CN102625836A - Hmgb1结合核酸分子及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了能够与HMGB1蛋白质结合的核酸分子及其用途。与HMGB1蛋白质的解离常数为5×10^-7以下的核酸分子可以作为能够与HMGB1蛋白质结合的核酸分子使用。所述HMGB1结合核酸分子由于能够与已知为癌、炎症等疾病的原因的HMGB1蛋白质结合，因此通过在生物体内与HMGB1蛋白质结合，能够获得对上述疾病的预防效果和治疗效果。

Description

HMGB1结合核酸分子及其用途

技术领域

本发明涉及与HMGB1蛋白质结合的核酸分子及其用途。 

背景技术

高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1 protein)，即，HMGB1蛋白质(以下称为“HMGB1”)是生存所必需的蛋白质(非专利文献1)，在细胞核内作为形成转录开始所需的染色质结构的蛋白质起作用(非专利文献2)。HMGB1一旦渗漏、分泌到细胞外时，即作为促进炎症反应、细胞形态变化和细胞移动的细胞因子起作用(非专利文献3)。近年，细胞外的HMGB1的功能分析得到发展，明确了自身免疫疾病、败血症、创伤性休克、缺血和缺血再灌注损伤发生时，会使炎症反应恶化或者诱导细胞凋亡。由此显示出HMGB1成了治疗这些疾病的靶标物质和诊断标志物(非专利文献4)。另外，关于癌症，也报告了HMGB1与乳腺癌、大肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌和肺癌等的增殖和转移浸润有关，与正常组织相比，HMGB1表达量有所增加(非专利文献5)。基于这种背景，希望通过制造能与HMGB1结合的物质、中和其作用来预防和治疗上述疾病。但是，到目前为止，显示出有效性的仅仅只有利用了单克隆抗HMGB1抗体的诊断方法以及实验动物中的脑梗塞模型治疗(专利文献1、2、非专利文献6)。 

现有技术文献 

专利文献 

专利文献1：专利第3876325号公报 

专利文献2：特开2008-520552号公报 

非专利文献 

非专利文献1：Calogero，S.et al.Nat.Genet.(1999)22，276-280。 

非专利文献2：Bustin，M.Mol.Cell Biol.(1999)19，5237-5246。 

非专利文献3：Andersson，U.et al.J.Leukoc.Biol.(2002)72，1084-1091。 

非专利文献4：Klune，J.R.et al.Mol.Med.(2008)14，476-484。 

非专利文献5：Ellerman，J.E.et al.Clin.Cancer Res.(2007)13，2836-2848。 

非专利文献6：Liu，K.et al.FASEB J.(2007)21，3904-16。 

发明内容

本发明要解决的问题 

本发明目的在于，例如，提供能够与HMGB1结合的核酸分子，作为在阐明与HMGB1有关而引起的疾病的发病机理、上述疾病的诊断和治疗中能够利用的物质，以及提供其用途。 

用于解决技术问题的手段 

因此，本发明的发明人以市售的精制HMGB1为靶标物质，通过体外选择法制作RNA。本发明的HMGB1结合核酸分子是以与HMGB1蛋白质(以下称为HMGB1)的解离常数为5×10^-7以下为特征的能够与HMGB1结合的结合核酸分子。 

本发明的组合物是以包含本发明的HMGB1结合核酸分子为特征的组合物。 

本发明的检测试剂是以含有上述本发明的HMGB1结合核酸分子为特征的、用于检测上述HMGB1的HMGB1检测试剂。 

发明的效果 

本发明的HMGB1结合核酸分子能够与HMGB1结合。因此，通过本发明的HMGB1结合核酸分子，例如能够通过与HMGB1结合抑制其功能，由此预防和治疗由于HMGB1而引起的前述那样的疾病。另外，通过本发明的HMGB1结合核酸分子，例如能够通过确认有无与HMGB1的结合，来检测HMGB1，能够早期诊断疾病。另外，例如，通过使本发明的 HMGB1结合核酸分子在培养细胞内表达，能够进行基因转录抑制实验，使用本发明的HMGB1结合核酸分子，能够进行HMGB1与其受体的细胞外结合抑制实验等，本发明的HMGB1结合核酸分子也可以在对HMGB1的功能阐明中使用。因此，本发明的HMGB1结合核酸分子作为新的研究用工具也是有用的。 

附图说明

图1是示出本发明的实施例1中的各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图2是示出本发明的实施例1中、各RNA适体针对HMGB1的结合能力的图。 

图3是示出本发明的实施例1中、各RNA适体针对附加有His-标签的MIF蛋白质的结合能力的图。 

图4是示出本发明的实施例1中、生理条件下各RNA适体针对HMGB1的结合能力的图。 

图5是示出本发明的实施例2中、示出各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图6是示出本发明的实施例3中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图7是示出本发明的实施例4中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图8是示出本发明的实施例5中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图9是示出本发明的实施例6中、HMGB1与TLR-2的结合的Pull-down检验的照片。 

图10是示出本发明的实施例7中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图11是示出本发明中的RNA适体R8c6_1和R8c6_18的推定二级结构的图。 

图12是示出本发明的实施例9中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图13是示出本发明的实施例9中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图14是示出本发明的实施例10中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图15是示出本发明的实施例11中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图16是示出本发明的实施例12中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图17是示出本发明的实施例12中、各RNA适体针对附加有His-标签的HMGB1的结合能力的图。 

图18是示出本发明中的RNA适体R8c6_1的推定二级结构的图。 

图19是示出本发明中的RNA适体R8c6_1-18的推定二级结构的图。 

图20是示出本发明中的RNA适体R8c6_1-25-S6的推定二级结构的图。 

图21是示出本发明的实施例13中、HMGB1与RNA适体的相互作用的图。 

具体实施方式

<HMGB1结合核酸分子> 

本发明的HMGB1结合核酸分子如前所述，是以与HMGB1的解离常数为5×10^-7以下为特征的能够与HMGB1结合的核酸分子。本发明的HMGB1结合核酸分子也称作例如HMGB1适体(アプタマ一)。 

本发明中，“能够与HMGB1结合”是指例如具有针对HMGB1的结合能力，或者，也可称作具有针对HMGB1的结合活性(HMGB1结合活性)。本发明的HMGB1结合核酸分子例如与HMGB1特异性结合。所述HMGB1结合核酸分子与HMGB1的结合例如能够通过表面等离子体共振分析分子相互作用等来确定。上述分析例如可以使用Biacore X(商品名、 GE Healthcare UK Ltd.)。 

本发明的HMGB1结合核酸分子只要是与HMGB1的解离常数为5×10^-7以下即可，其他的结构没有限制。上述针对HMGB1的解离常数不特别限制，但是，其上限例如为10^-8数量级(order)，更优选的是10^-10数量级，更为优选的是10^-12数量级。另外，上述解离常数的范围例如是10^-14～10^-8数量级，优选的是10^-14～10^-10数量级，更为优选的是10^-14～10^-12数量级。 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如其结构单位不特别限制。上述结构单位例如是核苷酸残基，上述核苷酸残基例如可以是核糖核苷酸残基、脱氧核糖核苷酸残基。本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以是由核糖核苷酸残基构成的RNA，也可以是由脱氧核糖核苷酸残基构成的DNA，优选是RNA。本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以含有作为DNA的结构单位的脱氧核糖核苷酸和作为RNA的结构单位的核糖核苷酸两者。这种情况下，本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以是含有脱氧核糖核苷酸残基的RNA，也可以是含有核糖核苷酸残基的RNA。 

上述核苷酸残基例如可以是经修饰化的核苷酸残基。上述修饰化核苷酸残基例如有上述核苷酸残基的糖残基被修饰的核苷酸残基。上述糖残基例如可以是核糖残基或脱氧核糖残基。上述核苷酸残基中的修饰位点不特别限制，例如可以是上述糖残基的2’位和/或4’位。上述修饰例如可以是甲基化、氟化、氨基化、硫化等。上述修饰化核苷酸残基例如可以是具有嘧啶碱基(嘧啶核)作为碱基的核苷酸残基被修饰的核苷酸残基，或者具有嘌呤碱基(嘌呤核)作为碱基的核苷酸残基被修饰的核苷酸残基，优选的是前者。以下，将具有嘧啶碱基的核苷酸残基称为嘧啶核苷酸残基，将经修饰的嘧啶核苷酸残基称为修饰化嘧啶核苷酸残基，将具有嘌呤碱基的核苷酸残基称为嘌呤核苷酸残基，将经修饰的嘌呤核苷酸残基称为修饰化嘌呤核苷酸残基。上述嘧啶核苷酸残基例如有具有尿嘧啶的尿嘧啶核苷酸残基、具有胞嘧啶的胞嘧啶核苷酸残基、具有胸腺嘧啶的胸腺嘧啶核苷酸残基等。上述修饰化核苷酸残基中，在碱基为嘧啶碱基的情况下，例如， 上述糖残基的2’位和/或4’位被修饰是优选的。作为上述修饰化核苷酸残基的具体例子，例如有核糖残基的2’位被修饰的2’-甲基尿嘧啶(2’-甲基化-尿嘧啶核苷酸残基)、2’-甲基胞嘧啶(2’-甲基化-胞嘧啶核苷酸残基)、2’-氟尿嘧啶(2’-氟化-尿嘧啶核苷酸残基)、2’-氟胞嘧啶(2’-氟化-胞嘧啶核苷酸残基)、2’-氨基尿嘧啶(2’-氨基化尿嘧啶-核苷酸残基)、2’-氨基胞嘧啶(2’-氨基化-胞嘧啶核苷酸残基)、2’-硫尿嘧啶(2’-硫化-尿嘧啶核苷酸残基)、2’-硫胞嘧啶(2’-硫化-胞嘧啶核苷酸残基)等。 

作为本发明的HMGB1结合核酸分子的上述结构单位，例如有PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、ENA(2’-O，4’-C-乙烯桥接核酸，2’-O，4’-C-Ethylenebridged Nucleic Acids)等单体残基。本发明的HMGB1结合核酸分子例如包括：含有PNA、LNA和ENA中的至少任何的单体残基的RNA或DNA。本发明的HMGB1结合核酸分子在含有上述单体残基的情况下，其数量不特别限制。 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以是单链核酸，也可以是双链核酸。上述单链核酸例如可以是单链RNA和单链DNA。上述双链核酸例如可以是双链RNA、双链DNA、以及RNA和DNA的双链核酸。在本发明的HMGB1结合核酸分子为双链核酸的情况下，例如在使用之前，可以预先通过变性等形成单链。 

本发明的HMGB1结合核酸分子中，各碱基例如可以是腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)的天然碱基(非人工核酸)，也可以是人工碱基(非天然碱基)。上述人工碱基例如可以是修饰碱基和改变的碱基等，优选与上述天然碱基(a、c、g、t或u)具有相同的功能。上述具有相同的功能的人工碱基例如可以为能够替代鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)结合的人工碱基、能够替代胞嘧啶(c)与鸟嘌呤(g)结合的人工碱基、能够替代腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)结合的人工碱基、能够替代胸腺嘧啶(t)与腺嘌呤(a)结合的人工碱基、能够替代尿嘧啶(u)与腺嘌呤(a)结合的人工碱基等。上述修饰碱基例如可以是甲基化碱基、氟化碱基、氨基化碱基、硫化碱基等。 作为上述修饰碱基的具体例子，例如有2’-甲基尿嘧啶、2’-甲基胞嘧啶、2’-氟尿嘧啶、2’-氟胞嘧啶、2’-氨基尿嘧啶、2’-氨基胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、2-硫胞嘧啶等。本发明中，例如，a、g、c、t和u所表示的碱基除上述天然碱基之外，还含有与上述各天然碱基具有相同功能的上述人工碱基的意思。 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如优选地对核酸酶耐受。上述核酸酶不特别限制，例如有核酸外切酶、核酸内切酶等，作为具体例子，例如有作为RNA分解酶的核糖核酸酶(RNase)、作为DNA分解酶的脱氧核糖核酸酶(DNase)、与RNA和DNA两者作用的核酸酶等。本发明的HMGB1结合核酸分子如前所述优选为RNA。在本发明的HMGB1结合核酸分子为RNA的情况下，例如优选地，对RNA分解酶、即RNase耐受。使之对上述核酸酶耐受的方法不特别限制，例如有对构成上述核酸分子的核苷酸残基进行修饰的方法。具体来说，关于本发明的HMGB1结合核酸分子，例如优选构成上述核酸分子的核苷酸残基或者部分核苷酸残基是修饰化核苷酸残基。上述修饰化核苷酸例如可以是上述修饰化核苷酸残基。上述修饰化核苷酸残基例如可以是上述甲基化核苷酸残基、上述氟化核苷酸残基、上述氨基化核苷酸残基、上述硫化核苷酸残基等，其中优选上述氟化核苷酸残基。上述修饰化核苷酸残基例如为具有嘧啶碱基作为碱基的上述嘧啶核苷酸残基，优选上述糖残基(核糖残基或脱氧核糖残基)被修饰。 

