JPWO2011007876A1 - Hmgb1結合核酸分子およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のHMGB1結合核酸分子は、前述のように、HMGB1との解離定数が5×10−7以下であることを特徴とする、HMGB1に結合可能な核酸分子である。本発明のHMGB1結合核酸分子は、例えば、HMGB1アプタマーともいう。
(A1)配列番号1〜42のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
(A2)配列番号1〜42のいずれかで表わされる塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、HMGB1に結合可能である核酸分子
(B1)配列番号45〜81のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
(B2)配列番号45〜81のいずれかで表わされる塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、HMGB1に結合可能である核酸分子
(A1)配列番号1〜42のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
mmhbuaagmcacguagmaccag
C_1(配列番号2)
accguaagacacguagaaccag
C_2(配列番号3)
aauuuaagccacguagaaccag
C_3(配列番号4)
acaguaagacacguagcaccag
C_4(配列番号5)
cauguaagccacguagaaccag
#04(配列番号6)
ucccaugauuguucaggcacggccuuucgguucccucaau
#08(配列番号7)
agucccuugacacguccguuuucuaacuggaauagaggcc
#12(配列番号8)
gggcugcaccucuccgcuacguugucguuggaggcaccau
#43(配列番号9)
gguauuaaaacucccucguaggucauccgcccggccuagc
#49(配列番号10)
cauccuuaucacauggucauccgcccggccaugcaauguu
#32(配列番号11)
cauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggcccgcau
#58(配列番号12)
cauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggccgcgcucgccaguca
#01(配列番号13)
uggcauccuugcucacuccaggcuaaaccucucgguuccc
#26(配列番号14)
ccaagcacuucaucgucuaggcaauugccucucgguaccc
#73(配列番号15)
ccacaagcucgcacuaguuccaggcuuccucucgguaccc
#77(配列番号16)
cauguauuucugcacguuccagagaauccucucgguaccc
#06(配列番号17)
uacacugcacgcuccgcuuugaacaucaauggaggcccug
#22(配列番号18)
gcgcucgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacu
#10(配列番号19)
uagucaaggugaaaacccccauagagacu
#21(配列番号20)
ggccugugcuaacaugagucauccguccggcucgcaacuc
#36(配列番号21)
ccuagcacguccguuucuggaucugucaguuagaggccua
#15(配列番号22)
gcaucaaccucuguaagagcgcgcuuugcuucaccaaaaa
#23(配列番号23)
acgguccuuaaaaucuuccuuaaccacgcccaggaucuua
#34(配列番号24)
auucaccucagcauguccgcuugugacgauggaggcaccu
#40(配列番号25)
gguccuuaaaaucuuccaaucuaaacgauccagacacggc
#47(配列番号26)
aaaaacuacugccgaaccguaagacacguagaaccaggca
#79(配列番号27)
gaccagguuccugacaucucugaacuauaccuccaaaacg
#80(配列番号28)
caucugaauuuaagccacguagaaccaggcccuccacgcg
#82(配列番号29)
uaauacgacucacuauagggacgcucacguacgcucagug
R4_1(配列番号30)
aaugagggcccacuuccggaucuuugguuugcuuccuugc
R4_4(配列番号31)
ucgcuuauggaugcccacuuccacucacuguccugcgcaa
R4_10(配列番号32)
uauuaauaccucagcccucuucucuuagucuggugccgau
R4_11(配列番号33)
ucucuuuucgaauuccguucuggcucacuccuuggguauu
R4_12(配列番号34)
cugacaucuuuuacacugauuucuguuggcccacuucugu
R8c6_1(配列番号35)
gaguacaguaagacacguagcaccagucugacguuugucg
R8c6_14(配列番号36)
ugccaucaccauguaagccacguagaaccagcacuacuag
R8c9_1(配列番号37)
ugagucuuauagccguccguuuacguuugucuagaggcca
R8c9_6(配列番号38)
gcuucuugcauuguccgcuuaguuucuauggaggcauagu
R8c9_10(配列番号39)
ccgaauauuuuugcaccguccgauugccaugcauugaggc
