ES2619713T3 - Clonotipos de receptores de células T compartidos entre pacientes con espondilitis anquilosante - Google Patents

Abstract

Un método para determinar un estado de la enfermedad de un paciente que sufre, o es sospechoso de sufrir, espondilitis anquilosante, donde el método comprende las etapas de: (a) amplificar moléculas de ácido nucleico de las células T de una muestra obtenida del paciente, teniendo las moléculas de ácido nucleico secuencias de ADN recombinadas de genes de los receptores de las células T; (b) secuenciar las moléculas amplificadas de ácido nucleico para formar un perfil de clonotipos; (c) determinar a partir del perfil de clonotipos una presencia, una ausencia y/o un nivel de clonotipos codificantes de segmentos de un receptor de las células T al menos un setenta por ciento idéntico a un segmento en el grupo consistente en LCASSLEASGSSYNEQFFGPGTRLTV (SEC. Nº ID. 1) y VYFCASSDSSGSTDTQYFGPGTRLTV (SEC. Nº ID. 2); y (d) correlacionar la presencia, ausencia y/o nivel de dichos clonotipos con un estado de espondilitis anquilosante en el paciente.

Description

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relacionadas; y Sidhu, editor, PhageDisplay in Biotechnology and Drug Discovery (CRC Press, 2005); Lutz y Bornscheuer, Editores, Protein Engineering Handbook (Wiley-VCH, 2009); y similares.

Una vez se ha obtenido un anticuerpo terapéutico, éste puede ser sometido de nuevo a ingeniería y/o fabricado y formulado para tratar a humanos usando métodos conocidos en la técnica, v.g., como se desvela en las patentes estadounidenses 7.892.550 y 8.030.023. Normalmente, un anticuerpo terapéutico es un anticuerpo aislado de la invención que se incluye en una formulación terapéutica. En un aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de la espondilitis anquilosante en un sujeto, consistiendo dicho método en administrar al sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención, mediante lo cual se trata dicha afección. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de la espondilitis anquilosante.

Se preparan formulaciones terapéuticas que contienen un anticuerpo de la invención para almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con soportes fisiológicamente aceptables, excipientes o estabilizadores eventuales (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de soluciones acuosas, formulaciones liofilizadas u otras formulaciones desecadas. Los soportes, excipientes

o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenes, tales como metil-o propilparabén; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparraguina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (v.g., complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

La formulación puede contener también aquí más de un compuesto activo, según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferiblemente los que tienen actividades complementarias y que no tienen efectos adversos entre sí. Dichas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el fin pretendido.

Los principios activos pueden también estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas están desveladas en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol,

A. Ed. (1980).

Las formulaciones para uso en administración in vivo deben ser estériles. Se consigue esto fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Como ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida, se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, estando estas matrices en forma de artículos dotados de forma, v.g., películas o microcápsulas. Como ejemplos de matrices de liberación mantenida, se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilo-metacrilato) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Patente Estadounidense Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y -etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, para dar lugar a una pérdida de actividad biológica y a posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio tío-disulfuro, se puede conseguir la estabilización modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos antes descritos. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto de envase sobre o asociado al recipiente. Como recipientes adecuados, se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados con una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es por sí misma, o cuando se

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combina con otra composición, efectiva para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección, y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un principio activo en la composición es un anticuerpo de la invención. De manera alternativa o adicional, el artículo de fabricación puede además incluir un segundo recipiente que contenga un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfatos, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede también incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Amplificación de poblaciones de ácidos nucleicos para perfiles de clonotipos

Se pueden generar amplicones de poblaciones diana de ácidos nucleicos mediante una variedad de técnicas de amplificación. En un aspecto de la invención, se usa PCR múltiple para amplificar miembros de una mezcla de ácidos nucleicos, en particular mezclas consistentes en moléculas inmunes recombinadas, tales como receptores de las células T o porciones de los mismos. Se encuentran directrices para llevar a cabo PCR múltiple de dichas moléculas inmunes en las siguientes referencias: Morley, patente estadounidense 5.296.351; Gorski, patente estadounidense 5.837.447; Dau, patente estadounidense 6.087.096; Von Dongen et al., publicación de patente estadounidense 2006/0234234; publicación de patente europea EP 1544308B1; y similares.