使之对上述核酸酶耐受的方法，除此之外，例如可以是使构成上述核酸分子的核苷酸残基LNA化的方法。具体来说，关于本发明的HMGB1结合核酸分子而言，例如，优选地，构成上述核酸分子的全部核苷酸残基或者部分核苷酸残基为上述LNA残基。使之耐受上述核酸酶的方法，除此之外，例如可以为使构成作为上述核酸分子的RNA的核苷酸残基DNA化的方法。具体而言，在本发明的HMGB1结合核酸分子为RNA的情况下，例如可以是，构成RNA的全部核苷酸残基中，具有尿嘧啶的核苷酸残基的全部或者部分被取代成具有胸腺嘧啶的核苷酸残基，具体而言，可 以取代成具有上述胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸残基。另外，在上述核酸分子为RNA的情况下，构成RNA的全部核苷酸残基或者部分核苷酸残基可以是脱氧核糖核苷酸残基和上述LNA残基。 

使之对上述核酸酶耐受的方法，除此之外，例如有在5’末端和/或3’末端结合聚乙二醇(PEG)或者脱氧胸苷的方法。上述PEG例如可以是几十kDa。 

本发明的HMGB1结合核酸分子的长度不特别限制，其全长例如是20～160个碱基长，优选30～120个碱基长，更优选的是40～100个碱基长。 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以是下述(A1)、(A2)、(B1)和(B2)中的任何的核酸分子。 

(A1)含有序列编号1～42中的任何所表示的碱基序列的核酸分子 

(A2)核酸分子，其含有序列编号1～42中的任何所表示的碱基序列中取代、缺失、添加或插入了一个或者多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1结合 

(B1)含有序列编号45～81中的任何所表示的碱基序列的核酸分子 

(B2)核酸分子，其含有序列编号45～81中的任何所表示的碱基序列中取代、缺失、添加或插入了一个或多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1结合 

下面说明上述(A1)的核酸分子。以下，将上述(A1)的核酸分子称作HMGB1结合核酸分子(A1)。另外，在上述HMGB1结合核酸分子(A1)中，将序列编号1～42所表示的碱基序列也称作碱基序列(A1)。含有上述序列编号1～42所表示的碱基序列(A1)和上述碱基序列(A1)的HMGB1结合核酸分子(A1)分别如下所示，有时也分别用序列编号之前示出的名称表示。 

(A1)含有序列编号1～42中的任何所表示的碱基序列的核酸分子 

C_0(序列编号1) 

mmhbuaagmcacguagmaccag 

C_1(序列编号2) 

accguaagacacguagaaccag 

C_2(序列编号3) 

aauuuaagccacguagaaccag 

C_3(序列编号4) 

acaguaagacacguagcaccag 

C_4(序列编号5) 

cauguaagccacguagaaccag 

#04(序列编号6) 

ucccaugauuguucaggcacggccuuucgguucccucaau 

#08(序列编号7) 

agucccuugacacguccguuuucuaacuggaauagaggcc 

#12(序列编号8) 

gggcugcaccucuccgcuacguugucguuggaggcaccau 

#43(序列编号9) 

gguauuaaaacucccucguaggucauccgcccggccuagc 

#49(序列编号10) 

cauccuuaucacauggucauccgcccggccaugcaauguu 

#32(序列编号11) 

cauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggcccgcau 

#58(序列编号12) 

cauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggccgcgcucgccaguca 

#01(序列编号13) 

uggcauccuugcucacuccaggcuaaaccucucgguuccc 

#26(序列编号14) 

ccaagcacuucaucgucuaggcaauugccucucgguaccc 

#73(序列编号15) 

ccacaagcucgcacuaguuccaggcuuccucucgguaccc 

#77(序列编号16) 

cauguauuucugcacguuccagagaauccucucgguaccc 

#06(序列编号17) 

uacacugcacgcuccgcuuugaacaucaauggaggcccug 

#22(序列编号18) 

gcgcucgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacu 

#10(序列编号19) 

uagucaaggugaaaacccccauagagacu 

#21(序列编号20) 

ggccugugcuaacaugagucauccguccggcucgcaacuc 

#36(序列编号21) 

ccuagcacguccguuucuggaucugucaguuagaggccua 

#15(序列编号22) 

gcaucaaccucuguaagagcgcgcuuugcuucaccaaaaa 

#23(序列编号23) 

acgguccuuaaaaucuuccuuaaccacgcccaggaucuua 

#34(序列编号24) 

auucaccucagcauguccgcuugugacgauggaggcaccu 

#40(序列编号25) 

gguccuuaaaaucuuccaaucuaaacgauccagacacggc 

#47(序列编号26) 

aaaaacuacugccgaaccguaagacacguagaaccaggca 

#79(序列编号27) 

gaccagguuccugacaucucugaacuauaccuccaaaacg 

#80(序列编号28) 

caucugaauuuaagccacguagaaccaggcccuccacgcg 

#82(序列编号29) 

uaauacgacucacuauagggacgcucacguacgcucagug 

R4_1(序列编号30) 

aaugagggcccacuuccggaucuuugguuugcuuccuugc 

R4_4(序列编号31) 

ucgcuuauggaugcccacuuccacucacuguccugcgcaa 

R4_10(序列编号32) 

uauuaauaccucagcccucuucucuuagucuggugccgau 

R4_11(序列编号33) 

ucucuuuucgaauuccguucuggcucacuccuuggguauu 

R4_12(序列编号34) 

cugacaucuuuuacacugauuucuguuggcccacuucugu 

R8c6_1(序列编号35) 

gaguacaguaagacacguagcaccagucugacguuugucg 

R8c6_14(序列编号36) 

ugccaucaccauguaagccacguagaaccagcacuacuag 

R8c9_1(序列编号37) 

ugagucuuauagccguccguuuacguuugucuagaggcca 

R8c9_6(序列编号38) 

gcuucuugcauuguccgcuuaguuucuauggaggcauagu 

R8c9_10(序列编号39) 

ccgaauauuuuugcaccguccgauugccaugcauugaggc 

HMGB1R4_9068(序列编号40) 

ugauauuuaaauuuggccgcguuuaaaacauccccuacga 

HMGB1R4_2478(序列编号41) 

gauuccguugcccuuccguugaacugugccaggcuuuuug 

HMGB1R4_5108(序列编号42) 

accuuugccgcaucucacccacgucuugucaggccguuuc 

上述序列编号1中，“m”为腺嘌呤或胞嘧啶，“h”为腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，“b”为鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。上述序列编号1所表示的碱基序列例如可以是上述序列编号2～5所表示的碱基序列。上述序列编号1～42和后述的序列编号45～81所表示的碱基序 列中，尿嘧啶(u)也可以是胸腺嘧啶(t)。这些碱基序列中，例如一个或两个以上的尿嘧啶也可以是胸腺嘧啶，另外，全部尿嘧啶也可以是胸腺嘧啶。这样，由含有胸腺嘧啶的碱基序列构成的核酸分子或含有上述碱基序列的核酸分子，例如可以例示为后述的(A2)的核酸分子。 

上述HMGB1结合核酸分子(A1)可以是由上述序列编号1～42中的任何的序列编号所表示的碱基序列(A1)构成的核酸分子，也可以是含有上述碱基序列(A1)的核酸分子。 

在上述HMGB1结合核酸分子(A1)含有上述碱基序列(A1)的情况下，例如以上述碱基序列(A1)为X区域，还可以具有Y区域和/或Y’区域。上述X区域、上述Y区域和上述Y’区域例如如下文所述。上述Y区域不特别限制，例如可以是由含有序列编号43或115所表示的碱基序列的序列和由上述碱基序列构成的序列。另外，上述Y’区域不特别限制，例如可以是由含有序列编号44所表示的碱基序列的序列和由上述碱基序列构成的序列。此外，这些序列仅是例子，并不限制本发明。 

gggacgcucacguacgcuca(序列编号43) 

acgcucacguacgcuca(序列编号115) 

ucagugccuggacgugcagu(序列编号44) 

在上述HMGB1结合核酸分子(A1)含有上述Y区域的情况下，上述Y区域例如优选结合在上述碱基序列(A1)的5’侧。在上述HMGB1结合核酸分子(A1)含有上述Y’区域的情况下，上述Y’区域例如优选结合在上述碱基序列(A1)的3’侧。上述碱基序列(A1)、上述Y区域以及上述Y’区域例如可以是直接结合，也可以经由介入序列(介在配列)结合。 

上述HMGB1结合核酸分子(A1)在含有上述序列编号1～42中的任何的碱基序列(A1)的情况下，例如可以例示为由序列编号45～81中的任何所表示的碱基序列构成的核酸分子或含有上述碱基序列的核酸分子。以下所示的序列编号45～81的碱基序列分别含有上述序列编号6～42的碱基序列(A1)，划线部分所表示的区域分别相当于上述序列编号6～42的碱 基序列。上述序列编号45～81的碱基序列和含有上述碱基序列的上述HMGB1结合核酸分子(A1)分别如下所示，有时也用序列编号之前示出的名称表示。 

#04(序列编号45) 

gggacgcucacguacgcucaucccaugauuguucaggcacggccuuucgguucccucaauucagu 

gccuggacgugcagu 

#08(序列编号46) 

gggacgcucacguacgcucaagucccuugacacguccguuuucuaacuggaauagaggccucagu 

gccuggacgugcagu 

#12(序列编号47) 

gggacgcucacguacgcucagggcugcaccucuccgcuacguugucguuggaggcaccauucagu 

gccuggacgugcagu 

#43(序列编号48) 

gggacgcucacguacgcucagguauuaaaacucccucguaggucauccgcccggccuagcucagu 

gccuggacgugcagu 

#49(序列编号49) 

gggacgcucacguacgcucacauccuuaucacauggucauccgcccggccaugcaauguuucagu 

gccuggacgugcagu 

#32(序列编号50) 

gggacgcucacguacgcucacauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggcccgcauucagug 

ccuggacgugcagu 

#58(序列编号51) 

gggacgcucacguacgcucacauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggccgcgcucgccag

ucaucagugccuggacgugcagu 

#01(序列编号52) 

gggacgcucacguacgcucauggcauccuugcucacuccaggcuaaaccucucgguucccucagu 

gccuggacgugcagu 

#26(序列编号53) 

gggacgcucacguacgcucaccaagcacuucaucgucuaggcaauugccucucgguacccucagug 

ccuggacgugcagu 

#73(序列编号54) 

gggacgcucacguacgcucaccacaagcucgcacuaguuccaggcuuccucucgguacccucagug 

ccuggacgugcagu 

#77(序列编号55) 

gggacgcucacguacgcucacauguauuucugcacguuccagagaauccucucgguacccucagu 

gccuggacgugcagu 

#06(序列编号56) 

gggacgcucacguacgcucauacacugcacgcuccgcuuugaacaucaauggaggcccugucagu 

gccuggacgugcagu 

#22(序列编号57) 

gggacgcucacguacgcucagcgcucgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacuucagug 

ccuggacgugcagu 

#10(序列编号58) 

gggacgcucacguacgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacuucagugccuggacgugc 

agu 

#21(序列编号59) 

gggacgcucacguacgcucaggccugugcuaacaugagucauccguccggcucgcaacucucagu 

gccuggacgugcagu 

#36(序列编号60) 

gggacgcucacguacgcucaccuagcacguccguuucuggaucugucaguuagaggccuaucagu 

gccuggacgugcagu 

#15(序列编号61) 

gggacgcucacguacgcucagcaucaaccucuguaagagcgcgcuuugcuucaccaaaaaucagug 

ccuggacgugcagu 

#23(序列编号62) 

gggacgcucacguacgcucaacgguccuuaaaaucuuccuuaaccacgcccaggaucuuaucagug 

ccuggacgugcagu 

#34(序列编号63) 

gggacgcucacguacgcucaauucaccucagcauguccgcuugugacgauggaggcaccuucagu 

gccuggacgugcagu 

#40(序列编号64) 

gggacgcucacguacgcucagguccuuaaaaucuuccaaucuaaacgauccagacacggcucagug 

ccuggacgugcagu 

#47(序列编号65) 

gggacgcucacguacgcucaaaaaacuacugccgaaccguaagacacguagaaccaggcaucagug 

ccuggacgugcagu 

#79(序列编号66) 

gggacgcucacguacgcucagaccagguuccugacaucucugaacuauaccuccaaaacgucagug 

ccuggacgugcagu 

#80(序列编号67) 

