KR20110081758A - 강직성척추염 진단용 프라이머 및 이를 이용한 강직성 척추염 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 강직성척추염 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 강직성척추염을 진단하는 방법 등에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 하기의 강직성척추염 진단용 프라이머 세트를 제공한다: (a) 서열번호 7로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머, 및 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; (b) 서열번호 15 내지 17로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 프라이머, 및 서열번호 19 로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및 (c) 서열번호 18로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머, 및 서열번호 20으로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트. 본 발명의 강직성척추염 진단용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 강직성척추염 진단용 키트는 강직성척추염의 조기 진단을 가능하게 하며, 강직성척추염의 경과 추적 및 예후 판정에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 강직성척추염 진단용 프라이머 및 이를 이용하여 강직성척추염을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.
강직성 척추염(ankylosing spondylitis, AS)은 척추관절염(spondyloarthroapthy, SpA)이 중증화한 질환의 한 형태로서 보통 10대 후반에서 20대 초반에 시작하여 30, 40대에 전형적인 척추강직을 보이며 천장관절 및 척추의 만성 염증 및 말초관절 혹은 눈, 심장, 장관 침범을 특징으로 하는 만성 진행성 전신질환이다. 척추관절염의 유병률은 국가마다 다르지만 보통 1~2% 정도로 알려져 있으며, 운동성 제한으로 인해 환자 및 사회에 사회적, 경제적으로 불리한 영향을 미친다. 최근 이 질환에 대한 경과와 치료에 대해 새로운 지식들이 축적되면서 조기 치료가 질환의 치료와 경과를 막는데 효과적임이 밝혀지면서 조기 진단 문제가 중요하게 대두 되고 있다.
질병의 원인은 뚜렷하게 밝혀지지 않았지만 류마티스관절염이나 전신성 홍반성 루푸스 같은 전신성 류마티스질환과 유사하게 유전적 이상, 감염, 면역염증 반응이 발병에 관여할 것으로 추정한다. 유전적으로는 ‘HLA-B27’이라는 조직적합성 항원 유전자가 발병에 관여하는 것으로 추정하고 있으며, 그 외 최근 연구에서는 ERAP1 (endoplasmic reticulum aminopeptidase 1)와 IL23R (interleukin 23 receptor) 유전자가 관계한다는 것이 시사되고 있다. 강직성척추염으로 인한 허리와 엉치의 통증은 서서히 시작하고, 경우에 따라서는 무릎, 발목 등에도 간헐적으로 관절염이 동반된다. 증상이 모호하고 악화와 호전을 반복하여 일반적인 요통이나 비특이적인 관절통과 구별하기 어렵다. 유럽의 연구에 의하면 척추관절염의 증상 발현에서 강직성 척추염 진단까지 평균 10년이 걸린다고 한다. 따라서 환자는 질병이 어느 정도 진행된 상태에서 전문의를 찾게 되며, 그 때는 이미 초기 치료 시점을 놓친 경우가 빈번하다.
강직성 척추염의 고전적인 진단은 환자의 증상, 병력, 천장관절 및 척추의 방사선학적 소견에 근거하여 이루어지고 있으나 방사선학적 이상은 병이 어느 정도 진행된 환자에게서만 발견되므로 조기 진단은 불가능하다. 최근 MRI 촬영을 활용하여 조기 진단에 도움을 받고 있지만 이 검사는 고가이며 시간이 소요되어 제한적으로 쓰이고 있다. 혈액에서의 ‘HLA-B27’ 유전자검사 역시 조기 진단에 이용되고는 있으나 환자의 15%에서 음성 결과를 보이고 정상인의 상당수에서 가양성으로 나온다. 또한 HLA-B27은 환자의 예후나 경과 추적에는 별다른 정보를 제공하지 못한다.
일반적으로 많은 류마티스 질환에서 ESR(적혈구침강속도)이나 CRP(C 반응성 단백) 같은 염증 지표가 질환의 활동성을 추적하는 지표로 활용되고 있는데 반해 강직성 척추염에서는 ESR이나 CRP가 질환의 활동성을 반영하지 않는다. 강직성 척추염의 경우 질환의 경과나 치료에 대한 반응은 아직까지 주로 환자의 주관적 호소의 정도에 의존하여 평가하고 있다.
