagaaccaggcccuccacgcg
#82（配列番号２９）
uaauacgacucacuauagggacgcucacguacgcucagug
R4_1（配列番号３０）
aaugagggcccacuuccggaucuuugguuugcuuccuugc
R4_4（配列番号３１）
ucgcuuauggaugcccacuuccacucacuguccugcgcaa
R4_10（配列番号３２）
uauuaauaccucagcccucuucucuuagucuggugccgau
R4_11（配列番号３３）
ucucuuuucgaauuccguucuggcucacuccuuggguauu
R4_12（配列番号３４）
cugacaucuuuuacacugauuucuguuggcccacuucugu
R8c6_1（配列番号３５）
gaguacaguaagacacguagcaccagucugacguuugucg
R8c6_14（配列番号３６）
ugccaucaccauguaagccacguagaaccagcacuacuag
R8c9_1（配列番号３７）
ugagucuuauagccguccguuuacguuugucuagaggcca
R8c9_6（配列番号３８）
gcuucuugcauuguccgcuuaguuucuauggaggcauagu
R8c9_10（配列番号３９）
ccgaauauuuuugcaccguccgauugccaugcauugaggc
HMGB1R4_9068（配列番号４０）
ugauauuuaaauuuggccgcguuuaaaacauccccuacga
HMGB1R4_2478（配列番号４１）
gauuccguugcccuuccguugaacugugccaggcuuuuug
HMGB1R4_5108（配列番号４２）
accuuugccgcaucucacccacgucuugucaggccguuuc
　前記配列番号１において、「ｍ」は、アデニンまたはシトシンであり、「ｈ」は、アデニン、シトシン、チミンまたはウラシルであり、「ｂ」は、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである。前記配列番号１で表わされる塩基配列は、例えば、前記配列番号２～５で表わされる塩基配列があげられる。前記配列番号１～４２および後述する配列番号４５～８１で表わされる塩基配列において、ウラシル（ｕ）は、チミン（ｔ）でもよい。これらの塩基配列において、例えば、１個または２個以上のウラシルがチミンでもよく、また、全てのウラシルがチミンでもよい。このように、チミンを含む塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子は、例えば、後述する（Ａ２）の核酸分子として例示できる。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、前記配列番号１～４２のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列（Ａ１）からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列（Ａ１）を含む核酸分子でもよい。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が、前記塩基配列（Ａ１）を含む場合、例えば、前記塩基配列（Ａ１）をＸ領域として、さらに、Ｙ領域および／またはＹ’領域を有してもよい。前記Ｘ領域、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、例えば、後述する通りである。前記Ｙ領域は、特に制限されず、例えば、配列番号４３または１１５で表わされる塩基配列を含む配列および前記塩基配列からなる配列があげられる。また、前記Ｙ’領域は、特に制限されず、例えば、配列番号４４で表わされる塩基配列を含む配列および前記塩基配列からなる配列があげられる。なお、これらの配列は、一例であって、本発明を制限するものではない。
　　　　gggacgcucacguacgcuca（配列番号４３）
　　　　acgcucacguacgcuca（配列番号１１５）
　　　　ucagugccuggacgugcagu（配列番号４４）
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が前記Ｙ領域を含む場合、前記Ｙ領域は、例えば、前記塩基配列（Ａ１）の５’側に結合していることが好ましい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が前記Ｙ’域を含む場合、前記Ｙ’領域は、例えば、前記塩基配列（Ａ１）の３’側に結合していることが好ましい。前記塩基配列（Ａ１）と前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域とは、例えば、直接結合してもよいし、介在配列を介して結合してもよい。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が、前記配列番号１～４２のいずれかの塩基配列（Ａ１）を含む場合、例えば、配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子が例示できる。以下に示す配列番号４５～８１の塩基配列は、それぞれ、前記配列番号６～４２の塩基配列（Ａ１）を含み、下線部で表わされる領域が、それぞれ、前記配列番号６～４２の塩基配列に相当する。前記配列番号４５～８１の塩基配列および前記塩基配列を含む前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、それぞれ、以下に示すように、配列番号の前に示す名称で表わすこともある。
#04（配列番号４５）
gggacgcucacguacgcucaucccaugauuguucaggcacggccuuucgguucccucaauucagugccuggacgugcagu
#08（配列番号４６）
gggacgcucacguacgcucaagucccuugacacguccguuuucuaacuggaauagaggccucagugccuggacgugcagu
#12（配列番号４７）
gggacgcucacguacgcucagggcugcaccucuccgcuacguugucguuggaggcaccauucagugccuggacgugcagu
#43（配列番号４８）
gggacgcucacguacgcucagguauuaaaacucccucguaggucauccgcccggccuagcucagugccuggacgugcagu
#49（配列番号４９）
gggacgcucacguacgcucacauccuuaucacauggucauccgcccggccaugcaauguuucagugccuggacgugcagu
#32（配列番号５０）
gggacgcucacguacgcucacauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggcccgcauucagugccuggacgugcagu
#58（配列番号５１）
gggacgcucacguacgcucacauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggccgcgcucgccagucaucagugccuggacgugcagu
#01（配列番号５２）
gggacgcucacguacgcucauggcauccuugcucacuccaggcuaaaccucucgguucccucagugccuggacgugcagu
#26（配列番号５３）
gggacgcucacguacgcucaccaagcacuucaucgucuaggcaauugccucucgguacccucagugccuggacgugcagu
#73（配列番号５４）
gggacgcucacguacgcucaccacaagcucgcacuaguuccaggcuuccucucgguacccucagugccuggacgugcagu
#77（配列番号５５）
gggacgcucacguacgcucacauguauuucugcacguuccagagaauccucucgguacccucagugccuggacgugcagu
#06（配列番号５６）
gggacgcucacguacgcucauacacugcacgcuccgcuuugaacaucaauggaggcccugucagugccuggacgugcagu
#22（配列番号５７）
gggacgcucacguacgcucagcgcucgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacuucagugccuggacgugcagu
#10（配列番号５８）
gggacgcucacguacgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacuucagugccuggacgugcagu
#21（配列番号５９）
gggacgcucacguacgcucaggccugugcuaacaugagucauccguccggcucgcaacucucagugccuggacgugcagu
#36（配列番号６０）
gggacgcucacguacgcucaccuagcacguccguuucuggaucugucaguuagaggccuaucagugccuggacgugcagu
#15（配列番号６１）
gggacgcucacguacgcucagcaucaaccucuguaagagcgcgcuuugcuucaccaaaaaucagugccuggacgugcagu
#23（配列番号６２）
gggacgcucacguacgcucaacgguccuuaaaaucuuccuuaaccacgcccaggaucuuaucagugccuggacgugcagu
#34（配列番号６３）
gggacgcucacguacgcucaauucaccucagcauguccgcuugugacgauggaggcaccuucagugccuggacgugcagu
#40（配列番号６４）
gggacgcucacguacgcucagguccuuaaaaucuuccaaucuaaacgauccagacacggcucagugccuggacgugcagu
#47（配列番号６５）
gggacgcucacguacgcucaaaaaacuacugccgaaccguaagacacguagaaccaggcaucagugccuggacgugcagu
#79（配列番号６６）
gggacgcucacguacgcucagaccagguuccugacaucucugaacuauaccuccaaaacgucagugccuggacgugcagu
#80（配列番号６７）
gggacgcucacguacgcucacaucugaauuuaagccacguagaaccaggcccuccacgcgucagugccuggacgugcagu
#82（配列番号６８）
gggacgcucacguacgcucauaauacgacucacuauagggacgcucacguacgcucagugccuggacgugcagu
R4_1（配列番号６９）
gggacgcucacguacgcucaaaugagggcccacuuccggaucuuugguuugcuuccuugcucagugccuggacgugcagu
R4_4（配列番号７０）
gggacgcucacguacgcucaucgcuuauggaugcccacuuccacucacuguccugcgcaaucagugccuggacgugcagu
R4_10（配列番号７１）
gggacgcucacguacgcucauauuaauaccucagcccucuucucuuagucuggugccgauucagugccuggacgugcagu
R4_11（配列番号７２）
gggacgcucacguacgcucaucucuuuucgaauuccguucuggcucacuccuuggguauuucagugccuggacgugcagu
R4_12（配列番号７３）
gggacgcucacguacgcucacugacaucuuuuacacugauuucuguuggcccacuucuguucagugccuggacgugcagu
R8c6_1（配列番号７４）
gggacgcucacguacgcucagaguacaguaagacacguagcaccagucugacguuugucgucagugccuggacgugcagu
R8c6_14（配列番号７５）
gggacgcucacguacgcucaugccaucaccauguaagccacguagaaccagcacuacuagucagugccuggacgugcagu
R8c9_1（配列番号７６）
gggacgcucacguacgcucaugagucuuauagccguccguuuacguuugucuagaggccaucagugccuggacgugcagu
R8c9_6（配列番号７７）
gggacgcucacguacgcucagcuucuugcauuguccgcuuaguuucuauggaggcauaguucagugccuggacgugcagu
R8c9_10（配列番号７８）
gggacgcucacguacgcucaccgaauauuuuugcaccguccgauugccaugcauugaggcucagugccuggacgugcagu
HMGB1R4_9068（配列番号７９）
gggacgcucacguacgcucaugauauuuaaauuuggccgcguuuaaaacauccccuacgaucagugccuggacgugcagu
HMGB1R4_2478（配列番号８０）
gggacgcucacguacgcucagauuccguugcccuuccguugaacugugccaggcuuuuugucagugccuggacgugcagu
HMGB1R4_5108（配列番号８１）
gggacgcucacguacgcucaaccuuugccgcaucucacccacgucuugucaggccguuucucagugccuggacgugcagu
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、前記配列番号４５～８１のいずれかの塩基配列（Ａ１）において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子であってもよい。すなわち、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、前記配列番号４５～８１のいずれかの塩基配列（Ａ１）において、５’末端のｇｇｇを欠失してもよい。
　前記塩基配列（Ａ１）は、例えば、配列番号１１４で表わされるモチーフ配列を含んでもよい。下記塩基配列において、ｎは、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、ウラシル（ｕ）、チミン（ｔ）であり、５塩基目のｎはアデニン（ａ）、１３塩基目のｎはシトシン（ｃ）、１７塩基目のｎはアデニン（ａ）が好ましい。前記モチーフ配列を含む塩基配列（Ａ１）は、例えば、＃４７（配列番号６５）、＃８０（配列番号６７）、Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）、Ｒ８ｃ６＿１４（配列番号７５）があげられる。
モチーフ配列（配列番号１１４）
uaagncacguagnaccng