gggacgcucacguacgcucacaucugaauuuaagccacguagaaccaggcccuccacgcgucagug 

ccuggacgugcagu 

#82(序列编号68) 

gggacgcucacguacgcucauaauacgacucacuauagggacgcucacguacgcucagugccugga 

cgugcagu 

R4_1(序列编号69) 

gggacgcucacguacgcucaaaugagggcccacuuccggaucuuugguuugcuuccuugcucagu 

gccuggacgugcagu 

R4_4(序列编号70) 

gggacgcucacguacgcucaucgcuuauggaugcccacuuccacucacuguccugcgcaaucagu 

gccuggacgugcagu 

R4_10(序列编号71) 

gggacgcucacguacgcucauauuaauaccucagcccucuucucuuagucuggugccgauucagu 

gccuggacgugcagu 

R4_11(序列编号72) 

gggacgcucacguacgcucaucucuuuucgaauuccguucuggcucacuccuuggguauuucagu 

gccuggacgugcagu 

R4_12(序列编号73) 

gggacgcucacguacgcucacugacaucuuuuacacugauuucuguuggcccacuucuguucagu 

gccuggacgugcagu 

R8c6_1(序列编号74) 

gggacgcucacguacgcucagaguacaguaagacacguagcaccagucugacguuugucgucagu 

gccuggacgugcagu 

R8c6_14(序列编号75) 

gggacgcucacguacgcucaugccaucaccauguaagccacguagaaccagcacuacuagucagug 

ccuggacgugcagu 

R8c9_1(序列编号76) 

gggacgcucacguacgcucaugagucuuauagccguccguuuacguuugucuagaggccaucagu 

gccuggacgugcagu 

R8c9_6(序列编号77) 

gggacgcucacguacgcucagcuucuugcauuguccgcuuaguuucuauggaggcauaguucag 

ugccuggacgugcagu 

R8c9_10(序列编号78) 

gggacgcucacguacgcucaccgaauauuuuugcaccguccgauugccaugcauugaggcucagu 

gccuggacgugcagu 

HMGB1R4_9068(序列编号79) 

gggacgcucacguacgcucaugauauuuaaauuuggccgcguuuaaaacauccccuacgaucagu 

gccuggacgugcagu 

HMGB1R4_2478(序列编号80) 

gggacgcucacguacgcucagauuccguugcccuuccguugaacugugccaggcuuuuugucagu 

gccuggacgugcagu 

HMGB1R4_5108(序列编号81) 

gggacgcucacguacgcucaaccuuugccgcaucucacccacgucuugucaggccguuucucagu 

gccuggacgugcagu 

上述HMGB1结合核酸分子(A1)，例如是由上述序列编号45～81中 任何的碱基序列(A1)中从5’侧第4个碱基到3’侧的末端碱基的碱基序列构成的核酸分子或含有上述碱基序列的核酸分子。即，上述HMGB1结合核酸分子(A1)例如可以缺失上述序列编号45～81中的任何的碱基序列(A1)中的5’末端的ggg。 

上述碱基序列(A1)例如可以含有序列编号114所表示的基元序列。下述碱基序列中，n为腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、尿嘧啶(u)、胸腺嘧啶(t)，优选第5碱基的n为腺嘌呤(a)，第13碱基的n为胞嘧啶(c)，第17碱基的n为腺嘌呤(a)。含有上述基元序列的碱基序列(A1)例如可以是#47(序列编号65)、#80(序列编号67)、R8c6_1(序列编号74)、R8c6_14(序列编号75)。 

基元序列(序列编号114) 

uaagncacguagnaccng 

在上述HMGB1结合核酸分子(A1)中，各碱基例如与上述相同。即，上述碱基例如可以是腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)的上述天然碱基(非人工碱基)，也可以是上述人工碱基(非天然碱基)。上述人工碱基例如可以如前所述。上述HMGB1结合核酸分子(A1)中，例如a、g、c、t和u所表示的碱基除上述天然碱基之外，还含有与上述各天然碱基具有相同的功能的上述人工碱基的意思。 

上述HMGB1结合核酸分子(A1)例如其结构单位不特别限制，与前述相同。即，上述结构单位例如可以是核苷酸残基，上述核苷酸残基例如可以是核糖核苷酸残基、脱氧核糖核苷酸残基。上述HMGB1结合核酸分子(A1)例如可以是由核糖核苷酸残基构成的RNA，也可以是由脱氧核糖核苷酸残基构成的DNA，优选的是RNA。另外，上述HMGB1结合核酸分子(A1)可以含有作为DNA结构单位的脱氧核糖核苷酸和作为RNA结构单位的核糖核苷酸两者。上述序列编号1～42和序列编号45～81的碱基序列例如只要上述各个碱基连续的序列即可，可以是由核糖核苷酸残基构成的RNA，也可以是由脱氧核糖核苷酸残基构成的DNA，可以是含有脱氧核糖核苷酸残基的RNA，也可以是含有核糖核苷酸残基的RNA。 

上述HMGB1结合核酸分子(A1)与前述同样地，上述结构单位例如可以为PNA、LNA、ENA等单体残基。上述HMGB1结合核酸分子(A1)例如可以为含有PNA、LNA和ENA中至少一种单体残基的RNA或DNA。上述HMGB1结合核酸分子(A1)在含有上述单体残基的情况下，其数量不特别限制。 

上述HMGB1结合核酸分子(A1)例如如前所述，优选地，对核酸酶耐受。使之对上述核酸酶耐受的方法不特别限制，与前述相同。上述HMGB1结合核酸分子(A1)如前所述，优选是RNA。在上述HMGB1结合核酸分子(A1)为RNA的情况下，例如优选对RNA分解酶耐受。使之对RNA分解酶耐受的方法不特别限制，与前述相同。 

在上述HMGB1结合核酸分子(A1)为RNA的情况下，例如，与前述同样，优选地，构成RNA的全部核苷酸残基或者部分核苷酸残基为上述修饰化核苷酸残基。上述修饰化核苷酸残基例如可以是前文所述的修饰化核苷酸残基。另外，在上述HMGB1结合核酸分子(A1)为RNA的情况下，例如与前述同样，优选地，构成RNA的全部核苷酸残基或部分核苷酸残基为上述脱氧核糖核苷酸残基和/或上述LNA残基。另外，在上述HMGB1结合核酸分子(A1)为RNA的情况下，与前述同样地，例如，构成RNA的核苷酸残基中，具有尿嘧啶的核苷酸残基的全部或者部分可以取代为具有胸腺嘧啶的核苷酸残基，具体而言，可以取代为具有上述胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸残基。另外，在上述HMGB1结合核酸分子(A1)为RNA的情况下，例如与前述同样地，优选在其5’末端和/或3’末端具有上述PEG或上述脱氧胸苷。如此由取代为胸腺嘧啶的碱基序列构成的核酸分子或含有上述碱基序列的核酸分子例如可以例示为后述的(A2)的核酸分子。 

上述HMGB1结合核酸分子(A1)的长度不特别限制，其全长例如为20～160个碱基长，优选30～120个碱基长，更优选40～100个碱基长。 

接着说明上述(A2)的核酸分子。以下，将上述(A2)的核酸分子称作HMGB1结合核酸分子(A2)。 

(A2)核酸分子，其含有序列编号1～42中的任何所表示的碱基序列 中、取代、缺失、添加或插入了一个或多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1结合 

上述HMGB1结合核酸分子(A2)可以是含有上述被取代等的碱基序列的核酸分子，也可以是由上述被取代等的上述碱基序列构成的核酸分子。上述HMGB1结合核酸分子(A2)中，也将上述被取代等的碱基序列称为碱基序列(A2)。 

“一个或多个”的意思不特别限制。“一个或多个”为上述序列编号1～42中的任何的碱基序列中的，例如1～5个，优选1～4个，更优选1～3个，进一步优选1个或2个，尤其优选1个。另外，“一个或多个”为上述HMGB1结合核酸分子(A1)的全长序列中的、例如1～5个，优选1～4个，更优选1～3个，进一步优选1个或2个，尤其优选1个。上述取代、添加或者插入中使用的碱基不特别限制，例如可以是上述天然碱基，也可以是上述人工碱基。上述碱基的取代、添加或插入例如可以使用上述核苷酸残基，也可以使用上述单体残基。 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以是下述(A3)的核酸分子。以下，将上述(A3)的核酸分子称作HMGB1结合核酸分子(A3)。 

(A3)核酸分子，其包含与序列编号1～42中的任何所表示的碱基序列具有60％以上同源性的碱基序列，并且能够与HMGB1结合 

上述HMGB1结合核酸分子(A3)可以是含有具有上述同源性的碱基序列的核酸分子，也可以是由具有上述同源性的碱基序列构成的核酸分子。在上述HMGB1结合核酸分子(A3)中，也将具有上述同源性的碱基序列称为碱基序列(A3)。 

上述同源性例如为70％以上，优选80％以上，更优选的是90％以上，进一步优选95％以上，特别优选的是99％以上。上述HMGB1结合核酸分子(A3)例如可以是，含有与上述HMGB1结合核酸分子(A1)的全长序列具有60％以上的同源性的碱基序列，并且能够与HMGB1结合的核酸分子。这种情况下，上述同源性例如是70％以上，优选的是80％以上，更优选的是90％以上，进一步优选的是95％以上，尤其优选的是99％以上。上述同源性例如可以通过使用BLAST等在默认条件下计算而计算得出。 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以是下述(A4)的核酸分子。以下，将上述(A4)的核酸分子称作HMGB1结合核酸分子(A4)。 

(A4)核酸分子，其含有与序列编号1～42中的任何所表示的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列或者与上述碱基序列互补的碱基序列，并且能够与HMGB1结合 

上述HMGB1结合核酸分子(A4)可以是由上述杂交的碱基序列构成的核酸分子，也可以是含有上述碱基序列的核酸分子。另外，上述HMGB1结合核酸分子(A4)可以是由上述互补碱基序列构成的核酸分子，也可以是含有上述互补碱基序列的核酸分子。在上述HMGB1结合核酸分子(A4)中，上述杂交的碱基序列和上述互补碱基序列也称为碱基序列(A4)。 

上述HMGB1结合核酸分子(A4)中，“在严谨条件下杂交”是指，例如在该技术领域的技术人员中公知的杂交实验条件。具体而言，“严谨条件”是指，例如，在0.7～1mol/L的NaCl存在下，于60～68℃进行杂交之后，使用0.1～2倍的SSC溶液，于65～68℃洗涤，由此能够鉴定的条件。1×SSC是指包括150mmol/L的NaCl、15mmol/L柠檬酸钠。另外，上述HMGB1结合核酸分子(A4)例如是下述核酸分子，其含有与上述HMGB1结合核酸分子(A1)的全长碱基在严谨条件下杂交的碱基序列、并且能够与HMGB1结合。 

除非另有指明，上述HMGB1结合核酸分子(A2)～(A4)中，例如碱基、结构单位、长度、核酸酶耐受性的赋予等，与上述HMGB1结合核酸分子(A1)相同。 

接着说明上述(B1)的核酸分子。以下，将上述(B1)的核酸分子称作HMGB1结合核酸分子(B1)。上述HMGB1结合核酸分子(B1)中，也将序列编号45～81所表示的碱基序列称为碱基序列(B1)。 

(B1)含有序列编号45～81中的任何所表示的碱基序列的核酸分子 

序列编号45～81所表示的碱基序列如前所述。含有序列编号45～81所表示的碱基序列的HMGB1结合核酸分子(B1)有时也分别用前述的序列编号之前示出的名称表示。上述HMGB1结合核酸分子(B1)例如可以是 由序列编号45～81中的任何的序列编号表示的碱基序列(B1)构成的核酸分子，也可以是含有上述碱基序列(B1)的核酸分子。 

上述HMGB1结合核酸分子(B1)例如可以是由上述序列编号45～81中的某个碱基序列(B1)中从5’侧第个4碱基3’侧的末端碱基的碱基序列构成的核酸分子或者含有上述碱基序列的核酸分子。即，上述HMGB1结合核酸分子(B1)例如在上述序列编号45～81中的某个碱基序列(A1)中，缺失5’末端的ggg。 

上述碱基序列(B1)例如可以含有序列编号114所示的基元序列。下述碱基序列中，n为腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、尿嘧啶(u)、胸腺嘧啶(t)，优选地，第5个碱基的n为腺嘌呤(a)、第13碱基的n为胞嘧啶(c)、第17个碱基的n为腺嘌呤(a)。含有上述基元序列的碱基序列(B1)例如可以是#47(序列编号65)、#80(序列编号67)、R8c6_1(序列编号74)、R8c6_14(序列编号75)。 