Tras amplificación del ADN a partir del genoma (o amplificación de ácido nucleico en forma de ADNc por transcripción inversa de ARN), se pueden aislar y eventualmente reamplificar las moléculas de ácido nucleico individuales, y secuenciar luego individualmente. Se pueden encontrar ejemplos de protocolos de amplificación en van Dongen et al., Leukemia, 17: 2257-2317 (2003), o van Dongen et al., publicación de patente estadounidense 2006/0234234. Resumiendo, un protocolo ejemplar es el siguiente:

Tampón de reacción: ABI Buffer II o ABI Gold Buffer (Life Technologies, San Diego, CA); volumen de reacción final 50 l; muestra de 100 ng de ADN; 10 pmol de cada cebador (sujeto a ajustes para equilibrar la amplificación como se describe más adelante); dNTP a 200 M de concentración final; MgCl2 a 1,5 mM de concentración final (sujeto a optimización dependiendo de las secuencias diana y de la polimerasa); polimerasa Taq (1-2 U/tubo); condiciones de ciclo: preactivación 7 min. a 95°C; hibridación a 60°C; tiempos de ciclo: 30 s desnaturalización; 30 s hibridación; 30 s extensión. Las polimerasas que se pueden emplear para la amplificación en los métodos de la invención están comercializadas e incluyen, por ejemplo, la polimerasa Taq, la polimerasa AccuPrime o Pfu. La elección de la polimerasa que se ha de utilizar puede basarse en si se prefiere fidelidad o eficacia.

Se pueden usar PCR en tiempo real, tinción PicoGreen, electroforesis nanofluida (v.g. LabChip) o mediciones de absorción UV en una etapa inicial para juzgar la cantidad funcional de material amplificable.

En un aspecto, se realizan amplificaciones múltiplex de tal forma que las cantidades relativas de secuencias en una población de partida sean substancialmente las mismas que las de la población amplificada, o amplicón. Es decir, se llevan a cabo múltiples amplificaciones con un sesgo mínimo de amplificación entre las secuencias miembro de una población de muestras. En una realización, dichas cantidades relativas son substancialmente las mismas si cada cantidad relativa en un amplicón está dentro de cinco veces su valor en la muestra de partida. En otra realización, dichas cantidades relativas son substancialmente las mismas si cada cantidad relativa en un amplicón está dentro de dos veces su valor en la muestra de partida. Tal como se discute más completamente a continuación, el sesgo de amplificación en la PCR puede ser detectado y corregido usando técnicas convencionales, de tal manera que se puede seleccionar un conjunto de cebadores de PCR para un repertorio predeterminado que proporcionen una amplificación sin sesgo de cualquier muestra.

Con respecto a muchos repertorios basados en secuencias de TCR o BCR, una amplificación múltiple usa eventualmente todos los segmentos V. Se optimiza la reacción para intentar conseguir una amplificación que mantenga la abundancia relativa de las secuencias amplificadas por diferentes cebadores de segmentos V. Algunos de los cebadores están relacionados, por lo que muchos de los cebadores pueden "interaccionar", amplificando plantillas que no están perfectamente emparejadas con ella. Se optimizan las condiciones de tal forma que cada plantilla puede ser amplificada de un modo similar independientemente de qué cebador la amplificó. En otras palabras, si hay dos plantillas, entonces, tras una amplificación de 1.000 veces, ambas plantillas pueden ser amplificadas aproximadamente 1.000 veces, y no importa que para una de las plantillas la mitad de los productos amplificados llevaran un cebador diferente debido a la interacción. En un análisis ulterior de los datos de secuenciación, se elimina la secuencia cebadora del análisis, por lo que no importa qué cebador se use en la amplificación siempre que las plantillas se amplifiquen de igual modo.

En una realización, se puede evitar el sesgo de amplificación realizando una amplificación en dos fases (como se describe en Faham y Willis, antes citado), donde se implementan un pequeño número de ciclos de amplificación en una etapa primera, o primaria, usando cebadores que tienen colas no complementarias con respecto a las secuencias diana. Las colas incluyen sitios de unión de cebadores que se añaden a los extremos de las secuencias del amplicón primario, de tal forma que dichos sitios son usados en una amplificación de segunda etapa usando sólo un único cebador hacia delante y un único cebador inverso, eliminando así una causa primaria de sesgo de

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amplificación. Preferiblemente, la PCR primaria tendrá un número suficientemente pequeño de ciclos (v.g. 5-10) para minimizar la amplificación diferencial por los diferentes cebadores. Se realiza la amplificación secundaria con un par de cebadores y por ello el problema de la amplificación diferencial es mínimo. Se lleva un uno por ciento de la PCR primaria directamente a la PCR secundaria. Treinta y cinco ciclos (equivalentes a 28 ciclos sin la etapa de dilución de 100 veces) usados entre las dos amplificaciones fueron suficientes para mostrar una sólida amplificación independientemente de si la descomposición de ciclos fue: un ciclo primario y 34 secundarios o 25 primarios y 10 secundarios. Incluso aunque de manera ideal la realización de sólo 1 ciclo en la PCR primaria pueda disminuir el sesgo de amplificación, existen otras consideraciones. Un aspecto de esto es la representación. Ésta juega un papel cuando la cantidad de entrada de partida no está en exceso con respecto al número de lecturas finalmente obtenidas. Por ejemplo, si se obtienen 1.000.000 de lecturas y se parte de 1.000.000 de moléculas de entrada y tomando luego sólo representación a partir de 100.000 moléculas para la amplificación secundaria, se degradaría la precisión de la estimación de la abundancia relativa de las diferentes especies en la muestra original. La dilución de 100 veces entre las dos etapas significa que la representación se reduce, a menos que la amplificación por PCR primaria generara significativamente más de 100 moléculas. Esto indica que se pueden usar un mínimo de 8 ciclos (256 veces), pero más confortablemente 10 ciclos (1.000 veces). La alternativa a ello es llevar más de un 1% de la PCR primaria a la secundaria, pero, debido a la gran concentración de cebador usada en la PCR primaria, se puede usar un gran factor de dilución para asegurarse de que estos cebadores no interfieran en la amplificación y no empeoren el sesgo de amplificación entre secuencias. Otra alternativa es añadir una etapa de purificación o enzimática para eliminar los cebadores de la PCR primaria y permitir una dilución más pequeña de ella. En este ejemplo, la PCR primaria tuvo 10 ciclos y la secundaria 25 ciclos.

