KR20200054594A - 호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주 및 이를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주 및 이를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091(Lactobacillus plantarum Probio-091) 균주(KCTC13625BP) 및 이를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 부작용이 없고, 항 조류인플루엔자 바이러스 효능을 가질 뿐만 아니라 지질대사 급성호흡곤란증후군 억제 또는 치료가 가능한 호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주 및 이를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 발명의 효과를 가진다.

Description

호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주 및 이를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물{Novel lactobacillus plantarum Probio-091 improving respiratory immunity, and Composition for reduction or treatment of avian influenza virus and acute respiratory distress syndrome comprising the same}
본 발명은 호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주 및 이를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 부작용이 없고, MDCK 세포와 수정란에서 H1N1 혹은 H9N2 조류인플루엔자 바이러스에 의한 세포 괴사 및 달걀 배아의 사멸을 억제하며, 리포폴리사카라이드에 의해 손상 받은 마우스의 폐 조직의 치료를 가능하게 하는 호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주 및 이를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱(Probiotics)은 살아 있는 미생물로 적당량 섭취한 경우 섭취자의 건강에 도움이 되는 것으로 WHO에서 정의하고 있다. 최근 프로바이오틱 연구에서 보고된 건강에 도움이 되는 다양한 기능으로는 항병원성세균 활성으로 병원성 미생물을 억제하여 급성 감염성 설사 억제, 면역조절 활성으로 아토피성 면역질환 개선, 장내 균총 개선으로 과민성대장증후군 완화, 항 조류인플루엔자 바이러스 억제 등이 있으며, 프로바이오틱 미생물에 포함되는 유산균은 일반적으로 안전한 균 (GRAS)에 속하는 균주로 간주되고 있다.
WHO에서 공시한 살아있는 균주에 대한 개념과 더 불어 최근 프로바이오틱 연구에서는 생존력이 소실된 열처리 사균에서도 프로바이오틱 미생물의 기능성이 나타난다는 보고가 있다. 생존성을 가지고 있지 않아도 세균의 세포벽이 가지는 면역자극 효과 혹은 열처리 과정에서 단편화된 DNA가 숙주의 RNAi에 관여하는 효과 등이 특정 균주의 사균에서 프로바이오틱 기능이 나타나는 원인으로 설명되고 있다 ((Fujiki 등 2012, Biosci.Biotechnol.Biochem.76:918~922). (Demont 등 2015, J.Allergy Clin.Immunol. 137:1264~1267). 분류학적 관점에서 유산균 중 프로바이오틱 유산균으로 가장 많이 생산되고 소비되는 균은 Bifidobacterium 속과 Lactobacillus 속의 균들이다. Bifidobacterium 속과 Lactobacillus 속 중에 Lactobacillus plantarum을 포함하여 몇 가지의 종(species)은 일반적으로 섭취 후 장에 도달하였을 때 유산을 생산하여 장환경을 산성으로 만들어 유해균의 생육을 저해하는 기능을 가짐으로 GRAS로 간주되는 몇 종들은 균주(strain)의 차이에 관계없이 유해균 억제, 배변활동 원할 등의 기능을 나타내고 있는 프로바이오틱 균주로 인정되고 있다. 하지만, 일부 프로바이오틱 전문가 그룹에서는 미생물 분류학적 측면에서 보았을 때 어떠한 유산균 종(species)이 프로바이오틱으로 효과를 가지기도 하지만 한 종을 구성하는 여려 균주 중에 지정된 한 균주가 특정한 효과를 나타냄으로 특정 효과를 나타내는 균주 특이적인 프로바이오틱 연구 및 개발을 주장하고 있다.
인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 조류 및 포유동물에서 감기 증상의 원인이 되는 병원성 바이러스로 분류학적으로는 Orthomyxoviridae에 속하는 RNA virus이다. 인플루엔자 바이러스에 의한 병증은 약한 감기 증상이 많지만 일부 간헐적으로 심각한 증상을 일으킨다. 공통적인 감염 증상은 고열, 콧물, 목통증, 근육통증, 심한 두통, 기침, 피곤함 등으로 이러한 증상이 바이러스 감염 후 2~3일 이내에 나타나서 2주 이상 지속되기도 한다. 이러한 감기 증상은 전국적 혹은 전 세계적으로 급속히 확산하는 경향을 보이기도 한다.
인플루엔자 바이러스는 Type A, Type B, Type C 로 크게 나누어지는 가장 많은 질병을 일으키는 것은 A형이다. 인플루엔자 바이러스 A형 바이러스 입자 표면에 있는 hemagglutinin(HA)과 neuraminidase(NA) 두 단백질의 종류에 따라 더 구체적으로 구분된다. 여러 종류의 HA 단백질과 여러 종류의 NA 단백질의 조합하여 특정한 형태의 다양한 인플루엔자 바이러스 입자의 조합이 가능한데, 이러한 조합 중 H1N1는 1918년의 스페인 독감 2009년의 신종 플루 감염, H2N2는 1957년의 아시아 독감, H3N2은 1968년 홍콩 독감, H5N1은 2004년의 조류 독감의 원인으로 많은 인명피해를 유발하였다.
조류에서 발생하여 인간도 숙주가 될 수 있는 조류인플루엔자 바이러스의 경우, 조류에서 자연 적인 바이러스 표면 입자의 재조합으로 매년 새로운 형태의 바이러스 입자가 만들어지고, 변이를 가진 철새에 의해 주기적으로 새로운 인플루엔자 바이러스의 발생 가능성이 상존하고 있다. 인플루엔자 바이러스의 감염 억제를 위해 예방접종 방법이 꾸준히 시도되고 있으나 이 바이러스 높은 돌연변이 빈도로 인해 매년 새로운 항원을 접종해야 하는 문제가 있다. 감염 초기에 사용할 수 있는 치료제로는 항바이러스 약제로 neuraminidase 저해제 혹은 M2 단백질 저해제가 사용될 수 있다. Neuraminidase 저해제로는 oseltamivir과 zanamivir이 처방될 수 있고 M2 단백질 저해제로는 adamantane 유도체가 처방될 수 있으나, 이들 약제에 내성을 가지는 조류인플루엔자 바이러스가 발견되고 있음으로 현 시점에서 새로운 약제 개발이 계속 진행 중이다.