류마티스관절염의 경우 환자에서 발견되는 류마티스인자(rheumatoid factor)나 항 CCP 항체(anti-cyclic citrullinated peptide antibody)는 환자의 예후를 짐작하게 하는 지표로도 활용된다. 즉 상기 지표가 양성인 환자는 관절염의 발생 및 진행 속도가 빠르다는 것이 알려져, 양성 결과는 조기에 적극적인 치료 대상으로 선정하는데 고려되고 있다. 그러나 강직성 척추염의 경우엔 아직까지 예후를 반영하는 지표가 없다.
결론적으로 현재 제한적으로 활용되는 HLA-B27 이외엔 강직성 척추염을 조기 진단하는데 이용되는 생체표지자는 없다. 또한 경과를 추적하는 데 활용되는 활동성 지표나 예후를 반영하는 생체표지자 역시 없다. 따라서 이런 생체표지자의 발견(명)은 강직성척추염의 진단, 추적, 예후를 결정하는데 독보적인 영향을 미칠 것임에 틀림없으며, 강직성척추염 조기 진단 수단의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명의 목적은 강직성척추염을 조기에 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로 본 발명은 강직성척추염 진단용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단 키트, 강직성 척추염 진단용 바이오마커 등을 제공한다.
본 발명은 하기를 포함하는 강직성척추염 진단용 프라이머 세트를 제공한다:
(a) 서열번호 7 로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 포워드(forward) 프라이머; 및 (b) 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 리버스(reverse) 프라이머.
또한 본 발명은 하기를 포함하는 강직성척추염 진단용 프라이머 세트를 제공한다: (a) 서열번호 15 내지 17로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 포워드(forward) 프라이머; 및 (b) 서열번호 19 로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 리버스(reverse) 프라이머.
또한 본 발명은 하기를 포함하는 강직성척추염 진단용 프라이머 세트를 제공한다: (a) 서열번호 18로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 포워드(forward) 프라이머; 및 (b) 서열번호 20으로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 리버스(reverse) 프라이머.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 강직성척추염을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) 환자의 생물 시료로부터 cDNA를 합성하는 단계; 및 (b) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트와 80%이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머 세트, 및 상기 합성 cDNA를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 을 수행하는 단계: 및 (c) 상기 PCT 산물의 염기서열을 확인하는 단계.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트와 80%이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머 세트를 포함하는 강직성척추염 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 21의 염기서열 전부 혹은 일부를 포함하는 강직성척추염 진단용 바이오마커를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 21의 염기서열 전부 혹은 일부를 이용하여 강직성척추염을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) 환자의 생물 시료로부터 cDNA를 합성하는 단계; (b) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트와 80%이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머 세트, 및 상기 합성 cDNA를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 을 수행하는 단계: 및(c) 서열번호 21의 염기서열 전부 혹은 일부를 포함하는 PCR 산물을 확인하는 단계.
또한 본 발명은 서열번호 21의 염기서열 전부 혹은 일부를 포함하는 강직성척추염 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 일 구현예로, 상기 진단 키트는 서열번호 21과 80% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 강직성척추염 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 강직성척추염을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 본 발명의 프라이머 세트를 이용함으로써 강직성척추염을 조기에 진단할 수 있고 나아가 강직성척추염의 경과 추적 및 예후판단을 가능하게 한다. 궁극적으로, 본 발명은 강직성척추염 조기 진단 및 치료용 정보 제공에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 프라이머를 이용한 정상군과 강직성척추염 환자군의 VH2* 의 발현양상의 차이를 확인하는 PCR 결과 표이다(NO: 정상군, AS: 강직성척추염 환자군, VH: 프라이머 조합).
도 2는 재조합 DNA가 들어간 균주 선별을 위한 콜로니중합효소 연쇄반응을 실시한 결과의 예이다(N숫자: 콜로니 번호, A: 선택된 콜로니, B: 밴드가 약해 제외된 콜로니).
도 3은 E.coli에 정상적으로 들어간 강직성 척추염 환자의 VH2* 파아지미드를 시퀀싱하여 VH2* 절편의 염기서열을 도출한 결과이다.
도 4는 염색체 14 위에서의 CDC42 BPB (binding protein kinase beta)유전자와 면역글로블린 유전자의 위치이다.
도 5는 CDC42 BPB (binding protein kinase beta)의 유전자 지도이다.
도 6은 강직성 척추염 환자군의 항체 절편의 일정한 패턴 모식도이다.
도 7은 본 실험에 사용 된 프라이머 세트의 그룹이 복제하는 항체 절편을 표시한 것이다.
도 8은 그룹 1 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 그룹 1 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과의 각 군별 평균값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 그룹 1 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 샘플별로 나타낸 것이다.