HMGB1R4_9068(配列番号40)
ugauauuuaaauuuggccgcguuuaaaacauccccuacga
HMGB1R4_2478(配列番号41)
gauuccguugcccuuccguugaacugugccaggcuuuuug
HMGB1R4_5108(配列番号42)
accuuugccgcaucucacccacgucuugucaggccguuuc
gggacgcucacguacgcuca(配列番号43)
acgcucacguacgcuca(配列番号115)
ucagugccuggacgugcagu(配列番号44)
#04(配列番号45)
gggacgcucacguacgcucaucccaugauuguucaggcacggccuuucgguucccucaauucagugccuggacgugcagu
#08(配列番号46)
gggacgcucacguacgcucaagucccuugacacguccguuuucuaacuggaauagaggccucagugccuggacgugcagu
#12(配列番号47)
gggacgcucacguacgcucagggcugcaccucuccgcuacguugucguuggaggcaccauucagugccuggacgugcagu
#43(配列番号48)
gggacgcucacguacgcucagguauuaaaacucccucguaggucauccgcccggccuagcucagugccuggacgugcagu
#49(配列番号49)
gggacgcucacguacgcucacauccuuaucacauggucauccgcccggccaugcaauguuucagugccuggacgugcagu
#32(配列番号50)
gggacgcucacguacgcucacauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggcccgcauucagugccuggacgugcagu
#58(配列番号51)
gggacgcucacguacgcucacauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggccgcgcucgccagucaucagugccuggacgugcagu
#01(配列番号52)
gggacgcucacguacgcucauggcauccuugcucacuccaggcuaaaccucucgguucccucagugccuggacgugcagu
#26(配列番号53)
gggacgcucacguacgcucaccaagcacuucaucgucuaggcaauugccucucgguacccucagugccuggacgugcagu
#73(配列番号54)
gggacgcucacguacgcucaccacaagcucgcacuaguuccaggcuuccucucgguacccucagugccuggacgugcagu
#77(配列番号55)
gggacgcucacguacgcucacauguauuucugcacguuccagagaauccucucgguacccucagugccuggacgugcagu
#06(配列番号56)
gggacgcucacguacgcucauacacugcacgcuccgcuuugaacaucaauggaggcccugucagugccuggacgugcagu
#22(配列番号57)
gggacgcucacguacgcucagcgcucgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacuucagugccuggacgugcagu
#10(配列番号58)
gggacgcucacguacgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacuucagugccuggacgugcagu
#21(配列番号59)
gggacgcucacguacgcucaggccugugcuaacaugagucauccguccggcucgcaacucucagugccuggacgugcagu
#36(配列番号60)
gggacgcucacguacgcucaccuagcacguccguuucuggaucugucaguuagaggccuaucagugccuggacgugcagu
#15(配列番号61)
gggacgcucacguacgcucagcaucaaccucuguaagagcgcgcuuugcuucaccaaaaaucagugccuggacgugcagu
#23(配列番号62)
gggacgcucacguacgcucaacgguccuuaaaaucuuccuuaaccacgcccaggaucuuaucagugccuggacgugcagu
#34(配列番号63)
gggacgcucacguacgcucaauucaccucagcauguccgcuugugacgauggaggcaccuucagugccuggacgugcagu
#40(配列番号64)
gggacgcucacguacgcucagguccuuaaaaucuuccaaucuaaacgauccagacacggcucagugccuggacgugcagu
#47(配列番号65)
gggacgcucacguacgcucaaaaaacuacugccgaaccguaagacacguagaaccaggcaucagugccuggacgugcagu
#79(配列番号66)
gggacgcucacguacgcucagaccagguuccugacaucucugaacuauaccuccaaaacgucagugccuggacgugcagu
#80(配列番号67)
gggacgcucacguacgcucacaucugaauuuaagccacguagaaccaggcccuccacgcgucagugccuggacgugcagu
#82(配列番号68)
gggacgcucacguacgcucauaauacgacucacuauagggacgcucacguacgcucagugccuggacgugcagu
R4_1(配列番号69)
gggacgcucacguacgcucaaaugagggcccacuuccggaucuuugguuugcuuccuugcucagugccuggacgugcagu