Generación de lecturas de secuencias para clonotipos

Se puede usar cualquier técnica de alto rendimiento para secuenciar ácidos nucleicos en el método de la invención. Preferiblemente, dicha técnica tiene una capacidad de generar de un modo efectivo en cuanto a costes un volumen de datos de secuencias del que se pueden determinar al menos 1.000 clonotipos, y preferiblemente del que se pueden determinar al menos de 10.000 a 1.000.000 de clonotipos. Las técnicas de secuenciación de ADN incluyen reacciones de secuenciación didesoxi clásicas (método de Sanger) usando finalizadores o cebadores marcados y separación en gel en capas o capilar, secuenciación por síntesis usando nucleótidos marcados reversiblemente terminados, pirosecuenciación, secuenciación 454, hibridación específica de alelos con una genoteca de sondas oligonucleotídicas marcadas, secuenciación por síntesis usando hibridación específica de alelos con una genoteca de clones marcados seguida de ligación, monitorización en tiempo real de la incorporación de nucleótidos marcados durante una etapa de polimerización, secuenciación “polony” y secuenciación SOLiD. Se ha demostrado más recientemente la secuenciación de las moléculas separadas por reacciones de extensión secuenciales o únicas usando polimerasas o ligasas, así como por hibridaciones diferenciales únicas o secuenciales con genotecas de sondas. Estas reacciones han sido realizadas sobre muchas secuencias clonales en paralelo, incluyendo demostraciones en aplicaciones comerciales actuales de más de 100 millones de secuencias en paralelo. Estos enfoques de secuenciación pueden, por lo tanto, ser utilizados para estudiar el repertorio de receptores de células T (TCR) y/o de receptores de células B (BCR). En un aspecto de la invención, se emplean métodos de alto rendimiento de secuenciación que comprenden una etapa de aislamiento espacial de moléculas individuales sobre una superficie sólida, donde se secuencian en paralelo. Dichas superficies sólidas pueden incluir superficies no porosas (tales como en la secuenciación Solexa, v.g., Bentley et al., Nature, 456: 53-59 (2008), o la secuenciación Complete Genomics, v.g., Drmanac et al., Science, 327: 78-81 (2010)), matrices de pocillos, que pueden incluir plantillas unidas a perlas o a partículas (tales como con 454, v.g., Margulies et al., Nature, 437: 376-380 (2005), o la secuenciación Ion Torrent, publicación de patente estadounidense 2010/0137143 o 2010/0304982), membranas microfabricadas (tales como con la secuenciación SMRT, v.g., Eid et al., Science, 323: 133-138 (2009)), o matrices de perlas (como con la secuenciación SOLiD o la secuenciación polony, v.g., Kim et al., Science, 316: 1481-1414 (2007)). En otro aspecto, dichos métodos comprenden la amplificación de las moléculas aisladas antes o después de aislarlas espacialmente sobre una superficie sólida. La amplificación previa puede incluir una amplificación basada en emulsión, tal como PCR en emulsión, o amplificación en círculo rodante. Es de particular interés la secuenciación basada en Solexa, donde se aíslan espacialmente moléculas de plantilla individuales sobre una superficie sólida, después de lo cual se amplifican en paralelo por PCR puente para formar poblaciones clonales separadas, o grupos, y se secuencian luego, como se describe en Bentley et al. (antes citado) y en las instrucciones del fabricante (v.g. TruSeq™ Sample Preparation Kit y Data Sheet, Illumina, Inc., San Diego, CA, 2010), y también en las siguientes referencias: patentes estadounidenses 6.090.592, 6.300.070, 7.115.400 y EP0972081B1. En una realización, las moléculas individuales dispuestas y amplificadas sobre una superficie sólida forman grupos en una densidad de al menos 105 grupos por cm2; o en una densidad de al menos 5x105 por cm2; o en una densidad de al menos 106 grupos por cm2. En una realización, se emplean químicas de secuenciación que tienen índices de error relativamente altos. En dichas realizaciones, las puntuaciones medias de calidad producidas por dichas químicas son funciones monotónicamente declinantes de longitudes de lectura de secuencias. En una realización, dicha declinación corresponde a que un 0,5 por ciento de lecturas de secuencias tienen al menos un error en las posiciones 1-75; un 1 por ciento de lecturas de secuencias tienen al menos un error en las posiciones 76-100; y un 2 por ciento de lecturas de secuencias tienen al menos un error en las posiciones 101-125.

