WO2011004111A1 - Catalyseur enzymatique heterogene, procede de preparation et utilisation - Google Patents

Catalyseur enzymatique heterogene, procede de preparation et utilisation Download PDF

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WO2011004111A1
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silica
group
monolith
catalyst
precursor
Prior art date
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PCT/FR2010/051413
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Inventor
Nicolas Brun
Annick Babeau-Garcia
Clément Sanchez
Rénal BACKOV
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Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6)
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
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    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier

Definitions

  • the present invention relates to a heterogeneous enzymatic catalyst, to a process for the preparation of such an enzymatic catalyst, and to its use for carrying out chemical reactions by heterogeneous phase enzymatic catalysis.
  • Enzymatic catalysis is part of "green” chemistry and sustainable development. It allows the realization of various chemical reactions by minimizing the use of solvents, while promoting the use of bioprecursors.
  • Heterogeneous catalysis (or contact catalysis) is aimed at transforming liquid or gaseous reactants by employing a solid catalyst.
  • the chemical process takes place at the solid-fluid interface, thanks to the adsorption of the reagents on the surface of the solid.
  • a generally porous solid support polymer matrices, colloidal silica, calcium silicate, zeolites, zirconium, kaolinite, porous glass, alumina, etc.
  • These systems allow easy recovery of the enzyme when the reaction is complete.
  • the present invention relates to a heterogeneous enzyme catalyst characterized in that it is in the form of a honeycomb monolith formed of a silica matrix or organically modified silica, said monolith comprising macropores having an average dimension A from 1 ⁇ m to 100 ⁇ m; mesopores having a mean dimension d E of 2 to 50 nm and micropores having a mean dimension di from 0.7 to 1.5 nm, said pores being interconnected, and wherein the internal surface of the macropores is functionalized by a surfactant; coupling selected from silanes on which is fixed, via a covalent or electrostatic bond, an unpurified enzyme.
  • non-purified enzyme means any protein material comprising at least one non-isolated enzyme which has not undergone any purification step.
  • the term "monolith” means a solid object having an average dimension of at least 1 mm.
  • the use of such a monolith makes possible the implementation of unpurified enzymes which is of great interest from an economic point of view.
  • the immobilization of an unpurified enzyme via a coupling agent chosen from silanes, within the macropores of such a monolith leads to a heterogeneous enzymatic catalyst having a very high catalytic activity, reaching most often 100% of the theoretical catalytic activity of the enzyme when it is carried out in the purified or non-immobilized state, as well as a great cyclability.
  • the inventors have also demonstrated that when an unpurified enzyme is immobilized in such a monolith, its kinetics of reaction is increased.
  • the walls of the macropores generally have a thickness of 0.5 to 40 microns, and preferably 2 to 25 microns.
  • the micropores are present in the thickness of the walls of the macropores, thus rendering them microporous.
  • the specific surface area of the monolith is generally from 200 to 1000 m 2 / g approximately, preferably from 300 to 700 m 2 / g approximately.
  • the silica carries organic groups R corresponding to the following formula (I): - (CH ⁇ -R 1 (I) in which:
  • R 1 represents a thiol group, a pyrrolyl group C 4 H 3 N- linked by nitrogen to the - (CH 2 ) n - group, an amino group which optionally carries one or more alkyl, alkylamino or optionally substituted aryl substituents, an alkyl group (preferably having from 1 to 5 carbon atoms), mono or polyhydroxyalkyl group C 2 -C 2I, a phenyl group or a phenyl group substituted by an alkyl radical, preferably methyl.
  • the organic group R may be:
  • the silica matrix of the alveolar monolith may, in addition, comprise one or more metal oxides MO 2 in which M is a metal chosen from Zr,
  • the silica matrix is a mixed matrix of SiO 2 -MO 2 type .
  • the SiO 2 -ZrO 2 matrices are preferred.
  • the metal oxide content MO 2 preferably represents from 10 to 50% by weight, relative to the weight of the silica or of the organically modified silica.
  • the bond ensuring the attachment of the coupling agent with the silica or the R group of the silica in the case of an organically modified silica is an iono-covalent bond.
  • the coupling agent is chosen from silanes selected from the group consisting of ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane; silylated ionic liquids such as by Examples are 1-methyl-3- (3-triethoxysilylpropyl) imidazolium chloride, 1-methyl-3- (3-triethoxysilylpropyl) imidazolium hexafluorophosphate; silanes of formula Si (OR) 3 R in which R represents a C 1 -C 2 alkyl group, and R 3 represents a group - (CH 2 OH-CH 2 OH) q -CH 2 OH or - (CH 2 OH-CH 2 OH) q -CH 2 CH 3 wherein q is an integer ranging from 1 to 10.
  • ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane also known under the name "Glymo” is particularly preferred.
  • the nature of the enzyme that can be immobilized on the silica monolith via the coupling agent is not critical from the moment when it comprises at least one functional group capable of reacting with a complementary functional group carried. by the coupling agent to form an iono-covalent bond.
  • the coupling agent used is a silylated ionic liquid, it is electrostatic bonds.
  • the unpurified enzyme is chosen from:
  • hydrolases class EC 3 of the classification established by the Commission for Enzymes, Brussels), such as esterases (EC 3.1), and in particular carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1) such as lipases ( EC 3.1.1.3 or triacylglycerol acylhydrolases); amino-acylases (E.C. 3.5.1.14), amidases (E.C. 3.5.1.4, E.C. 3-5-1-3 or omega-amidase, E.C. 3-5-1-11 or penicillin-amidase); nitrilases (class E.C. 3.5.5.1.) which catalyze the hydrolysis of nitriles to carboxylic acids;
  • lyases including carboxy lyases (EC 4.1.1), aldehyde lyases (EC 4.1.2) such as oxynitrilases (classes EC 4-1-2-10 and EC 4) -1-2-37) catalyzing the synthesis of chiral cyanohydrins; and hydro-lyases (E.C. 4.2.1);
  • E.C. 5 isomerases (E.C. 5) including epimerases and racemases (E.C. 5.1), and in particular epimerases and racemases of E.C. class 5.1.1. catalyzing the formation of enantiomers of amino acids;
  • oxidoreductases comprising especially glucose oxidases (E.C. 1.1.3.4) such as Aspergillus niger glucose oxidase and peroxidases (E.C. 1.11.1) such as horseradish peroxidase.
  • the unpurified enzyme is chosen from lipases of microbial or vegetable origin, and In particular, among the lipases of Candida Rugosa, Candida antartica, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Thermomyces lanuginosus, Chromobacterium viscosum, Rhizomucor miehei, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Penicillium roqueforti, Penicillium expansum, Rhizopus arrhizus and wheat germ lipases.
  • the amount of immobilized enzymes in the catalyst according to the invention can be determined by thermogravimetric analysis and by elemental analysis. According to a preferred embodiment of the invention, the amount of immobilized unpurified enzyme varies from about 3 to about 40% by weight and more preferably from about 10 to about 20% by weight based on the total weight of the catalyst.
  • the present invention also relates to a process for preparing a heterogeneous enzymatic catalyst according to the invention and as defined above, said process comprising a first step of preparing a solid silica impression in the form of an alveolar monolith consisting of an organically modified silica or silica matrix, said monolith comprising macropores having an average size d A of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m; mesopores having a mean dimension d E of 2 to 50 nm and micropores having an average size di of 0.7 to 1.5 nm, said pores being interconnected, said method being characterized in that it further comprises the steps following:
  • the preparation of the silica impression, in the first step is carried out according to the methods as described in patent applications FR-A1-2 852 947 and FR-A1 -2,912,400.
  • the precursor (s) of silica oxide or of organically modified silica can be chosen from the silica alkoxides of formula (II) below:
  • R 4 represents an alkyl radical having 1 to 5 carbon atoms or an aryl radical which optionally carry one or more functional groups;
  • R 5 represents an alkyl radical having 1 to 5 carbon atoms or a group of formula (I) below:
  • R 1 is selected from a thiol group, a N-linked pyrrolyl C 4 H 3 N- group to the - (CH 2 ) n - group, an amino group which optionally bears one or more alkyl, alkylamino or optionally substituted aryl, an alkyl group (preferably having from 1 to 5 carbon atoms), mono or polyhydroxy C 2 -C 2I, a phenyl group or a phenyl group substituted by an alkyl radical preferably a methyl group; and
  • p is an integer equal to 0, 1, 2 or 3.
  • the precursor of formula (II) comprises a single type of group of formula (I). In another embodiment, the precursor of formula (II) comprises at least two different types of groups of formula (I).
  • organic group of formula (I) may be:
  • the precursor (s) of formula (I) are chosen from tetramethoxyorthosilane (TMOS), tetraethoxyorthosilane (TEOS), dimethyldiethoxysilane (DMDES),
  • the precursor of formula (I) is chosen from TEOS, a mixture of TEOS and DMDES in which the DMDES represents from 5 to 30% by weight relative to TEOS, and the TMOS .
  • the concentration of silica oxide precursor (s) and / or organically modified silica oxide precursors in the aqueous solution is preferably greater than 10% by weight relative to the mass of the aqueous phase. . This concentration varies more preferably from 17 to 35% by weight relative to the mass of the aqueous phase.
