CZ221899A3 - Způsob imobilizace enzymu - Google Patents
Způsob imobilizace enzymu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ221899A3 CZ221899A3 CZ992218A CZ221899A CZ221899A3 CZ 221899 A3 CZ221899 A3 CZ 221899A3 CZ 992218 A CZ992218 A CZ 992218A CZ 221899 A CZ221899 A CZ 221899A CZ 221899 A3 CZ221899 A3 CZ 221899A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- enzyme
- water
- lipase
- aqueous phase
- carrier
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 53
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims abstract description 34
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims abstract description 34
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 24
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 18
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 claims description 24
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 14
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 14
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 14
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 12
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 241000235545 Rhizopus niveus Species 0.000 claims description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 claims description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 claims description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000223198 Humicola Species 0.000 claims 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 abstract description 47
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 abstract description 31
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 6
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 14
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 14
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 12
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 10
- 229940057917 medium chain triglycerides Drugs 0.000 description 10
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 9
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 9
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 7
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- -1 hydrolysis Chemical class 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Chemical group 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000009884 interesterification Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000006462 rearrangement reaction Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002316 solid fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005457 triglyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000002569 water oil cream Substances 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6454—Glycerides by esterification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu imobilizace enzymů a použití imobilizovaných enzymů pro katalýzu zpracování triglyceridových tuků.
Dosavadní stav techniky
Enzymy se v průmyslovém měřítku používají jako katalyzátory pro zpracování různých surovin. Často jsou tyto způsoby cenově io výhodné pouze v případě, jestliže lze enzymy mnohokrát opakovaně použít. Pro recirkulaci musí být enzymy odděleny od zpracovávané kapaliny. To je možné, jestliže se enzymy připojí na nosič, který může být filtrován nebo centrifugován.
Důležitá skupina průmyslových enzymů má amfifilní povahu. 15 Tyto enzymy jsou charakterizovány přítomností hydrofilní části a zároveň hydrofobní části v molekule. Příklady této skupiny enzymů jsou lipázy a fosfolipázy. Amfifilní enzymy jsou enzymy, které při dispergování v emulzi oleje a vody budou migrovat a hromadit se na rozhraní vodné fáze a olejové fáze. To je definice amfifilních enzymů v souvislosti předkládaného vynálezu. Hydrofobní část enzymu směřuje do hydrofobní fáze a hydrofilní část směřuje do fáze vodné.
Vynález bude popisován s lipázou jako nejdůležitějším příkladem amfifilního enzymu. Jinými průmyslově použitelnými amfifilními enzymy jsou fosfolipázy, v nichž jsou známé různé typy a které se například používají pro hydrolýzu fosfolipidů na lyzofosfolipidy.
Lipázy se používají pro jejich schopnost modifikovat strukturu a složení triglyceridových olejů a tuků. Katalyzují různé typy konverzí ·· · Μ · • ♦ · · · · · · » · · * · · · · ♦ 9 · · · • · ·· ·· 9 9 999999
9 9 9 9 9 9 9
9999 9 99 99 99 99
- 2 triglyceridů jako je hydrolýza, esterifikace a transesterifikace. Jde o rovnovážné reakce, které jedním směrem vedou k hydrolýze triglyceridů na mastné kyseliny a glycerol, mono- nebo diglyceridy, a ve druhém směru vedou k reesterifikaci glycerolu, monoglyceridů a diglyceridů na trigíyceridy. Pro reesterífikační proces odstraňování vody, která se tvoří v reakčním prostředí, je nutné posunout rovnováhu ve směru syntézy triglyceridů.
Použití lipázy ve v podstatě bezvodém prostředí vyžaduje disperzi lipázy v oleji v aktivní formě, což způsobuje největší problémy. io Pro tento účel se používá s výhodou imobilizovaná lipáza, která je aktivní v oleji, který obsahuje malé množství rozpuštěné vody, ale nikoliv vodu dispergovanou.
V současnosti hlavní způsob výroby imobilizované lipázy zahrnuje nejprve mikrobiologickou fermentaci vodného mikroorganismu, který za vhodných podmínek produkuje enzym, oddělení mikroorganismu a popřípadě čištění enzymu. Potom se roztok získané lipázy přidá k nosiči a enzym se ponechá přichytit na povrch nosiče. Tato metoda imobilizace se pro způsob interesterifikace jako příklad uvádí například v GB 2 159 527. so Přichycení enzymu na nosič umožňuje snadnou separaci ireverzibilně imobilizovaného enzymu z média pro následující použití.
Použité nosné materiály jsou obecně porézní, ve vodě nerozpustné látky ve vodě částic, které poskytují velké povrchové plochy na jednotkový objem. Příprava imobilizovaných enzymů se popisuje například v EP 0 140 542, EP 0 382 767, WO 95/22606, EP 0 444 092 a WO 89/01032.
Během enzymatického zpracování triglyceridů ztrácí imobilizovaný enzym postupně svou aktivitu. Ta musí být často nahrazována čerstvým enzymovým preparátem. Spotřeba enzymu určuje hlavní část celkových nákladů na zpracování. Pokud by bylo ·· «444 • 4 4 4444 4444
4 44 44 4444
4 44 44 44 444444
4 4444 4 4
4444 4 44 44 44 44
- 3 možné prodloužit životnost enzymu, představovalo by to velkou ekonomickou výhodu.
V obvyklých porézních nosných materiálech dále snižují aktivitu lipázy omezení spojená s přenosem hmoty.
Nepředuveřejněná patentová přihláška WO 97/01632 autorů vynálezu popisuje laciný a snadný způsob imobilizace enzymu stejně jako způsob regenerace a reaktivace takového enzymatického preparátu po jeho případném opotřebení při používání. První způsob zahrnuje kroky
a. volbu amfifilního enzymu pro imobilizaci,
b. přípravu emulze obsahující spojitou hydrofobní fázi a dispergovanou vodnou fázi, ve které je rozpuštěn enzym a materiál vhodný jako nosič enzymu při provádění dalšího kroku,
c. odstranění vody z dispergované fáze, dokud se tato fáze nepřemění na pevné enzymem potažené částice.