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）において、各塩基は、例えば、前述と同様である。すなわち、前記塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の前記天然塩基（非人工塩基）でもよいし、前記人工塩基（非天然塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、前述の通りである。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、その構成単位は、特に制限されず、前述と同様である。すなわち、前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよく、好ましくはＲＮＡである。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドとの両方を含んでもよい。前記配列番号１～４２および配列番号４５～８１の塩基配列は、例えば、それぞれ、前述のような塩基が連続する配列であればよく、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよいし、リボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよい。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、前述と同様に、前記構成単位として、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ等のモノマー残基があげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＥＮＡの少なくともいずれかのモノマー残基を含むＲＮＡまたはＤＮＡがあげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が、前記モノマー残基を含む場合、その数は、特に制限されない。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、前述のように、ヌクレアーゼに耐性であることが好ましい。前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、特に制限されず、前述と同様である。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、前述のように、ＲＮＡが好ましい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡ分解酵素耐性であることが好ましい。ＲＮＡ分解酵素耐性にする手法は、特に制限されず、前述と同様である。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記修飾化ヌクレオチド残基であることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前述の修飾化ヌクレオチド残基があげられる。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記デオキシリボヌクレオチド残基および／または前記ＬＮＡ残基であることが好ましい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、前述と同様に、例えば、ＲＮＡを構成するヌクレオチド残基のうち、ウラシルを有するヌクレオチド残基の全てまたは一部が、チミンを有するヌクレオチド残基に置換されてもよく、具体的には、前記チミンを有するデオキシリボヌクレオチド残基に置換されてもよい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、その５’末端および／または３’末端に、前記ＰＥＧまたは前記デオキシチミジンを有することが好ましい。このようにチミンに置換された塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子は、例えば、後述する（Ａ２）の核酸分子として例示できる。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０～１６０塩基長であり、好ましくは３０～１２０塩基長であり、より好ましくは４０～１００塩基長である。
　つぎに、前記（Ａ２）の核酸分子について、説明する。以下、前記（Ａ２）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ２）という。
（Ａ２）配列番号１～４２のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ２）は、前記置換等された塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記置換等された前記塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ２）において、前記置換等された塩基配列を、塩基配列（Ａ２）ともいう。
　「１または複数」とは、特に制限されない。「１または複数」は、前記配列番号１～４２のいずれかの塩基配列において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、「１または複数」は、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）の全長配列において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。前記置換、付加または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、前記天然塩基でもよいし、前記人工塩基でもよい。前記塩基の置換、付加または挿入は、例えば、前記ヌクレオチド残基を用いてもよいし、前記モノマー残基を用いてもよい。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ａ３）の核酸分子でもよい。以下、前記（Ａ３）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ３）という。
（Ａ３）配列番号１～４２のいずれかで表わされる塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ３）は、前記相同性を有する塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記相同性を有する塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ３）において、前記相同性を有する塩基配列を、塩基配列（Ａ３）ともいう。
　前記相同性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ３）は、例えば、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）の全長配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能な核酸分子でもよい。この場合、前記相同性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ａ４）の核酸分子でもよい。以下、前記（Ａ４）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）という。
（Ａ４）配列番号１～４２のいずれかで表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列または前記塩基配列に相補的な塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）は、前記ハイブリダイズする塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列を含む核酸分子でもよい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）は、前記相補的な塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記相補的な塩基配列を含む核酸分子でもよい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）において、前記ハイブリダイズする塩基配列および前記相補的な塩基配列を、塩基配列（Ａ４）ともいう。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７～１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０～６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５～６８℃で洗浄することにより同定できる条件をいう。１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）は、例えば、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）の全長塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ２）～（Ａ４）において、例えば、塩基、構成単位、長さ、ヌクレアーゼ耐性の付与等、特に示さない限り、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）と同様である。
　つぎに、前記（Ｂ１）の核酸分子について、説明する。以下、前記（Ｂ１）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）という。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）において、配列番号４５～８１で表わされる塩基配列を、塩基配列（Ｂ１）ともいう。
（Ｂ１）配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
　配列番号４５～８１で表わされる塩基配列は、前述の通りである。配列番号４５～８１で表わされる塩基配列を含むＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、それぞれ、前述した配列番号の前に示す名称で表わすこともある。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、配列番号４５～８１のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列（Ｂ１）からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列（Ｂ１）を含む核酸分子でもよい。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、前記配列番号４５～８１のいずれかの塩基配列（Ｂ１）において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子であってもよい。すなわち、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、前記配列番号４５～８１のいずれかの塩基配列（Ａ１）において、５’末端のｇｇｇを欠失してもよい。
　前記塩基配列（Ｂ１）は、例えば、配列番号１１４で表わされるモチーフ配列を含んでもよい。下記塩基配列において、ｎは、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、ウラシル（ｕ）、チミン（ｔ）であり、５塩基目のｎはアデニン（ａ）、１３塩基目のｎはシトシン（ｃ）、１７塩基目のｎはアデニン（ａ）が好ましい。前記モチーフ配列を含む塩基配列（Ｂ１）は、例えば、＃４７（配列番号６５）、＃８０（配列番号６７）、Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）、Ｒ８ｃ６＿１４（配列番号７５）があげられる。
モチーフ配列（配列番号１１４）
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　前記Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）の推定二次構造を図１１に示す。同図において、丸で囲んだ塩基が、前記モチーフ配列に該当する。図１１の前記推定二次構造において、前記モチーフ配列における「ｎ」に該当する塩基は、丸を省略している。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）において、各塩基は、例えば、前述と同様である。すなわち、前記塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の前記天然塩基（非人工塩基）でもよいし、前記人工塩基（非天然塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、前述の通りである。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、その構成単位は、特に制限されず、前述と同様である。すなわち、前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよく、好ましくはＲＮＡである。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドとの両方を含んでもよい。前記配列番号４５～８１の塩基配列は、例えば、それぞれ、前述のような塩基が連続する配列であればよく、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよいし、リボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよい。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、前述と同様に、前記構成単位として、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ等のモノマー残基があげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＥＮＡの少なくともいずれかのモノマー残基を含むＲＮＡまたはＤＮＡがあげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）が、前記モノマー残基を含む場合、その数は、特に制限されない。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、前述のように、ヌクレアーゼに耐性であることが好ましい。前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、特に制限されず、前述と同様である。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、前述のように、ＲＮＡが好ましい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡ分解酵素耐性であることが好ましい。ＲＮＡ分解酵素耐性にする手法は、特に制限されず、前述と同様である。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記修飾化ヌクレオチド残基であることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前述の修飾化ヌクレオチド残基があげられる。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記デオキシリボヌクレオチド残基および／または前記ＬＮＡ残基であることが好ましい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、前述と同様に、例えば、ＲＮＡを構成するヌクレオチド残基のうち、ウラシルを有するヌクレオチド残基の全てまたは一部が、チミンを有するヌクレオチド残基に置換されてもよく、具体的には、前記チミンを有するデオキシリボヌクレオチド残基に置換されてもよい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、その５’末端および／または３’末端に、前記ＰＥＧまたは前記デオキシチミジンを有することが好ましい。このようにチミンに置換された塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子は、例えば、後述する（Ｂ２）の核酸分子として例示できる。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０～１６０塩基長であり、好ましくは３０～１２０塩基長であり、より好ましくは４０～１００塩基長である。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、中でも、下記（ｂ１）の核酸分子であることが好ましい。以下、前記（ｂ１）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ１）ともいう。前記ＨＭＧＢ１核酸分子（ｂ１）は、例えば、配列番号７４の塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列からなる核酸分子でもよい。