  • the organically modified silica or silica matrix further comprises at least one metal oxide MO 2 in which M is a metal selected from Zr, Ti, Th, Nb, Ta, V, W and Al
  • the aqueous solution of precursor (s) silica or silica organically modified silica further comprises at least one precursor of said metal oxide, said precursor being selected from the compounds of formula (III) below:
  • M is a metal chosen from Zr, Ti, Th, Nb, Ta, V, W and Al, and
  • R 6 is a C 1 -C 4 alkyl radical, preferably a methyl or ethyl radical.
  • the oily phase is preferably constituted by one or more compounds chosen from linear or branched alkanes having at least 12 carbon atoms.
  • the oil can be constituted by a silicone oil of low viscosity, that is to say less than 400 centipoise.
  • the amount of oily phase present in the emulsion can be adjusted as a function of the diameter of the macropores that one wishes to obtain for the silica impression, it being understood that the higher the volume fraction oil / water, the larger the diameter. droplets of oil within the emulsion will be weak and the diameter of the macropores will be low also.
  • the oily phase represents from 60 to 90% by volume relative to the total volume of the emulsion. This amount of oil makes it possible to obtain a silica impression in which the mean diameter of the macropores varies from approximately 1 to 100 ⁇ m.
  • the surfactant compound may be a cationic surfactant chosen in particular from tetradecyltrimethylammonium bromide (TTAB), dodecyltrimethylammonium bromide or cetyltrimethylammonium bromide.
  • TTAB tetradecyltrimethylammonium bromide
  • the reaction medium is brought to a pH of less than 3, preferably less than 1. Tetradecyltrimethylammonium bromide is particularly preferred.
  • the surfactant compound may further be an anionic surfactant selected from sodium dodecyl sulphate, sodium dodecyl sulphonate and sodium dioctyl sulphosuccinate (AOT).
  • AOT sodium dioctyl sulphosuccinate
  • the surfactant compound may finally be a nonionic surfactant chosen from ethoxylated head surfactants and nonylphenols.
  • ethoxylated head surfactants and nonylphenols there may be mentioned in particular block copolymers of ethylene glycol and propylene glycol sold for example under the trade names Pluronic® P 123 and Pluronic® F 127 by BASF.
  • the reaction medium is brought to a pH of greater than 10 or less than 3, preferably less than 1, and preferably also contains sodium fluoride in order to improve the condensation of the precursors of silica oxide.
  • the total amount of surfactant present in the emulsion can also be adjusted as a function of the diameter of the macropores that it is desired to obtain in the silica impression. This amount is also variable depending on the nature of the surfactant used. In general, the amount of surfactant varies from 1 to 10% by weight, preferably from 3 to 6% by weight, relative to the total weight of the emulsion.
  • the step of condensing the precursor (s) of silica oxide and / or of the precursor (s) of organically modified silica oxide is advantageously carried out at a temperature close to ambient temperature.
  • the duration of this step can vary from a few hours (2 to 3 hours) to a few weeks (2 to 3 weeks) depending on the pH of the reaction medium.
  • the silica impression obtained at the end of the first step is washed with the aid of an organic solvent (such as, for example, tetrahydrofuran, acetone and their mixtures) and then dried (for example by air in an oven or by lyophilization) before undergoing the impregnation step with the solution of carbon precursor or ceramic precursor.
  • an organic solvent such as, for example, tetrahydrofuran, acetone and their mixtures
  • the solvent of the coupling agent solution used in the coupling reaction is an organic solvent, preferably selected from chloroform, toluene and mixtures thereof.
  • said solvent is a mixture of equal parts, chloroform and toluene.
  • the amount of coupling agent in the solution used for the functionalization step may be adjusted according to the diameter of the macropores of the silica monolith and the amount of unpurified enzyme that it is desired to immobilize. In general, this amount may vary from 0.02 M to 0.5 M, and preferably from 0.05 M to 0.2 M.
  • a solution of coupling agent at 0.1 M in a mixture of chloroform and toluene 50/50 (v / v) is used.
  • the functionalization step of the alveolar monolith by the coupling agent is preferably carried out under vacuum at ambient temperature for a duration of about 72 hours.
  • the immobilization step of the unpurified enzyme is preferably carried out under vacuum at room temperature for a period of about 72 hours.
  • the washing of the monolith at the end of the functionalization step is preferably carried out with an organic solvent such as, for example, tetrahydrofuran, chloroform or acetone. Finally, the monolith is dried, preferably in air for about 2 days. The washing of the monolith at the end of the immobilization step of the unpurified enzyme is preferably carried out with distilled water.
  • the heterogeneous enzymatic catalyst according to the present invention can be used for carrying out catalyzed chemical reactions in heterogeneous phase.
  • the nature of the chemical reactions that can be catalysed by the catalyst according to the invention will of course vary depending on the nature of the unpurified enzyme which is immobilized.
  • the catalyst according to the invention is used to catalyze the hydrolysis of triglycerides of fatty acids, esterification reactions between an acid and an alcohol, transesterification reactions between a ester and an alcohol, inter-esterification reactions between two esters or reactions of transfer of an acetyl group from an ester to an amine or a thiol.
  • said catalyst can be used, for example, to catalyze:
  • butyloleate which is a lubricant for biodiesels
  • hydrolysis of glycerolinoleic ester derivatives to lead to soaps or detergents
  • the present invention is illustrated by the following exemplary embodiments, to which it is however not limited.
  • TTAB tetradecyltrimethylammonium bromide
  • TEOS Tetraethoxyorthosilane 98%
  • Coupling agent ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane sold under the trade name Glymo by Sigma Aldrich (St-Louis, MO);
  • Candida Rugosa Lipase EC3.1.1.3, Type VII, 700 U / mg, Sigma Chemical Company (St. Louis, MO); Thermomyces Lanuginosus Lipase, at least 100,000 U / g solution, Sigma Aldrich Company (St. Louis, MO);
  • the macroporosity was qualitatively characterized by a scanning electron microscopy (SEM) technique using a scanning electron microscope sold under the reference JSM-840A by JEOL, operating at 10 kV.
  • SEM scanning electron microscopy
  • the macroporosity was quantified by mercury intrusion measurements, using a device marketed under the name Micromeritics Autopore IV, to reach the characteristics of the macroscopic cells composing the monolith skeleton.
  • the monoliths were subjected to a small angle X-ray (X-ray) diffraction analysis (SAXs), using a 18kW (Rigaku-200) rotating anode RX source using a crystal (111) of Ge as monochromator.
  • SAXs small angle X-ray
  • the scattered radiation was collected on a two-dimensional collector (Imaging Plate System, marketed by Mar Research, Hamburg). The distance from the detector to the sample was 500 mm.
  • the mesoporosity was characterized qualitatively by a transmission electron microscopy (TEM) technique using a microscope sold under the reference H7650 by the company Hitachi, having an acceleration voltage of 80 kV, and coupled to a camera sold under the reference Orius 11 MPX by the company Gatan lnc.
  • TEM transmission electron microscopy
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • TEOS TEOS
  • TTAB aqueous solution of TTAB
  • This solution was then acidified by adding 5.88 g of a 37% concentrated hydrochloric acid solution.
  • the hydrolysis was allowed to proceed with stirring for about 5 minutes until a monophasic hydrophilic medium (aqueous phase of the emulsion) was obtained.
  • 40.0 g of dodecane (oily phase of the emulsion) were then added to this aqueous phase dropwise with stirring.
  • the mixture was transferred to a cylindrical container as a macroscopic mold.
  • the emulsion was then allowed to condense as a silica monolith for 3 days at room temperature.
  • the Silica monolith thus synthesized was then washed three times with tetrahydrofuran (THF).
  • THF tetrahydrofuran
  • the silica monolith was then allowed to dry for 3 days at ambient temperature and then it was subjected to heat treatment at 650 ° C. for 6 hours by applying a temperature rise rate of 2 ° C./min., With a plateau. at 200 0 C for 2 hours.
  • a silica monolith was obtained which was designated MSi.
  • the silica monolith obtained above in the previous step was cut into several pieces of 1 g each.
  • silica monoliths were then extracted from the lipase solutions and then washed three times with distilled water in order to remove the excess of enzymes, and then dried at room temperature for 12 hours. There was thus obtained silica monoliths immobilizing a lipase via Glymo (MSi-Glymo-1CR and MSi-Glymo-17Z). These monoliths were stored at 4 ° C prior to their use as a heterogeneous enzymatic catalyst.
  • the same esterification reaction was thus repeated 21 times using, each time, the same catalyst. Between the 10 th and 11 th reactions, the catalyst was stored at 4 ° C for 2 months. Between each esterification reaction, the catalyst was thus recovered, washed with heptane and then dried before being reused again to catalyze a new esterification reaction.
  • the catalytic activity of the catalyst MSi-ICR which is not in accordance with the invention never reaches 100% (only 95% during the first cycle) and that the kinetics of the reaction is, moreover, twice as slow as with the enzymatic catalyst MSi-Glymo-1CR according to the present invention.