En un aspecto, se obtiene un perfil de clonotipos basado en secuencia de un individuo usando las siguientes etapas:

(a) obtener una muestra de ácido nucleico de las células T y/o de las células B del individuo; (b) aislar espacialmente

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las moléculas individuales derivadas de dicha muestra de ácido nucleico, incluyendo las moléculas individuales al menos una plantilla generada a partir de un ácido nucleico en la muestra, donde dicha plantilla tiene una región somáticamente redispuesta o una porción de la misma, siendo capaz cada molécula individual de producir al menos una lectura de secuencia; (c) secuenciar dichas moléculas individuales espacialmente aisladas, y (d) determinar las abundancias de diferentes secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la muestra de ácido nucleico para generar el perfil de clonotipos. En una realización, cada una de las regiones somáticamente redispuestas comprende una región V y una región J. En otra realización, la etapa de secuenciación comprende la secuenciación bidireccional de cada una de las moléculas individuales espacialmente aisladas para producir al menos una lectura de secuencia hacia delante y al menos una lectura de secuencia inversa. Además con respecto a esta última realización, al menos una de las lecturas de secuencia hacia delante y al menos una de las lecturas de secuencia inversas tienen una región de solapamiento, de tal modo que las bases de dicha región de solapamiento son determinadas por una relación complementaria inversa entre dichas lecturas de secuencia. En aún otra realización, cada una de las regiones somáticamente redispuestas comprende una región V y una región J, y la etapa de secuenciación incluye además la determinación de una secuencia de cada una de las moléculas de ácido nucleico individuales a partir de una o más de sus lecturas de secuencia hacia delante y al menos una lectura de secuencia inversa partiendo de una posición en una región J y extendiéndose en la dirección de su región V asociada. En otra realización, la etapa de secuenciación incluye la generación de las lecturas de secuencia que tienen puntuaciones de calidad monotónicamente decrecientes. Además con respecto a esta última realización, las puntuaciones de calidad monotónicamente decrecientes son tales que las lecturas de secuencia tienen índices de error no mejores que los siguientes: un 0,2 por ciento de las lecturas de secuencia contienen al menos un error en las posiciones de bases 1 a 50, de un 0,2 a un 1,0 por ciento de las lecturas de secuencia contienen al menos un error en las posiciones 51-75, de un 0,5 a un 1,5 por ciento de las lecturas de secuencia contienen al menos un error en las posiciones 76-100. En otra realización, el método anterior comprende las siguientes etapas: (a) obtener una muestra de ácido nucleico de las células T del individuo; (b) aislar espacialmente las moléculas individuales derivadas de dicha muestra de ácido nucleico, teniendo las moléculas individuales conjuntos anidados de plantillas generadas cada una de ellas a partir de un ácido nucleico en la muestra y conteniendo cada una una región somáticamente redispuesta o una porción de la misma, siendo capaz cada conjunto anidado de producir una pluralidad de lecturas de secuencia que se extienden cada una en la misma dirección y que parten cada una de una posición diferente en el ácido nucleico del que se generó el conjunto anidado; (c) secuenciar dichas moléculas individuales espacialmente aisladas; y (d) determinar las abundancias de diferentes secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la muestra de ácido nucleico para generar el perfil de clonotipos. En una realización, la etapa de secuenciación incluye la producción de una pluralidad de lecturas de secuencia para cada uno de los conjuntos anidados. En otra realización, cada una de las regiones somáticamente redispuestas comprende una región V y una región J, y cada una de la pluralidad de lecturas de secuencia parte de una posición diferente en la región V y se extiende en la dirección de su región J asociada.