（ｂ１）配列番号７４で表わされる塩基配列を含む核酸分子
　つぎに、前記（Ｂ２）の核酸分子について、説明する。以下、前記（Ｂ２）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）という。
（Ｂ２）配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、前記置換等された塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記置換等された前記塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）において、前記置換等された塩基配列を、塩基配列（Ｂ２）ともいう。
　「１または複数」は、特に制限されず、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）が、ＨＭＧＢ１に結合可能であればよい。前記置換された塩基の数は、配列番号４５～８１のいずれかの塩基配列において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。前記付加または挿入された塩基の数は、配列番号４５～８１のいずれかの塩基配列において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。前記欠失された塩基の数は、特に制限されないが、例えば、配列番号４５～８１のいずれかの塩基配列において、１～４６個、１～４３個、１～２１個、～１～１８個、１～４個、１～３個、２個または１個である。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０～１６０塩基長であり、好ましくは３０～１２０塩基長であり、より好ましくは４０～１００塩基長である。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）のうち、例えば、配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、欠失された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子は、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）を小型化した核酸分子ともいえる。前記小型化した核酸分子を、小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）ともいう。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前記（Ｂ２）に示すように、配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、欠失するだけでなく、例えば、１または複数の塩基が、置換、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。
　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、前述のように、前記欠失された塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記欠失された前記塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）において、前記欠失された塩基配列を、小型化塩基配列ともいう。前記欠失された塩基の数は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、例えば、配列番号４５～８１の塩基配列において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基まで塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子があげられる。すなわち、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、例えば、配列番号４５～８１のいずれかの塩基配列（Ｂ１）において、５’末端のｇｇｇを欠失した塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子があげられる。
　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０～１６０塩基長であり、好ましくは３０～１２０塩基長であり、より好ましくは４０～１００塩基長である。
　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）としては、例えば、配列番号７４で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、欠失された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子が好ましく、具体的には、下記（ｂ２）の核酸分子が好ましい。以下、前記（ｂ２）の核酸分子を、小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）ともいう。
（ｂ２）配列番号７４で表わされる塩基配列における連続する１１塩基以上の部分配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）において、前記連続する１１塩基以上の部分配列を、以下、連続部分配列ともいう。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、前記連続部分配列からなる核酸分子でもよいし、前記連続部分配列を含む核酸分子でもよい。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、前述のように、配列番号７４の塩基配列において、１または複数の塩基が、欠失するだけでなく、例えば、１または複数の塩基が、置換、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。
　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、前記配列番号７４の塩基配列における前記連続する１１塩基以上の連続部分配列を、１配列含んでもよいし、２配列以上有してもよい。
　前記連続部分配列の長さは、前述のように、１１塩基以上である。前記連続部分配列の長さは、特に制限されず、例えば、１２塩基以上でもよく、１４塩基以上でもよく、１６塩基以上でもよい。前記連続部分配列の長さの上限は、特に制限されず、８０塩基以下であり、好ましくは７９塩基以下である。
　前記連続部分配列は、特に制限されないが、例えば、以下に示すｙ配列、ｘ配列またはｙ’配列があげられる。前記ｙ配列は、例えば、前記配列番号７４の塩基配列における、１番目～２０番目、４番目～２０番目の領域があげられる。前記ｘ配列は、例えば、前記配列番号７４の塩基配列における、２１番目～６０番目、２２番目～６０番目、２４番目～６０番目、２５番目～６０番目、２９番目～６０番目、３４番目～６０番目、３８番目～６０番目、２２番目～４８番目、２２番目～４７番目、２５番目～４７番目、２６番目～４７番目、２７番目～４７番目、２８番目～４７番目、２９番目～４７番目、３０番目～４７番目、３１番目～４７番目、３４番目～４７番目、２９番目～４４番目、２９番目～４０番目、２９番目～４６番目、２５番目～４６番目、２６番目～４６番目、２７番目～４６番目、２８番目～４６番目、２９番目～４６番目の領域があげられる。前記ｙ’配列は、例えば、前記配列番号７４の塩基配列における、６１番目～８０番目、６１番目～７９番目、６１番目～７７番目、６１番目～７６番目、６１番目～７８番目、６４番目～８０番目、６５番目～８０番目、７０番目～８０番目、６４番目～７７番目の領域があげられる。
　前記連続部分配列からなる塩基配列および前記連続部分配列を含む塩基配列を、以下、塩基配列（ｂ２）ともいう。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、前記塩基配列（ｂ２）からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列（ｂ２）を含む核酸分子でもよい。前記塩基配列（ｂ２）は、例えば、前記ｘ配列と前記ｙ’配列とを含む塩基配列、前記ｙ配列と前記ｘ配列と前記ｙ’配列とを含む塩基配列があげられる。前記塩基配列（ｂ２）において、例えば、前記ｘ配列の５’側に前記ｙ配列、前記ｘ配列の３’側に前記ｙ’配列を含むことが好ましい。また、前記塩基配列（ｂ２）は、例えば、前記ｙ配列における５’末端のｇｇｇを欠失してもよい。
　前記塩基配列（ｂ２）は、例えば、配列番号８３～１１３で表わされる塩基配列があげられる。これらの塩基配列を、下記表１に示す。下記表１において、各塩基配列は、配列番号７４の塩基配列と対応するように示す。各塩基配列について、配列番号７４の塩基配列と対比して、欠失する部分は空欄で示し、異なる塩基は下線を付す。配列番号８３～１１３の塩基配列を含む、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、それぞれ、下記表１に示す名称で表わすこともある。
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　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、配列番号８３～１１３のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸分子でもよいし、配列番号８３～１１３のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸分子でもよい。
　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、配列番号７４および前記配列番号８３～１１３のいずれかの塩基配列（ｂ２）において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子であってもよい。すなわち、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、配列番号７４および配列番号８３～１１３のいずれかの塩基配列において、５’末端のｇｇｇを欠失してもよい。
　前記塩基配列（ｂ２）は、例えば、配列番号１１４で表わされるモチーフ配列を含んでもよい。下記塩基配列において、ｎは、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、ウラシル（ｕ）、チミン（ｔ）であり、５塩基目のｎはアデニン（ａ）、１３塩基目のｎはシトシン（ｃ）、１７塩基目のｎはアデニン（ａ）が好ましい。前記モチーフ配列を含む塩基配列（ｂ２）は、例えば、Ｒ８ｃ６＿１－１（配列番号８３）、Ｒ８ｃ６＿１－３（配列番号８４）、Ｒ８ｃ６＿１－４（配列番号８５）、Ｒ８ｃ６＿１－１５（配列番号８６）、Ｒ８ｃ６＿１－１８（配列番号８７）、Ｒ８ｃ６＿１－２０（配列番号８８）、Ｒ８ｃ６＿１－２１（配列番号８９）、Ｒ８ｃ６＿１－２５（配列番号９０）、Ｒ８ｃ６＿１－１８－Ｓ２（配列番号９３）、Ｒ８ｃ６＿１－１８－Ｓ４（配列番号９４）、Ｒ８ｃ６＿１－１８－Ｓ６（配列番号９５）、Ｒ８ｃ６＿１－２１－Ｓ６（配列番号９６）、Ｒ８ｃ６＿１－２２－Ｓ６（配列番号９７）、Ｒ８ｃ６＿１－２３－Ｓ６（配列番号９８）、Ｒ８ｃ６＿１－２４－Ｓ６（配列番号９９）、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６（配列番号１００）、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ａ３（配列番号１０５）、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ｃ２（配列番号１０７）、Ｒ８ｃ６＿１－２１－Ｓ８（配列番号１０８）、Ｒ８ｃ６＿１－２２－Ｓ８（配列番号１０９）、Ｒ８ｃ６＿１－２３－Ｓ８（配列番号１１０）、Ｒ８ｃ６＿１－２４－Ｓ８（配列番号１１１）、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ８（配列番号１１２）等があげられる。また、前記モチーフ配列の一部を含む塩基配列（Ｂ１）は、例えば、Ｒ８ｃ６＿１－３０（配列番号９１）、Ｒ８ｃ６＿１－３４ＣＣ（配列番号９２）、Ｒ８ｃ６＿１－２６－Ｓ６（配列番号１０１）、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ａ２（配列番号１０４）、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ｃ（配列番号１０６）等があげられる。
モチーフ配列（配列番号１１４）
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　前記Ｒ８ｃ６＿１－１８（配列番号７４）の推定二次構造を図１１に示す。同図において、丸で囲んだ塩基が、前記モチーフ配列に該当する。前記推定二次構造において、前記モチーフ配列における「ｎ」に該当する塩基は、丸を省略している。前記Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６（配列番号１００）の推定二次構造を図２０に示す。同図において、丸で囲んだ塩基が、前記モチーフ配列に該当する。前記推定二次構造において、前記モチーフ配列における「ｎ」に該当する塩基は、丸を省略している。
　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０～１６０塩基長であり、好ましくは３０～１２０塩基長であり、より好ましくは４０～１００塩基長である。また、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）において、前記塩基配列（ｂ２）は、その全長は、特に制限されないが、その下限が、例えば、２０塩基長以上、３０塩基長以上、３４塩基長以上、３７塩基長以上、４０塩基長以上であり、その上限が、例えば、１６０塩基以下、１２０塩基以下、１００塩基以下、８０塩基以下であり、好ましくは７９塩基長以下である。
