ES2829619T3 - Marcadores para predecir la resistencia a lactona macrocíclica en Dirofilaria immitis, el agente causante de la enfermedad de gusano del corazón - Google Patents

Abstract

Un método para determinar el genotipo de un nematodo de Dirofilaria immitis, método que comprende: a) poner en contacto una molécula de ácido nucleico de Dirofilaria immitis con al menos un oligonucleótido que tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos de SEQ ID NO: 118 o un complemento inverso del mismo; donde el al menos un oligonucleótido incluye el sitio polimórfico de la posición 151 de SEQ ID NO: 118; donde el al menos un oligonucleótido incluye además una marca detectable; y b) detectar un nucleótido alternativo en la posición 151 de SEQ ID NO: 118 en la molécula de ácido nucleico de nematodo de Dirofilaria immitis.

Description

DESCRIPCIÓN

Marcadores para predecir la resistencia a lactona macrocíclica en Dirofilaria immitis, el agente causante de la enfermedad de gusano del corazón

Campo

En la presente memoria se describe la genética relativa a la resistencia a endectocida de lactona macrocíclica (ML) en parásitos nematodos (p.ej., Dirofilaria immitis). Se describen los polimorfismos de nucleótido individual dentro del genoma de D. immitis que, por si solos o en combinación, se correlacionan con una capacidad de respuesta reducida de los parásitos a MLs. También se describen métodos para la detección de dichos parásitos, métodos para el tratamiento de dichos parásitos y métodos y kits para la determinación de la capacidad de respuesta de dichos parásitos frente a MLs.

Antecedentes

La dirofilariasis es una enfermedad parasitaria de animales y ocasionalmente de humanos, que puede ser resultado de una infección con una especie de Dirofilaria tal como D. immitis, D. repens, D. tenuis, D. ursi, D. subdermata, D. lutrae, D. striata y D spectans.

La Dirofilaria immitis (gusano del corazón) es un nematodo parasitario que habitualmente infecta a perros, zorros, lobos, coyotes y gatos. Los gusanos del corazón pueden producir daños vasculares graves y pueden ser fatales, especialmente en animales altamente activos.

El ciclo vital de D. immitis es bien conocido (revisado en McCall et al., Adv. Parasitol. 66: 193-285, 2008). Resumidamente, un mosquito puede infectarse cuando extrae sangre de un hospedante infectado (p.ej., un perro). En el mosquito, se desarrollan microfilarias (mf) en estado larval infectivo. Cuando el mosquito infectado se alimenta, puede transmitir las larvas a un nuevo hospedante (p.ej., otro perro). En el nuevo hospedante, las larvas continúan su maduración durante entre ocho y diez semanas, tras lo cual se desplazan al lado derecho de los pulmones y a la arteria pulmonar, donde se hacen adultas. Los gusanos adultos se aparean y las hembras producen huevos, que se desarrollan en el útero como embriones delgados alargados (microfilarias) que son liberados al torrente sanguíneo. Un mosquito que absorbe las mf en circulación cuando extrae sangre del hospedante infectado inicia el ciclo nuevamente.

D. immitis puede encontrarse donde se encuentre su vector, el mosquito.

Generalmente, D. immitis puede encontrarse a nivel mundial, pero son muy comunes en áreas con climas suaves y cálidos.

Las lactonas macrocíclicas (MLs) se prescriben a menudo como agentes terapéuticos o profilácticos en el tratamiento de D. immitis en aplicaciones veterinarias. Los ejemplos de MLs incluyen ivermectina (IVM), milbemicina oxima (MO), moxidectina (MOX) y selamectina (SLM). Sin embargo, la resistencia a las MLs es habitual en una variedad de nematodos parasitarios y parece que se desarrolla en D. immitis. Se han descrito una serie de tests para la detección de resistencia antihelmíntica en nematodos de ganado bovino y equino, que incluyen el test de reducción de conteo de huevos fecales, el test de eclosión de huevos, el test de desarrollo larvario en microagar y tests moleculares basados en resistencia a bencimidazol (revisado en Coles et al., Veterinary Parasitology 136: 167-185, 2006). Prichard et al. (Patente Europea EP 0979278) describe una secuencia de P-glicoproteína en Haemonchus contortus que puede ser útil para el diagnóstico de resistencia a ML en nematodos parasitarios. Sin embargo, sigue existiendo una necesidad de métodos para detectar D. immitis (gusanos del corazón) que son resistentes a una ML.

Los documentos WO 2011/120165 y Bourguinat et al. 2011 (Veterinary Parasitology 176(4): 374-381) describen ambos un sitio polimórfico en D. immitis que se asocia a la capacidad de respuesta a una lactona macrocíclica.

Sumario

La invención queda definida por el alcance de las reivindicaciones anexas.

Se han descubierto variaciones genéticas (p.ej., SNPs) en los genomas de nematodos de Dirofilaria spp. que se relacionan una menor capacidad de respuesta de los nematodos a las lactonas macrocíclicas. En un ejemplo, el nematodo es Dirofilaria immitis (el agente del gusano del corazón en animales). En un ejemplo, las lactonas macrocíclicas son ivermectina, selamectina, milbemicina oxima o moxidectina.

Se describen métodos para determinar la capacidad de respuesta de un nematodo de Dirofilaria spp. frente a una lactona macrocíclica. En un ejemplo, el método implica determinar el genotipo del nematodo en un sitio polimórfico de una molécula de ácido nucleico que incluye una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 del nematodo. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico posee al menos un 80% de identidad de secuencia con respecto a una o más de las SEQ ID NOs: 1-127. En otros ejemplos, la molécula de ácido nucleico posee al menos un 90%, o al menos un 95%, de identidad de secuencia con respecto a una o más de las SEQ ID NOs: 1-127. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento que tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos de una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 e incluye el sitio polimórfico. En otro ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento que tiene una longitud de al menos 50 nucleótidos de una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 e incluye el sitio polimórfico. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento que tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos y que posee al menos un 95% de identidad de secuencia con respecto a una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 e incluye el sitio polimórfico.

En una realización del método, la presencia de un nucleótido alternativo en el sitio polimórfico de las moléculas indica que el nematodo probablemente es resistente a la lactona macrocíclica. En una realización, el método puede incluir aislar la molécula de ácido nucleico del nematodo, y opcionalmente purificar los ácidos nucleicos antes de determinar el genotipo del nematodo. En una realización del método, el genotipo del nematodo se determina mediante secuenciamiento de ADN, métodos basados en hibridación que incluyen oligonucleótidos específicos de alelos, análisis de microsistemas, métodos basados en enzimas, polimorfismo conformacional de cadena individual (SSCP), fusión de alta resolución (HRM) o estrategias basadas en PCR, RT-PCR o qRT-PCR.

Se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una o más de las SEQ ID NOs: 1-127. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico posee al menos un 80% de identidad de secuencia con respecto a una o más de las SEQ ID NOs: 1-127. En otros ejemplos, la molécula de ácido nucleico posee al menos un 90% o al menos un 95% de identidad de secuencia con respecto a una o más de las SEQ ID NOs: 1-127. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento que tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos de una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 e incluye el sitio polimórfico. En otro ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento que tiene una longitud de al menos 50 nucleótidos de una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 e incluye el sitio polimórfico. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento que tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos y que posee al menos un 95% de identidad de secuencia con respecto a una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 e incluye el sitio polimórfico.

Se describen kits para determinar la capacidad de respuesta de un nematodo de Dirofilaria spp. a una lactona macrocíclica. En un ejemplo, el kit contiene una sonda capaz de determinar el genotipo del nematodo en un sitio polimórfico de una o más de las SEQ ID NOs: 1-127. La sonda puede ser un oligonucleótido, un cebador o un aptámero. Usando el kit, se puede determinar el genotipo del nematodo, por ejemplo, mediante secuenciamiento de ADN, métodos basados en hibridación que incluyen oligonucleótidos específicos de alelo, análisis de microsistema, métodos basados en enzimas, polimorfismo conformacional de cadena individual (SSCP), fusión de alta resolución (HRM) o estrategias basadas en PCR, RT-PCR o qRT-PCR.

Se describen métodos para seleccionar un tratamiento para tratar a un animal infectado con un nematodo de Dirofilaria spp. En un ejemplo, el método implica determinar el genotipo del nematodo en un sitio polimórfico de una molécula de ácido nucleico que incluye una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 y seleccionar el tratamiento en base al genotipo del nematodo. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico posee al menos un 80% de identidad de secuencia con respecto a una o más de las SEQ ID NOs: 1-127. En otros ejemplos, la molécula de ácido nucleico posee al menos un 90%, o al menos un 95%, de identidad de secuencia con respecto a una o más de las SEQ ID NOs: 1-127. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento que tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos de una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 e incluye el sitio polimórfico. En otro ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento que tiene una longitud de al menos 50 nucleótidos de una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 e incluye el sitio polimórfico. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento que tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos y que posee al menos un 95% de identidad de secuencia con respecto a una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 e incluye el sitio polimórfico.

En una realización, el método implica tratar al animal con uno o más agentes alternativos cuando se observa un nucleótido alternativo en el sitio polimórfico. Los agentes alternativos pueden incluir uno o más de una terapia basada en arsénico, dietilcarbamazina y antibióticos. En una realización, el método puede incluir aislar la molécula de ácido nucleico del nematodo, y opcionalmente purificar los ácidos nucleicos antes de determinar el genotipo del nematodo. En una realización del método, el genotipo del nematodo se determina mediante secuenciamiento de ADN, métodos basados en hibridación que incluyen oligonucleótidos específicos de alelo, análisis de microsistema, métodos basados en enzimas, polimorfismo conformacional de cadena individual (SSCP), fusión de alta resolución (HRM) o estrategias basadas en PCR, RT-PCR o qRT-PCR.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: ilustra las frecuencias de genotipo correspondientes al SNP dentro de cada uno de los marcadores indicados, para elementos aislados susceptibles y LOE. Los gráficos son representativos de marcadores que también se designan como SEQ ID NOs: 1-109 en la solicitud. Para los marcadores designados con un asterisco (*), el genotipo indicado muestra el análisis del complemento inverso de las secuencias mostradas como SEQ ID NOs: 1-109 en la solicitud.

Descripción detallada

Definiciones

En la presente memoria, “lactonas macrocíclicas” o “MLs” significa productos, o derivados químicos de los mismos, de microorganismos del suelo que pertenecen al género Streptomyces, que incluyen, aunque no necesariamente se limitan a, avermectinas y milbemicinas. Estas moléculas se usan para tratar especies de endo- y ecto-parásitos en un amplio rango de hospedantes. Las avermectinas en uso incluyen, sin limitación, ivermectina, abamectina, doramectina, eprinomectina y selamectina. Las lactonas macrocíclicas presentan un amplio y potente espectro antiparasitario en niveles de baja dosis. Son activas contra muchos nematodos inmaduros (que incluyen larvas hipobióticas) y artrópodos. Una dosis terapéutica individual puede persistir en concentraciones suficientes para ser efectiva contra las infecciones de nematodo de turno durante periodos prolongados después del tratamiento.

Los profilácticos contra gusano del corazón de tipo lactona macrocíclica (ML) fueron desarrollados para el tratamiento de perros y gatos, que no hubieran sido infectados todavía, para prevenir el establecimiento de infecciones adultas, atacando a los estadios de desarrollo L3/L4. Las lactonas macrocíclicas también presentan efectos en el estadio de microfilaria (L1). Los endectocidas de tipo lactona macrocíclica tales como ivermectina (IVM), milbemicina oxima (MO), moxidectina (MOX) y selamectina (SLM) se usan durante la temporada de transmisión para la quimioprofilaxis del gusano del corazón en perros y gatos.

En la presente memoria, “capacidad de respuesta” significa que un nematodo responde tras exposición a una lactona macrocíclica (ML). Un nematodo puede responder mostrándose sensible o resistente a una ML. Sensibilidad o sensible a una ML significa que la lactona macrocíclica afecta de forma adversa al nematodo de D. immitis expuesto. Por ejemplo, una ML puede ser letal o sub-letal para el nematodo de D. immitis, acortar su esperanza de vida o inhibir su capacidad para reproducirse. La resistencia es la reducción en la eficacia de un fármaco, en la presente memoria las MLs, para curar una enfermedad o para mejorar los síntomas (p.ej., erradicar los organismos de gusano del corazón de un perro). Un nematodo de D. immitis puede ser resistente a m L si el fármaco destinado a neutralizarlo es ineficaz, menos efectivo o presenta una eficacia reducida. Un nematodo de D. immitis también puede ser resistente a ML si el fármaco, en una dosis específica destinada a neutralizarlo, presenta un efecto reducido. Capacidad de respuesta de un nematodo frente a una lactona macrocíclica se puede determinar in vivo o in vitro.

En la presente memoria, “pérdida de eficacia” o “LOE” (del inglés “loss of efficacy”) significa que existe al menos un descenso percibido en la capacidad de respuesta de los nematodos a las MLs. El descenso percibido en la capacidad de respuesta puede ser percibido o puede ser real. En un ejemplo, el descenso en la capacidad de respuesta de los nematodos a las MLs puede ser real, en cuyo caso se dice que los nematodos son resistentes a las MLs. En otro ejemplo, el descenso en la capacidad de respuesta de los nematodos a las MLs puede ser percibido y no real. Por ejemplo, en el caso en el que un perro infectado con gusanos del corazón es tratado con MLs, con el fin de eliminar los gusanos del corazón en el perro, el dueño del perro puede que no colabore adecuadamente a la hora de administrar apropiadamente las MLs al perro. En dicho caso, la infección de los gusanos del corazón puede que no sea eliminada del perro debido a que no se han administrado dosis suficientes de MLs, por ejemplo. El dueño del perro, u otro observador, puede creer erróneamente que las MLs fueron administradas adecuadamente al perro (p.ej., el dueño/a cree que ha administrado las MLs directamente pero, en realidad, se saltó administraciones, administró dosis inadecuadas, etc.) y, debido a que los gusanos del corazón no fueron eliminados del perro, los parásitos de gusano del corazón son resistentes a las MLs. En al menos algunos de estos casos, los gusanos del corazón no son eliminados del perro debido a la falta de cumplimiento. En estos casos, la presencia continuada de los gusanos del corazón puede no ser debida a resistencia a ML de los organismos de gusano del corazón (es decir, el descenso en la capacidad de respuesta de los parásitos de gusanos del corazón es percibido y no real). En casos de LOE, generalmente no existe confirmación de que la infección de gusano del corazón es realmente resistente a las MLs.

En la presente memoria, “resistente” o “resistente confirmado” generalmente significa que se demostró que l os organismos de gusano del corazón presentan una capacidad de respuesta al menos reducida frente a las MLs. En un ejemplo, los perros infectados con gusanos del corazón son tratados con MLs, usando un régimen conocido habitualmente para librar a los perros de la infección de gusano del corazón (es decir, el cumplimiento del tratamiento de ML no se cuestiona), pero el tratamiento no consigue librar al perro de los organismos de gusano del corazón. Dichos organismos de gusano del corazón, que normalmente serían eliminados de los perros cumpliendo el tratamiento, no son eliminados debido a su capacidad de respuesta reducida frente a la ML. Se dice que dichos organismos de gusano del corazón son resistentes a las MLs.

En un ejemplo, se puede decir que un nematodo de D. immitis es resistente a una ML si menos de aproximadamente el 93%, menos de aproximadamente el 91 %, menos de aproximadamente el 89%, menos de aproximadamente el 87%, menos de aproximadamente el 85%, menos de aproximadamente el 83%, menos de aproximadamente el 81%, menos de aproximadamente el 79%, menos de aproximadamente el 77%, menos de aproximadamente el 75%, menos de aproximadamente el 73%, menos de aproximadamente el 71%, menos de aproximadamente el 69%, menos de aproximadamente el 67%, menos de aproximadamente el 65%, menos de aproximadamente el, 63%, menos de aproximadamente el 61%, menos de aproximadamente el 59%, menos de aproximadamente el 57%, menos de aproximadamente el 55%, menos de aproximadamente el 53%, menos de aproximadamente el 51 %, menos de aproximadamente el 49%, menos de aproximadamente el 47%, menos de aproximadamente el 45%, menos de aproximadamente el 43%, menos de aproximadamente el 41%, menos de aproximadamente el 39%, menos de aproximadamente el 37%, menos de aproximadamente el 35%, menos de aproximadamente el 33%, menos de aproximadamente el 31%, menos de aproximadamente el 29%, menos de aproximadamente el 27%, menos de aproximadamente el 25%, menos de aproximadamente el 23%, menos de aproximadamente el 21%, menos de aproximadamente el 19%, menos de aproximadamente el 17%, menos de aproximadamente el 15%, menos de aproximadamente el 13%, menos de aproximadamente el 11%, menos de aproximadamente el 9%, menos de aproximadamente el 7%, menos de aproximadamente el 5%, menos de aproximadamente el 3%, menos de aproximadamente el 1%, o si el 0% de los nematodos murieron tras exposición a una dosis o concentración DL⁹⁵ (una dosis o concentración letal de un fármaco que debería haber matado al 95% de los nematodos de D. immitis) de lactona macrocíclica.

En otra realización, se puede decir que un nematodo de D. immitis es sensible a una lactona macrocíclica si como mucho aproximadamente el 5%, como mucho aproximadamente el 4%, como mucho aproximadamente el 3%, como mucho aproximadamente el 2%, como mucho aproximadamente el 1%, o si el 0% de los nematodos sobrevivieron tras exposición a una dosis o concentración DL⁹⁵ (una dosis o concentración letal de un fármaco que debería haber matado al 95% de los nematodos de D. immitis) de lactona macrocíclica.

En la presente memoria, “ácido nucleico”, “secuencia de nucleótido” o “molécula de ácido nucleico” pueden referirse a un polímero de ADN y/o ARN que puede ser de cadena sencilla o doble y que opcionalmente contiene bases de nucleótido sintéticas, no naturales o alteradas capaces de incorporación en polímeros de ADN o ARN. “Ácidos nucleicos”, “secuencias de ácido nucleico” o “moléculas de ácido nucleico” pueden abarcar genes, ADNc, ADN (p.ej., ADN genómico) y ARN codificado por un gen. Los ácidos nucleicos o las secuencias de ácido nucleico pueden comprender al menos 3, al menos 10, al menos 100, al menos 1000, al menos 5000, o al menos 10000 nucleótidos o pares de bases.

Los “ácidos nucleicos”, las “secuencias de ácido nucleico” o las “moléculas de ácido nucleico” se pueden modificar mediante cualquier procedimiento químico y/o biológico conocido en la técnica, que incluyen, aunque sin limitación, reacción con cualquier reactivo conocido tal como agentes de alquilación, azúcares de oscurecimiento, etc.; conjugación a un grupo ligando (p.ej., PEG); metilación; oxidación; radiación ionizante; o la acción de carcinógenos químicos. Dichas modificaciones de ácido nucleico pueden producirse durante la síntesis o el procesamiento o después del tratamiento con reactivos químicos conocidos en la técnica.

En la presente memoria, una “molécula de ácido nucleico aislada” se puede referir a una molécula de ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia de polinucleótido más grande; y/o puede estar sustancialmente libre de cualquier otra molécula de ácido nucleico o de otros contaminantes que se dan en su entorno natural. Tal como se usa en la presente memoria, una “molécula de ácido nucleico aislada” también puede abarcar las moléculas de ácido nucleico producidas recombinante o sintéticamente.

En la presente memoria, el término “identidad” o “ idéntico” se refiere a la similitud de secuencia entre dos o más moléculas de polinucleótido, en una posición dentro de las moléculas, o en más de una posición dentro de las moléculas. La identidad se puede determinar comparando cada posición en secuencias alineadas. El grado de identidad entre secuencias de ácido nucleico es función del número de ácidos nucleicos idénticos o emparejados en posiciones compartidas por las secuencias, por ejemplo, en una región especificada. El alineamiento óptimo de secuencias para comparaciones de identidad puede llevarse a cabo usando una variedad de algoritmos, tal como se conoce en la técnica. En un ejemplo, la identidad de secuencia se puede determinar usando el bien conocido y disponible públicamente algoritmo BLAST (p.ej., BLASTn y BLASTp). En otra realización, el especialista en la técnica puede alinear fácil y adecuadamente cualquier secuencia dada y deducir la identidad/homología de secuencia mediante una simple inspección visual.