이러한 조류인플루엔자 바이러스에 의한 감염을 억제하고 치료할 수 있는 접근법으로 프로바이오틱으로 이용되는 유산균을 적용하려는 시도가 진행되고 있다. 일본 Makino 연구팀에 의해 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1이 면역을 개선하여 일반 감기에 효과가 있음이 증명 되었다(2010, British J. Nutrition, 104:998-1006). 대한민국에서도 프로바이오틱으로 이용 가능한 유산균을 이용한 바이러스 억제 효과가 꾸준히 보고되고 있다. 류코노스톡 메젠테로이드 CLUM0617, 류코노스톡 시트레움 CLUC0620, 락토바실러스 프란타럼 CLP0611, 락토바실러스 파라카제이 CLPC0603 가 저병원성 조류인플루엔자 혈청형 H9N2 바이러스를 억제한다고 보고되었고(대한민국 등록특허 제10-0808910호), 락토바실러스 프란타럼 GB-LP1가 H9N2 바이러스를 억제한다고 보고되었으며(대한민국 특허공개번호 10-2014-0022506호), 락토바실러스 프란타럼 DK119가 H1N1을 억제한다고 보고 되었고(대한민국 특허공개번호 10-2015-0044764호, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501가 H1N1 및 H9N2를 억제한다고 보고 되었다(대한민국 공개 10-2010-0049827호), 본 발명자도 락토바실러스 사케이 probio-65 및 그 조성물로 조류인플루엔자 바이러스 H9N2를 억제하는 대한민국 특허등록 제10-1241385호를 제안한 바 있다.
한편, 급성호흡곤란증후군(Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)은 의학적인 증상으로 외상, 패혈증, 폐렴 등의 다양한 병리학적 원인으로 나타난다. 가장 두드러진 병증은 폐에서 강한 염증반응으로 호중성 백혈구 보충, 간질성 부종, 상피보전 파괴, 폐 유연조직 손상을 동반한다(Ware LB, 2006, Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine 27: 337-349). 이러한 급성호흡곤란증후군 병증은 개개 환자의 나이와 사전 병력에 따라 다르지만 높은 치사율을 나타내기도 한다. 동물에서도 급성호흡곤란증후군 증상이 나타나는데, 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharides, LPS)를 비강으로 주입하여 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험 쥐의 폐에 나타나는 임상병리학적인 현상 사람에게 나타나는 증상과 비슷하다.
사람의 경우 급성호흡곤란증후군의 병증 발현은 폐의 폐포(肺胞)와 모세혈관이 손상되어 혈액과 수액이 폐포 사이 공간으로 누출되어 마침내 기낭(氣囊) 자체로 혈액과 수액이 누출되는 것으로 시작된다. 그 후 폐포의 기능이 감소로 흡입 공기에서 혈액으로의 산소 이동이 저해되어 산소 수치를 급격하게 떨어진다. 또한, 산소 수치 감소는 손상된 폐 세포와 백혈구에서 분비된 염증 유발 사이토카인(cytokine)이 혈류로 이동하여 다른 신체 기관에 염증과 합병증을 유발할 수 있다. 급성호흡곤란증후군이 발병한 직후 또는 며칠 또는 몇 주일 후 기관 부전 상태가 시작될 수 있고, 급성호흡곤란증후군이 있는 사람의 경우 폐 감염에 대한 저항력이 약해져서 세균성 폐렴이 발생하는 경향이 있다.
리포폴리사카라이드는 그람 음성 세균의 세포 외막의 주요 구성성분으로 endotoxins으로 작용하기도 한다. 이러한 리포폴리사카라이드가 분무 형태로 코 비강으로 주입된 경우 염증성 사이토카인 생산을 증가시켜 급성호흡곤란증후군을 유발한다(Mei 등, 2007). 또한, 리포폴리사카라이드가 Toll-like receptor 4(TLR4)를 활성화하여 면역반응을 유발하고 결과적으로 폐가 급성으로 손상된다는 보고도 있다 (Imai 등, 2008). 최근에도, 급성호흡곤란증후군은 심각한 질병으로 환자의 사망률이 30%에 달한다(Gunnarsson 등, 2013; Læknablađiđ 99: 443-448). 현재 급성호흡곤란증후군 증상이 발생한 환자의 주 치료방법은 산소공급을 증가시키는 것으로 안면 마스크 또는 비관을 통해 산소를 공급하며, 이를 통해서도 혈중 산소 수치가 낮거나 흡입해야 하는 산소량이 많은 경우 경구기관 삽입법, 기관절제술 등으로 기계적 환기를 사용하고 있다. 인공 호흡기 치료를 제외한 약물 치료로 효과가 검증된 것은 아직 없으나, 항 염증 및 폐포 손상에 대한 치료로 표면활성물질 (surfactant), 중성구 엘라스타아제(elastase) 효소 저해제, 스테로이드 등이 연구되고 있고, 폐 혈관 장애에 대한 치료로 혈중 단백질 C, 외인계 응고억제제 (Tissue factor pathway inhibitor), 산화질소(NO)가 연구되고 있고, 폐 부종에 대한 치료로 Beta-2 agonist의 연구가 진행 중이다. 이상의 다양한 약제가 급성호흡곤란증후군 치료에 사용되고 있으나, 급성호흡곤란증후군의 기준에 맞는 환자군 전체의 사망률을 낮추는 약제는 없다(손장원, 2010; 대한내과학회지, 79: 1-7).
급성호흡곤란증후군에 의한 폐 손상의 초기는 폐포 대식세포에서 각종 사이토카인 (cytokine; IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α)이 분비되어 폭발적인 염증 반응이 시작되고, 폐 조직으로 중성구의 침윤이 늘어난다. 이중 인터루킨-6(IL-6)은 염증반응을 유발하는 사이토카인 역할과 염증 반응을 억제하는 미오카인의 역할을 모두 가진다. IL-6은 화상이나 기타 조직 손상 시 염증 반응을 유도하는 등의 면역반응을 자극하는 사이토카인으로 T 세포와 마크로파지에서도 분비된다. 또한, IL-6은 조직에 감염이 발생한 경우 감염원과 싸우는데 중요한 역할을 하여, 쥐의 경우 Streptococcus pneumoniae에 대항하는 면역반응에 필요하다고 알려져 있다. 염증 반응 억제인자로의 IL-6의 역할은 TNF-alpha와 IL-1 억제 효과 및 IL-1ra 과 IL-10의 활성화 효과를 통해 나타난다. TNF-α (tumor necrosis factor alpha)는 주로 마크로파지에 의해 생성되며, TNF-α의 주 역할은 면역세포의 조절이다. TNF-α 생성의 조절장애는 알츠하이머(Alzheimer's disease), 악성종양(cancer), 우울성 장애(major depression), 건선(psoriasis), 염증성 장(腸)질환(inflammatory bowel disease)등의 다양한 질병과 관련되어 있다.
