KR102451861B1 - 급성 호흡기 바이러스 및 로타바이러스 감염 질환 예방 및 치료를 위한 조성물 - Google Patents

급성 호흡기 바이러스 및 로타바이러스 감염 질환 예방 및 치료를 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유산균 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 발효액의 상청액을 유효성분으로 함유하는 상기도 감염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명 유산균 발효물의 무세포상청액을 섭취하면 화농성연쇄상구균, 황색포도상구균, 폐렴구균 등 대표적인 상기도 감염균의 성장과 바이오필름을 억제하는 것은 물론, 호흡기 바이러스 감염도 억제하여 급성호흡기 질환에 대한 예방 및 치료 효과가 있다.

Description

급성 호흡기 바이러스 및 로타바이러스 감염 질환 예방 및 치료를 위한 조성물{COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF ACUTE RESPIRATORY VIRUSES AND ROTAVIRUS INFECTIONS}
본 발명은 급성호흡기 바이러스 및 로타바이러스 감염 질환 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유산균 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)의 발효물의 무세포상청액을 유효성분으로 함유하는 급성호흡기 바이러스 및 로타바이러스 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
급성호흡기 바이러스 감염은 전 세계적으로 이환율과 사망률을 높이는 중요한 원인이며, 대부분의 호흡기 바이러스는 매년 겨울과 봄에 발생하는 것이 특징이다.
특히, 인간호흡기 세포융합 바이러스 (Human syncytial virus; RSV)와 인플루엔자 에이 바이러스 (Influenza A virus; H1N1)는 입원 및 사망과 관련된 가장 중요한 호흡기 바이러스 중 하나이다. RSV는 감기 및 기관지염, 세기관지염, 폐렴과 같은 하기도 감염을 유발하는 바이러스이며, 어린이와 성인에게 발생하며 5세 미만 소아에서 가장 흔한 폐렴의 원인으로 알려져 있다.
H1N1은 1919년 스페인 독감과 2009년 돼지 독감 유행병을 일으킨 바이러스이며, 특히 성인의 입원 및 사망 증가와 관련이 있는 것으로 보고되고 있다.
급성 중이염과 급성 부비동염의 원인도 호흡기 바이러스로 인식되고 있으며, 또한 많은 연구에서 RSV가 유아에서 가장 흔한 바이러스 관련 급성 중이염이라는 사실이 밝혀졌다. 급성 부비동염은 급성 호흡기 감염이 있는 성인 환자의 10%에서 발생하며 RSV와 H1N1이 가장 일반적으로 연관되어 있는 것으로 알려져 있다.
로타바이러스(rotavirus)는 영유아에서 가장 흔한 설사 원인이며, 인플루엔자와 관련이 없는 장염을 일으키는 바이러스중 하나이다. 5세까지의 거의 모든 어린이는 적어도 한번은 로타바이러스에 감염된다고 알려져 있으며, 성인에게도 영향을 미칠 수 있다. 로타바이러스에는 5개의 바이러스 종 A, B, C, D, E가 있으며, 그 중 로타바이러스 에이 (rotavirus A; RVA)가 가장 많이 알려져 있다.
최근에는 인체 건강에 유익하다고 알려져 있는 프로바이오틱스 중에서 대표적인 락토바실러스의 다양한 생리적, 면역학적 효과가 보고되고 있는데, 특히 인플루엔자를 비롯한 다양한 감염병에 대한 유산균의 효과에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 락토바실러스 에시도필러스 L-92에 의해 자연살해 T세포의 활성이 상향 조절되어 생쥐의 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 것으로 보고도 되고 있다. 또한, 락토바실러스 에시도필러스 NCFM의 세포벽은 생쥐에서 Toll-유사 수용체 경로를 통해 항바이러스 유전자 발현을 상향 조절하는 것으로 밝혀졌다.
또다른 균종인 락토바실러스 가세리 SBT2055 (LG2055)는 원래 인간 배설물에서 분리되었으며 다기능 프로바이오틱스로 보고되고 있다. 담즙산에 대한 LG2055의 내성은 인간의 장내 집락화를 촉진하여 장 환경의 생리적인 개선에 기여할 수 있으며, 인간과 쥐의 복부 비만 예방, 꼬마 선충의 수명 연장, IgA 생산 촉진, H1N1 및 RSV 감염 예방과 같은 다양한 생물학적 효과를 촉진한다고 알려져 있다.