R4_4(配列番号70)
gggacgcucacguacgcucaucgcuuauggaugcccacuuccacucacuguccugcgcaaucagugccuggacgugcagu
R4_10(配列番号71)
gggacgcucacguacgcucauauuaauaccucagcccucuucucuuagucuggugccgauucagugccuggacgugcagu
R4_11(配列番号72)
gggacgcucacguacgcucaucucuuuucgaauuccguucuggcucacuccuuggguauuucagugccuggacgugcagu
R4_12(配列番号73)
gggacgcucacguacgcucacugacaucuuuuacacugauuucuguuggcccacuucuguucagugccuggacgugcagu
R8c6_1(配列番号74)
gggacgcucacguacgcucagaguacaguaagacacguagcaccagucugacguuugucgucagugccuggacgugcagu
R8c6_14(配列番号75)
gggacgcucacguacgcucaugccaucaccauguaagccacguagaaccagcacuacuagucagugccuggacgugcagu
R8c9_1(配列番号76)
gggacgcucacguacgcucaugagucuuauagccguccguuuacguuugucuagaggccaucagugccuggacgugcagu
R8c9_6(配列番号77)
gggacgcucacguacgcucagcuucuugcauuguccgcuuaguuucuauggaggcauaguucagugccuggacgugcagu
R8c9_10(配列番号78)
gggacgcucacguacgcucaccgaauauuuuugcaccguccgauugccaugcauugaggcucagugccuggacgugcagu
HMGB1R4_9068(配列番号79)
gggacgcucacguacgcucaugauauuuaaauuuggccgcguuuaaaacauccccuacgaucagugccuggacgugcagu
HMGB1R4_2478(配列番号80)
gggacgcucacguacgcucagauuccguugcccuuccguugaacugugccaggcuuuuugucagugccuggacgugcagu
HMGB1R4_5108(配列番号81)
gggacgcucacguacgcucaaccuuugccgcaucucacccacgucuugucaggccguuucucagugccuggacgugcagu
モチーフ配列(配列番号114)
uaagncacguagnaccng
(A2)配列番号1〜42のいずれかで表わされる塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、HMGB1に結合可能である核酸分子
(A3)配列番号1〜42のいずれかで表わされる塩基配列において、60%以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、HMGB1に結合可能である核酸分子
(A4)配列番号1〜42のいずれかで表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列または前記塩基配列に相補的な塩基配列を含み、且つ、HMGB1に結合可能である核酸分子
(B1)配列番号45〜81のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
モチーフ配列(配列番号114)
uaagncacguagnaccng
(b1)配列番号74で表わされる塩基配列を含む核酸分子
(B2)配列番号45〜81のいずれかで表わされる塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、HMGB1に結合可能である核酸分子
(b2)配列番号74で表わされる塩基配列における連続する11塩基以上の部分配列を含み、且つ、HMGB1に結合可能である核酸分子
モチーフ配列(配列番号114)
uaagncacguagnaccng
(B3)配列番号45〜81のいずれかで表わされる塩基配列において、60%以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、HMGB1に結合可能である核酸分子
(B4)配列番号45〜81のいずれかで表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列または前記塩基配列に相補的な塩基配列を含み、且つ、HMGB1に結合可能である核酸分子
gggacgcucacguacgcuca(配列番号43)
acgcucacguacgcuca(配列番号115)
ucagugccuggacgugcagu(配列番号44)
本発明の組成物は、前述のように、前記本発明のHMGB1結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のHMGB1結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。
本発明の検出試薬は、前記本発明のHMGB1結合核酸分子を含むことを特徴とする、前記HMGB1を検出するためのHMGB1検出試薬である。本発明は、前記本発明のHMGB1結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。