급성호흡곤란증후군에 대처할 수 있는 증명된 약물이 없는 현 상황에서 병증의 완화 및 치료를 위한 약물의 개발이 필요한 상황이다. 김치유산균은 대부분이 GRAS에 속하는 안전한 유산균으로, 면역 조절에 의한 피부개선, 혈중 콜레스테롤 수준 감소, 항 독감 바이러스 등의 다양한 기능이 있음이 알려지고 있다. 급성호흡곤란증후군은 각종 사이토카인에 의해 병증 발현이 전달됨으로써, 면역조절 기능이 있는 김치유산균 중에는 급성호흡곤란증후군에 의해 발생되는 병증의 개선에 기여할 수 있는 균주가 있을 것으로 충분히 예상되나 현재, 상업적으로 이용 가능한 급성호흡곤란증후군 억제 및 치료 효과가 우수한 유산균 관련 기술은 보고되고 있지 아니한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 부작용이 없고, 항 조류인플루엔자 바이러스 효능을 가질 뿐만 아니라 지질대사 급성호흡곤란증후군 억제 및 치료가 가능한 호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주 및 이를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적은 하기 설명되는 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.
본 발명은 호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091(Lactobacillus plantarum Probio-091) 균주(KCTC13625BP)를 제공한다.
여기서, 상기 균주는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료 효능이 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주(KCTC13625BP)를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주(KCTC13625BP)는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체인 것을 특징으로 한다.
상기 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주(KCTC13625BP)는 배양액을 원심분리한 후 세포만 회수하여 동결보호제와 혼합 후 동결 건조하여 제조된 생균인 것을 특징으로 한다.
상기 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주(KCTC13625BP)는 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 균주를 우유에서 발효한 요구르트를 포함한 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 발효식품인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 부작용이 없고, 항 조류인플루엔자 바이러스 효능을 가질 뿐만 아니라 지질대사 급성호흡곤란증후군 억제 또는 치료가 가능한 호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주 및 이를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 발명의 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 프란타럼 Probio-091은 리포폴리사카라이드에 의해 야기된 급성호흡곤란증후군의 증상인 폐 조직의 손상을 개선시킬 수 있다.
도 1은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091(Lactobacillus plantarum Probio-091)의 미생물 분류학적 위치를 나타내는 neighbor joining 방법으로 그린 계통도이다.
도 2 (A)는 혈액한천배지에서의 락토바실러스 프란타럼 Probio-091이 음성 용혈반응을 나타낸 사진이고, (B)는 혈액한천배지에서 Streptococcus aureus KCTC 1621 균주가 양성 용혈반응을 나타내는 사진이다.
도 3은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091에 의한 조류인플루엔자 바이러스 H1N1의 MDCK 세포 사멸 억제를 나타내는 현미경 사진이다.
도 4는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091에 의한 조류인플루엔자 바이러스 H9N2의 MDCK 세포 사멸 억제를 나타내는 현미경 사진이다.
도 5는 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체 투여에 의해 변화되는 실험동물 폐 무게의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 6은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물 폐 조직의 조직병리학적 변화를 관찰한 사진이다.
도 7은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물의 폐 조직의 폐포 표면 면적 (Alveolar surface area) 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물의 폐 조직의 폐포 격벽의 평균 두께 (Mean alveolar septum thickness) 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물의 폐 조직의 염증 세포 수 (Inflammatory cell numbers) 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(1차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의해 변화된 IL-6 mRNA 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
도 11은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(1차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의해 변화된 TNF-α mRNA 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
도 12는 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(2차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의한 실험동물 폐 무게의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(2차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의해 변화된 IL-6 유전자 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
도 14는 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(2차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의해 변화된 TNF-α 유전자 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 상술한 목적, 특징 및 장점들은 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명함으로써 더욱 명백해질 것이다. 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로 기술되는 것은 아니고, 본 발명의 범위는 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다
이하, 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 호흡기 면역개선용 신규한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 16S rRNA 유전자 염기서열은 유전자 등록번호 KT339389로 GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록되었다. 또한, 본 발명자는 신규한 락토바실러스 프란타럼 균주를 Lactobacillus plantarum Probio-091이라고 명명하고, 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에 2018년 8월 17일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC13625BP). 이에 본 발명은 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) Probio-091(수탁번호: KCTC13625BP) 균주를 제공한다.
실시예
실시예 1: 조류인플루엔자 바이러스 억제용 김치유산균의 분리 및 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 특성
실시예 1-1: 조류인플루엔자 바이러스 억제용 김치유산균 분리
대한민국 전국의 각 지역에서 채집한 다양한 종류의 김치 시료를 단계적으로 멸균 배지에 희석하고 유산균 선택용 배지에 도말한 후 생육하는 유산균을 분리하였다. 분리한 1200개의 김치유산균을 대상으로 항 조류인플루엔자 바이러스 활성의 유무를 MDCK 세포에서 세포변성효과 감소 검사로 확인하여 조류인플루엔자 바이러스 억제 활성이 가장 우수한 균주인 Probio-091을 선별하였다.
분리된 김치유산균은 유산균 배양용 배지인 MRS 액체 배지에서 24시간 배양하였다. 유산균 배양액을 원심 분리하여 유산균 세포와 세포가 제거된 배양액을 분리하고, 균체가 제거된 배양액은 4℃에서 보관하면서 항 조류인플루엔자 바이러스 활성 측정에 사용하였다. 항바이러스 활성 측정에는 1배 혹은 10배 농도의 균체가 제거된 배양액(cell-free supernatant)을 사용하였다. MDCK 세포를 감염대상으로 수행한 세포변성효과 감소 측정을 위해 H1N1 바이러스를 김치유산균 배양액과 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 이 혼합액을 96 well plate에 분주된 MDCK 세포에 감염하고 감염된 MDCK 세포를 72시간 배양하였다. MDCK 세포에 나타나는 세포 변성은 배양 도중 현미경 관찰로 판별하였다.
실시예 1-2: 김치유산균 Probio-091의 동정
분리한 김치유산균 Probio-091의 미생물 분류학적 위치 파악을 위해 Probio-091의 16S rRNA 유전자 서열을 확인하고 밝혀진 Probio-091의 서열을 기존에 알려진 표준 유산균주의 16S rRNA 유전자와 비교하여 상동성을 조사하였다. Probio-091의 16S rRNA 유전자는 세균의 16S rRNA 증폭에 사용되는 27f 프라이머(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492r 프라이머(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)로 증폭하였다. 증폭된 16S rRNA 유전자의 염기서열은 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit과 capillary 3730 DNA Analyzer로 분석하여 약 1400 개의 염기서열을 확보하였다.
