WO2010147397A2 - 조류 인플루엔자 바이러스 감염억제 효과를 가지는 신규 유산균 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

조류 인플루엔자 바이러스 감염억제 효과를 가지는 신규 유산균 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel microbial Weissella cibaria BLS13, and more particularly, to a novel microorganism Weissella cibaria BLS13 derived from kimchi having inhibitory activity against avian influenza virus and its use. will be.
  • Lactic acid bacteria can grow rapidly at 20 ⁇ 40 °C regardless of anaerobic or aerobic conditions, produce lactic acid to increase acidity, produce hydrogen peroxide, and inhibit the growth of pathogenic viruses and microorganisms. It is known to prevent disease. In addition, it improves self-defense ability by producing various bioactive substances, antiviral substances, antibacterial substances and anticancer substances, and in the case of livestock, it shows stabilization of intestinal microorganisms, increased feed efficiency, and increased disease resistance.
  • lactic acid bacteria in order to industrially use lactic acid bacteria correctly, it is generally necessary to go through a procedure to clearly understand and evaluate from a scientific standpoint what the use is and what characteristics are suitable for use, rather than judging by a list of positive effects. Only with such a procedure can you ensure the uniformity of the product and the reproducibility of the effects.
  • the present inventors have made efforts to isolate lactic acid bacteria that can be used to prevent avian influenza virus infection against 150 kinds of lactic acid bacteria derived from kimchi, and as a result, a novel lactic acid bacterium, visella sibaria BLS13, was selected and added to the culture components of the strain. This confirmed that the growth of the avian influenza virus was inhibited, the present invention was completed.
  • Another object of the present invention to provide a feed composition, pharmaceutical composition, health supplements, fermented foods and food additives containing Bisella Sibaria BLS13 KCTC11516BP or its culture.
  • the present invention provides Weissella cibaria BLS13 KCTC11516BP.
  • the present invention also provides a composition for anti-viral containing Vicella sibaria BLS13 KCTC11516BP or a culture thereof.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing influenza infection, which contains Vicella sibaria BLS13 KCTC11516BP or a culture medium thereof.
  • the present invention also provides a bisella sibaria BLS13 KCTC11516BP or a health supplement for preventing influenza infection containing the culture medium thereof.
  • the present invention also provides a fermented food containing Bisella Sibaria BLS13 KCTC11516BP or a culture solution thereof.
  • the present invention provides a food additive composition containing bisella sibaria BLS13 KCTC11516BP or a culture solution thereof.
  • the present invention also provides a feed additive containing bisella sibaria BLS13 KCTC11516BP or a culture thereof.
  • the present invention also provides a method for preventing influenza virus infection in an animal, wherein the animal is fed bisella sibaria BLS13 KCTC11516BP or a culture solution to the animal.
  • the present invention relates to a novel microbial bisella sibaria BLS13 KCTC11516BP.
  • Bisella Sibaria BLS13 KCTC11516BP is a novel lactic acid bacterium isolated from Kimchi, and was identified as Bisella sibaria as a result of molecular sieve analysis based on 16S rDNA sequence. It was deposited on May 26, 2017 to the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center (KCTC).
  • Bisella Sibaria is a Gram-positive bacterium belonging to the genus Weissella , which is usually salted with radishes, cabbages, cucumbers, etc., or mixed with red pepper, garlic, green onions, ginger, salted fish, etc. It is a kimchi lactic acid bacterium that appears during the fermentation process of kimchi, a product fermented at low temperature, and is fermented at a low temperature.
  • the lactic acid bacterium according to the present invention exhibits a high inhibitory effect against avian influenza virus and has excellent antiviral efficacy.
  • the avian influenza virus H9N2 has confirmed antiviral efficacy.
  • the present invention provides a composition for anti-viral, bisella sibaria BLS13 KCTC11516BP or a culture solution thereof, a pharmaceutical composition for preventing influenza infection, a health supplement for preventing influenza infection, a fermented food, a food additive composition and a feed additive to provide.
  • the term 'culture medium' of the present specification may be a culture stock solution, including a bacterial cell containing an active ingredient having an antiviral activity, a culture supernatant from which the bacteria are removed, or a dilution of the culture solution.
  • the bisella sibaria BLS13 of the present invention can be cultured in large quantities through conventional liquid or solid phase culture techniques.