  • the catalytic activity of MSi-ICR begins secondly to decrease from the 2nd esterification cycle, reaching 87% at the end of 5 th esterification cycle.
  • the MSi-Glymo-1CR catalyst according to the present invention leads to higher than the best conversion rates. levels obtained to date with the heterogeneous catalysts described in the prior art, this better catalytic activity being accompanied by a better stability over time of the catalyst. Indeed, the heterogeneous catalysts described in the prior art, in particular catalysts in which the same Candida Rugosa enzyme has been immobilized in a polyurethane foam (Awang, R et al., Am. J. Biochem.
  • Example 2 0.20 g of MSi-Glymo-1CR as prepared above in Example 1 was introduced into 15 ml of water saturated heptane (0.6% by weight). The mixture was brought to a temperature of 37-38 ° C., then 100 ⁇ l of trilinolein dissolved in MTBE at a concentration of 100 mg / ml were added to ultimately give a solution of trilinolein having a concentration of 0. , 66 mg / mL. The reaction medium was incubated for 24 hours at a temperature of 37-38 ° C.
  • the hydrolysis reaction was monitored by quantifying the disappearance of trilinolein and the appearance of the intermediate products (4 '), (4 ") and (4' ') and end products (linoleic acid (5) and glycerol (6)), by HPLC. After 24 hours of incubation, the heterogeneous MSi-Glymo-1CR catalyst was recovered and then washed 3 times with the heptane solution saturated with water.
  • This reaction leads to the formation of linoleic acid ethanoate (8) and glycerol (6).
  • Such a reaction is used for the production of biodiesels which are methyl or ethyl esters of vegetable oils.
  • the reaction was carried out in "batch" mode in tubes containing 4 ml of heptane, 100 ⁇ l of glyceryl trilinoleate (4) previously dissolved in MTBE at a concentration of 100 mg / ml, 25 mg of ethanol and 387 mg of MSi-Glymo-17i as prepared above in Example 1.
  • the reaction medium was incubated at 37 ° C for 24 hours.
  • the conversion of glyceryl trilinoleate (4) to linoleic acid ethanoate (8) was followed by HPLC.
  • the catalyst was recovered, washed with heptane and dried before being reused again to catalyze a new transesterification reaction.
  • the heterogeneous MSi-Glymo-17Z catalyst can be used to catalyze the transesterification of trilinoline into ethanoate linoleic acid with a conversion of up to 100% in 24 hours at 37C ° in the first cycle and decreasing to 45% after the 5th cycle.
  • This loss of activity is however certainly due to the presence of ethanol which has a denaturing action vis-à-vis the lipase.
  • This result is nevertheless higher than the conversion rates obtained by using a macroporous polyglutaraldehyde-modified polymer foam immobilizing the same enzyme, which is 90.2% in 24 hours (Dizge, N. et al, Bioresource Technology, 2009). , 100, 1983-1991.
  • heterogeneous catalyst according to the invention allows the T. lanuginosus lipase to function optimally in essentially anhydrous medium (heptane) without the need to add water while It is well known that for a lipase to express its maximum catalytic potential, it must be carried out in a medium with a certain water content (Linko, Y.Y. et al, JAOCS, 1995, 72 (1)). 1), 1293-1299).

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Abstract

L'invention concerne un catalyseur enzymatique hétérogène se présentant sous forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice ou de silice organiquement modifiée, ledit monolithe comprenant des macropores, des mésopores et des micropores, lesdits pores étant interconnectés, et dans lequel la surface interne des macropores est fonctionnalisée par un agent de couplage choisi parmi les silanes sur lequel est fixée, par l'intermédiaire d'une liaison covalente ou électrostatique, une enzyme non purifiée. L'invention concerne également le procédé de préparation d'un tel catalyseur, ledit procédé comportant : une première étape de préparation d'une empreinte de silice solide sous la forme d'un monolithe alvéolaire tel que défini ci-dessus; une deuxième étape de fonctionnalisation de la surface interne des macropores par un agent de couplage choisi parmi les silanes, par imprégnation sous vide du monolithe alvéolaire par une solution de l'agent de couplage dans un solvant organique; et une troisième étape d'imprégnation, sous vide, du monolithe ainsi fonctionnalisé par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une enzyme non purifiée. Enfin l'invention concerne l'utilisation d'un tel catalyseur pour la réalisation de réactions chimiques catalysées.

Description

CATALYSEUR ENZYMATIQUE HETEROGENE, PROCEDE DE
PREPARATION ET UTILISATION
La présente invention est relative à un catalyseur enzymatique hétérogène, à un procédé de préparation d'un tel catalyseur enzymatique, et à son utilisation pour la réalisation de réactions chimiques par catalyse enzymatique en phase hétérogène.
La catalyse enzymatique s'inscrit dans le cadre de la chimie « verte » et du développement durable. Elle permet la réalisation de diverses réactions chimiques en minimisant l'utilisation de solvants, tout en favorisant l'utilisation de bioprécurseurs.
Compte tenu du prix élevé des enzymes, notamment en raison de leurs coûts de production et de purification, il est important de pouvoir les récupérer facilement dans le milieu réactionnel lorsque la réaction qu'elles ont catalysée est terminée.
Une des solutions proposées pour résoudre ce problème consiste à immobiliser les enzymes sur un support solide. On parle alors de catalyse enzymatique hétérogène.
La catalyse hétérogène (ou catalyse de contact) vise à réaliser une transformation de réactifs liquides ou gazeux, en employant un catalyseur solide. Le processus chimique se déroule à l'interface solide-fluide, grâce à une adsorption des réactifs à la surface du solide.
Les différents systèmes catalytiques enzymatiques actuellement proposés sont majoritairement constitués d'un support solide généralement poreux (matrices polymères, silice colloïdale, silicate de calcium, zéolithes, zirconium, kaolinite, verre poreux, alumine, etc .), sur lequel une enzyme purifiée est immobilisée. Ces systèmes permettent la récupération aisée de l'enzyme lorsque la réaction est terminée. Ils présentent cependant un inconvénient majeur dans la mesure où les enzymes doivent être préalablement purifiées avant d'être immobilisées sur le support solide, ce qui augmente inévitablement le coût de revient de ces systèmes catalytiques.
Certains auteurs ont également proposé des catalyseurs hétérogènes enzymatiques incorporant des enzymes non purifiées. Le brevet US 6,004,786 décrit en particulier un catalyseur enzymatique hétérogène constitué d'un support solide tel que le verre poreux, la bentonite, les gels de silice, la silice colloïdale, l'hydroxyapatite de silice-alumine, les gels calcium-phosphate, etc .. sur/dans lequel des lipases non purifiées sont immobilisées par l'intermédiaire d'un agent de couplage de type silane à fonction ester carboxylique. Cependant, il est démontré dans les exemples de ce brevet US 6,004,786 que l'immobilisation des lipases non purifiées sur les supports utilisés ne conduit à des résultats satisfaisants en termes d'activité catalytique que lorsqu'un agent de couplage à fonction ester carboxylique est utilisé. A cet égard, des essais comparatifs d'immobilisation de lipases, réalisés avec un agent de couplage ne possédant pas de fonction carboxylique, à savoir le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane, également connu sous le nom commercial GLYMO, ne permettent pas d'aboutir à de bons résultats en termes d'activité catalytique.
Il n'est donc pas possible d'utiliser n'importe quel agent de couplage pour immobiliser des enzymes non purifiées sur/dans un support solide.
Il a également déjà été proposé, notamment dans le brevet US 6,025,171, d'immobiliser des enzymes amphiphiles non purifiées telles que des lipases, sur des sucres (amidon, dextrane, dérivés de cellulose, etc .). Cependant, si de tels supports présentent une stabilité thermique améliorée, leur utilisation répétée implique une étape systématique de régénération après chaque réaction de catalyse, ce qui n'est pas pratique d'un point de vue industriel et interdit leur utilisation dans un procédé de catalyse enzymatique en continu. Par ailleurs, la solubilité partielle ou totale de ces supports en milieu polaire (eau et autres solvants polaires) interdit leur utilisation dans tout procédé de catalyse cyclique ou en flux continu. Enfin, leur utilisation pour la production de biodiesel n'est pas envisageable non plus dans la mesure où les composés néoformés sont tous susceptibles de dissoudre les supports précités.
Il existe donc un besoin pour un catalyseur enzymatique hétérogène :
permettant l'utilisation d'enzymes non purifiées avec une très grande efficacité catalytique,
qui soit réutilisable un très grand nombre de fois sans perte significative d'activité catalytique,
qui soit utilisable en milieu polaire et/ou dans un procédé de catalyse en continu (ne nécessitant pas d'étape de régénération intermédiaire), et
- pouvant être préparé selon un procédé simple à mettre en œuvre, notamment avec des agents de couplage classiques.
Ce but atteint par le catalyseur enzymatique hétérogène qui fait l'objet de la présente invention et qui va être décrit ci-après. La présente invention a pour objet un catalyseur enzymatique hétérogène caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice ou de silice organiquement modifiée, ledit monolithe comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 μm à 100 μm ; des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits pores étant interconnectés, et dans lequel la surface interne des macropores est fonctionnalisée par un agent de couplage choisi parmi les silanes sur lequel est fixée, par l'intermédiaire d'une liaison covalente ou électrostatique, une enzyme non purifiée.