한편, 최근에 발표된 연구논문들에 따르면, 유산균이 사스 또는 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하고 인플루엔자 백신의 면역원성을 높이는 기능을 하는 것으로 밝혀졌으며 풍부한 유산균을 갖고 있는 우리나라의 대표적인 발효식품인 김치 및 김치 유래 유산균은 항바이러스 효능을 갖는 의약품 보조제로 개발될 수 있는 높은 가능성을 갖고 있는 것으로 보인다.
대한민국 공개특허번호 제 10-2018-0033912호에는 락토바실러스 플란타륨을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 약학 조성물에 관해 개시되어 있는데, 보다 구체적으로는, 본 발명의 락토바실러스 플란타륨 DSR M2는 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 우수하므로, 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발병되는 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴, 조류독감, 돼지독감, 염소독감 등의 예방 또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.
그런데 본 발명자들은 웨이쎌라 사이베리아 유산균을 이용한 각종 구강치료제를 개발하던 중, 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 유산균 발효물의 무세포상청액이 대표적인 상기도 감염균인 화농성연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae). 모락셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis)에 대해 항균 및 항바이오필름 형성억제 능력이 있음을 확인하였고, 뿐만 아니라, 발효액을 섭취하면 급성호흡기 감염 바이러스도 억제하여 호흡기바이러스성 감염 질환에 대한 예방 및 치료 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허번호 제 10-2018-0033912호 "락토바실러스 플란타륨을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 약학 조성물" 대한민국 공개특허번호 제 10-2018-0004233호 "상기도 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 폴리이노신-폴리사이티딜산 (Poly (I:C)) 완두 전분 제형"
본 발명은 감염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 유산균 발효물의 무세포상청액을 유효성분으로 함유하는 호흡기 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서 상기 호흡기 바이러스인 호흡기세포융합바이러스(Human respiratory syncytial virus; RSV), 인플루엔자 에이 바이러스(Human Influenza A; H1N1)와 유아 및 소아에 장염을 일으키는 로타바이러스 에이(Rotavirus A; RVA)인 것을 특징으로 하는 급성호흡기 바이러스 및 장염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서 상기 유산균 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 발효액의 상청액의 농도는 50%인 것을 특징으로 하는 상기도 감염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.
상기 호흡기 바이러스 감염으로 인한 질환은 독감, 감기, 기관지염, 세기관지염, 폐렴, 급성중이염, 부비동염 중의 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 상기 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 유산균 발효물의 무세포상청액을 돼지감자 전분에 흡입시켜 동결건조하여 분말화함을 특징으로 하는 호흡기 바이러스 감염 및 장염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제조함을 특징으로할 수 있다.
본 발명 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 유산균 발효물의 무세포상청액을 섭취하면 화농성연쇄상구균, 황색포도상구균, 폐렴구균 등 대표적인 상기도 감염균의 성장과 바이오필름을 억제하는 것은 물론, 호흡기 바이러스 감염도 억제하여 급성호흡기 질환에 대한 예방 및 치료 효과가 있다.
도 1은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)의 발효 상청액의 호흡기세포융합바이러스(RSV)에 대한 항바이러스 효능에 대한 역가계산 결과이다.
도 2는 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)의 발효 상청액의 인플루엔자에이 바이러스(H1N1)에 대한 항바이러스 효능에 대한 역가계산 결과이다.
도3은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)의 발효 상청액의 로타바이러스에이(RVA) 에 대한 항바이러스 효능에 대한 역가계산 결과이다.
도4는 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)의 발효 상청액의 호흡기세포융합바이러스, 인플루엔자에이 바이러스, 로타바이러스 에이에 대한 로그감소를 나타낸 결과이다.
도5는 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)의 발효 상청액의 호흡기세포융합바이러스, 인플루엔자에이 바이러스, 로타바이러스 에이에 대한 바이러스감소율을 나타낸 결과이다.
도6은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)의 발효 상청액의 농도에 따른 호흡기세포융합바이러스(RSV)에 대한 항바이러스 효능에 대한 역가계산 결과를 나타낸 것이다.