Determinación de clonotipos a partir de los datos de secuencia

La construcción de clonotipos a partir de los datos de lectura de secuencias depende en parte del método de secuenciación usado para generar dichos datos, ya que los diferentes métodos tienen diferentes longitudes de lectura esperadas y diferente calidad de datos. En un enfoque, se emplea un secuenciador Solexa para generar datos de lectura de secuencias para análisis, como se describe en Faham y Willis (antes citado). En una realización, se obtiene una muestra que proporciona al menos 0,5-1,0x106 linfocitos para producir al menos 1 millón de moléculas de plantilla, las cuales, tras una amplificación eventual, pueden producir un millón o más correspondientes de poblaciones clonales de moléculas (o grupos) de plantilla. Para la mayoría de los enfoques de secuenciación de alto rendimiento, incluyendo el enfoque Solexa, es deseable dicho sobremuestreo a nivel de grupos, de tal forma que cada secuencia de plantilla es determinada con un gran grado de redundancia para aumentar la precisión de la determinación de secuencias. Para las implementaciones basadas en Solexa, preferiblemente se determina la secuencia de cada plantilla independiente 10 veces o más. Para otros enfoques de secuenciación con diferentes longitudes de lectura esperadas y diferente calidad de datos, se pueden usar diferentes niveles de redundancia para una precisión comparable de la determinación de secuencia. Quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica reconocen que los anteriores parámetros, v.g., tamaño de la muestra, redundancia y similares, son elecciones de diseño relacionadas con aplicaciones particulares.

En un aspecto de la invención, se pueden determinar las secuencias de clonotipos combinando información de una

o más lecturas de secuencias, por ejemplo, a lo largo de las regiones V(D)J de las cadenas seleccionadas. En otro aspecto, se determinan las secuencias de clonotipos combinando información de una pluralidad de lecturas de secuencias. Dichas pluralidades de lecturas de secuencias pueden incluir una o más lecturas de secuencias a lo largo de una hebra sentido (es decir, lecturas de secuencias "hacia delante") y una o más lecturas de secuencias a lo largo de su hebra complementaria (es decir, lecturas de secuencias "inversas"). Cuando se generan múltiples lecturas de secuencias a lo largo de la misma hebra, se generan primeramente plantillas separadas amplificando las moléculas de la muestra con cebadores seleccionados para las diferentes posiciones de las lecturas de secuencias. Dichas amplificaciones pueden ser llevadas a cabo en la misma reacción o en reacciones separadas. En un aspecto, siempre que se emplee PCR, se usan reacciones de amplificación separadas para generar las plantillas separadas, las cuales a su vez se combinan y se usan para generar múltiples lecturas de secuencia a lo largo de la misma hebra. Este último enfoque es preferible para evitar la necesidad de equilibrar las concentraciones de cebadores (y/u

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típicamente usada con el secuenciador Illumina, tal como se muestra en la FIG. 1C. Se usan dos cebadores que se hibridan con la parte más externa de la molécula, los cebadores Illumina P5 y P7, para la amplificación en fase sólida de la molécula (formación de grupos). Se hacen tres lecturas de secuencia por molécula. Se hace la primera lectura de 100 pb con el cebador C’, que tiene una temperatura de fusión que resulta apropiada para el proceso de secuenciación Illumina. La segunda lectura tiene una longitud de sólo 6 pb y tiene únicamente el fin de identificar el marcador de la muestra. Se genera usando un cebador de marcador proporcionado por el fabricante (Illumina). La lectura final es el cebador Read 2, también proporcionado por el fabricante (Illumina). Usando este cebador, se genera una lectura de 100 pb en el segmento V partiendo de la secuencia del cebador V de la PCR de 1 etapa.

Ejemplo

En este ejemplo, se generaron perfiles de clonotipos a partir de cada muestra de ARN de muestras de sangre tomadas de pacientes con EA e individuos de control como se indica más adelante. El método de generación de perfiles de clonotipos para TCR era esencialmente el descrito en Faham y Willis (antes citado). Después de una transcripción inversa y de una amplificación por PCR en dos etapas como se ha descrito anteriormente, se determinaron las secuencias de los amplicones resultantes en un secuenciador de ADN Illumina GA usando los protocolos sugeridos por el fabricante. Cada perfil de clonotipos comprendía aproximadamente 2x105 clonotipos construidos a partir de aproximadamente 1,3x106 lecturas de secuencia generadas por el secuenciador Illumina. Se analizaron los perfiles de clonotipos para detectar clonotipos o características de clonotipos que se compartían entre números significativos de las muestras de los pacientes con EA, pero no de los controles. Se descubrió que un número significativo de pacientes con EA compartían clonotipos que codificaban los siguientes segmentos peptídicos de TCR: LCASSLEASGSSYNEQFFGPGTRLTV (SEC. Nº ID. 1) y VYFCASSDSSGSTDTQYFGPGTRLTV (SEC. Nº ID. 2).