Au sens de la présente invention, on entend par « enzyme non purifiée », tout matériel protéique comprenant au moins une enzyme non isolée, n'ayant subi aucune étape de purification.
On entend par « monolithe », un objet solide ayant une dimension moyenne d'au moins 1 mm.
Ainsi que cela est démontré dans les exemples illustrant la présente demande, l'utilisation d'un tel monolithe rend possible la mise en œuvre d'enzymes non purifiées ce qui présente un grand intérêt d'un point de vue économique. En effet, l'immobilisation d'une enzyme non purifiée par l'intermédiaire d'un agent de couplage choisi parmi les silanes, au sein des macropores d'un tel monolithe conduit à un catalyseur enzymatique hétérogène présentant une activité catalytique très élevée, atteignant le plus souvent 100 % de l'activité catalytique théorique de l'enzyme lorsqu'elle est mise en œuvre à l'état purifié ou non immobilisé, ainsi qu'une grande cyclabilité. Les Inventeurs ont également démontré que lorsqu'une enzyme non purifiée est immobilisée dans un tel monolithe, sa cinétique de réaction est augmentée.
Dans ce monolithe, les parois des macropores ont généralement une épaisseur de 0,5 à 40 μm, et de préférence de 2 à 25 μm.
Selon l'invention, les micropores sont présents dans l'épaisseur des parois des macropores, les rendant alors microporeuses.
La surface spécifique du monolithe est généralement de 200 à 1000 m2/g environ, préférentiellement de 300 à 700 m2/g environ.
Lorsque le monolithe alvéolaire est constitué d'une matrice de silice organiquement modifiée, la silice porte des groupements organiques R répondant à la formule (I) suivante : -(CH^-R1 (I) dans laquelle :
- 0<n<5, et
- R1 représente un groupe thiol, un groupe pyrrolyle C4H3N- lié par l'azote au groupe -(CH2)n-, un groupe amino qui porte éventuellement un ou plusieurs substituants alkyle, alkylamino ou aryle éventuellement substitué, un groupe alkyle (ayant de préférence de 1 à 5 atomes de carbone), un groupe mono ou polyhydroxyalkyle en C2-C2I, un groupe phényle ou un groupe phényle substitué par un radical alkyle, de préférence un groupe méthyle. En particulier, le groupement organique R peut être :
- un groupement 3-mercaptopropyle ;
- un groupement 3-aminopropyle ;
- un groupement N-(3-propyl) pyrrole ;
- un groupement N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyle ;
- un groupement 3-(2,4-dinitrophénylamino) propyle ;
- un groupement phényle ou benzyle ;
- un groupement méthyle ;
- un groupement de formule -(CH2OH-CH2OH)q-CH2OH ou -(CH2OH-CH2OH)q-CH2CH3 dans lesquels q est un nombre entier variant de 1 à 10.
La matrice de silice du monolithe alvéolaire peut, en outre, comprendre un ou plusieurs oxydes métalliques MO2 dans lesquels M est un métal choisi parmi Zr,
Ti, Th, Nb, Ta, V, W et Al. Dans ce cas, la matrice de silice est une matrice mixte de type SiO2-MO2. Parmi de telles matrices mixtes, les matrices de type SiO2-ZrO2 sont préférées.
Lorsque la matrice de silice est une matrice mixte, la teneur en oxyde métallique MO2 représente de préférence de 10 à 50 % en poids environ par rapport au poids de la silice ou de la silice organiquement modifiée.
Selon l'invention, la liaison assurant la fixation de l'agent de couplage avec la silice ou le groupement R de la silice dans le cas d'une silice organiquement modifiée est une liaison iono-covalente.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'agent de couplage est choisi parmi les silanes choisis dans le groupe constitué par le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane ; les liquides ioniques silylés tels que par exemples le chlorure de l-méthyl-3-(3-triéthoxysilylpropyl)imidazolium, l'hexafluorophosphate de l-méthyl-3-(3-triéthoxysilylpropyl)imidazolium ; les silanes de formule Si(OR )3R dans laquelle R représente un groupement alkyle en C1-C2, et R3 représente un groupement -(CH2OH-CH2OH)q-CH2OH ou -(CH2OH-CH2OH)q-CH2CH3 dans lesquels q est un nombre entier variant de 1 à 10.
Parmi de tels silanes, le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane, également connu sous la dénommination « Glymo », est particulièrement préféré.
La nature de l'enzyme pouvant être immobilisée sur le monolithe de silice par l'intermédiaire de l'agent de couplage n'est pas critique à partir du moment où elle comporte au moins un groupement fonctionnel apte à réagir avec un groupement fonctionnel complémentaire porté par l'agent de couplage pour former une liaison iono-covalente. Lorsque l'agent de couplage utilisé est un liquide ionique silylé, il s'agit de liaisons électrostatiques.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'enzyme non purifiée est choisie parmi :
i) les hydrolases (classe E.C. 3 de la classification établie par la Commission des Enzymes, Bruxelles), telles que les estérases (E.C. 3.1), et en particulier les hydrolases d'esters carboxyliques (E.C. 3.1.1) telles que les lipases (E.C. 3.1.1.3 ou triacylglycérol acylhydrolases) ; les amino-acylases (E.C. 3.5.1.14), les amidases (E.C. 3.5.1.4 ; E.C. 3-5-1-3 ou oméga-amidase ; E.C. 3-5-1-11 ou pénicilline - amidase) ; les nitrilases (classe E.C. 3.5.5.1.) qui catalysent l'hydrolyse des nitriles en acides carboxyliques ;
ii) les lyases (classe E.C. 4) comprenant notamment les carboxy-lyases (E.C. 4.1.1), les aldéhydes-lyases (E.C. 4.1.2.) telles que les oxynitrilases (classes E.C. 4-1-2-10 et E.C. 4-1-2-37) catalysant la synthèse de cyanohydrines chirales ; et les hydro-lyases (E.C. 4.2.1) ;
iii) les isomérases (E.C. 5) comprenant notamment les épimérases et les racémases (E.C. 5.1.), et en particulier les épimérases et les racémases de la classe E.C. 5.1.1. catalysant la formation d'énantiomères d'amino-acides ; et
iv) les oxydoréductases (E.C. 1) comprenant notamment les glucose oxydases (E.C. 1.1.3.4) telles que la glucose oxydase d'Aspergillus niger et les peroxydases (E.C. 1.11.1) telles que la peroxydase de raifort.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'enzyme non purifiée est choisie parmi les lipases d'origine microbienne ou végétale, et en particulier, parmi les lipases de Candida Rugosa, Candida antartica, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Thermomyces Lanuginosus, Chromobacterium viscosum, Rhizomucor miehei, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Pénicillium roqueforti, Pénicillium expansum, Rhizopus arrhizus et les lipases de germe de blé.
La quantité d'enzymes immobilisée au sein du catalyseur conforme à l'invention peut être déterminée par analyse thermogravimétrique et par analyse élémentaire. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la quantité d'enzyme non purifiée immobilisée varie de 3 à 40 % massique environ et plus préférentiellement de 10 à 20 % massique environ par rapport à la masse totale du catalyseur.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un catalyseur enzymatique hétérogène conforme à l'invention et tel que défini ci- dessus, ledit procédé comportant une première étape de préparation d'une empreinte de silice solide sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice ou de silice organiquement modifiée, ledit monolithe comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 μm à 100 μm ; des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1 ,5 nm, lesdits pores étant interconnectés, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes suivantes :
- une deuxième étape de fonctionnalisation de la surface interne des macropores par un agent de couplage choisi parmi les silanes, par imprégnation sous vide du monolithe alvéolaire par une solution de l'agent de couplage dans un solvant organique ;
- une troisième étape d'imprégnation, sous vide, du monolithe ainsi fonctionnalisé par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une enzyme non purifiée.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la préparation de l'empreinte de silice, lors de la première étape, est réalisée selon les procédés tels que décrits dans les demandes de brevet FR-A1-2 852 947 et FR-A1-2 912 400.
Ces procédés consistent, de façon générale, à :
- préparer une émulsion en introduisant une phase huileuse dans une solution aqueuse de tensioactif,
- à ajouter une solution aqueuse d'au moins un précurseur d'oxyde de silice et/ou d'au moins un précurseur d'oxyde de silice organiquement modifié à la solution de tensioactif, avant ou après la préparation de l'émulsion, - à laisser le mélange réactionnel au repos jusqu'à la condensation dudit précurseur, puis
- à sécher le mélange pour obtenir l'empreinte de silice solide attendue.