本発明の治療方法は、前記HMGB1が関与する疾患の対象に、本発明のHMGB1結合核酸分子を投与する工程を含むことを特徴とする。前記HMGB1が関与する疾患は、特に制限されないが、例えば、癌、炎症および脳卒中からなる群から選択された少なくとも一つの疾患があげられる。前記癌は、例えば、乳癌、大腸癌、メラノーマ、前立腺癌、膵臓癌および肺癌等があげられる。本発明の治療方法によれば、例えば、前記疾患の予防、前記疾患の進行の抑制または前記疾患の治療等が可能である。本発明の治療方法は、予防方法の意味も含み、前記疾患の危険性がある対象に、本発明のHMGB1結合核酸分子を投与する工程を含んでもよい。本発明のHMGB1結合核酸分子の投与方法、投与条件等は、特に制限されず、前述の通りである。また、前記投与対象(例えば、患者)も、特に制限されない。前記生体は、例えば、HMGB1遺伝子および/またはHMGB1オーソログ遺伝子を有する生物があげられ、具体例としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物があげられる。前記投与工程において、例えば、本発明の組成物を投与してもよい。
HMGB1に結合可能なRNAアプタマーを作製し、各RNAアプタマーについて、HMGB1に対する結合能を確認した。
#47(配列番号65)、#80(配列番号67)、#06(配列番号56)、#36(配列番号60)、#34(配列番号63)、#08(配列番号46)、#10(配列番号58)の各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のRNAアプタマーとして使用した。40塩基長のランダム配列を含む下記配列番号82で表わされるオリゴヌクレオチドからなるRNAを複数含むRNAライブラリー(40N)を、比較例のRNAとした(以下、同様)。配列番号82において、「n」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである。
40N(配列番号82)
gggacgcucacguacgcucannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnucagugccuggacgugcagu
前記各RNAアプタマーについて、N末端にHis−tagが付加されたHMGB1(His−tag付加HMGB1)に対する結合能を確認した。前記結合能の解析には、BIACORE(登録商標)X(GEヘルスケア社製)を、その使用説明書にしたがって使用した。
前記各RNAアプタマーについて、N末端にHis−tagが付加されていないHMGB1に対する結合能を確認した。前記結合能の解析は、前記His−tag付加HMGB1に代えて、1μmol/Lの前記HMGB1を使用し、前記HMGB1のインジェクション時間を60秒とした以外は、前記(2)と同様にして、結合能の解析を行った。これらの結果を、図2に示す。
前記各RNAアプタマーについて、His−tagに対する結合能を確認した。前記結合能の解析は、前記His−tag付加HMGB1に代えて、300nmol/Lの前記His−tag付加MIFタンパク質を使用した以外は、前記(2)と同様にして、結合能の解析を行った。これらの結果を、図3に示す。
生理条件下でのHMGB1に対する前記各RNAアプタマーの結合能を確認した。前記ランニングバッファーにおけるNaCl濃度500mmol/Lを、生体の生理条件である150mmol/Lに設定し、前記His−tag付加HMGB1のインジェクション時間を45秒とした以外は、前記(2)と同様にして、結合能の解析を行った。これらの結果を、図4に示す。
HMGB1に結合可能なRNAアプタマーを作製し、各RNAアプタマーについて、HMGB1に対する結合能を確認した。
R8c6_1(配列番号74)およびR8c6_14(配列番号75)の各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のRNAアプタマーとして使用した。
前記(1)で調製したRNAアプタマーを使用し、前記His−tag付加HMGB1の濃度を1μmol/L、インジェクション時間を60秒とした以外は、前記実施例1の前記(2)と同様にして、His−tag付加HMGB1に対する結合能の解析を行った。これらの結果を、図5に示す。
R8c6_1(配列番号74)のRNAアプタマーを、さらに小型化し、HMGB1に対する結合能を確認した。
下記表3に示す各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のRNAアプタマーとして使用した。前記RNAアプタマーは、それぞれ、R8c6_1の5’側の領域または3’側の領域を欠失した塩基配列とした。
前記RNAアプタマーを使用し、前記His−tag付加HMGB1の濃度を635nmol/Lとし、前記His−tag付加HMGB1のインジェクション時間を60秒とした以外は、前記実施例1の前記(2)と同様にして、His−tag付加HMGB1に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、前記40Nについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図6に示す。
R8c6_1(配列番号74)の小型化RNAアプタマーをフルオロ化して、HMGB1に対する結合能を確認した。
リボース残基の2’位がフルオロ化された2’−フルオロ−CTPおよび2’−フルオロ−UTP(以下、同様)を用いて、前記実施例3の前記表3に示す各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化RNAアプタマーとして使用した。前記フルオロ化RNAアプタマーは、前記表3に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。各フルオロ化RNAアプタマーは、それぞれ、2’F−R8c6_1、2’F−R8c6_1−1、2’F−R8c6_1−4、2’F−R8c6_1−15、2’F−R8c6_1−18、2’F−R8c6_1−21と表わす。また、前記N40について、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化し、フルオロ化N40(2’F−N40)を作製し、比較例として使用した(以下、同様)。