En la presente memoria, “polimorfismos de nucleótido individual” o “SNPs” se refiere a las variaciones genéticas (o de no identidad) en localizaciones específicas en un genoma (es decir, sitio polimórfico). Generalmente, en una posición específica de un genoma, la identidad de un nucleótido puede ser invariante o constante. En algunas posiciones de un genoma, sin embargo, la identidad de un nucleótido puede no ser invariante. En dichas posiciones, puede haber presente un nucleótido en la posición con una frecuencia relativamente mayor que otros nucleótidos, cuando se analiza el genoma de diferentes individuos de una población. El nucleótido encontrado más habitualmente en dicha posición puede referirse como nucleótido natural de dicha posición. Sin embargo, puede haber uno o más nucleótidos diferentes que aparezcan en esta posición con frecuencias relativamente más bajas. Estos nucleótidos pueden referirse como nucleótidos alternativos. Las frecuencias en las que se dan los nucleótidos alternativos pueden variar. En un ejemplo, los SNPs descritos en la presente memoria pueden desempeñar un papel en la capacidad de respuesta de los nematodos a las MLs. En un ejemplo, los SNPs pueden identificar o marcar una región de un genoma que pueda desempeñar un papel en la capacidad de respuesta de los nematodos a las MLs (es decir, el propio SNP no está implicado directamente en la capacidad de respuesta alterada a las MLs pero puede estar ligada genéticamente a los cambios genéticos implicados en la capacidad de respuesta alterada). En un ejemplo, la presencia de uno o más de los SNPs descritos puede indicar que el parásito cuyo genoma contiene el uno o más SNPs es menos responsivo a MLs que los parásitos que no tienen los SNPs.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “sitio polimórfico” se puede referir a una región / localización específica de un ácido nucleico en la que se observan dos o más secuencias de nucleótido alternativas en un número significativo de muestras de ácido nucleico de una población de individuos. Un sitio polimórfico que tiene una longitud de un nucleótido se puede referir en la presente memoria como “polimorfismo de nucleótido individual” o “SNP” (del inglés “single nucleotide polymorphism”.

En la presente memoria, “marcador” o “marcadores” generalmente se refieren a secuencias de ácido nucleico que pueden contener uno o más SNPs. Dichas secuencias de ácido nucleico pueden tener diferente longitud.

En la presente memoria, “genotipo” se refiere a la constitución genética de una célula, un organismo, o un individuo (es decir, la constitución de alelo específico del individuo) normalmente en referencia a un carácter específico en consideración. En el contexto de esta solicitud, genotipo generalmente se refiere a la identidad de los nucleótidos en las posiciones de SNPs. En un ejemplo, un genotipo GG puede significar que en una posición específica de un gen (p.ej., un sitio polimórfico) que tiene dos alelos, el nucleótido en la misma localización de cada alelo es G (guanina). Los alelos son secuencias de ADN alternativas en la misma localización física, que pueden dar o no como resultado directamente diferentes rasgos fenotípicos, pero de forma general en el contexto de esta solicitud se correlacionan con un descenso de la capacidad de respuesta de los parásitos frente a las MLs. En cualquier organismo diploide particular, con dos copias de cada cromosoma, el genotipo de cada gen comprende el par de alelos presentes en dicha localización, que son iguales en homocigotos y diferentes en heterocigotos.

Las estrategias adecuadas para uso en la determinación del genotipo son conocidas en la técnica, y puede incluir, aunque sin limitación, PCR, RT PCR, qRT PCR, SSCP e hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo. Otras estrategias pueden incluir la hibridación de ácido nucleico a microsistemas o perlas de ADN, el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción terminal (t-RFLP), el polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP), y la modificación de sonda dependiente de ligación múltiple (MLPA).

En la presente memoria, “consiste esencialmente en” o “consta esencialmente en” significa que la secuencia de ácido nucleico puede incluir una o más bases de nucleótido, lo que incluye dentro de la secuencia o en uno o ambos extremos de la secuencia, pero que las bases de nucleótido adicionales no afectan materialmente a la función de la secuencia de ácido nucleico.

Genomas y SNPs

En la presente memoria se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que poseen al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOs: 1-127, a lo largo de toda su longitud, y que comprenden los nucleótidos alternativos en la localización del SNP (es decir, el sitio polimórfico), los nucleótidos alternativos indicados por el nucleótido subrayado de las SEQ ID NOs: 1-127, tal como se describe en esta solicitud. Los nucleótidos alternativos generalmente presentan una menor frecuencia de aparición en las posiciones indicadas dentro de las secuencias, tal como se muestra en la Figura 1 y en la Tabla 1. El genoma de un nematodo parásito, o de una población de parásitos, puede contener uno o más de los nucleótidos alternativos en los sitios polimórficos mostrados en las SEQ ID NOs: 1-127. La presencia de estos nucleótidos alternativos generalmente se correlaciona con un descenso de la sensibilidad de los parásitos frente a las MLs en comparación con los parásitos que no contienen los nucleótidos alternativos.

Se describen además moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden, que consisten en, o que consisten esencialmente en la secuencia mostrada en las SEQ ID NOs: 1-127.

Una molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria puede comprender una secuencia correspondiente a la de las SEQ ID NOs: 1-127 a lo largo de su longitud, y que contiene el nucleótido alternativo en el sitio SNP (es decir, el sitio polimórfico). La secuencia de ácido nucleico puede ser idéntica en al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82%, al menos aproximadamente el 83%, al menos aproximadamente el 84%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 86%, al menos aproximadamente el 87%, al menos aproximadamente el 88%, al menos aproximadamente el 89%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99% o 100% a las SEQ ID NOs: 1-127, pero que fue aislada de un nematodo que tiene el nucleótido alternativo en la posición de cada secuencia indicada por el nucleótido subrayado como se describe en la presente solicitud.

En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico puede comprender una parte, un fragmento de las SEQ ID NOs: 1-127 que también contiene el sitio polimórfico y el nucleótido alternativo en el sitio polimórfico. En varios ejemplos, el fragmento de las SEQ ID NOs: 1-127 puede tener una longitud de 5, 20, 15, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300 o más nucleótidos.

Una molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria puede derivar de un nematodo de D. immitis que contiene una o más de las SEQ ID NOs: 1-127 tal como se describe en esta aplicación. Tal como se usa en la presente memoria, “derivar de” puede referirse a una molécula de ácido nucleico que fue aislada de una fuente natural, p.ej., de un nematodo de Dirofilaria immitis. Puede también referirse a una molécula de ácido nucleico hecha por el hombre, p.ej., recombinantemente o sintetizada en base a una molécula de ácido nucleico aislada de un nematodo de D. immitis.

Detección de SNPs

Los SNPs pueden detectarse mediante cualquier método que pueda determinar la identidad de un nucleótido en una posición específica de un genoma (p.ej., un sitio polimórfico) y que permita la comparación de las identidades de nucleótidos en la posición específica de genoma entre individuos o poblaciones de individuos. Las diferencias en las identidades de nucleótidos en una posición específica pueden ser indicativas de un SNP.

Se puede usar una variedad de métodos para detectar SNPs. En un ejemplo, se pueden usar métodos basados en hibridación. Los métodos basados en hibridación generalmente se basan en hibridar sondas de ADN complementarias al sitio que contiene el SNP. En un método, la hibridación específica de alelo dinámica (DASH) se basa en las diferencias en las temperaturas de fusión que resultan de un emparejamiento de bases no coincidente. Diseñando sondas que se hibridan diferencialmente en base a los cambios de nucleótido en los genomas diana, se pueden detectar los SNPs.

En un ejemplo de un método basado en hibridación, se pueden usar balizas moleculares. Las balizas moleculares son sondas de nucleótido de cadena sencilla, con un fluorocromo en un extremo y una molécula de extinción de fluorocromo en el otro extremo, que pueden formar una estructura de tallo-bucle y colocar el fluorocromo y la molécula de extinción en estrecha proximidad uno de la otra. En ausencia de hibridación de una baliza molecular a una región de genoma, el fluorocromo será extinguido, debido a su estrecha proximidad a la molécula de extinción. Cuando la baliza molecular se hibrida a una región de genoma, generalmente el fluorocromo no formará una estructura de tallobucle. En estas condiciones, el fluorocromo fluorescerá, debido a la distancia incrementada entre el fluorocromo y la molécula de extinción.

En un ejemplo de un método basado en hibridación, se usan microsistemas de oligonucleótidos, que son sistemas de alta densidad que contienen cientos de miles de sondas, para la hibridación a SNPs. Comparando la hibridación diferencial a sondas redundantes, es posible detectar los SNPs.

En un ejemplo de detección de SNPs, se pueden usar métodos basados en enzimas. En un ejemplo de un método basado en enzimas para detectar SNPs, se usan endonucleasas de restricción para digerir un ADN genómico. Determinando las longitudes de fragmento que resultan de la digestión, se puede determinar si determinados sitios dentro de un genoma no son atacados por la endonucleasa debido a un cambio de nucleótido (p.ej., nucleótido alternativo) en la secuencia reconocida por la endonucleasa.

En un ejemplo de un método basado en enzima para detectar SNPs, se usan métodos basados en PCR (reacción en cadena de polimerasa). En un ejemplo de esto, se diseñan dos pares de cebadores de tal modo que solo uno de ellos actuará para amplificar un sitio que contiene un SNP, dependiendo de si el SNP está presente. Los tamaños de los productos amplificados son distinguibles, por tanto informan sobre qué para de cebadores funciona, y si el SNP está presente.

En un ejemplo de un método basado en enzima para detectar SNPs, se diseñan sondas de nucleótido para hibridarse a un sitio genómico y producir una discrepancia, tanto si está presente como si no un SNP en el sitio genómico específico. Se usa una endonucleasa (p.ej., endonucleasa Flap) que rompe una de las sondas, dependiendo de si existe una discrepancia. Usando fluorocromos y moléculas de extinción, unidos a una o más de las sondas, se pueden detectar los SNPs.

En un ejemplo de un método basado en enzima para detectar SNPs, se usa la extensión de cebador. En este método, los cebadores se hibridan a ADN de genoma inmediatamente por encima del SNP. A continuación, se usa ADN polimerasa para extender el cebador en una reacción de mini-secuenciamiento. La reacción de secuenciamiento determina la presencia de un SNP.

En un ejemplo de un método basado en enzima para detectar SNPs, se usa la actividad de 5'-nucleasa de Taq ADN polimerasa. Se lleva a cabo un ensayo TaqMan concurrentemente con una reacción de PCR. El método se fija de tal modo que la reacción de PCR se extenderá a través de un sitio que contiene un SNP, y liberará un fluorocromo de una sonda que se hibrida a la región SNP, dependiendo de si la sonda contiene una discrepancia debido a la presencia del SNP.

En un ejemplo de un método basado en enzima para detectar SNPs, se usa ADN ligasa para ligar dos sondas, una que se hibrida a un sitio SNP en un genoma, dependiendo de si el SNP está presente, y una segunda sonda que se hibrida adyacente al sitio de SNP. Si ambas sondas se hibridan al genoma sin discrepancias, la ligasa conectará las dos sondas, lo que puede medirse.

Existen otros métodos para detectar SNPs, que incluye, por ejemplo, la detección de polimorfismos de conformación de cadena sencilla, la electroforesis de gel de gradiente de temperatura para detectar discrepancias dobles debidas a los SNPs, la cromatografía de líquidos de alta resolución desnaturalizante para detectar discrepancias dobles, análisis de fusión de alta resolución, el uso de proteínas de unión de discrepancia, y otros.

En un ejemplo de detección de SNPs, se puede obtener de un sujeto una muestra biológica que comprende un nematodo de D. immitis. El sujeto puede ser, sin limitación, un perro, zorro, lobo, coyote o gato. En el contexto de la descripción, una muestra biológica puede ser cualquier muestra (p.ej., fluido corporal, excremento, órgano, tejido, etc.) de un sujeto. La muestra biológica puede proceder de un sujeto que es conocido por presentar, o que se sospecha que presenta, una infección de nematodo de D. immitis. El nematodo de D. immitis puede aislarse de la muestra biológica con métodos y técnicas de separación estándar.

Se puede aislar u obtener una muestra de ácido nucleico de un nematodo de D. immitis antes de su uso. Los métodos para aislar ácidos nucleicos de organismos y tejidos son conocidos. Dichos métodos pueden incluir, aunque sin limitación, la extracción tradicional de ADN, con digestión de proteinasa K seguida de extracción con fenol cloroformo, extracción con hidróxido sódico, y disrupción física, seguido de purificación, p.ej., mediante centrifugación de cloruro de cesio o cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC); o el uso de kits comerciales. El especialista en la técnica apreciaría que pueden usarse diferentes estrategias para aislar una muestra de ácido nucleico de un nematodo de D. immitis adulto en comparación con una microfilaria. En una realización de la descripción, la muestra de ácido nucleico comprende ADN genómico.

Las secuencias de ácido nucleico de los ácidos nucleicos del parásito pueden determinarse usando uno cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica. En algunas técnicas, las secuencias de piezas separadas del genoma se ensamblan en representaciones de genoma entero lineal del parásito usando métodos basados en ordenador. En un ejemplo, se puede usar un secuenciamiento paralelo masivo. El secuenciamiento paralelo masivo (también denominado “secuenciamiento de nueva generación”) puede abarcar varios métodos de secuenciamiento de ADN de alta capacidad. Uno de tales métodos es el sistema HiSeq2000 de Illumina®.

A través de la comparación de secuencias de parásitos separados o de poblaciones de parásitos (p.ej., comparación de un genoma de consenso o de referencia obtenido de parásitos sensibles a MLs con un genoma de consenso o de referencia obtenido de parásitos resistentes a MLs), se pueden identificar los SNPs hipotéticos.

Los SNPs hipotéticos se pueden analizar adicionalmente. En un ejemplo, se usó un análisis de SNP de alta capacidad con PCR múltiple y espectrometría de masas MALDI-TOF (análisis Sequenom®). Generalmente, este sistema usa la extensión de un cebador de oligonucleótido o sonda usando nucleótidos de terminación de cadena para producir productos de PCR de diferente tamaño para cada alelo de un SNP. Los productos de PCR de diferentes tamaños se analizan usando espectrometría de masas MALDI-TOF.

SNPs descritos

En un ejemplo, los marcadores genéticos de D. immitis incluyen las siguientes secuencias (SEQ ID NOs: 1-109), donde los nucleótidos subrayadas (es decir, los sitios polimórficos) indican la posición de nucleótidos dentro del fragmento que se correlaciona con la resistencia a MLs (es decir, el nucleótido alternativo). En estas secuencias, el nucleótido de la posición subrayada generalmente es diferente del nucleótido presente en dicha posición en organismos que no son resistentes a MLs (naturales). En las siguientes secuencias, el nucleótido subrayado en la secuencia indicada es el nucleótido alternativo que se correlaciona con la resistencia a MLs. En el encabezado de cada secuencia, se muestra el cambio de nucleótido del natural al nucleótido alternativo (alternativo se correlaciona con resistencia a ML) en el sitio polimórfico (p.ej., C en la secuencia natural y A en la secuencia alternativa se designa como C ^A ). Las frecuencias de genotipo para cada SNP en los sitios polimórficos se muestran en la Figura 1. En la Figura 1, para los marcadores designados con un asterisco (*), el gráfico presenta los genotipos de la secuencia de complemento inverso, en comparación con la secuencia de nucleótido presentada en las SEQ ID NOs: 1-109.

MARCADOR 617 (SEQ ID NO: 1); C ^ A

AACATAAACATATTGAACTGAATCCTGCAAACAGTTCTCTTATAACGTGAACCATAACT AAATTTAGAGAAAATAT GAAAAAGAAAAATAAGTTGCTTTT GCTCGTGCACCAACTCTA ATACCCAGGAAAT CAAGAAGTGATAATGAGT AAT GT CATCATT AGATT CAGT AATTGG T GACACTATCAATATTATTATTATTATACTTAAAAATACGACGACCACTTATCGTAACTT AAAGCATGCATAATACGACTGTCATCATATTACATTTCTTCAAGTTCGTATTGGACAAG TGATT

MARCADOR 714 (SEQ ID NO: 2); C ^ T

GACAAGCGTTGACGGGAGAGACGATATAATAATAAAGAAGGCATTGGGTATCAGAAG GCACAATCCAATTATAAATGCCAAGGCAAAATGAATAAAATTTATGCTGACGATTTGA TCAATT ACGAAGAATTTCCGATCGGCTCGAAT CTTTGTTTGT AT GTGCACTACTGTT A ACTTAATCTTTGTTTTATATACTTTTGCGTGT CATATATAATATATT CATGTCAACTGAT ACGTTATGATGTTTTTTTGTAAATTAAGTTGATCGGAAACCTGAAGTCTATTTCAAATT TAAGAAAT

MARCADOR 814 (SEQ ID NO: 3); T ^ C

TTTT AGGAAAAT GGTGACTGTAGAGAGAT ATT ATCGGAACGACAAGGT C CACTTCGA ACGGGT CTTTT ATT GTCGACGGATT GT GAACCAAGTTTT GGCATT CATAATGACAGGT AGCTATTTTTCCAT CATCCCATTTTT GTATTAGT GCAAGCAAGT CATGAGTCGAAAGA AAATCTCAAAAGAAAAAAATGAAATTT CAGGTTCAAAGGACT GCGTCCATTATTCGCA CTGGTTGATGAGAACGTACAGATTCCAGAGCGGCAATGCTGCACAGTATCTTTTGTT TCACTTCTGAAT

MARCADOR 887 (SEQ ID NO: 4); C - T

TCGATTAAAAATTATCATCGATAAAATTCTAAAATTTATTTTAGTAAAATTATTATTATTT TGATGAATAAGTTAACAAAAAAATTTTAATAACTTTTTGATTCGCCAAAAATCTAATTCG TTAAAAAGTCGTTCCAAACAGATATCGCTTGTTCGATGAAAATGTCCGGTTGTTAGAA AAT CATAAATT GGTT CAAATAATTTT C CAGAAC GTTC GAAAAAATATTCCCTTGTATCG GATAAATAACCATTACAATTTTCCACTCGTGTTGCATGTGTTTCTCGACAAAAATCAGC TAA

MARCADOR 1514 (SEQ ID NO: 5); T -C

TCAACAGAAATCGAGATTCCAAAAAGTTTCCTACAAATACTTAATTATCAATGGATATT TAGTTTTGTTATCTGTTATCATAAGTTCTGCTTCTTACACGATTAAAAATGTCCAAGAA TTTTTT ACT ATT CAAAT GAGGGAAAT AAAAAACCAAT GC CAATAATATCCAGAAACTAC ATACATCTTT CTTTTTT CGAAGCTCATCTATTCCGGCCGAAAACAAT GAAGAACATT AA AATTCTTAAAAGATAGTCTTAGCCTTTTCCTTGACCACTATCTTAACTGTCAGCGCTAA AATGT

MARCADOR 2557 (SEQ ID NO: 6); T -C

AATAGTCGTCTCATTACTTTTTGACTTTTATAATTCGAGAATCTTATGTAGTCCTTCACT TTACCCTTCTTCTGTCGAACTAAGAATTACAGCATTATTTTCGAATTTAATGTGTAAAA GACAATAGCAGATTTT GTAATTTT GTGTT AACCT CACTTTATATTTCGCTT CAT ATCGT GACAGAGAATT ACT ATTTCAGAGAGT ATT ACTTGT CACCAGAGAATCTCCAGAAAGAT TTTTATTTACGTCGGAAAATGGACAAAAATGGTTTCTTATCATTAGCACTGATAGCTAG TTTCC

MARCADOR 3367 (SEQ ID NO: 7); G - A

TATCTCTTGTTGTGTGTTCTGCATTGTATCAAAGTGGGTAAATTTTGCTTTAGACGTTG ACTTATTGTCTTTTTTAAGTTATATTCTAGTCCATGTTTTTCTCTTTGCAAATATTTTTTT CCGCCGCCTATGATTCATT GTTTT GTTTGTAACT CT CT ATT AAGTT GCTTTT AGTTT GA ATT GTAT CAAAATTTCAAACATTTAAAATACGCACT AGCACTATTTTTT CTTATCT CAAT TAAGCGAATCCCGGAACAAGATTTAATCGATTTCCGAATCACAATTAAATCACTGGAA AAC

MARCADOR 3488 (SEQ ID NO: 8); T —C

ATTTTCCTTAACAAATCATTTTCAAACGAAAAAACATTAAAAAGTGTTAAAATAAAATG GTGATATTGATAAGAAATTAATTCAACCTGCATATCAATTCTTGTAGCGGCCATTTTCT TAGCAAGTTCTATAGCAGCTCGATCCATATCACCTTCTTGCTCTAATGTCAATTCCGG TTCCG GAATTTTTTTTATTTTGCCATTCTTCATCTTTTTTTTATTTTTTACT GAT ATAGCT ATAGACCCTTTCTCCCGTGCATGCCTGTAGGCCTGTTCTGATATACAGGCTTGTGAA CCACTG