V uvedené přihlášce se nosný materiál popisuje jako materiál úplně rozpustný ve vodné fázi. Žádným způsobem se nehovoří o materiálu ve vodné fázi, který je nerozpustný.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje způsob zahrnující kroky
a. volbu amfifilního enzymu pro imobilizaci,
b. přípravu emulze obsahující spojitou hydrofobní fázi a dispergovanou vodnou fázi, ve které je rozpuštěn enzym a materiál vhodný jako nosič enzymu při provádění dalšího kroku,
4444 • · · · 4 · 4 4 · 4 4
4 4 * 44 4444
4 44 44 44 444444
4 4444 4 4 ••44 4 44 44 ·4 «4
-4c. odstranění vody z dispergované fáze, dokud se tato fáze nepřemění na pevné enzymem potažené částice, kde vodná fáze navíc obsahuje nerozpuštěný materiál.
Vynález také poskytuje způsoby, kterými se získaný 5 imobilizovaný enzym používá.
Výchozí emulze se připravuje s výhodou s 5 až 15 % hmotnostními, výhodněji 8 až 10 % hmotnostními vodné fáze, která se disperguje v hydrofobní fázi. Vodná fáze by měla obsahovat amfifilní enzym pro imobilizaci, a dále jak rozpuštěný, tak i nerozpuštěný io materiál, přičemž oba tyto materiály mohou působit jako nosič po odpaření vody z kapiček vodné fáze, jak bude popsáno dále.
Ve vodě rozpustný nosný materiál se s výhodou volí ze skupiny cukrů jako je sacharóza, laktóza a glukóza, škrobů jako je pšeničná mouka, dextranu, ve vodě rozpustných derivátů celulózy a fermentačních zbytků.
Nerozpuštěná část nosného materiálu se může skládat z materiálu, který není rozpustný ani ve vodě, ani v oleji. Alternativně se může skládat z materiálu, který je jako takový rozpustný ve vodné fázi, ale který je v popisovaném případě přítomen v nerozpustné formě, protože je dispergován ve vodné fázi, která je již tímto ve vodě rozpustným materiálem nasycena. V důsledku toho při kolísání teploty také bude kolísat rozpuštěné množství takového materiálu.
Materiály, které nejsou jako takové rozpustné, se vhodně volí ze skupiny biomasy, cereální drti a nerozpustných složek sóji. Je možno také obecně použít inertní drti přírodního nebo syntetického materiálu, jako jsou porézní polypropylenové částice.
Rozumí se, že biomasa obsahuje inaktivované ve vodě rozpustné zbytky mikroorganismů použitých při fermentaci.
·· 9999 • · * · 9 9 * 9 • 9 99 9 9 9 9 * · 999999 9*9 999
9 9999 9 9
99999 99 *· 99 99
- 5 Pokud není nosný materiál přítomen ve vodné fázi nebo pokud je přítomen v nedostatečném množství, přidává se do vodné fáze před nebo po dispergaci vodné fáze do hydrofobní spojité fáze.
Množství nosného materiálu se s výhodou volí tak, aby bylo pro 5 enzym k dispozici dostatečné množství nosné plochy pro přichycení. Větší částice jsou výhodnější pro snadnější separaci, ale mají menší poměr povrch/hmotnost než malé částice. Nosný materiál se obecně používá v množství 0,5 až 5 % hmotnostních vzhledem k oleji, s výhodou 1 až 2 % hmotnostní.
io Rozumí se, že fermentační zbytky jsou všechny látky, které zbývají ve fermentační kapalině po fermentaci, a které jsou obsaženy v supernatantu po oddělení ve vodě nerozpustné biomasy z fermentační kapaliny. Tento supernatant se případně koncentruje, například průchodem přes mikrofiltrační membránový modul z dutých vláken s příčným tokem (známý jako umělá ledvina). Fermentační zbytky obsahují polysacharidy, proteinový materiál, soli a cukry. Tyto látky jsou rozpuštěny ve vodné fermentační kapalině, ale budou se oddělovat jako pevný materiál ve formě částic, jestliže se voda odstraní. Podle konkrétního provedení se fermentační zbytky používají
2o spolu s jakoukoliv vhodnou biomasou, která bude působit jako nerozpustná část nosiče. Další nerozpustný nosný materiál může být přidán dodatečně.
Obsah nerozpustného nosného materiálu může kolísat v širokých mezích, například od 0,001 do 99 % hmotnostních celkového nosného materiálu, s výhodou 0,01 až 80 % hmotnostních a výhodněji 0,1 až 20 % hmotnostních. Rozsah může kolísat v závislosti na nosném materiálu nebo kombinaci nosných materiálů. Vhodné směsi může snadno sestavit odborník v oboru.
Vodná fáze obsahující enzym se disperguje ve formě jemných kapíček v hydrofobní fázi obvyklými emulgačními technikami. Podle
0000 • * · 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 00 0 0 0 0 • · · · · · ·· 0·· ···
0 0 0 0 0 0 0
0000 0 00 00 00 00
- 6 povahy amfifilní enzym migruje a hromadí se na rozhraní vodné fáze a hydrofobní fáze.
Může být použita jakákoliv lipáza vhodná pro hydrolýzu nebo reesterifikaci triglyceridů, ale s výhodou se používá lipáza získaná fermentací z Rhizomucor miehei, Humicola lanuginosa nebo Rhizopus niveus. Množství přidané enzymatické aktivity je upraveno podle konkrétního postupu, pro který se bude používat. Obecně je vhodná aktivita lipázy 100 až 1500 lipázových jednotek (LU) na gram oleje. Jedna lipázová jednotka se definuje jako množství enzymu, který io uvolní jeden mikromol kyseliny máselné za minutu z emulgovaného tributyrinového substrátu (při pH 7,0 a teplotě 30 °C).
Hydrofobní fáze emulze může být jakákoliv potravinářská tekutina, ve které může být vodná fáze dispergována, kterou je s výhodou jedlý triglyceridový olej, a která se chová jako substrát enzymu. Jestliže hydrofobní fáze není substrát, měl by být přidán odděleně. Alternativně se imobilizované částice enzymu oddělují ze systému, ve kterém byly připraveny, a shromažďují se pro pozdější použití, kterým je přídavek k olejovému substrátu. Hydrofobní fáze se s výhodou skládá ze směsi triglyceridů, která případně dále obsahuje
2o diglyceridy, monoglyceridy, glycerol a mastné kyseliny.