도7은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)의 발효 상청액의 농도에 따른 인플루엔자 에이 바이러스(H1N1)에 대한 항바이러스 효능에 대한 역가계산 결과를 나타낸 것이다.
도8은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)의 발효 상청액의 농도에 따른 로타바이러스(RVA)에 대한 항바이러스 효능에 대한 역가계산 결과를 나타낸 것이다.
이하에서는, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 기재된 사항에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것은 아니다.
본 발명의 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 유산균의 배양 상청액은 감기 및 기관지염, 세기관지염, 폐렴과 같은 하기도 감염과 급성중이염과 부비동염을 유발하는 바이러스인 호흡기세포융합바이러스(Human respiratory syncytial virus; RSV), 독감을 일으키는 인플루엔자 에이 바이러스(Human Influenza A; H1N1)와 유아 및 소아에 장염을 일으키는 로타바이러스 에이(Rotavirus A; RVA)를 사멸시키는 효능을 가진다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 웨이쎌라 사이베리아(Weissella cibaria CMS1)는 구취를 발생하는 혐기성세균을 억제하고 호기성 및 혐기성 상태에서 과산화수소를 발생시키는 웨이쎌라속 유산균인 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (수탁번호: KCTC 10678BP) 활용에 관한 것임을 특징으로 한다.
(실시예1)
제조예 1
본 발명에 사용된 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1)은 구취를 발생하는 혐기성세균을 억제하고 호기성 및 혐기성 상태에서 과산화수소를 발생시키는 웨이쎌라속 유산균인 웨이쎌라 사이베리아 CMS1 KCTC 10678BP를 분양 받아 MRS 배지에서 37℃에서 24시간 배양하여 원심분리하여 유산균 발효물의 무세포상청액을 제조하였다.
<시험예 1> 호흡기세포융합바이러스에 대한 항바이러스 효능 평가
1. 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액의 제조
웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)균주는 MRS 배지를 사용하여 37℃에서 24시간 정치배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액을 원심분리(5,000 rpm, 4℃, 10분)한 후, 0.45 μm 필터로 여과하여 균을 제외한 상청액을 얻었다.
2. 항바이러스 시험
항바이러스 시험은 ASTM E1052-20에 따라, 아래와 같이 수행되었다.
(1) 숙주세포의 배양
Hep-2(KCLB 10023) 숙주세포는 Eagle's Minimal Essential Media(EMEM)에 10%의 Fetal Bovine Serum(FBS)를 첨가한 배지를 이용하여 5 % 이산화탄소, (36±2)℃ 조건에서 배양하였다.
(2) 바이러스의 배양
Hep-2세포에 바이러스를 감염시킨 후, 바이러스 배양배지를 첨가하여 90 % 이상의 숙주세포가 세포병변현상(Cytopathic effect, CPE)을 보일 때(최소 1일에서 12일)까지 바이러스를 배양하였다. 그 후 배양 상층액을 원심분리(2,000 rpm, 10분)하고 상층액을 0.45 μm 필터로 여과하여 바이러스를 분리하였다.
(3)세포독성(Cytotoxicity)시험
바이러스 배양배지를 시료에 1 : 9 비율로 혼합한 후, 바이러스 배양배지를 이용하여 10배씩 단계 희석하였다. 희석된 시험용액은 숙주세포에 (36±2)℃에서 30 ~ 60분 간 처리한 후, 세포독성 양상을 현미경을 통해 육안으로 관찰하였다. 단계희석만으로 세포독성이 감소하지 않음을 관찰한 후 Sephadex LH-20을 이용하여 필터 후, 중화하여 시험에 적용하였다.
시험용액을 중화한 후 세포독성여부를 확인하였다. 그 결과, 숙주세포 모두 10-2 희석배수에서 세포독성이 관찰되었다. 따라서 독성을 나타내지 않는 최고 희석배수는 10-3에서 확인하였다.
(4)아세포독성(sub-cytotoxicity)시험
세포독성을 나타내지 않은 농도별 시험용액을 숙주세포에 30분 간 처리한 후 세포단층을 PBS로 세척하고, 시험 바이러스 희석액을 접종하였다. 그 후 바이러스를 60 ~ 90 분간 감염한 후 배양하였다.