도 11은 그룹 2 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 그룹 2 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과의 각 군별 평균값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 그룹 2 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 샘플별로 나타낸 것이다.
도 14은 그룹 3 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 그룹 3 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과의 각 군별 평균값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 그룹 3 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 샘플별로 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 DNA가 들어간 균주 선별을 위한 콜로니중합효소 연쇄반응을 실시한 결과의 예이다(N숫자: 콜로니 번호, A: 선택된 콜로니, B: 밴드가 약해 제외된 콜로니).
도 3은 E.coli에 정상적으로 들어간 강직성 척추염 환자의 VH2* 파아지미드를 시퀀싱하여 VH2* 절편의 염기서열을 도출한 결과이다.
도 4는 염색체 14 위에서의 CDC42 BPB (binding protein kinase beta)유전자와 면역글로블린 유전자의 위치이다.
도 5는 CDC42 BPB (binding protein kinase beta)의 유전자 지도이다.
도 6은 강직성 척추염 환자군의 항체 절편의 일정한 패턴 모식도이다.
도 7은 본 실험에 사용 된 프라이머 세트의 그룹이 복제하는 항체 절편을 표시한 것이다.
도 8은 그룹 1 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 그룹 1 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과의 각 군별 평균값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 그룹 1 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 샘플별로 나타낸 것이다.
도 11은 그룹 2 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 그룹 2 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과의 각 군별 평균값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 그룹 2 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 샘플별로 나타낸 것이다.
도 14은 그룹 3 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 그룹 3 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과의 각 군별 평균값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 그룹 3 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 샘플별로 나타낸 것이다.
본 발명자들은 강직성척추염을 진단하기 위한 새로운 수단에 대하여 연구하던 중 본 발명의 프라이머 세트가 강직성척추염 환자에서 특정 PCR산물을 특이적으로 제조하는 것을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 강직성척추염 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것을 특징으로 한다. 정상인에서는 PCR 증폭산물을 생산하지 아니하며 강직성척추염 환자에서만 특이적으로 PCR 증폭산물을 생산하는 프라이머 세트는 본 발명에서 최초로 제공하는 것이다. 본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성 시작을 가능하게 하는 것이면 특별히 제한은 없다. 바람직하게는, 상기 프라이머의 길이는 약 5-50 뉴클레이티드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 따라 변화할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 강직성척추염 환자에서 특이적으로 발현되는 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트면 어떤 것이든 상관없다. 바람직하게는 본 발명의 프라이머 세트는 하기를 포함할 수 있다:
(1) 서열번호 7 로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 포워드(forward) 프라이머; 및 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 리버스(reverse) 프라이머.
(2) 서열번호 15 내지 17으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 포워드(forward) 프라이머; 및 서열번호 19 로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는리버스(reverse) 프라이머.
(3) 서열번호 18로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 포워드(forward) 프라이머; 및 서열번호 20으로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 리버스(reverse) 프라이머.
본 발명에서 사용되는 프라이머는 상기 각각의 프라이머와 80%이상, 바람직하게는 90%이상 서열 상동성을 가지는 기능적 동등물의 프라이머를 포함하는 것이다. 상기 기능적 동등물은 실질적으로 상기 프라이머 세트들에 의하여 생성되는 산물과 동등한 산물을 강직성척추염 환자에서만 특이적으로 만들어 내는 것을 말한다. 상기 기능적 동등물은 상기 프라이머의 염기서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 염기서열의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다.
본 발명의 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머는 시그널을 제공할 수 있는 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 시그널을 제공할 수 있는 표지는 형광, 인광 또는 방사선을 발하는 물질일 수 있으나 이에 제한되는 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3 일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 강직성척추염 진단용 프라이머 세트는 강직성척추염 조기 진단을 하는데 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 강직성척추염 진단용 프라이머 세트를 이용하여 강직성척추염을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 생물 시료로부터 cDNA를 합성하는 단계; (b) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트와 80%이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머 세트, 및 상기 합성 cDNA를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 을 수행하는 단계: 및 (c) 상기 PCT 산물의 염기서열을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계에서는 생물 시료로부터 cDNA를 합성한다. 상기 생물 시료는 타액 (saliva), 생검 (biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 또는 소변 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 바람직하게는 혈액일 수 있으며 더욱 바람직하게는 말초혈액일 수 있다. 상기 cDNA 합성은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법 또는 상업적으로 판매되는 cDNA 제작 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계의 cDNA 및 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한다.