Jestliže se pro imobilizace použije triglyceridový olej, s výhodou se volí olej, který v podstatě neobsahuje fosfolipidy, jinak mohou fosfolipidy nepříznivě interferovat s tvorbou částic potažených enzymem. Triglyceridový olej s výhodou neobsahuje více než 100 ppm hydratovatelných fosfolipidů. Jestliže je cílem enzymatického procesu hydrolýza fosfolipidů, musí být imobilizované částice enzymů připraveny v odděleném systému, který fosfolipidy neobsahuje.
Pro nezbytné odstranění vody z emulze jsou k dispozici běžné standardní způsoby včetně přidávání molekulových sít a probublávání inertního plynu jako je dusík skrz emulzi. Sušení se nejlépe provádí postupným odpařováním vody, s výhodou při 30 °C až 35 °C použitím • · • · 9 9 99 9 9 9 9 • 9 · · 9 9 ·· ··· ··· • 9 · · · · · · ···· 9 99 99 99 99
- 7 vakua s výhodou 100 Pa až 10 kPa, výhodněji 300 Pa až 2000 Pa. Je možné případně použít kombinaci těchto způsobů.
Jak se voda postupně odstraňuje z dispergované vodné fáze, kapičky se smršťují a vysoušejí se. Současně se bude rozpuštěný materiál oddělovat jako pevná látka ve formě částic. Enzym, který se na počátku hromadí na rozhraní voda/olej, se bude případně ukládat na pevný materiál ve formě částic, který se vytvořil při smršťování vysušené kapičky, a bude se na něj navazovat. V závislosti na množství enzymu dostupného ve vodné fázi budou částice nosiče io úplně nebo částečně potaženy vrstvou enzymu. Tímto způsobem poskytne sušení dispergované fáze imobilizovaný enzymatický preparát. Enzym může být po imobilizaci použit okamžitě za předpokladu, že jeho substrát bude dostupný hydrofobní fázi nebo může být imobilizovaný enzym oddělen a přidán k oleji - substrátu nebo může být uchován pro pozdější použití.
Na začátku imobilizačního postupu se vytvoří emulze voda/olej obsahující lipázu, a pokud jsou přítomny molekuly glyceridů, začnou se hydrolyzovat na mastné kyseliny a diglyceridy, monoglyceridy a glycerol. Hydrolýza pokračuje, dokud se nedosáhne předem zvolené úrovně. Jakmile se však ze zpracovávané směsi odstraní voda, enzymatická hydrolýza esterů se převrátí na proces enzymatické reesterifikace. Některé lipázy však nejsou schopny hydrolyzované glyceridy účinně reesterifikovat. To je zřejmé ze zvolna klesající hladiny mastných kyselin (viz obr. 1).
Imobilizace se s výhodou provádí při teplotě 30 °C až 35 °C.
Imobilizovaná lipáza má zvýšenou teplotní stabilitu za předpokladu, že enzym působí v nevodném prostředí, které neobsahuje žádnou dispergovanou vodu. Voda rozpuštěná ve zpracovávaném triglyceridovém oleji by však měla dostačovat pro počáteční krok
3o hydrolýzy. V závislosti na typu lipázy jsou dovoleny pracovní teploty 60 °C nebo dokonce 70 °C. S takovými odolnými enzymatickými • · • · · · • · ·· · ···· · · · · • · ···· · · · · • · ·· ·· ·« ··· ··· • · · · · · · · ····· ·· ·· ·· · ·
- 8 systémy je možné zpracovávat tuhé tuky, i když mají teploty tání v rozmezí 40 až 60 °C, což je za hranicí maximální pracovní teploty většiny vodných lipázových preparátů.
Imobilizované enzymy podle vynálezu mohou být používány při 5 vsádkovém postupu stejně jako kontinuálním způsobu zpracování. Velikost pevných částic potažených enzymem by měla být dostatečně velká pro umožnění separace, například centrifugací, filtrací nebo dekantováním. Pro snadné provádění separace je velikost alespoň 0,1 pm, s výhodou alespoň 1 pm a výhodněji 5 až 25 pm. Protože se io vzrůstající velikostí se povrch dostupný pro přichycení enzymu (na jednotku hmotnosti) zmenšuje, je nutno zachovat správnou rovnováhu.
Zvláštní výhodou předkládaného vynálezu je to, že vynález nepotřebuje čistý enzym. V případě potřeby je možno vynechat časově náročné a drahé postupy získávání a čištění enzymu ze surové fermentační kapaliny, jestliže například fermentační zbytky a biomasa poskytují vhodné nosné materiály.
Vynález dále zahrnuje způsoby katalyzované imobilizovaným amfifilním enzymem podle vynálezu. K těmto způsobům patří lipázou katalyzované přeuspořádání esterů a také acidolýza, při které triglyceridy reagují s mastnými kyselinami.
Přeuspořádání esterů se může týkat mono-, di- nebo triglyceridů, u kterých se za katalytického působení lipázy vyměňují skupiny mastných kyselin na glycerolových kostrách triglyceridových molekul.
Enzymatické odkyselení triglyceridového oleje zahrnuje katalytické působení lipázy, kde se mastné kyseliny odstraňují esterifikací s mono- nebo diglyceridy, které jsou také přítomny v oleji.
Jestliže se enzymy imobilizované in šitu podle vynálezu oddělí z reakčního prostředí buď filtrací, dekantací nebo centrifugací, mohou být mnohokrát opakovaně použity.
• · • · · · • φ φφ φ φφφφ φφφφ • φ φφφφ φφφφ φ φ φφ φφ φφ ΦΦΦΦΦΦ φ φ φφφφ · φ
ΦΦΦΦΦ φφ φφ φφ ··
- 9 Pro způsob přeuspořádání se preparát imobilizované lipázy přidává jako takový ke vsádce triglyceridového oleje. Není nutno přidávat žádnou vodu za předpokladu, že je dostatečné množství vody pro počáteční krok hydrolýzy přítomno v rozpuštěné formě ve zpracovávaném triglyceridovém oleji. Ačkoliv se při pokojových teplotách rozpouští v oleji pouze 0,3 % hmotnostních vody, dostačuje to pro hladký průběh enzymatické reakce.