  • the strain can also harvest the cells in the form of reduced pressure freeze-dried (Lyophilized), lyophilized, hydrated for formulation.
  • Bisella sibaria BLS13 of the present invention exhibits antiviral activity against avian influenza virus.
  • the pharmaceutical composition of the present invention means a microbial preparation containing Bisella sibaria BLS13 or a culture thereof, and is orally administered, parenteral administration, or physically to the skin or mucous membranes together with a pharmaceutically acceptable carrier substrate or nutritional component. Administration may be by contact, or directly to the intestine via a tube or catheter.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in tablets, capsules, implants, suppositories, powders, solutions, gels, liquid strain suspensions, and the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition can be determined by one of ordinary skill in the art, and the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response of the recipient The same factors can also be prescribed in various ways.
  • Fermented food products of the present invention are refrigerated, frozen or long-term storage of dairy products, for example, kimchi, milk, milk powder, yogurt, kefir, ice cream, milkshake, cheese, cream, curd, fermented milk, and milk
  • dairy products for example, kimchi, milk, milk powder, yogurt, kefir, ice cream, milkshake, cheese, cream, curd, fermented milk, and milk
  • fermented foods added soy milk, fermented grain products, patient diet and infant diet may be included, and may be provided to the animals as feed for the animals.
  • a substrate containing starch such as milk or grains is preferable for culturing the strain.
  • the nutritional composition prepared from the food or beverage may include one or more nutritional components consisting of fat, protein, carbohydrates, dietary fiber, minerals, vitamins, etc. together with the microorganism of the present invention.
  • the dietary fiber is known as a prebiotic substrate that promotes the cleavage of lactic acid bacteria, so it may enter the body and play an important role in the formation and maintenance of colonies in the intestine. It is included in the composition so that it can be administered after or simultaneously.
  • the pharmaceutical composition, fermented food or food additive of the present invention may further include a probiotic strain in addition to the pharmaceutically necessary ingredients or ingredients suitable for food.
  • the amount of bisella sibaria BLS13 included in the pharmaceutical carrier, fermented food or food additive may be about 10 5 cfu / g to about 10 11 cfu / g, preferably 10 6 cfu / g to about 10 10 cfu. / g, most preferably 10 7 cfu / g to about 10 9 cfu / g.
  • it is preferable to administer in a viable state it may be killed before ingestion or administered in an attenuation state.
  • when prepared using the culture supernatant may be further subjected to sterilization process through a heat treatment process.
  • the amount of strain and the daily intake required to have the minimum efficacy may vary depending on the body or health of the intake user, but in general, 10 6 to 10 12 cfu / day is preferred, most preferably 10 7 to 10 10 cfu / It is day.
  • the culture supernatant can be used to determine the degree of antimicrobial efficacy using techniques commonly used in the art, and thus the dosage can be determined.
  • the present invention relates to a method for preventing influenza virus infection in an animal characterized by feeding the bisella sibaria BLS13 KCTC11516BP or the culture solution to the animal.
  • the method of feeding the animals may be determined by experts in the art, such as in the form of feed additives, fermented foods, lyophilized preparations, diluents of cell cultures, etc. Factors such as age, weight, morbidity, rate of excretion and response sensitivity can also be varied.
  • the animal to be fed may be a mammal other than a human, preferably a livestock, more preferably poultry.
  • 11 kinds of kimchi prepared by the conventional kimchi production method were selected, and the kimchi was used as lactic acid bacteria isolated kimchi sample.
  • the kimchi sample was diluted 10-fold with 0.85% saline solution, and each 1 ml of MRS agar medium (MRS agar, Difco.); Bactopeptone 10 g, beef extract 10 g, yeast extract 5 g, glucose 20 g, Tween 801 g, 2 g of citric acid, 2 g of dibasic potassium phosphate, 5 g of sodium acetate, 0.1 g of manganese sulfate, 0.05 g of magnesium sulfate, 15 g of agar and 1 L of distilled water), and then inoculated with a glass rod.
  • MRS agar medium MRS agar, Difco.