Se analizaron los perfiles de clonotipos de muestras de pacientes de control y con EA usando técnicas de minería de datos convencionales, v.g., Witten et al., Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques, Tercera Edición (Morgan Kaufman, 2011), con el objetivo de determinar si los pacientes con EA tenían clonotipos que codificaran unidades de secuencia de aminoácidos comunes. Se establecieron los conjuntos de muestras de pacientes con EA como sigue: (a) se implementó un entrenamiento sobre 56 pacientes positivos para HLA B27 (1 muestra/paciente); (b) se implementaron pruebas sobre 56 pacientes positivos para HLA B27 (1 muestra/paciente);

(c) se realizó la confirmación sobre 57 muestras de 16 pacientes (12 pacientes positivos para HLA B27, 2 pacientes negativos para HLA B27 y 2 pacientes con un tipo desconocido de HLA). Se establecieron los conjuntos de muestras de control como sigue: (a) se implementó un entrenamiento sobre 521 muestras de 120 pacientes con lupus y 25 individuos normales, y (b) se realizaron pruebas sobre 56 pacientes con lupus (1 muestra/paciente, con las muestras pareadas en cuanto a los recuentos de clonotipos con las muestras de ensayo de EA). Se sacaron las muestras de ensayo y de entrenamiento de pacientes con lupus del mismo conjunto de muestras, pero no contenían pacientes solapantes. El procedimiento de entrenamiento examinó una secuencia de 26 aminoácidos que abarcaba la región CDR3 de TCR para determinar las secuencias de aminoácidos compartidas (es decir, clones funcionales putativos) codificadas por clonotipos de pacientes con EA, pero no de controles. Se encontraron 374 clonotipos funcionales putativos compartidos por al menos 28 muestras de entrenamiento de EA. La búsqueda de estos clonotipos en el conjunto de entrenamiento de control encontró (a) 1 secuencia altamente específica (péptido 1) (observada en un 5% de las muestras de control y en un 12% de los individuos de control), (b) 1 secuencia moderadamente específica (péptido 2) (observada en un 15% de las muestras de control y en un 27% de los individuos de control) y (c) el resto de las secuencias fueron observadas en >18% de las muestras de control y en >37% de los individuos de control. En el conjunto de ensayo, el péptido 1 estaba presente en 21/56 muestras de ensayo de EA, frente a 4/56 muestras de control (valor de p < 10-4) y el péptido 2 estaba presente en 29/56 muestras de ensayo de EA, frente a 13/56 muestras de control (valor de p < 10-3). En el conjunto de confirmación, el péptido 1 estaba presente en 14 muestras de 6 pacientes, incluyendo 1 paciente positivo a B27, y el péptido 2 estaba presente en 36 muestras de 10 pacientes, incluyendo a ambos pacientes positivos a B27.

Definiciones

A menos que se defina aquí específicamente de otro modo, los términos y símbolos de la química de ácidos nucleicos, la bioquímica, la genética y la biología molecular usados en el presente documento siguen los de los tratados y textos estándar en el campo, v.g., Kornberg y Baker, DNA Replication, Segunda Edición (W.H. Freeman, New York, 1992); Lehninger, Biochemistry, Segunda Edición (Worth Publishers, New York, 1975); Strachan y Read, Human Molecular Genetics, Segunda Edición (Wiley-Liss, New York, 1999); Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6ª edición (Saunders, 2007).

"Alineación" significa un método de comparación de una secuencia de ensayo, tal como una lectura de secuencia, con una o más secuencias de referencia para determinar qué secuencia de referencia o qué porción de una secuencia de referencia está más próximamente basada en alguna medida de distancia de secuencia. Un método ejemplar de alineación de secuencias de nucleótidos es el algoritmo Smith Waterman. Las medidas de distancia pueden incluir la distancia Hamming, la distancia Levenshtein o similares. Las medidas de distancia pueden incluir un componente relacionado con los valores de calidad de los nucleótidos de las secuencias que se estén comparando.

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componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo será purificado (1) hasta más de un 95% en peso de anticuerpo, según se determina por el método Lowry, y más preferiblemente hasta más de un 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminales o internos mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado por al menos una etapa de purificación.

"Clonalidad", tal como se usa aquí, significa una medida del grado al cual se desvía la distribución de las abundancias de clonotipos entre los clonotipos de un repertorio hacia un solo o unos cuantos clonotipos. A grosso modo, la clonalidad es una medida inversa de la diversidad de clonotipos. Se dispone de muchas medidas o estadísticas en ecología que describen las relaciones especie-abundancia que pueden ser empleadas para las medidas de clonalidad según la invención, v.g., Capítulos 17 y 18, en Pielou, An Introduction to Mathematical Ecology, (Wiley-Interscience, 1969). En un aspecto, una medida de clonalidad usada en la invención es una función de un perfil de clonotipos (es decir, el número de distintos clonotipos detectados y sus abundancias), de tal forma que, después de medir un perfil de clonotipos, se puede computar la clonalidad a partir de él para obtener un solo número. Una medida de clonalidad es la medida de Simpson, que es simplemente la probabilidad de que dos clonotipos sacados al azar sean el mismo. Otras medidas de clonalidad incluyen medidas basadas en información y el índice de diversidad de McIntosh, desvelado en Pielou (antes citado).