　前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、例えば、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）の前記連続部分配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。具体例としては、配列番号８３～１１３のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子があげられる。前記置換等の塩基の数は、特に制限されず、配列番号８３～１１３のいずれかの塩基配列において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個であり、より好ましくは１～３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ｂ３）の核酸分子でもよい。以下、前記（Ｂ３）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ３）という。
（Ｂ３）配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ３）は、前記相同性を有する塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記相同性を有する塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記相同性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ３）は、例えば、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）の全長配列において６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能な核酸分子でもよい。この場合、前記相同性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ｂ４）の核酸分子でもよい。以下、前記（Ｂ４）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）という。
（Ｂ４）配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列または前記塩基配列に相補的な塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）は、前記ハイブリダイズする塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列を含む核酸分子でもよい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）は、前記相補的な塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記相補的な塩基配列を含む核酸分子でもよい。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７～１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０～６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５～６８℃で洗浄することにより同定できる条件をいう。１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）は、例えば、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）の全長塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。
　前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）～（Ｂ４）において、例えば、塩基、構成単位、長さ、ヌクレアーゼ耐性の付与等、特に示さない限り、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）と同様である。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子が、前記二本鎖核酸の場合、例えば、一方の一本鎖が、前記（Ａ１）～（Ａ４）および前記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかの核酸分子であり、他方の一本鎖が、前記（Ａ１）～（Ａ４）および前記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかの核酸分子に相補的な塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子であることが好ましい。
　本発明のＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、使用時において、前記ＨＭＧＢ１への結合性に影響を与えない範囲で、さらに、ポリアデニン等のリンカー配列等が結合されてもよい。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の製造方法は、何ら制限されず、化学合成を利用した核酸合成方法等、公知の方法により合成できる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、前述のように、前記配列番号１～４２のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列を含む核酸分子でもよい。後者の場合、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、前記配列番号１～４２のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列以外の塩基配列を含んでもよい。このような本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の一形態としては、例えば、Ｙ領域、Ｘ領域およびＹ’領域を含み、５’末端から、前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域が連結した核酸分子があげられる。この形態の前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子において、前記Ｘ領域は、前記配列番号１～４２のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を含み、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、それぞれ任意の塩基配列からなることが好ましい。
　前記Ｘ領域の塩基数は、特に制限されないが、例えば、１０～６０塩基であり、好ましくは１５～５０塩基であり、より好ましくは２０～４０塩基である。前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基数は、特に制限されないが、それぞれ、例えば、１０～５０塩基であり、好ましくは１５～４０塩基であり、より好ましくは２０～３０塩基である。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の全塩基数は、特に制限されないが、例えば、２０～１６０塩基であり、好ましくは３０～１２０塩基であり、より好ましくは４０～１００塩基である。
　前記Ｙ領域の塩基配列およびＹ’領域の塩基配列は、それぞれ、特に制限されないが、例えば、プライマーがアニーリング可能なプライマー結合配列、および、ポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識配列等を含むことが好ましい。ターゲットに結合可能な核酸分子を大量に製造する場合、例えば、前述のような化学合成よりも、核酸増幅法により増幅させる方が、効率よい製造が可能である。そこで、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を核酸増幅法により増幅させる場合、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、プライマーがハイブリダイズ可能なプライマー結合配列およびポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識配列を含むことが好ましい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、前記Ｘ領域の５’側上流、すなわち、前記Ｙ領域、および前記Ｘ領域の３’側下流、すなわち、前記Ｙ’領域の少なくとも一方に、前記プライマー結合配列およびポリメラーゼ認識配列を含むことが好ましい。前記ポリメラーゼ認識領域は、例えば、核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、前記ポリメラーゼの認識配列は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識配列」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識配列であるＴ７プロモーター等があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、５’側の前記Ｙ領域は、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列と前記プライマー結合配列（以下、「５’側プライマー領域」ともいう）とを、この順序で含むことが好ましい。そして、前記Ｙ領域の３’側に、前記Ｘ領域が連結されていることが好ましい。さらに、前記Ｘ領域の３’側に、前記Ｙ’領域が連結され、前記Ｙ’領域が、プライマー結合配列（以下、「３’側プライマー領域」ともいう）を含むことが好ましい。前記ＲＮＡにおける前記５’側プライマー領域は、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’側に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’側に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、さらに、ＨＭＧＢ１への結合を補助する領域を有してもよい。また、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域、および、前記Ｘ領域と前記Ｙ’領域が、それぞれ、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を核酸増幅により調製する方法は、特に制限されない。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、ＤＮＡを鋳型として調製できる。以下、ＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ鎖をアンチセンス鎖、前記ＲＮＡのウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を含むＤＮＡ鎖をセンス鎖ともいう。前記鋳型ＤＮＡは、例えば、前記ＲＮＡにおける前記Ｘ領域の相補鎖のウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換したＤＮＡ（アンチセンス鎖）、および、前記Ｘ領域のウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を含むＤＮＡ（センス鎖）のいずれか一方を含むことが好ましい。これらのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写することにより、前記ＲＮＡを増幅できる。また、前記ＲＮＡを鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によりＤＮＡの核酸増幅を行い、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写することにより、前記ＲＮＡを増幅してもよい。
　また、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＤＮＡの場合、例えば、ＤＮＡをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法等によって、増幅できる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子において、前記Ｘ領域は、例えば、前述したｘ配列が例示できる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子において、前述のように、前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基配列は、それぞれ、特に制限されず、任意に決定できる。前記Ｙ領域の配列の一例としては、例えば、配列番号４３および配列番号１１５のいずれかで表わされる塩基配列を含む配列および前記塩基配列からなる配列があげられる。また、前記Ｙ領域は、例えば、前述したｙ配列が例示できる。なお、これらの配列は、一例であって、本発明を制限するものではない。
　　　　gggacgcucacguacgcuca（配列番号４３）
　　　　acgcucacguacgcuca（配列番号１１５）
　前記Ｙ’領域の配列の一例としては、例えば、配列番号４４で表わされる塩基配列を含む配列および前記塩基配列からなる配列があげられる。また、前記Ｙ’領域は、例えば、前述したｙ’配列が例示できる。なお、これらの配列は、一例であって、本発明を制限するものではない。
　　　　ucagugccuggacgugcagu（配列番号４４）
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、自己アニーリングによる二次構造を有してもよい。前記二次構造は、例えば、ステムループ構造があげられる。前記ステムループ構造は、例えば、前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域のいずれかが二本鎖を形成することによって、形成されてもよい。具体例としては、例えば、前記Ｙ領域の一部が、前記Ｘ領域の一部と二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよいし、前記Ｙ’領域の一部が、前記Ｘ領域の一部と二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよい。また、前記Ｙ領域の一部および前記Ｙ’領域の一部が、それぞれ、前記Ｘ領域の一部と二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよい。また、前記Ｙ領域の内部で二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよいし、前記Ｙ’領域の内部で二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよいし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域の内部において、ステムループ構造を形成してもよい。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、例えば、ＨＭＧＢ１との結合によりＨＭＧＢ１の機能を中和する中和剤として使用できる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、例えば、ＨＭＧＢ１との結合によりＨＭＧＢ１の機能を阻害する阻害剤として使用できる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、ＨＭＧＢ１の発現が原因となる疾患を予防または治療するための医薬品として使用できる。前記本発明の医薬品は、例えば、抗癌剤、抗炎症剤、抗脳卒中剤等として使用できる。