  • Bactopeptone 10 g beef extract 10 g, yeast extract 5 g, glucose 20 g, Tween 801 g, 2 g of cit
  • the plates were then incubated for 48 hours in a 30 ° C. incubator. Each colony produced was inoculated in MRS agar medium and incubated at 30 ° C. for 48 hours to isolate a total of 150 lactic acid bacteria colonies. Ten colonies that are considered to be dominant based on the colony's shape, color, and the like were distinguished from each other to confirm that the bacteria to be separated by secondary culture in MRS medium were the single strains.
  • 26 kinds of kimchi-derived lactic acid bacteria which were selected as a single strain from the secondary culture, were inoculated in 50 ml of MRS broth (Difco) and incubated at 30 ° C. for 24 hours.
  • the cultured medium was centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes to remove the cells, and then neutralized to pH 6.5 and filtered with a 0.22um filter to prepare a lactic acid bacteria culture solution.
  • a / chicken / Korea / LPM77 / 06 (H9N2) virus isolated from 11-day-old fertilized eggs was inoculated from native chickens at the traditional market in Cheongju-si, Chungcheongbuk-do.
  • RNA extraction was performed using RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany). The extracted RNA was subjected to 8 segments (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1, PB2) by RT-PCR method. A) all were amplified and confirmed to be H9N2 virus through genetic analysis.
  • the lactic acid bacteria selected in Example 1 were subjected to antiviral efficacy in the following manner.
  • the virus was used as the low pathogenic avian influenza H9N2 serotype virus A / chicken / Korea / LPM77 / 06 (H9N2) isolated in Example 2.
  • Viral AIV LPM77 strains were grown in SPF embryonated eggs at 9-10 days of age to grow to a minimum titer of 10 8 EID 50 / ml.
  • the propagated virus was used while stored in a freezer maintained at minus 70 ° C.
  • the lactic acid bacteria culture solution was diluted 10-fold with distilled water and maintained at 4 ° C.
  • a 10-fold diluted virus solution (uremic fluid) was mixed with 24 ml of distilled water to prepare a virus for reaction with the extract.
  • 10-fold diluted lactic acid bacteria culture medium was added to the test tube 2.5ml, 2.5ml of the prepared virus solution was mixed (total 5ml), and reacted for exactly 45 minutes at 4 °C and shaken well every 10 minutes.
  • the reaction solution was diluted to 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 and 10 -6 using PBS and 4 10 eggs per dilution factor.
  • 0.2 ml of neutralized reaction solution was inoculated into the ureter cavity into the embryonated eggs.
  • the virus titer of the negative control group was 10 5.0
  • the virus titer after treatment of one strain of lactic acid bacteria culture medium was 10 3.5
  • the antiviral activity was very high (Table 1).
  • 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria registered on the GenBank (GenBank, www.ncbi.nlm.nih.gov) to perform 16S rDNA sequence analysis Based on this, a primer capable of amplifying a 16S rRNA coding DNA region was prepared.
  • lactic acid bacteria lysates were subjected to PCR using the pair of primers as a template to obtain a DNA fragment of 1308 bp (SEQ ID NO: 3), which was cloned into a pGEM-Teasy vector (Promega Co.). After nucleotide sequence analysis. As a result, the selected lactic acid bacteria were confirmed to have a homology of 99% or more with Bicella sibaria (Accession No FJ429987.1), Bicella sibaria (Accession No FJ429985.1) and the like. As a result, it was named as Lactobacillus bisella sibaria BLS13 having antiviral activity against avian influenza virus, and deposited on May 26, 2009 to the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center (KCTC) (KCTC11516BP).
  • KCTC Biotechnology and Biotechnology Center
  • the bisella sibaria BLS13 or its culture medium according to the present invention contains a substance having antiviral ability, and thus may be usefully used in feed additives, fermented products, foods, and pharmaceuticals.

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Abstract

본 발명은 신규 미생물 바이셀라 시바리아(Weissella cibaria)BLS13에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 억제 활성을 가지는 김치 유래 신규 미생물 바이셀라 시바리아(Weissella cibaria)BLS13 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이셀라 시바리아 BLS13 또는 그 배양액은 항바이러스능을 가지는 물질을 포함하고 있어, 사료첨가제, 발효제품, 식품, 의약품 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

조류 인플루엔자 바이러스 감염억제 효과를 가지는 신규 유산균 및 이를 포함하는 조성물
본 발명은 신규 미생물 바이셀라 시바리아(Weissella cibaria)BLS13에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 억제 활성을 가지는 김치 유래 신규 미생물 바이셀라 시바리아(Weissella cibaria)BLS13 및 그 용도에 관한 것이다.