"Clonotipo" significa una secuencia nucleotídica recombinada de una célula T que codifica un receptor de las células T (TCR), o una porción del mismo. En un aspecto, una colección de todos los distintos clonotipos de una población de linfocitos de un individuo es un repertorio de dicha población, v.g., Arstila et al., Science, 286: 958-961 (1999); Yassai et al., Immunogenetics, 61: 493-502 (2009); Kedzierska et al., Mol. Immunol., 45(3): 607-618 (2008); y similares. Tal como se usa aquí, "perfil de clonotipos" o "perfil de repertorio" es una tabulación de los clonotipos de una muestra de células T (tal como una muestra de sangre periférica que contiene dichas células) que incluye substancialmente todos los clonotipos del repertorio y sus abundancias relativas. En un aspecto de la invención, un clonotipo comprende un ácido nucleico que codifica una porción de una cadena TCR.

"Coalescer" significa tratar dos clonotipos candidatos con diferencias de secuencia como si fueran el mismo determinando que dichas diferencias son debidas a un error experimental o de medición y no a diferencias biológicas genuinas. En un aspecto, se compara una secuencia de un clonotipo candidato de mayor frecuencia con la de un clonotipo candidato de menor frecuencia y, si se satisfacen criterios predeterminados, entonces se añade el número de clonotipos candidatos de menor frecuencia al del clonotipo candidato de mayor frecuencia y se desecha a continuación el clonotipo candidato de menor frecuencia. Es decir, se añaden los recuentos de lectura asociados al clonotipo candidato de menor frecuencia a los del clonotipo candidato de mayor frecuencia.

"Regiones determinantes de complementariedad" (CDR) significa regiones de una inmunoglobulina (es decir, anticuerpo) o receptor de células T donde la molécula complementa la conformación de un antígeno, determinando así la especificidad de la molécula y el contacto con un antígeno específico. Los receptores de las células T y las inmunoglobulinas tienen cada uno tres CDR: CDR1 y CDR2 se encuentran en el dominio variable (V) y CDR3 incluye algunos dominios de V, todos los diversos (D) (sólo cadenas pesadas) y de la unión (J) y algunos de los constantes (C).

"Cantidad efectiva" significa una cantidad suficiente para mejorar un síntoma de una afección autoinmune. La cantidad efectiva para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como el estado de la afección autoinmune que se esté tratando, la salud general del paciente, el método de administración, la severidad de los efectos colaterales y similares. En general, se administra un anticuerpo terapéutico específico para un péptido relacionado con la EA como una composición farmacéutica que tiene una cantidad efectiva de dicho anticuerpo y un soporte farmacéutico. Un soporte farmacéutico puede ser cualquier substancia no tóxica compatible adecuada para administrar las composiciones de la invención a un paciente. En general, las composiciones útiles para administración parenteral de dichos fármacos son bien conocidas, v.g., Remington’s Pharmaceutical Science, 15ª Ed. (Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1980). De manera alternativa, se pueden introducir las composiciones de la invención en el organismo de un paciente mediante un sistema de administración de fármacos implantable o inyectable, v.g., Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, págs. 199-236 (1984); Lewis, ed. Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); Patente Estadounidense Nº 3.773.919; Patente Estadounidense Nº 3.270.960; y similares.

"Por ciento homólogo", "por ciento idéntico" o términos similares usados en relación a la comparación de una secuencia de referencia y otra secuencia ("secuencia de comparación") significan que en una alineación óptima entre las dos secuencias, la secuencia de comparación es idéntica a la secuencia de referencia en un número de posiciones subunitarias equivalentes al porcentaje indicado, siendo las subunidades nucleótidos para las comparaciones de polinucleótidos o aminoácidos para las comparaciones de polipéptidos. Tal como se usa aquí,

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estudiados por separado o conjuntamente con una secuencia diana. La secuencia de referencia puede ser endógena o exógena a una muestra o espécimen, y en este último caso puede incluir una o más plantillas competidoras. Como secuencias de referencia endógenas típicas, se incluyen segmentos de transcriptos de los siguientes genes: -actina, GAPDH, 2-microglobulina, ARN ribosomal y similares. Las técnicas para la PCR cuantitativa son bien conocidas para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica, según se ejemplifica en las siguientes referencias: Freeman et al., Biotechniques, 26: 112-126 (1999); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989); Zimmerman et al., Biotechniques, 21: 268-279 (1996); Diviacco et al., Gene, 122: 3013-3020 (1992); Becker-Andre et al., Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989); y similares.

"Cebador" significa un oligonucleótido, ya sea natural o sintético, que es capaz, al formar un dúplex con una plantilla de polinucleótido, de actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ácidos nucleicos y de extenderse desde su extremo 3’ a lo largo de la plantilla, de tal modo que se forma un dúplex extendido. La extensión de un cebador es normalmente llevada a cabo con una ácido nucleico polimerasa, tal como una ADN o ARN polimerasa. Se determina la secuencia de nucleótidos añadidos en el proceso de extensión por la secuencia del polinucleótido de plantilla. Normalmente, los cebadores son extendidos por una ADN polimerasa. Los cebadores normalmente tienen una longitud de 14 a 40 nucleótidos, o de 18 a 36 nucleótidos. Los cebadores son empleados en una variedad de reacciones de amplificación nucleica, por ejemplo, reacciones de amplificación lineal usando un solo cebador, o reacciones en cadena de polimerasa, empleando dos o más cebadores. Las directrices para seleccionar las longitudes y las secuencias de cebadores para aplicaciones particulares son bien conocidas para quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica, como evidencian las siguientes referencias: Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2ª Edición (Cold Spring Harbor Press, New York, 2003).