MARCADOR 4553 (SEQ ID NO: 9); C - T

TTCTGGGGTAGTTATACGGAAAATTAGACAATGAAGAGAATCAAAAAACATGCGATTT TCAAACAGAGGAACTTTGGTACTTTTGCCTCGACTTACTTTATTTTAAAACCCATACAA AATAAAT GTTT CATTT GATT GATATT GTCGTACTAAT AATT AGAGCTTCAACATT AGGA TTTT AAT AACCTT CAATTTATTT CAGAATTTAAGAAACTTACGTATGGAT GGAGAAAAT ATAAAGAATGGCGATGACAAATAAGATTTGCTATGAAAAAACTAATGCCACAAGATCC GAATGCA

MARCADOR 5266 (SEQ ID NO: 10); C - T

TTTATGAACAAAAATAATAAAAATTAGGATAACAGATATCAATTTCTTTTAGCTATAAAT ATACGCTTCGATTGAAAAAAGCTTTCAAATTATAATTAAGGCATACGTTACGATATAGA CAATTAAGT C GACATT AATT ATTTGAAAT ATTTT AAATTTTTTTCTCTTT CTTTTTTT CTA TTCTCTTCCAAAGT GT CAAAT AGTT AT GAAATT GT CAGAAGCT AAAATGAT AAT ATT AT T CAAGTTTATTACCT AAT CTTTTATCACCT CATTTCTTATCATTTATCTGAAAAT CT AAT C

MARCADOR 5365 (SEQ ID NO: 11); G ^ A

AT GTT GAATTTTTAATGAAACTTTTT CGGT GCAT AAGCATTACAGATCTGTAAGCTGTG CAAACCCT GTTTCTTT GT AAATT GAAACAAAGATCATTT ATT GTTTCCAGCGTCGATTT GACCT GGATAAAT GTGGT ACCAAAAGTAGAT GACGAGAGGT AAGT GCAAACAAAATG CACAAAAATGATTTT GAT GCACT CAAAT CATTTTT AAGTTTT GT GCAATTTTCCATTTT A TAGTTTCGTGATCGGTTGTTATTCATCAACTTGATTTTGTTTGTTTTTTGTGACTTATAT TTCAT

MARCADOR 5667 (SEQ ID NO: 12); G ^ A

TTTGACACTTTCAGATACCTTACAAACTCATCTCCAGCACCCAATTTACAATATCGCTG CCTAAATAAAGAATTTATTCGGATATGAGACTGTAGTTTTCATTCCGTACCAATCATAG TAGAACAGAT CTAT AGCATGGTGTCCTACT AAAGTT GTGACTGGCT ATT AAGTATGTG GGT GTTTTT ACGTGTGCGTGGGT GTTT GT GCGTGT GTGCGTGTGCGTTTCTGCACAT ATTTTCGTGCGCGGTGTCTGTGTGTGTCCGTTTGTATATGCCGAGTGTAGCTGTGTG TATGTTCTTG

MARCADOR 6568 A (SEQ ID NO: 13); G ^C

CACTCATAATATACCTGTCAACAAACTCAGAAATCTGAATAAAATGACGCAAAAATGA CAAAAACATTTTATCAACCTTTTCTTCATCACTCCCCCGCATTTCCAATTTTCTTCCAA ACT GTTTTTGTCGTGCT ACAAAGT CAT CAGCCACTT CATTTT CTTCAAGAT GGTT C GA GACGCCATTCTTGGATTCACCCCTTATTTCAACTGTTTCCGAAGTCCCAGCAGTTGAA GCTGAACCTAGCATTTATATCACCACCCGATGTCAAAAAATGACAGCGGTCAGAGAA TACGACTTCC

MARCADOR 6568 B (SEQ ID NO: 14); G ^ A

GCTAGGTCAACAGTTGGTTTATTTGGACTTATACGATATTAAACATAATATCGCCTCAT ATACACAGAAATATCAAAAAAACGAACACAGCTAAATCGAAGAATACGAACAAATGTT TTAAAAATT AT ATTAAAT CTTTTAATGCTCTCTACAAT GTCGTATCTTCCCTTTTGTCTG TATTT CTC CTTT C GTT C CACCACTGCTATTT CT CAT GCCTTT GAACT AT GGTTCTC GTT GCGTCGAATTGTCCTCGAAACTGTTGTTTCTGTCGAATTACGTCGAACTGCTGGACTT TGTCGG

MARCADOR 7633 (SEQ ID NO: 15); T ^ C

ATATCTCACTTCTGACATAAATTGAAGTGGCACTGATTTGAATGAAATGATAAATAAAA TAAAGACGACAAGGTAGTGGAAAAAAAAAGAGGAGAAAACACCGTTTAGTTTTGGAT GCAAGCTCGAAT CTGAGTTTT CTTGCAAACCGTACACTGAT CAATTTT CTTACACAAA CATAAGAAAAAAAGAAGTGATTTTACTGTAGCTGTATCGTAT AATTCAAATCATATATA TATATGTTTCAATAATCTATACATTTATGTATATTTTTTTTTGAATGGAACAGTGAATGA TTTTAAA

MARCADOR 9400 (SEQ ID NO: 16); T ^ C

ACAAATGCCATCGGGAGAGAAATATCGTTGGCGTACTGATCACATTGGCGGTATCAC TTCTTTGAAAACTCCAGCTGGTATTGTGTATCATTTCATGCAATACGCTATTTTTGATC GAATAT GTCGACGGCGT AGT GTTT CATTTTCCAACGCATCTTACGTTGCGT GTAT GGA T GAT GACGGACAATTATTG GAATAT CAAACACCGGATC GATT GCATTCCGTAACCTTG AAACGTGACATATATGGGAGAGTAGTGCAAATAACTTCAGATGGCGAAAATATTTTCT TCGAATATGG

MARCADOR 9473 (SEQ ID NO: 17); C ^ G

ATAATATATATTTCCATTGATAATATTTTTCATATTATGTGATGTTTGAAATTTTCTGCA ATTGCTACATTCCGATTAAAAACTTTTATTATCCGTACTGGAGAATTTTGCTTTTTTTTG ACGGTTTGTTCAATAAGTTGTCAATATATTGTCTGCCTTAGTAAAACCTTTCTAATCTA T CCGTTCGAATTGGAAGTTGAAAGTTCAGCATCATTCTTTTAGTGAGGTGTTTAAGTT GTTCAATAGATATTATTTAGAACGATCTCAATTAAAATCTTCTGAATGATTTTATGTTTT TAT

MARCADOR 9858 (SEQ ID NO: 18); A ^ G

GCAGCACATT GCACACAGTAAACT GCAAACT GAATTAAGAGATATTGGGTT GAATT AT TTCTAATTTAAAAGGAT AT AAT AAAT GACTTT GAT GATT GTT GATTTT AAGGTATCTCG GAAGACTCCAT CAGTCTCAGTGCTCTAGCAAT CGCTATAGGT ACT AAAAGAAAAGAAA AGATGTCTCGTTATTCACTTT GAAAT GTACATAT CAAAT CATTTTGTCGTAT GAAATT A AGTATATT ATGTCT AATCGTAT CATTCGAAAT GAATTT ACT GT CACT GTT AGAACT ATT TAGGCAG

MARCADOR 10349 (SEQ ID NO: 19); A - G

AGAGTTCAATCGCCAAGTTGTTCTTTTTCTCGCTCGCAGAGATCAAAACGGTGTTGG CTATACACTCATTCATCAGGCTGTGATAGACATCTCTTAGAATTTCAGTGCTTTTCTG GATGAAAACATTATTT CT CAAACAT GACACTT AAGGACAAT AGT GCGT GACTT CTTTG TTAACGTACAC GAGAAAACAAAACAGATGAT GCTT GTT AT CTTGGT GAT AAATGTGTA TTCAGAATAATGTTATATATCTTTGCGTGACAAATATCATTTCGTTATACTTCGGATAC GCCTTTTTAT

MARCADOR 10520 (SEQ ID NO: 20); A - G

AACTTTACTTGAACTTTTTTGGTGTTCAATTTTGAATATTATACCAACCATTCAGAAGA CTGTATATAGAAATGAACCTTCAAGAATTAATCGAAATTTTTATTAAAATCTTTTATTTG AATATTTCATTATTTAAAC TCATTACTATTTGCAGTATATTATTAGAT CT AAT GT AGAAA AAAAAAT CAGATGGCAAAAAT AAT AT CATAGGTTT GTTTTTAAAATTCATT GCAAAATT CAGTGCGCCGTTCCAGTCGCTCGTAATTACCCTATCCCTGAGCTTTACAAAAAGAAT GCTTT

MARCADOR 10678 (SEQ ID NO: 21); A - T

AGGTATCTAGATAGCATAATAAATTACTACACAAACCGATGGAAACGCAAGTTTGGCG TTGCGTGTTGATACAAAATATTAGAGCCAAGGATGGTATCACATGTAAAACTGCAATT TT GCTATTTGTTTAAAGCAAATAAGAAATAAATATTTCGTTCTTATT CTTT AATTT ATTT C AT CAGATGGCTTT GTTAT AC CATAATT GTAAATCTGT CATATCTTAATTGCGCAATAGC CCAAGATTCTTGTATATTCTTACATTTCACAATTTATTTTCTTATTTCTAGTTTTAGAATT ATA

MARCADOR 11676 (SEQ ID NO: 22); A - G

AATAGCTACTCACAGCTTAAGTTAACTAATGGATTCTTGAATTTATTTAAGCGTGTAGT TAAGCGATTAATATGATGGATGCCCAGAATCGCTTTGTCTTATAGTTTTGTCTCGACA GAAAGGATGCATTGTTGTCTTGAATTTGTTCAAGGGAAAATTAAATAGGTTTCTTTCAA TGACTCCTATTAAATTTTTTTGAATTTAGGCTTGCATTGCGTGTTCTGATCCACTATTA GCACGTACGGGTATCGCAGTGCCATGTGATGCAGCACTATGCAAAAACCACCTCCAT GTCACTTG

MARCADOR 11933 A (SEQ ID NO: 23); A - G

TCTGTTGTAAGTTTCACAATCCAGTTAATTTAAGCTCAGCTTATTTGAAATTTTCAACA AAATTACGAAAATTACTTTCTCGGTTCATTTTTTTCAACCACCAAATATTTAGCATAATT GGCCT GAAAT C GTCAAAGTTT ACAAACTTTT GTT CAGCAATCTTCTCTT ACTCTT ACAA TAAACAT GATT AACTT GTCGT CAT ACCAAT CTCGTTT AT AGCAAATT CTTTT CAAAAAA ACATTGCTACAAATTTTATATCGCATCATTTCAACACGCATAATTATTTTTCATATATGA AAA

MARCADOR 11933 B (SEQ ID NO: 24); T —C

TTCACAATCCAGTTAATTTAAGCTCAGCTTATTTGAAATTTTCAACAAAATTACGAAAA TTACTTTCTCGGTTCATTTTTTTCAACCACCAAATATTTAGCATAATTGGCCTGAAATC GT CAAAGTTT ACAAACTTTTATT CAGCAAT CT CCTCTTACTCTTACAATAAACAT GATT AACTT GTCGTCATACCAATCTCGTTTATAGCAAATTCTTTT CAAAAAAACATT GCT ACA AATTTTATATCGCATCATTTCAACACGCATAATTATTTTTCATATATGAAAAACCATATT ATAA

MARCADOR 12716 (SEQ ID NO: 25); A - G

ATTAACTCTGAACCCAAAGACTGTTGGTTAAAATAAAGATCTATTTTAGTTATACATCT AACATTAAAGGTTTTCGTACGGAAACAAGTAGGTTTGATAATTTTCATGTAACTGTAAA GAACACCT GT GAAAGGGATCAGT AAAATTT GGGGGATGTAGCACGGAAAT AT GAAGC T GAGTGTTTT GT ACCCAAAAGTTTTTCAAATCTGCGAAATAACGAGAGGTGTAATGAT CGTTTTTAACCAAATTTTTTGATTCTAATCCTTCCCACAGTTTTGAAATTCAGTAAGCA TTTCTTTT

MARCADOR 12925 (SEQ ID NO: 26); T ^ C

TT GCAACAAAT CAAT AAT AAAAGACTTGCGGCTAACAATATATTTGATT CTTTTTTACC GTT ATT ATT AT GACAGGT AAT AAT AGT ATT ACAAGCAT ATTT GT AGGTGTCAATTTTTT CAATT CAAATTTTCTT AATT CATTATTT CTTCCTTTCCTT AATAAATAGT CTTTCCATTTA AGAATTAACTTTTTGAAATCTTTAATGAGAAGACACAAAAGATTCCGGATAATTTT GCA TCATCTTTTCTATTTCGCGTTAGTATTTTATGTTTTCAACAGATTTTTATGATTTAACTA TA

MARCADOR 13063 (SEQ ID NO: 27); C ^ T

GATAAAATGGGTTCTTGTCAAGCTCATTTGGCATATCTTCGTCTTCTATATTTATATCC TTTAATATCTTCTCTTTTTTCAAATTTTCCTTCCCGACGTTTTCCATATCGACCTCTTTC TTCATAAATTTATCTTCCTCATTTGCCTCATTTTTTGACTTTTCATCCGTTTCATCCTTA TTTTT CTTTTTTT CAT CTCCTATTTTAC CTTTTCCTTTAT CAACTT CTATCTTAACTTTCT CAATGTTTTTTTTATTTTCTTTCATCTTTTTGTTTTCTTCTATTGACATACTATAACAAA

MARCADOR 15000 A (SEQ ID NO: 28); T ^ A

TTTTACGAACAATTATTTCATAAAAGATTCGTATTTTTGATTAGTTTTTAAGAATTTTTTT TTATTATTTTTAGCCAACAAATATATTTTTCAAAATTGTTAAATTTGAAATTATAAATTTC AACTAAAAAAAAGCAAAAAGCT AAGCCAATAGAAATAACATACAT GTGTAATAT AAAAT ATAAAGTATTCGAAATGAAAAT CAAAGTTT CATAACAAAAAACAAAAAAT ATT CT AACC TTTTAGATTTCATCAAAACTTCACTAAAAAGTTAAATTTAAATTTTCAAATTGTTATACA

MARCADOR 15000 B (SEQ ID NO: 29); A ^ G

CGAACAATTATTTCATAAAAGATTCGTATTTTTGATTAGTTTTTAAGAATTTTTTTTTATT ATTTTTAGCCAACAAATATATTTTTCAAAATTGTTAAATTTGAAATTATAAATTTCAACTA AAAAAAAGCAAAAAGCT AAGCCATTAGAGATAACATACATGTGTAATAT AAAAT AT AAA GTATTCGAAATGAAAAT CAAAGTTT CATAACAAAAAACAAAAAATATTCTAACCTTTTA GATTTCATCAAAACTTCACTAAAAAGTTAAATTTAAATTTTCAAATTGTTATACAATGAT

MARCADOR 15709 A (SEQ ID NO: 30); T ^ C

TCAAAGACAAAATGAAGAACTTAACAAAAAAAAGGCCAATAAATAAAGGCTATTTCGT GAAAAATCTAAAAAAAAAAAGATCTGTTCCTTTCGAATCAAGTGATTCTTCCTACTACA TTCGT GTT GT AATT CTT ACTT GT AT ACAGTCCCCAGTTTTTCGACGATAAAAAACATTT CGATAAGT GAGTTT GAATTAATT GAATTTT AAAAGAT CATAAAAATAAAAT CAAAATAA AAAGACCAAAATTAAGTCTGATAATTCCAGAAAACACAATAATAAATATACAAATAATA AAAACT

MARCADOR 15709 B (SEQ ID NO: 31); T ^ A

AAATAATTCACTAATTTCTCATCATCAAATTATTTCGTACAATCGATAAATCAACGATTA TAATAGCGAAGAGAATGAAAATTAATGTGGTGCACAGTATACGGACCCCATATACAAT GTT CAACAGAGAT GAACATTTTTTTT CT ATT AAAGTTTT CT GTTCGGCGAAAGAAAGAC ACTTTCTAACGATGCTTTCCTCCCAACTCCCCTTGCAATGATAGAGGATGCAGCCAA GATTCGTCGACTCAAGCAGCATCACTCAACCGGCCATCACTTCGGGACCTTTTTCCC TGCCTTTTA

MARCADOR 17333 (SEQ ID NO: 32); A ^ G

CATTGCGAATGACCGCTATGGAATATCAATTAGCAGATATTAATCGTGAATTAAGCAC ATTGGTGGAATTTTTACGACCAAATCGAATTTCAAAAAATGCTACACTTGCAACATCA GCAACCATT GCAACATATAACAGTACTTC GAT GCGTAATGTAAAAAAGAAAT GT AAT G CATCTGAAAGCTGAAAATT CATCTGATATATT GAAGCAAAAGGTAAGATT ATTTTTAAG ATATCATTCTTGATGCTCTCATAATTTCTACATCAAATTTAATCAAACGATTCATTTATG TTCATTT

MARCADOR 18110 (SEQ ID NO: 33); C ^ T

TTCTTGTTGTACCTATCATAGATGATAACTTAAGTACCAATAGCAATAGTGCAACGAT GCAAGGATTCTGATTAATGATTATAAAAGTTTAACCAATCTTCTTCATTCCTTCTAATC AAGAGAAAAAAAAAT GAGAACATTTTTAT GACATTT GAAGAAAGGCAATTT ATCGCTG AAAATT CTACT GCGAT ATGGAAGTAT CAGATAGAGAAAATAAAT ATT AAAATAT GGATT TCATACGAAAAATGATAAAAGATAATAATTTACATTTTGGTGCTTTACT GATAT GATT G GAGTATT

MARCADOR 19999 (SEQ ID NO: 34); T ^ A

CGATATTTTTTGGACGAATCAAACCTTTTTGGGAAATCATTTGATGTCACAAGCATGG TTTGAGAAATTTTTTTCCGAATTAGTTCTGCTAAAAATACTCCAAATGAGTCTAGTGGA ATTAAGCTAAGCACCTTAAGTAAGTTGAGAAAAACGTTTCCATTTGACTAACAAGGCT AGTATATCGACATGAGACAGAAATGGTT ATTACTT CACTCACTT CAT GAAGCGAAT AC GAAATATCTGTTCACTTTAGTTTCAATCTACTATTTTACCAATAAACGTGTTCTTTTCCG GATAAAT

MARCADOR 20570 (SEQ ID NO: 35); T ^ C

TCTTAATTGATTTTCTTAACTCGAAACACTTGTCTTGATTACTGTGCTGTACTTTATCTT ATTAAATTAAATAATTTCCATGACCACTTCATACCATTGACCATCAAACTTTGATGAAG TTT ATGTGT GAAGTGCCAAACAAT CATT CATCCCTT CAGTTT AACTTATT GCTGGTCAA ATT CATAAAAAT GCAAATT AT CAAGCAGATAGTAATT CAGTGAACGT AGCGT ATTCTC GAAATTTCTTTCCTTGTATTTACCTTATATAGAACAACGTATATTTGTAGCATATATTCA ATAT

MARCADOR 20587 (SEQ ID NO: 36); G ^ A

TTTCTGAGTTTGCGTTACAGCGCCAAATCTTCACGGAGATAGATAAAATACTTATCGT GAAATTTTGGCGCCATGATTTAAAAAACACGGAGATAAAAATAAAATGCTTATCGGTG ATAATTT AGCGCCATAAT ATGAATGAATT GAAAAAACAATTT GAGT AGAAACAT GACAT AGAGTTTTCGTTTT CTGGCTACGAAAATGGAT GAATTTTTCT GGAATCGAATT CAGT C AAAGAAATAGGAACGTTGTTACTAAATGATCGAAAAGCTTTCTAAAATTAAATTTATGA CGTCTAAG

MARCADOR 20698 (SEQ ID NO: 37); T ^ C

ATCTAAATCTTCGTTTTATAGTGGTAAGACTTCCATTTGCTGCATTCTTGCAAATTAAG CTGTTGAAAATACTTTTTTTTTTGATAGATTTCCAATTTAATCATATTATAAGAAGAATT AATTT CGAATAGAATTTTTAAAT CATTTAAACTTTAAGTTTTAAAAC TAATATAAGTTAT GCAGATTTCGCGAAAAAGTCT CATTT GTT AATT CAATTATTCCAAAAT GTAATAATTTT ATAAATTCAAATTTAAACTACTACTAACTTCTGAAGTCAGGAGCCAGTAGCAACAACG TAAT