고병원성 조류 인플루엔자에 의한 인체감염은 H5N1, H7N7, 그리고H9N2형의 바이러스로 밝혀지고 있으며, 팬더믹 인플루엔자 발생시 전 세계적으로 200만명 이상이 사망하는 막대한 인명피해와 사회적인 공황 상태 및 경제마비를 야기할 수 있어 세계보건기구 (WHO)는 국제적인 대책 마련을 촉구하고 있다 (2005년, Global Influenza Preparedness Plan 발표).
최근 우리나라에서도 2003년, 2006년 및 2008년 세 차례 조류 인플루엔자의 발생으로 포유동물의 감염가능성의 확인뿐만 아니라 양계산업 및 사회경제에 막대한 경제적 손실을 초래하였으며, 국내에서도 무증상 감염자의 발생으로 팬더믹 인플루엔자 발생에 대한 심각한 사회적 문제점이 야기되고 있는 상황이다.
국내 양계산업에 있어서 바이러스성 질병뿐 아니라 세균 감염에 의한 닭 호흡기성 마이코플라스마병, 대장균증, 살모넬라증 등의 세균성 질병도 빈번히 발생하여 세균에 감염되는 경우 면역력의 저하로 다른 질병에도 보다 취약해질 수 있다. 양계농가에서는 조류 질병의 피해를 막기 위해 방역 및 위생관리, 백신이나 항생제를 사용하지만 백신의 접종에 의해 감염을 억제하는 것은 유행하는 바이러스의 형과 백신의 바이러스의 형이 맞지 않으면 효능에 문제점이 있어 백신에 의한 예방에는 한계가 있기 때문에 바이러스에 대한 효과적인 치료법이나 예방책은 아직 미비한 상태이다. 따라서 병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 억제 효과를 가지면서 계군 자체의 면역시스템을 강화시킬 수 있고, 또한 안정성에 문제가 없는 복합적인 치료예방제가 필요한 상황이다.
유산균은 혐기 또는 호기의 조건과 상관없이 20 ~ 40℃에서 빠른 속도로 생장할 수 있으며, 배양 과정 중 젖산을 생산하여 산도를 높이고, 과산화수소 등을 생성함으로써 병원성 바이러스 및 미생물의 증식을 억제하여 토양의 병해를 방지한다고 알려져 있다. 또한 각종의 생리활성물질, 항바이러스물질, 항균물질, 항암물질을 생산함으로써 자기방어능력을 향상시키며, 가축의 경우 장내 미생물의 안정화, 사료 효율증가, 내병성의 증가 효과를 나타낸다. 그러나, 유산균을 산업적으로 올바르게 사용하기 위해서는 일반적으로 긍정적인 효과의 나열에 의한 판단보다는 사용용도가 무엇이며 용도에 적합한 특성이 무엇인지를 과학적인 입장에서 명확하게 이해하고 평가하는 절차를 반드시 거쳐야 한다. 이와 같은 절차를 통해서만이 제품의 균일성과 효과의 재현성을 보장할 수 있기 때문이다.
이에, 본 발명자들은 김치 유래의 유산균 150 종에 대하여 조류 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는데 사용할 수 있는 유산균을 분리하기 위해 예의 노력한 결과, 신규 유산균인 바이셀라 시바리아 BLS13을 선별하였고, 상기 균주의 배양액 성분에 의해 조류 인플루엔자 바이러스의 성장이 저해되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 항바이러스능을 가지는 신규 미생물 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 사료용 조성물, 약제학적 조성물, 건강보조제, 발효식품 및 식품첨가물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 동물에 급여하는 것을 특징으로 하는 동물에서 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이셀라 시바리아 (Weissella cibaria)BLS13 KCTC11516BP를 제공한다.
또한, 본 발명은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 항바이러스용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 인플루엔자 감염 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 인플루엔자 감염 예방용 건강보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 발효식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 식품첨가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 사료첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 배양액을 동물에 급여하는 것을 특징으로 하는 동물에서 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부한 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 신규 미생물 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP은 김치에서 분리한 신규 유산균으로, 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 실시한 결과, 바이셀라 시바리아로 동정되었으며, 신규한 미생물로 확인되었으며, 2009년 5월 26일자로 한국생물공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다.