Probio-091의 16S rRNA 유전자 염기서열을 Genbank와 ChunLab의 유전자 서열 정보와 비교하여, Probio-091의 16S rRNA 유전자 염기서열이 락토바실러스 프란타럼 표준균주인 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 14917 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열인 gene bank 등록번호 ACGZ01000098 염기서열과 100% 일치함을 확인하였다. 16S rRNA 유전자 상동성이 높은 유산균을 서열을 ClustalW 프로그램으로 multiple alignment하고 alignment 된 서열을 이용하여 neighbor-joining method로 계통도를 작성하였다. 도 1은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091(Lactobacillus plantarum Probio-091)의 미생물 분류학적 위치를 나타내는 neighbor joining 방법으로 그린 계통도이다. 도 1에 도시된 바와 같이 16S rRNA 유전자 계통도에서도 Probio-091 균주는 락토바실러스 프란타럼 표준균주와 가장 가깝게 연결됨이 확인되어 Probio-091 균주를 락토바실러스 프란타럼으로 동정하였다.
실시예 1-3: 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 탄소원 이용성
미생물은 각각의 보유한 유전자의 특성에 따라 대사 과정에 이용할 수 있는 탄수화물의 종류가 상이하다. 락토바실러스 프란타럼 Probio-091을 이용하여 산을 생산할 수 있는 탄수화물을 확인하고자 API 50 CHL strip 과 API CHL medium를 사용하여 탄소원 이용성을 확인하였다. 검사방법은 제작사인 API bioMerieux(USA)에서 권장한 방법으로 생육이 왕성한 상태의 미생물 집락을 취하여 살균 수에 현탁 하여 균의 농도가 108 CFU/mL되는 균 현탁액을 조제하고, 이 현탁액 2ml를 10ml의 APL 50CHL 배지에 넣어 완전하게 섞은 후, API 50CHL strips에 분주하고, mineral oil로 덮어 공기와의 접촉을 차단하고, 48 시간 동안 37℃ 항온기에서 배양하였다. 배양 과정에 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 대사로 균체 주변의 pH가 낮아지면 배지의 색이 변하는 현상으로 탄수화물의 이용성을 확인하였다. API CHL 배지에는 bromocresol purple 지시약이 포함되어 있어 산이 생성하면 배지의 색이 노란색으로 변한다.
락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 API 50 CHL strip은 시험의 결과 D-xylose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, L-rhamnose, D-mannitol, D-sorbitol, N-acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D-cellobiose, D-maltose, D-lactose, D-melibiose, D-saccharose, D-trehalose, D-melezitose, D-raffinose, gentiobiose, D-turanose, D-tagatose, 그리고 D-arabitol에서 양성반응을 나타내었다.
표 1은 API CHL kit를 이용하여 확인한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 탄소원 이용성을 나타내는 표이다.
Carbohydrates Acid production Carbohydrates Acid production
Control - Esculin +
Glycerol - Salicin +
Erythritol - D-cellobiose +
D-arabinose - D-maltose +
L-arabinose + D-lactose +
D-ribose + D-melibiose +
D-xylose - D-saccharose +
L-xylose - D-trehalose -
D-adonitol - Inulin +
Methyl-β-D- xylopyranoside + D-melezitose -
D-galactose + D-raffinose -
D-glucose + Amidon (starch) -
D-fructose + Glycogen -
D-mannose - Xylitol +
L-sorbose - Gentiobiose -
L-rhamnose - D-turanose -
Dulcitol - D-lyxose +
Inositol + D-tagatose -
D-mannitol + D-fuccose -
D-sorbitol - L-fuccose -
Methyl-a-D-mannopytanoside + D-arabitol -
Methyl-a-D-glucopyranosside + L-arabitol +
N-acetylglucosamine + Potassium Gluconate -
Amygdalin + Potassium 2-Ketogluconate -
Arbutin - Potassium 5-Ketogluconate -
실시예 1-4: 락토바실러스 프란타럼 Probio -091의 항생물질 감수성
항생제 감수성 검사를 위해 락토바실러스 프란타럼 Probio-091를 37℃에서 24 시간 MRS 한천평판 배지에서 배양하였다. 배양한 세균 집락을 살균수로 희석하여 균체의 농도가 McFarland 표준액 1번과 동일한 탁도의 균체 현탁액을 조제하고(OD600nm 기준 1.2~1.6), 현탁액을 LSM 배지에 1:500의 비율로 접종하였다. 항생물질 감수성 검사용 배지(LAB susceptibility test medium는 IST 액체배지와 MRS 액체배지를 9:1로 혼합하고 pH 6.7로 산도를 조절한 후 사용하였다. 유럽 식품 안전청(European Food Safety Authority) 지침에 따라 항생제에 대한 감수성을 확인하였다. 사용한 항생제는 gentamicin (0.5~256 mg/L, Tokyo chemical industry Co; Ltd, Tokyo, Japan), kanamycin (2~1024 mg/L, Biopure reagent, Seoul Korea), streptomycin (0.5~256 mg/L, Tokyo chemical industry Co; Ltd, Tokyo, Japan), tetracycline (0.125~64 mg/L, Tokyo Chemical Industry Co; Ltd, Tokyo, Japan), erythromycin (0.016~8 mg/L, Tokyo Chemical Industry Co; Ltd, Tokyo, Japan), clindamycin (0.032~16 mg/L, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), chloramphenicol (0.125~64 mg/L, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 그리고 ampicillin (0.032~16 mg/l, Biopure reagent, Seoul Korea)이었다.
검사한 각각의 항생제에 대한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 최소 저해농도 (MIC; minimum inhibitory concentration)는 0.5mg/L gentamicin, 4mg/L kanamycin, 2mg/L streptomycin, 8mg/L tetracycline, 0.125 mg/L erythromycin, 0.125 mg/L clindamycin, 4 mg/L chloramphenicol, 그리고 0.25 mg/L ampicillin이었다. European Food Safety Authority에 의해 제시된 MIC이하의 농도 생육이 억제 되었으므로, 항생물질 감수성 관점에서 락토바실러스 프란타럼 Probio-091는 안전한 것으로 판정되었다.
표 2은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 항생제 감수성을 나타내는 표이다. 밑줄 친 수치는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 MIC를 나타낸다. 회색으로 표시된 항의 수치는 유럽 식품 안전청의 지침에 표시된 항생제 MIC농도를 나타낸다. 락토바실러스 프란타럼 Probio-091는 항생제가 포함되지 않은 모든 A 실험군에서 생육하였고, 배지만 포함되고 미생물과 항생물질이 포함되지 않은 모든 B 실험군에서는 생육하지 않았다.