프라이머 세트에 대하여는 상기 기재한 바와 같다. 상기 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 분석하고자 하는 상기 cDNA와 본 발명에서 제공되는 강직성척추염 진단용 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O) 등을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우, 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다.
상기에서 변성 및 증폭은 94℃-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 52℃-65℃이며, 보다 바람직하게는 60℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 강직성척추염 진단용 프라이머 세트를 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 60℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 30 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 반응시킨다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 강직성척추염 진단용 프라이머 세트를 포함하는 강직성척추염 진단 키트를 제공한다. 진단 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있게 하기 위하여, DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
참고로, 상기에서 언급한 공지의 방법은 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA (1990)).
본 발명의 일실시예에서는 강직성척추염 환자와 정상인의 혈액을 채취하여 cDNA를 합성하고 다양한 프라이머를 이용하여 강직성척추염 환자에서 특이적으로 PCR산물을 합성하는 프라이머를 선별하였다. 그 결과 서열번호 7로 표시되는 프라이머를 포워드(forward) 프라이머로 하고 서열번호 9 내지 13으로 표시되는 프라이머들의 혼합물을 리버스(reverse) 프라이머로 이용한 경우 강직성척추염 환자에서 특이적으로 PCR산물이 합성되는 것을 확인하였다 (실시예 1 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 합성되는 산물을 확인하기 위하여 상기 산물을 PIT2 파이지미드 벡터에 삽입하여 E.coli 에 전기주입시켜 배양하는 방법으로 상기 산물을 증폭하였다 (실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 상기 배양된 E.coli 중 상기 산물이 정상적으로 들어간 균주를 선별하여 DNA를 분리하여 염기서열을 획득하였으며, 서열번호 21로 표시하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 상기 획득된 염기서열이 어떠한 유전자인지 유전자 데이터베이스 검색을 통하여 규명하였으며, 강직성척추염 환자에서 동일하게 상기 부분이 나타나는지 여부를 확인하였다. 그 결과 상기 서열번호 21의 염기서열은 CDC 42 BPB (binding protein kinase beta) 의 인트론 부분의 염기서열과 일치한다는 결과를 얻었으며, 39명의 강직성척추염 환자의 혈액을 채취하여 동일한 과정으로 실험을 진행하여 획득한 염기서열을 상호비교한 결과 본 발명의 프라이머 세트는 강직성척추염 환자에서 안정적으로 동일한 PCR 산물을 합성하는 것을 확인하였다 (실시예 4 참조). 상기로부터, 서열번호 21의 염기서열은 강직성 척추염을 진단하는 바이오마커 유전자가 될 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 서열번호 21의 염기서열의 전부 또는 일부를 이용하여 강직성척추염을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) 환자의 생물 시료로부터 cDNA를 합성하는 단계; (b) 상기 본 발명의 프라이머 세트 중 하나와 80%이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머 세트, 및 상기 합성 cDNA를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 을 수행하는 단계: 및 (c) 서열번호 21의 염기서열 전부 혹은 일부를 포함하는 PCR 산물을 확인하는 단계. 상기 생물 시료는 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 상기 실시예 4에서 밝혀진 강직성척추염 환자에서 특이적으로 증폭되는 산물의 염기서열을 분석한 결과를 바탕으로 강직성척추염 환자에서 특이적으로 PCR 산물을 만들어내는 프라이머 세트를 추가적으로 제작하였다. 제작된 프라이머 세트를 이용하여 시험한 결과 이들도 강직성척추염 환자에서 특이적으로 PCR 산물을 만들어내는 것을 확인하였다 (실시예 5 참조).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
VH
지역 유전자증폭
먼저 강직성척추염 환자와 정상대조군으로부터 혈액을 채취하여 분리배지(Histopaque-sigma, UK)의 밀도구배원심분리법을 이용하여 PBMC(peri- pheral blood mononuclear cells)와 혈청을 추출하여 cDNA를 합성하고 여기서 합성된 cDNA로부터 VH (immunoglobulin heavy chain variable region) 포워드(forward) 프라이머 및 JH (immunoglobulin heavy chain joining region) 리버스(reverse) 프라이머를 이용하여 각각 샘플의 VH지역 유전자를 증폭시켰다. 프라이머의 디자인은 우선적으로 cDNA로부터 human VH 지역을 증폭하는데 일반적으로 사용되는 프라이머를 근간으로 하여 설정하였으며 (Van et al., (2003) Clin. Exp. Immunol. 131(2):364-376), IgBLAST의 human 유전자의 항체 VH 배선유전자(Immunoglobulin Blast Human VH germline gene) 배열과의 비교를 통하여 세가지 프라이머를 추가하였다 (서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 13 의 프라이머)