바이셀라 시바리아는 바이셀라(Weissella)속에 속하는 그람 양성균으로서 일반적으로 무, 배추 및 오이 등을 소금에 절인 것 또는 이 절인 것을 고추, 마늘, 파, 생강, 젓갈 등의 양념을 버무린 후 젖산 생성에 의해 숙성되어 저온에서 발효된 제품인 김치의 발효 과정에서 출현하는 김치 유산균으로, 본 발명의 바이셀라 시바리아 BLS13은 신규로 분리 동정된 신규 미생물이다.
본 발명에 따른 유산균은 조류인플루엔자 바이러스에 대해 높은 저해효능을 나타내어 우수한 항바이러스 효능을 가지며, 본 발명의 일 실시예에서는, 조류인플루엔자 바이러스인 H9N2를 항바이러스 효능을 확인하였다.
다른 관점에서, 본 발명은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 항바이러스용 조성물, 인플루엔자 감염 예방용 약제학적 조성물, 인플루엔자 감염 예방용 건강보조제, 발효식품, 식품첨가용 조성물 및 사료첨가제를 제공한다.
본 명세서의 용어 '배양액'은 항바이러스활성을 갖는 유효성분을 포함하는 균체를 포함한 배양원액, 균체를 제거한 배양 상등액 또는 배양액의 희석액일 수 있다.
본 발명의 항바이러스조성물을 제조하기 위해서 본 발명의 바이셀라 시바리아 BLS13은 통상의 액상 또는 고상의 배양기술을 통하여 대량으로 배양할 수 있다. 상기 균주는 또한 제제화 하기 위하여 감압동결건조(Lyophilized), 동결건조, 수화의 상태로 균체를 수거할 수 있다.
본 발명의 바이셀라 시바리아 BLS13은 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스작용을 나타낸다.
본 발명의 약제학적 조성물은 바이셀라 시바리아 BLS13 또는 그 배양액을 함유한 미생물 제제를 의미하며, 약제학적으로 허용되는 담체기질 또는 영양 성분과 함께 경구 투여, 비경구 투여, 또는 피부 또는 점막에 물리적인 접촉을 통해 투여하거나, 직접적으로 튜브나 카테타를 통해 장에 투여할 수도 있다.
상기 약제학적 조성물은 타블렛, 캡슐, 인플란트, 좌약, 분말, 용액, 젤, 액상의 균주 현탁액 등으로 제조될 수 있다.
약제학적 조성물의 투여량은 당해 기술분야에 속하는 전문가에 의해 결정될 수 있고, 제제화 방법, 투여 방식, 투여자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해서도 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 발효식품은 냉장, 냉동 또는 장기보관이 가능한 유제품, 예를 들면, 김치, 우유, 분유, 요커트, 케피어(kefir), 아이스크림, 밀크쉐이크, 치즈, 크림, 커드, 발효유, 및 우유가 첨가된 발효식품뿐만 아니라 두유, 발효된 곡류제품, 환자식이 및 유아식이 등이 포함될 수 있으며, 동물의 사료로서 동물에게 제공할 수도 있다.
본 발명의 바이셀라 시바리아 BLS13을 배양하여 식품으로 제조하거나 식품에 첨가하기 위해서는 우유 또는 곡류와 같이 녹말을 포함한 기질이 균주 배양에 바람직하다.
상기 식품 또는 음료로 제조된 영양조성물은 본 발명의 미생물과 더불어 지방, 단백질, 탄수화물, 식이섬유, 무기질 및 비타민 등으로 구성된 하나 이상의 영양 구성물을 포함할 수 있다. 상기 구성물 중에서 특히 식이섬유는 일반적으로 유산균의 분열을 촉진하는 생물발생이전(Prebiotic)기질로 알려져 있기 때문에 체내에 유입되어 장내에서 콜로니의 형성 및 유지에 중요한 역할을 할 수 있으므로 본 발명의 조성물을 섭취한 후에 또는 동시에 투여될 수 있도록 조성물에 포함시킨다.