MARCADOR 21554 (SEQ ID NO: 38); A ^ G

AACTTTACATTTATATTCAATTTTTTTTTATTTTGTTTGTTTTTAGAAATTTGAAAATGGG TACTAATCAGTGTCATTTGCAGCCTCTTAGACCCTCTTTATAACGACCGATTCGATGA AATACGT CAT CAAT AT GCCAGTTTATTGTTCGGGTGGAGAAT GTTTTCAAAAGTT GCT GAAGT GAT GAAGTATAGTGAGAATGCACCTTATTCAGCACCATTAAGAAGTAAATTTT TGCTTTGGAATTTGACAAAGACAAAGCAGGAAGTTGACAACGATGTTCTGATGAAAC GGTTTCGA

MARCADOR 22174 (SEQ ID NO: 39); A ^ C

GTCTATTTTGGCTGTCTTCTAATAATTCATTTTGTAACCTTTTGAAATATGATAAATGTA GAAATTTTTTCTTCCTGGTCTATAATAGTTTAATAATGTGTTGTAGTAATAGTTTTGGT GCCGTT GAAATATTTCAATGATATGCTATCGCAAAATT AG GAATT CAAAT CAAGGTTA CAAGATAATT CAAAAACAAACAAC GT AAAAAT GAAAT AATTT CTTCTTCTTACTTACCA ACAGGCATATCATCATCATCCTCAAATTCATGACTATATTTAACATTGTCATATTTGAA TAATC

MARCADOR 22254 (SEQ ID NO: 40); C ^ A

CGACGCAAAAATCTTTCAAATTGTCACCCAGTTCTCTAAGTGATTCCAATGATGTTGG TAAACATTCTGCATGATGTACCGGGTAATGAACTACCAAGTTGTTTTTTGCTTTTAATA CAACTC GCAAAGATT C T GAAAAC CATGAAATTAAGAAAGATTAAAATAATCTGAAC TCT TTTTTT CATTTTTCCTT GAACTTAGCAATATACTGAGTT GGAT AAAATTTAGAAACGAA ATTTCGCAAATTTATTCAGTAAATTCAGGAAAACTCGGTTTCGGTATTCTAAATATAAA TAGATA

MARCADOR 22259 (SEQ ID NO: 41); A ^ G

GTTTCTTTGGTTT ATCTCAGT AAGATTT GGGCGGAAATTT CAGTTATACTTTT CATTT C CAT GTGCTGTTTTAAATTT CTTCCAT ATTAGT AT AATTTT CAAATAATT GTAGC GT CACT GGTTT ATTT AAGGAT AACAGGTTGGACT GCAGTGGCT GAGAAGT GTCTT GCCGGTCA ATT GTTTGTTGGT GAT CAACTT GTACGAGTTACTGAT ATCGACAT AT AT AAT ACACGG CAAATTCCATTCGTTTT CAGT ACT GCAT CAAAAACGGGATT ATCGGT ACTTT GT AAAT C GCAGTAT

MARCADOR 24708 (SEQ ID NO: 42); C ^ T

GACCCCTGCTCACAAGGCAGTTCCCACAGACAATCACACATCTAATCACACACATCA ACTCATCCGACGTAGGCTATCAATAAGGAAAATTGCATTGCTTTATCGTCTAACTGTA ATAAACATCTACATAAT GAAATT ATTT C GCCACT ATGACAACTAATATCGCCCAAT GCA AATATTTGT CTCAGAGTT ATTCCCTTTT AACAGCTGTT GAACGAATAGAT AGGACGT C ATGTGGATGATCTACTTGTTTCAAAGGTTGAGGTAACACATGAAACACATGAAAACGG TAATTTAAAA

MARCADOR 25276 A (SEQ ID NO: 43); A ^ G

AAAGAATGGTCAGCAAGATGTGGAAAATCGATTACTATAGTTGAAGTATGAATCGAAG AGGTTTTTTTAAATTCTAAGAGAACGAATAATCGGCAAAGAGAAAGTTGAGTAACCTT ATTTT GCCTT GTTTT CAGT CAATTT ATAATATGCGGTTAATT GTGTT AAAGAAAGT ACA AGGT ATGAAAT CT AAGCCAAGAAATAAGAGAAAACAGCTAAT GATTATTT CT GCATTTT TTCTTTTTCGACACAAACTTGGAACCAGAATCAATTGAACTAGTAATCAGATTTTGATT ATTGCTT

MARCADOR 25443 (SEQ ID NO: 44); T ^ C

TTAGATTTTGCTGAAGCATTGTTGGTTAGATCGATGAAAATATAATTATGAGAGATTTT GTTGAAATTCAGCAACAAAATTATTATTCATGTCTTCATGCTGTCAGTTTTGTTTTTATT TCTTCTTT GACAT CGGTTATATTTTTGTCTTCCAACAATATAAAAAAAAAATTATAATCA ATT GGTAAT CAAATT AAAACT CT AATTGTTAGCTCCCT AAAT CAGCTTT AAAAAAAT AA TTGCTTAATTGGTATTTGCTACTATTAGCAAACTGAAACTATCCTTTTCTCGAATGGTG AAC

MARCADOR 26447 (SEQ ID NO: 45); G ^ A

ATGAGCTGATATTTGATATGCATATTAAAAATAGGGTAAATTACATTAAGTTAGATATC GTTCGGATAAATTAATTAGAAAAAATGTTTACCAATTAGATCGCAATGATGTAAAATTT CACGT ATTTTTATT CTTAAGATTTATTT GCAAAATT CAAAAATATGTCTTAT GAAAAAT A ATATTT CTGTGT AAGAACAAGGGACCGATTCACTTGATTTATTCGCAAACAATCGAAA TTCAAAATTAGTAATTTTAAATATTGCTTTATTCAAACCATACCAATAATAATTTGAGAG ATTT

MARCADOR 26730 (SEQ ID NO: 46); A ^ G

ATTGATTGATTCAAATAAGAAATTTAAATTATTTCCCCTTTTTTTCAAAAGATTTAACAA ATATTATTTATTTGATCTCCTCGTTCGTTCTTATCTTTTTGATTATCAATCCATCCTCCT CCATCATATAGCTAATTT ATTTTTTGCATCGTAAAT CAATT GAT GTAT GATT GATTT CTT GATTATAAAAAGTT AGAAGAATT GAATT GCTTAAATTT AATT ATT GATAAT GAAAT ATT A TTATATTTCAAAATGATACGAAGAAATATGACGATGATAAGAGAAAATATGATATTTAT C

MARCADOR 26974 (SEQ ID NO: 47); C ^ T

TACGATAAGTTATTTTATTTTACACATCTCCATCCTTGACTAGTGTCCGTGCCGACTGT CGGACTTGAACCGACAACCTACTAATTACAAGTCAGTTGCTCTACCCAATTGAGCTAA GCCGGCCATCTAGAATGTGCGACCCCGTCGTGGTACATCTTCTATAATCGTTTGGTA TT CAGGACTCTCTT CTTTCGT GGGT GGAGGAT CTT GAT ACAGTT GACT ATTAAAAATA GGGCCTTTGTTAGTCTGTTACAACTCATAGACAAAGGCGACAATTTTAGCTTACATCT TACGTTATGC

MARCADOR 27080 A (SEQ ID NO: 48); A ^ G

ATGGTAGAAAATTATATGAAAAAATATCATACTAAAAATATAACAGATTGTTATAAGGT ATGGTTTAAGAATTTACAACAATTGATTATTTATGATAAAAAAAAAAAAAGTAAATCAGT GAAT CATT AAGATAGTT AT GAT AAGCAGTTT GTATT CGGTAAAGCGAAT GATT AGAGG AATTAT GGGACGAAACGT CT AT AACCT ATT CT CAAACTTTT AAT GAGT AT GACGT GT CT TGCTTGCTT AAAATT ATTT CAAT GAT CATTT CACTTTACCAGTAT GAT CATGATT AGAC TTGAA

MARCADOR 27349 (SEQ ID NO: 49); T ^ A

TTAGTATCGATATTATCACAAATGATATCACTTTCATCAATACTGGATACGATTTTATTA GTATCATAATTTTGTGGCTCGCATTCCGAAAGTTTTACACGTAGAAGATTAACCTGCA ATAT GATTT ATTTTATCATTTTCGAAT AT CCAACTTT GAAATAATTCGAAAAT GTT GAAA AATTTTGAAAAATTGTTAACAAAAT ATT ACAAAAAT AT CAAAT GAAATT AAATAACTGT C CATTTCAAAAAAAGAAGAAAAATTATGAAATTACCAATTAAAAACAGGACTTATTAATT AAA

MARCADOR 27461 (SEQ ID NO: 50); G ^ T

TGTGGAAATAAAGTACAATTAATTGCTGTTCGCTTAATAATATTATTTTCATTCTTGGC TTTTTTTTTCTTTCCCCGTGATATTATAAAATATAGTTTTTTAATTTTAACAAATCGTCAT AATTATTT AAAAAAT ACTGAGGT GAGTAAATGT AATT GGTT GCT GGAAAAAAAGT GGG TGATGAGAGGTGAATGAAAGCAGAATAGTTTATGATTGCATCAAATTTCCTCCTTAAT CTGTGATTAAAATCAAACAAAACCCGAAAAGTTTCTTCTTCGCCTTTTTCTTCTCTTTG TTTCA

MARCADOR 29128 (SEQ ID NO: 51); T ^ C

CGAAATCCGCCGCGTGCATTACTTTGCGCTTGTTGATTACGACGCATTTGTTCGTCG TTGATAACCTTATCAATCATCATACGTCCGTTACGTATGCAATCAACATCGCCAGTTA GGCT GAAAT CAAATGGAT GGCGAT GATAT CAAAAACAAAAAT AAGGAGTATTT GCT GA AT CATTTCTTTTTCTGTATTATTATCAAAATTTT CTCCTTTCCATT GTTTCCTT CTTAATC AAGTGAATGCTCATTTCATTTTGAAATAATCCAACGTAATAATTCCCCATATTCCCAAT TACTTTC

MARCADOR 29168 (SEQ ID NO: 52); A ^ G

AGAAATATTAAACTTTGAAAAGATGTGACATGTTCTGTAACAAAAGCCCAAAATTTCGA CTGCTGCGGCTTGAAGTAAAATTTTGGAATATGCTACATCAGTAGTGCAACAGATGGT TCGATAAATAGTGGTAAGTGATGGGAATCCT AGGAAT AGATGGGAATT GTATTT CAGA TATAAATTT GATGCATATTTTCATAGTT GATTATATCTAC GAT CACACGTT GAATATTCT AAAAGCAAACTGTAATTAACTAATTGAATTTGAAAATTTCCAAGAATTAAAATTGGTAA CAAAAA

MARCADOR 29455 (SEQ ID NO: 53); T ^ A

ATTGTCAGGAATGAGAAGCAAGTTTTGGATACTTAAGGGATGAATGGAACACATACAT GGCAGAAAATGTTAGTAATCAAACCATTTAAATTACTTAGCCACTATGCTAAACTTTCT AGAAGT ATGGTT GAACGTTTAAAAACCTTCGCAAAAATTGT ATT AGATT AT CTTAATCT TCCCTACATCAAAACAGAGAATTTTTGTTCTACGACGTGAGTCTGCATGTATTAAGGA AGTTCGTATCATGACGTAAATATCCTGAGTGATTATTGAATTCAGAAAATGAGCTTTTT CATTTGG

MARCADOR 29816 (SEQ ID NO: 54); G ^ A

ATATGAGTGTTACATGTGTACGTTACATGTAAATATTATATGTTATATGTAAAAATGTC ATGTATAGCATCTATTCACGTGTACGTACACGTGTATATACATATACATTGATACTTAA TACGTATACGCAT GAAT GAACAGATATTATATATTTAC GT ACACT AGACTCACAT GTAC CTCTGTATACGCATACAT GTACAGATATAT GTTT GACATACGTAAATT CAT AT ATGCTT TTATTTATGCTTATATTAATTGTCACATACATGCCTTATATTTTCGTTGTTATAAACACA TAAA

MARCADOR 30575 (SEQ ID NO: 55); T ^ C

GAAAATAAAATTAGCTGAAAATATATGCGAGGTAAAGCACACAGAAGAATTAACTTAA GGTAATATATTGTAAGAATTTTTATATTCGGCGCACCTAATAATTTTTAGACCGCATAT GCCCAGTATTTGAAACTGGTAGCGCTGTTCGTACTTGCTGTTGTCCATGTTATGTATA T GATACCATTCCT AAAT ACTTTTGCGGCTGT GGTTTCCAGTGTT GATGTGACT GGT AT GATGCCTAACACTGGATCCTTCCATCTGCGGCATTTTGTTGAAATTCTTATTGATGTG AGCTGTTTA

MARCADOR 30991 (SEQ ID NO: 56); A ^ G

CAACTGTGAAT CAT AAACATTACTTAAATT AATGAAGCT AGTT AACGACAAATATATTT TTTT AT GT AT CAGTGCTAT CAT AT AACAT AAAAACTT ACTTT CATTAATAAATGAGCT CA AATATT GACTTTTGTCCAAAAT GCT CAAAAT GTCGT CAT AAT ATTTGAAAT GAAGATAA TTTCACGCTTTTCGAAGCCTCCTCTCACGTCTTTTAATCTTCTTTTCTTCTTCTTGCTC TAAT GGTT CT GCGAAAAACCACGGT GCAAT AAT CACTTTCCAT AATTT AT ACAGT ACAT AAGC

MARCADOR 31796 (SEQ ID NO: 57); A ^ G

CTGCTTAACTCTTTTCATTTTTCAGAGAATCTTCTCTAAAATTGTGAATTGATCCAAAC CAAAGAATATGGATAATGTGATTCGAATTCCTGGAATTTAGATTTTGAGAGTTTTGAA GTTTTTAAAGAGATTGAATTTCTGTGACCTTCTGGTATATTTGATGTCATTTCGGGATG CGTATTTTTGCCGAAAATTTTTGGCCTCACTGCAATCTTGTTAAAAGTCAAAAAAATTC AATCGTAGAATTTCGGGTTTACCTGATATTACTGGAAATCTCTGATCTTTGTTCTAGAT TGCTGT

MARCADOR 32164 (SEQ ID NO: 58); A ^ T

ATAAAGAATTTGCAACTCTGTATACCTTTTTGCAGTGCAAAAGCGGATGAATTCTTCA CTGCAGTGTGACAGATTCCTTTGATAAAATTGCTTCGTTCTTATGTAAACTTGGAAATT CTCGGT AGTTATGCTTTT GCTAGTT GAAAAT GTTCT GCTCTT GTAAAACAT GCAAAAA GAGATTAT CTTT GTT CT ATTATGGAAAGATT CTTTT GAAATTTT GACGACT GAGAAGAC AAATTTTATCCCAACTTGTCATCTGCAATAAAAATTTTTCCTGACCTGTTTCTTAACCTT CCAAGT

MARCADOR 32223 (SEQ ID NO: 59); T ^ C

AAAATCAAATCAATATGATCAGATAACTCATACTTATCTTACTGAAAATTCCTCATTCA AGGGAAATAAATAATTGCAATTCTTGATTCCGATCATGGATGATTTTCAAGCAAATTAC CAAT GATATCT ATCGAT AACGATT ACAGCATACAGCT AT AACTT ATTATT GATT GAATT GATGAAAATAATTTT ACCAGAAATTTATCAATGTTT ATCTCATT GCAGTAT ACGAT GTT TAGTGTGACAACACTTTTTCTTGGAATAATTGTGCATAAATCATTGATTGCATTTAGTA TTGGA

MARCADOR 34439 (SEQ ID NO: 60); T ^ C

TCCTGCCCACATTCTTTCTACTTTAGATAATCAACAGGAGTTAGTTGAAAGAGAAGAC TAGGAACAGTTGCAACTTCTGAATCTTTCTGACTTTCTTTCGTTTTGTAAATTATTTATT TGTATAAATTTAAAATT C GAAGAGAAATAAT CCAAGGTC CAACTTCTTTTT CTGTTAGT TCTT GCGAATGCTCCATCAAAATGCAAAAATATGATTAGAATTCT GAT GGAAATTAACA AAATCGATTAGATAAGAAAAGTACAAAACAGAAACTAACTTTTTCTCCCATTTTCATAT TATAG

MARCADOR 34903 (SEQ ID NO: 61); T ^ C

TCATTGCTTTAATACTTTTTAACGAGAATTTTCTCGATCAAAATAAGATCTGCAATTGA TATACGTCAATAAGCGAACATTAGCTGTATTACACGCTAATATTCACATATGATGAAC GTT GTAAGCGTCATACAT CAACATAT ATCCAT CCGAT AAATAAT GACCACTACACATT GCTACCAACCATCCTATCCCGCCACTATTTGAAATGAACTGAGAAGGAGTTATCGAC ACAGGCTTCCTAGCAACCAAACAAAAGACGAGACAGATGAATAGATAGACAGACAGA CGAACATACAA

MARCADOR 35336 (SEQ ID NO: 62); A ^ G

AGATTCTGGTTATTATTGTATTTCTGATTTATTTAATCCCAACTTAAAGATTCATTGGCT ATTGTTTAGCATCTATATCAATTTTATAAATAAATAGTAATACCTGATGAAAAGCAATAA ATAATTAGATGCAAATTTTAATTAGATACAGTTTGATGGAAAACATTGAAGCCATGTAC AACTAATTTATGCATGTTGAATTATGCATGCATAATTAATTTATGCATGACAGCAAGTT TGGTATAAAATTAATTTTGTATGAAGATAAAATTTTATAAATAATGATAATAATGCTGGT AA

MARCADOR 36040 (SEQ ID NO: 63); T ^ C

ATTATTGAAAAGAATAATGTAGCTAATTAGTTGAAGCTGTTAAAAGTAAAGCTAAAAAG ATGATGGAAATTATTCGTATAAACATTCTTTGTAAACAAACAGTCATTTCTGTGAATAA ACAATTATAATT ATAAACAAT ACTTTT CAAGACAATAAAAAAATTAGGAAGCATT GTT G T GATAAT CAATAGTT GAT AGACT GT CAATGT ATTTTTAT CAGT CGTGCT GCTTTTTTT C CCTTTCTT GACT CATTT ATTTTATT ATTT ATTGAT AGAATGT CAAT ATT CT AGT CATTT G TTAT

MARCADOR 37881 (SEQ ID NO: 64); T ^ C

ATCTTAACTTGCTTTAAACAAATAAATTAAAACAGCCCAATGTTCCAAGAAAAAAAGAT AAGTTAAAAGTGGGGTGTCCAAAAATTTATGAATTGAATTGGACAGTTATTCAGATCC T GAAAATACGCTTCTCT GATCACTGCAAAT ATTCCCGATAAATAAGT GAACATTAGGT TAATCTTAATTTTCCCTTAACTTTCCTTAGCCTTTTTTAAATTTTTGGATTATTCAAGCA TTTTTATTGCGGTATCGTTTTTGTAAAAAAAAAAGTATAATTCAACATTCAGGCTCGAC GTTATG

MARCADOR 38622 A (SEQ ID NO: 65); C ^ A

AATTAATAAAAAGAAAGGAATACGATAAAATATCTATTTTTTGAAACTAATCAAACATAT TCCTCACTGCTCACCGGATAGTTGCTTTCTAATTTTACATTAAGAAATATATTTTTTTTT TT CAATAAGGAAAGTTAT GCAGACTAGGAGAATTCTACTCT GAAGAAGAGAT AAGCAT GTT AGAATT ATT AAAAT CT AT GGAAAT ATCCTT AAAAGAAT GCCTATAGTAGCTCTGAT TTCGAAAAAAAAAGCAAAAAACAAAATAACAAATTCTGCTCAATTGAAATAAAAAACTT TCCT

MARCADOR 38622 B (SEQ ID NO: 66); C ^ T

TAAAATATCTATTTTTTGAAACTAATCAAACATATTCCTCACTGCTCACCGGATAGTTG CTTTCTAATTTTACATTAAGAAATATATTTTTTTTTTTCAATAAGGAAAGTTATGCAGAC TAGGAGCATTCTACTCTGAAGAAGAGAT AAGTAT GTTAGAATTATT AAAAT CTATGGA AATATCCTT AAAAGAAT GCCTATAGTAGCTCTGATTT C GAAAAAAAAAGCAAAAAACAA AATAACAAATTCTGCTCAATTGAAATAAAAAACTTTCCTTCAACTTCCAGCATCACTGC TGTGA

MARCADOR 38622 C (SEQ ID NO: 67); C ^ T

AACTGCTAAAAAATTGAAACTAGTGTTAGATTGATAAGTGGGCAGATTAAAACCAATT GTGTTATTGGCCCGTTAATTAGTGACTCTGAATAGCTATGGCGAATCGTATAGTGTTG TACC GACGAC GTATCTAT CAAAT GTCTGCCTTGTTAAATTT CGAT GAT AGTTTATGTG CCTATT ATAGTT GT AACGAGTAACGGAGAAT AAGGTTTCGACTCCGGAGAGGGAGCC TGAGTTGCCACATTCAAGGAAGGAAGCAGTCGCGAAGATTACCCACTCTTAGAATGA GGAAAGAGTGAC