前記フルオロ化RNAアプタマーを使用し、His−tag付加HMGB1の濃度を200nmol/Lとし、前記His−tag付加HMGB1のインジェクション時間を60秒とした以外は、前記実施例1の前記(2)と同様にして、HMGB1に対する結合能の解析を行った。また、前記2’F−N40、フルオロ化していない未修飾のR8c6_1についても、同様に解析を行った。これらの結果を、図7に示す。
R8c6_1(配列番号74)およびその小型化RNAアプタマーであるR8c6_1−18(配列番号87)を、それぞれフルオロ化して、HMGB1に対する結合能を確認した。
前記2’−フルオロ−CTPおよび前記2’−フルオロ−UTPを用いて、前記R8c6_1および前記R8c6_1−18の各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化RNAアプタマーとして使用した。前記フルオロ化RNAアプタマーは、R8c6_1(配列番号74)およびR8c6_1−18(配列番号87)の塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。各フルオロ化RNAアプタマーは、それぞれ、2’F−R8c6_1、2’F−R8c6_1−18と表わす。
前記フルオロ化RNAアプタマーを使用し、His−tag付加HMGB1の濃度を200nmol/Lとし、前記ランニングバッファーにおけるNaClの濃度を150mmol/Lとし、前記His−tag付加HMGB1のインジェクション時間を60秒とした以外は、前記実施例1の前記(2)と同様にして、His−tag付加HMGB1に対する結合能の解析を行った。また、前記2’F−N40、フルオロ化していない未修飾のR8c6_1についても、同様に解析を行った。これらの結果を、図8に示す。
R8c6_1−18(配列番号87)による、HMGB1とレセプターTLR−2との結合阻害を確認した。
N末端にHis−tagが付加されたTLR−2(His−tag付加TLR−2)を使用した。2μgのHis−tag付加TLR−2、2μgのHMGB1および所定量のR8c6_1−18を、50μLのバインディングバッファーに添加し、この混合液を、4℃で20分間インキュベートした。R8c6_1−18の添加量は、1μg、2μgおよび4μgとした。前記バインディングバッファーの組成は、前記ランニングバッファーと同じであり、1mg/mL tRNA添加またはtRNA未添加とした。前記混合液に、Co2+が結合したアガロースビーズ1μL(製品名BD TALON(登録商標)Metal Affinity Resin:BD バイオサイエンス社製)を加えて、4℃で20分間インキュベートした。インキュベート後、前記アガロースビーズを洗浄し、抗HMGB1抗体(製品名Rabbit polyclonal to HMGB1:abcam社製)を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。また、比較例として前記40Nについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図9に示す。
RNAアプタマーをフルオロ化して、HMGB1に対する結合能を確認した。
前記2’−フルオロ−CTPおよび前記2’−フルオロ−UTPを用いて、下記表4に示す各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化RNAアプタマーとして使用した。前記フルオロ化RNAアプタマーは、下記表4に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基および/またはウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。ウラシルヌクレオチド残基およびシトシンヌクレオチド残基がフルオロ化されたRNAアプタマーを、それぞれ、2’F−CU−R8c6_1、2’F−CU−#06、2’F−CU−CU#80、2’F−CU−R4_9068と表わす。シトシンヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたRNAアプタマーを、それぞれ、2’F−C−R8c6_1、2’F−C−#06、2’F−C−#80、2’F−C−R4_9068と表わす。ウラシルヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたRNAアプタマーを、それぞれ、2’F−U−R8c6_1、2’F−U−#06、2’F−U−#80、2’F−U−R4_9068と表わす。
前記フルオロ化RNAアプタマーを使用し、前記His−tag付加HMGB1(Sigma社製)の濃度を200nmol/Lとし、前記ランニングバッファーにおけるNaClの濃度を150mmol/Lとし、前記His−tag付加HMGB1のインジェクション時間を60秒とした以外は、前記実施例1の前記(2)と同様にして、前記His−tag付加HMGB1に対する結合能の解析を行った。また、フルオロ化していない未修飾のR8c6_1についても、同様に解析を行った。また、比較例として、フルオロ化していない前記40Nについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図10に示す。
R8c6_1(配列番号74)およびR8c6_1−18(配列番号87)の二次構造を推定した。これらの二次構造を、図11に示す。
R8c6_1(配列番号74)のRNAアプタマーを、さらに小型化し、HMGB1に対する結合能を確認した。
下記表5および下記表6に示す各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のRNAアプタマーとして使用した。
前記RNAアプタマーを使用し、前記His−tag付加HMGB1の濃度を160nmol/Lとした以外は、前記実施例1の前記(2)と同様にして、His−tag付加HMGB1に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、前記40Nについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図12および図13に示す。