"Puntuación de calidad" significa una medida de la probabilidad de que una asignación de bases en una localización de secuencia particular sea correcta. Una variedad de métodos son bien conocidos para quienes tienen conocimientos ordinarios para el cálculo de las puntuaciones de calidad para circunstancias particulares, tales como para bases identificadas como resultado de diferentes químicas de secuenciación, sistemas de detección, algoritmos de identificación de bases, etc. En general, los valores de las puntuaciones de calidad se relacionan monotónicamente con las probabilidades de una correcta identificación de bases. Por ejemplo, una puntuación de calidad, o Q, de 10 puede significar que hay un 90 por ciento de probabilidad de que una base sea identificada correctamente, una Q de 20 puede significar que hay un 99 por ciento de probabilidad de que una base sea identificada correctamente, etc. Para algunas plataformas de secuenciación, particularmente para las que usan químicas de secuenciación por síntesis, las puntuaciones medias de calidad disminuyen en función de la longitud de lectura de secuencia, de tal modo que las puntuaciones de calidad al comienzo de una lectura de secuencia son mayores que las del final de una lectura de secuencia, siendo debidas dichas disminuciones a fenómenos tales como extensiones incompletas, extensiones hacia delante, pérdida de plantilla, pérdida de polimerasa, fallos de terminación, fallos de desprotección y similares.

"Repertorio" o "repertorio inmune" o "repertorio de receptores inmunes" significa un conjunto de distintas secuencias nucleotídicas recombinadas, o clonotipos, que codifican receptores de las células T (TCR) o fragmentos de los mismos en una población de linfocitos de un individuo. Las poblaciones de linfocitos de los que se determina un repertorio pueden ser tomadas de diferentes muestras de tejidos, para producir diferentes repertorios inmunes. En algunos aspectos de la invención, la población de linfocitos correspondientes a un repertorio puede ser de células T circulantes, o puede tratarse de subpoblaciones de las anteriores poblaciones, incluyendo, aunque sin limitación, células T CD4+, o células T CD8+, u otras subpoblaciones definidas por marcadores de la superficie celular, o similares. Dichas subpoblaciones pueden ser adquiridas tomando muestras de tejidos particulares, v.g., médula ósea o ganglios linfáticos o similares, o clasificando o enriqueciendo las células de una muestra (tal como sangre periférica) en base a uno o más marcadores de la superficie celular, al tamaño, a la morfología o similares. En aún otros aspectos, la población de linfocitos correspondientes a un repertorio puede derivar de tejidos enfermos, tales como un tejido tumoral, un tejido infectado o similares. En una realización, un repertorio que comprende cadenas TCR humanas o fragmentos de las mismas comprende un número de distintas secuencias nucleotídicas en el rango de 0,1 x 106 a 1,8 x 106, o en el rango de 0,5 x 106 a 1,5 x 106, o en el rango de 0,8 x 106 a 1,2 x 106. En una realización particular, un repertorio de la invención comprende un conjunto de secuencias nucleotídicas codificantes substancialmente de todos los segmentos de la región V(D)J de la cadena TCR. En un aspecto, "substancialmente todos", tal como se usa aquí, significa cada segmento que tiene una abundancia relativa del 0,001 por ciento o superior; o en otro aspecto, "substancialmente todos", tal como se usa aquí, significa cada segmento que tiene una abundancia relativa del 0,0001 por ciento o superior. En otra realización, un repertorio de la invención comprende un conjunto de secuencias nucleotídicas que tienen longitudes en el rango de 25-200 nucleótidos y que incluyen segmentos de las regiones V, D y J de una cadena TCR. En otra realización, un repertorio de la invención comprende un número de distintas secuencias nucleotídicas que es substancialmente equivalente al número de linfocitos que expresan una cadena TCR distinta. En aún otra realización, "substancialmente equivalentes" significa que, con una probabilidad del noventa y nueve por ciento, un repertorio de secuencias nucleotídicas incluirá una secuencia nucleotídica codificante de una TCR o porción de la misma llevada o expresada por cada linfocito de una población de un individuo a una frecuencia del 0,001 por ciento o superior. En aún otra realización, "substancialmente equivalentes" significa que, con una probabilidad del noventa y nueve por ciento, un repertorio de secuencias nucleotídicas incluirá una secuencia nucleotídica codificante de una TCR o porción de la misma llevada

Claims (1)

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