MARCADOR 38622 D (SEQ ID NO: 68); C ^ T

GAAAACTAAGAAGTAAGTGAAATTTCTAAGTTCTTTCCCAGAAAGGTTAGATCCAATA TTTGTTTTCATTTTAGCATTTTTATCCAATGAAAAATGTGCCCAATAAATACTTGTATAT AGTATT GCATTT AAAAACTT CAGAAAGCACAATGAGATCTAAGCTCAGAAATATGACG AATACCAATCCTTTTCCT AGTCTT ACCGCTT CTT AACTTTT GT GTCGCTTT AT AAAAATT AAAAATAAAAAGTTGAACAATGGGAATTACATCATTTTCATCTGAATGGTTTATTTCCT ATTCT

MARCADOR 39492 (SEQ ID NO: 69); T ^ C

CTTCCCTAGCTATGCCTTTTCGTCACTTAAGCTTCNNNNNNNNNNTCTAGCTACGTAT CGTTATCATTTATGCTTCTTTAGCTACGTTTCTCCATCATTTATGCTTCCTAAGCTACG TATCTTCATCACTTACGCTTCCCTAGCTATGTCCTTTCGTCACTTAAGCTTCTTTGGCT GCGTGTCTTCATCATTAATCTTCTTTAGCTACGTATCGTTATCATTTACGCTTCCTTAG CTACGTCTTTCCATCATTTATGCTTCCCAAGCTACGTATTTTCATCATTTATGCTTCCT TAGATA

MARCADOR 42291 (SEQ ID NO: 70); G ^ A

GATCTTAAAATTCTATGAAACTTCTTCTGCATGGTATTGTTTCCAACAGAATATAATGA CAATAGCAACAGTATTGGTTATATAAAAATATTGACTGCAGCAGGATTATATTTCAAGT TCTTTT AATTT CATTT ATTT ATT CTTT CATTTACTTTTACTGTTTTTAT GTTTTTCTTCTTT AAAAAATAT GATTT CTCT CACT GTT CT CTTT CAT CTATCTATATTT ATTT GATAATT GCT TATATGATAACTAGCTAAAGGGAAATAAACTTTCAGTCATCATAGCTTCATTTTAGTAA A

MARCADOR 42411 (SEQ ID NO: 71); A ^ T

CTATACTAATCAGTCCACTATCCATTTTTAGGTTGCAAAAGTTGCAATGACGGTTTGAT TTCATCCTCCAAT GCAATTTT GAGTCT CAATCTCGAGAGAT AGATCGATCGCTTTT AG CTT GATTTAGCTT GGTT AATGTT GT GAGGGATATT GGGCAGAAATTCTGT CAAGCGTT ACTTAAT GAAATAGT AAAT GAT CACT GAT ATTTATTGTTAAT GATACTT GAGCT CTCTA GATTAT GAAC TGGAAGGTTTT CGATAGAAATAATC GATACATATATT AGAAT CGACTT C TTTTTTC

MARCADOR 45689 (SEQ ID NO: 72); A ^ C

TCATCTTTTTCACATTTCATTTAATCATCATTTTATCAATTCCTATTTTTAAACAAATTCT TTTCAAATATTCTCTCTTTCCTTCTCTTTTTGTTTTCCGCTTATTCATTCTAATGATGAA CAGATGT AGAAAATTTGCATTCTATTGCTCACT ACAATTTT GAGT AGAAT ATATTTAAT TATTT GATTCGAGACAGATGGTTATAGC CTTTAGCTT CAGCTT CTCGTT CAAATTAAGT ACTTGTGACCTTTCCAAGTACCATTAAAGCTTTCCTGCGTTTCCTAATTAGAAAAAAAA GG

MARCADOR 45719 (SEQ ID NO: 73); G ^ A

GCATTTTAAGTTAAAAGTATCACGCTGCATGACACCTCACGTTTGCTATCTCAAATTG AGTAGGTTAGAATCTTTTTTTGGCTACTATTCAAATATTAATAATAAATTGCTGCAAAC AGATTT CACAC CGGAAAAAAATTAAATTTTT CT AGCAATGTTTTAACTCCCTTATT AAAT ATTTAT AGAAAATCGACT ACTT AAAAAGAATT GACT AACATTTCTGAAT CTCT GCAGAG ATTTATAGATGGATTAGCATCCTACAAGTTTTTATCTTTTTGCTATATTTCCATTATTTT TTTA

MARCADOR 46063 (SEQ ID NO: 74); T ^ A

GATAAGACGTCTTATTTTGTAATAATTCAAAAATTAATTAATATAGAAGTAAGATCTTGA TAATAATTAATATGCTCAAATTTCTTAATGAGAATATGTTCAGGATGAAGATGAAGTGA AAGAAATT GATAGATTGAGGAAGCAATT GCT AATT GAAACAGAACAGCTCGTTT CCAA TTCTCTTAAAGATTTACTGAAGAAAATTT ATT ATCCACTT GAAGAAGCTATT GAT CTCA AAATTCATCAGAAATTAATTCAACAAATTGCTGCCTTGTTGAAGTGTATTAGTATCTTG GATAA

MARCADOR 47481 (SEQ ID NO: 75); C ^ G

ACCGCAAAATACCTAAAAATTTCTATAACAACGATTAACACGGCCTCGAACTGGAAGC ATATTAATCCATGCGTGGCTCAAACTTCAATCATAAAGACAAGATCTAGAGATCAACA CAAAATGGT GAATT GTTACCCTATCGTTGCTAAAGTTT GAGAGAAAAAAGT GCTAAAT CAAGTAGT ACACCAAATTTAGTTAATATTAAGAAAT CAATTTAGTACTGAATTTAAACA AATGAAATTTTACGATAAAATAAAAAAGTACCTGATCAAACAGCGTCCTCCCGTTATTC CCATTGCT

MARCADOR 47722 A (SEQ ID NO: 76); C ^ T

TATAAGACTAGTAAACAGATCGTAATATAATAAATATCGATTTTATTTTAAATTTTCGAA AACTTCCAAATCTATCGATATGAAATTAAAGATCAATTTTTAATTTCCATAATATATTTA GATTCTATCCCAACATCACTCATCTTTATGTCAACTT ATTTAATT CTCTT ATT AACATTA TATTT CTT GTTTACAAT GATAAATTTT AT CAATTTT CT AATAT GAT AGAACATCTT CAT C ATCTGAAGATATGCTTTTCTCATCTTTGTAACAATTCGTATCGCTTCTGATTTTACTTTC

MARCADOR 48750 B (SEQ ID NO: 77); G ^ A

GTTTTATTATTGCTTATTGAATAGTGATAATAACACTTTGATATGATATTGTTTTGTTGC GATCATTGTATTGATTATAACCTTAATTAAACGAGGATATTATGGGAAATGTATTTATT ACAAAATTAAATAT GAAAGGTT GAAGT CTT GACGAAAC TTT CAAACACATTT CTCGAAT TTTCTCT GCAAAAATATCGTT ACGATTTTTGGAAATT AT GAAGTCCAAGAATTCAATCG AGAGTTCGCCATGTCACTTTGGCTAGTTTCGTTTGTTTTTAATATTTCAATCAAAAGTC AATT

MARCADOR 48750 C (SEQ ID NO: 78); G ^ A

CCTTGGATATTGTTCTTGACATCGTTGATCAGAAGGTCACCGTAGTGTTCGGTGAGC GAGATGGAATTGGACTCAGGTTTATTCTCCGTTTTTTTCATGTTTTTGAATTTTAGAGA GAAAATAAT GTTTGTCT GAAT GGTT AGCAAACTAATTAGTTTTTAAGTT AT CAGGAACT CGAAGT AT CTTCTTTT GCACTTCTTT AACCTTTTT CAT CAAATTTTTTAACAGT AACAAG ATTTTTTT GAGAATTTT CAAAATATTTTT GACTT CT GATGATATTTGAT GAGAAAACCAT CACTG

MARCADOR 48790 (SEQ ID NO: 79); A ^ C

AGAGT ATT ATTATACAT GATGATGATGAT GAT GAT GAT GAT GAT GATGATGAT GATAT GATGATGATGATGATGATGATGATATGATGATGATGATGATAATGATAATGATGATGA T GAT GATT AATT GCTT ATTTTTAAT GATT GATAACTTTAAAAGAAAT CATT GAAATTT GA TCGAATAAAAATTTT CTTAAAAAAAGCATTTGCTATTTATATAGTAAACCT AT AAAAAAT TACTTATTTTTATTACTAATATTCATTTGATTGTATGAAAGAGAAGAGAAAAAAAACCTT TGCA

MARCADOR 49731 (SEQ ID NO: 80); T ^ A

TGGTATCACAGCACTGGGTTTAATTTCAACAATCGGTTGACGATCTTTTCGGGATATG CCTATACCCAGAAATGAACGTATGCCAAACGATGGTATGTTTGATGCAACAGACGAC GT CAACTTAAAAT GTGTTTTTTTTT CAAAAATT CAAT ATTTTT AGTTTAAAATT GCACGT CAGTAAAAATT AATTCAT AAT AAAT CTCTTTGATTT CTTCGTTCTCCTTTTTTTT CAGAA AAAATTGAAATTTTACATACCTGATTTCCAAGAGCATATAAAGCATCACTTAAAGCATT CTGCGA

MARCADOR 49824 (SEQ ID NO: 81); T ^ C

TCCTTTTCATGATTTGTAGCTAACCAATAAGATGTGTATATGTTCATATATTTACTCTC CCCTGACTCTTTTACACTCTCATTCTCTCATTTGTTCATTTAGATAAGTAATATGCGCC TTTCTCTTCCTGATTCTCT CAAT CTTTCATCCCTTCATCTCCTCAATCTTT CTCCCATT C TCTCAAT CTTTCCT GCATT GCATT CATT GAT GAAACACGATAGTATT AATAAGCAT AAT TT GATAAATT GAAAT AATTTTTTTTNN NNNNNN NNTCATTCTCTCAATCTTTCCTGCATT GCA

MARCADOR 49904 A (SEQ ID NO: 82); A ^ G

TTTGAATTAACAAAATATTAACAATTACAACTATTTCGGAATTTAATTTAAGAATAATTT AATTAATCAATTTCCTATTTTGTATTTTAAAAATTACCACAATAATTATGTAATTTTTGG GATATTT GAAACTTT GAAAAAAGTGGTATT GT ATTT GAGAAT AAATT AATTAAT GTAATT CTTGCTGCTCATCGTT CCATAACTTACAAATATTTCTCGGTATTTT ATTT GAGAT AATT CTTATCATTTCTTCCATAGCTTTCAATATATTTATAACTTATTTGTAATCACTCTTATCA C

MARCADOR 50378 (SEQ ID NO: 83); A ^ G

TTGAGATATCAAATCAAGCGTTGCATATTTATAGTACACTGGTGTAGCTGAAATCGCG AAGAGAACACGAAAATCAGAGAAGTCAATGGTTCCTTTGTGTTGGATTTCACATGAAA GCATCCTTATGTT GT ACATGCGTGATTACAATAT GAT ACAAGATGTAAGCT AAAAATT GTTTT ATCTTT GTCTAT GAGAT GT AGTT CAT ACT CT AT AAT AAAGTCCCAACCCTT AAT TCTCATATTCACAACCGTATCAGAATCCAACACCAAACCATTATAAAGAATGTTCTTCG TCGAGGCG

MARCADOR 51565 (SEQ ID NO: 84); C ^ T

CCACTATCGCTTACACTTTCTTTATCCTGTTCTTCTTCATCTTTCGTTTTGGACTTTATT TTACTGTCAGGTGACAAGCAAAGTAACGATGTTGGACTTTGCGAAGATGTGGATGGT ACGCT AGAAAAAAAAT GAGGATT GGTT AAT AT GTCTAATTATTACATCGCTTTTTTTTA AAT CTTTTCTAAAATTAAAC T GAATAATCAACTTATTTGCTATTCAGTTTATCTTATTTTT TATCAACAAAATTCGAGGAAACAAATCGCTTATCAGAATAATTGTTTTGATCAACAAAT AAAG

MARCADOR 58162 A (SEQ ID NO: 85); G ^ A

CAATCCCACAAATTCAGTGTGTCGGCGGGTCAGCGAAGGGAAAGTTTGAACCGAGG GTATGTACAAATTGTGATAATTTTGTGATGACGTAGTAAATTTCATAGTTTTGCATGCT TTAATGTTGATAGTCGCACAATCCTACGTTGATTAAATTTAGCTATTAGATATCCTACT AAATTAT GTT GTT CAT AATTTTTGTTTTT AAAAT GCTCCACTT AT ATTTT CAGGTTGT GC AGTGCTACAATAGGGGTTATGACGGCAATGATGTCCAATGGGAGTGTAAAGCGGAAA TGAGCAATC

MARCADOR 58864 (SEQ ID NO: 86); T ^ C

T CAGATAAATT GT ATTT GATGTT AATT CAAAGAAGAAAAAAATAAT CAGTAGAATATGA AT CGAATAATATTCATACAACCAGTTTATTCATTATTATTCACTTTTAACGTCTAAAT GA CGTAGCTACGCTTTTTTT CTCGCTTT CAAGCCTTTACTGACCAAGATT AATGT ACATT C TGTT GAACAAGATT AATCGACATTCTATCGAT CAAGATCAAGCTTTT ACT GAT CAAGAT TAATAAT GACATT CTTCT GTT GAT CAAGATT AATCGACATTCCATT GAT CAAGATT AAT CGAC

MARCADOR 62666 A (SEQ ID NO: 87); G ^ A

CTCTCTAAAACCTATTGGTCACTAAACTTGCACTGACTAAAAACTATTGGTCATCAGA CTT GT GATT CATT GAAAAGACCGTTAGCCGCT AAAATT ATGATT CACT AAAAAAAAT CT ATT GAT CATT AAAT CTGT AAT CATT GAGAAACTACAATCATT GGT CATT AAGTTT GTGC TCTCT AAAACCT ATT GGT CATT AAACT GACT AAAAACT ATT GGT CACTGAACCTAGAGT CTATTAAAAAAAAAATCATTGTATCAATAAATTTATTGTTTACTATCAAATCCATTGATT ACTGA

MARCADOR 62666 B (SEQ ID NO: 88); A ^ T

TCTAAAACCTATTGGTCACTAAACTTGCACTGACTAAAAACTATTGGTCATCAGACTT GTGATTCATTGAAAAGACCGTTAGCCGCTAAAATTATGATTCACTAAAAAAAATCTATT GAT CATT AAAT CTGT AAT CATT GAGAAACTGCATT CATTGGT CATT AAGTTT GTGCTCT CTAAAACCTATT GGTCATT AAACTGACT AAAAACTATT GGTCACTGAACCT AGAGT CT ATTAAAAAAAAAATCATTGTATCAATAAATTTATTGTTTACTATCAAATCCATTGATTAC TGAATA

MARCADOR 7060 (SEQ ID NO: 89); G ^ A

AAAATGTATCAAATTCTTCGATGCCATAAATTATACAGACTTGATTGGCATTTTTTCTA ACTTTCATCATGAACCATTCTATTTCTAAATTGATCCATTACAAAATCAACTTTGTGATA T CAT CAAT CT CAGT CAT AACGAGAAATAATGAT AAT ATAAAGCGACT AT CATTTGAATT TCCTGAATATT CAAGATGTAATT ACAT CTTTTTTTT AATGTAAT CAAAATTT CTTGCCAT CAATAATTTTTCAACATATGCTTTCATCGACTGCCTTATGCAGATCGTAATGATGACAG CCA

MARCADOR 12056 (SEQ ID NO: 90); T ^ C

ATTGATTAAAAAGAATCAACATTAAATTTTTGATATAGTCGAGAAATCCTTCGTGATAA TTCTTTTAGAACAATTCTTTACACTAAACTTGTATTTACTTGCTTATTATTTGTCTAAAG ATACTAACTATTTGTCAGT GGAATTT AT GAT CTTGGCATTATTGCATATAACGCTTTCC TAAAAT C T GAAATTTTT CAGTATTTTAAAAAC TAAGACGATT ATTAAATATTACT CAAAG CTTAGAACTTTGATTATACTAATCAAATCAAAAATTTCATCAGCGATTTTTGTTGTGTC ATT

MARCADOR 16261 (SEQ ID NO: 91); T ^ C

ATTTTTTCCAGCAGAATTGTCATCAAAAATCCCATTTTTGATATCCTCTTCATCGAAAC TTGCTCCTGAATCCAGAGAACAACGAAGAATGTGTAAATCTATTTCAGTAGCCTGCTC ATT GT GCAATT CAGCGACTTTATTT CTGTGCTTCAAGCT AACTT CTT CATTATGCCACT CCTCTT CT CTCGCT ATTTTTTCGCT AT CT AATT CAAAAT CTTCGTCTGAAACGGAAT CA ACTCCTGACGATGTACTCGACACTGATAATATTTTCATGCCGATTTTTCTCTCAAACG AATCTTT

MARCADOR 23195 (SEQ ID NO: 92); C ^ T

GAATGAAGAGCAAAAAAATAGTCACGACCACCTGCAATAAAAACAGCATCTCCGTAA AAATGATTGAATTGATTCCCGAAATACGAGTTTATCAAATTGAGAATTATGCAAATTAA TTATCAGCATGCAGATTT ACTGATTTT ATATCT CTCATACCGAAATTAAGGT GAT GTTT TCCATTT CTTT GTTTCCACAAT GT CTT CTTTGT GAATCGTTTTGGAT CAACT ATTAAT C CGATCGAATCAATCCTCCAAATATGAGTTTATTCAACGTAACAAAACATTGTCCGAGA TAATCAAA

MARCADOR 28579 (SEQ ID NO: 93); T ^ C

TGGAAATTTCGAAATCGAAAGGATGAAGAAAAAGGATCCTTGATCTATACATTAAATA TCACCATATCAACTAGCATGGCAAGTCAAAGTAATGTTATCATTTAAATAAAAAAGATG AATAGTAGGACTACAGGTTATATT GTTAAAAGTCGACAAATTTGGAGTAATT GACAGA GATCAACGATTAAATGTAATGGATGATCTTATCTTCTTTTTTCAACTACGCCAAAATGA AAATAACAATT GAATTT GTC GAAT AAGAAAC TAACATTTT GAAAAT AAGATTGAACATT TATAAAT

MARCADOR 48869 (SEQ ID NO: 94); G ^ A

GGTTGGATCATTATCGACAGAACTTTAGAAGTTTCTTGATAAGGACGAAAAGAAGCAG CACCATTGCTGATCTAAACAAGGAAAAAAGACCTTTTTTGGAATATTGAAGTTTTTACT GATAGGT GCGTGCT GT GTACT GT GGGCATAAGTACAAGCTTCATGCTCCGCAGCGT GAATACGTGCTGCATGCATACT AT GCAGTAAAGGTGCGT GTCGT ATT GCT CAATAAG TGTATAAATTGCTGCTTTTCTTGCATAGTTAAATATTTTGTTTTCATTTTTTCCGCTATT CAAAATAAAT

MARCADOR 53021 (SEQ ID NO: 95); G ^ A

GTTGGGATTTCAGACTCTCACTCGGTGTCGTTTCACAGTGATATCTGAATCGAAGTCA CAAGCAGGTATGAATGCATAACAACTAATATCCATTGCAGAAACAAGGCAAAACTGA GAAGCTCGAGCAAT ATAGCT AT AGAAGCTGGTACCACAGATGACATT ACATGGTATTT CCATTTCAGCTTCACAAACATTGTAAATAGCTTGCTTCGATGATTCAATATCTCGTTCT ACGATATTCTTAAAGTAATTTTTATTTATTTGAAGTATAGATTACATCCATGTTCTATCT ATCATTTC

MARCADOR 7986 (SEQ ID NO: 96); G ^ A

TGTTCTGAACATCTCTTTTTGATTATCTTTTTTAATTCCTCCATTATTTTCGTTTTTTTCG TTGTGAATTAATATTGTTTGTCTTTGATTCAGATGATATTTTCGGATCGTAAATAGATG GCATCGGCAT AAGCGT ATT GAGAAGCATTCAAT GGTGCACTCTT GCTT CTTTTTTTTT T GAAAT CTTT CTCGAT AAT CAAAT AAGT GCAGGATGCCAAT CATT AACAATTTCGTTCC ACTTTTTCAGTTCTTATTCTTATAACACCACATCTCATTTGCAATTTTGTCGCCAATGAT TTT