基元序列(序列编号114) 

uaagncacguagnaccng 

上述R8c6_1(序列编号74)的推定二级结构示于图11。该图中，圆圈围住的碱基相当于上述基元序列。图11的上述推定二级结构中，对应于上述基元序列中的“n”的碱基省略了圆圈。 

上述HMGB1结合核酸分子(B1)中，各碱基例如与上述相同。即，上述碱基例如可以是腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)的上述天然碱基(非人工碱基)，也可以是上述人工碱基(非天然碱基)。上述人工碱基例如如前所述。上述HMGB1结合核酸分子(B1)中，例如a、g、c、t和u所示的碱基除了上述天然碱基之外，还含有与上述各天然碱基具有相同的功能的上述人工碱基的意思。 

上述HMGB1结合核酸分子(B1)例如其结构单位不特别限制，与前述相同。即，上述结构单位例如是核苷酸残基，上述核苷酸残基例如可以是核糖核苷酸残基、脱氧核糖核苷酸残基。上述HMGB1结合核酸分子(A1)例如可以是由核糖核苷酸残基构成的RNA，也可以是由脱氧核糖核苷酸残基构成的DNA，优选的是RNA。另外，上述HMGB1结合核酸 分子(A1)可以含有作为DNA的结构单位的脱氧核糖核苷酸和作为RNA的结构单位的核糖核苷酸两者。上述序列编号45～81的碱基序列例如分别只要是上述那样的碱基连续的序列即可，可以是由核糖核苷酸残基构成的RNA，也可以是由脱氧核糖核苷酸残基构成的DNA，可以是含有脱氧核糖核苷酸残基的RNA，也可以是含有核糖核苷酸残基的RNA。 

上述HMGB1结合核酸分子(B1)与前述同样地，上述结构单位例如可以为PNA、LNA、ENA等单体残基。上述HMGB1结合核酸分子(B1)例如可以是含有PNA、LNA和ENA中的至少一种单体残基的RNA或者DNA。在上述HMGB1结合核酸分子(B1)含有上述单体残基的情况下，其数量不特别限制。 

上述HMGB1结合核酸分子(B1)例如，如前所述，优选地，对核酸酶耐受。使之对上述核酸酶耐受的方法不特别限制，与前述相同。上述HMGB1结合核酸分子(B1)如前所述，优选地是RNA。在上述HMGB1结合核酸分子(B1)为RNA的情况下，例如优选对RNA分解酶耐受。使之对RNA分解酶耐受的方法不特别限制，与前述相同。 

在上述HMGB1结合核酸分子(B1)为RNA的情况下，例如与前述同样，优选地，构成RNA的全部核苷酸残基或部分核苷酸残基为上述修饰化核苷酸残基。上述修饰化核苷酸残基例如可以是前文所述的修饰化核苷酸残基。另外，在上述HMGB1结合核酸分子(B1)为RNA的情况下，例如与前述同样，优选地，构成RNA的全部核苷酸残基或部分核苷酸残基为上述脱氧核糖核苷酸残基和/或上述LNA残基。另外，在上述HMGB1结合核酸分子(B1)为RNA的情况下，与前述同样地，例如，构成RNA的核苷酸残基中，具有尿嘧啶的核苷酸残基的全部或者部分可以取代为具有胸腺嘧啶的核苷酸残基，具体而言，可以取代为具有上述胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸残基。另外，在上述HMGB1结合核酸分子(B1)为RNA的情况下，例如与前述同样地，优选在其5’末端和/或3’末端上具有上述PEG或者上述脱氧胸苷。由如此取代为胸腺嘧啶的碱基序列构成的核酸分子或含有上述碱基序列的核酸分子例如可以例示为下文所述的(B2)的核酸分子。 

上述HMGB1结合核酸分子(B1)的长度不特别限制，其全长例如是20～160个碱基长，优选的是30～120个碱基长，更优选的是40～100个碱基长。 

其中，上述HMGB1结合核酸分子(B1)优选下述(b1)的核酸分子。以下，将上述(b1)的核酸分子也称为HMGB1结合核酸分子(b1)。上述HMGB1核酸分子(b1)例如可以是由序列编号74的碱基序列构成的核酸分子，也可以是含有上述碱基序列的核酸分子。 

(b1)含有序列编号74所示的碱基序列的核酸分子 

接着说明上述(B2)的核酸分子。以下，将上述(B2)的核酸分子称为HMGB1结合核酸分子(B2)。 

(B2)核酸分子，其含有序列编号45～81中的任何所示的碱基序列中、取代、缺失、添加或插入了一个或多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1结合 

上述HMGB1结合核酸分子(B2)可以是含有上述被取代等的碱基序列的核酸分子，也可以是由上述被取代等的上述碱基序列构成的核酸分子。上述HMGB1结合核酸分子(B)中，也将上述被取代等的碱基序列称为碱基序列(B2)。 

“一个或多个”不特别限制，只要上述HMGB1结合核酸分子(B2)能够与HMGB1结合即可。上述被取代的碱基数量，在序列编号45～81中的任何的碱基序列中，例如为1～5个，优选1～4个，更优选1～3个，进一步优选1个或2个，特别优选1个。上述添加或插入的碱基的数量，在序列编号45～81中的任何的碱基序列中，例如为1～5个，优选1～4个，更优选1～3个，进一步优选1个或2个，尤其优选一个。上述缺失的碱基的数量不特别限制，例如在序列编号45～81中的某个碱基序列中为1～46个、1～43个、1～21个、～1～18个、1～4个、1～3个、2个或者1个。 

上述HMGB1结合核酸分子(B2)的长度不特别限制，其全长例如为20～160个碱基长，优选的是30～120个碱基长，更优选的是40～100个碱基长。 

上述HMGB1结合核酸分子(B2)中，例如，含有序列编号45～81中 的任何所示的碱基序列中缺失了一个或多个的碱基的碱基序列、并且能够与HMGB1结合的核酸分子，也可以被称为将上述HMGB1结合核酸分子(B1)小型化的核酸分子。上述小型化的核酸分子也称为小型化HMGB1结合核酸分子(B2)。上述小型化HMGB1结合核酸分子如上述(B2)所示，可以是下述核酸分子，其含有序列编号45～81中的任何所示的碱基序列中不仅缺失一个或多个碱基，例如还取代、添加或插入了一个或多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1结合。 

上述小型化HMGB1结合核酸分子(B2)如前所述，可以是含有上述缺失了的碱基序列的核酸分子，也可以是由上述缺失了的上述碱基序列构成的核酸分子。上述小型化HMGB1结合核酸分子(B2)中，也将上述缺失了的碱基序列称为小型化碱基序列。上述缺失了的碱基的数量不特别限制，例如如前所述。 

上述小型化HMGB1结合核酸分子(B2)例如可以是含有序列编号45～81的碱基序列中从5’侧的第4个碱基到3’侧的末端碱基的碱基序列构成的核酸分子或含有上述碱基序列的核酸分子。即，上述小型化HMGB1结合核酸分子(B2)例如可以是由序列编号45～81中的任何的碱基序列(B1)中、缺失了5’末端的ggg的碱基序列构成的核酸分子或者含有上述碱基序列的核酸分子。 

上述小型化HMGB1结合核酸分子(B2)的长度不特别限制，其全长例如为20～160个碱基长，优选的是30～120个碱基长，更优选的是40～100个碱基长。 

作为上述小型化HMGB1结合核酸分子(B2)，例如优选地含有序列编号74所示的碱基序列中缺失了一个或多个碱基的碱基序列并且能够与HMGB1结合的核酸分子，具体而言，优选下述(b2)的核酸分子。以下，将上述(b2)的核酸分子也称为小型化HMGB1结合核酸分子(b2)。 

(b2)核酸分子，其含有序列编号74所示的碱基序列中连续11个碱基以上的部分序列，并且能够与HMGB1结合 

上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)中，上述连续11个碱基以 上的部分序列在下文中也称为连续部分序列。上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)可以是由上述连续部分序列构成的核酸分子，也可以是含有上述连续部分序列的核酸分子。上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)例如如前所述，可以是下述核酸分子，其含有序列编号74的碱基序列中不仅缺失一个或多个碱基，例如还取代、添加或插入了一个或多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1结合。 

上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)例如可以含有一条上述序列编号74的碱基序列中的上述连续的11个碱基以上的连续部分序列的序列，也可以含有两条以上的序列。 

上述连续部分序列的长度如前所述，为11个碱基以上。上述连续部分序列的长度不特别限制，例如可以是12个碱基以上，也可以是14个碱基以上，也可以是16个碱基以上。上述连续部分序列的长度的上限不特别限制，为80个碱基以下，优选的是79个碱基以下。 

上述连续部分序列不特别限制，例如可以为以下示出的y序列、x序列或y’序列。上述y序列例如可以为上述序列编号74的碱基序列中的、第1位～第20位、第4位～第20位的区域。上述x序列例如可以为上述序列编号74的碱基序列中的第21位～第60位、第22位～第60位、第24位～第60位、第25位～第60位、第29位～第60位、第34位～第60位、第38位～第60位、第22位～第48位、第22位～第47位、第25位～第47位、第26位～第47位、第27位～第47位、第28位～第47位、第29位～第47位、第30位～第47位、第31位～第47位、第34位～第47位、第29位～第44位、第29位～第40位、第29位～第46位、第25位～第46位、第26位～第46位、第27位～第46位、第28位～第46位、第29位～第46位的区域。上述y’序列例如可以为上述序列编号74的碱基序列中的、第61位～第80位、第61位～第79位、第61位～第77位、第61位～第76位、第61位～第78位、第64位～第80位、第65位～第80位、第70位～第80位、第64位～第77位的区域。 

下文中也将由上述连续部分序列构成的碱基序列和含有上述连续部分序列的碱基序列称为碱基序列(b2)。上述小型化HMGB1结合核酸分子 (b2)例如可以是由上述碱基序列(b2)构成的核酸分子，也可以是含有上述碱基序列(b2)的核酸分子。上述碱基序列(b2)例如可以是含有上述x序列和上述y’序列的碱基序列、含有上述y序列、上述x序列和上述y’序列的碱基序列。上述碱基序列(b2)中，例如优选地，上述x序列的5’侧含有上述y序列，上述x序列的3’侧含有上述y’序列。另外上述碱基序列(b2)例如可以缺失上述y序列中的5’末端的ggg。 

上述碱基序列(b2)例如可以是序列编号83～113所示的碱基序列。这些碱基序列示于下述表1。在下述表1中，与序列编号74的碱基序列对应地示出各碱基序列。关于各碱基序列，与序列编号74的碱基序列对比地在空白中示出缺失的部分，不同的碱基带有下划线。含有序列编号83～113的碱基序列的上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)有时也分别由下述表1所示的名称表示。 

[表1] 

上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)例如可以是由序列编号83～113中的任何的序列编号所示的碱基序列构成的核酸分子，也可以是含 有序列编号83～113中的任何的序列编号所示的碱基序列的核酸分子。 

上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)例如可以是由序列编号74和上述序列编号83～113中的任何的碱基序列(b2)中的从5’侧第4个碱基到3’侧的末端碱基的碱基序列构成的核酸分子或含有上述碱基序列的核酸分子。即，上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)例如可以在序列编号74和序列编号83～113中的任何的碱基序列中缺失5’末端的ggg。 

上述碱基序列(b2)例如可以含有序列编号114所示的基元序列。下述碱基序列中，n为腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、尿嘧啶(u)、胸腺嘧啶(t)，优选第5碱基的n为腺嘌呤(a)，第13碱基的n为胞嘧啶(c)、第17碱基的n为腺嘌呤(a)。含有上述基元序列的碱基序列(b2)例如可以为R8c6_1-1(序列编号83)、R8c6_1-3(序列编号84)、R8c6_1-4(序列编号85)、R8c6_1-15(序列编号86)、R8c6_1-18(序列编号87)、R8c6_1-20(序列编号88)、R8c6_1-21(序列编号89)、R8c6_1-25(序列编号90)、R8c6_1-18-S2(序列编号93)、R8c6_1-18-S4(序列编号94)、R8c6_1-18-S6(序列编号95)、R8c6_1-21-S6(序列编号96)、R8c6_1-22-S6(序列编号97)、R8c6_1-23-S6(序列编号98)、R8c6_1-24-S6(序列编号99)、R8c6_1-25-S6(序列编号100)、R8c6_1-25-S6A3(序列编号105)、R8c6_1-25-S6C2(序列编号107)、R8c6_1-21-S8(序列编号108)、R8c6_1-22-S8(序列编号109)、R8c6_1-23-S8(序列编号110)、R8c6_1-24-S8(序列编号111)、R8c6_1-25-S8(序列编号112)等。另外，含有上述基元序列的部分的碱基序列(B1)例如可以为R8c6_1-30(序列编号91)、R8c6_1-34CC(序列编号92)、R8c6_1-26-S6(序列编号101)、R8c6_1-25-S6A2(序列编号104)、R8c6_1-25-S6C(序列编号106)等。 