　本発明の中和剤、本発明の阻害剤および本発明の医薬品は、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の中和剤、本発明の阻害剤および本発明の医薬品は、それぞれ、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の他に、例えば、キャリアー等を含んでもよく、例えば、以下に示す組成物と同様の構成があげられ、同様にして使用できる。
＜組成物＞
　本発明の組成物は、前述のように、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。
　本発明の組成物は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、例えば、ＨＭＧＢ１との結合によりＨＭＧＢ１の機能を中和する中和剤として使用できる。
　本発明の組成物は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、例えば、ＨＭＧＢ１との結合によりＨＭＧＢ１の機能を阻害する阻害剤として使用できる。
　本発明の組成物は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、ＨＭＧＢ１の発現が原因となる疾患を予防または治療するための医薬品として使用できる。前記本発明の医薬品は、例えば、抗癌剤、抗炎症剤、抗脳卒中剤等として使用できる。
　本発明の組成物の適用対象は、特に制限されず、その用途に応じて適宜決定できる。前記適用対象は、例えば、細胞、組織および生体等があげられる。前記細胞および組織の由来、ならびに生体の種類は、特に制限されない。前記生体は、例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子および／またはＨＭＧＢ１オーソログ遺伝子を有する生物があげられ、具体例としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物があげられる。生体に投与する場合、投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与があげられる。前記非経口投与は、例えば、静脈投与、動脈投与、リンパ管への投与、筋肉投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。
　本発明の組成物は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の他に、例えば、各種添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、特に制限されず、例えば、本発明の組成物の用途に応じて、適宜決定できる。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を、例えば、細胞、組織または生体内等にデリバリーする場合、本発明の組成物は、さらに、前記添加剤として、キャリアーを含むことが好ましい。前記キャリアーは、特に制限されないが、例えば、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、逆ミセル、ポリカチオン、細胞膜透過性ペプチド、磁気粒子、リン酸カルシウム等があげられる。前記ナノ粒子は、特に制限されないが、例えば、カーボンナノホーンおよびカーボンナノチューブ等のナノカーボンがあげられる。これらのキャリアーは、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。また、前記添加剤は、例えば、緩衝剤、金属塩、界面活性剤等があげられる。
＜検出試薬＞
　本発明の検出試薬は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含むことを特徴とする、前記ＨＭＧＢ１を検出するためのＨＭＧＢ１検出試薬である。本発明は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。
　本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＨＭＧＢ１に結合可能である。このため、例えば、本発明の検出試薬を用いて、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子とＨＭＧＢ１との結合の有無を確認することにより、試料中におけるＨＭＧＢ１を定性または定量可能となる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子とＨＭＧＢ１との結合の有無の確認方法は、特に制限されず、核酸とタンパク質との結合を検出する公知の方法を利用できる。このように本発明の検出試薬を用いれば、ＨＭＧＢ１を容易に検出できることから、例えば、生化学や臨床の分野に有用である。
＜治療方法＞
　本発明の治療方法は、前記ＨＭＧＢ１が関与する疾患の対象に、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を投与する工程を含むことを特徴とする。前記ＨＭＧＢ１が関与する疾患は、特に制限されないが、例えば、癌、炎症および脳卒中からなる群から選択された少なくとも一つの疾患があげられる。前記癌は、例えば、乳癌、大腸癌、メラノーマ、前立腺癌、膵臓癌および肺癌等があげられる。本発明の治療方法によれば、例えば、前記疾患の予防、前記疾患の進行の抑制または前記疾患の治療等が可能である。本発明の治療方法は、予防方法の意味も含み、前記疾患の危険性がある対象に、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を投与する工程を含んでもよい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の投与方法、投与条件等は、特に制限されず、前述の通りである。また、前記投与対象（例えば、患者）も、特に制限されない。前記生体は、例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子および／またはＨＭＧＢ１オーソログ遺伝子を有する生物があげられ、具体例としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物があげられる。前記投与工程において、例えば、本発明の組成物を投与してもよい。
　本発明は、前記ＨＭＧＢ１が関与する疾患の治療に使用するための核酸分子であることを特徴とする。前記核酸分子は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子である。前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述の通りである。また、本発明は、前記ＨＭＧＢ１が関与する疾患の治療に使用するための組成物であることを特徴とする。前記組成物は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含む前記本発明の組成物である。前記本発明の組成物は、前述の通りである。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
　ＨＭＧＢ１に結合可能なＲＮＡアプタマーを作製し、各ＲＮＡアプタマーについて、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　＃４７（配列番号６５）、＃８０（配列番号６７）、＃０６（配列番号５６）、＃３６（配列番号６０）、＃３４（配列番号６３）、＃０８（配列番号４６）、＃１０（配列番号５８）の各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。４０塩基長のランダム配列を含む下記配列番号８２で表わされるオリゴヌクレオチドからなるＲＮＡを複数含むＲＮＡライブラリー（４０Ｎ）を、比較例のＲＮＡとした（以下、同様）。配列番号８２において、「ｎ」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである。
４０Ｎ（配列番号８２）
gggacgcucacguacgcucannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnucagugccuggacgugcagu
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記各ＲＮＡアプタマーについて、Ｎ末端にＨｉｓ－ｔａｇが付加されたＨＭＧＢ１（Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１）に対する結合能を確認した。前記結合能の解析には、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘ（ＧＥヘルスケア社製）を、その使用説明書にしたがって使用した。
　まず、ＢＩＡＣＯＲＥ専用のセンサーチップ（商品名Ｓｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ　ＳＡ、ＧＥヘルスケア社製）を、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘにセットした。前記センサーチップのフローセル２に、ランニングバッファーを用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化デオキシチミジンをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｕｎｉｔ）が約１０００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化デオキシチミジンは、５’末端をビオチン化した２０塩基長のデオキシチミジンを使用した。そして、前記チップの前記フローセル１、２に、ランニングバッファーを用いて、１０μｇ／ｍＬのＲＮＡアプタマーを流速２０μＬ／ｍｉｎで１分間インジェクションし、シグナル強度が約１０００ＲＵになるまで結合させた。続いて、６７５ｎｍｏｌ／Ｌの前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１を、前記ランニングバッファーを用いて、流速２０μＬ／ｍｉｎで３０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で前記ランニングバッファーを流して洗浄を行った。前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクションおよび前記ランニングバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。前記ランニングバッファーの組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ-１００（登録商標）とし、そのｐＨは、７．２とした。また、非特異結合を抑えるためのブロッキング剤として、ｔＲＮＡを１ｍｇ／ｍＬ濃度で使用した。比較例は、前記実施例のＲＮＡアプタマーに代えて、前記比較例のＲＮＡを使用した以外は、同様にして、シグナル強度の測定を行った。これらの結果を図１に示す。
　図１は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－１０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～３０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図１に示すように、前記比較例のＲＮＡを使用した場合、シグナル強度の増加が見られないことから、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１と結合していないことがわかった。これに対して、実施例の各ＲＮＡアプタマーによれば、シグナル強度の増加が見られたことから、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。
　そして、得られたシグナル強度から、各ＲＮＡアプタマーと前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１との解離定数を求めた。この結果を下記表２に示す。下記表２に示すように、前記比較例のＲＮＡは、解離定数が１．０４×１０－６であるのに対して、前記実施例の各ＲＮＡアプタマーは、解離定数が１０－１３～１０－７オーダーという優れた値を示し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能に優れることがわかった。特に、＃０６および＃０８のＲＮＡアプタマーは、それぞれ解離定数のオーダーが１０－１０および１０－１１であり、抗体の一般的なオーダー（１０－９オーダー）よりも十分に低い、つまり、十分に高い結合能を示した。さらに、＃４７および＃８０のＲＮＡアプタマーは、それぞれ、１０－１２オーダーおよび１０－１３オーダーを示し、このオーダーは、出願時において報告されたことのないオーダーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（３）ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記各ＲＮＡアプタマーについて、Ｎ末端にＨｉｓ－ｔａｇが付加されていないＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。前記結合能の解析は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に代えて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ＨＭＧＢ１を使用し、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記（２）と同様にして、結合能の解析を行った。これらの結果を、図２に示す。
　図２は、前記ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図２のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－１０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～６０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図２に示すように、Ｈｉｓ－ｔａｇを付加していないＨＭＧＢ１についても、実施例の各ＲＮＡアプタマーは高い結合能を示した。この結果から、実施例のＲＮＡアプタマーが、Ｈｉｓ－ｔａｇではなく、ＨＭＧＢ１に結合するＲＮＡアプタマーであることがわかった。
（４）Ｈｉｓ-ｔａｇに対する結合能