MARCADOR 48094 (SEQ ID NO: 97); C ^ T

TTTTTTCGAGGTCACTCTGGAAAAATAAATCATATTTTAAAAAGACATAAAATAAAAAA TATGTATATATAAGAAAATTTTTACTCTGAATTTCTTAAGAAAATTCTCGATTCTGTTTT CCATAAATTCCGGAATATGTTGTCCCTGAATTAAGAATTCGATTCCTTGCACACCATT ATTTCGTCTAGTTCCT GT GTGAACAATGTAACCTGGAAAT GAACACAT AAACTGTAAT ATTTTGAGCTTAAAATAATTATGAGGATGCGAAACTGAAGATATTCATAAATGTTTAAA AAAAAA

MARCADOR 6568 (SEQ ID NO: 98); T ^ C

GTCCATGCATTGCTTTTCGGAAGTTAGTGTAGATTCAGTGAATATTTAATACCAGTCT CTTTCTAATTCAAAAGAGCCTCCCATTTCTTTTTTCAGTTTCAGTCTCTGAATCAGAGC GTGTAATCTACCACTCCATTGCCGAAAACAGCTCGATGTATTTCCTGCTACGTAGTGT TTAGAATTGGCGTATGCCACTTGCTCATTATTCGCGCATGAAGTGTAACTGTGAATAG AATGATACTACTGTTAGAAGAGAATGCGTTCACTTTATTTAACATTATACTGATTCATT TCTTCTTT

MARCADOR 17022 (SEQ ID NO: 99); C ^ T

AGTGAACGAGAAAAAACAGAAGAAGAGATAGCACATCAAGATCGTGAGAAATTAATT AGACAAGAAAAAGCTCGTCTTACACAAATATATCAGGTTTTCTTTTTCTTGCTTTCGAA AGTTATTTGAATT ATCTCATTTCTTT GAATTTT ATAAGAAATAATTT AATTTTTTTTT GAA ATTTT GCCTATTGAGCT CT AAATTTTGTAAAAAGTTTTCTAGGAT GAT GTT AGCAAAGC AAAAAAGAAATCCAAAAGTGATGGTAACAAACAGGAAGATTTTATAGTGAGGTACGAT AATACG

MARCADOR 55751 A (SEQ ID NO: 100); A ^ G

TAGACAATATCATCCTTCCTTTTTTTTTGCTCAATTTCTCTGCTCATTGCTTTGATGATA ATGGTAGGTGGTATAATGAAACGAATAGATAATTGATGTTCGCAAACATTTGCTGTTA AATTTCAGTAAAGAAATTGACCTTTTTGCTTTGTGTTGGATGTTTAGCTTCATTTTCTT CTTGTTCATTGTCATATTCATTCTCTCAAAACTTCTTGCTTAGCGATGCTAATATAAAT ACTGGAAGAATGCCTTTGCTTTGTTTTAGTTGTAAATCATCACCAAGGTATTTTTTTGC AAAAT

MARCADOR 55751 B (SEQ ID NO: 101); A ^ G

AAGATGAAACT AAAAAAAATT ATTT C GAAAAAAAGAAAATAAAATTAAT GAAATAAAAG CAAAAAT GAACAAACCGTATT AATTTT AAACAAT AAACAATATCGAAAT C GAAAAAT GG ACTATT ATTGAT GAACT AT ATTTT CAAAATGT GAAAGGTCAAAGTTT GTTT CAATT ATG ATAAATACAATTT AAAATAAGATTAAGCTAACAAAT AAGTT GAGCAAATTGAT GAAACA AACAAAT CAGAAT ATATT ACAGAAAATGATATAACATGAAAATATATT AGACCAATTAT TTTTA

MARCADOR 15893 (SEQ ID NO: 102); T ^ C

TTGAAGTTTTCAGATAAACTTTGATAAAAAATTGTTCTATGAATTCTCAAATTTCAATTA GTGATACTTATTTCGAAGGTAATTATGCCTGATTGAATCTTCAATATCAACAAAATGAA AATTTTAGTATGATTGTTAACTCATACACCTCTAATTAAAGGTATTTTCTTTATCCCATG AAATGAAAATTTATTAAGAACTTAGAAAGCTACGGTATGCCTTTGATGCAAAAGAAAG ATTCATTTTCATTAAATCATGTTTAAAAAAAAGAGCAAAGAGCAAAAGGTGATGAAAGT

MARCADOR 25462 (SEQ ID NO: 103); C ^ T

TTCTATACGAAATATTTGTCTGCCATAAATCTACTCAGGAACTCGATACATCAAAACAT AAGTACGCTTGCTCTTTATTTTTCGTTTGAAAAATAAATAGATCATTTTCGCACTTACA TTTCAATTT CAATT GCTTTATTCATATCTTTCTGTTTTTACTTACTG GTATTTAACAGTC GTT GTT CACAATTT AAT GATCT AT GAAACACCATTT AATT GT ATTT GGACT AACTTTT C GACAAGCAAAAGATTAAAATTGTCTTCAGATACAGTTATAAATTTACATTGAAGATAAA TGAA

MARCADOR 33494 (SEQ ID NO: 104); A ^ C

TAACGATCTGTATATCAATGGAATAATATTCAGTTCATGTTGTACTCGATATGAGATAG AATTACAATTTTGGAACAAGATAATCTCAACAGCTATTTTCAAGAATAGTTAAATTAGG ATACCATT CAAAGAAACTTT AAAAAAT GATTT CCATACATTAAT GCTTTTT GTGTTTT C G CTCTCGACCAGAAT CCAGGAATT GTCCATTATCAT CAATTT GATT AACTTTTATCTTTA TTCTAATTCTTCAACATTTCTCTAATTGATATTAGTTTCAATATTTTAATAAGTAAAAATT TA

MARCADOR 17935 (SEQ ID NO: 105); T ^ C

ATAATGTGTTATTGATCAAAGGATTTTTAGTTACCTACCAGATGGAAAAAAAGCAAGTT TACGAAAACAGAAGTTAGCATCAACTTTCATCCATGGTTACACCGTATATAATCCAAT CGACT CAT ACTTT AT GTT GAT CT GATTTTATAGCAGATAACTAGTTACCTTGCT CAGCA GCAGCT AAAT CCTTTCTATTT GCTT AAT AACAGAAAT ATTTTTCATTAACAAAGAAATT A TACTCCGTGTTTGACATTTCATTTTAATTTCGTTCCAAAAATGAAAAAAGCTTCGTCCG GAAAT

MARCADOR 48561 (SEQ ID NO: 106); C ^ T

ATTATTTTGTAGTTTTTCATTTTTTAGTTCAATTTTCCTTTGCTTATTTTAAATATGCCAT TCTTTATTCAGACTCATAGCGAATGCATATGTTCATTAATTTTTTTAGTTACAGTTACAA ATTCTCAATTTCTCTTTAATCATTTTTTTTTCCAAAAATAGTCTGAGCACTCAACCATTC ATTCAACAATT GCAGCTTTTTTTATTGGAGCCTT GT CAAATTATCAATTCGTTTCCATG TTTATTATTGAAATAATAAACGGTATTTAGGATAACGAAGTTCGCTTAGCTTCTTTGAC T

MARCADOR 42003 (SEQ ID NO: 107); T ^ G

AAAAATTCAGGTAATGAGATCAGTAATTTTTTTTGGTCACTTTGCTGTTTCTTATCAGC TCATTGTTATCCATATCAAATGAGCGAAAGTGTGTATCACATATTGGCAGAGTGTAAT CTAT GAAGATTTT GCGTATCAAAGTAATTAT GAGAGAACTGATAATTTTATTTT AAAGT AGTAGAAAACTCGAATTAAGCTAATAAATAATCGGTTGATATCCATGAAATGAATTACT AATGAAATGGATAATTGAGTAATAACAAATGATATTCATGAAGAAAGGCAGGTTTTTTT TAATAG

MARCADOR 29566 (SEQ ID NO: 108); C ^ T

TATACTTAAAACAAGAAATACAATTAATGCCAATAGCAGAGTGAAACTTCTGAAAAATA ATGAGTTGAAACTGGTAAAATTAACATTTTATTAGAAATTTCAGAAACTTATGACTCCT CATGGCACT ATCACAAAATGTTT GAAAAAAATTGACAGCTCGCGTCGATT GCAAAAAT

CAT GATT CCTGATATTTAGTATCGAACATGT GACAAATAATATAAAGACCTAACCATAA AGCACT GAAACAACTCGCGGAAACAAAAAATT AATTT GCAT AAACACGGAATACGATC AGAAAAT

MARCADOR 33868 (SEQ ID NO: 109); G ^ A

GAATTTTTTTAGAAGGCTTGAAGTCGAGAATATTAGAGACTATATCGAAGACTTAAATA ATCCTGGTAATCTTCTGTATGAATCAAAATTACCTCGAACAGAACCATTCAGCACATC ACGAGAT AATTCATGGAATGAAACT AGCCAAT CAGAGCGTT GT AAAAGAAGAAAGTT A T GAAAT GACCTT AAAAT CAATTT AAAGCAT GTCCTC GCCAT AT AAGCGTT GAAAAGTT AGGATAGAATCAATTATCAAAAAAATATGTTAACTAGATCTTATCAATCAAAACATCAG AAGGAAAA

En otro ejemplo, los marcadores genéticos de D. immitis incluyen las siguientes secuencias (SEQ ID NOs: 110-127), donde los nucleótidos subrayados (es decir, los sitios polimórficos) indican la posición de nucleótido de SNP dentro del fragmento que se correlaciona con la resistencia a MLs (es decir, el nucleótido alternativo). Dichos marcadores fueron identificados después de una comparación de frecuencias de genotipo entre individuos susceptibles e individuos resistentes a ML confirmados. En dichas secuencias, el nucleótido subrayado en la posición de SNP generalmente es diferente del nucleótido encontrado en esta posición en organismos que son susceptibles a MLs (naturales). En las siguientes secuencias, el nucleótido de la posición de SNP en la secuencia indicada se correlaciona con la resistencia a MLs. En el encabezado de cada secuencia, se muestra el cambio de nucleótido entre el natural y el nucleótido alternativo (el nucleótido alternativo se correlaciona con la resistencia a ML) en el sitio polimórfico.

MARCADOR 31307 (SEQ ID NO: 110); A ^ G

ATATGATAATAGTGAAACAATTCCATCACAATAAATATTATCGATTAGGAGATAAATTA ACATTGATGCCTCAATTTTGGTCAACAATATATATTTGCTATTAGCATTTTTATTAAATC GTTTTT ATCTGACTTGACATAAATT GAAAT AGAAAAAATT GAATCTGTT CCTT GTT AGA TTTT CTTCTAAAAATTCTT GAAATACAAATAATTT CTT AAATTTCAAT ATTTCTACATAAT GTATTGCGACAAAAATGCTAATGATTGGCTTATTATTATTTCGAATAATTTTTTAATCAA A

MARCADOR 26225 (SEQ ID NO: 111); A ^ G

AGCTCGAAGATCGGACAAAATTTGTTCAGCTTGTTGCCTTGAGGCTTTAGTCTGAAAA GACACTTAAAAGTATAAACAAATTATATTCAAAAAATCTTATTTTGCATTTGCGTCTTAA TTTTT GCTTTTT GCAAAGTTTTTTCCGAGCAAGTTTTT CTAT CTTCGAAAAGATTATAT C AATTAAAATTT CAATTT AAGCAAT CATT GCCTCTTC GAGTTT CT GTTTCAGCAAAT AAA TATCACCACCACGACGCTGTCGGAAGAAAGAAACGCCTTTCCCAATTTCTCGTCTCA ACTTTT

MARCADOR 47722 B (SEQ ID NO: 112); A ^ G

TAAGAAAGCTGGGAGATTTTCCAAAAACACTATTTCCCACGATTTGTTGTTTTCTATGA TCAATTCTTAATCAAACTCTGAAATTCTCAAATTTTCGATTTCTATCCAACTTCTACATA TTTTTTT AGAAAATT CATATTTAGCAAAGCT GAGTGTAGAAAT AATT CATACTTGCAATT CATTTTT CTT AAATTTTCGAATTTCTT AAAAAAGTATTT CAAATT ACCTACCAATTTT GA TTGGAAAATTCGTGGATGCTAAAAATTCAAATCAAAATAGTTAAACAGTATTCCTAATT GT

MARCADOR 58162 B(SEQ ID NO:113); T ^ C

AATTTAAAAAACACATCGACATTTTGCGGTACGGTAATGATTGTTTACAGTAACTAAAT GTGTCCTACGGTAGTAATACTCGTGTACGTAATGAATGAGTATAGTGACCGGATATTT CCTT CACTAGT AGGCAATATTAAGAAGTATTTTCATTTT CATATT CTATCT AAAAT AAAC CGATAAAATGGTTTTT GAATT ATTACTTTTT CATT GTTATTTTTT GATCCT AAATTGTAA AATACTGTAATAATTTAGCTAATTTCTATGATTCTATTCAATATGCTTAAATTAAAATTC TAA

MARCADOR 17709 (SEQ ID NO: 114); T ^ C

TCGTATTTGTTGTATGTAATATAGAAATATTGTTTAAATTCAATATGTAGAAAAAATTTC TANNNNNNNNN NAATT AATT ACATATTAACTCGTATTT GTTGTATGTAATATAGAAATA TTGTTTAAATTCAATATGTAGAAAAAATTTCCATAATAAAGACGAACAGCATTTATAATT ATCAATGATAAGTTGAAATTAATTCATCAATGATAAGTTGAAATTAATTTATTTGAAATA ATTTCTTTGAAATTCGAATATAGACGAGAATTTTTTTTTTTTTGCTAATCGTTTATCAAA

T

MARCADOR 47141 (SEQ ID NO: 115); T ^ C

TCTAGCAATAT AAATT ACAAGAAT ATGCCGTCCAAGTATTT CAGAATTTATTATT AATTT GGAT AATAATACATT GT AAAT ACT GCGTATTCTGGATTATT AT GCACTGCATAAT AACA T GCAATTTCGTCT ACAT ATCGCGAATAAACGCCAAAAGATTTCTCGAT AAAAGAAAAT ATAAGAATTCGTAAATGAATGTT GT GT CAGAGATATGTGTTAATT CAT AAGT CAAGAT G TT GTAAATCGATCCAT ATT AGT AAT CAT ATTT ACGT GCTCGT AAATAAAAGCGGTGATT CTTGT

MARCADOR 48750 A (SEQ ID NO: 116); A ^ G

ATCGAAAAAAGATGATCTGATGACGGAAGGCGAAATGTCTGCAGAAGCTAAGATGAC GGAAGAAAAAAGTGAAGAAATGAAAGAAGAAGCTGGTAAAACTCAGAAGGAATGTAA AACTGGAGAATCGAAAAAAGATGATCTGAT GACGGAGGGCGAAAT GT CT AAAGAAGC TAAGAT GTC GGAAGAAAAAAGTGAAGAAAT GAAAGAAGAAGCTGATAAAACTCAGAA GGAATGTAAAACGGAAGAATCGAAAAAAGACGATCTGACGACAGAAGGCGAAAAATC TGAAGTAGATGAGCC

MARCADOR 63962 (SEQ ID NO: 117); A ^ G

ACTAATGATAAGAAACGGAGCCGACGATTTTAGGAAATGAATAATAACGACATTGACA ACCATTGTTAGAAAATTGATAGTACTGATAATAAAAGCTAGTTATAGAAAATTGATAAT AATAATAAAATTGCTGGT AGCAAAT GTCTAGAAGT GATAATAAAATTAATGATAGCAAA TGGATT AGCAAT GATAATT AAACT GATGAT AGCGAATGGATT AGT AAT GAT AAT AAAAT TGATGATAGCAAATGACTAATAATGGTAATAAAAGTTAATGCTAGTGATAACTTGTATT TTAAGT

MARCADOR 6372 (SEQ ID NO: 118); A ^ G

ACAGTTTATAGTTACAATATTCTCCGGTGACTAACTGTATTTTACAACTTATAATTATA GATTACAAAATATATTATAGTAGTTTTATAATTACAGTATTCTTAAGTGAATAACTATAC TTT ACAGCTT ACAGTT ACAGTAGTTTTCTAT GTTTTT GAATATTAATTTT ACATGGTTTT TCCTAGTTT CAGTTT CAAAATTTT CAGAT ATTTTATGTGTTAAAGCAAATT AT ATTCGAG ATATAAAAAGTACTGGTCATATCTTACAATTCTCATCCTTCTATATTGGAAAGAATTGA GT

MARCADOR 15611 (SEQ ID NO: 119); T ^ C

GTATTGGGACCGCGTATCGGGAAATCTGAAAGAAGTCTTTAACAGTATTTTAAATGAA TAATTCAAATCGTTACTTCTTAATATATTAATTTATGCGTATATATGCAGTACATAGCAT TGCTT AAATT CTTATTTTT CCGCGGTTAAAACCCTATGTAAGATAAGGGAGGT GATT G TATCTGCGCCGTACTCCTTGTTTTAATCTACCTGCTTGTTGTATATCCTCCACATATTG TAACTGCAGCTTCACATTTGCATATATAGTAAGGGCATCGTTGTCTCCAGAAGAGATA TATTATC

MARCADOR 46432 (SEQ ID NO: 120); T ^ A

GCTGCCCGAATGTTACAATTAGGACGAAAGTAAAAGTAGTTGACTGTAGGTATGACG ATAAAGGAAAAATTTGTATCTTAAGACTTTACAATTTCTAAATATTACGTGTTTTATCGT GCTAACATCACGAATTCCATATTCACAAAAAAAATTTT GTAGAACTCCATCTGGTTT GG AT GAATTT GCT ACAGTT GAACTGGAT GAT GGAACGAAATT GCAAACATCTCTTATT GT TAGTATTTTCTAAATTCTGTGAAATTTTGCAACGGCATTCATGTTTAATTATTAATTTGG AGAAAG

MARCADOR 29594 (SEQ ID NO: 121); T ^ A

AAATAAGCAAATCCGAAAGTATTACATATACGGACTAAATATTGCCATTCATTCGGGA GTATACCATTGCAACCATTGGTATTTCATTTGATCGAGAAAACTAGTTTTTGTAGTTTG GGAT AAAGAGAAATGGAGAGAGGAACTTT CAT GAT CAATTT CTTTAC GT ACT GAAATT CATTTCTATGGATGTTCTTTTTCTATTTCATTCTCCTCAGCAAATACAGTCCGAACAGT CATCAAATAAGTCTAAAAGGCATGAATAATATAAACATCAGCAACTTTTTAAATGAATG CTTATTA

MARCADOR 26784 (SEQ ID NO: 122); G ^C

ATTTCTAT AAACATCTCTTGCATT GATT AATTTAACATGTT GCAAT AAAT ATTT CTTACT

TTTGAAT GTAT CATTTACTAGAAAAAACTT CAATCGAGGAAATAAGTTTTAAAATAAATT CATATTTGAATT CAT GT CAGTT CAAAAATT CTATT ACT ATAAT ACAT GTCT CTTGGTT GT ATCTTTTTTTCTTTT GAAAT AAT ACAAT CAAACGGTTTCCTAAATTTTCAT AGACAT CAT ATTTT AAAAAAAAATGCATTT GAAAATTTTCGAAAAT CAAT GAACTT AATT GAT GAAAAA

MARCADOR 51661 (SEQ ID NO: 123); C ^ G

GCATGTGTATGTAGTATTTCTTTGTAAACAACATATCTAATCTGTCTGTCCCTTTAACA TTATAGAATAGTCAGTTAGTCCGCTATTTATTTTAATAACAAAATATCTCACTTAACTTC CATTTCTTTCCTAAATAATTTTGTTTCGCTAGATCTTTCCTATAATTTTCAAATTTTCAA AAAT GAATT AAT CTTTTATTTATATATGTGTATGTATGTGTATGTATGTATGTGTACGTT GCATATATGTATATGTATGTGTGTATGTGTGTATATGTATATGTATATGTGTGTATGTG TG

MARCADOR 7819 (SEQ ID NO: 124); G ^C

TATGCATAATGTGCGACCAGCCAATAATGTCTTCAAACCATAATTATGCAGAAATAAA TTTTTTCCAGAAATAATTTTTTTTTTTTTACATATACTTCCGATCTGTGAGAAAATACAT TT GAAGTGAAGT GT GAAGCAAT GCTACTTTTT CAAACAACATT GT GAAAATGGATT AA AACGCACCAAT GGAGCAAGAGATCGT AAGTTTCGTTCCGCATGTCCTGTGGCAACGT GTAAACCATCCGTTAACGATATATGATGTAAAAGCCGACACACCCAAATTAAAATCCA TTATAAACA

MARCADOR 26704 (SEQ ID NO: 125); G ^C

AAATGGATCGTATTCACTTCGTAAGAACTTAGTGAACGAAAAATCAAACCATCACAAT AACTTTACTTTTTTTCTTTTTTTACTAAACACACTATCCTATGAAAACAAAATGTCCAAA TAGATT CATAT GAT AAT GAACT GT GAAGTTAT CCAAT CTAT CAGTT CTCGAAGAGGGA ATAAATAAAAACATTAAGCAACCCACCGATCTTCGCTGACCATCTCCTTCTTCATTAG CAAGAAGCAAATCTTGTGGTGATATTTCTGCAACCATCTGCAAAATAAAGCACGAAAA ATTAAGGA

MARCADOR 14329 (SEQ ID NO: 126); C ^ A

TTTGATATGCAATCAACTAACCAAATCAGAATTCAATGCATTCTGATAAATTTCTTCAA TATCGTGCATCAATTCGACATCATATTTTGACAGTGATGCTACCTTTTTAGCCGTATTT CGGAAAAAT AT GAATTCAACCAGCT GCGTCCCAAAATTT AAGGCT GT AGCAAGTCCA GCAACAACCAGCCCTACAACTGAAAATTCTAAAAACTGGTTCACGTGCTTATCATTAA TAATTTCAACACTATCACTATCTCCACATGAACTTGATCGATTATAATTTAGTAGAACT GAAAAAAA

MARCADOR 56169 (SEQ ID NO: 127); T ^ G

ACAAATTCGTTTTAATATTGGATTACATTGAAATTGCTGAAATAAAGTGGAAATATTGA AAAGCATTTTACAATATTTGTTAACAACATTATATTTAAAGAATATACACCTTGGTTTAA ATGGTAAAATAATCT CAAGAATTTT CATT AGGTTAATTTTTTTTT ATTTATTTATATTCAC AAAAAATT GTAAAAGAAAACAAAAACAACAAT AATAACGGT GACAACAACAACAATAAT AATAACAAAACTATTTGTTGTGATTTTGCAGCATTGATGTAGTGGGGATCTTTTGGAG CGA

Las frecuencias de genotipo de cada SNP (SEQ ID NOs: 110-127) en los sitios polimórficos se muestran en la Tabla 1. En un análisis, las diferencias de genotipo de los individuos susceptibles se compararon con los individuos resistentes confirmados. En un segundo análisis, las diferencias de genotipo de individuos susceptibles se compararon con los individuos agrupados confirmados resistentes y LOE.