Imobilizovaný enzym se ekonomicky používá pro řadu alespoň dvou následných enzymaticky katalyzovaných reakcí, kde v řadě io reakcí je zahrnut alespoň jeden krok regenerace enzymatické aktivity.
Taková regenerace nebo reaktivace se může provádět dispergací vody do systému imobilizovaný enzym v oleji, ponecháním enzymu a jeho nosiče interagovat s vodou za částečného rozpuštění nosného materiálu a potom odpařením vody z dispergované fáze takovým způsobem, že se opět vytvoří enzymem pokryté částice nosiče.
Pro uvedenou reaktivaci se přidává s výhodou 5 až 15 % hmotnostních, výhodněji 8 až 10 % hmotnostních vodné fáze, která se disperguje do hydrofobní fáze. Rozpuštěný enzym migruje do rozhraní voda/olej a hromadí se v něm. Když se voda odstraní jak bylo popsáno výše, kapičky se vysycháním smrští a rozpuštěný nosný materiál se opět oddělí jako pevná látka. Pokud voda postupně odchází ze sušených kapiček, enzym nakonec opět přilne k nosiči.
Alternativně se nejprve použitý enzym na nosiči oddělí z reakčního prostředí, smísí se s vodnou fází, přičemž se enzym a část nosiče rozpustí a získaná vodná fáze se potom disperguje v olejové fázi a suší se jak bylo popsáno výše.
Enzym na nosiči se případně po oddělení přidá k hotové emulzi voda/olej pro reaktivační působení.
• · · · • · ·· · ···· · · · · • · ···· · · · · • 9 9 9 ·· · · ······ • · 9 9 9 9 9 ·
999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
- 10 Opakovaná imobilizace vede k obnovení, alespoň částečnému, enzymatické aktivity. Vliv obnovení může být zaznamenán jako stabilizace aktivity nebo snížení obvyklé a očekávané inaktivace.
Reaktivace novou imobilizaci může být znovu a znovu 5 opakována a poskytuje možnost prodlouženého použití enzymu a nosného materiálu. Obrázky 2, 3 a 4 ukazují opětné použití imobilizovaného enzymu lipázy v za sebou následujících vsádkách. Postupné snižování enzymatické aktivity při následných krocích přeuspořádání se částečně zlepší (obr. 3 a 4) nebo alespoň zastaví io (obr. 2) použitím opětné imobilizace (vyznačeno tmavě stínovanými oblastmi) použitím stejného enzymu a stejného nosného materiálu. Enzym poškozený nebo spotřebovaný při procesu je možno kompenzovat přídavkem určitého množství čerstvého enzymatického preparátu.
Aktivita a stabilita imobilizovaného enzymu může být závislá na pH. pH by mělo být před provedením (opětné) imobilizace nastaveno. Vhodné hodnoty pH mohou být v rozmezí 5 až 8 v závislosti na enzymu a nosiči.
Budoucí opakované použití materiálů, laciná příprava enzymu
2o z nepurifikované formy a nepřítomnost nákladného nosného materiálu ve velké míře snižuje náklady na drahý katalyzátor. Navíc se snižují problémy spojené s ukládáním vypotřebovaného enzymatického materiálu do odpadu. Tyto výhodné rysy jsou jedinečné a nejsou popsány pro enzymy imobilizované způsoby podle dosavadního stavu techniky.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje, jak se během imobilizace enzymu in šitu podle předkládaného vynálezu mění obsah vody a obsah volných mastných kyselin.
4· 44 44 44
4 4 4 4 4 4
444 4 44 4
44 444 444
4 4 4 4 «4 44 44
- 11 Obr. 2 ukazuje aktivitu enzymu lipázy imobilizovaného podle vynálezu v průběhu několika následujících procesů přeuspořádání přerušených jedním krokem opětné imobilizace (tmavě stínovaná oblast) po přibližně 48 hodinách.
Obr. 3 viz obr. 2, ale s použitím odlišného nosného systému pro imobilizaci.
Obr. 4 viz obr. 2, ale s použitím odlišného nosného systému pro imobilizaci.
Byly použity dvě opětné imobilizace.
Vynález bude ilustrován následujícími příklady:
Příklady provedení vynálezu
Pro monitorování postupujícího způsobu podle následujících 15 příkladů byly v časových intervalech odebírány vzorky oleje. Vzorky odebrané z reakčního média jehlou byly smíseny s bezvodým síranem sodným pro odstranění zbývající vody z oleje a potom zahřátý na teplotu vyšší než 85 °C ve 2 ml skleněných zkumavkách pro deaktivaci enzymů.
2o Obsah volných mastných kyselin byl stanoven rozpuštěním přibližně 0,5 g homogenizovaného oleje v 50 ml neutrálního rozpouštědla obsahujícího stejné objemy ethanolu (96 %) a diethyletheru (p.a.) a titraci směsi roztokem hydroxidu sodného 0,1 mol/l s použitím fenolftaleinu jako indikátoru. Obsah volných mastných kyselin (free fatty acid. FFA) se vypočte podle následující rovnice:
V . M . 282 % FFA = W.1000
100 % • · · · · · ·· · · · · · * • * · · · · · • · · · · · » · · · • · · · · · · · ······ • φ «··· · · ····· · · · · · · ··
- 12 kde: V = titrovaný objem (ml)
W = hmotnost vzorku oleje (g)
M = molarita roztoku NaOH
282 = typická molekulová hmotnost mastných kyselin (v kyselině olejové)
Aktivita katalyzátoru se vypočte z následujících rovnic:
k = -ln(1 - x) *M/W . t kde: k = aktivita katalyzátoru (g oleje/g katalyzátoru za hod)
M = hmotnost oleje (g)
W = hmotnost katalyzátoru (g enzymatického preparátu) t = čas(hod) x = stupeň konverze definovaný jako lCNt - ΣΟΝι
X = ΣΟΝθ- ΣΟΝ,
ΣΟΝ znamená součet hodnot rozmezí počtů uhlíků zvolených pro specifický proces, kde indexy (t, i, e) se vztahují k prostředku v jakémkoli časovém okamžiku (t), k počáteční směsi (i) a k rovnovážné směsi (e). Hodnoty počtů uhlíků se získávají analýzou vzorků plynovou kapalinovou chromatografií (GLC). Pro přeuspořádání směsi SF/MCT se volí pro výpočet stupně přeměny hodnoty CN 34 46 a pro přeuspořádání směsi PO/PK se volí hodnotyCN 44 - 46.