본 발명의 약제학적 조성물, 발효식품 또는 식품첨가제는 약제학적으로 필요한 구성물 또는 식품으로 적합한 구성물 외에 인체에 이로운(probiotic) 균주를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약제학적 담체, 발효식품 또는 식품첨가제에 포함되는 바이셀라 시바리아 BLS13의 양은 약 105 cfu/g 내지 약 1011 cfu/g일 수 있으며, 바람직하게는 106 cfu/g 내지 약 1010 cfu/g, 가장 바람직하게는 107 cfu/g 내지 약 109 cfu/g이다. 균주를 투여할 경우에는 생균상태로 투여하는 것이 바람직하며, 섭취 전에 사멸시키거나, 감쇄(attenuation)상태로 투여할 수 있다. 또한, 배양 상등액을 사용하여 제조할 경우에는 열처리 과정을 통한 멸균화 과정을 추가적으로 거칠 수 있다. 최소의 효능을 가지는데 필요한 균주량 및 일일 섭취 정도는 섭취자의 신체 또는 건강상태에 따라 달라질 수 있으나 일반적으로 106 내지 1012 cfu/day가 바람직하며, 가장 바람직하게는 107 내지 1010 cfu/day 이다. 배양 상등액은 당업계에서 통상적으로 사용되는 기술을 사용하여 항균 효능의 정도를 판단할 수 있으며, 이에 따라 투여량이 결정될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 배양액을 동물에 급여하는 것을 특징으로 하는 동물에서 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 동물에 급여하는 방법은 사료첨가제 형태이거나, 발효식품, 동결건조제제, 균체 배양액의 희석액 등의 형태 등 당해 기술분야에 속하는 전문가에 의해 결정될 수 있고, 급여 방식, 급여동물의 종류, 나이, 체중, 병적 상태, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해서도 다양하게 급여될 수 있다.
본 발명에서, 급여되는 동물은 인간을 제외한 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 가축일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 가금류이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서는 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP의 H9N2에 대한 항바이러스 활성만을 확인하였으나, 조류인플루엔자 바이러스와 비슷한 기작으로 활동하는 바이러스에 대해서도 억제 효능을 가진다는 것은 당업자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 김치 유산균의 분리 및 항바이러스용 배양액의 제조
통상적인 김치 제조방법으로 제조된 김치 11종을 선택하고, 상기 김치를 유산균 분리 김치시료로 사용하였다. 상기 김치시료를 0.85% 식염수로 10배 희석하여1 ㎖씩 MRS 아가 배지(MRS 아가, 디프코(Difco.); 박토펩톤 10 g, 소고기추출물 10 g, 효모추출물 5 g, 글루코스 20 g, 트윈 801 g, 구연산 2 g, 제2 인산칼륨 2 g, 초산나트륨 5 g, 황산망간 0.1 g, 황산마그네슘 0.05 g, 아가 15 g/증류수 1 ℓ) 에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 30℃의 항온 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 MRS 아가 배지에 획선 접종하였고, 30℃에서 48시간 동안 배양하여 총 150개의 유산균 콜로니를 분리하였다. 생장된 집락(colony)의 형태, 색깔 등을 기준으로 우세하다고 여겨지는 10 가지의 집락을 구별하여 MRS 배지에 2차 배양하여 분리하고자 하는 균이 단독균주인지를 확인하였다.
상기 2차 배양으로부터 단독균주로 선발된 26종의 김치유래 유산균을 50ml의 MRS broth(Difco)에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 정치배양하였다. 상기 배양된 배양액을 6000rpm으로 5분간 원심분리하여 균체를 제거한 후 pH를 6.5로 중화하고 0.22um 필터로 여과하여 유산균 배양액을 제조하였다.
실시예 2 : 조류 인플루엔자 바이러스의 분리
충청북도 청주시 육거리에 위치한 재래시장의 토종닭에서 채취한 분변을 11일령의 유정란에 접종하여 분리한 A/chicken/Korea/LPM77/06 (H9N2)바이러스를 이용하였다.
인플루엔자 바이러스의 확인을 위해, Viral RNA 추출은 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Germany)를 사용하였으며, 추출한 RNA를 RT-PCR 방법으로 8개의 segments (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1, PB2) 모두를 증폭하여 유전자분석을 통해 H9N2 바이러스임을 확인하였다.
