JP2013528355A - 強直性脊椎炎診断用プライマー及びこれを用いた強直性脊椎炎診断方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、強直性脊椎炎診断用プライマーセット及びこれを用いて強直性脊椎炎を診断する方法などに関する。具体的に、本発明は下記の強直性脊椎炎診断用プライマーセットを提供する：（ａ）配列番号７で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するプライマー、及び配列番号９〜配列番号１３で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のプライマーを含むプライマーセット;（ｂ）配列番号１５〜１７で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のプライマー、及び配列番号１９で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するプライマーを含むプライマーセットと、（ｃ）配列番号１８で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するプライマー、及び配列番号２０で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するプライマーを含むプライマーセット。本発明の強直性脊椎炎診断用プライマーセット及びこれを含む強直性脊椎炎診断用キットは、強直性脊椎炎の早期診断を可能にし、強直性脊椎炎の経過追跡及び予後判定に効果的に利用され得ることが期待される。
Description
本発明は、強直性脊椎炎診断用プライマー及びこれを用いて強直性脊椎炎を診断する方法などに関する。
強直性脊椎炎（Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ、ＡＳ）は、脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏａｐｔｈｙ、ＳｐＡ）が重症化した疾患の一形態であって、通常、１０代後半〜２０代前半から始まって３０、４０代に典型的な脊椎強直を示し、仙腸関節及び脊椎の慢性炎症及び末梢関節あるいは目、心臓、腸管侵入を特徴とする慢性進行性全身疾患である。脊椎関節炎の有病率は国によって異なるが、通常１〜２％程度であることが知られており、運動性の制限により患者及び社会に社会的、経済的に不利な影響を及ぼす。最近、この疾患に対する経過と治療に対して新たな知識が蓄積されることにより、早期治療が疾患の治療と経過を防ぐのに効果的であることが明らかになり、早期診断が重要な課題として浮上している。
疾病の原因は明確になっていないが、関節リウマチや全身性エリテマトーデスのような全身性リウマチ疾患と類似するように、遺伝的異常、感染、免疫炎症反応が発病に関与するものと推定する。遺伝的には「ＨＬＡ-Ｂ２７」という組織適合性抗原遺伝子が発病に関与するものと推定しており、その他、最近の研究ではＥＲＡＰ１（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ １）とＩＬ２３Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２３ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子が係るということが示唆されている。強直性脊椎炎による腰と仙骨の痛みは徐々に始まり、場合によっては、膝、足首などにも間欠的に関節炎が伴う。症状が曖昧であり、悪化と好転を繰り返すため、一般的な腰痛や非特異的な関節痛と区別し難い。欧州の研究によれば、脊椎関節炎の症状発現から強直性脊椎炎の診断まで平均１０年がかかるという。従って、患者は疾病がある程度進行した状態で専門医を訪れるようになり、その際には既に初期治療の時期を逃してしまったケースが頻繁にある。
強直性脊椎炎の古典的な診断は、患者の症状、病歴、仙腸関節及び脊椎の放射線学的な所見に基づいて行われているが、放射線学的な異常は病気がある程度進行した患者からのみ発見されるので、早期診断は不可能である。最近、ＭＲＩ撮影を活用して早期診断に役立っているが、この検査は高価なうえ、時間がかかることから、制限的に用いられている。血液における「ＨＬＡ-Ｂ２７」遺伝子検査も早期診断に利用されてはいるものの、患者の１５％で陰性の結果を示し、健常者の相当数で仮陽性の結果が出る。また、ＨＬＡ-Ｂ２７は、患者の予後や経過追跡にはこれといった情報を提供できない。
一般に、多くのリウマチ疾患でＥＳＲ（赤血球沈降速度）やＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）のような炎症の指標が疾患の活動性を追跡する指標として活用されているのに対し、強直性脊椎炎ではＥＳＲやＣＲＰが疾患の活動性を反映していない。強直性脊椎炎の場合、疾患の経過や治療に対する反応はまだ主に患者の主観的な訴えの程度に依存して評価している。
関節リウマチの場合、患者から発見されるリウマチ因子（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ）や抗ＣＣＰ抗体（ａｎｔｉ-ｃｙｃｌｉｃｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、患者の予後を予測させる指標としても活用される。即ち、前記指標が陽性である患者は関節炎の発生及び進行速度が速いということが知られ、陽性結果は早期に積極的な治療対象として選定するのに考慮されている。しかし、強直性脊椎炎の場合には、まだ予後を反映する指標がない。