　 < MIC >MIC mg/l
Antibiotics A1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 B12
Ampicillin P 0.03 0.06 0.13 0.25 0.5 1 2 4 8 16 N
Gentamycin P 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Kanamycin P 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 N
Streptomycin P 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
Erythromycin P 0.02 0.03 0.06 0.13 0.25 0.5 1 2 4 8 N
Clindamycin P 0.03 0.06 0.13 0.25 0.5 1 2 4 8 16 N
Tetracycline P 0.13 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 N
Chloramphenicol P 0.13 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 N
실시예 1-5: 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 용혈성
용혈성 검사는 생육이 활발한 상태의 락토바실러스 프란타럼 Probio-091을 이용하여 진행하였다. 용혈성 확인을 위한 혈액한천배지는 tryptone soy agar 배지에 최종 5% (v/v) 양 혈액을 첨가하여 조제한 후 사용하였다. 액체 배양하여 12시간이 지나지 않은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091을 혈액한천배지에 접종한 후, 혈액한천배지를 37°C로 온도가 유지되는 이산화탄소배양기(8% CO2)에서, 48시간 배양 후 용혈현상을 관찰하였다. 용혈반응은 생성된 세균 집락 주변 나타나는 투명한 부위의 존재 유무로 판별하였다.
도 2 (A)는 혈액한천배지에서의 락토바실러스 프란타럼 Probio-091이 음성 용혈반응을 나타낸 사진이고, (B)는 혈액한천배지에서 Streptococcus aureus KCTC 1621 균주가 양성 용혈반응을 나타내는 사진이다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091은 혈액한천배지에서 집락을 형성하였으나, 집락 주위에 투명한 영역이 관찰되지 않아 용혈성이 없는 것(A)으로 판정하였다. 한편 용혈성이 있는 Streptococcus aureus KCTC 1621 균주는 혈액한천배지에서 용혈성 양성 반응(B)이 나타났다.
실시예 2: 락토바실러스 프란타럼 Probio -091의 조류인플루엔자 바이러스 억제활성
실시예 2-1: 조류인플루엔자 바이러스의 숙주세포인 MDCK 세포 배양
조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus)의 감염력 저해는 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포의 생육 저해 유무로 판정하였다. MDCK 세포(KTCC® AC30015)는 KTCC에서 분양받았다. MDCK 세포에 배양은 high-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 배지에 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) (HyClone, Logan, UT), 1% (v/v) 100U/mol penicillin 와 100 μg/ml streptomycin 용액을 첨가한 배지를 사용하였고, 실온(23 ± 1℃)에서 배양하였다.
실시예 2-2: 조류인플루엔자 바이러스 H1N1 및 H9N2의 배양
조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus) H1N1(A/Korea/01/2009)은 한국질병관리본부에서 분양받아 김치유산균의 바이러스 감염성 억제 실험에 사용되었다. H1N1 (A/Korea/01/2009)은 수정란을 이용하여 배양하였다. 닭의 배아를 생육시키기 위해 특정병원체부재 달걀을 70%(v/v) 에탄올 용액으로 세척한 후 습도를 유지한 35℃ 달걀배양기에서 11일간 배양하였다. 11일 후 수정란의 요막 공간에 주사기를 이용하여 H1N1 바이러스를 주입하고, 주입한 부분은 오염을 막기 위해 밀랍으로 봉인하였다. 바이러스가 감염된 달걀은 후 습도를 유지한 35℃ 달걀배양기에서 3일간 배양하였다. 그 후 달걀을 4℃에서 ~18시간 보관한 다음 체액회수를 진행하였다. H1N1 바이러스가 포함된 요막액은 주사기로 회수하였으며, 회수 후 -80°C에서 보관하거나 감염성 실험에 사용하였다. 요막액에 포함된 바이러스의 역가는 50% 말단희석방법을 이용하여 측정하고 (Reed & Muench; 1938 Am J Hyg 27, 493~497), 배아감염용량 (embryo infection dose) 105.5EID50/0.1ml로 확인하였다.
저병원성 조류인플루엔자 바이러스 H9N2 (low-pathogenic avian influenza virus) (AchickenKoreaMS961996, H9N2)는 수의과학검역원에서 분양 받아 사용하였다. H9N2 바이러스는 상기 H1N1 바이러스 배양방법과 동일하게 수정된 특정병원체부재 달걀을 이용하여 배양하고 배양한 달걀에서 회수 하였다. 바이러스 액은 50% 말단희석방법을 적용하여 희석하여 역가가 배아감염용량 106. 5EID50/0.1ml인 것으로 확인하였다.
실시예 2-3: 유산균의 항 조류인플루엔자 바이러스 활성측정
실시예 2-3-1: 유산균에 의한 세포변성효과 감소 측정
락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 세포변성효과 감소는 in vitro에서 MDCK 세포를 이용하여 측정하였다. 배양한 MDCK 세포를 96-well culture plate에 well 당 x104 세포가 들어가게 분주하였다. 락토바실러스 프란타럼 Probio-091를 유산균 배양용 배지인 MRS 액체 배지에 배양한 후 제균 필터를 통화시켜 균체가 제거된 배양액을 준비하였다.
H1N1 바이러스를 균체가 제거된 배양액과 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 이 혼합액을 96 well plate에 분주된 MDCK 세포에 감염하고 72시간 배양하였다. MDCK 세포에 나타나는 세포 변성은 배양 도중 현미경 관찰로 판별하였다.
H1N1를 MDCK 세포와 반응시키면 MDCK 세포가 변하는 세포변성효과가 나타난다. 그러나, 이러한 MDCK 세포변성은 1배 혹은 10배의 부피의 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균 제거 배양액에 처리한 후 바이러스 양 105. 5EID50/0.1ml에서 72시간 후 감소되거나 나타나지 않았다. 그럼으로, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091이 조류독감바이러스에 의하여 MDCK 세포에 나타나는 세포변성효과를 감소시킴을 나타낸다.
락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균 제거 배양액의 처리양의 경우 1배 처리에서는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 원액(20)에서 H1N1 감염에 의한 세포변성을 억제하였으나 10배 처리에서는 21배 및 22배 희석한 실험군에서도 H1N1에 의한 세포변성억제가 관찰되었다.
MDCK 세포에 H9N2 바이러스를 감염한 경우에 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양 원액(21)에서 H9N2 감염에 의한 세포변성을 억제하였으며, 10배 농도 처리에서는 22배 및 23배 희석한 실험군에서도 H9N2에 의한 세포변성억제가 관찰되었다.
표 3은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균 제거 배양액의 H1N1 감염에 의한 MDCK 세포변성효과의 감소를 나타내는 표이다. 바이러스는 역가가 105.5EID50/0.1ml인 것을 사용하였으며, + 기호는 인플루엔자 바이러스 효과가 있음을 나타낸다.