(5)중화(Neutralization)시험
중화된 농도별 시험용액과 시험 바이러스 희석액을 동량으로 혼합하여 10 ~ 20 분 간 반응시킨 후, 숙주세포에 접종하였다. 그 후 바이러스를 60 ~ 90 분간 감염한 후 배양하였다.
(6)실험군의 편성
세포배양 대조군 (숙주세포에 바이러스 배양배지를 처리)
바이러스 대조군 (시험 바이러스를 바이러스 배양배지에 1 : 9 비율로 혼합하여 중화 및 필터링 후, 10배씩 단계희석하여 숙주세포에 처리)
바이러스 시험군 (시험 바이러스를 시료(웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 유산균의 배양 상청액)에 1 : 9 비율로 혼합하여 중화 및 필터링 후 10배씩 단계희석하여 숙주세포에 처리)
3. 바이러스 회수
반응이 끝난 각 용액은 10배씩 단계희석하고 단계별 희석액을 미리 96-well plate에 배양한 세포에 처리하여 배양하였다.
(1)염색
25% 메틸알코올 (v/v), 0.5% 크리스털바이올렛 (w/v)의 염색시약을 세포에 처리하여 10분 동안 염색하였다.
(2)염색결과 관찰
세포배양 플레이트의 염색된 well의 개수를 세어 Spearman-Karber법으로 역가를 산출하였다. 바이러스 역가와 로그감소는 아래의 바이러스 역가 계산식과 로그감소 계산식에 따라 결정하였다.
(3)바이러스 역가 계산식
L =
Figure 112021124502517-pat00001
L (Log
Figure 112021124502517-pat00002
TCID
Figure 112021124502517-pat00003
역가)
Figure 112021124502517-pat00004
(모든 시험 접종이 양성인 최저 희석액 역수의 로그(Log
Figure 112021124502517-pat00005
)값)
Figure 112021124502517-pat00006
(희석 계수의 로그(Log
Figure 112021124502517-pat00007
)값)
Figure 112021124502517-pat00008
(각 희석에 사용된 시험 접종 수)
Figure 112021124502517-pat00009
(
Figure 112021124502517-pat00010
중 양성 시험 접종 수)
Figure 112021124502517-pat00011
(Sum of the proportion of positive tests beginning at the lowest dilution showing 100% positive result)
(4)로그감소(log reduction, LR)계산식
LR =
Figure 112021124502517-pat00012
Figure 112021124502517-pat00013
(바이러스 대조군의 역가 (아무 처리도 하지 않은 그룹))
Figure 112021124502517-pat00014
(바이러스 시험군의 역가 (시험 시료로 처리된 그룹))
<시험예 2> 인플루엔자 에이 바이러스에 대한 항바이러스 효능 평가
1. 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액의 제조
웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)균주는 MRS 배지를 사용하여 37℃에서 24시간 정치배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액을 원심분리(5,000 rpm, 4℃, 10분)한 후, 0.45 μm 필터로 여과하여 균을 제외한 상청액을 얻었다.
2. 항바이러스 시험
항바이러스 시험은 ASTM E1052-20에 따라, 아래와 같이 수행되었다.
(1) 숙주세포의 배양
MDCK(ATCC CCL-34) 숙주세포는 Eagle’ Minimal Essential Media(EMEM)에 10%의 Fetal Bovine Serum(FBS)를 첨가한 배지를 이용하여 5 % 이산화탄소, (36±2)℃ 조건에서 배양하였다.
(2) 바이러스의 배양
MDCK 세포에 바이러스를 감염시킨 후, 바이러스 배양배지를 첨가하여 90 % 이상의 숙주세포가 세포병변현상(Cytopathic effect, CPE)을 보일 때(최소 1일에서 12일)까지 바이러스를 배양하였다. 그 후 배양 상층액을 원심분리(2,000 rpm, 10분)하고 상층액을 0.45 μm 필터로 여과하여 바이러스를 분리하였다.
(3)세포독성(Cytotoxicity)시험
바이러스 배양배지를 시료에 1 : 9 비율로 혼합한 후, 바이러스 배양배지를 이용하여 10배씩 단계 희석하였다. 희석된 시험용액은 숙주세포에 (36±2)℃에서 30 ~ 60분 간 처리한 후, 세포독성 양상을 현미경을 통해 육안으로 관찰하였다. 단계희석만으로 세포독성이 감소하지 않음을 관찰한 후 Sephadex LH-20을 이용하여 필터 후, 중화하여 시험에 적용하였다.