| 서열번호 | 이름 | 염기서열(5' -> 3') |
| 1 | HuVH1For | CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG |
| 2 | HuVH2For | CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCT GG |
| 3 | HuVH3For | GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG |
| 4 | HuVH4For | CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG |
| 5 | HuVH5For | GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC |
| 6 | HuVH6For | CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG |
| 7 | HuVH2*For | CAG ATC ACC TTG AAG GAG TCT GG |
| 8 | HuVH4*For | CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG |
| 9 | HuJH1-2Rev | TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC |
| 10 | HuJH3Rev | TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC |
| 11 | HuJH4-5Rev | TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC |
| 12 | HuJH6Rev | TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC |
| 13 | HuJH7Rev | TGA CCG TGG TCC CTT GGC CCC AGA |
[상기 A는 a(Adenine); C는 c(Cytosine); G는 g(Guanine); T는 t(Thymine); U는 u(Uracil); Y는 c 또는 t(u); R은 a 또는 g; M은 a 또는 c; K는 g 또는 t(u); S는 g 또는 c; W는 a 또는 t(u); H는 a 또는 c 또는 t(u); B는 g 또는 t(u) 또는 c; V는 g 또는 c 또는 a; D는 g 또는 a 또는 t(u); N은 g, a, c 또는 t(u)이다. 이하 염기서열에서도 동일하다.]
강직성척추염 환자와 정상대조군의 cDNA샘플을 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하여 VH 지역의 절편을 얻었다.
50의 전체 반응액에 각각의 VH 포워드프라이머 (HuVH1For, HuVH2For, HuVH3For, HuVH4For, HuVH5For, HuVH6For, HuVH2*For, 또는 HuVH4*For) 2.5와 리버스프라이머 혼합물(HuJH1-2Rev, HuJH3Rev, HuJH4-5Rev, HuJH6Rev, HuJH7Rev의 동일 농도 혼합액) 2.5를 첨가하고 dNTP 1, 샘플 DNA 1그리고 PCR 중합효소 1를 넣고 잘 섞은 후 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간 30회 사이클을 반복하여 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA를 아가젤에서 전기영동한 뒤 예측한 크기의 DNA를 가열 추출기법으로 정제하였다.
이 결과 정상대조군과 강직성척추염 환자군에서 HuVH1For, HuVH2For, HuVH3For, HuVH4For, HuVH5For, HuVH6For 및 HuVH4*For 포워드 프라이머를 사용한 경우의 발현양상은 차이가 없으나, HuVH2*For를 포워드 프라이머로 사용한 경우의 발현 양상은 정상대조군과 강직성척추염 환자군이 차이가 나는 것을 확인하였다(도 1 참조).
이로부터 정상대조군과 환자의 항체 절편을 얻었다 (정상대조군의 VH1, VH3, VH5 절편과 환자의 VH1, VH3, VH5 및 VH2* 절편).
실시예
2.
VH2
* 로
형질전환 된
박테리아 제조
상기 실시예 1에서 얻은 VH2* 절편과 PIT2 파아지미드 벡터를 100의 전체 반응액에 4의 제한효소 NcoI과 잘 혼합한 후 4시간 동안 37℃에서 항온 반응한 후 정제를 하고, 이어서 4의 제한효소 XhoI을 가한 후 37℃에서 4시간 동안 항온 반응한 후 이를 아가젤에 전기 영동하여 가열 추출방식으로 DNA를 분리하였다.
PIT2 파아지미드 벡터의 경우는 NcoI과 XhoI 처리를 마친 다음 여기에 2의 탈인산 효소를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 항온 반응을 한 후 정제하였다. 제한효소로 잘려진 VH2* 절편과 제한효소 및 탈인산효소로 처리된 PIT2 파아지미드 벡터를 전체 반응액 20에 각각 3와 4씩 가한 후 여기에 1의 연결효소(ligase)를 넣어 잘 섞은 후 16℃에서 18시간동안 항온반응을 하였다.
항온반응 결과물을 정제하고 미리 준비된 E. coli TG1 균주에 전기충격법을 이용하여 주입하였다. 전기충격법의 반응조건은 12.5kV/cm, 200오옴, 25mF으로 하였다.
전기충격작업이 끝난 후 암피실린을 함유한 아가 배지 플레이트에 E. coli를 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다.