RNAアプタマーをフルオロ化して、HMGB1に対する結合能を確認した。
前記2’−フルオロ−CTPおよび前記2’−フルオロ−UTPを用いて、下記表7に示す各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化RNAアプタマーとして使用した。前記フルオロ化RNAアプタマーは、前記表7に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。ウラシルヌクレオチド残基およびシトシンヌクレオチド残基がフルオロ化されたRNAアプタマーを、それぞれ、2’F−R8c6_1−18−S6、2’F−R8c6_1−25、2’F−R8c6_1−25−S6、2’F−R8c6_1−25−S6A、2’F−R8c6_1−25−S6A2、2’F−R8c6_1−25−S6A3、2’F−R8c6_1−25−S6C、2’F−R8c6_1−25−S6C2、2’F−R8c6_1−25−S8と表わす。また、前記N40についても、同様に、前記2’−フルオロ−CTPおよび前記2’−フルオロ−UTPを用いてフルオロ化を行った。
前記RNAアプタマーを使用し、前記His−tag付加HMGB1の濃度を150500nmol/Lとした以外は、前記実施例1の前記(2)と同様にして、His−tag付加HMGB1に対する結合能の解析を行った。これらの結果を、図14に示す。
R8c6_1(配列番号74)のRNAアプタマーを、さらに小型化し、HMGB1に対する結合能を確認した。
下記表8に示す各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のRNAアプタマーとして使用した。
前記RNAアプタマーを使用し、前記His−tag付加HMGB1の濃度を150nmol/Lとした以外は、前記実施例1の前記(2)と同様にして、His−tag付加HMGB1に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、前記40Nについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図15に示す。
RNAアプタマーをフルオロ化して、HMGB1に対する結合能を確認した。
前記2’−フルオロ−CTPおよび前記2’−フルオロ−UTPを用いて、下記表9および下記表10に示す各RNAアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化RNAアプタマーとして使用した。前記フルオロ化RNAアプタマーは、前記表9および前記表10に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。ウラシルヌクレオチド残基およびシトシンヌクレオチド残基がフルオロ化されたRNAアプタマーを、それぞれ、2’F−R8c6_1−21−S6、2’F−R8c6_1−22−S6、2’F−R8c6_1−23−S6、2’F−R8c6_1−24−S6、2’F−R8c6_1−25−S6、2’F−R8c6_1−26−S6、2’F−R8c6_1−27−S6、2’F−R8c6_1−21−S8、2’F−R8c6_1−22−S8、2’F−R8c6_1−23−S8、2’F−R8c6_1−24−S8、2’F−R8c6_1−25−S8、2’F−R8c6_1−25−S8CAと表わす。
前記RNAアプタマーを使用し、前記His−tag付加HMGB1の濃度を150nmol/Lとした以外は、前記実施例1の前記(2)と同様にして、His−tag付加HMGB1に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、未修飾の前記40Nについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図16および図17に示す。図16および図17において、各RNAアプタマーの名称は、R8c6_1を省略して表わした。
ELISA法により、RNAアプタマーR8c6_1−18−S6(配列番号95)とHMGB1との相互作用を確認した。
Claims (26)
- HMGB1タンパク質との解離定数が5×10−7以下の核酸分子である、HMGB1タンパク質に結合可能なHMGB1結合核酸分子。
- 下記(A1)、(A2)、(B1)および(B2)のいずれかの核酸分子である、請求項1記載のHMGB1結合核酸分子。
(A1)配列番号1〜42のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
(A2)配列番号1〜42のいずれかで表わされる塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、HMGB1タンパク質に結合可能である核酸分子
(B1)配列番号45〜81のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
(B2)配列番号45〜81のいずれかで表わされる塩基配列において、1または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、HMGB1タンパク質に結合可能である核酸分子 - 前記(B2)の核酸分子が、配列番号45〜81のいずれかで表わされる塩基配列において、5’側の4塩基目から3’側の末端塩基までの塩基配列を含む核酸分子である、請求項2記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記(B1)の核酸分子が、下記(b1)の核酸分子であり、前記(B2)の核酸分子が、下記(b2)の核酸分子である、請求項2または3記載のHMGB1結合核酸分子。
(b1)配列番号74で表わされる塩基配列を含む核酸分子