基元序列(序列编号114) 

uaagncacguagnaccng 

上述R8c6_1-18(序列编号74)的推定二级结构示于图11。该图中，圆圈围住的碱基对应于上述基元序列。在上述推定二级结构中，对应于上述基元序列中的“n”的碱基省略了圆圈。上述R8c6_1-25-S6(序列编号 100)的推定二级结构示于图20。该图中，圆圈围住的碱基与上述基元序列对应。上述推定二级结构中，对应于上述基元序列中的“n”的碱基省略了圆圈。 

上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)的长度不特别限制，其全长例如为20～160个碱基长，优选的是30～120个碱基长，更优选的是40～100个碱基长。另外，上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)中，上述碱基序列(b2)的全长不特别限制，其下限例如为20个碱基长以上、30个碱基长以上、34个碱基长以上、37个碱基长以上、40个碱基长以上，其上限例如为160个碱基以下、120个碱基以下、100个碱基以下、80个碱基以下，优选的是79个碱基长以下。 

上述小型化HMGB1结合核酸分子(B2)例如为下述核酸分子，其含有上述小型化HMGB1结合核酸分子(b2)的上述连续部分序列中、取代、缺失、添加或插入了一个或多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1结合。作为具体例子，例如可以是下述核酸分子，其含有序列编号83～113中的任何的序列编号所示的碱基序列中、取代、缺失、添加或插入了一个或多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1结合。上述取代等的碱基的数量不特别限制，在序列编号83～113中某个碱基序列中，例如为1～5个，优选的是1～4个，更优选的是1～3个，进一步优选的是1个或2个，尤其优选的是1个。 

本发明HMGB1结合核酸分子可以是例如下述(B3)的核酸分子。以下，将上述(B3)的核酸分子称为HMGB1结合核酸分子(B3)。 

(B3)核酸分子，其含有与序列编号45～81中的某个所示的碱基序列具有60％以上的同源性的碱基序列，并且能够与HMGB1结合 

上述HMGB1结合核酸分子(B3)可以是含有具有上述同源性的碱基序列的核酸分子，也可以是由具有上述同源性的碱基序列构成的核酸分子。上述同源性例如为70％以上，优选80％以上，更优选的是90％以上，进一步优选95％以上，特别优选的是99％以上。上述HMGB1结合核酸分子(B3)例如可以是，含有与上述HMGB1结合核酸分子(B1)的全长序列具有60％以上的同源性的碱基序列、并且能够与HMGB1结合的核酸分 子。这种情况下，上述同源性例如是70％以上，优选的是80％以上，更优选的是90％以上，进一步优选的是95％以上，尤其优选的是99％以上。上述同源性例如可以通过使用BLAST等在默认条件下计算而计算得出。 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以是下述(B4)的核酸分子。下文中，将上述(B4)的核酸分子称为HMGB1结合核酸分子(B4)。 

(B4)核酸分子，其含有与序列编号45～81中的某个所示的碱基序列在严谨条件下杂交的碱基序列或者与上述碱基序列互补的碱基序列，并且能够与HMGB1结合 

上述HMGB1结合核酸分子(B4)可以是由上述杂交的碱基序列构成的核酸分子，也可以是含有上述碱基序列的核酸分子。另外，上述HMGB1结合核酸分子(B4)可以是由上述互补的碱基序列构成的核酸分子，也可以是含有上述互补碱基序列的核酸分子。 

上述HMGB1结合核酸分子(B4)中，“在严谨条件下杂交”是指，例如在该技术领域的技术人员中公知的杂交实验条件。具体而言，“严谨条件”是指，例如，在0.7～1mol/L的NaCl存在下，于60～68℃进行杂交之后，使用0.1～2倍的SSC溶液，于65～68℃洗涤，由此能够鉴定的条件。1×SSC是指包括150mmol/L的NaCl、15mmol/L柠檬酸钠。另外，上述HMGB1结合核酸分子(A4)例如是下述核酸分子，其含有与上述HMGB1结合核酸分子(B1)的全长碱基在严谨条件下杂交的碱基序列，并且能够与HMGB1结合。 

除非另有指明，上述HMGB1结合核酸分子(B2)～(B4)中，例如，碱基、结构单位、长度、核酸酶耐性的赋予等，与上述HMGB1结合核酸分子(B1)相同。 

本发明的HMGB1结合核酸分子如前所述例如可以是单链核酸，也可以是双链核酸。在本发明的HMGB1结合核酸分子为上述双链核酸的情况下，例如，一条单链为上述(A1)～(A4)和上述(B1)～(B4)中的任何的核酸分子，另一条单链优选为由与上述(A1)～(A4)和上述(B1)～(B4)中某种核酸分子互补的碱基序列构成的核酸分子或含有上述碱基序列的核酸分子。 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如在使用时，在不影响与上述HMGB1的结合性的范围内，可以还结合有聚腺嘌呤等的连接子序列等。 

本发明的HMGB1结合核酸分子的制造方法没有任何限制，可以通过利用化学合成的核酸合成方法等公知方法来合成。 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如如前所述，可以是由上述序列编号1～42中的任何的序列编号所示的碱基序列构成的核酸分子，也可以是含有上述碱基序列的核酸分子。在后者的情况下，本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以含有上述序列编号1～42中的任何的序列编号所示的碱基序列之外的碱基序列。作为这样的本发明的HMGB1结合核酸分子的一种形式，例如有含有Y区域、X区域和Y’区域，从5’末端起上述Y区域、上述X区域和上述Y’区域连接的核酸分子。该形式的上述HMGB1结合核酸分子中，优选地，上述X区域含有上述序列编号1～42中的某个序列编号所示的碱基序列，上述Y区域和上述Y’区域分别包含任意的碱基序列。 

上述X区域的碱基数不特别限制，例如为10～60个碱基，优选的是15～50个碱基，更优选的是20～40个碱基。上述Y区域和Y’区域的碱基数不特别限制，例如分别为10～50个碱基，优选的是15～40个碱基，更优选的是20～30个碱基。本发明的HMGB1结合核酸分子的总碱基数不特别限制，例如为20～160个碱基，优选的是30～120个碱基，更优选的是40～100个碱基。 

上述Y区域的碱基序列和Y’区域的碱基序列各自不被特别限制，例如优选地含有引物能够退火的引物结合序列，以及聚合酶能够识别的聚合酶识别序列等。在大量制造能够与目标结合的核酸分子的情况下，例如用核酸扩增法扩增比起前述的化学合成，能够更高效地进行制造。因此，在用核酸扩增法扩增本发明的HMGB1结合核酸分子的情况下，本发明的HMGB1结合核酸分子例如优选地含有引物能杂交的引物结合序列和聚合酶能够识别的聚合酶识别序列。本发明的HMGB1结合核酸分子例如优选在上述X区域的5’侧上游(即上述Y区域)以及上述X区域的3’侧下游(即上述Y’区域)的至少一者中含有上述引物结合序列和聚合酶识别序 列。上述聚合酶识别区域例如可以根据核酸扩增中使用的聚合酶的种类而适当决定。在本发明的HMGB1结合核酸分子为RNA的情况下，上述聚合酶的识别序列例如优选地是依赖DNA的RNA聚合酶的识别序列(以下也称为“RNA聚合酶识别序列”)，具体例子例如可以是作为T7RNA聚合酶的识别序列的T7启动子等。在本发明的HMGB1结合核酸分子为RNA的情况下，例如优选地，5’侧的上述Y区域依次含有上述RNA聚合酶识别序列和上述引物结合序列(以下也称“5’侧引物区域”)。并且优选地，上述X区域连接在上述Y区域的3’侧。再者，优选地，上述Y’区域连接在上述X区域的3’侧，上述Y’区域含有引物结合序列(以下也称“3’侧引物区域”)。上述RNA中的上述5’侧引物区域例如优选地与以上述RNA为模板合成的DNA反义链的3’侧互补的序列，即与能够与上述反义链的3’侧结合的引物相同的序列。另外，本发明的HMGB1结合核酸分子例如还可以具有对与HMGB1的结合进行辅助的区域。另外，本发明的HMGB1结合核酸分子例如，上述Y区域和上述X区域、以及上述X区域和上述Y’区域分别直接邻接，也可以经由介入序列间接邻接。 

通过核酸扩增来制备发明的HMGB1结合核酸分子的方法不特别限制。在本发明的HMGB1结合核酸分子为RNA的情况下，例如可以以DNA为模板制备。以下，也将作为RNA的模板的DNA链称为反义链，也将含有上述RNA的尿嘧啶(u)取代为胸腺嘧啶(t)的序列的DNA链称为正义链。上述模板DNA例如优选含有：上述RNA中上述X区域的互补链的尿嘧啶(u)取代为胸腺嘧啶(t)的DNA(反义链)、以及、含有上述X区域的尿嘧啶(u)取代为胸腺嘧啶(t)的序列的DNA(正义链)中的任何一者。以这些DNA为模板，使用依赖DNA的DNA聚合酶进行核酸扩增之后，以得到的DNA扩增产物为模板，再使用依赖DNA的RNA聚合酶转录RNA，由此能够扩增上述RNA。另外，可以以上述RNA为模板，通过使用了依赖RNA的DNA聚合酶的逆转录反应来制备cDNA，以上述cDNA为模板通过PCR等进行DNA的核酸扩增，以得到的DNA扩增产物为模板，再使用依赖DNA的RNA聚合酶转录RNA，由此扩增上述RNA。 

另外，在本发明的HMGB1结合核酸分子为DNA的情况下，例如可以通过聚合酶链式反应(PCR)法等来扩增DNA扩增。 

本发明的HMGB1结合核酸分子中，上述X区域例如可以由前述的x序列来例示。 

在本发明的HMGB1结合核酸分子中，如前所述，上述Y区域和Y’区域的碱基序列分别不特别限制，可以任意决定。作为上述Y区域的序列的例子，例如有含有序列编号43和序列编号115中的任何所表示的碱基序列的序列和由上述碱基序列构成的序列。另外，上述Y区域例如可以例示为前述的y序列。此外，这些序列为示例，而并不限制本发明。 

gggacgcucacguacgcuca(序列编号43) 

acgcucacguacgcuca(序列编号115) 

作为上述Y’区域的序列的示例，例如可以为含有序列编号44所表示的碱基序列的序列和由上述碱基序列构成的序列。另外，上述Y’区域例如可以例示为前述的y’序列。此外，这些序列为示例，而并不限制本发明。 

ucagugccuggacgugcagu(序列编号44) 

本发明的HMGB1结合核酸分子例如可以具有由自退火产生的二级结构。上述二级结构例如有茎环结构。上述茎环结构例如可以由于上述Y区域、上述X区域和上述Y’区域中的任何形成双链而形成。作为具体例子，例如可以通过上述Y区域的部分与上述X区域的部分形成双链而形成茎环结构，也可以通过上述Y’区域的部分与上述X区域的部分形成双链而形成茎环结构。另外，也可以通过上述Y区域的部分和上述Y’区域的部分分别与上述X区域的部分形成双链而形成茎环结构。另外，可以通过在上述Y区域的内部形成双链而形成茎环结构，也可以通过在上述Y’区域的内部形成双链来形成茎环结构，也可以在上述Y区域和上述Y’区域的内部中形成茎环结构。 

本发明的HMGB1结合核酸分子，由于能够与HMGB1结合，因此例如能够作为通过与HMGB1结合而中和HMGB1的功能的中和剂使用。 

本发明的HMGB1结合核酸分子，由于能够如前所述与HMGB1结合，因此例如能够作为通过与HMGB1的结合而抑制HMGB1的功能的抑 制剂使用。 

本发明的HMGB1结合核酸分子，由于如前所述能够与HMGB1结合，因此能够作为用于预防或治疗由HMGB1表达而引起的疾病的医疗用品使用。上述本发明的医疗用品例如可以作为抗癌剂、抗炎剂、抗脑卒中剂等使用。 

本发明的中和剂、本发明的抑制剂和本发明的医疗用品只要含有本发明的HMGB1结合核酸分子即可，其他的构成没有任何限制。本发明的中和剂、本发明的抑制剂和本发明的医疗用品除了本发明的HMGB1结合核酸分子之外，例如可以分别含有载体等，例如可以为与以下所示的组合物相同的构成，可以同样地进行使用。 