Kits y métodos

En las realizaciones descritas en la presente memoria se pueden proporcionar las sondas al usuario en la forma de un kit. Un kit puede contener una o más sondas descritas en la presente memoria. Por ejemplo, un kit puede comprender una sonda capaz de determinar el genotipo de un nematodo en una posición SNP en uno de los fragmentos descritos en la presente memoria. El kit puede comprender además uno o más reactivos, tampones, materiales de embalaje, instrucciones para usar el kit y recipientes para contener los componentes del kit.

Una sonda puede ser una o más moléculas que sean capaces de unirse, o de asociarse, a la muestra de ácido nucleico para determinar el genotipo del nematodo en una o más posiciones específicas (p.ej., sitio polimórfico) en los fragmentos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se pueden usar sondas para determinar si un nucleótido natural o alternativo está presente en la posición de SNP de uno o más de los fragmentos descritos en la presente memoria. Un ejemplo de sonda puede ser una molécula de ácido nucleico o un oligonucleótido. Los ejemplos de sondas pueden contener una marca o marcas. Los ejemplos de marcas incluyen marcas radioactivas, marcas enzimáticas y/o marcas fluorescentes.

Un oligonucleótido usado como sonda o cebador puede comprender cualquier tamaño, forma y composición que sean adecuados para uso en el contexto de la invención. Preferiblemente, un oligonucleótido puede comprender ADN, ARN, nucleótidos sintéticos, nucleótidos no naturales, nucleótidos alterados o combinaciones de uno o más de los mismos. En una realización, un oligonucleótido puede comprender ácidos nucleicos bloqueados y/o ácidos nucleicos de péptido.

En realizaciones descritas en la presente memoria, un oligonucleótido puede comprender una secuencia de al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, o más nucleótidos.

En realizaciones descritas en la presente memoria, un oligonucleótido puede abarcar, sin limitación, un cebador o más de un cebador, p.ej., un par de cebadores, tal como un cebador directo y un cebador inverso.

Un cebador puede ser un oligonucleótido que puede usarse para iniciar la replicación de ADN. Típicamente, un cebador es un oligonucleótido corto que puede tener aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100 o más nucleótidos.

Se puede usar un cebador como parte de una estrategia para detectar el genotipo de un nematodo en una localización específica de un gen. Por ejemplo, un cebador puede ser útil para amplificar a Dn tal como mediante PCR, RT-PCR y qRT PCR, para posterior análisis, tal como mediante Southern blot, secuenciamiento, HRM (fusión de alta resolución) o SSCP (polimorfismo conformacional de cadena sencilla).

Tal como se usa en la presente memoria, un “aptámero” puede ser un ácido nucleico o una molécula de péptido que se une a una diana molecular específica. Por ejemplo, en disolución, una cadena de nucleótidos puede formar interacciones intramoleculares que pliegan el aptámero en una forma tridimensional compleja. La forma de dicho aptámero le permite unirse firmemente a la superficie de su molécula diana. Debido a la diversidad de formas moleculares que existen para secuencias de nucleótidos y aminoácidos, pueden obtenerse aptámeros para un rango amplio de dianas moleculares, que incluyen, aunque sin limitación, moléculas de ácido nucleico, enzimas, proteínas de membrana, proteínas víricas, citocinas, factores de crecimiento e inmunoglobulinas.

Una sonda puede prepararse de acuerdo a técnicas estándar conocidas por el especialista en la técnica. Por ejemplo, una sonda puede ser producida sintéticamente, recombinantemente o puede aislarse a partir de una fuente natural. En una realización, la fuente puede ser una fuente biológica, por ejemplo, de un microorganismo (p.ej., una bacteria o un virus), un animal (p.ej., un ratón, una rata, un conejo, una cabra o un humano), o una planta.

En el contexto de la descripción, “una sonda” puede significar una sonda o más de una sonda. En los métodos de la invención se puede usar uno o más tipos de sondas simultáneamente. El diseño y la producción de sondas son conocidos en la técnica. De forma general, una sonda puede ser producida recombinantemente, sintéticamente, o puede aislarse a partir de una fuente natural, p.ej. de una célula, un animal o una planta. Sin embargo, el especialista en la técnica apreciará que la producción de la sonda puede depender del tipo de sonda en cuestión. Una sonda preferida puede ser una molécula de ácido nucleico (p.ej., un cebador), con o sin un fluoróforo o colorante. Una sonda puede ser lineal o tener forma de horquilla, con un fluoróforo, con o sin un grupo de extinción u otro fluoróforo (p.ej., para análisis FRET). También podría ser un anticuerpo que reconoce específicamente la secuencia de ADN (o de proteína). Otra sonda podría estar basada en una molécula de ARN. Lo que sería preferible puede depender de consideraciones técnicas, de la estabilidad, el coste, la facilidad de uso, etc.

En realizaciones descritas en la presente memoria, se pueden proporcionar sondas descritas en la presente memoria a un usuario en la forma de un kit. Un kit puede contener una o más sondas.

Usos de los métodos y los kits

Los métodos de la invención y los kits para llevar a cabo los métodos pueden tener aplicaciones de investigación, médicas e industriales. La invención encuentra una amplia aplicación en la gestión de gusanos del corazón en animales infectados y en la detección de nematodos de D. immitis resistentes a ML en un área. Las aplicaciones representativas, no limitativas, de la invención pueden incluir la detección, cuantificación y/o diagnosis de la existencia de individuos o poblaciones de D. immitis que son susceptibles a dosis normales de m L para profilaxis o terapia. En una realización, la capacidad para detectar y cuantificar moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria tiene valor en la medida en que instruirá a un médico veterinario para alterar los regímenes quimioterapéuticos para animales infectados con nematodos de D. immitis que presentan una capacidad de respuesta disminuida a MLs. La identificación de nematodos de D. immitis resistentes a ML puede instruir a un veterinario para cambiar de una terapia basada solo en ML a una terapia que puede incluir un agente alternativo o agentes alternativos, tal como un adulticida (p.je., fármacos basados en arsénico), dietilcarbamicina, antibióticos tales como tetraciclina y combinaciones de uno o más de los mismos a fin de lograr la cura y/o de minimizar la extensión de la cepa resistente. Alternativamente, un veterinario puede ajustar la dosis de una ML y/o el régimen de tratamiento usando una ML en el tratamiento de un animal infectado con un nematodo resistente a ML. Las tasas de dosis recomendadas típicas para profilácticos de ML incluyen, por ejemplo, 6 pg/kg para ivermectina; 500 mg/kg para milbemicina oxima; 3 pg/kg (mensualmente) moxidectina; y 6 mg/kg para selamectina. Un veterinario también puede combinar una o más de las estrategias de tratamiento y las terapias anotadas anteriormente en cualquier combinación adecuada para tratar un animal infectado con un nematodo de Dirofilaria spp., p.ej., un nematodo de D. immitis resistente a ML. Por ejemplo, un veterinario puede tratar a dicho animal con un adulticida, tal como un fármaco basado en arsénico, y a continuación un seguimiento con un microfilaricida, tal como una ML o dietilcarbamacina.

En un caso, se puede usar un fármaco basado en arsénico para tratar un animal infectado con un nematodo de D. immitis resistente a ML. Un fármaco basado en arsénico puede incluir, aunque sin limitación, dihidrocloruro de melarsomina. El dihidrocloruro de melarsomina puede usarse, por ejemplo, en una dosis de 2,5 mg/kg, dos veces, con 24 de diferencia. Esto puede repetirse en 4 meses dependiendo de la respuesta al primer tratamiento y de la condición, edad y uso del animal. Sin embargo, un especialista en la técnica entenderá que la dosis puede variar dependiendo de la gravedad de la infección. Por ejemplo, un animal infectado tal como un perro con enfermedad grave (clase 3) puede recibir una dosis y dejar que se recupere durante unos pocos meses antes de recibir el conjunto completo de 2 dosis.

En otro ejemplo, se puede usar dietilcarbamacina para tratar un animal infectado con un nematodo de D. immitis resistente a ML. Se puede usar dietilcarbamacina, por ejemplo, en una dosis de 25 a 50 mg por libra (0,453 kg) de animal. La duración de la administración puede depender de la condición en tratamiento, de la respuesta a la medicación y del desarrollo de cualquier efecto adverso.

En otro ejemplo, se puede usar un antibiótico para tratar un animal infectado con un nematodo de D. immitis resistente a ML. Dicho antibiótico puede incluir, aunque sin limitación, tetraciclina. Se puede usar una tetraciclina, tal como doxiciclina, que ataca a endosimbiontes de Wolbachia en D. immitis, por ejemplo, en una dosis de 10 mg/kg/día durante 40 días.

En un ejemplo adicional, se puede usar otro agente antihelmíntico. Dicho otro agente antihelmíntico puede incluir, aunque sin limitación, acaciasides. Se puede usar un acaciaside, por ejemplo, en una dosis de 10 mg/kg/día durante 7 días.

En otra realización, la detección de poblaciones de nematodos de D. immitis con los genotipos mencionados anteriormente puede indicar el uso de agentes alternativos, tal como dietilcarbamacina como profiláctico para proteger animales susceptibles, p.ej. perros.

En un ejemplo, se puede usar dietilcarbamacina para prevenir que un animal se infecte con un nematodo de D. immitis resistente a ML. A este respecto, se puede usar dietilcarbamacina, por ejemplo, en una dosis de 3 mg por libra (0,453 kg) de un animal una vez al día.

En otra realización, un kit descrito en la presente memoria puede ser útil como producto comercial en la detección de nematodos de D. immitis resistentes a Ml . Dicho producto puede ser adecuado para uso, sin limitación, por parte de un veterinario, un médico, un dueño de mascota, un cuidador de zoológico, un epidemiólogo, u otro consumidor que lo necesite.

Ejemplos

Los ejemplos tienen el propósito de ilustrar un ejemplo y no deben considerarse como que ilustran limitaciones.

Ejemplo 1 - Poblaciones susceptibles y LOE de parásitos de D. immitis usadas en los estudios

Las diversas poblaciones susceptibles y LOE de D. immitis usadas en estos estudios se describen a continuación:

a. Elementos aislados susceptibles de Missouri, EE.UU. Se obtuvieron treinta y cinco (35) especímenes adultos de D. immitis de dos perros originarios de una perrera de Missouri. Se desconoce el historial previo de los perros antes de entrar en la perrera. Los perros no fueron tratados con posterioridad. Se consideró que los elementos aislados de D. immitis eran susceptibles a los profilácticos de ML para gusano del corazón.

b. Elementos aislados de Gran Canaria, España. Se obtuvieron setenta y un (71) especímenes adultos de D. immitis de 12 perros originarios de un refugio de acogida de Gran Canaria. Los perros nunca fueron expuestos a profilácticos de ML para gusano del corazón y en esta región de Gran Canaria no lleva a la práctica una prevención contra el gusano del corazón.

c. Elementos aislados de Granada, Indias Occidentales. Se obtuvieron diez (10) especímenes adultos de D. immitis de 2 perros originarios de Granada. Los perros fueron reclutados de áreas pobres y remotas de la isla, donde no se lleva a la práctica una prevención contra el gusano del corazón.

d. Elementos aislados susceptibles de Italia. Se obtuvieron seis (6) especímenes adultos de D. immitis de la cuenca del Po en el norte de Italia. Se ha reportado que la seroprevalencia de D. immitis en perros de esta zona es de aproximadamente 60-70%. En esta zona se administra habitualmente profilácticos de ML para el gusano del corazón a los perros. Pero existen informes de LOE (pérdida de eficacia) en Italia.

e. Elemento aislado de pérdida de eficacia (LOE) caso 1. Se aislaron microfilarias (mf) de un perro previamente descrito (véase Bourguinat et al.; WO 2011/120165). El perro era una mezcla de Labrador macho castrado, nacido en febrero de 2006, que pesaba aproximadamente 31 kg. Era un perro de rescate de Nueva Orleans, Louisiana, EE.UU., recogido por la “Boudreaux Rescue Crew”, Nueva Orleans, y posteriormente transferido a Canadá donde fue adoptado en enero de 2008.

El perro fue llevado al “Main West Animal Hospital” (MWAH) de Welland, Ontario, el 6 de junio de 2008 (día 1) para una revisión. Una muestra de sangre extraída del perro dio positivo en un test de antígeno de gusano del corazón (PetChek® PF; IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine) y contenía microfilarias de D. immitis. El 11 de junio de 2008 (día 6), se llevó a cabo una exploración inicial (trabajo sanguíneo, radiografías torácicas, examen físico, análisis de orina). Una auscultación reveló un incremento moderado en los sonidos broncovesiculares de los pulmones y un murmullo cardiaco de grado III-IV/VI. El resto del examen físico fue normal. La radiografía torácica reveló un ensanchamiento moderado del lado derecho del corazón y un patrón pulmonar intersticial en el campo pulmonar caudodorsal. Estos exámenes indicaron un diagnóstico de enfermedad de gusano del corazón de clase 2.

El tratamiento adulticida se inició el 11 de junio de 2008 (día 6) con 2,5 mg/kg de dihidrocloruro de melarsomina intramuscular (Immiticide®; Merial Inc.). El tratamiento continuó con dos tratamientos intramusculares de 2,5 mg/kg de dihidrocloruro de melarsomina el 9 de julio y el 10 de julio (días 34, 35). En los siguientes 90 días, a fin de eliminar las mf en circulación, el perro fue tratado en una ocasión con milbemicina oxima (MO) y en dos ocasiones con IVM (ver Tabla 2). En los días 159 y 160, cuatro meses después de la última dosis de adulticida, el perro volvió a ser tratado con 2,5 mg/kg de dihidrocloruro de melarsomina intramuscularmente. Las pruebas diagnósticas posteriores y los tratamientos microfilaricidas se resumen en la Tabla 2. Durante el tratamiento del perro, se llevaron a cabo varios test de antígeno de gusano del corazón, que incluyeron DiroChek® (Synbiotics Corporation, San Diego, California) y PetChek® PF (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine), que son ensayos ELISA de micropocillo, y SNAP® PF (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine, un test de formato de membrana diseñado para un uso clínico rápido (ver la Tabla 2).

Para llevar a cabo el test de Knott, se mezclaron en un tubo de centrífuga 9 mL de formalina al 2% y 1 mL de sangre (extraída en EDTA). Se llevó a cabo la centrifugación en una centrífuga LW Scientific EZ Swing SK a 3000 rpm (604 m/s2) durante 5 minutos. El fluido sobrenadante fue desechado. Se añadió una gota de disolución de azul de metileno al 0,1% a la partícula del fondo del tubo de centrífuga, se mezcló, y se examinó una mezcla teñida en el microscopio para determinar microfilarias de D. immitis. La Tabla 2 indica cuando se lleva a cabo este test y, cuando se determina, el nivel de microfilaremia.

El perro fue tratado como se indica a continuación. Dos días después de la última de tres dosis de dihidrocloruro de melarsomina en julio de 2008 (es decir, en el día 37), el perro mostró síntomas transitorios consistentes con la muerte de gusanos del corazón adultos (temperatura rectal elevada, letargia, tos, sonidos pulmonares elevados). Con inicio en el día 41, estos síntomas fueron gestionados con prednisona (Apo-Prednisone; Apotex, Toronto, ON, Canadá), 1,3 mg/kg dos veces al día durante 6 días. Después de la administración de milbemicina oxima (MO) oral a 0,74 mg/kg en el día 74, IVM oral a 50 pg/kg en el día 95 e IVM oral a 200 pg/kg (4x la tasa de dosis microfilaricida normal) en el día 125, el perro permaneció continuadamente microfilarémico. En el día 207, seis semanas después del segundo régimen de tratamiento de dihidrocloruro de melarsomina, en los días 159 y 160, un test de Knott seguía siendo positivo, por lo que el perro volvió a ser tratado con 200 pg/kg de IVM oral. Un mes después, en el día 242, un ensayo de antígeno de D. immitis resultó negativo, lo que confirmó que el perro estaba libre de gusanos adultos. Sin embargo, el perro seguía estando microfilarémico. Por tanto, comenzando el día 243, se administró al perro MO oral a 0,74 mg/kg cada 2 semanas en cuatro ocasiones (ver Tabla 2). A pesar de esto, el perro permanecía microfilarémico en el día 298. Por lo tanto, se administró MO oral a 1,1 mg/kg en los días 298, 312, 326, 340 y 354. En el día 356, se extrajo sangre al perro y se examinó: seguía habiendo presentes microfilarias, y el test de D. immitis seguía siendo negativo. En el día 375, se envió una muestra de sangre al “Anima1Health Laboratory”, Universidad de Guelph (AHLUG): la microfilaremia estaba en 6530 mf/mL, y el test de antígeno seguía siendo negativo (ver Tabla 2). Como resultado, con inicio el día 384, se administró al perro MO oral a 2,0 mg/kg una vez al día durante 7 días. En el día 420, el perro presentaba una microfilaremia de 355 mf/mL. En el día 420, el perro volvió a ser tratado con MO oral a 2,0 mg/kg, y esto se continuó una vez al día durante 8 días. A pesar de este segundo régimen de dosis elevada, en el día 480, aunque seguía siendo negativo para el test de antígeno de gusano del corazón, el perro presentaba una microfilaremia de 1810 mf/mL.

Se realizó una toma de sangre al perro en el día 706 y se aisló el ADN de las microfilarias agrupadas.

Tabla 2. Ensayos diagnósticos e historial de tratamiento del perro entre 2008 y 2009.