균 제거 배양액 vol. Two fold dilution
20 21 22 23 24
1X + 0 0 0 0
10X ++ + + 0 0
균 제거 배양액 vol. Two fold dilution
20 21 22 23 24
1X ++ + 0 0 0
10X ++ ++ ++ + 0
실시예 2-3-2: 락토바실러스 프란타럼 Probio -091의 배양 상등액의 열안정성 측정
락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 항 바이러스 활성이 온도에 따라 변화하는지 H1N1 바이러스에 감염된 MDCK 세포의 세포변성효과의 감소로 확인하였다. 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양 상등액 10X 시료를 30, 45, 60, 90, 121℃에서 각각 5, 10, 15분 열처리한 시료를 H1N1에 처리하였다. 처리한 H1N1를 96 well plate에서 MDCK 세포에 감염한 후 배양과정 MDCK 세포의 세포변성효과의 감소를 관찰하였다.
락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양 상등액 10X 시료는 열처리에 의해 H1N1 바이러스의 MDCK 세포변성 유발이 억제되지 않았다. 매 24시간씩 4일간 배양하면서 관찰한 결과 모든 실험군에서 세포변성이 억제되었다.
표 5는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 배양 상등액의 열안정성을 나타내는 표이다.
온도 시간 24h 48h 72h 96h
30˚C 5min + + + +
10min + + + +
15min + + + +
45˚C 5min + + + +
10min + + + +
15min + + + +
60˚C 5min + + + +
10min + + + +
15min + + + +
90˚C 5min + + + +
10min + + + +
15min + + + +
121˚C 5min + + + +
10min + + + +
15min + + + +
실시예 2-3-3: 유산균에 의한 적혈구응집반응 감소 측정
적혈구응집반응은 조류인플루엔자 바이러스가 적혈구와 반응하는 공통적인 현상이다. 균체가 제거된 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액과 고온고압 처리된 배양액의 적혈구응집반응 감소를 측정하였다. 균체가 제거된 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액과 배아감염용량(embryo infection dose) 105. 5EID50/0.1ml의 바이러스를 혼합한 후, 5% 이산화탄소 세포 배양기에서 37℃로 유지하며 1시간 동안 배양하였다. 배양된 혼합액을 순차적으로 희석하고 동량의 1% SPF chicken red blood cell(RBC)과 혼합하고 실온에서 2~3시간 방치한 후 적혈구응집반응을 확인하였다. 유산균 배양액 첨가 없이 조류인플루엔자 바이러스와 적혈구를 반응한 실험군을 음성반응구로 사용하였다.
혈구응집실험에서 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균 제거 배양액이 바이러스의 HA 단백질이 관여한다고 알려져 있는 닭혈구응집반응을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 균 제거 배양액은 1배 혹은 10배 혹은 열처리된 균 제거 배양액에서도 혈구응집반응을 억제하였다. H1N1와 H9N2 바이러스는 각각 24희석 농도와 26희석 농도에서도 응집반응이 억제되었다.
표 6은 조류인플루엔자 바이러스 H1N1에 대한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균 제거 배양액의 적혈구응집반응을 나타내는 표이다. 조류인플루엔자 바이러스 H1N1은 역가가 105. 5EID50/0.1ml인 것을 사용하였으며, + 기호는 적혈구응집반응 감소 효과가 있음을 나타내고, 0 기호는 적혈구응집반응이 발생함을 나타낸다.
Sample name Two fold dilution
20 21 22 23 24 25 26
배양액 (10X) ++ ++ ++ ++ ++ + 0
열처리배양액 (10X) ++ ++ ++ ++ ++ + 0
표 7은 조류인플루엔자 바이러스 H9N2에 대한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균 제거 배양액의 적혈구응집반응을 나타내는 표이다. 조류인플루엔자 바이러스 H9N2는 역가가 105. 5EID50/0.1ml인 것을 사용하였으며, + 기호는 적혈구응집반응 감소 효과가 있음을 나타내고, 0 기호는 적혈구응집반응이 발생함을 나타낸다.
Sample name Twofold dilution
20 21 22 23 24 25 26 27 28
배양액 (10X) ++ ++ ++ ++ ++ ++ + 0 0
열처리배양액 (10X) ++ ++ ++ ++ ++ ++ + 0 0
실시예 2-3-4: 달걀에서 항 조류인플루엔자 바이러스의 활성측정
난에서의 항바이러스 검사(In ovo antiviral assay)실험은 항 조류인플루엔자 바이러스 N1N1의 감염력 억제 실험으로 수정된 특정병원체부재 달걀에 시험물질을 처리한 H1N1 바이러스 감염 후 감염력 억제 정도를 측정하였다. 조류인플루엔자 바이러스의 억제용 시료로는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균 제거 배양액, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균 제거 배양액 열처리 시료, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균체를 사용하였다. 조류인플루엔자 바이러스의 억제 약물인 타미플루 (Tamiflu; Oseltamivir phosphate)를 억제반응 양성 실험군으로 사용하였다. 실험군 1과 2는 H1N1과 배양액 1X, 10X을 반응하였다. 실험군 3은 H1N1과 세포를 반응시켰다. 실험군 4는 H1N1과 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균체(3x108CFU/ml)을 반응시켰다. 실험군 5는 H1N1만 달걀에 감염시켰다. 실험군 6은 H1N1과 타미플루를 반응시켰다. 각각의 실험군은 2개의 특정병원체부재 달걀에 접종하였다. 생존한 달걀의 수를 항 바이러스 활성 판정에 이용하였다. 사용한 인플루엔자 바이러스는 역가가 105. 5EID50/0.1ml인 시료를 특정병원체부재 달걀 감염용으로 사용하였다.
무처리 H1N1에 감염된 달걀은 모두 생존하지 못했다. 열처리 유무에 관계없이 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액 10X을 처리한 H1N1에 감염된 달걀은 모두 생존했다. 타미플루 처리, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균체 처리, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액 1X을 처리한 H1N1에 감염된 달걀은 각각 50%만이 생존했다.
도 3은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091에 의한 조류인플루엔자 바이러스 H1N1의 MDCK 세포 사멸 억제를 나타내는 현미경 사진이고, 도 4는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091에 의한 조류인플루엔자 바이러스 H9N2의 MDCK 세포 사멸 억제를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, MDCK only는 무처리 실험군으로 정상적인 MDCK 세포의 모습이고, MDCK+YML015(1X)+H1N1 실험군은 MDCK 세포에 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액과 H1N1를 처리한 실험군이며, MDCK+YML015(10X)+H1N1 실험군은 MDCK 세포에 10배의 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액과 H1N1를 처리한 실험군이고, MDCK+H1N1 실험군은 MDCK 세포에 H1N1를 처리한 실험군이다. 여기서, 조류인플루엔자 바이러스 H1N1만 처리한 경우 MDCK 세포가 사멸되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, MDCK only는 무처리 실험군으로 정상적인 MDCK 세포의 모습이고, MDCK+YML015(1X)+H9N2 실험군은 MDCK 세포에 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액과 H9N2를 처리한 실험군이며, MDCK+YML015(10X)+H9N2 실험군은 MDCK 세포에 10배의 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액과 H9N2를 처리한 실험군이며, MDCK+H9N2 실험군은 MDCK 세포에 H9N2를 처리한 실험군이다. 여기서, 조류인플루엔자 바이러스 H9N2만 처리한 경우 MDCK 세포가 사멸되는 것을 확인할 수 있었다.