結論として、現在、制限的に活用されるＨＬＡ-Ｂ２７以外には強直性脊椎炎を早期診断するのに利用されるバイオマーカーはない。また、経過を追跡するのに活用される活動性指標や予後を反映するバイオマーカーもない。従って、このようなバイオマーカーの発見（名）は、強直性脊椎炎の診断、追跡、予後を決定するのに独歩的な影響を及ぼすことになることは間違いなく、強直性脊椎炎を早期診断する手段の開発が急務となっているのが現状である。
本発明の目的は、強直性脊椎炎を早期に診断できる方法を提供することにある。具体的に、本発明は強直性脊椎炎診断用プライマーセット及びこれを含む診断キット、強直性脊椎炎診断用バイオマーカーなどを提供する。
本発明は、下記を含む強直性脊椎炎診断用プライマーセットを提供する：
（ａ）配列番号７で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するフォワードプライマーと、（ｂ）配列番号９〜配列番号１３で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のリバースプライマー。
（ａ）配列番号７で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するフォワードプライマーと、（ｂ）配列番号９〜配列番号１３で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のリバースプライマー。
また、本発明は、下記を含む強直性脊椎炎診断用プライマーセットを提供する：（ａ）配列番号１５〜１７で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のフォワードプライマーと、（ｂ）配列番号１９で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するリバースプライマー。
更に、本発明は下記を含む強直性脊椎炎診断用プライマーセットを提供する：（ａ）配列番号１８で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するフォワードプライマーと、（ｂ）配列番号２０で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するリバースプライマー。
また、本発明は前記プライマーセットを用いて強直性脊椎炎を診断する方法を提供する。前記方法は、下記の段階を含むことができる：（ａ）患者の生物試料からｃＤＮＡを合成する段階と、（ｂ）第１項〜第３項の何れか一項によるプライマーセットと８０％以上の配列相同性を有するプライマーセット、及び前記合成ｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行う段階と、（ｃ）前記ＰＣR 産物の塩基配列を確認する段階。
更に、本発明は、前記本発明のプライマーセットと８０％以上の配列相同性を有するプライマーセットを含む強直性脊椎炎診断キットを提供する。
また、本発明は、配列番号２１の塩基配列の全部あるいは一部を含む強直性脊椎炎診断用バイオマーカーを提供する。
更に、本発明は、配列番号２１の塩基配列の全部あるいは一部を用いて強直性脊椎炎を診断する方法を提供する。前記方法は、下記段階を含むことができる：（ａ）患者の生物試料からｃＤＮＡを合成する段階と、（ｂ）第１項〜第３項の何れか一項によるプライマーセットと８０％以上の配列相同性を有するプライマーセット、及び前記合成ｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行う段階と、（ｃ）配列番号２１の塩基配列の全部あるいは一部を含むＰＣＲ産物を確認する段階。
また、本発明は、配列番号２１の塩基配列の全部あるいは一部を含む強直性脊椎炎診断キットを提供する。本発明の一実現例として、前記診断キットは配列番号２１と８０％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。
本発明は、強直性脊椎炎診断用プライマーセット及びこれを用いて強直性脊椎炎を診断する方法を提供する。
前記本発明のプライマーセットを利用することで、強直性脊椎炎を早期に診断でき、更に強直性脊椎炎の経過追跡及び予後判断を可能にするという効果を奏する。究極には、本発明は強直性脊椎炎の早期診断及び治療用情報の提供に大きく貢献できることが期待される。
本発明者らは、強直性脊椎炎を診断するための新たな手段について研究を行っていたところ、本発明のプライマーセットが強直性脊椎炎患者で特定のＰＣＲ産物を特異的に製造することを確認し、これに基づいて本発明を完成するに至った。