<组合物> 

如前所述，本发明的组合物的特征在于，含有上述本发明的HMGB1结合核酸分子。本发明的组合物只要含有上述本发明的HMGB1结合核酸分子即可，其他的构成没有任何限制。 

本发明的组合物由于如前所述，能够与HMGB1结合，因此例如可以作为通过与HMGB1的结合而中和HMGB1的功能的中和剂使用。 

本发明的组合物由于如前所述，能够与HMGB1结合，因此例如可以通过与HMGB1的结合而抑制HMGB1的功能的抑制剂使用。 

本发明的组合物由于如前所述，能够与HMGB1结合，因此可以作为用于预防或治疗由HMGB1的表达而引起的疾病的医疗用品使用。上述本发明的医疗用品例如可以作为抗癌剂、抗炎剂、抗脑卒中剂等使用。 

本发明的组合物的适用对象不特别限制，可以根据其用途适当决定。上述适用对象可以为例如细胞、组织和生物体等。上述细胞和组织的来源、以及生物体的种类不特别限制。上述生物体例如有具有HMGB1基因和/或HMGB1直接同源基因的生物，具体例子例如有人、除人之外的非人哺乳动物、鸟类、鱼类等动物。在对生物体施用的情况下，施用方法不特别限制，例如可以是经口施用和非经口施用。上述非经口施用例如可以是静脉施用、动脉施用、对淋巴管施用、肌肉施用、皮下施用、直肠施用、经皮施用、腹腔施用、局部施用等。 

本发明的组合物除了上述本发明的HMGB1结合核酸分子之外，还可以含有例如各种添加剂。上述添加剂不特别限制，例如可以根据本发明的组合物的用途适宜决定。 

在将本发明的HMGB1结合核酸分子递送(delivery)到例如细胞、组织或生物体内等时，本发明的组合物优选含有载体作为上述添加剂。上述载体无特别限制，例如可以为纳米粒子、脂质体、胶束、反胶束、聚阳离子、细胞膜渗透肽、磁性粒子、磷酸钙等。上述纳米粒子不特别限制，例如可以是碳纳米角和碳纳米管等纳米碳。这些载体可以使用任何一种，也可以并用两种以上。另外，上述添加剂例如可以是缓冲剂、金属盐、表面活性剂等。 

<检测试剂> 

本发明的检测试剂为用于检测上述HMGB1的HMGB1检测试剂，其特征在于含有上述本发明的HMGB1结合核酸分子。本发明只要含有上述本发明的HMGB1结合核酸分子即可，其他的结构无任何限制。 

本发明的HMGB1结合核酸分子如上所述，能够与HMGB1结合。因此，例如通过使用本发明的检测试剂，确认有无本发明的HMGB1结合核酸分子与HMGB1的结合，能够对试样中的HMGB1进行定性或定量。上述HMGB1结合核酸分子和HMGB1的结合的有无的确认方法不特别限制，可以利用检测核酸和蛋白质的结合的公知方法。若如此使用本发明的检测试剂，则由于能够容易地检测HMGB1，因此例如在生物化学和临床领域中是有用的。 

<治疗方法> 

本发明的治疗方法的特征在于，含有对与上述HMGB1相关的疾病的对象施用本发明的HMGB1结合核酸分子的步骤。上述与HMGB1相关的疾病不特别限制，例如可以是选自包括癌、炎症和脑卒中的组中的至少一种疾病。上述癌例如可以是乳腺癌、大肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌和肺癌等。通过本发明的治疗方法，例如可以预防上述疾病预防、抑制上述疾病的发展或者治疗上述疾病。本发明的治疗方法还含有预防方法的意思，可以包括对上述疾病有危险性的对象给予本发明的HMGB1结合核 酸分子的步骤。本发明的HMGB1结合核酸分子的施用方法、施用条件等不特别限制，如前所述。另外，上述施用对象(例如，患者)也不特别限制。上述生物体例如可以是具有HMGB1基因和/或HMGB1直接同源基因的生物，作为具体例子，例如有人、除人之外的非人哺乳动物、鸟类、鱼类等动物。上述施用步骤中，例如可以施用本发明的组合物。 

本发明的特征在于，是用于在与上述HMGB1有关的疾病的治疗中使用的核酸分子。上述核酸分子为上述本发明的HMGB1结合核酸分子。上述本发明的HMGB1结合核酸分子如前所述。另外，本发明的特征在于，是用于在与上述HMGB1有关的疾病的治疗中使用的组合物。上述组合物是含有上述本发明的HMGB1结合核酸分子的上述本发明的组合物。上述本发明的组合物如前所述。 

实施例

接着说明本发明的实施例。但是本发明不限于下述实施例。市售的试剂除非特别指出，否则基于其方案使用。 

[实施例1] 

制作能够与HMGB1结合的RNA适体，确认各RNA适体针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

使用公知的核酸合成方法制作#47(序列编号65)、#80(序列编号67)、#06(序列编号56)、#36(序列编号60)、#34(序列编号63)、#08(序列编号46)、#10(序列编号58)的各RNA适体，作为实施例的RNA适体使用。将含有多个RNA(其由含有40个碱基长的随机序列的下述序列编号82所表示的寡核苷酸构成)的RNA库(40N)作为比较例的RNA(以下相同)。在序列编号82中，“n”为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。 

40N(序列编号82) 

gggacgcucacguacgcucannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnuc 

agugccuggacgugcagu 

(2)针对附加了His标签的HMGB1的结合能力 

对于上述各RNA适体，确认了针对N末端附加了His-标签的HMGB1(附加了His标签的HMGB1)的结合能力。上述结合能力的分析中，根据使用说明书使用了BIACORE(注册商标)X(GE health care公司制造)。 

首先，将BIACORE专用的传感器芯片(商品名Sensor Chip SA、GE healthcare公司制造)设置在上述BIACORE(注册商标)X中。向上述传感器芯片的流动池(flow cell)2中，使用运行缓冲液(running buffer)，注入5μmol/L的生物素化脱氧胸苷，使之结合至信号强度(RU：Resonance Unit)为约1000RU为止。上述生物素化脱氧胸苷使用了例如5’末端生物素化的20碱基长的脱氧胸苷。然后，向上述芯片的上述流动池1、2中，使用运行缓冲液，以20μL/min的流速注入10μg/mL的RNA适体1分钟，使之结合至信号强度为约1000RU为止。接着，使用上述运行缓冲液，以20μL/min的流速，注入675nmol/L的上述附加了His标签的HMGB130秒钟，接着在相同条件下使上述运行缓冲液流过并进行洗涤。与上述附加了His标签的HMGB1的注入与利用上述运行缓冲液的洗涤并行地，进行信号强度的测定。上述运行缓冲液的组成为20mmol/LHEPES、500mmol/L NaCl、0.1mmol/L MgCl₂、0.1％Triton X-100(注册商标)，其pH为7.2。另外，作为用于抑制非特异结合的阻断剂，使用了浓度的1mg/mL tRNA。比较例中，除了使用了上述比较例的RNA替代上述实施例的RNA适体之外，以同样的方式进行了信号强度的测定。其结果示于图1。 

图1为示出各RNA适体针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的图。在图1的图中，纵轴表示上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。在横轴中，-10秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入开始时刻，0秒～30秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入时间，30秒之后为通过上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图1所示，在使用上述比较例的RNA的情况下，由于未见信号强 度的增加，因此可知没有与上述附加了His标签的HMGB1结合。与此相对，由于利用实施例的各RNA适体时可见信号强度的增加，因此可知与上述附加了His标签的HMGB1结合了。 

然后，基于得到的信号强度，求各RNA适体和上述附加了His标签的HMGB1的解离常数。结果示于下述表2。如下述表2所示，上述比较例的RNA的解离常数为1.04×10^-6，与此相对，上述实施例的各RNA适体显示出解离常数为10^-13～10^-7数量级的优异的值，可见针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力优异。尤其是，#06和#08的RNA适体的解离常数的数量级分别为10^-10和10^-11，比起抗体的一般的数量级(10^-9数量级)而言非常低，也就是说，显示了非常高的结合能力。然后，#47和#80的RNA适体分别显示10^-12数量级和10^-13数量级，该数量级是在本申请提出时从未报告过的数量级。 

[表2] 

(3)针对HMGB1的结合能力 

对于上述各RNA适体，确认了针对N末端添加了His-标签的HMGB1的结合能力。上述结合能力的分析中，除了使用1μmol/L的上述HMGB1替代上述附加了His标签的HMGB1、并且上述HMGB1注入时间为60秒之外，与上述(2)同样地进行结合能力的分析。其结果示于图2。 

图2是示出各RNA适体针对上述HMGB1的结合能力的图。在图2的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-10秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述HMGB1的注入时间开始时刻，0秒 ～60秒为上述HMGB1的注入时间，60秒以后为利用上述运行缓冲液的洗涤的时间。 

如图2所示，对于没有附加His-标签的HMGB1而言，实施例的各RNA适体也显示出较高的结合能力。由该结果可知，实施例的RNA适体是不与His-标签结合而与HMGB1结合的RNA适体。 

(4)针对His-标签的结合能力 

对上述各RNA适体确认了针对His-标签的结合能力。上述结合能力的分析除了使用了300nmol/L的上述附加了His标签的MIF蛋白质替代上述附加了His标签的HMGB1之外，与上述(2)同样地，进行结合能力的分析。其结果示于图3。 

图3是表示各RNA适体针对上述附加了His标签的MIF蛋白质的结合能力的图。在图3的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-10秒～0秒是利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒是上述附加了His标签的MIF蛋白质的注入开始时刻，0秒～30秒是上述附加了His标签的MIF蛋白质的注入时间，30秒之后是利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图3所示，实施例的各RNA适体在附加了His标签的MIF蛋白质注入过程中(0秒～30秒)可见若干信号强度的增加，并非随时间而增加，而由于30秒之后的洗涤而可见信号强度的急速減少，最终信号强度变为0。由此确认了实施例的各RNA适体并不与His-标签结合。 

(5)生物体的生理条件下对HMGB1的结合能力 

确认了上述各RNA适体在生理条件下对HMGB1的结合能力。将上述运行缓冲液中的NaCl浓度500mmol/L设定为作为生物体的生理条件的150mmol/L，使上述附加了His标签的HMGB1的注入时间为45秒，除此之外，与上述(2)同样地进行结合能力的分析。其结果示于图4。 

图4是表示各RNA适体在生理条件下针对上述HMGB1的结合能力的图。在图4的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-20秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述HMGB1的注入开始时 刻，0秒～45秒为上述HMGB1的注入时间，45秒之后是利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图4所示，实施例的各RNA适体在生理条件下也对上述HMGB1显示出高结合能力。由该结果可知，实施例的RNA适体是在生理条件下也与HMGB1结合的适体。因此，可以说利用本发明的RNA适体，例如，即使施用给生物体，也能够以优异的结合能力与生物体中的HMGB1结合。 

[实施例2] 

制作能够与HMGB1结合的RNA适体，对各RNA适体确认了针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

通过公知核酸合成方法制作R8c6_1(序列编号74)和R8c6_14(序列编号75)的各RNA适体，作为实施例的RNA适体使用。 

(2)针对附加了His标签的HMGB1的结合能力 

使用上述(1)中制备的RNA适体，使上述附加了His标签的HMGB1的浓度为1μmol/L、注入时间为60秒，除此之外，与上述实施例1的上述(2)同样地进行针对附加了His标签的HMGB1的结合能力的分析。其结果示于图5。 

图5是表示各RNA适体针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的图。图5的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-20秒～0秒表示利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入开始时刻，0秒～60秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入时间，60秒之后是利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图5所示，通过实施例的各RNA适体，由于可以看见信号强度的增加，因此可知与上述HMGB1结合了。另外，R8c6_1和R8c6_14的RNA适体的解离常数分别为极低的7.52×10^-14和1.06×10^-13，显示出非常优异的结合能力。 

[实施例3] 

使R8c6_1(序列编号74)的RNA适体进一步小型化，确认了针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

通过公知的核酸合成方法制作下述表3所示的各RNA适体，作为实施例的RNA适体使用。上述RNA适体分别为缺失了R8c6_1的5’侧的区域或者3’侧的区域的碱基序列。 

[表3] 

(2)针对附加了His标签的HMGB1的结合能力 

使用上述RNA适体，使上述附加了His标签的HMGB1的浓度为635nmol/L、上述附加了His标签的HMGB1的注入时间为60秒，除此之外，与上述实施例1的上述(2)同样地进行针对附加了His标签的HMGB1的结合能力的分析。另外，作为比较例，对上述40N也同样地进行分析。其结果示于图6。 