• · · · · · « · · · • · « ·
- 13 Příklad 1
Obr. 1 ukazuje obsah vody a volných mastných kyselin v průběhu imobilizace lipázy získané z Humicola lanuginosa in šitu. Jako nosný materiál byl použit vodný kvasničný extrakt obsahující přibližně 0,1 % hmotnostních ve vodě nerozpustného materiálu a jako spojitá olejová fáze byl použit slunečnicový olej (SF).Volné mastné kyseliny byly produkovány pro obsah vody ve zpracovávaném prostředí. Hydrolýza se zastavila, když byla použitím vakua ze systému odstraněna voda.
ίο V reaktoru opatřeném míchadlem bylo smícháno 10 kg vody s 2 kg práškového kvasničného extraktu (firmy OHLY, Německo), který sloužil jako nosný materiál, a 1 kg kapalného roztoku enzymu (firma NOVO, Dánsko), který byl vyroben z fermentační kapaliny Humicola lanuginosa a který obsahoval 100 k lipázových jednotek NOVO na gram roztoku. Oddělený vsádkový reaktor opatřený míchadlem a vodním pláštěm byl naplněn 100 kg slunečnicového oleje (SF) a zahřát na teplotu 35 °C. Směs enzym - nosič byla vložena do oleje po důkladném míchání pro zajištění homogenního stavu. Důkladné míchání poskytlo emulzi voda/olej s jemně rozptýlenými kapičkami
2o vody a velkým rozhraním oleje a vody.
Hydrolýza triglyceridových molekul začala po přídavku vodné fáze a pokračovala při 35 °C až do dosažení hladiny 30 % FFA.
Snížením tlaku na 500 Pa byla odpařena voda, což způsobilo uložení a imobilizaci lipázy na usušený nosný materiál. Spolu s odstraněním vody se zastaví tvorba FFA a začala částečná reesterifikace. Obr. 1 ukazuje procento volných mastných kyselin a vody přítomných v systému v průběhu času. Odstraňování vody pokračovalo, dokud obsah vody v oleji nepoklesl pod mez rozpustnosti, která byla nižší než 0,2 %.
Tento postup poskytl enzym, který byl imobilizován na nosném materiálu. Uvedený imobilizovaný enzym může být z oleje oddělen • · · · • · • · • · · · ♦ · · ···· • · · · ·· ···· • · ·· ·· ·· ······ • · · · · · ·· •··« · ·· ·· ·· ··
- 14 a použit nebo znovu použit pro reakce přeuspořádání pro výrobu cenných jedlých olejů. Olej použitý pro imobilizaci může být opakovaně použit ke stejnému účelu.
Příklad 2
Obr. 2 ukazuje enzymatickou aktivitu (gramy přeměněného oleje na gram enzymu za hodinu) jako funkci času (hodiny) pro lipázu získanou z Humicola lanuginosa a použitou v za sebou následující řadě přeuspořádání ve vsádkovém provedení. Tmavě stínované oblasti io v grafu označují přípravu in šitu, popřípadě opětnou aktivaci imobilizovaného enzymu. Teploty imobilizace in šitu a postupu opětné aktivace byly 35 °C. Samotný proces přeuspořádání probíhal při 60 °C. Imobilizovaný enzymatický preparát byl z oleje oddělen centrifugací pro použití při následujícím postupu.
Příprava šarže pro imobilizaci in šitu byla prováděna v podstatě stejně jak bylo popsáno v příkladu 1 a jak je ilustrováno na obr. 1. Tentokrát byly jako nosný materiál použity (1,39 % hmotnostních) celé pšeničné otruby, které jsou přírodním vedlejším produktem zpracování pšeničného zrna. Obsahují přibližně 60 % hmotnostních ve vodě nerozpustného materiálu, který poskytuje ve zpracovávaném oleji 0,84 % hmotnostních pevných látek. Vsádkový reaktor opatřený míchadlem a vodním pláštěm byl naplněn směsí pro přeuspořádání složenou ze 127,2 g triglyceridů se střední délkou řetězce (MCT) a 238,95 g slunečnicového oleje (SF). 95 % hmotnostních mastných kyseliny materiálu MCT tvořily C8-Ci0 mastné kyseliny a 5 % hmotnostních jiných kyselin. Za sebou následující postupy přeuspořádání byly prováděny s reakčními dobami, z nichž některé byly přibližně 16 hodin (přes noc) a některé 8 hodin.
Obr. 2 jasně ukazuje změnu průměrné aktivity na šarži v průběhu různých kroků přeuspořádání olejové směsi SF/MCT. V tomto konkrétním případě je deaktivace mezi přeuspořádáním Re1 • · · < 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 99 · · · · • · ·· · · · » 999 999
9 9 9 9 9 9 9
9999 9 99 99 99 99
- 15 a Re3 (je umožněno přímé porovnání, protože je stejná doba trvání procesu) 36 %. Regenerace po třetím kroku přeuspořádání vedla k pouze mírně vyšší aktivitě. Bez regenerace však došlo k dalšímu poklesu aktivity.
Příklad 3
Obr. 3 ukazuje, jak byla použita imobilizovaná lipáza získaná z Humicola lanuginosa v za sebou následující řadě šarží přeuspořádání. Aktivita (gram přeměněného oleje na gram enzymu za io hodinu) je ukázána jako funkce času (hodiny). Jako nosných materiálů bylo požito deaktivovaných fermentačních zbytků a porézních polypropylenových částic. Tmavě stínované oblasti v grafu ukazují přípravu in šitu, popřípadě opětnou aktivaci enzymatického preparátu. Teplota imobilizace in šitu a postupu opětné aktivace byla 35 °C, zatímco přeuspořádání probíhalo při 60 °C. Před použitím v následujícím procesu byl enzymatický preparát z oleje oddělen centrifugací a filtrací.