本発明は、強直性脊椎炎診断用プライマーセットを提供することを特徴とする。健常者ではＰＣＲ増幅産物を生産せず、強直性脊椎炎患者でのみ特異的にＰＣＲ増幅産物を生産するプライマーセットは、本発明で初めて提供するものである。本発明において、「プライマー」とは、コピーしようとする核酸鎖に相補的な単一鎖オリゴヌクレオチド配列のことをいい、プライマー延長産物の合成のための開始点として作用できる。前記プライマーの長さ及び配列は、延長産物の合成開始を可能にするものであれば、特に制限はない。好ましくは、前記プライマーの長さは約５〜５０ヌクレオチドである。具体的な長さ及び配列は、要求されるＤＮＡ又はＲＮＡ標的の複合度（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）だけでなく、温度及びイオン強度のようなプライマーの利用条件に応じて変化し得る。
発明のプライマーセットは、強直性脊椎炎患者で特異的に発現する遺伝子を増幅できるプライマーセットであれば何でもよい。好ましくは、本発明のプライマーセットは、下記を含むことができる：
（１）配列番号７で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するフォワードプライマーと、配列番号９〜配列番号１３で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のリバースプライマー。
（１）配列番号７で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するフォワードプライマーと、配列番号９〜配列番号１３で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のリバースプライマー。
（２）配列番号１５〜１７で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のフォワードプライマーと、配列番号１９で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するリバースプライマー。
（３）配列番号１８で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するフォワードプライマーと、配列番号２０で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するリバースプライマー。
本発明で用いられるプライマーは、前記それぞれのプライマーと８０％以上、好ましくは、９０％以上の配列相同性を有する機能的同等物のプライマーを含むものである。前記機能的同等物は、実質的に前記プライマーセットによって生成される産物と同等な産物を強直性脊椎炎患者でのみ特異的に作り出すものをいう。前記機能的同等物は、前記プライマーの塩基配列のうちの一部が付加、置換又は欠失の結果として生成されたものであり得る。前記で塩基配列の置換は、好ましくは保存的置換である。
本発明のプライマーとして用いられたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、アルキルホスホロチオエート又はペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含むことができるか、又は挿入物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含むことができる。
また、本発明のプライマーは、シグナルを提供できる標識が付着されたものであり得る。前記シグナルを提供できる標識は、蛍光、燐光又は放射線を発する物質であり得るが、これに制限されるものではない。好ましくは、前記標識物質はＣｙ-５又はＣｙ-３であり得る。
本発明で提供される強直性脊椎炎診断用プライマーセットは、強直性脊椎炎を早期診断するのに有用に使用され得る。
従って、本発明は、前記強直性脊椎炎診断用プライマーセットを用いて強直性脊椎炎を診断する方法を提供する。前記方法は、（ａ）生物試料からｃＤＮＡを合成する段階と、（ｂ）第１項〜第３項の何れか一項によるプライマーセットと８０％以上の配列相同性を有するプライマーセット、及び前記合成ｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行う段階と、（ｃ）前記ＰＣＲ産物の塩基配列を確認する段階を含むことができる。
前記（ａ）段階では生物試料からｃＤＮＡを合成する。前記生物試料は、唾液、生検、血液、皮膚組織、液体培養物、糞便又は小便などであり得るが、これに制限されず、好ましくは、血液であってもよく、より好ましくは、末梢血液であってもよい。前記ｃＤＮＡの合成は、当業界において通常用いられる方法又は商業的に販売されるｃＤＮＡ製作キットを用いて行うことができる。
また、前記（ｂ）段階では、前記（ａ）段階のｃＤＮＡ及び本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う。
プライマーセットについては、前述した通りである。前記ＰＣＲは、ＰＣＲ反応に必要な当業界に公知された多様な成分を含むＰＣＲ反応混合液を用いて実行され得る。前記ＰＣＲ反応混合液は、分析しようとする前記ｃＤＮＡと本発明で提供される強直性脊椎炎診断用プライマーセット以外に適当量のＤＮＡ重合酵素、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ緩衝溶液及び水（ｄＨ２Ｏ）などを含むことができる。前記ＰＣＲ緩衝溶液は、トリス-ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ）、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌなどを含む。