图6是表示各RNA适体针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的图。图6的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-20秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入开始时刻，0秒～60秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入时间，60秒之后是利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图6所示，使R8c6_1小型化了的RNA适体分别可见到信号强度的增加，由此可知与上述HMGB1结合了。其中，缺失了R8c6_1的5’侧的R8c6_1-15、R8c6_1-18、R8c6_1-20和R8c6_1-21显示出比R8c6_1更优异的结合能力。 

[实施例4] 

将R8c6_1(序列编号74)的小型化RNA适体氟化，确认了针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

使用核糖残基的2’位被氟化的2’-氟-CTP和2’-氟-UTP(以下相同)，通过公知的核酸合成方法制作上述实施例3中上述表3所示的各RNA适体，作为实施例的氟化RNA适体使用。就上述氟化RNA适体而言，在上述表3所示的碱基序列中，胞嘧啶核苷酸残基和尿嘧啶核苷酸残基被氟化。各氟化RNA分别表示为2’F-R8c6_1、2’F-R8c6_1-1、2’F-R8c6_1-4、2’F-R8c6_1-15、2’F-R8c6_1-18、2’F-R8c6_1-21。另外，对于上述N40，氟化胞嘧啶核苷酸残基和尿嘧啶核苷酸残基氟化，制作氟化N40(2’F-N40)，作为比较例使用(以下相同)。 

(2)针对附加了His标签的HMGB1的结合能力 

使用上述氟化RNA适体，使附加了His标签的HMGB1的浓度为200nmol/L，上述附加了His标签的HMGB1的注入时间为60秒，除此之外，与上述实施例1的上述(2)同样地进行针对HMGB1的结合能力的分析。另外，对于上述2’F-N40、未氟化的未修饰的R8c6_1，也同样地进行分析。其结果示于图7。 

图7是示出各氟化RNA适体针对上述HMGB1的结合能力的图。图7的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-20秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述HMGB1的注入开始时刻，0秒～60秒是上述HMGB1的注入时间，60秒之后是利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图7所示，使R8c6_1小型化了的上述氟化RNA适体分别可见信号强度的增加，由此可知与上述HMGB1结合了。其中2’F-R8c6_1-18显示出与未修饰的R8c6_1同等的优异的结合能力。已知氟化了的RNA适体通常显示RNase抗性。因此，具有与HMGB1结合的能力的上述氟化RNA适体由于例如即使给予到生物体内也难以分解，因此可以说例如在医疗用品等中是有用的。 

[实施例5] 

将R8c6_1(序列编号74)和作为其小型化RNA适体的R8c6_1-18(序列编号87)分别氟化，确认了针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

使用上述2’-氟-CTP和上述2’-氟-UTP，通过公知的核酸合成方法，制作上述R8c6_1和上述R8c6_1-18的各RNA适体，作为实施例的氟化RNA适体使用。就上述氟化RNA适体而言，R8c6_1(序列编号74)和R8c6_1-18(序列编号87)的碱基序列中的胞嘧啶核苷酸残基和尿嘧啶核苷酸残基被氟化。各氟化RNA适体分别表示为2’F-R8c6_1、2’F-R8c6_1-18。 

(2)针对附加了His标签的HMGB1的结合能力 

使用上述氟化RNA适体，使附加了His标签的HMGB1的浓度为200nmol/L，使上述运行缓冲液中NaCl的浓度为150mmol/L，上述附加了His标签的HMGB1的注入时间为60秒，除此之外，与上述实施例1的上述(2)同样地进行针对附加了His标签的HMGB1的结合能力的分析。另外，对于上述2’F-N40、未氟化的未修饰R8c6_1，也同样地进行分析。其结果示于图8。 

图8是示出各氟化RNA适体针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的图。在图8的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-20秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入开始时刻，0秒～60秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入时间，60秒之后为利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图8所示，上述氟化RNA适体分别可见信号强度的增加，由此可见与上述HMGB1结合了。其中，2’F-R8c6_1-18显示出与未修饰的R8c6_1同等的优异的结合能力。 

[实施例6] 

确认了R8c6_1-18(序列编号87)对HMGB1和受体TLR-2的结合的抑制。 

(1)Pull-down实验 

使用了N末端添加了His-标签的TLR-2(附加了His标签的TLR-2)。将2μg的附加了His标签的TLR-2、2μg的HMGB1和给定量的R8c6_1-18添加到50μL的结合缓冲液(binding buffer)中，将该混合液在4℃下孵育20分钟。R8c6_1-18的添加量为1μg、2μg和4μg。上述结合缓冲液的组成与上述运行缓冲液相同，添加1mg/mL tRNA或不添加tRNA。向上述混合液中加入结合了Co²⁺的琼脂糖珠粒1μL(产品名BD TALON(注册商标)Metal Affinity Resin：BD Bio Science公司制造)，在4℃下孵育20分钟。孵育之后，洗涤上述琼脂糖珠粒，使用抗HMGB1抗体(产品名对HMGB1的兔多克隆抗体：abcam公司制造)，进行蛋白印迹实验(Western blotting)。另外，作为比较例对于上述40N也同样地进行分析。其结果示于图9。 

图9是示出HMGB1和TLR-2的结合的Pull-down实验的照片。图9中，tRNA“-”表示使用了tRNA未添加的上述结合缓冲液，tRNA“+”表示使用了tRNA添加的上述结合缓冲液。图9中，从左边起，道“M”表示分子量标记、道“-”表示tRNA未添加并且RNA适体未添加的结果、道“+”表示tRNA添加并且RNA适体未添加的结果、道“40N”表示添加量4μg、2μg、1μg的结果、道“R8c6_1-18”表示添加量4μg、2μg、1μg的结果。另外，对各道的结果，用TLR-2量校正检测出的HMGB1量，在各道下示出以道“+”的校正值作为100的相对值。 

如图9所示，在添加比较例的40N的情况下，即使通过增加添加量，HMGB1的量也不发生变化。与此相对，在添加了R8c6_1-18的情况下，随着添加量的增加，HMGB1量降低。由该结果可知，R8c6_1-18抑制了HMGB1和TLR-2的结合。因此，可以说本发明的HMGB1结合核酸分子例如在治疗与HMGB1相关的疾病方面是有用的。 

[实施例7] 

将RNA适体氟化，确认了针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

使用上述2’-氟-CTP和上述2’-氟-UTP，通过公知的核酸合成方法， 制作下述表4所示的各RNA适体，作为实施例的氟化RNA适体使用。对上述氟化RNA适体而言，在下述表4所示的碱基序列中，胞嘧啶核苷酸残基和/或尿嘧啶核苷酸残基被氟化。将尿嘧啶核苷酸残基和胞嘧啶核苷酸残基被氟化的RNA适体分别表示为2’F-CU-R8c6_1、2’F-CU-#06、2’F-CU-CU#80、2’F-CU-R4_9068。将仅胞嘧啶核苷酸残基被氟化的RNA适体分别表示为2’F-C-R8c6_1、2’F-C-#06、2’F-C-#80、2’F-C-R4_9068。将仅尿嘧啶核苷酸残基被氟化的RNA适体分别表示为2’F-U-R8c6_1、2’F-U-#06、2’F-U-#80、2’F-U-R4_9068。 

[表4] 

(2)针对附加了His标签的HMGB1的结合能力 

使用上述氟化RNA适体，使上述附加了His标签的HMGB1(Sigma公司制造)的浓度为200nmol/L，上述运行缓冲液中NaCl的浓度为150mmol/L，上述附加了His标签的HMGB1的注入时间为60秒，除此之外，与上述实施例1的上述(2)同样地进行针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的分析。另外，对于未氟化的未修饰的R8c6_1，也同样地进行分析。另外，作为比较例，也对未氟化的上述40N同样地进行分析。其结果示于图10。 

图10是表示各氟化RNA适体针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的图。在图10的图中，纵轴表示附加了His标签的HMGB1的注入结束时的、用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)。上述图从左边起表示40N、#06、#80、R8c6_1、HMGB1R4_9068的结果。上述图中，“2’F-CU-修饰”为胞嘧啶核苷酸残基和尿嘧啶核苷酸残基两者被氟化的RNA适体的结果，“2’F-C-修饰”为仅胞嘧啶核苷酸残基被氟化的RNA适体的结果，“2’F-U-修饰”为仅尿嘧啶核苷酸残基被氟化的RNA适体的结果，“未修饰”为未修饰的RNA适体R8c6_1和未修饰 的N40的结果。 

如图10所示，各氟化RNA适体分别可见较之比较例的未修饰的40N更高的信号强度的增加，由此可见与上述HMGB1结合了。其中，2’F-CU-R8c6_1、2’F-C-R8c6_1和2’F-U-R8c6_1显示出优异的结合能力，尤其是2’F-CU-R8c6_1显示出与未修饰的R8c6_1同等的结合能力。 

[实施例8] 

推定了R8c6_1(序列编号74)和R8c6_1-18(序列编号87)的二级结构。其二级结构示于图11。 

[实施例9] 

将R8c6_1(序列编号74)的RNA适体进一步小型化，确认了针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

通过公知的核酸合成方法，制作下述表5和下述表6所示的各RNA适体，作为实施例的RNA适体使用。 

[表5] 

上述表5的RNA适体是将R8c6_1小型化的适体。图18中示出R8c6_1的推定二级结构的概略图，图19中示出R8c6_1-18的推定二级结构的概略图。在上述表5中，R8c6_1-25和R8c6_1-18分别是从R8c6_1缺失了其5’侧的区域的碱基序列。R8c6_1-18-S2、R8c6_1-18-S4和R8c6_1-18-S6分别是与R8c6_1-18同样地从R8c6_1缺失了其5’侧的区域、而且还缺失了图18所示的S2、S4或S6的区域的碱基序列。R8c6_1的推定二级结构中，S2和S4分别是形成茎结构的碱基对区域，S6是茎环结构的区域。 

[表6] 

上述表6的RNA适体是将上述表5的R8c6_1-25-S6进一步小型化的适体。图20中示出R8c6_1-25-S6的推定二级结构的概略图。R8c6_1-25-S6A2、R8c6_1-25-S6C、R8c6_1-25-S8分别是缺失了图20所示的A2、C和S8的区域的碱基序列。另外，R8c6_1-26-S6分别作为缺失了R8c6_1-25-S6的5’侧的一个碱基的碱基序列。 

(2)针对附加了His标签的HMGB1的结合能力 

示出上述RNA适体，使上述附加了His标签的HMGB1的浓度为160nmol/L，除此之外，与上述实施例1的上述(2)同样地进行针对附加了His标签的HMGB1的结合能力的分析。另外，作为比较例，对于上述40N也同样地进行分析。其结果示于图12和图13。 

图12和图13分别是示出各RNA适体针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的图。图12和图13的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-10秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入开始时刻，0秒～30秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入时间，30秒之后为利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图12所示，将R8c6_1小型化的RNA适体分别可见信号强度的增加，由此可见于上述HMGB1结合了。其中，R8c6_1-18-S2、R8c6_1-25显示出较R8c6_1更优异的结合能力。 

另外，如图13所示，作为R8c6_1的小型化了的RNA适体的R8c6_1-25进一步小型化的各RNA适体，分别可见信号强度的增加，由此可知与上述HMGB1结合了。 

[实施例10] 

将RNA适体氟化，确认了针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

使用上述2’-氟-CTP和上述2’-氟-UTP，通过公知的核酸合成方法，制作下述表7所示的各RNA适体，作为实施例的氟化RNA适体使用。上述氟化RNA适体在上述表7所示的碱基序列中，胞嘧啶核苷酸残基和尿嘧啶核苷酸残基被氟化。尿嘧啶核苷酸残基和胞嘧啶核苷酸残基被氟化的RNA适体分别表示为2’F-R8c6_1-18-S6、2’F-R8c6_1-25、2’F-R8c6_1-25-S6、2’F-R8c6_1-25-S6A、2’F-R8c6_1-25-S6A2、2’F-R8c6_1-25-S6A3、2’F-R8c6_1-25-S6C、2’F-R8c6_1-25-S6C2、2’F-R8c6_1-25-S8。另外，对于上述N40，也同样地使用上述2’-氟-CTP和上述2’-氟-UTP进行氟化。 

[表7] 

(2)针对附加了His标签的HMGB1的结合能力 

除了使用上述RNA适体，使上述附加了His标签的HMGB1的浓度为150500nmol/L之外，与上述实施例1的上述(2)同样地，进行针对附加了His标签的HMGB1的结合能力分析。其结果示于图14。 

图14是示出各氟化RNA适体针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的图。图14的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-10秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述附加了His标签的HMGB1注入开始时刻，0秒～30秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入时间，30秒之后是利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图14所示，小型化了的上述氟化RNA适体分别可见信号强度的增加，由此可知与上述HMGB1结合了。其中，2’F-R8c6_1-18-S6和2’-R8c6_1-25显示出优异的结合能力。 