Dans ce cas, le ou les précurseur(s) d'oxyde de silice ou d'oxyde de silice organiquement modifié peuvent être choisis parmi les alcoxydes de silice de formule (II) suivante :
R4 p(OR5)4-pSi (II)
dans laquelle :
- R4 représente un radical alkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone ou un radical aryle qui portent éventuellement un ou plusieurs groupes fonctionnels ;
- R5 représente un radical alkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone ou un groupement de formule (I) suivante :
-(CH^-R1 (I)
dans laquelle 0<n<5, et R1 est choisi parmi un groupe thiol, un groupe pyrrolyle C4H3N- lié par l'azote au groupe -(CH2)n-, un groupe amino qui porte éventuellement un ou plusieurs substituants alkyle, alkylamino ou aryle éventuellement substitué, un groupe alkyle (ayant de préférence de 1 à 5 atomes de carbone), un groupe mono ou polyhydroxyalkyle en C2-C2I, un groupe phényle ou un groupe phényle substitué par un radical alkyle, de préférence un groupe méthyle ; et
- p est un nombre entier égal à 0, 1, 2 ou 3.
Dans un mode de réalisation, le précurseur de formule (II) comporte un seul type de groupement de formule (I). Dans un autre mode de réalisation, le précurseur de formule (II) comporte au moins deux types différents de groupements de formule (I).
En particulier, le groupement organique de formule (I) peut être :
- un groupement 3-mercaptopropyle ;
- un groupement 3-aminopropyle ;
- un groupement N-(3-propyl) pyrrole ;
- un groupement N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyle ;
- un groupement 3-(2,4 dinitrophénylamino) propyle ;
- un groupement phényle ou benzyle ;
- un groupement méthyle ; ou - un groupement de formule -(CH2OH-CH2OH)q-CH2OH ou -(CH2OH-CH2OH)q-CH2CH3 dans lesquels q est un nombre entier variant de 1 à 10
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le ou les précurseur(s) de formule (I) sont choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane (TMOS), le tetraéthoxyorthosilane (TEOS), le diméthyldiéthoxysilane (DMDES), le
(3-mercaptopropyl)triméthoxysilane, le (3-aminopropyl)triéthoxysilane, le
N-(3-triméthoxysilylpropyl)pyrrole, le 3-(2,4-dinitrophénylamino)- propyltriéthoxysilane, le N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyltriméthoxysilane, le phényltriéthoxysilane, le méthyltriéthoxysilane et leurs mélanges.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, le précurseur de formule (I) est choisi parmi le TEOS, un mélange de TEOS et de DMDES dans lequel le DMDES représente de 5 à 30 % massique par rapport au TEOS, et le TMOS.
La concentration en précurseur(s) d'oxyde de silice et/ou en précurseurs d'oxyde de silice organiquement modifié au sein de la solution aqueuse est, de préférence, supérieure à 10 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. Cette concentration varie plus préférentiellement de 17 à 35 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse.
Selon une forme de réalisation particulière de l'invention, et lorsque la matrice de silice ou de silice organiquement modifiée comprend en outre au moins un oxyde métallique MO2 dans lequel M est un métal choisi parmi Zr, Ti, Th, Nb, Ta, V, W et Al, alors la solution aqueuse de précurseur(s) d'oxyde de silice ou de silice organiquement modifiée comprend en outre au moins un précurseur dudit oxyde métallique, ledit précurseur étant choisi parmi les composés de formule (III) suivante :
M(OR6)4 (III)
dans laquelle :
- M est un métal choisi parmi Zr, Ti, Th, Nb, Ta, V, W et Al, et
- R6 est un radical alkyle en Ci-C4, de préférence un radical méthyle ou éthyle.
La phase huileuse est de préférence constituée par un ou plusieurs composés choisis parmi les alcanes linéaires ou ramifiés ayant au moins 12 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer le dodécane et l'hexadécane. La phase huileuse peut en outre être constituée par une huile de silicone de faible viscosité, c'est-à-dire inférieure à 400 centipoise.
La quantité de phase huileuse présente au sein de l'émulsion peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir pour l'empreinte de silice, étant entendu que plus la fraction volumique huile/eau sera élevée, plus le diamètre des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion sera faible et plus le diamètre des macropores sera faible également.
De manière générale, la phase huileuse représente de 60 à 90 % en volume par rapport au volume total de l'émulsion. Cette quantité d'huile permet d'obtenir une empreinte de silice dans laquelle le diamètre moyen des macropores varie de 1 à 100 μm environ.
Le composé tensioactif peut être un tensioactif cationique choisi notamment parmi le bromure de tetradécyltriméthylammonium (TTAB), le bromure de dodécyltriméthylammonium ou le bromure de cétyl-triméthylammonium. Lorsque le composé tensioactif est cationique, le milieu réactionnel est porté à un pH inférieur à 3, de préférence inférieur à 1. Le bromure de tetradécyltriméthylammonium est particulièrement préféré.
Le composé tensioactif peut en outre être un tensioactif anionique choisi parmi le dodécylsulfate de sodium, le dodécylsulfonate de sodium et le dioctylsulfosuccinate de sodium (AOT). Lorsque le composé tensioactif est anionique, le milieu réactionnel est porté à un pH supérieur à 10.
Le composé tensioactif peut enfin être un tensioactif non ionique choisi parmi les tensioactifs à tête éthoxylée, et les nonylphénols. Parmi de tels tensioactifs, on peut en particulier citer les copolymères blocs d'éthylèneglycol et de propylèneglycol vendus par exemple sous les dénominations commerciales Pluronic® P 123 et Pluronic® F 127 par la société BASF. Lorsque le composé tensioactif est non ionique, le milieu réactionnel est porté à un pH supérieur à 10 ou inférieur à 3, de préférence inférieur à 1 et contient en outre, de préférence, du fluorure de sodium afin d'améliorer la condensation des précurseurs de l'oxyde de silice.
La quantité totale de tensioactif présente au sein de l'émulsion peut également être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir dans l'empreinte de silice. Cette quantité est également variable en fonction la nature du tensioactif utilisé. De manière générale, la quantité de tensioactif varie de 1 à 10 % en masse, de préférence de 3 à 6 % en masse, par rapport à la masse totale de l'émulsion.
L'étape de condensation du ou des précurseur(s) d'oxyde de silice et/ou du ou des précurseur(s) d'oxyde de silice organiquement modifié est effectuée avantageusement à une température proche de la température ambiante. La durée de cette étape peut varier de quelques heures (2 à 3 heures) à quelques semaines (2 à 3 semaines) en fonction du pH du milieu réactionnel.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'empreinte de silice obtenue à la fin de la première étape est lavée à l'aide d'un solvant organique (tel que par exemple le tetrahydrofurane, l'acétone et leurs mélanges), puis séchée (par exemple à l'air en étuve ou par lyophilisation) avant de subir l'étape d'imprégnation par la solution de précurseur de carbone ou de précurseur de céramique.
Le solvant de la solution d'agent de couplage utilisé lors de la réaction de couplage est un solvant organique, de préférence choisi parmi le chloroforme, le toluène et leurs mélanges. De façon préférentielle, ledit solvant est un mélange à parts égales, de chloroforme et de toluène.
La quantité d'agent de couplage dans la solution utilisée pour l'étape de fonctionnalisation peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores du monolithe de silice et de la quantité d'enzyme non purifiée que l'on souhaite immobiliser. De manière générale, cette quantité peut varier de 0,02 M à 0,5 M, et de préférence de 0,05 M à 0,2 M.
Selon une forme de réalisation particulière et préférée de l'invention, on utilise une solution d'agent de couplage à 0,1 M dans un mélange de chloroforme et de toluène 50/50 (v/v).
L'étape de fonctionnalisation du monolithe alvéolaire par l'agent de couplage est de préférence réalisée sous vide à température ambiante pendant une durée d'environ 72 heures.
L'étape d'immobilisation de l'enzyme non purifiée est de préférence réalisée sous vide à température ambiante pendant une durée d'environ 72 heures.
Le lavage du monolithe à la fin de l'étape de fonctionnalisation est de préférence réalisé avec un solvant organique tel que par exemple le tetrahydrofurane, le chloroforme ou l'acétone. Enfin, le monolithe est séché, de préférence à l'air pendant 2 jours environ. Le lavage du monolithe à la fin de l'étape d'immobilisation de l'enzyme non purifiée est de préférence réalisé avec de l'eau distillée.
Le catalyseur enzymatique hétérogène conforme à la présente invention peut être utilisé pour la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène. La nature des réactions chimiques susceptibles d'être catalysées par le catalyseur conforme à l'invention variera bien entendu en fonction de la nature de l'enzyme non purifiée qui est immobilisée.
Ainsi lorsque l'enzyme non purifiée est une lipase, le catalyseur conforme à l'invention est utilisé pour catalyser l'hydrolyse de triglycérides d'acides gras, des réactions d'estérification entre un acide et un alcool, des réactions de transestérification entre un ester et un alcool, des réactions d'inter-estérification entre deux esters ou des réactions de transfert d'un groupement acétyle d'un ester sur une aminé ou sur un thiol.
En particulier, lorsque l'enzyme est une lipase, ledit catalyseur peut être utilisé par exemple pour catalyser :
la synthèse du butyloléate qui est un lubrifiant pour les biodiesels ; l'hydrolyse des dérivés de l'ester glycérolinoléique pour conduire à des savons ou à des détergents :
des réactions de trans-estérifications impliquées dans la synthèse de biodiesels à faible viscosité.