표 8은 수정란을 이용한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균 제거 배양액의 조류인플루엔자 바이러스 H1N1의 달걀 배아의 사멸 억제를 나타내는 표이다. aCFS는 Cell free supernatant를, bCFS(10X)는 10배 농도의 Cell free supernatant를, cHCFS(10X): 열처리한 cell free supernatant(10X)를, eT는 타미플루를, fPBS는 phosphate buffer 용액 (pH 7.4)을 나타낸다.
Group Dilution Survival/total
IFVA (H1N1)+CFSa 1:104 1/2
IFVA (H1N1)+CFS (10X)b 1:104 2/2
IFVA (H1N1)+HKCFS (10X)c 1:104 2/2
IFVA (H1N1)+CMd 1:104 (3x108CFU/ml) 1/2
IFVA (H1N1)+ Te 5mg/0.1ml 1/2
IFVA (H1N1) + PBSf 1:104 0/2
실시예 3: 동물모델을 이용한 락토바실러스 프란타럼 Probio -091에 의한 급성 호흡 곤란 증후군 억제
동물실험은 쥐를 대상으로 수행하였다. 동물실험은 2회 반복하였고 각기 다른 형태로 조제된 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양체, 균체 혹은 발효식품이 실험용 동물에 급여되었다. “실험쥐에서 Lipopolysaccharide에 의해 유도된 급성 호흡 곤란 증후군에 대한 Lactobacillus plantarum Probio-091의 효능”에 관한 본 동물 실험계획은 영남대학교의 동물실험윤리가이드라인에 따라 계획되었고, 영남대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)에서 승인 후 진행되었다(1차 실험 승인번호 2016-013; 2차 실험 승인번호 2016-020).
실시예 3-1: 실험 동물 섭취용 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 시료
한국의 전통발효식품인 김치에서 분리한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 는 분리 후 -80℃에서 보존하였다. 냉동 보존된 균주는 MRS broth(Difco laboratories, USA)배지에 접종하여 37℃의 배양기에 넣어 2~3회 계대 배양한 후 균의 생육이 우수해 진 상태의 균체를 마우스 실험용 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 스타터로 사용하였다. 그 후, 글루코즈 1 중량%, 효모 추출물 1 중량%, 소이펩톤 0.25 중량%, 폴리옥시에틸렌 소비탄 모노-올리에이트(Polyoxyethelene sorbitan mono-oleate) 0.1 중량%, 황산암모늄((NH4)2SO4) 0.1 중량%, 황산마그네슘(MgSO4) 0.01 중량%, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.1 중량% 및 물 90~99 중량% 를 포함하는 액체배양 배지를 121℃에서 15분간 멸균한 후, 이 배지를 이용하여 상기 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 를 37℃에서 24시간 동안 액체 배양함으로써 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액을 제조하였다.
동물임상 1차 실험에 사용한 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체 (whole cell culture)는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주를 상기 배지에서 배양한 배양액 자체를 의미하는 것으로, 균체와 균체의 대사산물이 함께 혼합되어 있는 것이다. 동물임상 2차 실험에 사용한 생균(live cell)은 상기 배양액을 원심분리하여 세포만 회수하여 동결보호제와 혼합 후 동결 건조하여 조제하였으며, 살아있는 상태의 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균체이다. 동물임상 2차 실험에 사용한 요구르트는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 생균이 포함된 발효유로 락토바실러스 프란타럼 Probio-091를 종균으로 이용하여 우유를 발효하여 조제하였다.
실시예 3-2: 실험동물 사육 (Animals and ethical approval)
동물실험은 동물을 쥐를 선택하였으며, 사용한 쥐는 생후 6주된 ICR 수컷 마우스를 사용하였다. ㈜중앙실험동물(Central Lab. Animal Inc., Korea)에서 공급받은 실험 동물은 실험 시작 전 1주일 동안 동물실험센터에서 생육 시키면서 실험 장소 및 온도에 순응시켰다. 실험 동물은 동일한 실내온도(23±2℃) 와 습도(60±5%)에서 12시간씩 낮과 밤의 주기가 반복되는 배양실의 우리에서 사육되었고, 실험 기간 전체에 물과 사료는 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
실시예 3-3: 급성 호흡 곤란 증후군 유발
그람 음성 세균의 세포 외막의 주요 구성성분인 리포폴리사카라이드는 정상적인 동물에 주입되었을 때 강한 면역반응을 유발한다. 정상 실험동물에 급성호흡곤란증후군을 유발하기 위하여 대장균 유래의 리포폴리사카라이드(Escherichia coli O55:B5; Sigma, MO, USA)를 실험동물의 비강으로 주입시켰다. 급성호흡곤란증후군의 증상인 폐 손상 유도를 위해 실험동물을 diethyl ether로 약하게 마취시킨 후, 50μl PBS 혹은 리포폴리사카라이드(20 mg/kg)를 실험동물의 비강으로 천천히 스며들게 하였다.
리포폴리사카라이드를 처리한 실험동물에 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 효과를 확인하기 위한 전배양체, 생균, 요구르트는 구강으로 주입하였으며, 급성호흡곤란증후군 치료물질인 dexamethasone은 리포폴리사카라이드 투입 1시간 전에 복강으로 주입하였다. 리포폴리사카라이드 비강 투입 시점 기준으로 7~8시간 후에 모든 실험군의 실험동물은 이산화탄소로 안락사시켰고, 폐 조직의 시료를 추가 분석을 위해 회수하였다.
실시예 3-4: 실험동물의 폐 시료의 무게 측정
안락사한 실험동물에서 절개하여 떼어낸 폐는 흡습지에 얻어 표면의 수분을 제거하고 건조 전 중량(wet weight)을 측정하였다. 건조 전 중량 측정 후, 80℃ 건조기에서 2일간 건조 후 건조 후 중량(dry weight)를 측정하였다. 폐 조직 부종의 정도를 파악하기 위해 건조 전과 후의 폐 중량 비율을 산출하였다.