실시예
3. 형질전환 균주의 염기서열 분석
상기 실시예 2에서의 재조합 DNA의 주입으로, 암피실린이 함유된 배지에서 성장하는 균주를 골라 LB 배지에 넣어 16시간 배양한 후 그 속에서 재조합 DNA를 정제하고 이를 LMB3 프라이머(서열번호 14; 5’- CAG GAA ACA GCT ATG AC -3’)를 사용하여 시퀀싱을 실시하여 VH2* 절편이 재조합DNA에 들어갔는지 확인하였다.
콜로니 중합효소 연쇄반응을 통해 선별된 클론의 DNA 시퀀싱 결과 VH2* 절편이 재조합 DNA에 들어갔음을 확인할 수 있었다. 상기 실시예 2에서의 재조합 DNA의 주입으로 인해 암피실린이 함유된 배지에서 성장한 균주만을 대상으로, 제대로 재조합DNA가 들어간 균주들을 선별하기 위하여 콜로니중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 콜로니중합효소 연쇄반응은 상기 실시예 1에서 VH2* 를 증폭하는 프라이머 세트를 이용하여 동일한 PCR 조건에서 PCR을 실시하였으며, 주형 DNA(template DNA)는 상기 암피실린이 함유된 배지에서 성장한 콜로니를 선별 투여하여 실시하였다.
PCR 결과물을 아가젤에 영동한 뒤 예측한 크기의 DNA 가 정확히 나타난 클론만을 선별하였다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, DNA band 가 정확히 나타난 클론은 N(콜로니번호) 3, 6, 및 9 (A로 나타냄) 였으며, N4 및 N 10은 밴드가 약하여 제외된 클론이다(B로 나타냄).
콜로니중합효소 연쇄반응에 의하여 선별된 콜로니의 DNA를 Eurofins MWG Operon사(독일)에 의뢰하여 염기서열을 획득하였으며, 획득한 DNA 시퀀싱 결과를 Vector NTI Suite 6 프로그램(Invitrogen, 미국)을 이용하여 분석하였다.
분석결과, 선별된 총 100개의 클론의 유전자 염기서열 시퀀싱 결과 48%의 클론에서 특정 연속 염기서열을 얻었으며 다(도 3 참조).
실시예
4. 강직성 척추염
바이오마커
유전자 규명
상기의 과정을 통해 얻어진 연속 염기 서열을 뉴클레오티드 서열 데이터베이스(GenBank, EMBL 및 RefSeq)를 이용하여 어떤 유전자에 속하는지 검색하였다.
검색 결과 본 발명의 VH2* 절편은 CDC42 BPB (binding protein kinase beta) 의 인트론 부분의 염기서열과 일치한다는 결과를 얻었다. CDC42 BPB 는 염색체 14에(4q32 83660K) 위치하며 길이가 총 1278K bp 이며 (도 4 참조), 실험을 통해 얻어진 염기서열은 인트론 부분(도 5 참조)으로 36.09K bp에서 36.35K bp 부분이다. 상기 염기서열을 서열번호 21로 표시하였다.
다음으로 강직성 척추염 환자군의 VH2* 절편의 염기 서열간의 유사성 검사를 실시하였다. 총 9명의 강직성척추염 환자의 혈액에서 cDNA를 합성하여 서열번호 7을 포워드 프라이머로 하고, 서열번호 9 내지 13으로 표시되는 프라이머의 동일농도 혼합물을 리버스 프라이머로 하여 PCR을 시행한 후, 실시예 2 및 실시예 3과 같은 방법으로 염기서열을 획득하였으며, 획득한 DNA 시퀀싱 결과를 Vector NTI Suite 6 프로그램(Invitrogen, 미국)을 이용하여 분석하였다.
그 결과 강직성 척추염 환자군에서 VH2* 절편의 염기서열이 보존적으로 존재하는 것을 확인하였다. 또한 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 실험을 통해 얻어진 강직성 척추염 환자군의 VH2* 절편은 일정한 패턴으로 CDC42 BPB 의 염기서열과 맞물려 있음을 확인할 수 있었다(도 6: 강직성 척추염 환자군의 항체 절편의 일정한 패턴 모식도).