　前記各ＲＮＡアプタマーについて、Ｈｉｓ－ｔａｇに対する結合能を確認した。前記結合能の解析は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に代えて、３００ｎｍｏｌ／Ｌの前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質を使用した以外は、前記（２）と同様にして、結合能の解析を行った。これらの結果を、図３に示す。
　図３は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図３のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－１０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質のインジェクション開始時点であり、０秒～３０秒が、前記Ｈｉｓ-ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図３に示すように、実施例の各ＲＮＡアプタマーは、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質のインジェクション中（０秒～３０秒）に若干のシグナル強度の増加が見られたが、経時的に増加することはなく、３０秒以降の洗浄により、シグナル強度の急速な減少が見られ、最終的にはシグナル強度が０となった。このことから、実施例の各ＲＮＡアプタマーは、Ｈｉｓ－ｔａｇに結合するものではないことが確認された。
（５）生体の生理条件下におけるＨＭＧＢ１に対する結合能
　生理条件下でのＨＭＧＢ１に対する前記各ＲＮＡアプタマーの結合能を確認した。前記ランニングバッファーにおけるＮａＣｌ濃度５００ｍｍｏｌ／Ｌを、生体の生理条件である１５０ｍｍｏｌ／Ｌに設定し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を４５秒とした以外は、前記（２）と同様にして、結合能の解析を行った。これらの結果を、図４に示す。
　図４は、生理条件下における、前記ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図４のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－２０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～４５秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、４５秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図４に示すように、実施例の各ＲＮＡアプタマーは、生理条件下においても、前記ＨＭＧＢ１に対して高い結合能を示した。この結果から、実施例のＲＮＡアプタマーが、生理条件下においても、ＨＭＧＢ１に結合するアプタマーであることがわかった。このため、本発明のＲＮＡアプタマーによれば、例えば、生体に投与しても、生体中のＨＭＧＢ１と優れた結合能で結合できるといえる。
［実施例２］
　ＨＭＧＢ１に結合可能なＲＮＡアプタマーを作製し、各ＲＮＡアプタマーについて、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）およびＲ８ｃ６＿１４（配列番号７５）の各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記（１）で調製したＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１μｍｏｌ／Ｌ、インジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。これらの結果を、図５に示す。
　図５は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図５のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－２０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～６０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図５に示すように、実施例の各ＲＮＡアプタマーによれば、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。また、Ｒ８ｃ６＿１およびＲ８ｃ６＿１４のＲＮＡアプタマーの解離定数は、それぞれ７．５２×１０－１４および１．０６×１０－１３と極めて低く、非常に優れた結合能を示した。
［実施例３］
　Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）のＲＮＡアプタマーを、さらに小型化し、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　下記表３に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。前記ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、Ｒ８ｃ６＿１の５’側の領域または３’側の領域を欠失した塩基配列とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を６３５ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図６に示す。
　図６は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図６のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－２０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～６０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図６に示すように、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、Ｒ８ｃ６＿１の５’側を欠失させたＲ８ｃ６＿１－１５、Ｒ８ｃ６＿１－１８、Ｒ８ｃ６＿１－２０およびＲ８ｃ６＿１－２１は、Ｒ８ｃ６＿１よりも優れた結合能を示した。
［実施例４］
　Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）の小型化ＲＮＡアプタマーをフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　リボース残基の２’位がフルオロ化された２’－フルオロ－ＣＴＰおよび２’－フルオロ－ＵＴＰ（以下、同様）を用いて、前記実施例３の前記表３に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、前記表３に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。各フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－１、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－４、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－１５、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－１８、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２１と表わす。また、前記Ｎ４０について、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化し、フルオロ化Ｎ４０（２’Ｆ－Ｎ４０）を作製し、比較例として使用した（以下、同様）。
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーを使用し、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、前記２’Ｆ－Ｎ４０、フルオロ化していない未修飾のＲ８ｃ６＿１についても、同様に解析を行った。これらの結果を、図７に示す。
　図７は、前記ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図７のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－２０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～６０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図７に示すように、Ｒ８ｃ６＿１を小型化した前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－１８は、未修飾のＲ８ｃ６＿１と同等の優れた結合能を示した。フルオロ化したＲＮＡアプタマーは、通常、ＲＮａｓｅ耐性を示すことが知られている。このため、ＨＭＧＢ１に結合能を有する前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、例えば、生体内に投与されても分解され難いため、例えば、医薬品等に有用であるといえる。
［実施例５］
　Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）およびその小型化ＲＮＡアプタマーであるＲ８ｃ６＿１－１８（配列番号８７）を、それぞれフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　前記２’－フルオロ－ＣＴＰおよび前記２’－フルオロ－ＵＴＰを用いて、前記Ｒ８ｃ６＿１および前記Ｒ８ｃ６＿１－１８の各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）およびＲ８ｃ６＿１－１８（配列番号８７）の塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。各フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－１８と表わす。
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーを使用し、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記ランニングバッファーにおけるＮａＣｌの濃度を１５０ｍｍｏｌ／Ｌとし、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、前記２’Ｆ－Ｎ４０、フルオロ化していない未修飾のＲ８ｃ６＿１についても、同様に解析を行った。これらの結果を、図８に示す。
　図８は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図８のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－２０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～６０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図８に示すように、前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－１８は、未修飾のＲ８ｃ６＿１と同等の優れた結合能を示した。
［実施例６］
　Ｒ８ｃ６＿１－１８（配列番号８７）による、ＨＭＧＢ１とレセプターＴＬＲ－２との結合阻害を確認した。
（１）プルダウンアッセイ
　Ｎ末端にＨｉｓ－ｔａｇが付加されたＴＬＲ－２（Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＴＬＲ－２）を使用した。２μｇのＨｉｓ－ｔａｇ付加ＴＬＲ－２、２μｇのＨＭＧＢ１および所定量のＲ８ｃ６＿１－１８を、５０μＬのバインディングバッファーに添加し、この混合液を、４℃で２０分間インキュベートした。Ｒ８ｃ６＿１－１８の添加量は、１μｇ、２μｇおよび４μｇとした。前記バインディングバッファーの組成は、前記ランニングバッファーと同じであり、１ｍｇ／ｍＬ　ｔＲＮＡ添加またはｔＲＮＡ未添加とした。前記混合液に、Ｃｏ２＋が結合したアガロースビーズ１μＬ（製品名ＢＤ　ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ：ＢＤ　バイオサイエンス社製）を加えて、４℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、前記アガロースビーズを洗浄し、抗ＨＭＧＢ１抗体（製品名Ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ｔｏ　ＨＭＧＢ１：ａｂｃａｍ社製）を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。また、比較例として前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図９に示す。
　図９は、ＨＭＧＢ１とＴＬＲ－２との結合を示すプルダウンアッセイの写真である。図９において、ｔＲＮＡ「－」は、ｔＲＮＡ未添加の前記バインディングバッファーの使用を示し、ｔＲＮＡ「＋」は、ｔＲＮＡ添加の前記バインディングバッファーの使用を示す。図９において、左から、レーン「Ｍ」は、分子量マーカー、レーン「－」は、ｔＲＮＡ未添加且つＲＮＡアプタマー未添加の結果、レーン「＋」は、ｔＲＮＡ添加且つＲＮＡアプタマー未添加の結果、レーン「４０Ｎ」は、それぞれ、添加量４μｇ、２μｇ、１μｇの結果、レーン「Ｒ８ｃ６＿１－１８」は、それぞれ、添加量４μｇ、２μｇ、１μｇの結果を示す。また、各レーンの結果について、検出したＨＭＧＢ１量をＴＬＲ－２量で補正し、レーン「＋」の補正値を１００とした相対値を、各レーンの下に示す。
　図９に示すように、比較例の４０Ｎを添加した場合、添加量の増加によっても、ＨＭＧＢ１の量は変化しなかった。これに対して、Ｒ８ｃ６＿１－１８を添加した場合、添加量の増加によって、ＨＭＧＢ１量が低下した。この結果から、Ｒ８ｃ６＿１－１８によって、ＨＭＧＢ１とＴＬＲ－２との結合が阻害されていることがわかる。このため、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＨＭＧＢ１が関与する疾患の治療に有用であるといえる。
［実施例７］
　ＲＮＡアプタマーをフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　前記２’－フルオロ－ＣＴＰおよび前記２’－フルオロ－ＵＴＰを用いて、下記表４に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、下記表４に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基および／またはウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。ウラシルヌクレオチド残基およびシトシンヌクレオチド残基がフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ－ＣＵ－Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ－ＣＵ－＃０６、２’Ｆ－ＣＵ－ＣＵ＃８０、２’Ｆ－ＣＵ－Ｒ４＿９０６８と表わす。シトシンヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ－Ｃ－Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ－Ｃ－＃０６、２’Ｆ－Ｃ－＃８０、２’Ｆ－Ｃ－Ｒ４＿９０６８と表わす。ウラシルヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ－Ｕ－Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ－Ｕ－＃０６、２’Ｆ－Ｕ－＃８０、２’Ｆ－Ｕ－Ｒ４＿９０６８と表わす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１（Ｓｉｇｍａ社製）の濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記ランニングバッファーにおけるＮａＣｌの濃度を１５０ｍｍｏｌ／Ｌとし、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、フルオロ化していない未修飾のＲ８ｃ６＿１についても、同様に解析を行った。また、比較例として、フルオロ化していない前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図１０に示す。
　図１０は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１０のグラフにおいて、縦軸は、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション終了時における、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示す。前記グラフは、左から、４０Ｎ、＃０６、＃８０、Ｒ８ｃ６＿１、ＨＭＧＢ１Ｒ４＿９０６８の結果を示す。前記グラフにおいて、「２’Ｆ－ＣＵ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ」は、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基の両方がフルオロ化されたＲＮＡアプタマーの結果であり、「２’Ｆ－Ｃ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ」は、シトシンヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたＲＮＡアプタマーの結果であり、「２’Ｆ－Ｕ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ」は、ウラシルヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたＲＮＡアプタマーの結果であり、「ｎｏｎ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ」は、未修飾のＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１および未修飾のＮ４０の結果である。
　図１０に示すように、各フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、比較例の未修飾の４０Ｎよりも高いシグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ－ＣＵ－Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ－Ｃ－Ｒ８ｃ６＿１および２’Ｆ－Ｕ－Ｒ８ｃ６＿１は、優れた結合能を示し、特に、２’Ｆ－ＣＵ－Ｒ８ｃ６＿１は、未修飾のＲ８ｃ６＿１と同等の結合能を示した。
［実施例８］
　Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）およびＲ８ｃ６＿１－１８（配列番号８７）の二次構造を推定した。これらの二次構造を、図１１に示す。
［実施例９］
　Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）のＲＮＡアプタマーを、さらに小型化し、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　下記表５および下記表６に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　前記表５のＲＮＡアプタマーは、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したアプタマーである。図１８に、Ｒ８ｃ６＿１、図１９に、Ｒ８ｃ６＿１－１８の推定二次構造の概略図を示す。前記表５において、Ｒ８ｃ６＿１－２５およびＲ８ｃ６＿１－１８は、それぞれ、Ｒ８ｃ６＿１から、その５’側の領域を欠失した塩基配列とした。Ｒ８ｃ６＿１－１８－Ｓ２、Ｒ８ｃ６＿１－１８－Ｓ４およびＲ８ｃ６＿１－１８－Ｓ６は、それぞれ、Ｒ８ｃ６＿１から、Ｒ８ｃ６＿１－１８と同様に、その５’側の領域を欠失し、さらに、図１８に示すＳ２、Ｓ４またはＳ６の領域を欠失した塩基配列とした。Ｒ８ｃ６＿１の推定二次構造において、Ｓ２およびＳ４は、それぞれ、ステム構造を形成する塩基対領域であり、Ｓ６は、ステムループ構造の領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　前記表６のＲＮＡアプタマーは、前記表５のＲ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６をさらに小型化したアプタマーである。図２０に、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６の推定二次構造の概略図を示す。Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ａ２、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ｃ、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ８は、それぞれ、図２０に示すＡ２、ＣおよびＳ８の領域を欠失した塩基配列とした。また、Ｒ８ｃ６＿１－２６－Ｓ６は、それぞれ、Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６の５’側の１塩基を欠失した塩基配列とした。
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１６０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図１２および図１３に示す。
　図１２および図１３は、それぞれ、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１２および図１３のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－１０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～３０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図１２に示すように、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、Ｒ８ｃ６＿１－１８－Ｓ２、Ｒ８ｃ６＿１－２５は、Ｒ８ｃ６＿１よりも優れた結合能を示した。
　また、図１３に示すように、Ｒ８ｃ６＿１の小型化したＲＮＡアプタマーであるＲ８ｃ６＿１－２５を、さらに小型化した各ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。
［実施例１０］
　ＲＮＡアプタマーをフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　前記２’－フルオロ－ＣＴＰおよび前記２’－フルオロ－ＵＴＰを用いて、下記表７に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、前記表７に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。ウラシルヌクレオチド残基およびシトシンヌクレオチド残基がフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－１８－Ｓ６、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ａ、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ａ２、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ａ３、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ｃ、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６Ｃ２、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ８と表わす。また、前記Ｎ４０についても、同様に、前記２’－フルオロ－ＣＴＰおよび前記２’－フルオロ－ＵＴＰを用いてフルオロ化を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１５０５００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。これらの結果を、図１４に示す。
　図１４は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１４のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－１０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～３０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図１４に示すように、小型化した前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－１８－Ｓ６および２’－Ｒ８ｃ６＿１－２５は、優れた結合能を示した。
［実施例１１］
　Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）のＲＮＡアプタマーを、さらに小型化し、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　下記表８に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　前記表８のＲＮＡアプタマーは、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したアプタマーである。Ｒ８ｃ６＿１－２１－Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１－２２－Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１－２３－Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１－２４－Ｓ６は、それぞれ、前記Ｒ８ｃ６＿１－１８－Ｓ６から、その５’側の領域を欠失した塩基配列とした。また、Ｒ８ｃ６＿１－２１－Ｓ８、Ｒ８ｃ６＿１－２２－Ｓ８、Ｒ８ｃ６＿１－２３－Ｓ８、Ｒ８ｃ６＿１－２４－Ｓ８は、それぞれ、５’側の配列が、Ｒ８ｃ６＿１－２１－Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１－２２－Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１－２３－Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１－２４－Ｓ６と同じであり、前記図２０に示す前記Ｓ８と同じ領域を欠失する塩基配列とした。
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１５０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図１５に示す。
　図１５は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１５のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－１０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～３０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図１５に示すように、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。
［実施例１２］
　ＲＮＡアプタマーをフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。
（１）ＲＮＡアプタマー
　前記２’－フルオロ－ＣＴＰおよび前記２’－フルオロ－ＵＴＰを用いて、下記表９および下記表１０に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、前記表９および前記表１０に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。ウラシルヌクレオチド残基およびシトシンヌクレオチド残基がフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２１－Ｓ６、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２２－Ｓ６、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２３－Ｓ６、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２４－Ｓ６、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ６、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２６－Ｓ６、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２７－Ｓ６、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２１－Ｓ８、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２２－Ｓ８、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２３－Ｓ８、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２４－Ｓ８、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ８、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２５－Ｓ８ＣＡと表わす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