[实施例11] 

将R8c6_1(序列编号74)的RNA适体进一步小型化，确认了针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

通过公知的核酸合成方法制作下述表8所示的各RNA适体，作为实施例的RNA适体使用。 

[表8] 

上述表8的RNA适体为将R8c6_1小型化的适体。R8c6_1-21-S6、R8c6_1-22-S6、R8c6_1-23-S6、R8c6_1-24-S6分别为从上述R8c6_1-18-S6缺失了其5’侧的区域的碱基序列。另外，R8c6_1-21-S8、R8c6_1-22-S8、R8c6_1-23-S8、R8c6_1-24-S8的5’侧的序列分别与R8c6_1-21-S6、R8c6_1-22-S6、R8c6_1-23-S6、R8c6_1-24-S6相同，作为缺失与上述图20所示的上述S8相同的区域的碱基序列。 

(2)针对附加了His标签的HMGB1结合能力 

除了使用上述RNA适体，使上述附加了His标签的HMGB1的浓度为150nmol/L之外，与上述实施例1的上述(2)同样地进行针对附加了His标签的HMGB1的结合能力的分析。另外，作为比较例，对于上述40N也同样地进行分析。其结果示于图15。 

图15是示出各RNA适体针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的图。图15的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-10秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入开始时刻，0秒～30秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入时间，30秒之后为利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图15所示，将R8c6_1小型化的RNA适体分别可见信号强度的增加，由此可知与上述HMGB1结合了。 

[实施例12] 

将RNA适体氟化，确认了针对HMGB1的结合能力。 

(1)RNA适体 

使用上述2’-氟-CTP和上述2’-氟-UTP，通过公知的核酸合成方法，制作下述表9和下述表10所示的各RNA适体，作为实施例的氟化RNA适体使用。上述氟化RNA适体在上述表9和上述表10所示的碱基序列中，胞嘧啶核苷酸残基和尿嘧啶核苷酸残基被氟化。尿嘧啶核苷酸残基和胞嘧啶核苷酸残基被氟化的RNA适体分别表示为2’F-R8c6_1-21-S6、2’F-R8c6_1-22-S6、2’F-R8c6_1-23-S6、2’F-R8c6_1-24-S6、2’F-R8c6_1-25-S6、2’F-R8c6_1-26-S6、2’F-R8c6_1-27-S6、2’F-R8c6_1-21-S8、2’F-R8c6_1-22-S8、2’F-R8c6_1-23-S8、2’F-R8c6_1-24-S8、2’F-R8c6_1-25-S8、2’F-R8c6_1-25-S8CA。 

[表9] 

[表10] 

(2)针对附加了His标签的HMGB1的结合能力 

除了使用上述RNA适体，上述附加了His标签的HMGB1的浓度为150nmol/L之外，与上述实施例1的上述(2)同样地进行针对附加了His标签的HMGB1的结合能力的分析。另外，作为比较例，对于未修饰的上 述40N也同样地进行了分析。其结果示于图16和图17。图16和图17中，各RNA适体的名称省略了R8c61表示。 

图16和图17是示出各氟化RNA适体针对上述附加了His标签的HMGB1的结合能力的图。图16和图17的图中，纵轴表示用上述BIACORE(注册商标)X测定的信号强度(RU)，横轴表示分析时间(秒)。横轴中，-10秒～0秒为利用上述运行缓冲液进行预洗涤的时间，0秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入开始时刻，0秒～30秒为上述附加了His标签的HMGB1的注入时间，30秒之后为利用上述运行缓冲液进行洗涤的时间。 

如图16和图17所示，小型化的上述氟化RNA适体分别可见信号强度的增加，由此可知与上述HMGB1结合了。其中，2’F-R8c6_1-21-S6和2’F-R8c6_1-21-S8显示出优异的结合能力。 

[实施例13] 

通过ELISA法，确认了RNA适体R8c6_1-18-S6(序列编号95)和HMGB1的相互作用。 

使用碳酸缓冲液(pH9.0)稀释抗his抗体(产品名Penta·His Antibody：QIAGEN社)，使之浓度为4ug/mL。将该稀释抗体液分别注入50μL到96孔板(产品名96Well ELISA Plates：Asahi Techno Glass公司)的各孔中，在室温静置2小时。然后，将1％BSA/TBS分别注入50μL到上述板的各孔中，静置一晚上。上述TBS的组成为20mmol/L Tris-HCl(pH7.6)、0.9％NaCl。如此进行了上述板的封闭处理。将进行了封闭处理的上述板的孔用缓冲液200μL洗涤3次。上述缓冲液的组成为10mmol/L HEPES、500mmol/L NaCl、0.1mmol/L MgCl₂、0.1％Triton X-100(注册商标)，其pH为7.2。 

将HMGB1(产品名HMG-1：Sigma社)用含有tRNA的上述缓冲液稀释至规定浓度(1μg/mL、2μg/mL)，制备上述HMGB1稀释液。 

另一方面，用上述缓冲液稀释上述RNA适体，将上述RNA适体稀释液在95℃下进行5分钟加热处理之后，冷却到室温。然后，在上述RNA适体稀释液中混合RNase抑制剂(产品名RNase Inhibitor：TOYOBO社) 和生物素化脱氧胸苷，制备RNA适体混合液。上述生物素化脱氧胸苷使用5’末端生物素化了的20个碱基长的脱氧胸苷。上述RNA适体混合液中，上述RNA适体的浓度为10μg/mL、20μg/mL。另外，上述RNA适体混合液设定为每50μL(即，每一孔)上述RNase抑制剂为0.2μL、上述生物素化脱氧胸苷为0.2μL。 

然后，在上述洗涤后的上述板的各孔中，分别注入上述HMGB1稀释液50μL，在4℃静置2小时之后，用上述缓冲液200μL洗涤3次。接着，在上述各孔中，再分别注入上述RNA适体混合液50μL，于4℃反应2小时。添加到上述各孔中的上述HMGB1稀释液(50μL)的浓度和上述RNA适体混合液(50μL)的浓度之比为1∶20、2∶20、1∶10、2∶10。 

接着，向各孔中，将添加了亲和素的HRP(产品名Streptavidin-Biotinylated Horseradish Peroxidase Complex：GEhealth care社)用上述缓冲液稀释1000倍，分别注入50ul至各孔中，在4℃反应1小时。将上述板用上述缓冲液200μL洗涤3次，将常温的TMB(产品名1-Srep(TM)Ultra TMB-ELISA：Thermo SCIENTIFIC社)分别向各孔中注入100uL。在遮住上述板的光的状态下，于室温静置30分钟。向各孔中分别注入100uL的2mol/L硫酸，使反应停止。然后，测定上述各孔的450nm的吸光度。另外，作为对照例，除了不添加RNA适体之外，同样地进行处理，进行吸光度的测定。其结果示于图21。 

图21是示出HMGB1和上述RNA适体的相互作用的图，纵轴表示吸光度。如图21所示，表示HMGB1和上述RNA适体的结合的吸光度增加了，由此可以确认上述RNA适体与HMGB1的结合。另外，由增加上述HMGB1相对于RNA适体浓度的浓度而使得上述吸光度增加了。由此可以说，通过本发明的HMGB1结合核酸分子，能够进行HMGB1的定量。 

上文中参照实施方式和实施例对本申请的发明进行了说明，但是本申请的发明不限定于上述实施方式和实施例。本申请发明的构成和细节可以在本申请的发明的范围内，进行本领域技术人员能够理解的各种变更。 

该申请主张以2009年7月16日提交的日本申请特愿2009-167622为基础的优先权，将其全部公开并入本文。 

产业上的利用可能性 

根据本发明的适体，能够通过例如与HMGB1结合，来预防和治疗由HMGB1引起的如前所述的疾病。另外，根据本发明的适体，例如能够通过确认有无与HMGB1的结合来检测HMGB1，另外，由于也能够在HMGB1的功能阐明中使用，因此作为新的研究用工具也是有用的。 

Claims (26)

1.能够与HMGB1蛋白质结合的HMGB1结合核酸分子，其为与HMGB1蛋白质的解离常数为5×10^-7以下的核酸分子。

2.根据权利要求1所述的HMGB1结合核酸分子，所述核酸分子为下述(A1)、(A2)、(B1)和(B2)中任何的核酸分子，

(A1)含有序列编号1～42中的任何所表示的碱基序列的核酸分子，

(A2)核酸分子，其含有在序列编号1～42中的任何所表示的碱基序列中取代、缺失、添加或插入了一个或多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1蛋白质结合

(B1)含有序列编号45～81中的任何所表示的碱基序列的核酸分子，

(B2)核酸分子，其含有在序列编号45～81中的任何所表示的碱基序列中取代、缺失、添加或插入了一个或多个碱基的碱基序列，并且能够与HMGB1蛋白质结合。

3.根据权利要求2所述的HMGB1结合核酸分子，所述(B2)的核酸分子为含有序列编号45～81中的任何所表示的碱基序列中从5’侧第4个碱基到3’侧的末端碱基的碱基序列的核酸分子。

4.根据权利要求2或3所述的HMGB1结合核酸分子，所述(B1)的核酸分子为下述(b1)的核酸分子，所述(B2)的核酸分子为下述(b2)的核酸分子，

(b1)含有序列编号74所表示的碱基序列的核酸分子，

(b2)含有序列编号74所表示的碱基序列中连续11个碱基以上的部分序列、并且能够与HMGB1蛋白质结合的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的HMGB1结合核酸分子，所述(b2)的核酸分子为含有序列编号83～113中的任何所表示的碱基序列的核酸分子。

6.根据权利要求4所述的HMGB1结合核酸分子，所述(b2)的核酸分子为含有序列编号83～113中的任何所表示的碱基序列中的从5’侧第4个碱基到3’侧的末端碱基的碱基序列的核酸分子。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，所述核酸分子含有经修饰的核苷酸残基。

8.根据权利要求7所述的HMGB1结合核酸分子，所述经修饰的核苷酸残基为选自包括甲基化核苷酸残基、氟化核苷酸残基、氨基化核苷酸残基和硫化核苷酸残基的组中的至少一种。

9.根据权利要求7或8所述的HMGB1结合核酸分子，所述经修饰的核苷酸残基为具有胞嘧啶的核苷酸残基和具有尿嘧啶的核苷酸残基中的至少一者。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，所述经修饰的核苷酸残基为核糖残基被修饰的核苷酸残基。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，

所述HMGB1结合核酸分子含有Y区域、X区域和Y’区域，

从5’末端起，所述Y区域、所述X区域和所述Y’区域连结，

所述X区域含有所述序列编号1～42中的任何的序列编号所表示的碱基序列，

所述Y区域和所述Y’区域分别包括任意的碱基序列。

12.根据权利要求11所述的HMGB1结合核酸分子，所述X区域的碱基数为20～40个碱基。

13.根据权利要求11或12所述的HMGB1结合核酸分子，所述Y区域的碱基数和所述Y’区域的碱基数分别为20～30个碱基。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，所述Y区域的序列含有序列编号43和序列编号115中的任何所表示的碱基序列，

gggacgcucacguacgcuca(序列编号43)，

acgcucacguacgcuca(序列编号115)。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，所述Y’序列含有序列编号44所表示的碱基序列，

ucagugccuggacgugcagu(序列编号44)。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，所述核酸分子的总碱基数为40～100个碱基。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，所述核酸分子具有茎环结构。

18.根据权利要求10至17中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，所述Y区域和所述Y’区域的至少一者中的部分通过与所述X区域的部分形成双链而形成茎环结构。

19.根据权利要求10至18中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，所述Y’区域和所述Y’区域的至少一者中，通过在内部形成双链而形成茎环结构。

20.中和剂，其特征在于，其含有权利要求1至19中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，并通过HMGB1蛋白质与所述HMGB1结合核酸分子的结合而中和HMGB1蛋白质的功能。

21.抑制剂，其特征在于，其含有权利要求1至19中任一项所述的HMGB1结合核酸分子，并通过HMGB1蛋白质和所述HMGB1结合核酸分子的结合而抑制HMGB1蛋白质的功能。

22.医疗用品，其特征在于，含有权利要求1至19中任一项所述的HMGB1结合核酸分子。

23.根据权利要求22所述的医疗用品，所述医疗用品为选自包括抗癌剂、抗炎剂、抗脑卒中剂的组中的至少一者。

24.组合物，其含有权利要求1至19中任一项所述的HMGB1结合核酸分子。

25.根据权利要求24所述的组成物，所述组成物含有载体。

26.用于检测HMGB1蛋白质的HMGB1检测试剂，所述HMGB1检测试剂含有权利要求1至19中任一项所述的HMGB1结合核酸分子。

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