このとき、ＭｇＣｌ２の濃度は、増幅の特異性と数量に大きく影響を与え、好ましくは、１.５〜２.５ｍＭの範囲で使用され得る。一般に、Ｍｇ２+が過量である場合、非特異的なＰＣＲ増幅産物が増加し、Ｍｇ２+が足りない場合、ＰＣＲ産物の算出率が減少する。前記ＰＣＲ緩衝溶液には、適当量のトライトンＸ-１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００）が追加で含まれることもできる。また、ＰＣＲは９４〜９５℃で鋳型ＤＮＡを前変性させた後、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）；結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）；増幅（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）のサイクルを経た後、最終的に、７２℃で延長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）させる一般的なＰＣＲ反応条件で実行され得る。
前記で変性及び増幅は、９４℃〜９５℃及び７２℃でそれぞれ実行され得、結合時の温度は、プライマーの種類によって変わり得る。好ましくは、５２℃〜６５℃であり、より好ましくは、６０℃である。各段階の時間とサイクル数は、当業界において一般に行われる条件に応じて定められ得る。本発明に係る強直性脊椎炎診断用プライマーセットを用いたＰＣＲ実行時の最適の反応条件は、以下の通りである：９５℃で３分間鋳型ＤＮＡを前変性させた後、９４℃で３０秒;６０℃で３０秒；及び７２℃で１分を３０サイクル繰り返し行った後、最終的に、７２℃で５分間反応させる。
また本発明は、本発明に係る強直性脊椎炎診断用プライマーセットを含む強直性脊椎炎診断キットを提供する。診断方法は、前述した通りである。この他にＰＣＲ反応を容易に行えるようにするために、ＤＮＡ重合酵素及び前記で記載した組成のＰＣＲ反応緩衝溶液が追加で含まれ得、ＰＣＲ産物の増幅如何を確認できる電気泳動の実行に必要な構成成分が本発明のキットに追加で含まれ得る。
参考までに、前記で言及した公知の方法は、次の文献を参照できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ.（１９８２）;Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, ２ｄ Ｅｄ., Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）;Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ, Ｍ., Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉfｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ, ｖｏｌ． １８２. Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ. Ｉｎｃ., Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ（１９９０））。
本発明の一実施例では強直性脊椎炎患者と健常者の血液を採取してｃＤＮＡを合成し、多様なプライマーを用いて強直性脊椎炎患者で特異的にＰＣＲ産物を合成するプライマーを選別した。その結果、配列番号７で表されるプライマーをフォワードプライマーとし、配列番号９〜１３で表されるプライマーの混合物をリバースプライマーとして用いた場合、強直性脊椎炎患者で特異的にＰＣＲ産物が合成されることを確認した（実施例１参照）。
本発明の他の一実施例では、前記合成される産物を確認するために、前記産物をＰＩＴ２ファージミドベクトルに挿入し、Ｅ.ｃｏｌｉに電気注入させて培養する方法により前記産物を増幅した（実施例２参照）。
本発明の更に他の実施例では、前記培養されたＥ.ｃｏｌｉのうち、前記産物が正常に入った菌株を選別してＤＮＡを分離して塩基配列を獲得し、配列番号２１で表した（実施例３参照）。
更に本発明の別の実施例では、前記獲得された塩基配列がいかなる遺伝子であるか、遺伝子データベースの検索を通じて究明し、強直性脊椎炎患者で同一に前記部分が現れるか否かを確認した。その結果、前記配列番号２１の塩基配列は、ＣＤＣ ４２ ＢＰＢのイントロン部分の塩基配列と一致するという結果が得られ、３９人の強直性脊椎炎患者の血液を採取して同じ過程で実験を行って獲得した塩基配列を互いに比較した結果、本発明のプライマーセットは強直性脊椎炎患者で安定的に同一のＰＣＲ産物を合成することを確認した（実施例４参照）。前記から、配列番号２１の塩基配列は、強直性脊椎炎を診断するバイオマーカー遺伝子になり得る。
従って、本発明は、配列番号２１の塩基配列の全部又は一部を用いて強直性脊椎炎を診断する方法を提供する。
前記方法は、下記段階を含むことができる：（ａ）患者の生物試料からｃＤＮＡを合成する段階と、（ｂ）前記本発明のプライマーセットのうちの１つと８０％以上の配列相同性を有するプライマーセット、及び前記合成ｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行う段階と、（ｃ）配列番号２１の塩基配列の全部あるいは一部を含むＰＣＲ産物を確認する段階。前記生物試料は、前述した通りである。