　前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１５０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、未修飾の前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図１６および図１７に示す。図１６および図１７において、各ＲＮＡアプタマーの名称は、Ｒ８ｃ６＿１を省略して表わした。
　図１６および図１７は、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１６および図１７のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、－１０秒～０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒～３０秒が、前記Ｈｉｓ－ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。
　図１６および図１７に示すように、小型化した前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２１－Ｓ６および２’Ｆ－Ｒ８ｃ６＿１－２１－Ｓ８は、優れた結合能を示した。
［実施例１３］
　ＥＬＩＳＡ法により、ＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１－１８－Ｓ６（配列番号９５）とＨＭＧＢ１との相互作用を確認した。
　炭酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて、Ａｎｔｉ－ｈｉｓ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（製品名Ｐｅｎｔａ・Ｈｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＱＩＡＧＥＮ社）を、４ｕｇ／ｍＬとなるように希釈した。この希釈抗体液を、９６ウェルプレート（製品名９６ウエルエライサプレート：旭テクノグラス社）の各ウェルに、５０μＬずつ分注し、室温で２時間静置した。さらに、前記プレートの各ウェルに、１％ＢＳＡ／ＴＢＳを５０μＬずつ分注し、一晩静置した。前記ＴＢＳの組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．９％ＮａＣｌとした。このようにして、前記プレートのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理を行った前記プレートのウェルを、バッファー２００μＬで３回洗浄した。前記バッファーの組成は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（登録商標）とし、そのｐＨは、７．２とした。
　ＨＭＧＢ１（製品名　ＨＭＧ－１：Ｓｉｇｍａ社）を、ｔＲＮＡを含む前記バッファーで、所定濃度（１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ）となるように希釈し、前記ＨＭＧＢ１希釈液を調製した。
　他方、前記ＲＮＡアプタマーを前記バッファーで希釈し、前記ＲＮＡアプタマー希釈液を９５℃で５分間加熱処理した後、室温に戻した。そして、前記ＲＮＡアプタマー希釈液に、ＲＮａｓｅ阻害剤（製品名　ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＴＯＹＯＢＯ社）およびビオチン化デオキシチミジンを混合し、ＲＮＡアプタマー混合液を調製した。前記ビオチン化デオキシチミジンは、５’末端をビオチン化した２０塩基長のデオキシチミジンを使用した。前記ＲＮＡアプタマー混合液において、前記ＲＮＡアプタマーの濃度は、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬとした。また、前記ＲＮＡアプタマー混合液は、５０μＬあたり（すなわち、１ウェルあたり）、前記ＲＮａｓｅ阻害剤が０．２μＬ、前記ビオチン化デオキシチミジンが０．２μＬとなるように設定した。
　そして、前記洗浄後の前記プレートの各ウェルに、前記ＨＭＧＢ１希釈液を５０μＬずつ分注し、４℃で２時間静置した後、前記バッファー２００μＬで３回洗浄した。つぎに、前記各ウェルに、さらに、前記ＲＮＡアプタマー混合液を５０μＬずつ分注し、４℃で２時間反応させた。前記各ウェルに添加した前記ＨＭＧＢ１希釈液（５０μＬ）の濃度と前記ＲＮＡアプタマー混合液（５０μＬ）の濃度との比率は、１：２０、２：２０、１：１０、２：１０とした。
　続いて、各ウェルに、アビジン付加したＨＲＰ（製品名Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＧＥヘルスケア社）を、前記バッファーで１０００倍希釈し、各ウェルに５０ｕｌずつ分注し、４℃で１時間反応させた。前記プレートを、前記バッファー２００μＬで３回洗浄し、常温のＴＭＢ（製品名１－Ｓｒｅｐ（ＴＭ）Ｕｌｔｒａ　ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を、各ウェルに、１００ｕＬずつ分注した。前記プレートを遮光した状態で、室温で３０分静置した。各ウェルに２ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００ｕＬずつ分注して、反応を停止させた。そして、前記各ウェルについて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。また、対照例として、ＲＮＡアプタマーを添加しない以外は、同様にして処理を行い、吸光度の測定を行った。これらの結果を、図２１に示す。
　図２１は、ＨＭＧＢ１と前記ＲＮＡアプタマーとの相互作用を示すグラフであり、縦軸は、吸光度を示す。図２１に示すように、ＨＭＧＢ１と前記ＲＮＡアプタマーとの結合を示す吸光度が増加したことから、ＨＭＧＢ１に前記ＲＮＡアプタマーが結合することが確認できた。また、前記ＲＮＡアプタマー濃度に対するＨＭＧＢ１濃度を増加させることで、前記吸光度が増加した。このことから、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子によれば、ＨＭＧＢ１の定量が可能であるといえる。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
　この出願は、２００９年７月１６日に出願された日本出願特願２００９－１６７６２２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　本発明のアプタマーによれば、例えば、ＨＭＧＢ１と結合することより、ＨＭＧＢ１が原因となる前述のような疾患の予防および治療が可能となる。また、本発明のアプタマーによれば、例えば、ＨＭＧＢ１との結合の有無を確認することで、ＨＭＧＢ１を検出でき、また、ＨＭＧＢ１の機能解明にも使用できることから、新たな研究用ツールとしても有用である。

Claims (26)

  1. ＨＭＧＢ１タンパク質との解離定数が５×１０－７以下の核酸分子である、ＨＭＧＢ１タンパク質に結合可能なＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  2. 　下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ｂ１）および（Ｂ２）のいずれかの核酸分子である、請求項１記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
    （Ａ１）配列番号１～４２のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
    （Ａ２）配列番号１～４２のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１タンパク質に結合可能である核酸分子
    （Ｂ１）配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
    （Ｂ２）配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１タンパク質に結合可能である核酸分子
  3. 前記（Ｂ２）の核酸分子が、配列番号４５～８１のいずれかで表わされる塩基配列において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列を含む核酸分子である、請求項２記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  4. 前記（Ｂ１）の核酸分子が、下記（ｂ１）の核酸分子であり、前記（Ｂ２）の核酸分子が、下記（ｂ２）の核酸分子である、請求項２または３記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
    （ｂ１）配列番号７４で表わされる塩基配列を含む核酸分子
    （ｂ２）配列番号７４で表わされる塩基配列における連続する１１塩基以上の部分配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１タンパク質に結合可能である核酸分子
  5. 前記（ｂ２）の核酸分子が、配列番号８３～１１３のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子である、請求項４記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  6. 前記（ｂ２）の核酸分子が、配列番号８３～１１３のいずれかで表わされる塩基配列において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列を含む核酸分子である、請求項４記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  7. 前記核酸分子が、修飾化ヌクレオチド残基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  8. 前記修飾化ヌクレオチド残基が、メチル化ヌクレオチド残基、フルオロ化ヌクレオチド残基、アミノ化ヌクレオチド残基およびチオ化ヌクレオチド残基からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項７記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  9. 前記修飾化ヌクレオチド残基が、シトシンを有するヌクレオチド残基およびウラシルを有するヌクレオチド残基の少なくとも一方である、請求項７または８記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  10. 前記修飾化ヌクレオチド残基が、リボース残基が修飾されたヌクレオチド残基である、請求項７から９のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  11. Ｙ領域、Ｘ領域およびＹ’領域を含み、
    ５’末端から前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域が連結し、
    前記Ｘ領域が、前記配列番号１～４２のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を含み、
    前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域が、それぞれ任意の塩基配列からなる、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  12. 前記Ｘ領域の塩基数が、２０～４０塩基である、請求項１１記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  13. 前記Ｙ領域の塩基数および前記Ｙ’領域の塩基数が、それぞれ、２０～３０塩基である、請求項１１または１２記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  14. 前記Ｙ領域の配列が、配列番号４３および配列番号１１５のいずれかで表わされる塩基配列を含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
    　　　　gggacgcucacguacgcuca（配列番号４３）
    　　　　acgcucacguacgcuca（配列番号１１５）
  15. 前記Ｙ’の配列が、配列番号４４で表わされる塩基配列を含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
    　　　　ucagugccuggacgugcagu（配列番号４４）
  16. 前記核酸分子の全塩基数が、４０～１００塩基である、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  17. 前記核酸分子が、ステムループ構造を有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  18. 前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域の少なくとも一方において、一部が、前記Ｘ領域の一部と二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成している、請求項１０から１７のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  19. 前記Ｙ’領域および前記Ｙ’領域の少なくとも一方において、内部で二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成している、請求項１０から１８のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
  20. 請求項１から１９のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含み、ＨＭＧＢ１タンパク質と前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子との結合により、ＨＭＧＢ１タンパク質の機能を中和することを特徴とする中和剤。
  21. 請求項１から１９のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含み、ＨＭＧＢ１タンパク質と前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子との結合により、ＨＭＧＢ１タンパク質の機能を阻害することを特徴とする阻害剤。
  22. 請求項１から１９のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含むことを特徴とする医薬品。
  23. 前記医薬品が、抗癌剤、抗炎症剤、抗脳卒中剤からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２２記載の医薬品。
  24. 請求項１から１９のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含む、組成物。
  25. さらに、キャリアーを含む、請求項２４記載の組成物。
  26. 請求項１から１９のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含む、ＨＭＧＢ１タンパク質を検出するためのＨＭＧＢ１検出試薬。
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