(b2)配列番号74で表わされる塩基配列における連続する11塩基以上の部分配列を含み、且つ、HMGB1タンパク質に結合可能である核酸分子 - 前記(b2)の核酸分子が、配列番号83〜113のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子である、請求項4記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記(b2)の核酸分子が、配列番号83〜113のいずれかで表わされる塩基配列において、5’側の4塩基目から3’側の末端塩基までの塩基配列を含む核酸分子である、請求項4記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記核酸分子が、修飾化ヌクレオチド残基を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記修飾化ヌクレオチド残基が、メチル化ヌクレオチド残基、フルオロ化ヌクレオチド残基、アミノ化ヌクレオチド残基およびチオ化ヌクレオチド残基からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項7記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記修飾化ヌクレオチド残基が、シトシンを有するヌクレオチド残基およびウラシルを有するヌクレオチド残基の少なくとも一方である、請求項7または8記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記修飾化ヌクレオチド残基が、リボース残基が修飾されたヌクレオチド残基である、請求項7から9のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子。
- Y領域、X領域およびY’領域を含み、
5’末端から前記Y領域、前記X領域および前記Y’領域が連結し、
前記X領域が、前記配列番号1〜42のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を含み、
前記Y領域および前記Y’領域が、それぞれ任意の塩基配列からなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子。 - 前記X領域の塩基数が、20〜40塩基である、請求項11記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記Y領域の塩基数および前記Y’領域の塩基数が、それぞれ、20〜30塩基である、請求項11または12記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記Y領域の配列が、配列番号43および配列番号115のいずれかで表わされる塩基配列を含む、請求項11から13のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子。
gggacgcucacguacgcuca(配列番号43)
acgcucacguacgcuca(配列番号115) - 前記Y’の配列が、配列番号44で表わされる塩基配列を含む、請求項11から14のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子。
ucagugccuggacgugcagu(配列番号44) - 前記核酸分子の全塩基数が、40〜100塩基である、請求項1から15のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記核酸分子が、ステムループ構造を有する、請求項1から16のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記Y領域および前記Y’領域の少なくとも一方において、一部が、前記X領域の一部と二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成している、請求項10から17のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子。
- 前記Y’領域および前記Y’領域の少なくとも一方において、内部で二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成している、請求項10から18のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子。
- 請求項1から19のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子を含み、HMGB1タンパク質と前記HMGB1結合核酸分子との結合により、HMGB1タンパク質の機能を中和することを特徴とする中和剤。
- 請求項1から19のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子を含み、HMGB1タンパク質と前記HMGB1結合核酸分子との結合により、HMGB1タンパク質の機能を阻害することを特徴とする阻害剤。
- 請求項1から19のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子を含むことを特徴とする医薬品。
- 前記医薬品が、抗癌剤、抗炎症剤、抗脳卒中剤からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項22記載の医薬品。
- 請求項1から19のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子を含む、組成物。
- さらに、キャリアーを含む、請求項24記載の組成物。
- 請求項1から19のいずれか一項に記載のHMGB1結合核酸分子を含む、HMGB1タンパク質を検出するためのHMGB1検出試薬。
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