시험용액을 중화한 후 세포독성여부를 확인하였다. 그 결과, 숙주세포 모두 10-2 희석배수에서 세포독성이 관찰되었다. 따라서 독성을 나타내지 않는 최고 희석배수는 10-3에서 확인하였다.
(4)아세포독성(sub-cytotoxicity)시험
세포독성을 나타내지 않은 농도별 시험용액을 숙주세포에 30분 간 처리한 후 세포단층을 PBS로 세척하고, 시험 바이러스 희석액을 접종하였다. 그 후 바이러스를 60 ~ 90 분간 감염한 후 배양하였다.
(5)중화(Neutralization)시험
중화된 농도별 시험용액과 시험 바이러스 희석액을 동량으로 혼합하여 10 ~ 20 분 간 반응시킨 후, 숙주세포에 접종하였다. 그 후 바이러스를 60 ~ 90 분간 감염한 후 배양하였다.
(6)실험군의 편성
세포배양 대조군 (숙주세포에 바이러스 배양배지를 처리)
바이러스 대조군 (시험 바이러스를 바이러스 배양배지에 1 : 9 비율로 혼합하여 중화 및 필터링 후, 10배씩 단계희석하여 숙주세포에 처리)
바이러스 시험군 (시험 바이러스를 시료(웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 유산균의 배양 상청액)에 1 : 9 비율로 혼합하여 중화 및 필터링 후 10배씩 단계희석하여 숙주세포에 처리)
3. 바이러스 회수
반응이 끝난 각 용액은 10배씩 단계희석하고 단계별 희석액을 미리 96-well plate에 배양한 세포에 처리하여 배양하였다.
(1)염색
25% 메틸알코올 (v/v), 0.5% 크리스털바이올렛 (w/v)의 염색시약을 세포에 처리하여 10분 동안 염색하였다.
(2)염색결과 관찰
세포배양 플레이트의 염색된 well의 개수를 세어 Spearman-Karber법으로 역가를 산출하였다. 바이러스 역가와 로그감소는 아래의 바이러스 역가 계산식과 로그감소 계산식에 따라 결정하였다.
(3)바이러스 역가 계산식
L =
Figure 112021124502517-pat00015
L (Log
Figure 112021124502517-pat00016
TCID
Figure 112021124502517-pat00017
역가)
Figure 112021124502517-pat00018
(모든 시험 접종이 양성인 최저 희석액 역수의 로그(Log
Figure 112021124502517-pat00019
)값)
Figure 112021124502517-pat00020
(희석 계수의 로그(Log
Figure 112021124502517-pat00021
)값)
Figure 112021124502517-pat00022
(각 희석에 사용된 시험 접종 수)
Figure 112021124502517-pat00023
(
Figure 112021124502517-pat00024
중 양성 시험 접종 수)
Figure 112021124502517-pat00025
(Sum of the proportion of positive tests beginning at the lowest dilution
showing 100% positive result)
(4)로그감소(log reduction, LR)계산식
LR =
Figure 112021124502517-pat00026
Figure 112021124502517-pat00027
(바이러스 대조군의 역가 (아무 처리도 하지 않은 그룹))
Figure 112021124502517-pat00028
(바이러스 시험군의 역가 (시험 시료로 처리된 그룹))
<시험예 3> 로타바이러스에 대한 항바이러스 효능 평가
1. 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액의 제조
웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1)균주는 MRS 배지를 사용하여 37℃에서 24시간 정치배양하였다. 배양이 완료된 후 배양액을 원심분리(5,000 rpm, 4℃, 10분)한 후, 0.45 μm 필터로 여과하여 균을 제외한 상청액을 얻었다.
2. 항바이러스 시험
항바이러스 시험은 ASTM E1052-20에 따라, 아래와 같이 수행되었다.
(1) 숙주세포의 배양
CV-1(KCLB 10070) 숙주세포는 Eagle's Minimal Essential Media(EMEM)에 10%의 Fetal Bovine Serum(FBS)를 첨가한 배지를 이용하여 5 % 이산화탄소, (36±2)℃ 조건에서 배양하였다.