Pro imobilizaci in šitu byla připravena šarže a bylo použito stejného postupu jak se popisuje v příkladu 1 a jak je ilustrováno na obr. 1. Použitými nosnými materiály bylo 5,1 g deaktivovaných fermentačních zbytků z Rhizopus niveus rozpuštěných ve 30,9 g vody a 1,8 g porézních polypropylenových částic (Accurel™, firma AKZO, Holandsko). Vsádkový reaktor opatřený míchadlem a vodním pláštěm byl naplněn směsí 127,2 g triglyceridů se střední délkou řetězce (MCT) a 238,95 g slunečnicového oleje (SF) pro přeuspořádání. 95 % mastných kyselin MCT tvořily Cs-C-io mastné kyseliny a 5 % tvořily jiné kyseliny.
Obr. 3 jasně ukazuje změnu průměrné enzymatické aktivity s časem v průběhu přeuspořádání směsi olejů SF/MCT. V tomto konkrétním případě poklesla počáteční aktivita enzymů při přeuspořádání Re1 z hodnoty 100 % na hodnotu 54,7 % ·* · to · · ·· ·· » to · « • · · » ·· « ř ·· <
·· toto • to 4 » · to » · · • · · « • to «
- 16 u přeuspořádání Re3. Přímé porovnání je umožněno, protože procesy trvají stejnou dobu. Regenerace po třetím kroku přeuspořádání vedla ke zvýšení aktivity na 73,9 % počáteční úrovně. Bez regenerace byl očekáván další pokles aktivity proti počáteční úrovni.
Příklad 4
Obr. 4 ukazuje enzymatickou aktivitu (gram přeměněného oleje na gram enzymu za hodinu) jako funkci času (hodiny) pro lipázu získanou z Humicola lanuginosa a použitou v následujících řadách io přeuspořádání (Re). Tmavě stínované oblasti v grafu ukazují přípravu imobilizovaného enzymu in sítu a popřípadě jeho opětnou aktivaci. Teplota při imobilizaci in šitu a opětné aktivaci byla 35 °C. Samotný postup přeuspořádání probíhal při 60 °C. Imobilizovaný enzymatický preparát byl z oleje oddělen centrifugací pro použití při následujícím postupu.
Příprava vsádky pro imobilizaci in sítu byla v principu provedena stejně jak se popisuje v příkladu 1 a jak je ilustrováno na obr. 1. Katalyzátor byl dispergován a rozpuštěn ve vodném roztoku. Při imobilizaci bylo nastaveno pH na 7 a stejně tak na začátku druhé regenerace. Na začátku první regenerace bylo pH nastaveno na 6,3. Tentokrát byl použitým nosným materiálem kvasničný extrakt obsahující přibližně 0,1 % hmotnostních ve vodě nerozpustné látky a méně než 1 % hmotnostní soli.
Vsádkový reaktor opatřený míchadlem a vodním pláštěm byl naplněn směsí pro přeuspořádání 127,2 g triglyceridů se středním řetězcem (MCT) a 238,95 g slunečnicového oleje (SF). 95 % hmotnostních mastných kyselin tvořících MCT byly C8-Ci0 mastné kyseliny a 5 % dalších kyselin. S reakčními dobami 22 až 23 hodin a pro dvě reakční doby 73 a 93 hodin (přes víkend) bylo provedeno
3c osm následujících přeuspořádání. Opětná aktivace byla vložena po přeuspořádáním Re5 a Re9.
4444 •9 44 44 44 • 4 4 · 4 4 · 4 4 4 ·
4 44 44 4444 • 4 » 4 44 44 444 444 « 4 4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 44 44 44 44
- 17 Obr. 4 jasně ukazuje změnu průměrné aktivity na šarži v průběhu doby při různých přeuspořádáních směsi oleje SF/MCT. V tomto konkrétním případě poklesla aktivita enzymu proti přeuspořádání Re1 s počáteční hodnotou 100 % na hodnotu 53 % v přeuspořádání Re5. Přímé porovnání je umožněno díky stejné době trvání procesu.
Regenerace po pátém kroku přeuspořádání vedla k přírůstku aktivity na 64 % z počáteční hodnoty. Bez regenerace však došlo k dalšímu poklesu aktivity na úroveň 39 % až 47 % podobně jako po io krocích přeuspořádání Re3 a Re4. Při devátém kroku přeuspořádání poklesla aktivita enzymu na 26,8 % počáteční hodnoty, ale regenerace potom vedla ke zvýšení na 32,7 % počáteční hodnoty.
Claims (11)
1. Způsob imobilizace enzymu, charakterizovaný kroky:
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e lipáza se získává z fermentace Rhizomucor miehei, Humicola Ianuginosa nebo Rhizopus niveus.
3. Způsob podle některého z nároků 1až2, vyznačující se tím, že vodná fáze obsahuje fermentační kapalinu,
4. Způsob podle některého z nároků 1až3, vyznačující
25 s e t í m , ž e hydrofobní fází je jedlý triglyceridový olej.
5 kterém se za katalytického působení lipázy vymění na glycerolové kostře skupiny mastné kyseliny, vyznačující se tím, že lipázou je imobilizovaný enzym získaný podle některého z nároků 1 až 7.
5 s e t í m , ž e nerozpuštěný nosný materiál se skládá buď z materiálu, který není rozpustný ani ve vodě, ani v oleji, nebo materiálu, který je jako takový rozpustný ve vodné fázi, ale který je v konkrétním případě navíc k vodné fázi, která je již tímto ve vodě rozpustným materiálem nasycena, přítomen v io nerozpuštěné formě.
5. Způsob podle některého z nároků 1až4, vyznačující se tím, že rozpuštěný nosný materiál je zvolen ze
5 a. volbou lipázového enzymu pro imobilizaci,
b. přípravou emulze obsahující spojitou hydrofobní fázi a dispergovanou vodnou fázi, která obsahuje nerozpuštěný materiál, a ve které je rozpuštěn enzym a materiál vhodný jako nosič enzymu při provádění dalšího kroku, io c. odstraněním vody z dispergované fáze, dokud se tato fáze nepřemění na pevné enzymem potažené částice, vyznačující se tím, že hydrofobní fáze obsazuje látky, které jsou určeny ke zpracování enzymem, z nichž jedna nebo více je zvolena ze skupiny triglyceridů,
15 diglyceridů, monoglyceridů, glycerolu a mastných kyselin.