실시예
5. 강직성 척추염 진단용
프라이머
추가 규명
실시예 4에서 밝힌 구조에 의하여 CDC42 BPB 의 intron 중 일부가 chromosomal inversion에 의해 VH2 항체 유전자(antibody gene) 사이로 들어간 것을 확인하였다. 이러한 점을 바탕으로 항체 heavy 사슬의 variable region leader sequence(VH-L), CDC42 BPB 의 intron 및 항체 constant region에서 프라이머를 제작하여 상기 실시예 1 내지 3의 방법으로 강직성척추염 환자에서만 특이적으로 산물을 만들어내는 프라이머 세트를 추가적으로 발굴 하였다.
| 서열번호 | 이름 | 염기서열(5' -> 3') |
| 15 | HuVHL1For | CR CTC CTG CTG CTG ACC A |
| 16 | HuVHL2For | GR CTG AGC TGG RTT TTC CT |
| 17 | HuVHL3For | KR CTY YGC TGG STT TTY CT |
| 18 | HuCDC42BPBFor | GAG CAC TGG CCA AGC ACT A |
| 19 | HuCDC42BPBRev | TG CTC TGT GCG AGT GTC A A |
| 20 | HuCepsilonRev | CGG ATG GGC TCT GTG TGG |
그 결과 서열번호 15 내지 17로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머와 서열번호 19의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 18 및 서열번호 20으로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 경우 강직성척추염 환자에서 특이적으로 PCR 산물을 만들어 내는 것을 확인하였다.
하기 표 3에 본 실험에서 사용된 프라이머 세트를 세 개의 그룹으로 나누어 표시하였다.
| 그룹 | 서열번호 | 이름 | 염기서열(5' -> 3') |
| 1 | 7 9 10 11 12 13 |
HuVH2*For HuJH1-2Rev HuJH3Rev HuJH4-5Rev HuJH6Rev HuJH7Rev |
CAG ATC ACC TTG AAG GAG TCT GG TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TGA CCG TGG TCC CTT GGC CCC AGA |
| 2 | 15 16 17 19 |
HuVHL1For HuVHL2For HuVHL3For HuCDC42BPBRev |
CR CTC CTG CTG CTG ACC A GR CTG AGC TGG RTT TTC CT KR CTY YGC TGG STT TTY CT TG CTC TGT GCG AGT GTC A A |
| 3 | 18 20 |
HuCDC42BPBFor HuCepsilonRev |
GAG CAC TGG CCA AGC ACT A CGG ATG GGC TCT GTG TGG |
상기 세 그룹의 프라이머 세트가 각각 복제하는 항체 절편을 도 7에 표시하였다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 그룹 1 프라이머 세트가 복제하는 영역은 항체 VH 배선유전자 지역과 항체 JH 배선유전자 사이이며, 그룹 2 프라이머 세트가 복제하는 영역은 항체 VH 배선유전자 선도 지역과 CDC42 BPB DNA 의 인트론 부분 사이이며, 그룹 3 프라이머 세트가 복제하는 영역은 CDC42 BPB DNA 의 인트론 부분과 항체 Cepsilon 배선유전자 사이이다.
도 8은 그룹 1 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이며, 도 9는 상기 정량적 PCR 결과의 각 군별 평균값을 그래프로 나타낸 것이다. 또한 도 10은 그룹 1 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 샘플별로 나타낸 것이다.
도 11은 그룹 2 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이며, 도 12는 상기 정량적 PCR 결과의 각 군별 평균값을 그래프로 나타낸 것이다. 또한 도 13은 그룹 2 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 샘플별로 나타낸 것이다.
도 14은 그룹 3 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 그래프로 나타낸 것이며, 도 15는 상기 정량적 PCR 결과의 각 군별 평균값을 그래프로 나타낸 것이다. 또한 도 16은 그룹 3 프라이머 세트를 이용한 정량적 PCR 결과를 샘플별로 나타낸 것이다.
도 8 내지 도 16에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트 (그룹 1 내지 그룹 3) 를 사용한 경우, 강직성척추염 환자에서 특이적으로 PCR 산물을 만들어 내는 것을 명백히 알 수 있다.
결론적으로, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 강직성척추염 환자를 조기에 진단하는 것이 가능하다.