(2) 바이러스의 배양
CV-1 숙주세포에 바이러스를 감염시킨 후, 바이러스 배양배지를 첨가하여 90 % 이상의 숙주세포가 세포병변현상(Cytopathic effect, CPE)을 보일 때(최소 1일에서 12일)까지 바이러스를 배양하였다. 그 후 배양 상층액을 원심분리(2,000 rpm, 10분)하고 상층액을 0.45 μm 필터로 여과하여 바이러스를 분리하였다.
(3)세포독성(Cytotoxicity)시험
바이러스 배양배지를 시료에 1 : 9 비율로 혼합한 후, 바이러스 배양배지를 이용하여 10배씩 단계 희석하였다. 희석된 시험용액은 숙주세포에 (36±2)℃에서 30 ~ 60분 간 처리한 후, 세포독성 양상을 현미경을 통해 육안으로 관찰하였다. 단계희석만으로 세포독성이 감소하지 않음을 관찰한 후 Sephadex LH-20을 이용하여 필터 후, 중화하여 시험에 적용하였다.
시험용액을 중화한 후 세포독성여부를 확인하였다. 그 결과, 숙주세포 모두 10-2 희석배수에서 세포독성이 관찰되었다. 따라서 독성을 나타내지 않는 최고 희석배수는 10-3에서 확인하였다.
(4)아세포독성(sub-cytotoxicity)시험
세포독성을 나타내지 않은 농도별 시험용액을 숙주세포에 30분 간 처리한 후 세포단층을 PBS로 세척하고, 시험 바이러스 희석액을 접종하였다. 그 후 바이러스를 60 ~ 90 분간 감염한 후 배양하였다.
(5)중화(Neutralization)시험
중화된 농도별 시험용액과 시험 바이러스 희석액을 동량으로 혼합하여 10 ~ 20 분 간 반응시킨 후, 숙주세포에 접종하였다. 그 후 바이러스를 60 ~ 90 분간 감염한 후 배양하였다.
(6)실험군의 편성
세포배양 대조군 (숙주세포에 바이러스 배양배지를 처리)
바이러스 대조군 (시험 바이러스를 바이러스 배양배지에 1 : 9 비율로 혼합하여 중화 및 필터링 후, 10배씩 단계희석하여 숙주세포에 처리)
바이러스 시험군 (시험 바이러스를 시료(웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 유산균의 배양 상청액)에 1 : 9 비율로 혼합하여 중화 및 필터링 후 10배씩 단계희석하여 숙주세포에 처리)
3. 바이러스 회수
반응이 끝난 각 용액은 10배씩 단계희석하고 단계별 희석액을 미리 96-well plate에 배양한 세포에 처리하여 배양하였다.
(1)염색
25% 메틸알코올 (v/v), 0.5% 크리스털바이올렛 (w/v)의 염색시약을 세포에 처리하여 10분 동안 염색하였다.
(2)염색결과 관찰
세포배양 플레이트의 염색된 well의 개수를 세어 Spearman-Karber법으로 역가를 산출하였다. 바이러스 역가와 로그감소는 아래의 바이러스 역가 계산식과 로그감소 계산식에 따라 결정하였다.
(3)바이러스 역가 계산식
L =
Figure 112021124502517-pat00029
L (Log
Figure 112021124502517-pat00030
TCID
Figure 112021124502517-pat00031
역가)
Figure 112021124502517-pat00032
(모든 시험 접종이 양성인 최저 희석액 역수의 로그(Log
Figure 112021124502517-pat00033
)값)
Figure 112021124502517-pat00034
(희석 계수의 로그(Log
Figure 112021124502517-pat00035
)값)
Figure 112021124502517-pat00036
(각 희석에 사용된 시험 접종 수)
Figure 112021124502517-pat00037
(
Figure 112021124502517-pat00038
중 양성 시험 접종 수)
Figure 112021124502517-pat00039
(Sum of the proportion of positive tests beginning at the lowest dilution
showing 100% positive result)
(4)로그감소(log reduction, LR)계산식
LR =
Figure 112021124502517-pat00040
Figure 112021124502517-pat00041
(바이러스 대조군의 역가 (아무 처리도 하지 않은 그룹))
Figure 112021124502517-pat00042
(바이러스 시험군의 역가 (시험 시료로 처리된 그룹))
각 시험 바이러스의 로그감소 및 퍼센트 감소결과는 표1과 같았다. 호흡기세포융합바이러스는 oraCMS1 상청액 처리에 의해 2시간 및 4시간 후 99.9% 이상 감소하는 것을 알 수 있었다. 인플루엔자 에이 바이러스 H1N1의 경우 oraCMS1 상청액 처리 2시간 후 99.9% 이상 감소하였으며 4시간 후에는 99% 이상 감소하였다. 로타바이러스 에이는 oraCMS1 상청액 처리 1시간,2시간,4시간 후 99% 이상 감소하였다.