MO = milbemicina oxima (Interceptor®); IVM = ivermectina (Ivomec® inyección para ganado vacuno, ovino y porcino, Merial Inc.); *Adulticida = Immiticide®; a = Main West Animal Hospital (es decir, ensayo llevado a cabo en instalaciones de la casa); b = Idexx Laboratories; c = Animal Health Laboratory, Universidad de Guelph.

f. Elemento aislado LOE caso 2. Se obtuvieron aproximadamente 9000 mf agrupadas de un perro de Mechanicsville, Virginia, que había sido tratado con Interceptor® entre 2004 y 2008. En mayor de 2008, el perro resultó positivo para antígeno de gusano del corazón y se le administró Heartgard Plus (IVM/PYR) para un tratamiento de muerte lenta. En 2008, el perro seguía siendo positivo para antígeno de gusano del corazón y seguía estando microfilarémico. Del ensayo in vitro del Dr. Blagburn (Universidad de Auburn): una concentración LD⁹⁵ para mf susceptible produjo solo un 10,5% de muerte, y 2x LD⁹⁵ produjo un 13,6% de muerte de mf.

g. Elemento aislado LOE caso 3. Se obtuvieron mf agrupadas de mf de baja respuesta procedentes de un ensayo de susceptibilidad in vitro con ivermectina. El perro, infectado de forma natural, era de un cliente de Monroe, Luisiana, y se seleccionó debido a que había estado sometido a tratamiento profiláctico de gusano del corazón con ML. El veterinario estaba convencido de que el cumplimiento del tratamiento no era el problema. Los registros del paciente indicaban que se habían suministrado las cantidades apropiadas de producto al cliente, en base a los números y los pesos de animales diana de la casa. El perro estaba microfilarémico a pesar del hecho de que había estado bajo profilaxis de ML para gusano del corazón.

h. Elemento aislado LOE caso 4. Se obtuvieron mf agrupadas de un perro que presentaba el historial indicado a continuación. Este perro callejero era originario del Condado de Haywood, Tennessee, EE.UU., y fue presentado como positivo para antígeno de gusano del corazón en una clínica local el 21 de enero de 2011. El perro fue castrado el 26 de enero de 2011. El 1 de febrero de 2011 se inició una terapia de doxiciclina (200 mg oralmente dos veces al día) y prednisona (1 comprimido de 5 mg oralmente cada dos días) y se continuó durante 30 días. Los días 2 de febrero, 3 de marzo y 4 de marzo de 2011, se administró una inyección de dihidrocloruro de melarsomina (Immiticide) (2,5 mg/kg). Los días 2 de febrero, 3 de marzo y 1 de abril de 2011, se administró una dosis oral de milbemicina oxima (Interceptor) (11,5 mg/comprimido). El 5 de abril de 2011, se llevó a cabo un test de Knott y resultó positivo; se administró ivermectina subcutáneamente en una dosis de 0,26 mg/kg. El 11 de abril de 2011, otro test de Knott resultó nuevamente positivo; se administró ivermectina subcutáneamente en una dosis de 0,39 mg/kg. Se llevaron a cabo nuevos test de Knott el 19 y el 26 de abril de 2011, y ambos fueron positivos. El 2 de mayo de 2011, el test de Knott volvió a dar positivo y una mancha de sangre mostró microfilarias; se administró al perro Advantage Multi® (2,5% de imidacloprid, 10% de moxidectina). El 5 de mayo de 2011 una mancha de sangre fue positiva para microfilarias; en ese momento, se tomó una muestra de microfilarias. El tratamiento con adulticida repetido condujo a la suposición de que el perro no tenía parásitos adultos. El 11 de junio de 2011, se administró al perro 200 mg de dietilcarbamacina. No se observaron efectos secundarios del tratamiento. A los 7 días, la mancha de sangre no mostró ninguna mf. El perro fue adoptado el 18 de agosto de 2011 y se mudó a Massachusetts.

i. Elemento aislado LOE caso 5. Se obtuvieron mf agrupadas de un perro originario de West Monroe, Luisiana, EE.UU. Se trataba del perro de un veterinario. El historial médico implicaba el uso conforme de milbemicina oxima y hubo varios tests de antígeno de gusano del corazón negativos en las revisiones anuales, hasta tener un test de antígeno de gusano del corazón positivo y presencia de mf en la sangre el 25 de septiembre de 2008. Se realizó un ensayo de sensibilidad de microfilaria in vitro (laboratorio de B. Blagburn, Universidad de Auburn, Alabama) el 19 de noviembre de 2008. Los resultados del ensayo indicaron organismos resistentes al fármaco. Se alimentó a mosquitos con la sangre infectada de dicho perro original. Se usaron larvas L3 para infectar a un segundo perro.

En el momento de la infección, el segundo perro había estado en tratamiento con ivermectina. Después de eso, en intervalos semanales, el segundo perro recibió 1 dosis de 3 pg de ivermectina/kg, seguido de 11 dosis de 6 pg de ivermectina/kg, seguido de 4 dosis de 12 pg de ivermectina/kg, seguido de 8 dosis de 24 pg de ivermectina/kg (interrumpidas durante una semana después de la 4a dosis). Durante todo el periodo de dosis semanales con ivermectina, el perro permaneció positivo para mf. Se recolectaron las microfilarias entre 1 y 2 semanas después del último tratamiento y se usaron en el análisis.

j. Elemento aislado LOE caso 6. Las muestras corresponden al segundo pasaje de parásito procedente de un perro originario de Earle, Arkansas, EE.UU. El perro original del elemento aislado LOE-6 recibió milbemicina oxima en 2004 y 2005, ivermectina/pyrantel en 2006 y 2007, e ivermectina/praziquantel/pyrantel (Iverhart Max™) en enero de 2008 y a comienzos de julio de 2008. La propietaria indicó que había sido consistente con la profilaxis. Este perro dio negativo para antígeno de gusano del corazón en las revisiones anuales en 2005, 2006 y 2007. Este perro dio positivo para antígeno de gusano del corazón y estaba microfilamérico en el examen anual del 4 de noviembre de 2008. Los resultados del ensayo de microfilarias in vitro (laboratorio de B. Blagburn, Universidad de Auburn, AL) con este perro sugirieron resistencia. El perro LOE-6 fue infectado experimentalmente el 16 de noviembre de 2009 con larvas L3 derivadas de mosquitos alimentados con sangre del primer pasaje. El perro del primer pasaje fue infectado experimentalmente el 24 de febrero de 2009 con larvas L3 derivadas de mosquitos alimentados con sangre procedente de un perro infectado de forma natural (el pero original del elemento aislado LOE-6).

Ejemplo 2 - Aislamiento de ADN de parásitos usados en los estudios

El ADN genómico de los gusanos adultos individuales fue extraído con el kit DNeasy™ de Qiagen (Qiagen Inc, Mississauga, Canadá). La extracción de ADN genómico de mf individuales fue extraído usando el kit QIAmp® DNA Micro de Qiagen. Para obtener suficiente ADN para el análisis, el ADN de mf fue amplificado usando un kit Repli-g® de Qiagen que permite la amplificación del genoma completo a partir de una cantidad muy pequeña de ADN. Las mf fueron aisladas mediante filtración a través de filtros de membrana de policarbonato a partir de sangre fresca extraída.

Ejemplo 3 - Secuenciamiento de ADN, análisis e identificación de SNPs

El objetivo era identificar cambios genéticos (p.ej., variaciones de nucleótido) presentes en las poblaciones de gusanos del corazón LOE que no estuvieran presentes en las poblaciones de gusanos del corazón susceptibles. Las variaciones de nucleótidos en cualquiera de las poblaciones LOE, en comparación con un genoma de referencia obtenido de elementos aislados susceptibles, indicarían potenciales marcadores de SNP.

Inicialmente, se secuenciaron los genomas de poblaciones de gusanos del corazón identificadas en los párrafos numerados a-h del anterior Ejemplo 2 (elementos aislados susceptibles de Missouri, Isla de Gran Canaria, Granada e Italia; elementos aislados LOE casos 1-4) usando el sistema HiSeq2000 de Illumina®. La Tabla 3 muestra el número de lecturas y el número de bases que fueron secuenciadas para cada población. En la Tabla 3 no se incluye información de las poblaciones de gusanos del corazón identificadas en los párrafos i y j (elementos aislados resistentes de los casos LOE 5 y 6).

Tabla 3. Información de lectura de elementos aislados usados para el secuenciamiento de genoma completo.

Los datos generados a partir de las muestras susceptibles a ML (elementos aislados susceptibles de Missouri, Isla de Gran Canaria, Granada e Italia) se usaron para construir el genoma, que a su vez se usó como genoma de referencia para el proyecto. Se agruparon todos los fragmentos individuales de las 4 poblaciones susceptibles. Se usó el software de alineamiento Velvet (http:www.molecularevolution.org/software/genomics/velvet) para construir el genoma. Las lecturas se filtraron eliminando/cortando las secuencias de adaptador, si se encontraban. Las lecturas se cortaron a una longitud Q30 de 32 pares de bases. Una longitud de 32 pares de bases es el valor por defecto de siembra de Aligner y el número de lecturas fue consistente con el valor por defecto. La Tabla 4 describe la construcción del genoma de referencia usado para el estudio.

Tabla 4. Información sobre la construcción del genoma de D. immitis.

Una vez obtenido el genoma de referencia de gusano del corazón a partir de las secuencias de las poblaciones/elementos aislados susceptibles, a continuación se compararon los genomas de las poblaciones LOE con el genoma de referencia, para identificar diferencias y posibles SNPs. Como parte de este análisis, las localizaciones genéticas que contienen los SNPs potenciales se demostró que no eran significativamente diferentes entre las poblaciones susceptibles individuales (es decir, entre los elementos aislados susceptibles de Missouri, Isla de Gran Canaria, Granda e Italia), además de no ser significativamente diferentes entre las poblaciones LOE individuales (LOE 1-4), pero sí eran significativamente diferentes entre las poblaciones susceptibles y las poblaciones LOE. Para llevar a cabo este análisis, se usó el paquete de software denominado PoPoolation2 (Kofler et al. Bioinformatics 27: 3435­ 3436, 2011; http://bioinformatics.oxfordiournals.org/content/27/24/3435). El programa requirió el uso de otros programas, tal como Peri (http://www.perl.org/), R (http://www.r-project.org/), bwa y Samtools. En primer lugar, se generó un archivo sincronizado, que contenía las frecuencias de nucleótido de cada población en cada base del genoma de referencia, tras filtrar para calidad de la base, en un formato conciso. El archivo sincronizado generado con el programa PoPoolation2 contenía información detallada del recuento de nucleótidos en las localizaciones de cada una de las poblaciones. Se generaron los valores-P con el test exacto de Fisher para todas las posibles comparaciones entre poblaciones. Para identificar localizaciones asociadas a resistencia a ML, los valores-p tenían que ser simultáneamente no significativos estadísticamente (>0,05) en todas las muestras susceptibles y en todas las muestras LOE, y estadísticamente significativos (<0,05) entre todas las muestras susceptibles frente a las muestras LOE. Trescientas treinta y ocho localizaciones cumplían estos criterios, incluyendo 12 que presentaban un valor-p de 10'5. Se analizaron regiones flanqueantes de 1000 pb que incluían cada localización estadísticamente diferente entre las muestras susceptibles y LOE usando Blast (BlastN y BlastX) en NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y en la base de datos de genoma filarial del Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/filarial worms/Blast.html) para eliminar las localizaciones ubicadas en ADN mitocondrial de Wolbachia o C. lupus familiaris. Las localizaciones ubicadas en lecturas con un polimorfismo muy elevado (>2 nucleótidos y/o indeles) o con baja cobertura (<10X) fueron eliminados de análisis posteriores. Los recuentos de nucleótidos de cada localización de interés fueron analizados individualmente para las poblaciones agrupadas para asegurar que el aumento o el descenso de la frecuencia de nucleótido estaba en la misma dirección para todas las muestras susceptibles o para todas las muestras LOE. Las localizaciones que mejor cumplían los criterios fueron retenidas para un análisis de genotipo adicional en parásitos individuales, para determinar las frecuencias de alelo reales en poblaciones que habían sido caracterizadas en términos de respuesta a ML.

A partir de estos análisis, se observó que 186 localizaciones eran significativamente diferentes entre las muestras susceptibles y las muestras LOE. Como esta estrategia se basa en lecturas y en frecuencias de nucleótidos de muestras agrupadas, dichas localizaciones fueron estudiadas adicionalmente (genotipado de SNP) usando poblaciones individuales (no agrupadas). Para este propósito se usó un análisis de frecuencia de SNP Sequenom®. La siguiente Tabla 5 muestra los orígenes del ADN usado en este análisis.

Tabla 5. Descripción de elementos aislados usados para el análisis Sequenom.

El análisis Sequenom® se basa en PCR múltiple y espectrometría de masas MALDI-TOF. Se usó el análisis Sequenom® para evaluar las 186 localizaciones usando 425 muestras individuales (5 paneles con 36-38 SNPs en cada panel). El diseño de cebadores de cada marcador de SNP se basó en el requisito de que los cebadores de elongación estén localizados en una región no polimórfica 15 pares de bases antes o después del SNP de interés. Todas las llamadas de genoma se realizaron a ciegas (es decir, el origen de la muestra y el historial de tratamiento del perro permanecían ocultos durante el análisis). Se analizaron un total de 79050 genotipos. De las 186 localizaciones potenciales, se observó que 109 presentaban ventajas técnicas para predecir la pérdida de eficacia de las ML. La población susceptible portaba más del 90% del genotipo natural, mientras que la población LOE presentó una frecuencia de genotipo significativa menor del genotipo natural. Dichas 109 localizaciones se describen en la presente memoria como las SEQ ID NOs: 1-109.

Ejemplo 4 - SNPs adicionales de organismos resistentes confirmados

Las muestras LOE, tal como se describe en el Ejemplo 1, se supuso que eran resistentes a MLs debido al historial de tratamiento de los perros con MLs y a la presencia continuada de organismos de gusano del corazón. Sin embargo, a pesar del historial de tratamiento, una explicación alternativa a la verdadera resistencia a ML de los parásitos es la falta de cumplimiento por parte del dueño en el tratamiento con ML. Por lo tanto, se llevó a cabo un estudio en condiciones de tratamiento con ML controladas, para eliminar la posibilidad de la falta de cumplimiento por parte del dueño en el tratamiento con ML, como posible razón para la presencia de organismos de gusano del corazón en perros.

Los organismos de gusano del corazón usados en los estudios de eficacia fueron derivados de uno identificado como Jd2009 de Earle, Arkansas, EE.UU. Jd2009 recibió mensualmente MO en 2004 y 2005, IVM/pyrantel en 2006 y 2007, e IVM/praziquantel/pyrantel en enero de 2008 hasta principios de julio de 2008. Jd2009 dio negativo para antígeno de gusano del corazón en 2005, 2006 y 2007. Este perro fue positivo para antígeno de gusano del corazón y estaba microfilarémico el 11 de abril de 2008, a pesar del historial de cumplimiento con profilácticos contra gusano del corazón. Se obtuvieron mf del perro en ese momento, con el consentimiento del dueño, y se enviaron a la Universidad de Auburn, donde las mf fueron examinadas para determinar la sensibilidad a IVM en un ensayo in vitro de concentraciónrespuesta que mide la migración (Blagburn, B., “American Heartworm Society-13th Triennial State of the Heartworm Symposium”, 2010). Dichas mf fueron significativamente menos sensibles a IVM que las mf obtenidas de un perro infectado con una cepa de laboratorio de D. immitis que era completamente susceptible al fármaco. Las mf se usaron en la Universidad de Auburn para infectar mosquitos para producir L3 que fueron usadas para infectar al perro Jd2009-1, que desarrollo una infección patente. Se observó que las mf de este perro eran tan resistentes a m L como las mf de Jd2009 en el ensayo de migración in vitro.

Las L3s derivadas de mf tomadas de Jd2009-1 se usaron en la Universidad de Auburn para infectar un segundo perro, Jd2009-2, y el perro fue tratado mensualmente con Heartgard Plus® (0,006 - 0,013 mg/kg de IVM) 9 veces consecutivas. Se recuperaron gusanos adultos, lo que indica que el elemento aislado Jd2009-2 era resistente a la profilaxis con IVM. En un segundo estudio, los perros fueron expuestos a L3 de Jd2009-2 en el día 0, y fueron tratados mensualmente durante 5 meses consecutivos con Heartgard Plus® (0,007 - 0,009 mg/kg de IVM; Estudio 1b). En la necropsia del día 188, la eficacia era del 71,3%, lo que confirma la resistencia a la profilaxis con IVM en el elemento aislado de Jd2009-2.

En otro estudio, los perros fueron expuestos a L3 en el día 180 después de inyección de ProHeart6®. En la necropsia del día 150 después de la infección, la eficacia fue del 21,6%, lo que indica que el Jd2009-2 también era resistente a la formulación de MOX de acción duradera ProHeart 6®, que tiene una reivindicación de un 100% de protección durante 180 días después del tratamiento.

En otro estudio, el elemento aislado Jd2009-2 resistente a IVM confirmado se usó para determinar si la resistencia se extendía a otros profilácticos de ML contra gusano del corazón. Ninguno de los otros profilácticos de ML contra gusano del corazón (MOX, MO y SEL), suministrados como quimioprofilaxis mensual según las recomendaciones, fue completamente efectivo, es decir, al menos un perro de grupos de cuatro a seis perros tratados con estos profilácticos contra gusano del corazón se infectó con D. immitis después del tratamiento con cada una de estas MLs usadas según las recomendaciones.

Se usó el ADN de organismos individuales de dos elementos aislados de Jd2009. El ADN de individuos de un grupo, denominado RES-1, procedía de 4 perros del estudio de ProHeart6® descrito anteriormente. El ADN de individuos del otro grupo, denominado RES-2, procedía de 6 perros del estudio de Heartgard Plus®, descrito anteriormente.

Se aisló el ADN de 115 gusanos adultos y 79 mg de las poblaciones RES-1 y RES-2, tal como se describe en el Ejemplo 2, y se analizó usando el análisis de frecuencia de SNP Sequenom®, tal como se describe en el Ejemplo 3. A partir de este análisis, 18 localizaciones adicionales (de las 186 localizaciones iniciales) resultaron significativamente diferentes entre las muestras susceptibles y las muestras RES. Dichas localizaciones se describen en la presente memoria como SEQ ID NOs: 110-127.

Aunque la descripción ha ilustrado ejemplos de composición, métodos, etc., y aunque las descripciones incluyen un detalle considerable, no es intención de los solicitantes restringir, o limitar en modo alguno, el alcance de la solicitud. Por supuesto, no es posible describir cualquier combinación concebible de los componentes o metodologías para el propósito de describir las composiciones, métodos, etc., descritos en la presente memoria. Los especialistas en la técnica identificarán fácilmente otras ventajas y modificaciones adicionales. Por lo tanto, la descripción no se limita a los detalles específicos, el aparato representativo y los ejemplos ilustrativos mostrados y descritos. Por tanto, esta solicitud pretende abarcar las alteraciones, modificaciones y variaciones que entren dentro del alcance de la solicitud. Adicionalmente, la descripción precedente no pretende limitar el alcance de la invención. En su lugar, el alcance de la invención queda determinado por las reivindicaciones acompañantes.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar el genotipo de un nematodo de Dirofilaria immitis, método que comprende:

a) poner en contacto una molécula de ácido nucleico de Dirofilaria immitis con al menos un oligonucleótido que tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos de SEQ ID NO: 118 o un complemento inverso del mismo;

donde el al menos un oligonucleótido incluye el sitio polimórfico de la posición 151 de SEQ ID NO: 118; donde el al menos un oligonucleótido incluye además una marca detectable; y

b) detectar un nucleótido alternativo en la posición 151 de SEQ ID NO: 118 en la molécula de ácido nucleico de nematodo de Dirofilaria immitis.

2. El método de la Reivindicación 1, donde la detección de un nucleótido G en la posición 151 de SEQ ID NO: 118 en la molécula de ácido nucleico de nematodo de Dirofilaria immitis determina un genotipo que se correlaciona con una resistencia a una lactona macrocíclica seleccionada del grupo de ivermectina, selamectina, milbemicina oxima o moxidectina.

3. El método de la Reivindicación 1, donde la detección del nucleótido alternativo en la posición 151 de SEQ ID NO: 118 de la molécula de ácido nucleico de nematodo de Dirofilaria immitis con el al menos un oligonucleótido se detecta mediante secuenciamiento de ADN, métodos basados en hibridación que incluyen oligonucleótidos específicos de alelo, análisis de microsistemas, métodos basados en enzimas, polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP), fusión de alta resolución (HRM) o estrategias basadas en Pc R, RT-PCR o qRT-PCR.

4. El método de la Reivindicación 1, que además comprende:

a) poner en contacto la molécula de ácido nucleico de Dirofilaria immitis con al menos un segundo oligonucleótido que consiste en al menos 15 nucleótidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1­ 117, y 119-127, o un complemento inverso de la misma;

donde el al menos un segundo oligonucleótido comprende el respectivo sitio polimórfico de SEQ ID NOs: 1-117 y 119-127;

donde el al menos un segundo oligonucleótido comprende además una marca detectable; y

b) detectar un nucleótido alternativo en el sitio polimórfico de la molécula de ácido nucleico de nematodo de Dirofilaria immitis.