본 발명의 강직성척추염 진단용 프라이머 세트 및 강직성척추염 진단용 바이오마커를 이용한 진단방법은 강직성척추염의 조기 진단을 가능하게 할 뿐만 아니라 강직성척추염의 경과 추적 및 예후 판정에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuVH1For: Forward Primer for variable segment of human antibody
heavy chain
<400> 1
caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuVH2For : Forward Primer for variable segment of human antibody
heavy chain
<400> 2
caggtcaact taagggagtc tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuVH3For : Forward Primer for variable segment of human antibody
heavy chain
<400> 3
gaggtgcagc tggtggagtc tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuVH4For : Forward Primer for variable segment of human antibody
heavy chain
<400> 4
caggtgcagc tgcaggagtc ggg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuVH5For : Forward Primer for variable segment of human antibody
heavy chain
<400> 5
gaggtgcagc tgttgcagtc tgc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> HuVH6For : Forward Primer for variable segment of human antibody
heavy chain
<400> 6
caggtacagc tgcagcagtc agg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuVH2*For : Forward Primer for variable segment of human antibody
heavy chain
<400> 7
cagatcacct tgaaggagtc tgg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> HuVH4*For : Forward Primer for variable segment of human antibody
heavy chain
<400> 8
caggtgcagc tacagcagtg ggg 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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heavy chain
<400> 9
tgaggagacg gtgaccaggg tgcc 24
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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tgaggagacg gtgaccgtgg tccc 24
<210> 13
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> HuJH7Rev : Reverse Primer for joining segment of human antibody
heavy chain
<400> 13
tgaccgtggt cccttggccc caga 24
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LMB3 : Primer for sequencing
<400> 14
caggaaacag ctatgac 17
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuVHL1For: Forward Primer for leader sequence of human antibody
heavy chain
<400> 15
crctcctgct gctgacca 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> HuVHL2For: Forward Primer for leader sequence of human antibody
heavy chain
<400> 16
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> HuVHL3For: Forward Primer for leader sequence of human antibody
heavy chain
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<210> 18
<211> 19
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<213> Artificial Sequence
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<223> HuCDC42bkFor: Forward Primer for CDC42 binding kinase
<400> 18
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<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tgctctgtgc gagtgtcaa 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HuCepsilonRev: Reverse Primer for constant region of human
antibody epsilon heavy chain
<400> 20
cggatgggct ctgtgtgg 18
<210> 21
<211> 243
<212> DNA
<213> Human CDC42 binding kinase intron
<400> 21
tcagaagcag cggtgagatc ctggctgttc ctgaaagtga gacgagcgga tttcctgctg 60
gatggggcgt gcaggttgac actcgcacag agcactggcc aagcactagg acgctggagt 120
tgcctgcatg ggaaggctga cagaggctgg tgggctgagt ggcagggaag cagctggaca 180
ggtgatgcag ttccagagag aagcccaagg tgcccagtgt acagctggta tcggatgaga 240
tca 243
Claims (14)
- 하기를 포함하는 강직성척추염 진단용 프라이머 세트:
(a) 서열번호 7 로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 포워드(forward) 프라이머; 및
(b) 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 리버스(reverse) 프라이머.
- 하기를 포함하는 강직성척추염 진단용 프라이머 세트:
(a) 서열번호 15 내지 17로 표시되는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 포워드(forward) 프라이머; 및
(b) 서열번호 19 로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 리버스(reverse) 프라이머.
- 하기를 포함하는 강직성척추염 진단용 프라이머 세트:
(a) 서열번호 18로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 포워드(forward) 프라이머; 및
(b) 서열번호 20으로 표시되는 프라이머와 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 리버스(reverse) 프라이머.
- 하기 단계를 포함하는, 강직성척추염 진단 방법:
(a) 환자의 생물 시료로부터 cDNA를 합성하는 단계;
(b) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트와 80%이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머 세트, 및 상기 합성 cDNA를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 을 수행하는 단계: 및
(c) 상기 PCT 산물의 염기서열을 확인하는 단계.
- 제 4항에 있어서,
상기 생물 시료는 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변, 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
- 제 5항에 있어서,
상기 생물 시료는 혈액인, 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트와 80%이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머 세트를 포함하는 강직성척추염 진단 키트.
- 서열번호 21의 염기서열 전부 혹은 일부를 포함하는 강직성척추염 진단용 바이오마커.
- 서열번호 21의 염기서열 전부 혹은 일부를 이용하여 강직성척추염을 진단하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 환자의 생물 시료로부터 cDNA를 합성하는 단계;
(b) 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트와 80%이상의 서열 상동성을 가지는 프라이머 세트, 및 상기 합성 cDNA를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 을 수행하는 단계: 및
(c) 서열번호 21의 염기서열 전부 혹은 일부를 포함하는 PCR 산물을 확인하는 단계.
- 제 10항에 있어서,
상기 생물 시료는 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변, 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 생물 시료는 혈액인, 방법.
- 서열번호 21의 염기서열 전부 혹은 일부를 포함하는 강직성척추염 진단 키트.
- 제 13항에 있어서, 상기 염기서열은 서열번호 21과 80% 이상의 서열 상동성을 가지는 것인, 진단 키트.
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