6. Způsob podle některého z nároků 1až5, vyznačující
7. Způsob podle některého z nároků 1až6, vyznačující se tím, že enzym stejně jako nosná látka, které mají být rozpuštěny ve vodné fázi, jsou odvozeny z imobilizovaných
15 enzymových částic vyrobených podle některého z předcházejících nároků a oddělených z reakční směsi.
8. Způsob katalyzovaný enzymem lipázou, vyznačující se tím, že enzymem je imobilizovaný enzym získaný
20 podle některého z nároků 1 až 7.
9 9 · 9 9 9 9 9
99999 9· 99 99 99
- 20 olejové fáze, přičemž se znovu vytvoří enzymem potažené nosné částice.
10. Způsob přeuspořádání esterů mono-, di- nebo triglyceridů, při
9 9 · 9 99 99 999 999
9 9 9 9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9. Použití imobilizovaného enzymu získaného podle některého z nároků 1 až 7 pro řadu alespoň dvou následujících lipázou katalyzovaných reakcí, vyznačující se tím,
25 ž e v řadě reakcí je zahrnut alespoň jednou krok regenerace aktivity enzymu, který zahrnuje přídavek vody k imobilizovanému enzymu, ponechání enzymu a jeho nosiče interagovat s vodou a odpaření vody po tom, co byla vodná fáze s enzymem a desintegrovaným nosičem dispergována do
99 9999
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 9 99 99 99 99
- 19 skupiny cukrů, škrobu, dextranu, ve vodě rozpustných derivátů celulózy a fermentačních zbytků.
9 9 999999 999 999
9 9 9 9 99 9 9 9 9
9 9 · β · 9 · Β « · ·
9 9
9 9 9999
10
11. Způsob enzymatického odkyselení triglyceridového oleje, kde za katalytického působení lipázy se esterifikují mastné kyseliny s mono- nebo diglyceridy, vyznačující se tím, ž e lipázou je enzym schopný reesterifikovat, získaný podle některého z nároků 1 až 7.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96203644 | 1996-12-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ221899A3 true CZ221899A3 (cs) | 1999-11-17 |
Family
ID=8224734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ992218A CZ221899A3 (cs) | 1996-12-19 | 1997-12-03 | Způsob imobilizace enzymu |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6025171A (cs) |
| EP (1) | EP0951535A1 (cs) |
| JP (1) | JP4017082B2 (cs) |
| AU (1) | AU741174B2 (cs) |
| BR (1) | BR9713949A (cs) |
| CA (1) | CA2275707A1 (cs) |
| CO (1) | CO4650228A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ221899A3 (cs) |
| HU (1) | HUP0000486A3 (cs) |
| PL (1) | PL334336A1 (cs) |
| SK (1) | SK80799A3 (cs) |
| TR (1) | TR199901337T2 (cs) |
| WO (1) | WO1998027199A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA9711159B (cs) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2225475A1 (en) * | 1995-06-27 | 1997-01-16 | Unilever Plc | Immobilized enzyme and its use for the processing of triglyceride oils |
| US7226771B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-05 | Diversa Corporation | Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| WO2003089620A2 (en) | 2002-04-19 | 2003-10-30 | Diversa Corporation | Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| AU2003257211A1 (en) * | 2002-08-09 | 2004-02-25 | The Procter And Gamble Company | A process for immobilizing an enzyme |
| WO2004076657A2 (en) | 2003-02-28 | 2004-09-10 | Mcgill University | Cell and enzyme compositions for modulating bile acids, cholesterol and triglycerides |
| CA2889013C (en) | 2003-03-07 | 2018-07-17 | Dsm Ip Assets B.V. | Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| DE102004019472A1 (de) * | 2004-04-22 | 2005-11-17 | Bayer Healthcare Ag | Phenylacetamide |
| GB0600913D0 (en) * | 2006-01-17 | 2006-02-22 | Syngenta Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
| EP1987142A4 (en) | 2006-02-02 | 2009-07-15 | Verenium Corp | ESTERASES AND ASSOCIATED NUCLEIC ACIDS AND METHODS |
| EA015591B1 (ru) | 2006-09-21 | 2011-10-31 | Верениум Корпорейшн | Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения |
| UA97127C2 (uk) * | 2006-12-06 | 2012-01-10 | Бандж Ойлз, Инк. | Спосіб безперервної ферментативної обробки композиції, що містить ліпід, та система для його здійснення |
| DK2177608T3 (en) * | 2007-07-31 | 2015-12-14 | Fuji Oil Co Ltd | Immobilized lipase and process for producing the same |
| US8198062B2 (en) * | 2008-08-29 | 2012-06-12 | Dsm Ip Assets B.V. | Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US8357503B2 (en) | 2008-08-29 | 2013-01-22 | Bunge Oils, Inc. | Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US8153391B2 (en) | 2008-08-29 | 2012-04-10 | Bunge Oils, Inc. | Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| CN101381721B (zh) * | 2008-09-26 | 2011-01-05 | 北京凯泰新世纪生物技术有限公司 | 一种固定化脂肪酶及其制备方法 |
| FR2947564B1 (fr) | 2009-07-06 | 2011-07-22 | Univ Paris Curie | Catalyseur enzymatique heterogene, procede de preparation et utilisation |
| UA111708C2 (uk) | 2009-10-16 | 2016-06-10 | Бандж Ойлз, Інк. | Спосіб рафінування олії |
| UA109884C2 (uk) | 2009-10-16 | 2015-10-26 | Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU540882B2 (en) * | 1980-03-08 | 1984-12-06 | Fuji Oil Company Limited | Enzymatic transesterification of lipid and enzyme used therein |
| DK402583D0 (da) * | 1983-09-05 | 1983-09-05 | Novo Industri As | Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf |
| US4940845A (en) * | 1984-05-30 | 1990-07-10 | Kao Corporation | Esterification process of fats and oils and enzymatic preparation to use therein |