본 발명은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 발효액의 상청액을 유효성분으로 함유하는 상기도 감염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.
Contact time (h) RSV H1N1 RVA
Log reduction 1 2.87 2.50 ≥2.50
2 ≥3.25 ≥3.00 ≥2.38
4 ≥3.00 ≥2.75 ≥2.00
Percent (%)reduction 1 ≥99.0 ≥99.0 ≥99.0
2 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.0
4 ≥99.9 ≥99.0 ≥99.0
(실시예 2)
실시예 1에서 얻은 웨이쎌라속 유산균인 웨이쎌라 사이베리아 CMS1 KCTC 10678BP를 MRS 배지에서 배양한 후 37℃에서 24시간 배양하여 원심분리하여 유산균 발효물의 무세포상청액을 돼지감자 전분에 흡입시켜 동결건조하여 분말화하여 호흡기 바이러스 감염 및 장염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제조한다.
(실시예 3) 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원( Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액 농도에 따른 항바이러스 효과
(실시예 3-1) 호흡기세포융합바이러스에 대한 효과
하기 표 2, 3, 4 및 도 6은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액 100% 용액 및 이를 배양액으로 희석한 배양상청액 75%, 50%, 25%, 10% 용액에 대하여 항호흡기세포융합바이러스 효과를 실험하여 나타낸 것이다.
Contact time (h) oraCMS1
0 100% 75% 50% 25% 10%
0 7 7 7 7 7 7
0.5 7 4 5 3.5 4 4.5
1 6.75 3.2 2.88 2.5 3.5 3.88
2 6.75 2.5 2.5 1.5 3 3.5
4 6.5 2.5 2.5 1.2 3 3.5
Contact time (h) oraCMS1(Log reduction on RSV)
100% 75% 50% 25% 10%
0.5 3.0 2.0 3.5 3.0 2.5
1 3.8 4.12 4.5 3.5 3.12
2 4.5 4.5 5.5 4 3.5
4 4.5 4.5 5.8 4 3.5
Contact time (h) oraCMS1(Percent (%) reduction on RSV)
100% 75% 50% 25% 10%
0.5 ≥99.9 ≥99.0 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.0
1 ≥99.9 ≥99.99 ≥99.99 ≥99.9 ≥99.9
2 ≥99.99 ≥99.99 ≥99.999 ≥99.99 ≥99.9
4 ≥99.99 ≥99.99 ≥99.999 ≥99.99 ≥99.9
표 2 및 도 6은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액의 농도에 따른 호흡기세포융합바이러스에 대한 역가계산결과를 나타낸 것이고, 표 3은 로그감소값, 표4는 퍼센트 감소결과를 나타낸 것이다. 상기 표 2, 3, 4 및 도 6에 따르면, 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액 농도가 50%인 경우가 나머지 100%, 75%, 25%, 10%인 경우와 비교하여 월등히 우수한 항바이러스 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있다.
(실시예 3-2) 인플루엔자 에이 바이러스에 대한 효과
하기 표 5, 6, 7 및 도 7은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액 100% 용액 및 이를 배양액으로 희석한 배양상청액 75%, 50%, 25%, 10% 용액에 대하여 항인플루엔자 에이 바이러스 효과를 실험하여 나타낸 것이다.