실시예 3 : 선발된 김치 유산균의 조류 인플루엔자 항바이러스능 확인
실시예 1에서 선발한 유산균에 대해 다음과 같은 방법으로 항바이러스 효능을 실시하였다. 바이러스는 실시예 2에서 분리한 저병원성 조류인플루엔자 H9N2 혈청형 바이러스인 A/chicken/Korea/LPM77/06 (H9N2)를 사용하였다. 바이러스 AIV LPM77주를 9~10일령의 SPF 부화란에 배양하여 역가가 최소 108EID50/ml이상 되도록 증식하며, 증식된 바이러스는 영하 70℃가 유지되는 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 유산균 배양액은 증류수로 각각 10배 희석하여 4℃로 유지한 후 사용하였다.
10배 희석한 바이러스액(요막강액) 1.0ml를 24ml의 증류수와 섞어 추출물과의 반응용 바이러스를 준비하였다. 10배 희석된 유산균 배양액을 2.5ml씩 시험관에 넣고, 준비된 바이러스액 2.5ml를 넣어 혼합한 다음(총 5ml), 4℃에서 정확히 45분간 반응시키며 도중에 10분마다 잘 흔들어 주었다. 바이러스 증식여부의 판정을 위해 반응이 끝나면 반응액을 PBS를 사용하여 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 및 10-6로 희석하고 희석배수당 4개의 10일란 발육란에 중화된 반응액 0.2ml을 요막강 내로 접종하였다. 접종 후 37℃에서 5일 동안 배양하며, 매일 검란을 실시하고, 접종 24시간 이내에 죽은 발육란은 사고사로 간주하고 시험성적에서 제외하였다. 접종 24시간 후부터 5일 이내에 죽은 접종란은 모두 4℃에 보관하였다. 접종 5일 후까지 살아남은 모든 발육란과 4℃에 보관된 죽은 접종란으로부터 요막강액을 각각 채취하였고, 혈구응집여부 시험을 실시하여 바이러스 유무를 판단하였다.
그 결과, 음성 대조군의 바이러스 역가가 105.0인데 비하여, 한 균주의 유산균 배양액의 처리 후의 바이러스 역가가 103.5가 으로 나타나 매우 높은 항바이러스 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (표 1).
표 1
Figure PCTKR2010003895-appb-T000001
실시예 4 : 바이셀라 시바리아 BLS13의 균주 동정
실시예 3에서 바이러스 저항능을 확인한 유산균의 동정을 위하여, 16S rDNA 염기서열 분석을 수행하기 위해 유전자은행(GenBank, www.ncbi.nlm.nih.gov) 상에 등록되어 있는 유산균의 16S rDNA 염기서열을 바탕으로 16S rRNA 코딩 DNA 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하였다.
서열번호 1 : 5’-gac ggg tga gta aca cgt gg-3’
서열번호 2 : 5’-acg ggc ggt gtg tac-3’
109 개의 유산균 균체의 파쇄물을 주형으로 상기 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 1308 bp의 DNA 단편(서열번호 3)을 수득하였으며, 상기 단편을 pGEM-Teasy vector(Promega Co.)에 클로닝 후 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 선별된 유산균은 바이셀라 시바리아(Accession No FJ429987.1), 바이셀라 시바리아(Accession No FJ429985.1) 등과 99% 이상의 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스활성을 갖는 유산균주 바이셀라 시바리아 BLS13라 명명하고, 2009년 5월 26 일자로 한국생물공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(KCTC11516BP).
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 바이셀라 시바리아 BLS13 또는 그 배양액은 항바이러스능을 가지는 물질을 포함하고 있어, 사료첨가제, 발효제품, 식품, 의약품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.
Figure PCTKR2010003895-appb-I000001

Claims (8)

  1. 바이셀라 시바리아 (Weissella cibaria)BLS13 KCTC11516BP.
  2. 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 항바이러스용 조성물.
  3. 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 인플루엔자 감염 예방용 약제학적 조성물.
  4. 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 인플루엔자 감염 예방용 건강보조제.
  5. 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 발효식품.
  6. 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 식품첨가용 조성물.
  7. 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 그 배양액을 함유하는 인플루엔자 감염 예방용 사료첨가제.
  8. 바이셀라 시바리아 BLS13 KCTC11516BP 또는 배양액을 동물에 급여하는 것을 특징으로 하는 동물에서 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법.
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