La présente invention est illustrée par les exemples de réalisation suivants, auxquels elle n'est cependant pas limitée.
EXEMPLES
Les matières premières utilisées dans les exemples qui suivent sont listées ci-après :
- Bromure de tetradécyltriméthylammonium à 98 % (TTAB) : société Fluka ;
- Tetraéthoxyorthosilane à 98 % (TEOS) : société Fluka ;
- Dodécane à 99 % : société Fluka ;
- Agent de couplage : γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane vendu sous la dénomination commerciale Glymo par la société Sigma Aldrich (St-Louis, MO) ;
- Lipase de Candida Rugosa, E.C.3.1.1.3, Type VII, à 700 U/mg, Société Sigma Chemical (St Louis, MO) ; - Lipase de Thermomyces Lanuginosus, solution à au moins 100000 U/g, société Sigma Aldrich (St. Louis, MO) ;
- Acide oléique, trilinoléate de glycéryle (98 %), linoléate d'éthyle (> 98%), acide linoléique (> 99 %), n-heptane, éthanol, 1-butanol, Société Sigma Aldrich (Paris, France).
Les autres produits chimiques et solvants utilisés dans les exemples étaient tous de grade analytiques ou de grade HPLC.
Ces matières premières ont été utilisées telles que reçues des fabricants, sans purification supplémentaire.
Caractérisations :
La macroporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique de microscopie électronique à balayage (MEB) à l'aide d'un microscope électronique à balayage vendu sous la référence JSM-840A par la société JEOL, fonctionnant à 10 kV. Les échantillons ont été revêtus d'or ou de carbone avant leur caractérisation.
La macroporosité a été quantifiée par des mesures d'intrusion de mercure, à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics Autopore IV, pour atteindre les caractéristiques des cellules macroscopiques composant le squelette du monolithe.
Les mesures de surface spécifique et les caractérisations à l'échelle mésoscopique ont été faites par des techniques d'adsorption-désorption d'azote à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics ASAP 2010 ; le dépouillement étant fait par les méthodes de calcul B.E.T ou B.J.H..
Les monolithes ont été soumis à une analyse par diffraction des rayons X (RX) aux petits angles (SAXs), à l'aide d'une source de RX à anode tournante de 18 kW (Rigaku-200) utilisant un cristal (111) de Ge comme monochromateur. La radiation diffusée a été collectée sur un collecteur à deux dimensions (Imaging Plate System, commercialisé par Mar Research, Hamburg). La distance du détecteur à l'échantillon était de 500 mm.
La mésoporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique de microscopie électronique à transmission (MET) à l'aide d'un microscope vendu sous la référence H7650 par la société Hitachi, ayant une tension d'accélération de 80 kV, et couplé à une caméra vendue sous la référence Orius 11 MPX par la société Gatan lnc. Des analyses par chromatographie liquide haute performance (High Performance Liquid Chromatography » : HPLC) ont été réalisées sur un système équipé de pompes à solvants 600 à injection manuelle (Waters, Milford, MA, USA), en régime isocratique, et en utilisant de l'acétonitrile comme phase mobile. Les composés ont été séparés sur une colonne de chromatographie Atlantis dCig (4,6 mm x 150 mm, 5 μm) avec une colonne de garde Atlantis dC18 (Waters). Les colonnes ont été utilisées à température ambiante. Le logiciel Empower® (Waters) a été utilisé pour l'acquisition et le traitement des données. Les standards ont été dissous dans le méthyléther de t-butyle (MTBE). Toutes les solutions ont été filtrées au travers d'une membrane de 0,45 μm et dégazées avant usage. Le débit de la phase liquide a été fixé à 1 ml/min et le volume des échantillons injectés était de 20 μl. Les réactions catalysées d'estérification ont été suivies à l'aide d'un réfractomètre vendu sous la référence 410 par la société Waters (Milford, MA, USA). Pour la détection des produits issus des réactions catalysées d'hydrolyse et de trans-estérification, le système a été équipé d'un détecteur ultraviolet (UV) à barrettes de diodes (WAT996, Waters, Milford, MA, USA). Les mesures ont été réalisées à une longueur d'onde de 204 nm, ce qui correspondait à l'absorbance maximum. Le gradient d'élution suivant a été utilisé : (Solvant A : acétonitrile, solvant B : MTBE) : A/B : 100/0 (v/v) isocratique pendant 4 min., A/B : 70/30 (v/v) gradient pendant 2 min., A/B : 70/30 (v/v) puis A/B : 100/0 (v/v) gradient pendant 5 min. La colonne a été équilibrée dans les conditions données ci-dessus pendant 10 minutes.
Exemple 1
Préparation de monolithes de silice intégrant une enzyme
Dans cet exemple on illustre la préparation de monolithes de silice et l'immobilisation de lipases dans les macropores de ces monolithes.
1) Première étape : Synthèse du monolithe de silice (MSi).
5,02 g de TEOS ont été ajoutés à 16,02 g d'une solution aqueuse de TTAB à 35 % massique. On a ensuite acidifié cette solution par ajout de 5,88 g d'une solution d'acide chlorhydrique concentré à 37 %. On a laissé l'hydrolyse se dérouler sous agitation pendant environ 5 minutes jusqu'à obtention d'un milieu hydrophile monophasique (phase aqueuse de l'émulsion). On a ensuite ajouté à cette phase aqueuse, 40,0 g de dodécane (phase huileuse de l'émulsion) au goutte à goutte et sous agitation. Le mélange a été transféré dans un récipient cylindrique servant de moule macroscopique. On a ensuite laissé l'émulsion se condenser sous forme d'un monolithe de silice pendant 3 jours à température ambiante. Le monolithe de silice ainsi synthétisé a ensuite été lavé trois fois au tetrahydrofurane (THF). Le monolithe de silice a alors été mis à sécher pendant 3 jours à température ambiante puis il a été soumis à traitement thermique à 6500C pendant 6 heures en appliquant une vitesse de montée en température de 2°C/min., avec un plateau à 2000C pendant 2 heures. On a obtenu un monolithe de silice que l'on a désigné MSi.
Le monolithe ainsi obtenu présentait les caractéristiques morphologiques suivantes :
- porosité : 94 %
- densité du monolithe : 0,085 g. cm"3
- densité du squelette de silice : 1,56 g.cm"3
- mésopores de type vermiculaire, distance moyenne entre 2 parois : 3 IA,
- Surface spécifique : 170 itf.g"1 (BET) significative d'une macroporosité élevée et 45 itf.g"1 (BJ.H.) significative d'une faible mésoporosité.
2) Deuxième étape : Fonctionnalisation du monolithe de silice par un agent de couplage de type silane
Le monolithe de silice obtenu ci-dessus à l'étape précédente a été découpé en plusieurs morceaux de 1 g chacun.
Chaque morceau a ensuite été fonctionnalisé par du Glymo.
Pour ce faire, les différents morceaux de Msi ont été placés dans un récipient contenant une solution de 0,01 mol. de Glymo dans 120 g de chloroforme. La suspension a été placée sous vide pour favoriser l'imprégnation. Après 48 heures à température ambiante, la suspension a été filtrée, puis les morceaux de Msi récupérés ont été lavés au chloroforme, puis à l'acétone, avant d'être finalement séchés à l'air. On a obtenu ainsi des monolithes dont la surfaces des macropores est fonctionnalisée par du Glymo (MSi-Glymo).
3) Troisième étape : Immobilisation des lipases dans les macropores des MSi-Glymo
540 mg de lipase non purifiée de Candida Rugosa (ICR) ont été dispersés dans 18 ml d'eau distillée et mélangés pendant une heure jusqu'à obtention d'une solution. On a ensuite introduit des morceaux de 250 mg de MSi-Glymo dans la solution aqueuse de lipase, puis on a soumis le mélange à un vide de 20 mbar pendant 72 heures à température ambiante afin d'imprégner les MSi-Glymo de la solution de lipase.
53 mg de lipase non purifiée de Thermomyces Lanuginosus (17X) ont été dissous dans 10 ml d'eau distillée. On a ensuite introduit des morceaux de 350 mg de MSi-Glymo dans la solution aqueuse de lipase, puis on a soumis le mélange à un vide de 20 mbar pendant 72 heures à température ambiante afin d'imprégner les
MSi-Glymo de la solution de lipase.
Les monolithes de silice ont ensuite été extraits des solutions de lipase puis lavés trois fois à l'eau distillée afin d'éliminer l'excès d'enzymes, puis séchés à température ambiante pendant 12 heures. On a ainsi obtenu des monolithes de silice immobilisant une lipase par l'intermédiaire du Glymo (MSi-Glymo-lCR et MSi- Glymo-17Z). Ces monolithes ont été stockés à 4°C avant leur utilisation à titre de catalyseur enzymatique hétérogène.
Exemple 2
Esterification de l'acide oléique par le 1-butanol, en présence d'un catalyseur enzvmatique conforme à l'invention
Dans cet exemple on a réalisé une réaction catalysée d' esterification de l'acide oléique (1) par le 1-butanol (2) selon le schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000016_0001
Cette réaction conduit à la formation de l'ester butylique de l'acide oléique
(3).
2,0 mmoles d'acide oléique (1), 1,0 mmole de 1-butanol (2) et 0,247 mg de MSi-Glymo-lCR tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1, ont été introduits dans 2 ml d'heptane. Le mélange réactionnel a été incubé à 37°C pendant 24 heures et la formation de l'ester (3) a été suivie par HPLC.
La même réaction d' esterification a ainsi été répétée 21 fois en utilisant, à chaque fois, le même catalyseur. Entre les 10eme et l leme réactions, le catalyseur a été stocké à 4°C pendant 2 mois. Entre chaque réaction d'estérification, le catalyseur a donc été récupéré, lavé à l'heptane, puis séché avant d'être à nouveau réutilisé pour catalyser une nouvelle réaction d'estérification.
La même expérience a été réalisée à titre comparatif avec un monolithe de silice tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1 mais selon un procédé de préparation dans lequel l'étape de fonctionnalisation de la surface interne des pores du monolithe par le Glymo n'a pas été réalisée. L'étape d'imprégnation par la solution de lipase de Candida Rugosa ayant été réalisée directement après la synthèse du monolithe. On a ainsi obtenu un catalyseur enzymatique ne faisant pas partie de l'invention et qui a été dénommé MSi-ICR.
Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 1 annexée sur laquelle le taux de conversion de l'acide (1) en ester (3), exprimé en pourcentage, est fonction du temps en heures. Le nombre de cycles (un cycle correspondant à la réalisation d'une réaction d'estérification et d'un lavage du catalyseur) est indiqué au dessus de chacun des pics. Le tracé en ligne continue correspond au suivi des réactions d'estérification catalysées par le catalyseur MSi-Glymo-lCR conforme à l'invention, alors que le tracé en pointillés correspond au suivi des réactions d'estérification réalisées avec le catalyseur MSi-LCR non conforme à l'invention.
Les résultats présentés sur la figure 1 démontrent que le catalyseur enzymatique MSi-Glymo-Lc conforme à la présente invention permet de catalyser 19 réactions successives d'estérification de l'acide (1) en ester (3) avec un taux de conversion de 100 %. Une légère diminution du taux de conversion apparaît entre les 20eme et 21eme cycles. Ces résultats montrent également que le stockage du catalyseur MSi-Glymo-lCR à 4°C pendant 2 mois entre les 10ème et 1 lème cycles n'a pas affecté ses performances catalytiques. On remarque par contre que l'activité catalytique du catalyseur MSi-ICR non conforme à l'invention n'atteint jamais 100 % (95 % seulement lors du premier cycle) et que la cinétique de la réaction est par ailleurs deux fois plus lente qu'avec le catalyseur enzymatique MSi-Glymo-lCR conforme à la présente invention. L'activité catalytique du MSi-ICR commence d'autre part à diminuer dès le 2eme cycle d'estérification, pour atteindre 87 % au bout du 5eme cycle d'estérification. Ces résultats confirment que même en utilisant une enzyme non purifiée, la fonctionnalisation de la surface interne des pores du monolithes de silice utilisé comme support de l'enzyme est nécessaire à l'obtention d'une bonne activité catalytique (taux de conversion de 100 %).
En termes d'activité catalytique, le catalyseur MSi-Glymo-lCR conforme à la présente invention conduit à des taux de conversion supérieurs aux meilleurs taux obtenus jusqu'à ce jour avec les catalyseurs hétérogènes décrits dans l'art antérieur, cette meilleure activité catalytique étant accompagnée d'une meilleure stabilité dans le temps du catalyseur. En effet, les catalyseurs hétérogènes décrits dans l'art antérieur, en particulier les catalyseurs dans lesquels la même enzyme Candida Rugosa a été immobilisée dans une mousse de polyuréthane (Awang, R et al, Am. J. Biochem. & Biotech., 2007, 3, 163-166), sur du kaolin naturel (Rahman, M.B.A. et al, Applied Clay Science, 2005, 29, 111-116) ou sur des hydroxydes métalliques en double couche (Raman, M.B.A. et al, Catalysis Today, 2004, 93- 95, 405-410) ne permettent d'atteindre un taux de conversion qui n'est que de 70 à 85%, taux qui commence à diminuer dès le 9eme cycle. Dans ce type de catalyseur, la durée de vie moyenne de l'enzyme immobilisée est par ailleurs beaucoup plus courte (environ 12 jours).
Exemple 3
Hydrolyse de la trilinoléine en présence d'un catalyseur enzvmatique conforme à l'invention
Dans cet exemple on a réalisé la réaction d'hydrolyse catalysée d'un tri-ester d'acide linoléique, la tri-linoléine (4) qui est l'un des constituants majeurs de l'huile d'olive, dans l'heptane saturé en eau selon le schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000018_0001
(5) (6) Cette réaction conduit à la formation d'acide linoléique (5) et de glycérol (6) ; les composés (4'), (4") et (4'") étant les produits intermédiaires de la réaction.
0,20 g de MSi-Glymo-lCR tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1, ont été 5 introduits dans 15 ml d'heptane saturé en eau (0,6 % en poids). Le mélange a été porté à une température de 37-38°C, puis on y a ajouté 100 μL de trilinoléine dissous dans le MTBE à une concentration de 100 mg/mL pour conduire au final à une solution de trilinoléine ayant une concentration de 0,66 mg/mL. Le milieu réactionnel a été incubé pendant 24 heures à une température de 37-38°C
10 La réaction d'hydrolyse a été suivie en quantifiant la disparition de la trilinoléine et l'apparition des produits intermédiaires (4'), (4") et (4'") et des produits finaux (acide linoléique (5) et glycérol (6)), par HPLC. Après 24 heures d'incubation, le catalyseur hétérogène MSi-Glymo-lCR a été récupéré puis lavé 3 fois avec la solution d'heptane saturée en eau.
15 Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2 annexée sur laquelle le taux de conversion du tri-ester (4) en acide linoléique (5) exprimé en pourcentage (axe vertical à gauche, courbe en trait continu), et le taux d'apparition de l'acide linoléique exprimé en pourcentage (axe vertical à droite, courbe en pointillés) sont fonction du temps en heures. Le nombre de cycles (un cycle correspondant à la
20 réalisation d'une réaction d'hydrolyse et des lavages du catalyseur) est indiqué au dessus des pics. Sur cette figure la ligne en pointillés située à la verticale du neme cycle indique que le catalyseur a été réhydraté dans l'eau sous vide, puis séché à l'air avant d'être utilisé dans un nouveau cycle d'hydrolyse.
Ces résultats montrent que le catalyseur hétérogène MSi-Glymo-lCR permet
25 d'assurer l'hydrolyse de la trilinoléine avec un taux de conversion constant d'environ 65 % pendant 7 cycles à 37°C. Ce taux de conversion est supérieur à celui qui est obtenu lorsque l'on utilise la même enzyme immobilisée sur une membrane de polypropylène (Deng, H.-T. et al, Enzyme and Microbial. Tech.,
2005, 36, 996-1002) et avec laquelle on obtient un taux de conversion de seulement
30 60 % et qui chute à 18 % après 7 cycles.
Ces résultats démontrent également qu'un tel catalyseur hétérogène est réutilisable et que l'activité catalytique peut être augmentée par réhydratation du catalyseur lorsque celle-ci commence à diminuer, une certaine humidité étant nécessaire au bon fonctionnement de la lipase. Exemple 4
Trans-estérification de la trilinoléine en présence d'un catalyseur enzvmatique conforme à l'invention
Dans cet exemple on a réalisé une réaction de trans-estérification catalysée de la trilinoléine (4) par l'éthanol, en milieu non aqueux, selon le schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000020_0001
Heptane 37°C
Figure imgf000020_0002
Cette réaction conduit à la formation d'éthanoate d'acide linoléique (8) et de glycérol (6). Une telle réaction est utilisée pour la production de biodiesels qui sont des esters méthyliques ou éthyliques d'huiles végétales.
La réaction a été effectuée en mode « batch » dans des tubes contenant 4 ml d'heptane, 100 μL de trilinoléate de glycéryle (4) préalablement dissous dans le MTBE à une concentration de 100 mg/mL, 25 mg d'éthanol et 387 mg de MSi-Glymo-17ï tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1. Le milieu réactionnel a été incubé à 37°C pendant 24 heures. La conversion du trilinoléate de glycéryle (4) en éthanoate d'acide linoléique (8) a été suivie par HPLC.
Entre chaque réaction de transestérification, le catalyseur a été récupéré, lavé à l'heptane, puis séché avant d'être à nouveau réutilisé pour catalyser une nouvelle réaction de transestérification.
Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 3 annexée sur laquelle le taux de conversion du triester (4) en ester (8) exprimé en pourcentage (axe vertical de gauche, courbe en trait continu) et le taux de production de l'ester (8) exprimé en pourcentage (axe vertical de droite, courbe en pointillés) sont fonction du temps en heures. Sur cette figure le nombre de cycle figure au dessus de chaque pic.
Ces résultats montrent que le catalyseur hétérogène MSi-Glymo-17Z peut être utilisé pour catalyser la transestérification de le trilinoléine en éthanoate d'acide linoléique avec un taux de conversion atteignant 100 % en 24 heures à 37C° lors du premier cycle et qui diminue jusqu'à 45 % au bout du 5eme cycle. Cette perte d'activité est cependant certainement due à la présence de l'éthanol qui a une action dénaturante vis-à-vis de la lipase. Ce résultat est néanmoins supérieur aux taux de conversion obtenus en mettant en œuvre une mousse de polymère modifiée par du polyglutaraldéhyde macroporeux immobilisant la même enzyme et qui est de 90,2 % en 24 heures (Dizge, N. et al, Bioresource Technology, 2009, 100, 1983-1991.
Par ailleurs, ces résultats démontrent également que le catalyseur hétérogène conforme à l'invention permet à la lipase T. Lanuginosus de fonctionner de façon optimale en milieu essentiellement anhydre (heptane) sans qu'il ne soit nécessaire d'ajouter d'eau alors qu'il est bien connu que pour qu'une lipase exprime son potentiel catalytique maximal, elle doit être mise en œuvre dans un milieu présentant une certaine teneur en eau (Linko, Y.-Y. et al, JAOCS, 1995, 72(1 1), 1293-1299).
L'ensemble des résultats présentés dans ces exemples démontre que les catalyseurs enzymatiques hétérogènes conformes à l'invention permettent de catalyser diverses réactions chimiques avec des rendements atteignant le plus souvent 100 % de l'activité catalytique théorique, lesdits catalyseurs étant réutilisables un grand nombre de fois sans perte significative de leur activité catalytique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Catalyseur enzymatiques hétérogène, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice ou de silice organiquement modifiée, ledit monolithe comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 μm à 100 μm ; des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits pores étant interconnectés, et dans lequel la surface interne des macropores est fonctionnalisée par un agent de couplage choisi parmi les silanes sur lequel est fixée, par l'intermédiaire d'une liaison covalente ou électrostatique, une enzyme non purifiée.
2. Catalyseur selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit monolithe a une surface spécifique de 200 à 1000 m2/g.
3. Catalyseur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le monolithe alvéolaire est constitué d'une matrice de silice organiquement modifiée, la silice porte des groupements organiques R répondant à la formule (I) suivante :
-(CHs)n-R1 (I) dans laquelle :
- 0<n<5, et
- R1 représente un groupe thiol, un groupe pyrrolyle C4H3N- lié par l'azote au groupe -(CH2)n-, un groupe amino qui porte éventuellement un ou plusieurs substituants alkyle, alkylamino ou aryle éventuellement substitué, un groupe alkyle, un groupe mono ou polyhydroxyalkyle en C2-C2I, un groupe phényle ou un groupe phényle substitué par un radical alkyle.
4. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice de silice du monolithe alvéolaire comprend en outre un ou plusieurs oxydes métalliques MO2 dans lesquels M est un métal choisi parmi Zr, Ti, Th, Nb, Ta, V, W et Al.
5. Catalyseur selon la revendication 4, caractérisé en ce que la matrice mixte est une matrice de type SiO2-ZrO2.
6. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent de couplage est choisi les silanes choisis dans le groupe constitué par le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane ; les liquides ioniques silylés ; les silanes de formule Si(OR )3R dans laquelle R représente un groupement alkyle en Ci -C2, et R3 représente un groupement -(CH2OH-CH2OH)q-CH2OH ou -(CH2OH-CH2OH)q-CH2CH3 dans lesquels q est un nombre entier variant de 1 à 10.
7. Catalyseur selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent de couplage est le γ-grycidoxypropyltriméthoxysilane.
8. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme non purifiée est choisie parmi les hydrolases, les lyases, les isomérases et les oxydoréductases.
9. Catalyseur selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'enzyme non purifiée est une hydrolase choisie parmi les estérases.
10. Catalyseur selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'enzyme non purifiée est une estérase choisie parmi les hydrolases d'esters carboxyliques, les amino-acylases, les amidases et les nitrilases.
11. Catalyseur selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'enzyme non purifiée est choisie parmi les lipases de Candida Rugosa, Candida antartica,
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Thermomyces Lanuginosus, Chromobacterium viscosum, Rhizomucor miehei, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Pénicillium roqueforti, Pénicillium expansum, Rhizopus arrhizus et les lipases de germe de blé.
12. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la quantité d'enzyme non purifiée immobilisée varie de 3 à 40 % massique par rapport à la masse totale du catalyseur.
13. Procédé de préparation d'un catalyseur enzymatique hétérogène tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, ledit procédé comportant une première étape de préparation d'une empreinte de silice solide sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice ou de silice organiquement modifiée, ledit monolithe comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 μm à 100 μm ; des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm et des micropores ayant une dimension moyenne di de 0,7 à 1,5 nm, lesdits pores étant interconnectés, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes suivantes :
- une deuxième étape de fonctionnalisation de la surface interne des macropores par un agent de couplage choisi parmi les silanes, par imprégnation sous vide du monolithe alvéolaire par une solution de l'agent de couplage dans un solvant organique ; - une troisième étape d'imprégnation, sous vide, du monolithe ainsi fonctionnalisé par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une enzyme non purifiée.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la préparation de l'empreinte de silice lors de la première étape est réalisée selon un procédé consistant à :
- préparer une émulsion en introduisant une phase huileuse dans une solution aqueuse de tensioactif,
- à ajouter une solution aqueuse d'au moins un précurseur d'oxyde de silice et/ou d'au moins un précurseur d'oxyde de silice organiquement modifié à la solution de tensioactif, avant ou après la préparation de l'émulsion,
- à laisser le mélange réactionnel au repos jusqu'à la condensation dudit précurseur, puis
- à sécher le mélange pour obtenir l'empreinte de silice solide attendue.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le ou les précurseur(s) d'oxyde de silice ou d'oxyde de silice organiquement modifié sont choisis parmi les alcoxydes de silice de formule (II) suivante :
R4 p(OR5)4-pSi (H)
dans laquelle :
- R » 4 représente un radical alkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone ou un radical aryle qui portent éventuellement un ou plusieurs groupes fonctionnels ;
- R5 représente un radical alkyle ayant de 1 à 5 atomes de carbone ou un groupement de formule (I) suivante :
-(CH^-R1 (I)
dans laquelle 0<n<5, et R1 est choisi parmi un groupe thiol, un groupe pyrrolyle C4H3N- lié par l'azote au groupe -(CH2)n-, un groupe amino qui porte éventuellement un ou plusieurs substituants alkyle, alkylamino ou aryle éventuellement substitué, un groupe alkyle, un groupe mono ou polyhydroxyalkyle en C2-C2I, un groupe phényle ou un groupe phényle substitué par un radical alkyle ; et
- p est un nombre entier égal à 0, 1, 2 ou 3.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le ou les précurseur(s) de formule (I) sont choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane, le tetraéthoxyorthosilane, le diméthyldiéthoxysilane, le (3-mercaptopropyl)- triméthoxysilane, le (3-aminopropyl)triéthoxysilane, le N-(3-triméthoxysiryl- propyl)pyrrole, le 3-(2,4-dinitrophénylamino)-propyltriéthoxysilane, le N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyltriméthoxysilane, le phényltriéthoxysilane, le méthyltriéthoxysilane et leurs mélanges.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le précurseur de formule (II) est choisi parmi le tetraéthoxyorthosilane, un mélange de tetraéthoxyorthosilane et de diméthyldiéthoxysilane dans lequel le diméthyldiéthoxysilane représente de 5 à 30 % massique par rapport au tetraéthoxyorthosilane, et le tetraméthoxyorthosilane.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que la matrice de silice ou de silice organiquement modifiée comprend en outre au moins un oxyde métallique MO2 dans lequel M est un métal choisi parmi Zr, Ti, Th, Nb, Ta, V, W et Al, et en ce que la solution aqueuse de précurseur(s) d'oxyde de silice ou de silice organiquement modifiée comprend en outre au moins un précurseur dudit oxyde métallique, ledit précurseur étant choisi parmi les composés de formule (III) suivante :
M(OR6)4 (III)
dans laquelle :
- M est un métal choisi parmi Zr, Ti, Th, Nb, Ta, V, W et Al, et
- R6 est un radical alkyle en Ci-C4.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que le solvant de la solution d'agent de couplage est choisi parmi le chloroforme, le toluène, et leurs mélanges.
20. Utilisation d'un catalyseur enzymatique hétérogène tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène.
21. Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que l'enzyme non purifiée est une lipase, pour catalyser l'hydrolyse de triglycérides d'acides gras, des réactions d'estérification entre un acide et un alcool, des réactions de transestérification entre un ester et un alcool, des réactions d'inter-estérification entre deux esters ou des réactions de transfert d'un groupement acétyle d'un ester sur une aminé ou sur un thiol.
22. Utilisation selon la revendication 21, pour catalyser :
la synthèse du butyloléate qui est un lubrifiant pour les biodiesels ; l'hydrolyse des dérivés de l'ester glycérolinoléique pour conduire à des savons ou à des détergents :
des réactions de trans-estérifications impliquées dans la synthèse de biodiesels à faible viscosité.
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