| DK399387D0 (da) * | 1987-07-31 | 1987-07-31 | Novo Industri As | Immobiliseret lipase og dennes anvendelse |
| EP0382767B1 (en) * | 1987-09-28 | 1993-12-15 | Novo Nordisk A/S | Method for immobilizing lipase |
| DE3854042T2 (de) * | 1987-12-09 | 1995-11-16 | Kao Corp., Tokio/Tokyo | Immobilisiertes Enzym und Veresterung und Zwischenveresterung mit demselben. |
| FI96036C (fi) * | 1988-08-24 | 1996-04-25 | Allied Colloids Ltd | Menetelmä partikkelien valmistamiseksi, jotka sisältävät biologisesti tuotetun aineen polymeerimateriaalimatriisissa |
| DK638688D0 (da) * | 1988-11-16 | 1988-11-16 | Novo Industri As | Partikelformet immobiliseret lipase-praeparat, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf |
| GB8915299D0 (en) * | 1989-07-04 | 1989-08-23 | Cerestar Holding Bv | Carbohydrate refining process and a supported enzyme for use therein |
| DE4027290C2 (de) * | 1990-08-29 | 1995-03-23 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus enzymhaltigen Suspensionen |
| US5182201A (en) * | 1990-10-26 | 1993-01-26 | Uop | Lipase immobilization without covalent bonding on an amphiphilic support containing lipophilic alkyl chains |
| DE4115938A1 (de) * | 1991-05-16 | 1992-11-19 | Metallgesellschaft Ag | Enzymatisches verfahren zur verminderung des gehaltes an phosphorhaltigen bestandteilen in pflanzlichen und tierischen oelen |
| JP3194792B2 (ja) * | 1992-06-12 | 2001-08-06 | 天野エンザイム株式会社 | 酵素を用いた脂肪族ポリエステルの分解法 |
| EP0746608B1 (en) * | 1994-02-21 | 2003-08-20 | Novozymes A/S | Method for production of an immobilized enzyme preparation and use of the immobilized enzyme preparation |
| CA2225475A1 (en) * | 1995-06-27 | 1997-01-16 | Unilever Plc | Immobilized enzyme and its use for the processing of triglyceride oils |
-
1997
- 1997-12-03 TR TR1999/01337T patent/TR199901337T2/xx unknown
- 1997-12-03 CZ CZ992218A patent/CZ221899A3/cs unknown
- 1997-12-03 JP JP52728298A patent/JP4017082B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-12-03 WO PCT/EP1997/006957 patent/WO1998027199A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-12-03 SK SK807-99A patent/SK80799A3/sk unknown
- 1997-12-03 AU AU56623/98A patent/AU741174B2/en not_active Ceased
- 1997-12-03 HU HU0000486A patent/HUP0000486A3/hu unknown
- 1997-12-03 BR BR9713949A patent/BR9713949A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-12-03 EP EP97952927A patent/EP0951535A1/en not_active Withdrawn
- 1997-12-03 PL PL97334336A patent/PL334336A1/xx unknown
- 1997-12-03 CA CA002275707A patent/CA2275707A1/en not_active Abandoned
- 1997-12-11 ZA ZA9711159A patent/ZA9711159B/xx unknown
- 1997-12-16 US US08/991,307 patent/US6025171A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-12-17 CO CO97073565A patent/CO4650228A1/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0000486A3 (en) | 2001-10-29 |
| EP0951535A1 (en) | 1999-10-27 |
| BR9713949A (pt) | 2000-03-21 |
| JP2001506499A (ja) | 2001-05-22 |
| PL334336A1 (en) | 2000-02-28 |
| AU741174B2 (en) | 2001-11-22 |
| CO4650228A1 (es) | 1998-09-03 |
| US6025171A (en) | 2000-02-15 |
| TR199901337T2 (xx) | 1999-10-21 |
| WO1998027199A1 (en) | 1998-06-25 |
| HUP0000486A2 (hu) | 2000-06-28 |
| AU5662398A (en) | 1998-07-15 |
| CA2275707A1 (en) | 1998-06-25 |
| SK80799A3 (en) | 2000-03-13 |
| JP4017082B2 (ja) | 2007-12-05 |
| ZA9711159B (en) | 1999-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU720776B2 (en) | Immobilized enzyme and its use for the processing of triglyceride oils | |
| CZ221899A3 (cs) | Způsob imobilizace enzymu | |
| RU2520093C2 (ru) | Способ получения сложных метиловых эфиров жирных кислот с использованием смеси липаз (варианты) | |
| DK2152866T3 (en) | Modified-immobilized enzymes of high tolerance for hydrofilesubstrater in organic media | |
| KR101556799B1 (ko) | 개량되고 안정화된 활성을 갖는 고정된 계면 효소 | |
| WO2009010561A1 (en) | Immobilization of enzymes | |
| KR20130004286A (ko) | 지방산 알킬 에스테르의 효소적 합성을 위한 방법 | |
| WO2011004111A1 (fr) | Catalyseur enzymatique heterogene, procede de preparation et utilisation | |
| Dizge et al. | Covalent attachment of microbial lipase onto microporous styrene–divinylbenzene copolymer by means of polyglutaraldehyde | |
| EP1008647B1 (en) | A process for preparing an immobilized enzyme | |
| Otero et al. | Influence of the support on the reaction course of tributyrin hydrolysis catalyzed by soluble and immobilized lipases | |
| de Castro et al. | Immobilization of porcine pancreatic lipase on celite for application in the synthesis of butyl butyrate in a nonaqueous system | |
| JP2657887B2 (ja) | 固定化酵素の調製方法 | |
| JP2676470B2 (ja) | 固定化リパーゼ、その製造方法及び該リパーゼを用いた油脂類のエステル交換方法 | |
| Gao | Immobilization of lipases via sol-gel procedures and application of the immobilized lipases in oleochemical reactions | |
| WO2021009550A1 (en) | Preparation of immobilized enzymes | |
| JPH06327486A (ja) | 固定化酵素を用いるエステル交換法 | |
| Garlapati et al. | Research Article Solvent-Free Synthesis of Flavour Esters through Immobilized Lipase Mediated Transesterification | |
| NABI et al. | Enzymatic transesterification between sugar alcohol and oils | |
| JPH01309689A (ja) | 微生物菌体を用いる油脂のエステル交換方法 | |
| JP2006158389A (ja) | 固定化酵素の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |