WO2012022882A1 - Catalyseur enzymatique heterogene, procede de preparation et utilisation pour la catalyse enzymatique en flux continu - Google Patents

Catalyseur enzymatique heterogene, procede de preparation et utilisation pour la catalyse enzymatique en flux continu Download PDF

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Rénal BACKOV
Clément Sanchez
Nicolas Brun
Hervé DELEUZE
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Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6)
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Definitions

  • the present invention relates to a heterogeneous enzymatic catalyst consisting of a macroporous silica monolith incorporating an enzyme immobilized via a coupling agent, a process for preparing this enzymatic catalyst, and the use of this catalyst. for the production of heterogeneous enzymatic catalyzed chemical reactions in continuous flow and to a continuous heterogeneous enzymatic catalysis process using said catalyst.
  • biodiesel methyl or ethyl esters of fatty acids
  • an alcohol such as methanol or ethanol.
  • the triglycerides of the oils are esters of glycerol (also referred to as glycerine) and fatty acids -COOH.
  • transesterification reaction of the triglycerides of the oils with methanol can be represented by the following reaction scheme:
  • biodiesel production process There are two main types of biodiesel production process: homogeneous phase catalysis processes, using soluble catalysts in the reaction medium and heterogeneous phase catalysis processes using insoluble catalysts in the reaction medium. .
  • biodiesel is mainly carried out by catalysis in homogeneous phase. It consists in carrying out the transesterification of triglycerides in the presence of acidic catalysts such as mineral acids (HCl, H 2 SO 4 ) or sulphonic acids, or basic catalysts such as hydroxides, alkoxides, alkali or alkaline-earth metal soaps or even amines of the guanidine family, for example.
  • acidic catalysts such as mineral acids (HCl, H 2 SO 4 ) or sulphonic acids
  • basic catalysts such as hydroxides, alkoxides, alkali or alkaline-earth metal soaps or even amines of the guanidine family, for example.
  • a greater reactivity is generally obtained in basic medium. Acid catalysts are less often used because of their lower reactivity (they are about 4000 times slower than basic catalysts) and high risks of corrosion of industrial plants.
  • Heterogeneous enzymatic catalysis consists in carrying out the transesterification of vegetable oil triglycerides in the presence of a catalyst that is insoluble in the reaction medium.
  • Heterogeneous enzymatic catalysis has significant advantages in respect of the environment. In particular, it meets the criteria associated with the new concepts of "green chemistry", because the purity of the products obtained, combined with high synthesis yields, leads to a virtually total disappearance of polluting discharges.
  • the absence of salts in the reaction products does not impose, unlike in-phase catalysis. homogeneous, costly purification treatments, and broadens the possibilities of industrial outlets.
  • the various enzymatic catalyst systems currently proposed consist of a generally porous solid support (polymer matrices, colloidal silica, calcium silicate, zeolites, zirconium, kaolinite, porous glass, alumina, etc.), on which an enzyme is immobilized.
  • the solid supports of the catalysts used in heterogeneous catalysis are, in particular, acidic zeolites, heteropolyacids, ion exchange resins and sulfonic acids immobilized on solid supports, sulphated zirconias and mixed metal oxides.
  • the solid catalysts in which the solid support is a zeolite are in the form of powder and must be dispersed in the reaction medium in which they must be present to catalyze a reaction. Given the small particle size, the recovery of these catalysts in the reaction medium is a constraining step.
  • the other solid supports that can be used in heterogeneous catalysis do not give full satisfaction from a point of view of their mechanical resistance and temperature.
  • the solid supports on which it is possible to immobilize enzymes are however not compatible with a heterogeneous catalysis process in continuous flow.
  • the media used in continuous flow do not always achieve high conversion rates and stable over time.
  • the first condition sine qua none is to have a material monolithic.
  • the second condition is that this material has an interconnected macroporosity so as to allow the flow of the reaction medium.
  • the third condition is that the mechanical properties of the monolith support the imposed flow and the temperature over long time.
  • the subject of the present invention is a heterogeneous enzymatic catalyst characterized in that it is in the form of an alveolar monolith made of a silica matrix, said monolith being free of micropores and comprising macropores having a mean size d A from 1 ⁇ to 100 ⁇ and mesopores having a mean dimension d E of 2 to 50 nm, said macropores being interconnected, and in which the internal surface of the macropores is functionalized by a coupling agent chosen from silanes on which is fixed a enzyme, via a covalent or electrostatic bond.
  • the immobilized enzyme is an unpurified enzyme.
  • the use of such a monolith makes possible the implementation of an unpurified enzyme for the continuous flow catalysis of a chemical reaction, and all particularly, when the enzyme is a lipase, a transesterification reaction of triglycerides of fatty acids.
  • non-purified enzyme means any protein material comprising at least one non-isolated enzyme which has not undergone any purification step.
  • monolith means a solid object having an average dimension of at least 1 mm.
  • the average dimension d A of macropores varies from 10 to 100 ⁇ , and even more preferably from 20 to 70 ⁇ approximately.
  • the process for preparing the monoliths according to the invention has the advantage of not requiring a sintering step which would result in a narrowing of the size of the macropores.
  • the preparation method according to the invention leads to monoliths in which the macropores preferably have the dimensions indicated above, these being particularly well suited to the production enzymatic catalysis in continuous flow.
  • the macropore walls generally have a thickness of 0.5 to 40 ⁇ , and preferably from 2 to 25 ⁇ .
  • the specific surface area of the monolith is generally from 200 to 1000 m 2 / g approximately, preferably from 100 to 300 m 2 / g approximately.
  • the bond ensuring the attachment of the coupling agent with the silica is an iono-covalent bond.
  • the coupling agent is chosen from silanes selected from the group consisting of ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane; silylated ionic liquids, such as, for example, 1-methyl-3- (3-triethoxysilylpropyl) imidazolium chloride, 1-methyl-3- (3-triethoxysilylpropyl) imidazolium hexafluorophosphate; silanes of formula Si (O 2 ) 3 3 in which R 2 represents a C 1 -C 2 alkyl group, and R 3 represents a group - (CH 2 OH-CH 2 OH) q -CH 2 OH or - (CH 2 OH-CH 2 OH) q -CH 2 CH 3 wherein q is an integer ranging from 1 to 10.
  • ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane also known under the name "Glymo” is particularly preferred.
  • the nature of the enzyme that can be immobilized on the silica monolith via the coupling agent is not critical from the moment when it comprises at least one functional group capable of reacting with a complementary functional group carried. by the coupling agent to form an iono-covalent bond.
  • the coupling agent used is a silylated ionic liquid, it is electrostatic bonds.
  • the enzyme is chosen from:
  • hydrolases class EC 3 of the classification established by the Commission for Enzymes, Brussels), such as esterases (EC 3.1), and in particular carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1) such as lipases ( EC 3.1.1.3 or triacylglycerol acylhydrolases); amino-acylases (E.C. 3.5.1.14), amidases (E.C. 3.5.1.4, E.C. 3-5-1-3 or omega-amidase, E.C. 3-5-1-1 1 or penicillin-amidase); nitrilases (class E.C. 3.5.5.1.) which catalyze the hydrolysis of nitriles to carboxylic acids;
  • lyases including carboxy lyases (EC 4.1.1), aldehyde lyases (EC 4.1.2) such as oxynitrilases (classes EC 4-1-2-10 and EC 4) -1-2-37) catalyzing the synthesis of chiral cyanohydrins; and hydro-lyases (E.C. 4.2.1);
  • E.C. 5 isomerases (E.C. 5) including epimerases and racemases (E.C. 5.1), and in particular epimerases and racemases of E.C. class 5.1.1. catalyzing the formation of enantiomers of amino acids;
  • oxidoreductases including glucose oxidases (E.C. 1.1.3.4) such as Aspergillus niger glucose oxidase and peroxidases (E.C. 1.1 1.1) such as horseradish peroxidase.
  • the heterogeneous catalyst is intended for use in a process for producing biodiesel by transesterification of triglycerides of fatty acids and the enzyme is chosen from lipases of microbial or vegetable origin.
  • the amount of immobilized enzymes in the catalyst according to the invention can be determined by thermogravimetric analysis and by elemental analysis. According to a preferred embodiment of the invention, the amount of immobilized enzyme ranges from about 1 to about 40% by weight and more preferably from about 3 to about 20% by weight based on the total weight of the catalyst.
  • the subject of the present invention is also a process for preparing a heterogeneous enzymatic catalyst according to the invention and as defined above, said process comprising the following steps:
  • the mold used during the first step is itself confined inside a device allowing the circulation of a liquid in continuous flow, such as for example a column of chromatography.
  • the continuous flows mentioned in steps 2) and 3) of said process are ascending stream flows so as to optimize the distribution of the coupling agent, then the enzyme in the whole volume of macropores of the alveolar silica monolith.
  • the flow rate preferably varies from 0.02 to 0.1 ml / min.
  • Stage 2) of functionalization is preferably carried out at room temperature, and for a period of 24 hours and even more preferably for a period of about 72 hours.
  • the immobilization step 3) is preferably carried out at room temperature, and for a period of 72 hours and even more preferably for a duration of about 120 hours (5 days). Optionally, this step can be repeated twice.
  • the method further comprises, before carrying out step 3) for the second time, an additional step of impregnation of the monolith in continuous flow with a solution of an aldehyde, such as for example glutaraldehyde. This step involves the attachment of the aldehyde on the amino groups of the enzyme previously fixed on the coupling agent and allows the subsequent immobilization of a second layer of enzymes.
  • the precursor (s) of silica are chosen from tetramethoxyorthosilane (TMOS), tetraethoxyorthosilane (TEOS), dimethyldiethoxysilane (DMDES), mixtures of DMDES with TEOS or TMOS, mixtures of TMOS. or TEOS with ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane, and mixtures of DMDES or ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane with a silicate.
  • TMOS tetramethoxyorthosilane
  • TEOS tetraethoxyorthosilane
  • DMDES dimethyldiethoxysilane
  • the silica precursor is TEOS.
  • the concentration of precursor (s) of silica oxide in the aqueous solution is preferably greater than 10% by weight relative to the weight of the aqueous phase. This concentration varies more preferably from 17 to 35% by weight relative to the mass of the aqueous phase.
  • the oily phase of the emulsion prepared in step 1) is preferably constituted by one or more compounds chosen from linear or branched alkanes having at least 12 carbon atoms. By way of example, mention may be made dodecane and hexadecane.
  • the oily phase may further consist of a silicone oil of low viscosity, that is to say less than 400 centipoise.
  • the amount of oily phase present within the emulsion can be adjusted as a function of the diameter of the macropores that one wishes to obtain for the silica matrix, it being understood that the higher the volume fraction oil / water, the larger the diameter of the oil droplets within the emulsion will be low and the diameter of the macropores will be low also.
  • the oily phase represents from 60 to 90% by volume relative to the total volume of the emulsion. This amount of oil makes it possible to obtain a silica matrix in which the mean diameter of the macropores varies from approximately 1 to 100 ⁇ .
  • the surfactant compound may be a cationic surfactant chosen in particular from tetradecyltrimethylammonium bromide (TTAB), dodecyltrimethylammonium bromide or cetyltrimethylammonium bromide.
  • TTAB tetradecyltrimethylammonium bromide
  • the reaction medium is brought to a pH of less than 3, preferably less than 1. Tetradecyltrimethylammonium bromide is particularly preferred.
  • the surfactant compound may finally be a nonionic surfactant chosen from ethoxylated head surfactants and nonylphenols.
  • ethoxylated head surfactants and nonylphenols there may be mentioned in particular block copolymers of ethylene glycol and propylene glycol sold for example under the trade names Pluronic® PI 23 and Pluronic® F 127 by BASF.
  • the reaction medium is brought to a pH of greater than 10 or less than 3, preferably less than 1, and preferably also contains sodium fluoride in order to improve the condensation of the precursors of silica oxide.
  • the total amount of surfactant present in the emulsion can also be adjusted as a function of the diameter of the macropores that it is desired to obtain in the silica impression. This amount is also variable depending on the nature of the surfactant used.
  • the amount of surfactant varies from 1 to 10% by weight, preferably from 3 to 6% by weight, relative to the total weight of the emulsion.
  • the condensation step of the silica oxide precursor (s) is advantageously carried out at a temperature close to ambient temperature.
  • the duration of this step can vary from a few hours (2 to 3 hours) to a few weeks (2 to 3 weeks) depending on the pH of the reaction medium.
  • the organic solvent used for washing the silica matrix obtained at the end of the first stage is chosen from tetrahydrofuran, acetone and their mixtures.
  • the solvent of the coupling agent solution used during the functionalization step 2) is an organic solvent, preferably chosen from chloroform, toluene and their mixtures.
  • said solvent is chloroform.
  • the amount of coupling agent in the solution used for the functionalization step may be adjusted according to the diameter of the macropores of the silica monolith and the amount of enzyme that it is desired to immobilize. In general, this amount may vary from 0.02 M to 0.5 M, and preferably from 0.05 M to 0.2 M.
  • a 0.05 M coupling agent solution in chloroform is used.
  • the monolith functionalized by the coupling agent, as obtained at the end of step 2) of functionalization is washed, under continuous flow, with a organic solvent such as for example tetrahydrofuran, chloroform or acetone, and then with distilled water.
  • a organic solvent such as for example tetrahydrofuran, chloroform or acetone
  • the monolith is preferably washed, in continuous flow, with distilled water.
  • the heterogeneous enzymatic catalyst according to the present invention can be used for carrying out heterogeneous phase catalysed chemical reactions in a continuous flow.
  • the nature of the chemical reactions that can be catalysed by the catalyst according to the invention will of course vary depending on the nature of the unpurified enzyme which is immobilized.
  • the catalyst according to the invention is used to catalyze the hydrolysis of triglycerides of fatty acids, esterification reactions between an acid and an alcohol, transesterification reactions between a ester and an alcohol, inter-esterification reactions between two esters or reactions of transfer of an acetyl group from an ester to an amine or a thiol.
  • said catalyst can be used, for example, to catalyze:
  • butyloleate which is a lubricant for biodiesels
  • hydrolysis of glycerolinoleic ester derivatives to lead to soaps or detergents
  • the present invention relates to a heterogeneous enzymatic catalysis method implementing said catalyst. This process is characterized in that it is carried out by passing a liquid reaction medium in ascending flow through said heterogeneous catalyst.
  • the flow rate may vary depending on the nature of the immobilized enzyme in the catalyst. In general, the flow rate varies from 0.02 to 0.2 mL / min.
  • the heterogeneous catalysis process is a process for producing biodiesel, while the reaction medium comprises triglycerides of fatty acids and the enzyme incorporated in the heterogeneous catalyst is a lipase.
  • the present invention is illustrated by the following exemplary embodiments, to which it is however not limited.
  • TTAB tetradecyltrimethylammonium bromide
  • TEOS Tetraethoxyorthosilane 98%
  • Coupling agent ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane sold under the trade name Glymo by Sigma Aldrich (St-Louis, MO); Candida Rugosa Lipase, EC3.1.1.3, Type VII, 700 U / mg, Sigma Chemical Company (St. Louis, MO);
  • Thermomyces Lanuginosus Lipase at least 100,000 U / g solution, Sigma Aldrich Company (St. Louis, MO);
  • the macroporosity was qualitatively characterized by a scanning electron microscopy (SEM) technique using a scanning electron microscope sold under the reference JSM-840A by JEOL, operating at 10 kV.
  • SEM scanning electron microscopy
  • the macroporosity was quantified by mercury intrusion measurements, using a device marketed under the name Micromeritics Autopore IV, to reach the characteristics of the macroscopic cells composing the monolith skeleton.
  • the mesoporosity was characterized qualitatively by a transmission electron microscopy (TEM) technique using a microscope sold under the reference H7650 by the company Hitachi, having an acceleration voltage of 80 kV, and coupled to a camera sold under the reference Orius 1 1 MPX by Gatan Inc.
  • TEM transmission electron microscopy
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the flow rate of the liquid phase was set at 1 ml / min and the volume of the samples injected was 20 ⁇ l.
  • the catalyzed esterification reactions were monitored using a refractometer sold under the reference 410 by the company Waters (Milford, MA, USA).
  • a refractometer sold under the reference 410 by the company Waters (Milford, MA, USA).
  • UV diode array ultraviolet
  • WAT996, Waters, Milford, MA, USA The measurements were made at a wavelength of 204 nm, which corresponded to the maximum absorbance.
  • TEOS aqueous solution of 35% TTAB previously acidified with 7 g of a 37% concentrated hydrochloric acid solution.
  • the hydrolysis was allowed to proceed with stirring for about 5 minutes until a monophasic hydrophilic medium (aqueous phase of the emulsion) was obtained.
  • 35.0 g of dodecane (oily phase of the emulsion) were then added to this aqueous phase dropwise with stirring.
  • the emulsion was then allowed to condense as a silica monolith for 1 week at room temperature.
  • the silica monolith thus synthesized has then washed for 4 days by continuous circulation of a tetrahydrofuran / acetone mixture (50/50: v / v) at a rate of 0.1 mL / min in order to extract the oily phase of the monolith.
  • the monolith obtained is free of micropores.
  • the silica monolith obtained above in the previous step was then functionalized with Glymo.
  • the monolith was then washed with chloroform, then with acetone, and finally with water in a continuous flow at a rate of 0.5 ml.mn -1 .
  • the chromatography column impregnated with the lipase solution was then allowed to stand for 1 month at 4 ° C.
  • the chromatography column containing the monolith was then washed, in ascending flow, with distilled water, to completely eliminate the lipases that would not have been immobilized in the macropores of the monolith.
  • the follow-up of total lipase elimination was performed by the Bradford method, which is a colorimetric protein assay, based on the change in absorbance (measured at 595 nm), manifested by the change in Coomassie blue color after binding (complexation) with the aromatic amino acids (tryptophan, tyrosine and phenylalanine) and the hydrophobic amino acid residues present in the protein (s) (Bradford M, Anal Biochem., 1976, 72, 248). 254).
  • the Bradford method is a colorimetric protein assay, based on the change in absorbance (measured at 595 nm), manifested by the change in Coomassie blue color after binding (complexation) with the aromatic amino acids (tryptophan, tyrosine and phenylalanine) and the hydrophobic amino acid residues present in the protein (s) (Bradford M, Anal Biochem., 1976, 72, 248). 254).
  • the chromatography column was then washed with heptane in a continuous flow at a rate of 0.1 ml.mn -1 .
  • a heterogeneous catalyst according to the invention was obtained (MSi-Glymo- RQ, that is to say an alveolar silica monolith containing macropores and mesopores, free of micropores, and whose macropores contained a lipase immobilized by In this monolith, the macropores had dimensions ranging from 10 to 50 ⁇ approximately.
  • the chromatography column containing the monolith was then impregnated by circulating in a closed loop of 200 ml of a 5% (w / v) aqueous solution of glutaraldehyde, under a continuous rising flow at a rate of 0.1 ml / ml. 1 for 3 days at room temperature.
  • the chromatography column containing the monolith was then impregnated with a new lipase solution TL (4 g of lipase per 200 ml of distilled water) under the same conditions as above.
  • the chromatography column was then washed with distilled water until the Bradford absorbance had disappeared to completely eliminate the non-immobilized lipases and then with heptane (0.1 mL.mn -1). continuous upward flow), for 3 days.
  • a heterogeneous catalyst according to the invention (MSi-Glymo- ⁇ TL), that is to say an alveolar silica monolith containing macropores and mesopores, free of micropores, and whose macropores contained a lipase, was obtained. immobilized through the Glymo. In this monolith, the macropores had dimensions ranging from 10 to 50 ⁇ approximately.
  • the esterification reaction was thus carried out continuously for a total period of 50 days.
  • FIG. 2 represents a photograph of the whole of the reaction device (FIG. 2a), of the solid catalyst according to the invention after 60 days of continuous flow reaction: inside its mold and the column of chromatography (2b and 2c) and solid catalyst after 50 days of continuous flow catalysis, after having removed it from its mold (2d). It is noted that after 50 days of use in continuous flow, the integrity of the monolith is preserved.
  • FIG. 3 shows SEM images of the catalyst in section after 50 days of continuous flow reaction, washing with distilled water and lyophilization (magnification x 200: 3a, magnification x 800: 3b and magnification x 1500: 3c). . It is also noted that the macroporous structure of the monolith is preserved. In FIGS. 3a and 3b, the interconnected macropores of the monolith can be observed. In Figure 3c, the white arrow represents the inner cell junction, while the black dashed arrow represents the outer cell junction.
  • FIG. 4a shows the rate of formation of the oleic acid butyl ester (3), expressed as a percentage, as a function of time in days.
  • Figure 4b shows the enzymatic activity of the catalyst (in mol / min / mg / l ) as a function of time in days.
  • the results presented in this figure show that after 50 days of reaction, the activity of the The enzyme is still equal to 50% of the initial activity, which is unprecedented for an enzymatic catalyst used in continuous flow.
  • This reaction leads to the formation of the ethyl ester of linoleic acid (5) and glycerol (6).
  • Such a reaction is used for the production of biodiesels which are methyl or ethyl esters of vegetable oils.
  • reaction medium containing 38% by weight of safflower oil, 12% by weight of ethanol and 50% by weight of heptane was prepared.
  • the reaction medium was passed in ascending flow at 40 ° C. for the first 10 days and then at 50 ° C. the following days, in the chromatography column equipped with the MSi-Glymo-17 ⁇ catalyst as prepared above.
  • Example 2 and at a rate of 0.05 mL.mn -1
  • the formation of the ester (5) was followed by HPLC.
  • the esterification reaction was thus carried out continuously for a total period of 60 days.

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Abstract

La présente invention est relative à un catalyseur enzymatique hétérogène constitué d'un monolithe de silice macroporeux incorporant une enzyme immobilisée par l'intermédiaire d'un agent de couplage, à un procédé de préparation de ce catalyseur enzymatique, à l'utilisation de ce catalyseur pour la réalisation de réactions chimiques par catalyse enzymatique hétérogène en flux continu et à un procédé de catalyse enzymatique hétérogène en flux continu mettant en œuvre ledit catalyseur.

Description

CATALYSEUR ENZYMATIQUE HETEROGENE, PROCEDE DE PREPARATION ET UTILISATION POUR LA CATALYSE ENZYMATIQUE EN FLUX CONTINU
La présente invention est relative à un catalyseur enzymatique hétérogène constitué d'un monolithe de silice macroporeux incorporant une enzyme immobilisée par l'intermédiaire d'un agent de couplage, à un procédé de préparation de ce catalyseur enzymatique, à l'utilisation de ce catalyseur pour la réalisation de réactions chimiques par catalyse enzymatique hétérogène en flux continu et à un procédé de catalyse enzymatique hétérogène en flux continu mettant en œuvre ledit catalyseur.
Etant donné que les carburants dérivés du pétrole sont des sources d'énergie non renouvelable et que leur utilisation génère une accumulation de dioxyde de carbone, de polluants et de composés potentiellement cancérigènes dans l'environnement, des efforts considérables ont été déployés pour développer des carburants « verts » alternatifs, c'est-à-dire des carburants renouvelables, biodégradables et non toxiques. Dans ce contexte, le biodiesel (esters méthyliques ou éthyliques d'acides gras), carburant naturel obtenu à partir de végétaux ou d'huiles végétales usagées, a suscité une attention considérable au cours des dix dernières années. Le biodiesel est obtenu par transestérification des triglycérides des huiles végétales avec un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol. Les triglycérides des huiles sont des esters de glycérol (encore désigné sous le nom de glycérine) et d'acides gras -COOH.
A titre d'exemple, la réaction de transestérification des triglycérides des huiles par le méthanol peut être représentée par le schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000002_0001
Triglycérides Méthanol Glycérol Esters méthyliques
Il est existe deux grands types de procédé de production de biodiesel : les procédés de catalyse en phase homogène, mettant en œuvre des catalyseurs solubles dans le milieu réactionnel et les procédés de catalyse en phase hétérogène mettant en œuvre des catalyseurs non solubles dans le milieu réactionnel.
A l'heure actuelle, la production de biodiesel est principalement réalisée par catalyse en phase homogène. Elle consiste à réaliser la transestérification des triglycérides en présence de catalyseurs acides tels que des acides minéraux (HC1, H2SO4) ou des acides sulfoniques, ou bien des catalyseurs basiques tels que des hydroxydes, des alcoolates, des savons de métaux alcalins ou alcalino-terreux ou bien encore des aminés de la famille des guanidines par exemple. Une plus grande réactivité est généralement obtenue en milieu basique. Les catalyseurs acides sont moins souvent utilisés du fait de leur moindre réactivité (ils sont environ 4000 fois moins rapides que les catalyseurs basiques) et des risques élevés de corrosion des installations industrielles. Ces procédés peuvent être mis en œuvre en flux discontinus ou en flux continus. Bien que les procédés de production de biodiesel par catalyse en phase homogène alcaline soient peu chers à mettre en œuvre et très réactifs, ils présentent cependant l'inconvénient majeur d'être très consommateurs en énergie. De plus, la présence à la fois d'eau et d'acides gras dans le milieu réactionnel génère une réaction partielle de saponification entraînant une perte de l'efficacité catalytique (H. Fukuda et al, Journal of Bioscience and Bioengineering, 2001, 92, 405-416).
Récemment, des procédés de transestérification enzymatique mettant en œuvre une lipase ont été présentés comme une alternative intéressante pour la synthèse du biodiesel car ces procédés permettent de s'affranchir des inconvénients rencontrés avec le procédé de catalyse homogène (M.S. Antczak et al., Renewable Energy, 2009, 34, 1 185-1 194). Les lipases permettent de catalyser l'hydrolyse des huiles végétales de façon spécifique et en conditions douces, d'une part en libérant du glycérol et d'autre part, en présence d'un alcool à chaîne courte, de favoriser la formation d'esters à chaînes linéaires. De plus, à l'issue de la réaction, il est facile de récupérer le glycérol, qui est le sous produit de la réaction de transestérification, et la purification des esters d'acides gras est simple à réaliser.
Le principal obstacle à l'industrialisation de ces procédés est le coût de production des enzymes, ainsi que le contrôle rigoureux des paramètres réactionnels pendant la réaction de transestérification.
Une des solutions à ce problème consiste à immobiliser les enzymes sur un support solide. On parle alors de catalyse enzymatique hétérogène. La catalyse enzymatique hétérogène consiste à réaliser la transestérification des triglycérides des huiles végétales en présence d'un catalyseur insoluble dans le milieu réactionnel. La catalyse enzymatique hétérogène présente des avantages significatifs en matière de respect de l'environnement. En particulier, elle répond aux critères associés aux nouveaux concepts de « chimie verte », car la pureté des produits obtenus, associée à des rendements de synthèse élevés, conduit à une disparition pratiquement totale de rejets polluants. De plus, l'absence de sels dans les produits de réaction, n'impose pas, à la différence de la catalyse en phase homogène, des traitements coûteux de purification, et élargit les possibilités de débouchés industriels.
Il a par exemple déjà été proposé, notamment par Chen G. et al., Biodiesel. AppL, Biochem. Biotech., 2006, 132 (1-3), 91 1-921, un procédé de conversion d'huiles de cuisson en biodiesel par une lipase de Rhizopus orzyae immobilisée sur un support solide. Les auteurs indiquent que dans les conditions les plus optimales, le taux de conversion en esters méthylique est de 88-90 %. La nature du support solide sur lequel la lipase est immobilisée n'est pas indiquée dans cet article. Plus récemment, Li et al., Process Biochem., 2009, 44 (6), 685-688, ont proposé un procédé de conversion enzymatique d'huiles de cuisson en biodiesel en milieu solvant organique utilisant une lipase de Pénicillium expansum adsorbée dans un gel de silice. Les auteurs indiquent cependant que la présence de l'eau issue de la réaction d'estérification nuit à l'obtention d'un taux élevé en esters méthyliques.
Les différents systèmes catalytiques enzymatiques actuellement proposés sont constitués d'un support solide généralement poreux (matrices polymères, silice colloïdale, silicate de calcium, zéolithes, zirconium, kaolinite, verre poreux, alumine, etc .), sur lequel une enzyme est immobilisée. Les supports solides des catalyseurs mis en œuvre en catalyse hétérogène sont notamment des zéolites acides, des hétéropolyacides, des résines échangeuses ions et des acides sulfoniques immobilisés sur des supports solides, des zircones sulfatées et des oxydes métalliques mixtes. Le plus souvent, les catalyseurs solides dans lesquels le support solide est une zéolithe se présentent sous la forme de poudre et doivent être dispersés dans le milieu réactionnel dans lequel ils doivent être présents pour catalyser une réaction. Compte tenu de la petite taille des particules, la récupération de ces catalyseurs dans le milieu réactionnel est une étape contraignante. Les autres supports solides utilisables en catalyse hétérogène ne donnent par ailleurs pas entièrement satisfaction d'un point de vue de leur résistance mécanique et à la température.
Afin d'atteindre des niveaux de production élevés, notamment en biodiesel, il est important de pouvoir faire fonctionner ces catalyseurs hétérogènes en flux continu.
Or, tous les supports solides sur lesquels il est possible d'immobiliser des enzymes ne sont cependant pas compatibles avec un procédé de catalyse hétérogène en flux continu. Par ailleurs, les supports utilisables en flux continu ne permettent pas toujours d'atteindre des taux de conversion élevés et stables dans le temps. En effet, la première condition sine qua none est d'avoir un matériau monolithique. La seconde condition est que ce matériau ait une macroporosité interconnectée de façon à permettre l'écoulement du milieu réactionnel. La troisième condition est que les propriétés mécaniques du monolithe supportent le flux imposé et la température sur longue durée.
Il existe donc un besoin pour un catalyseur enzymatique hétérogène :
qui soit utilisable dans un procédé de catalyse en flux continu (ne nécessitant pas d'étape de régénération intermédiaire), notamment pour catalyser la production de biodiesel par transestérification des triglycérides d'acides gras présents dans les huiles végétales ;
qui soit utilisable sur une longue durée sans perte significative de l'activité catalytique ;
qui puisse être préparé selon un procédé simple à mettre en œuvre, qui permettent l'utilisation d'enzymes non purifiées avec une très grande efficacité catalytique.
Ce but atteint par le catalyseur enzymatique hétérogène qui fait l'objet de la présente invention et qui va être décrit ci-après.
La présente invention a pour objet un catalyseur enzymatique hétérogène caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice, ledit monolithe étant exempt de micropores et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 μηι à 100 μηι et des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm, lesdits macropores étant interconnectés, et dans lequel la surface interne des macropores est fonctionnalisée par un agent de couplage choisi parmi les silanes sur lequel est fixée une enzyme, par l'intermédiaire d'une liaison covalente ou électrostatique.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'enzyme immobilisée est une enzyme non purifiée. En effet, ainsi que cela est démontré dans les exemples illustrant la présente demande, l'utilisation d'un tel monolithe rend possible la mise en œuvre d'une enzyme non purifiée pour la catalyse en flux continu d'une réaction chimique, et tout particulièrement, lorsque l'enzyme est une lipase, d'une réaction de transestérification des triglycérides d'acides gras.
Au sens de la présente invention, on entend par « enzyme non purifiée », tout matériel protéique comprenant au moins une enzyme non isolée, n'ayant subi aucune étape de purification. On entend par « monolithe », un objet solide ayant une dimension moyenne d'au moins 1 mm.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la dimension moyenne dA des macropores varie de 10 à 100 μηι, et encore plus préférentiellement de 20 à 70 μηι environ. Le procédé de préparation des monolithes conformes à l'invention présente l'avantage de ne pas nécessiter d'étape de frittage qui entraînerait un rétrécissement de la dimension des macropores. Ainsi, le procédé de préparation conforme à l'invention et qui va être décrit ci-après permet d'aboutir à des monolithes dans lesquels les macropores présentent de préférence les dimensions indiquées ci-dessus, celles-ci étant particulièrement bien adaptées à la réalisation de catalyse enzymatique en flux continu.
Dans ce monolithe, les parois des macropores ont généralement une épaisseur de 0,5 à 40 μηι, et de préférence de 2 à 25 μηι.
La surface spécifique du monolithe est généralement de 200 à 1000 m2/g environ, préférentiellement de 100 à 300 m2/g environ.
Selon l'invention, la liaison assurant la fixation de l'agent de couplage avec la silice est une liaison iono-covalente.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'agent de couplage est choisi parmi les silanes choisis dans le groupe constitué par le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane ; les liquides ioniques silylés tels que par exemples le chlorure de l-méthyl-3-(3-triéthoxysilylpropyl)imidazolium, l'hexafluorophosphate de l-méthyl-3-(3-triéthoxysilylpropyl)imidazolium ; les silanes de formule Si(O 2)3 3 dans laquelle R2 représente un groupement alkyle en Ci-C2, et R3 représente un groupement -(CH2OH-CH2OH)q-CH2OH ou -(CH2OH-CH2OH)q-CH2CH3 dans lesquels q est un nombre entier variant de 1 à 10.
Parmi de tels silanes, le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane, également connu sous la dénommination « Glymo », est particulièrement préféré.
La nature de l'enzyme pouvant être immobilisée sur le monolithe de silice par l'intermédiaire de l'agent de couplage n'est pas critique à partir du moment où elle comporte au moins un groupement fonctionnel apte à réagir avec un groupement fonctionnel complémentaire porté par l'agent de couplage pour former une liaison iono-covalente. Lorsque l'agent de couplage utilisé est un liquide ionique silylé, il s'agit de liaisons électrostatiques. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, l'enzyme est choisie parmi :
i) les hydrolases (classe E.C. 3 de la classification établie par la Commission des Enzymes, Bruxelles), telles que les estérases (E.C. 3.1), et en particulier les hydrolases d'esters carboxyliques (E.C. 3.1.1) telles que les lipases (E.C. 3.1.1.3 ou triacylglycérol acylhydrolases) ; les amino-acylases (E.C. 3.5.1.14), les amidases (E.C. 3.5.1.4 ; E.C. 3-5-1-3 ou oméga-amidase ; E.C. 3-5-1-1 1 ou pénicilline - amidase) ; les nitrilases (classe E.C. 3.5.5.1.) qui catalysent l'hydrolyse des nitriles en acides carboxyliques ;
ii) les lyases (classe E.C. 4) comprenant notamment les carboxy-lyases (E.C. 4.1.1), les aldéhydes-lyases (E.C. 4.1.2.) telles que les oxynitrilases (classes E.C. 4-1-2-10 et E.C. 4-1-2-37) catalysant la synthèse de cyanohydrines chirales ; et les hydro-lyases (E.C. 4.2.1) ;
iii) les isomérases (E.C. 5) comprenant notamment les épimérases et les racémases (E.C. 5.1.), et en particulier les épimérases et les racémases de la classe E.C. 5.1.1. catalysant la formation d'énantiomères d'amino-acides ; et
iv) les oxydoréductases (E.C. 1) comprenant notamment les glucose oxydases (E.C. 1.1.3.4) telles que la glucose oxydase d' Aspergillus niger et les peroxydases (E.C. 1.1 1.1) telles que la peroxydase de raifort.
Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, le catalyseur hétérogène est destiné à être utilisé dans un procédé de production de biodiesel par transestérification de triglycérides d'acides gras et l'enzyme est choisie parmi les lipases d'origine microbienne ou végétale, et en particulier, parmi les lipases de Candida Rugosa, Candida antartica, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Thermomyces Lanuginosus, Chromobacterium viscosum, Rhizomucor miehei, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Pénicillium roqueforti, Pénicillium expansum, Rhizopus arrhizus et les lipases de germe de blé.
La quantité d'enzymes immobilisée au sein du catalyseur conforme à l'invention peut être déterminée par analyse thermogravimétrique et par analyse élémentaire. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la quantité d'enzyme immobilisée varie de 1 à 40 % massique environ et plus préférentiellement de 3 à 20 % massique environ par rapport à la masse totale du catalyseur. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un catalyseur enzymatique hétérogène conforme à l'invention et tel que défini ci-dessus, ledit procédé comportant les étapes suivantes :
1) une première étape de préparation d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice, ledit monolithe étant exempt de micropores et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 μηι à 100 μηι et des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm, lesdits pores étant interconnectés, ladite première étape comprenant les sous-étapes suivantes :
la) la préparation d'une émulsion en introduisant une phase huileuse dans une solution aqueuse de tensioactif,
lb) l'ajout d'une solution aqueuse d'au moins un précurseur d'oxyde de silice à la solution de tensioactif, avant ou après la préparation de l'émulsion,
le) l'introduction du mélange réactionnel dans un moule,
ld) le repos du mélange réactionnel dans le moule jusqu'à la condensation dudit précurseur de silice sous la forme dudit monolithe,
ld) le lavage dudit monolithe, en flux continu, avec un solvant organique ;
2) une deuxième étape de fonctionnalisation de la surface interne des macropores par un agent de couplage choisi parmi les silanes, par imprégnation du monolithe alvéolaire, en flux continu, par une solution de l'agent de couplage dans un solvant organique ; et
3) une troisième étape d'immobilisation d'au moins une enzyme sur l'agent de couplage par l'intermédiaire d'une liaison covalente, par imprégnation du monolithe ainsi fonctionnalisé, en flux continu, par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une enzyme.
Selon une forme particulière et préférée de l'invention, le moule utilisé lors de la première étape est lui-même confiné à l'intérieur d'un dispositif permettant la circulation d'un liquide en flux continu, tel que par exemple une colonne de chromatographie .
Selon le procédé conforme à l'invention, aucune étape de frittage de la matrice de silice n'est requise, ce qui permet d'accéder à des monolithes dans lesquels la dimension des macropores varie préférentiellement de 10 à 100 μηι, et encore plus préférentiellement de 20 à 70 μηι. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les flux continus mentionnés aux étapes 2) et 3) dudit procédé sont des flux continus ascendants de façon à optimiser la répartition de l'agent de couplage, puis de l'enzyme dans l'ensemble du volume des macropores du monolithe de silice alvéolaire.
Au cours des étapes 2) et 3), la vitesse du flux varie de préférence de 0,02 à 0,1 mL/min.
L'étape 2) de fonctionnalisation est de préférence réalisée à température ambiante, et pendant une durée de 24 heures et encore plus préférentiellement pendant une durée d'environ 72 heures.
L'étape 3) d'immobilisation est de préférence réalisée à température ambiante, et pendant une durée de 72 heures et encore plus préférentiellement pendant une durée d'environ 120 heures (5jours). Eventuellement, cette étape peut être réitérée deux fois. Dans ce cas, le procédé comprend en outre, avant la réalisation de l'étape 3) pour la seconde fois, une étape supplémentaire d'imprégnation du monolithe en flux continu par une solution d'un aldéhyde, tel que par exemple le glutaraldéhyde. Cette étape entraîne la fixation de l'aldéhyde sur les groupements aminés de l'enzyme préalablement fixée sur l'agent de couplage et permet l'immobilisation subséquente d'une deuxième couche d'enzymes.
Selon l'invention, le ou les précurseur(s) de silice sont choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane (TMOS), le tetraéthoxyorthosilane (TEOS), le diméthyldiéthoxysilane (DMDES), les mélanges du DMDES avec le TEOS ou le TMOS, les mélanges du TMOS ou du TEOS avec le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane, et les mélanges du DMDES ou du γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane avec un silicate.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, le précurseur de silice est le TEOS.
La concentration en précurseur(s) d'oxyde de silice au sein de la solution aqueuse est, de préférence, supérieure à 10 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse. Cette concentration varie plus préférentiellement de 17 à 35 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse.
La phase huileuse de l'émulsion préparée à l'étape 1) est de préférence constituée par un ou plusieurs composés choisis parmi les alcanes linéaires ou ramifiés ayant au moins 12 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer le dodécane et l'hexadécane. La phase huileuse peut en outre être constituée par une huile de silicone de faible viscosité, c'est-à-dire inférieure à 400 centipoise.
La quantité de phase huileuse présente au sein de l'émulsion peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir pour la matrice de silice, étant entendu que plus la fraction volumique huile/eau sera élevée, plus le diamètre des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion sera faible et plus le diamètre des macropores sera faible également.
De manière générale, la phase huileuse représente de 60 à 90 % en volume par rapport au volume total de l'émulsion. Cette quantité d'huile permet d'obtenir une matrice de silice dans laquelle le diamètre moyen des macropores varie de 1 à 100 μηι environ.
Le composé tensioactif peut être un tensioactif cationique choisi notamment parmi le bromure de tetradécyltriméthylammonium (TTAB), le bromure de dodécyltriméthylammonium ou le bromure de cétyl-triméthylammonium. Lorsque le composé tensioactif est cationique, le milieu réactionnel est porté à un pH inférieur à 3, de préférence inférieur à 1. Le bromure de tetradécyltriméthylammonium est particulièrement préféré.
Le composé tensioactif peut enfin être un tensioactif non ionique choisi parmi les tensioactifs à tête éthoxylée, et les nonylphénols. Parmi de tels tensioactifs, on peut en particulier citer les copolymères blocs d'éthylèneglycol et de propylèneglycol vendus par exemple sous les dénominations commerciales Pluronic® PI 23 et Pluronic® F 127 par la société BASF. Lorsque le composé tensioactif est non ionique, le milieu réactionnel est porté à un pH supérieur à 10 ou inférieur à 3, de préférence inférieur à 1 et contient en outre, de préférence, du fluorure de sodium afin d'améliorer la condensation des précurseurs de l'oxyde de silice.
La quantité totale de tensioactif présente au sein de l'émulsion peut également être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir dans l'empreinte de silice. Cette quantité est également variable en fonction la nature du tensioactif utilisé.
De manière générale, la quantité de tensioactif varie de 1 à 10 % en masse, de préférence de 3 à 6 % en masse, par rapport à la masse totale de l'émulsion.
L'étape de condensation du ou des précurseur(s) d'oxyde de silice est effectuée avantageusement à une température proche de la température ambiante. La durée de cette étape peut varier de quelques heures (2 à 3 heures) à quelques semaines (2 à 3 semaines) en fonction du pH du milieu réactionnel.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, le solvant organique utilisé pour le lavage de la matrice de silice obtenue à la fm de la première étape est choisi parmi le tetrahydrofurane, l'acétone et leurs mélanges.
Le solvant de la solution d'agent de couplage utilisé lors de l'étape 2) de fonctionnalisation est un solvant organique, de préférence choisi parmi le chloroforme, le toluène et leurs mélanges. De façon préférentielle, ledit solvant est le chloroforme.
La quantité d'agent de couplage dans la solution utilisée pour l'étape de fonctionnalisation peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores du monolithe de silice et de la quantité d'enzyme que l'on souhaite immobiliser. De manière générale, cette quantité peut varier de 0,02 M à 0,5 M, et de préférence de 0,05 M à 0,2 M.
Selon une forme de réalisation particulière et préférée de l'invention, on utilise une solution d'agent de couplage à 0,05 M dans le chloroforme.
Selon une forme de réalisation préférée du procédé conforme à l'invention, le monolithe fonctionnalisé par l'agent de couplage, tel qu'obtenu à l'issue de l'étape 2) de fonctionnalisation, est lavé, sous flux continu, avec un solvant organique tel que par exemple le tetrahydrofurane, le chloroforme ou l'acétone, puis ensuite à l'eau distillée.
Egalement de manière préférée, à la fm de l'étape 3) d'immobilisation, le monolithe est de préférence lavée, en flux continu, avec de l'eau distillée.
Le catalyseur enzymatique hétérogène conforme à la présente invention peut être utilisé pour la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène en flux continu. La nature des réactions chimiques susceptibles d'être catalysées par le catalyseur conforme à l'invention variera bien entendu en fonction de la nature de l'enzyme non purifiée qui est immobilisée.
Ainsi lorsque l'enzyme non purifiée est une lipase, le catalyseur conforme à l'invention est utilisé pour catalyser l'hydrolyse de triglycérides d'acides gras, des réactions d'estérification entre un acide et un alcool, des réactions de transestérification entre un ester et un alcool, des réactions d'inter-estérification entre deux esters ou des réactions de transfert d'un groupement acétyle d'un ester sur une aminé ou sur un thiol. En particulier, lorsque l'enzyme est une lipase, ledit catalyseur peut être utilisé par exemple pour catalyser :
la synthèse du butyloléate qui est un lubrifiant pour les biodiesels ; l'hydrolyse des dérivés de l'ester glycérolinoléique pour conduire à des savons ou à des détergents :
des réactions de trans-estérification de triglycérides d'acides gras par un alcool, lesdites réactions étant impliquées dans la synthèse de biodiesels à faible viscosité.
Enfin la présente invention a pour objet un procédé de catalyse enzymatique hétérogène mettant en œuvre ledit catalyseur. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il est réalisé par passage d'un milieu réactionnel liquide en flux continu ascendant au travers dudit catalyseur hétérogène.
La vitesse du flux peut varier en fonction de la nature de l'enzyme immobilisée dans le catalyseur. De façon générale, la vitesse du flux varie de 0,02 à 0,2 mL/min.
Selon une forme de réalisation particulière et préférée de l'invention, le procédé de catalyse hétérogène est un procédé de production de biodiésel, alors milieu réactionnel comprend des triglycérides d'acides gras et l'enzyme incorporée dans le catalyseur hétérogène est une lipase.
La présente invention est illustrée par les exemples de réalisation suivants, auxquels elle n'est cependant pas limitée.
EXEMPLES
Les matières premières utilisées dans les exemples qui suivent sont listées ci-après :
- Bromure de tetradécyltriméthylammonium à 98 % (TTAB) : société Fluka ;
- Tetraéthoxyorthosilane à 98 % (TEOS) : société Fluka ;
- Dodécane à 99 % : société Fluka ;
- Agent de couplage : γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane vendu sous la dénomination commerciale Glymo par la société Sigma Aldrich (St-Louis, MO) ; - Lipase de Candida Rugosa, E.C.3.1.1.3, Type VII, à 700 U/mg, Société Sigma Chemical (St Louis, MO) ;
- Lipase de Thermomyces Lanuginosus, solution à au moins 100000 U/g, société Sigma Aldrich (St. Louis, MO) ;
- Acide oléique, trilinoléate de glycéryle (98 %), linoléate d'éthyle (> 98%), acide linoléique (> 99 %), n-heptane, éthanol, 1-butanol, Société Sigma Aldrich (Paris, France).
Les autres produits chimiques et solvants utilisés dans les exemples étaient tous de grade analytiques ou de grade HPLC.
Ces matières premières ont été utilisées telles que reçues des fabricants, sans purification supplémentaire.
Caractérisations :
La macroporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique de microscopie électronique à balayage (MEB) à l'aide d'un microscope électronique à balayage vendu sous la référence JSM-840A par la société JEOL, fonctionnant à 10 kV. Les échantillons ont été revêtus d'or ou de carbone avant leur caractérisation.
La macroporosité a été quantifiée par des mesures d'intrusion de mercure, à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics Autopore IV, pour atteindre les caractéristiques des cellules macroscopiques composant le squelette du monolithe.
Les mesures de surface spécifique et les caractérisations à l'échelle mésoscopique ont été faites par des techniques d'adsorption-désorption d'azote à l'aide d'un appareil commercialisé sous la dénomination Micromeritics ASAP 2010 ; le dépouillement étant fait par les méthodes de calcul B.E.T ou B.J.H.
La mésoporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique de microscopie électronique à transmission (MET) à l'aide d'un microscope vendu sous la référence H7650 par la société Hitachi, ayant une tension d'accélération de 80 kV, et couplé à une caméra vendue sous la référence Orius 1 1 MPX par la société Gatan Inc.
Des analyses par chromatographie liquide haute performance (High Performance Liquid Chromatography » : HPLC) ont été réalisées sur un système équipé de pompes à solvants 600 à injection manuelle (Waters, Milford, MA, USA), en régime isocratique, et en utilisant de l'acétonitrile comme phase mobile. Les composés ont été séparés sur une colonne de chromatographie Atlantis dCi8 (4,6 mm x 150 mm, 5 μηι) avec une colonne de garde Atlantis dC18 (Waters). Les colonnes ont été utilisées à température ambiante. Le logiciel Empower® (Waters) a été utilisé pour l'acquisition et le traitement des données. Les standards ont été dissous dans le méthyléther de t-butyle (MTBE). Toutes les solutions ont été filtrées au travers d'une membrane de 0,45 μηι et dégazées avant usage. Le débit de la phase liquide a été fixé à 1 ml/min et le volume des échantillons injectés était de 20 μΐ. Les réactions catalysées d'estérification ont été suivies à l'aide d'un réfractomètre vendu sous la référence 410 par la société Waters (Milford, MA, USA). Pour la détection des produits issus des réactions catalysées d'hydrolyse et de trans-estérification, le système a été équipé d'un détecteur ultraviolet (UV) à barrettes de diodes (WAT996, Waters, Milford, MA, USA). Les mesures ont été réalisées à une longueur d'onde de 204 nm, ce qui correspondait à l'absorbance maximum. Le gradient d'élution suivant a été utilisé : (Solvant A : acétonitrile, solvant B : MTBE) : A/B : 100/0 (v/v) isocratique pendant 4 min., A/B : 70/30 (v/v) gradient pendant 2 min., A/B : 70/30 (v/v) puis A/B : 100/0 (v/v) gradient pendant 5 min. La colonne a été équilibrée dans les conditions données ci-dessus pendant 10 minutes.
Exemple 1
Préparation d'un monolithes de silice intégrant une lipase de Candida Rugosa
Dans cet exemple on illustre la préparation d'un monolithe de silice et l'immobilisation d'une lipase de Candida Rugosa dans les macropores de ce monolithe.
1) Première étape : Synthèse du monolithe de silice (MSi).
5,0 g de TEOS ont été ajoutés à 16,0 g d'une solution aqueuse de TTAB à 35 % massique préalablement acidifiée par 7 g d'une solution d'acide chlorhydrique concentré à 37 %. On a laissé l'hydrolyse se dérouler sous agitation pendant environ 5 minutes jusqu'à obtention d'un milieu hydrophile monophasique (phase aqueuse de l'émulsion). On a ensuite ajouté à cette phase aqueuse, 35,0 g de dodécane (phase huileuse de l'émulsion) au goutte à goutte et sous agitation. Le mélange a été transféré dans un récipient cylindrique en Téflon ® (L = 251 ,0 mm ; r = 9,65 mm) servant de moule macroscopique, ledit récipient étant lui-même confiné dans une colonne de chromatographie en acier de longueur utile 300 mm et de diamètre interne 19 mm vendue par la société Interchim (Montluçon, France). On a ensuite laissé l'émulsion se condenser sous forme d'un monolithe de silice pendant 1 semaine à température ambiante. Le monolithe de silice ainsi synthétisé a ensuite été lavé pendant 4 jours par circulation en flux continu d'un mélange tetrahydrofurane/acétone (50/50 : v/v) à raison de 0,1 mL/min afin d'extraire la phase huileuse du monolithe.
Le monolithe ainsi obtenu présentait les caractéristiques morphologiques suivantes :
- porosité : 94 %
- densité du monolithe : 0,07 g.cm"3
- densité du squelette de silice : 1 ,23 g.cm"3
- Surface spécifique : 210 irf.g"1 (BET) et 190 irf.g"1 (B.J.H.).
Les résultats des mesures d'intrusion au mercure effectuées sur ce monolithe sont présentés sur la figure 1 annexée sur laquelle, le volume différentiel des pores (en unités arbitraires) est fonction du diamètre des pores (en nm).
On peut constater que le monolithe obtenu est exempt de micropores.
2) Deuxième étape : Fonctionnalisation du monolithe de silice par un agent de couplage de type silane
Le monolithe de silice obtenu ci-dessus à l'étape précédente a ensuite été fonctionnalisé par du Glymo.
Pour ce faire, on a fait passer à travers la colonne de chromatographie contenant le monolithe obtenu ci-dessus à l'étape précédente, en flux continu et en circuit fermé, 200 ml d'une solution de Glymo à 0,05 M dans le chloroforme à une vitesse de 0,1 mL.min"1 pendant 3 jours.
Le monolithe a ensuite été lavé au chloroforme, puis à l'acétone, et enfin à l'eau en flux continu à une vitesse de 0,5 mL.mn"1.
On a obtenu ainsi un monolithe de silice dont la surfaces des macropores est fonctionnalisée par du Glymo (MSi-Glymo).
3) Deuxième étape : Immobilisation de la lipase dans les macropores du MSi-Glymo
500 mg de lipase non purifiée de Candida Rugosa (1CR) ont été dispersés dans 200 ml d'eau distillée et mélangés pendant une heure à température ambiante jusqu'à obtention d'une solution. L'immobilisation de la lipase dans les macropores du monolithe MSi-Glymo obtenu ci-dessus à l'étape précédente a ensuite été réalisée par mise en circulation, en circuit fermé et en flux ascendant, de la solution de lipase, à une vitesse de OJmL.mn"1 pendant 5 jours à température ambiante.
La colonne de chromatographie imprégnée de la solution de lipase a ensuite été laissée au repos pendant 1 mois à 4°C. La colonne de chromatographie renfermant le monolithe a ensuite été lavée, en flux continu ascendant, avec de l'eau distillée, pour éliminer totalement les lipases qui n'auraient pas été immobilisées dans les macropores du monolithe. Le suivi de l'élimination totale des lipases a été effectué par la méthode de Bradford, qui est un dosage colorimétrique des protéines, basé sur le changement d'absorbance (la mesure se fait à 595 nm), se manifestant par le changement de la couleur du bleu de Coomassie après liaison (complexation) avec les acides aminées aromatiques (tryptophane, tyrosine et phénylalanine) et les résidus hydrophobes des acides aminés présent dans la ou les protéines (M.M. Bradford, Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254).
La colonne de chromatographie a ensuite été lavée par de l'heptane sous flux continu à une vitesse de 0,1 mL.mn"1.
On a obtenu un catalyseur hétérogène conforme à l'invention (MSi-Glymo- ÎRQ, c'est-à-dire un monolithe de silice alvéolaire comportant des macropores et des mésopores, exempt de micropores, et dont les macropores renfermaient une lipase immobilisée par l'intermédiaire du Glymo. Dans ce monolithe, les macropores présentaient des dimensions allant de 10 à 50 μηι environ.
Exemple 2
Préparation d'un monolithes de silice intégrant une lipase de Thermomyces Lanuginosus
Dans cet exemple on illustre la préparation d'un monolithe de silice et l'immobilisation d'une lipase de Thermomyces Lanuginosus dans les macropores de ce monolithe.
4 g de lipase non purifiée de Thermomyces Lanuginosus (\TL) ont été dispersés dans 200 ml d'eau distillée et mélangés pendant une heure à température ambiante jusqu'à obtention d'une solution. L'immobilisation de la lipase dans les macropores d'un monolithe MSi-Glymo tel qu'obtenu ci-dessus à l'issue de l'étape 2) de l'exemple 1 a ensuite été réalisée par mise en circulation, en circuit fermé et en flux ascendant, de la solution de lipase, à une vitesse de 0,1 mL.mn"1 pendant 5 jours à température ambiante. La colonne de chromatographie imprégnée de la solution de lipase a ensuite été laissée au repos pendant 2 semaines à 4°C, puis lavée à l'eau jusqu'à disparition de l'absorbance selon la méthode de Bradford pour éliminer totalement les lipases non immobilisées.
La colonne de chromatographie renfermant le monolithe a ensuite été imprégnée par circulation en circuit fermé de 200 ml d'une solution aqueuse de glutaraldéhyde à 5 % (poids/volume), sous flux continu ascendant à une vitesse de 0,1 mL.mn"1 pendant 3 jours à température ambiante.
La colonne de chromatographie contenant le monolithe a ensuite à nouveau été imprégnée par une nouvelle solution de lipase \TL (4 g de lipase pour 200 mL d'eau distillée) dans les mêmes conditions que précédemment.
La colonne de chromatographie a ensuite été lavée à l'eau distillée jusqu'à disparition de l'absorbance selon la méthode de Bradford pour éliminer totalement les lipases non immobilisées, puis avec de l'heptane (0,1 mL.mn"1 en flux continu ascendant), pendant 3 jours.
On a obtenu un catalyseur hétérogène conforme à l'invention (MSi-Glymo- \TL), c'est-à-dire un monolithe de silice alvéolaire comportant des macropores et des mésopores, exempt de micropores, et dont les macropores renfermaient une lipase immobilisée par l'intermédiaire du Glymo. Dans ce monolithe, les macropores présentaient des dimensions allant de 10 à 50 μηι environ.
Exemple 3
Estérification de l'acide oléique par le 1-butanol, en présence d'un catalyseur enzymatique conforme à l'invention
Dans cet exemple on a réalisé une réaction catalysée d' estérification de l'acide oléique (1) par le 1-butanol (2) selon le schéma réactionnel suivant :
(GH2)7
° Heptane, 37°C H3C^ /^(CH2)7 0
*" (CH2)7
O
Η, /\ /OH (2) (3)
Cette réaction conduit à la formation de l'ester butylique de l'acide oléique
(3).
Un milieu réactionnel contenant 23,0 mmol.L"1 d'acide oléique (1) et
46,0 mmol.L"1 de 1-butanol (2) dans l'heptane a été préparé. Le milieu réactionnel a été passé en flux continu ascendant, à 37°C, dans la colonne de chromatographie équipée du catalyseur MSi-Glymo-lCR tel que préparé ci-dessus à l'exemple 1, et à une vitesse initiale de 0,05 mL.mn"1 pendant 20 jours, puis à une vitesse de 0,1 mL.mn"1 pendant 25 jours, et enfin à une vitesse de 0,05 mL.min"1 pendant 5 jours. La formation de l'ester (3) a été suivie par HPLC.
La réaction d'estérification a ainsi été conduite en continu pendant une durée totale de 50 jours.
La figure 2 annexée représente une photographie de l'ensemble du dispositif réactionnel (figure 2a), du catalyseur solide conforme à l'invention au bout de 60 jours de réaction en flux continu : à l'intérieur de son moule et de la colonne de chromatographie (2b et 2c) et du catalyseur solide après 50 jours de catalyse en flux continu, après l'avoir sorti de son moule (2d). On constate qu'après 50 jours d'utilisation en flux continu, l'intégrité du monolithe est conservée.
La figure 3 annexée représente des photographies prises en MEB du catalyseur en coupe après 50 jours de réaction en flux continu, lavage à l'eau distillée et lyophilisation (grossissement x 200 : 3a ; grossissement x 800 : 3b et grossissement x 1500: 3c). On constate également que la structure macroporeuse du monolithe est préservée. Sur les figures 3a et 3b, on peut observer les macropores interconnecté du monolithe. Sur la figure 3c, la flèche blanche représente la jonction cellulaire interne, tandis que la flèche noire en trait pointillé représente la jonction cellulaire externe.
Les résultats d'estérification obtenus sont reportés sur la figure 4 annexée. La figure 4a présente le taux de formation de l'ester butylique de l'acide oléique (3), exprimé en pourcentage, en fonction du temps en jours. La figure 4b présente l'activité enzymatique du catalyseur (en mol.min^.mg"1) en fonction du temps en jours. Les résultats présentés sur cette figure montrent qu'au bout de 50 jours de réaction, l'activité de l'enzyme est encore égale à 50 % de l'activité initiale, ce qui est sans précédent pour un catalyseur enzymatique utilisé en flux continu. Exemple 4
Transestérification de triglycérides d'acide linoléique contenus dans de l'huile de carthame brute en présence d'un catalyseur enzvmatique conforme à l'invention
Dans cet exemple on a réalisé la transestérification des triglycérides d'acide linoléique (4) contenus dans l'huile de carthame brute {Carthamus tinctorius) par l'éthanol (2) selon le schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000019_0001
Heptane, 40°C puis 50°C
Figure imgf000019_0002
Cette réaction conduit à la formation de l'ester éthylique de l'acide linoléique (5) et de glycérol (6). Une telle réaction est utilisée pour la production de biodiesels qui sont des esters méthyliques ou éthyliques d'huiles végétales.
Un milieu réactionnel contenant 38 % massique d'huile de carthame, 12 % massique d'éthanol et 50 % massique d'heptane a été préparé.
Le milieu réactionnel a été passé en flux continu ascendant, à 40°C les 10 premiers jours, puis à 50°C les jours suivants, dans la colonne de chromatographie équipée du catalyseur MSi-Glymo-17ï tel que préparée ci-dessus à l'exemple 2, et à une vitesse de 0,05 mL.mn"1. La formation de l'ester (5) a été suivie par HPLC.
La réaction d'estérification a ainsi été conduite en continu pendant une durée totale de 60 jours.
Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 5 annexée sur laquelle le taux de conversion en ester (5) exprimé en pourcentage est fonction du temps en jours.
Ces résultats montrent que le catalyseur hétérogène MSi-Glymo-17ï peut être utilisé en flux continu pour catalyser la transestérification des triglycérides de l'huile de carthame avec un taux de conversion qui est encore de 20 % au bout de 60 Jours. L'ensemble des résultats présentés dans ces exemples démontre que les catalyseurs enzymatiques hétérogènes conformes à l'invention permettent de catalyser diverses réactions chimiques en flux continu, avec des rendements supérieurs aux rendements habituellement obtenus dans l'art antérieur.

Claims

REVENDICATIONS
1. Catalyseur enzymatique hétérogène caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice, ledit monolithe étant exempt de micropores et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 μηι à 100 μηι et des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm, lesdits macropores étant interconnectés, et dans lequel la surface interne des macropores est fonctionnalisée par un agent de couplage choisi parmi les silanes sur lequel est fixée une enzyme, par l'intermédiaire d'une liaison covalente ou électrostatique.
2. Catalyseur selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme immobilisée est une enzyme non purifiée.
3. Catalyseur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les macropores ont une dimension moyenne dA variant de 10 à 100 μηι.
4. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit monolithe a une surface spécifique de 200 à 1000 m2/g.
5. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent de couplage est choisi parmi les silanes choisis dans le groupe constitué par le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane ; les liquides ioniques silylés et les silanes de formule Si(O 2)3 3 dans laquelle R2 représente un groupement alkyle en Ci-C2, et R3 représente un groupement -(CH2OH-CH2OH)q-CH2OH ou -(CH2OH-CH2OH)q-CH2CH3 dans lesquels q est un nombre entier variant de 1 à 10.
6. Catalyseur selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'agent de couplage est le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane.
7. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi les hydrolases, les lyases, les isomérases et les oxydoréductases.
8. Catalyseur selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'enzyme est une hydrolase choisie parmi les estérases.
9. Catalyseur selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'enzyme est une estérase choisie parmi les hydrolases d'esters carboxyliques, les amino- acylases, les amidases et les nitrilases.
10. Catalyseur selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'enzyme est choisie parmi les lipases de Candida Rugosa, Candida antartica, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Thermomyces Lanuginosus, Chromobacterium viscosum, Rhizomucor miehei, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Pénicillium roqueforti, Pénicillium expansum, Rhizopus arrhizus et les lipases de germe de blé.
1 1. Catalyseur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la quantité d'enzyme immobilisée varie de 1 à 40 % massique par rapport à la masse totale du catalyseur.
12. Procédé de préparation d'un catalyseur enzymatique hétérogène tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, ledit procédé comportant les étapes suivantes :
1) une première étape de préparation d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice, ledit monolithe étant exempt de micropores et comprenant des macropores ayant une dimension moyenne dA de 1 μηι à 100 μηι et des mésopores ayant une dimension moyenne dE de 2 à 50 nm, lesdits pores étant interconnectés, ladite première étape comprenant les sous-étapes suivantes :
la) la préparation d'une émulsion en introduisant une phase huileuse dans une solution aqueuse de tensioactif,
lb) l'ajout d'une solution aqueuse d'au moins un précurseur d'oxyde de silice à la solution de tensioactif, avant ou après la préparation de l'émulsion,
le) l'introduction du mélange réactionnel dans un moule,
ld) le repos du mélange réactionnel dans le moule jusqu'à la condensation dudit précurseur de silice sous la forme dudit monolithe,
ld) le lavage dudit monolithe, en flux continu, avec un solvant organique ;
2) une deuxième étape de fonctionnalisation de la surface interne des macropores par un agent de couplage choisi parmi les silanes, par imprégnation du monolithe alvéolaire, en flux continu, par une solution de l'agent de couplage dans un solvant organique ; et
3) une troisième étape d'immobilisation d'au moins une enzyme sur l'agent de couplage par l'intermédiaire d'une liaison covalente, par imprégnation du monolithe ainsi fonctionnalisé, en flux continu, par une solution aqueuse ou une dispersion aqueuse d'au moins une enzyme.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le moule utilisé lors de la première étape est lui-même confiné à l'intérieur d'un dispositif permettant la circulation d'un liquide en flux continu.
14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que les flux continus mentionnés aux étapes 2) et 3) dudit procédé sont des flux continus ascendants.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'au cours des étapes 2) et 3), la vitesse du flux varie de 0,02 à 0,1 mL/min.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que l'étape 3) d'immobilisation est réitérée deux fois et en ce que le procédé comprend en outre, avant la réalisation de l'étape 3) pour la seconde fois, une étape supplémentaire d'imprégnation du monolithe, en flux continu, par une solution d'un aldéhyde.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que le ou les précurseur(s) de silice sont choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane, le tetraéthoxyorthosilane, le diméthyldiéthoxysilane, les mélanges du diméthyldiéthoxysilane avec le tetraéthoxyorthosilane ou le tetraméthoxyorthosilane, les mélanges du tetraméthoxyorthosilane ou du tetraéthoxyorthosilane avec le γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane, et les mélanges du diméthyldiéthoxysilane ou du γ-glycidoxypropyltriméthoxysilane avec un silicate.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, caractérisé en ce que le monolithe fonctionnalisé par l'agent de couplage, tel qu'obtenu à l'issue de l'étape 2) de fonctionnalisation, est lavé, sous flux continu, avec un solvant organique.
19. Utilisation d'un catalyseur enzymatique hétérogène tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 pour la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène en flux continu.
20. Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'enzyme est une lipase, pour catalyser l'hydrolyse de triglycérides d'acides gras, des réactions d'estérification entre un acide et un alcool, des réactions de transestérification entre un ester et un alcool, des réactions d'inter-estérification entre deux esters ou des réactions de transfert d'un groupement acétyle d'un ester sur une aminé ou sur un thiol.
21. Utilisation selon la revendication 20, pour catalyser :
- la synthèse du butyloléate ;
- l'hydrolyse des dérivés de l'ester glycérolinoléique pour conduire à des savons ou à des détergents ;
- des réactions de trans-estérification de triglycérides d'acides gras par un alcool, lesdites réactions étant impliquées dans la synthèse de biodiesels à faible viscosité.
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