本発明の他の実施例では、前記実施例４で明らかになった強直性脊椎炎患者で特異的に増幅される産物の塩基配列を分析した結果に基づいて強直性脊椎炎患者で特異的にＰＣＲ産物を作り出すプライマーセットを追加で製作した。製作されたプライマーセットを用いて試験した結果、これらも強直性脊椎炎患者で特異的にＰＣＲ産物を作り出すことを確認した（実施例５参照）。
以下、本発明の理解を促進するために、好適な実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるだけであって、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１．ＶＨ地域遺伝子の増幅
まず、強直性脊椎炎患者と正常対照群から血液を採取して分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ-ｓｉｇｍａ、ＵＫ）の密度勾遠心分離法を利用してＰＢＭＣ（ｐｅｒｉ-ｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）と血清を抽出してｃＤＮＡを合成し、ここで合成されたｃＤＮＡからＶＨ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）フォワードプライマー及びＪＨ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｊｏｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）リバースプライマーを用いてそれぞれサンプルのＶＨ地域遺伝子を増幅させた。プライマーのデザインは、優先的にｃＤＮＡからＨｕｍａｎ ＶＨ地域を増幅するのに一般に用いられるプライマーを根幹として設定し（Ｖａｎ ｅｔ ａｌ.,（２００３）Ｃｌｉｎ. Ｅｘｐ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １３１（２）：３６４-３７６）、ＩｇＢＬＡＳＴのＨｕｍａｎ遺伝子の抗体ＶＨ配線遺伝子（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｂｌａｓｔ Ｈｕｍａｎ ＶＨ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅ）配列との比較を通じて３つのプライマーを追加した（配列番号６、配列番号７及び配列番号１３のプライマー）
まず、強直性脊椎炎患者と正常対照群から血液を採取して分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ-ｓｉｇｍａ、ＵＫ）の密度勾遠心分離法を利用してＰＢＭＣ（ｐｅｒｉ-ｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）と血清を抽出してｃＤＮＡを合成し、ここで合成されたｃＤＮＡからＶＨ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）フォワードプライマー及びＪＨ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｊｏｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）リバースプライマーを用いてそれぞれサンプルのＶＨ地域遺伝子を増幅させた。プライマーのデザインは、優先的にｃＤＮＡからＨｕｍａｎ ＶＨ地域を増幅するのに一般に用いられるプライマーを根幹として設定し（Ｖａｎ ｅｔ ａｌ.,（２００３）Ｃｌｉｎ. Ｅｘｐ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １３１（２）：３６４-３７６）、ＩｇＢＬＡＳＴのＨｕｍａｎ遺伝子の抗体ＶＨ配線遺伝子（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｂｌａｓｔ Ｈｕｍａｎ ＶＨ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅ）配列との比較を通じて３つのプライマーを追加した（配列番号６、配列番号７及び配列番号１３のプライマー）
[前記Ａは、ａ（Ａｄｅｎｉｎｅ）;Ｃはｃ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）;Ｇはｇ（Ｇｕａｎｉｎｅ）;Ｔはｔ（Ｔｈｙｍｉｎｅ）;Ｕはｕ（Ｕｒａｃｉｌ）;Ｙはｃ又はｔ（ｕ）;Ｒはａ又はｇ;Ｍはａ又はｃ;Ｋはｇ又はｔ（ｕ）;Ｓはｇ又はｃ；Ｗはａ又はｃ又はｔ（ｕ）；Ｂはｇ又はｔ（ｕ）又はｃ；Ｖはｇ又はｃ又はａ；Ｄはｇ又はａ又はｔ（ｕ）；Ｎはｇ、ａ、ｃ又はｔ（ｕ）である。以下、塩基配列でも同一である。]
強直性脊椎炎患者と正常対照群のｃＤＮＡサンプルを、以下のような条件でＰＣＲを行ってＶＨ地域の断片を得た。
強直性脊椎炎患者と正常対照群のｃＤＮＡサンプルを、以下のような条件でＰＣＲを行ってＶＨ地域の断片を得た。
５０の全体反応液にそれぞれのＶＨフォワードプライマー（ＨｕＶＨ１Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ２Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ３Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ４Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ５Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ６Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ２*Ｆｏｒ、又はＨｕＶＨ４*Ｆｏｒ）２.５とリバースプライマー混合物（ＨｕＪＨ１-２Ｒｅｖ、ＨｕＪＨ３Ｒｅｖ、ＨｕＪＨ４-５Ｒｅｖ、ＨｕＪＨ６Ｒｅｖ、ＨｕＪＨ７Ｒｅｖの同一濃度混合液）２.５を添加し、ｄＮＴＰ１、サンプルＤＮＡ１、そしてＰＣＲ重合酵素１を入れて十分に混ぜた後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分間３０回サイクルを繰り返してＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡを寒天ゲルで電気泳動した後、予測した大きさのＤＮＡを加熱抽出技法により精製した。
この結果、正常対照群と強直性脊椎炎患者群でＨｕＶＨ１Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ２Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ３Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ４Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ５Ｆｏｒ、ＨｕＶＨ６Ｆｏｒ及びＨｕＶＨ４*Ｆｏｒフォワードプライマーを用いた場合の発現様相は差がないが、ＨｕＶＨ２*Ｆｏｒをフォワードプライマーとして用いた場合の発現様相は、正常対照群と強直性脊椎炎患者群とで差があることを確認した（図１参照）。
これにより正常対照群と患者の抗体断片を得た（正常対照群のＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５断片と患者のＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５及びＶＨ２*断片）。
実施例２．ＶＨ２*に形質転換されたバクテリアの製造
前記実施例１で得たＶＨ２*断片とＰＩＴ２ファージミドベクトルを１００の全体反応液に４の制限酵素ＮｃｏＩと十分に混合した後、４時間間３７℃で恒温反応した後、精製し、続いて４の制限酵素ＸｈｏＩを加えた後、３７℃で４時間間恒温反応した後、これを寒天ゲルに電気泳動して加熱抽出方式によりＤＮＡを分離した。
前記実施例１で得たＶＨ２*断片とＰＩＴ２ファージミドベクトルを１００の全体反応液に４の制限酵素ＮｃｏＩと十分に混合した後、４時間間３７℃で恒温反応した後、精製し、続いて４の制限酵素ＸｈｏＩを加えた後、３７℃で４時間間恒温反応した後、これを寒天ゲルに電気泳動して加熱抽出方式によりＤＮＡを分離した。
ＰＩＴ２ファージミドベクトルの場合は、ＮｃｏＩとＸｈｏＩ処理を終了した後、これに２の脱リン酸酵素を添加して３７℃で１時間間恒温反応をした後、精製した。制限酵素により切断されたＶＨ２*断片と制限酵素及び脱リン酸酵素により処理されたＰＩＴ２ファージミドベクトルを全体反応液２０にそれぞれ３と４ずつ加えた後、これに１の連結酵素（ｌｉｇａｓｅ）を入れて十分に混ぜた後、１６℃で１８時間間恒温反応を行った。
恒温反応の結果物を精製し、予め準備したＥ.ｃｏｌｉ ＴＧ１菌株に電気衝撃法を利用して注入した。電気衝撃法の反応条件は、１２.５ｋＶ／ｃｍ、２００Ω、２５ｍＦとした。
電気衝撃作業が終了した後、アンピシリンを含有した寒天培地プレートにＥ．ｃｏｌｉを塗抹して３７℃で１６時間間培養した。
実施例３．形質転換菌株の塩基配列分析
前記実施例２での組換えＤＮＡの注入により、アンピシリンが含有された培地で成長する菌株を選び、ＬＢ培地に入れて１６時間培養した後、その中で組換えＤＮＡを精製し、これをＬＭＢ３プライマー（配列番号１４;５’-ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴＡＴＧ ＡＣ-３’）を用いてシークエンシングを行ってＶＨ２*断片が組換えＤＮＡに入ったかを確認した。
前記実施例２での組換えＤＮＡの注入により、アンピシリンが含有された培地で成長する菌株を選び、ＬＢ培地に入れて１６時間培養した後、その中で組換えＤＮＡを精製し、これをＬＭＢ３プライマー（配列番号１４;５’-ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴＡＴＧ ＡＣ-３’）を用いてシークエンシングを行ってＶＨ２*断片が組換えＤＮＡに入ったかを確認した。
コロニー重合酵素連鎖反応を通じて選別されたクローンのＤＮＡシークエンシングの結果、ＶＨ２*断片が組換えＤＮＡに入ったことを確認することができた。前記実施例２での組換えＤＮＡの注入により、アンピシリンが含有された培地で成長した菌株のみを対象に、正常に組換えＤＮＡが入った菌株を選別するために、コロニー重合酵素連鎖反応を行った。コロニー重合酵素連鎖反応は、前記実施例１でＶＨ２*を増幅するプライマーセットを用いて同一のＰＣＲ条件でＰＣＲを行い、鋳型ＤＮＡ（ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ）は、前記アンピシリンが含有された培地で成長したコロニーを選別投与して行った。
ＰＣＲの結果物を寒天ゲルで泳動した後、予測した大きさのＤＮＡが正確に現れたクローンのみを選別した。図２から分かるように、ＤＮＡ ｂａｎｄが正確に現れたクローンは、Ｎ（コロニー番号）３、６、及び９（Ａで示す）であり、Ｎ４及びＮ１０はバンドが弱くて除外されたクローンである（Ｂで示す）。
コロニー重合酵素連鎖反応により選別されたコロニーのＤＮＡをＥｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ社（ドイツ）に依頼して塩基配列を獲得し、獲得したＤＮＡシークエンシングの結果をＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ６プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて分析した。
分析結果、選別された計１００個のクローンの遺伝子塩基配列シークエンシングの結果、４８％のクローンから特定の連続塩基配列を得た（図３参照）。
実施例４．強直性脊椎炎バイオマーカー遺伝子の究明
前記過程を通じて得られた連続塩基配列をヌクレオチド配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＲｅｆＳｅｑ）を用いていかなる遺伝子に属するかを検索した。
前記過程を通じて得られた連続塩基配列をヌクレオチド配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＲｅｆＳｅｑ）を用いていかなる遺伝子に属するかを検索した。
検索結果、本発明のＶＨ２*断片は、ＣＤＣ４２ ＢＰＢのイントロン部分の塩基配列と一致するという結果を得た。ＣＤＣ４２ ＢＰＢは、染色体１４に（４ｑ３２ ８３６６０Ｋ）位置し、長さが計１２７８Ｋ ｂｐであり（図４参照）、実験を通じて得られた塩基配列はイントロン部分（図５参照）であって、３６.０９Ｋ ｂｐから３６.３５Ｋ ｂｐ部分である。前記塩基配列を配列番号２１で示した。
次に、強直性脊椎炎患者群のＶＨ２*断片の塩基配列間の類似性検査を行った。計９人の強直性脊椎炎患者の血液でｃＤＮＡを合成して配列番号７をフォワードプライマーとし、配列番号９〜１３で表されるプライマーの同一濃度混合物をリバースプライマーとしてＰＣＲを行った後、実施例２及び実施例３と同一の方法で塩基配列を獲得し、獲得したＤＮＡシークエンシングの結果をＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ６プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて分析した。
その結果、強直性脊椎炎患者群でＶＨ２*断片の塩基配列が保存的に存在することを確認した。また、図６から分かるように、実験を通じて得られた強直性脊椎炎患者群のＶＨ２*断片は一定のパターンでＣＤＣ４２ＢＰＢの塩基配列と噛み合っていることが確認できた（図６：強直性脊椎炎患者群の抗体断片の一定のパターン模式図）。
実施例５．強直性脊椎炎診断用プライマーの追加の究明
実施例４で明確にした構造によってＣＤＣ４２ ＢＰＢのｉｎｔｒｏｎのうちの一部がｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎによりＶＨ２抗体遺伝子（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅ）の間に入ったことを確認した。このような点に基づいて抗体ｈｅａｖｙ鎖のｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＶＨ-L）、ＣＤＣ４２ ＢＰＢのｉｎｔｒｏｎ及び抗体ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎでプライマーを製作して前記実施例１〜３の方法により強直性脊椎炎患者でのみ特異的に産物を作り出すプライマーセットを追加的に発掘した。
実施例４で明確にした構造によってＣＤＣ４２ ＢＰＢのｉｎｔｒｏｎのうちの一部がｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎによりＶＨ２抗体遺伝子（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｎｅ）の間に入ったことを確認した。このような点に基づいて抗体ｈｅａｖｙ鎖のｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＶＨ-L）、ＣＤＣ４２ ＢＰＢのｉｎｔｒｏｎ及び抗体ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎでプライマーを製作して前記実施例１〜３の方法により強直性脊椎炎患者でのみ特異的に産物を作り出すプライマーセットを追加的に発掘した。
その結果、配列番号１５〜１７からなる群より選択された何れか１つのプライマーと配列番号１９のプライマーからなるプライマーセット、配列番号１８及び配列番号２０からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う場合、強直性脊椎炎患者で特異的にＰＣＲ産物を作り出すことを確認した。
下記表３に本実験で用いらたプライマーセットを３つのグループに分けて示した。
前記３つのグループのプライマーセットがそれぞれ複製する抗体断片を図７に示した。図７から分かるように、グループ１のプライマーセットが複製する領域は、抗体ＶＨ配線遺伝子地域と抗体ＪＨ配線遺伝子との間であり、グループ２のプライマーセットが複製する領域は、抗体ＶＨ配線遺伝子先導地域とＣＤＣ４２ ＢＰＢ ＤＮＡのイントロン部分との間であり、グループ３のプライマーセットが複製する領域は、ＣＤＣ４２ ＢＰＢ ＤＮＡのイントロン部分と抗体Ｃｅｐｓｉｌｏｎ配線遺伝子との間である。
図８は、グループ１のプライマーセットを用いた定量的ＰＣＲ結果をグラフで示すものであり、図９は、前記定量的ＰＣＲ結果の各群別の平均値をグラフで示すものである。また、図１０は、グループ１のプライマーセットを用いた定量的ＰＣＲ結果をサンプル別に示すものである。
図１１は、グループ２のプライマーセットを用いた定量的ＰＣＲ結果をグラフで示すものであり、図１２は、前記定量的ＰＣＲ結果の各群別の平均値をグラフで示すものである。また、図１３は、グループ２のプライマーセットを用いた定量的ＰＣＲ結果をサンプル別に示すものである。
図１４は、グループ３のプライマーセットを用いた定量的ＰＣＲ結果をグラフで示すものであり、図１５は、前記定量的ＰＣＲ結果の各群別の平均値をグラフで示すものである。また、図１６は、グループ３のプライマーセットを用いた定量的ＰＣＲ結果をサンプル別に示すものである。
図８〜図１６に示すように、本発明のプライマーセット（グループ１〜グループ３）を用いた場合、強直性脊椎炎患者で特異的にＰＣＲ産物を作り出すことが明確に分かる。
結論として、本発明のプライマーセットを用いて強直性脊椎炎患者を早期に診断することが可能になる。
本発明の強直性脊椎炎診断用プライマーセット及び強直性脊椎炎診断用バイオマーカーを用いた診断方法は、強直性脊椎炎の早期診断を可能にするだけでなく、強直性脊椎炎の経過追跡及び予後判定に効果的に利用され得ることが期待される。
Claims (14)
- 強直性脊椎炎診断用プライマーセットであって、
（ａ）配列番号７で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーと、及び
（ｂ）配列番号９〜配列番号１３で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーとを備えてなる、プライマーセット。 - 強直性脊椎炎診断用プライマーセットであって、
（ａ）配列番号１５〜１７で表されるプライマーからなる群より選択された１つ又は２つ以上のフォワードプライマーと、及び
（ｂ）配列番号１９で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するリバースプライマーとを備えてなる、プライマーセット。 - 強直性脊椎炎診断用プライマーセットであって、
（ａ）配列番号１８で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するフォワードプライマーと、及び
（ｂ）配列番号２０で表されるプライマーと９５％以上の配列相同性を有するリバースプライマーを備えてなる、プライマーセット。 - 強直性脊椎炎診断方法であって、
（ａ）患者の生物試料からｃＤＮＡを合成する段階と、
（ｂ）第１項〜第３項の何れか一項によるプライマーセットと８０％以上の配列相同性を有するプライマーセット、及び前記合成ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行う段階と、及び
(ｃ)前記ＰＣR 産物の塩基配列を確認する段階とを備えてなる、診断方法。 - 前記生物試料が、唾液（ｓａｌｉｖａ）、生検（ｂｉｏｐｓｙ）、血液、皮膚組織、液体培養物、糞便、及び小便からなる群より選択されるものである、請求項４に記載の方法。
- 前記生物試料が血液である、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
- 請求項１〜３の何れか一項に記載のプライマーセットと、８０％以上の配列相同性を有するプライマーセットを備えてなる、強直性脊椎炎診断キット。
- 配列番号２１の塩基配列の全部あるいは一部を備えてなる、強直性脊椎炎診断用バイオマーカー。
- 配列番号２１の塩基配列の全部あるいは一部を用いて強直性脊椎炎を診断する方法。
- （ａ）患者の生物試料からｃＤＮＡを合成する段階と、
（ｂ）第１項〜第３項の何れか一項によるプライマーセットと８０％以上の配列相同性を有するプライマーセット、及び前記合成ｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行う段階と、及び
(ｃ)配列番号２１の塩基配列の全部あるいは一部を含むＰＣＲ産物を確認する段階とをさらに含んでなる、請求項９に記載の方法。 - 前記生物試料が、唾液、生検、血液、皮膚組織、液体培養物、糞便、及び小便からなる群より選択されるものである、請求項１０に記載の方法。
- 前記生物試料が、血液である、請求項１１に記載の方法。
- 配列番号２１の塩基配列の全部あるいは一部を備えてなる、強直性脊椎炎診断キット。
- 前記塩基配列が、配列番号２１と８０％以上の配列相同性を有するものである 第１３項に記載の診断キット。
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