Contact time (h) oraCMS1
0 100% 75% 50% 25% 10%
0 6.88 6.88 6.88 6.88 6.88 6.88
0.5 6.88 4.2 4 3.8 4.5 4.8
1 6.63 3 3.2 2.87 3.5 4.13
2 6.5 2.8 2.5 2 3 3.5
4 6.25 2.5 2 1.5 3 3.5
Contact time (h) oraCMS1(Log reduction on H1N1)
100% 75% 50% 25% 10%
0.5 2.68 2.88 3.08 2.38 2.08
1 3.88 3.68 4.01 3.38 2.75
2 4.08 4.38 4.88 3.88 3.38
4 4.38 4.88 5.38 3.88 3.38
Contact time (h) oraCMS1(Percent (%) reduction on H1N1)
100% 75% 50% 25% 10%
0.5 ≥99.0 ≥99.0 ≥99.9 ≥99.0 ≥99.0
1 ≥99.9 ≥99.9 ≥99.99 ≥99.9 ≥99.0
2 ≥99.99 ≥99.99 ≥99.99 ≥99.9 ≥99.9
4 ≥99.99 ≥99.99 ≥99.999 ≥99.9 ≥99.9
표 5 및 도 7은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액의 농도에 따른 인플루엔자 에이 바이러스에 대한 역가계산결과를 나타낸 것이고, 표 6은 로그감소값, 표 7는 퍼센트 감소결과를 나타낸 것이다. 상기 표 5, 6, 7 및 도 7에 따르면, 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액 농도가 50%인 경우가 나머지 100%, 75%, 25%, 10%인 경우와 비교하여 월등히 우수한 항바이러스 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있다.
(실시예 3-3) 로타 바이러스에 대한 효과
하기 표 8, 9, 10 및 도 8은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액 100% 용액 및 이를 배양액으로 희석한 배양상청액 75%, 50%, 25%, 10% 용액에 대하여 항로타바이러스 효과를 실험하여 나타낸 것이다.
Contact time (h) oraCMS1
0 100% 75% 50% 25% 10%
0 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25
0.5 6.25 3.5 4 3 4 4.5
1 6 2.5 2.5 2 3.5 3.5
2 5.88 2 1.5 1 3 3.5
4 5.5 2 1.25 1 3 3.5
Contact time (h) oraCMS1(Log reduction on RVA)
100% 75% 50% 25% 10%
0.5 2.75 2.25 3.25 2.25 1.75
1 3.75 3.75 4.25 2.75 2.75
2 4.25 4.75 5.25 3.25 2.75
4 4.25 5 5.25 3.25 2.75
Contact time (h) oraCMS1(Percent (%) reduction on RVA)
100% 75% 50% 25% 10%
0.5 ≥99.0 ≥99.0 ≥99.9 ≥99.0 ≥90.0
1 ≥99.90 ≥99.90 ≥99.99 ≥99.0 ≥99.0
2 ≥99.99 ≥99.99 ≥99.999 ≥99.9 ≥99.0
4 ≥99.99 ≥99.999 ≥99.999 ≥99.9 ≥99.0
표 8 및 도 8은 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액의 농도에 따른 로타바이러스에 대한 역가계산결과를 나타낸 것이고, 표 6은 로그감소값, 표 7는 퍼센트 감소결과를 나타낸 것이다. 상기 표 8, 9, 10 및 도 8에 따르면, 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원(Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 배양 상청액 농도가 50%인 경우가 나머지 100%, 75%, 25%, 10%인 경우와 비교하여 월등히 우수한 항바이러스 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있다.

Claims (5)

  1. 유산균 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 발효액의 상청액을 유효성분으로 함유하는 상기도 감염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물로서,
    상기 유산균 웨이쎌라 사이베리아 씨엠에스원 (Weissella cibaria CMS1; oraCMS1) 발효액의 상청액의 농도는 50%인 것을 특징으로 하는 상기도 감염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 감염 바이러스는 호흡기세포융합바이러스(Human respiratory syncytial virus), 인플루엔자 에이 바이러스 (Human Influenza A; H1N1)와 로타바이러스 에이(Rotavirus A)인 것을 특징으로 하는 상기도 감염 바이러스 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 상기도 감염으로 인한 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴, 조류독감, 돼지독감 중의 하나인 것을 특징으로 하는 상기도 감염균 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 발효액의 상청액을 돼지감자 전분에 흡입시켜 동결건조하여 분말화함을 특징으로 하는 상기도 감염균 질환 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
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