실시예 3-5: 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물의 폐 조직의 조직병리검사
동물 실험 후 쥐의 폐 조직을 채취하였다. 채취한 폐 조직은 적절한 크기로 절단 후 10% neutral buffered formalin에 넣어서 24시간 동안 고정하였다. 파라핀이 삽입된 후 폐 조직을 미세 절단하여 3-4 μm 두께의 시료를 제작하였다. 각 실험군의 표본 절단 시료를 조직학적구조 관찰을 위해 hematoxylin 과 eosin 염색시약으로 염색하였다. 염색한 폐 조직은 광학현미경(Model Eclipse 80i, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
조직학적 검사는 폐 조직의 각각의 표본에서 두 개의 영역에서 행해져서, 각 실험군에서 유래한 폐 조직에서 6개의 영역이 조직형태학 분석에 사용되었다. 조직병리학자는 분석 전에 분석하려는 시료가 어떠한 실험군 유래의 시료인지 알지 못하게 하였다.
폐 조직의 미세한 변화를 관찰하기 위해 폐포 표면 면적 (alveolar surface area (ASA; %/mm2 of lung parenchyma), 폐포 격벽의 두께의 평균 (mean thickness of alveolar septum (μm) 그리고 침윤된 염증 세포 수의 평균 (mean infiltrated inflammatory cell numbers (cells/mm2 of lung tissues)을 컴퓨터 기반 자동 이미지 분석기(iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Vancouver, Quebec, Canada)를 이용하여 계산하였다. 최소 5회의 반복 측정으로 나온 값으로 조직형태 측정 값의 평균을 산출하였다.
실시예 3-6: 급성호흡곤란증후군 유발된 실험동물의 유전자 발현 검사
리포폴리사카라이드유발 급성호흡곤란증후군 유도 쥐의 폐 세포조직의 유전자 발현은 qPCR 반응 (Quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction) 으로 확인하였다. 임상시험 종료 후 채취한 시험 쥐의 폐 조직에서 RNA를 추출하였다. RNA 추출은 TrizolTM (Invitrogen, USA) 시약을 이용하였다. 추출한 RNA는 Nano Drop 핵산 정량 장치를 이용하여 파장 260nm와 280nm에서 흡광도를 측정하고, 측정한 파장의 강도를 환산하여 농도를 확인하였다. 추출된 폐 조직 RNA 1 μg을 주형으로 이용하여 Maxime RT premix (iNtRON Biotechnology)로 핵산 합성반응을 진행하여 cDNA를 만들었다. 폐 조직에서 발현된 유전자의 전사 정도(transcription level)는 RT-PCR (Stratagene 246 mix 3000p QPCR System, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)과 SYBR green (Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany)을 이용하여 정량적으로 비교하였다. 각각의 시료에 대한 RT-PCR 반응은 2번 진행하였고, 전사 정도는 각 조직에서 항상 일정하게 전사되는 β-actin 유전자의 전사 정도를 기준으로 비교하였다. 유전자 증폭에 사용된 프라이머는 Microgen (Korea)에서 구입하였다.
표 9는 급성호흡곤란증후군 유발 실험동물의 폐 조직 유전자 발현량을 비교하기 위해 선택한 유전자와 각 유전자의 증폭에 사용된 프라이머의 서열이다.
Target genes Orientation Sequences (5'->3')
IL-6 Forward AGGCACAGGGTCATCATCAA
　 Reverse ACTCCTTCTGTGACTCCAGC
TNF-α Forward TTCCCAAATGGCCTCCCTCTCATC
　 Reverse TCCTCCACTTGGTGGTTTGCTAC
실시예 3-7: 락토바실러스 프란타럼 Probio -091에 의한 급성호흡곤란증후군 억제 (1차 동물실험)
실시예 3-7-1: 급성호흡곤란증후군 억제 1차 동물실험의 실험군
일차동물실험의 실험군은 5개로 급성호흡곤란증후군 유발하지 않은 정상대조군(Normal Control), 리포폴리사카라이드로 급성호흡곤란증후군 유발 한 급성호흡곤란증후군 대조군 (ARDS Control), 리포폴리사카라이드로 급성호흡곤란증후군 유발 후 급성호흡곤란증후군 치료물질인 DEX (dexamethasone)을 5mg/kg의 농도로 희석하여 경구 투여한 급성호흡곤란증후군 치료 대조군, 리포폴리사카라이드로 급성호흡곤란증후군 유발 후 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 배양액 200mg/kg 혹은 300mg/kg 처리한 실험군으로 구성하였다.
표 10은 급성호흡곤란증후군 유발 쥐에서 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 효과를 확인 하기 위해 진행한 1차 실험의 각 실험군을 나타내는 표이다. Control은 정상 대조군, LPS 는 리포폴리사카라이드 처리 대조군, DEX는 dexamethasone 처리 실험군, whole cell culture는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체를 포함한 실험군을 나타낸다.
Group name Number of mice Treatment Dose
Control 6 PBS 1X
LPS 6 LPS 20 mg/kg
LPS+DEX 6 Dexamethasone 5mg/kg
LPS+whole cell culture 6 Whole cell culture of Probio-091 200mg/kg
LPS+whole cell culture 6 Whole cell culture of Probio-091 300mg/kg
실시예 3-7-2: 급성호흡곤란증후군 억제 1차 실험동물의 폐 무게의 변화
쥐를 대상으로 수행한 동물실험에서 리포폴리사카라이드 투여 후 7-8시간 후 모든 실험동물이 살아있었다. 모든 실험동물을 희생시켜 폐를 절개하였다. 폐 수분을 측정하여 부종의 정도를 측정하였다. 도 5는 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체 투여에 의해 변화되는 실험동물 폐 무게의 비율을 나타내는 그래프이다. 도 5에 도시된 바와 같이, Control은 무처리 실험군으로 정상적인 실험동물이고, LPS 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물이며, LPS+DEX는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물이고, LPS+whole cell culture 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체를 투여한 실험동물에서 도출한 폐의 건조 무게 비율이다. 리포폴리사카라이드 투여로 폐의 건조 전/건조 후 무게 비율(wet/dry weight ratio)이 대조구와 비교하여 약 50% 증가하였으나, 약제인 DEX와 전배양체의 투여로 건조 전/건조 후 무게 비율의 증가 폭이 상당량 감소하였다.
실시예 3-7-3: 급성호흡곤란증후군 억제 1차 실험동물 폐 조직의 병리학적 변화
리포폴리사카라이드 유발 급성호흡곤란증후군 유도 쥐의 폐 조직의 조직병리학적 변화 및 조직형태측정학적 변화측정을 위해 수행한 1차 동물시험 실험군인 정상(control), LPS control, LPS+DEX, LPS+whole cell culture (200mg/kg 과 300mg/kg) 처리 쥐의 폐 조직을 관찰하였다.
도 6은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물 폐 조직의 조직병리학적 변화를 관찰한 사진이다. 여기서, Control은 무처리 실험군으로 정상적인 실험동물; LPS 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물; LPS+DEX는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물; LPS+whole cell culture 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체를 투여한 실험동물에서 도출한 폐의 조직 관찰 사진이다. ASA는 폐포 표면 면적(Alveolar surface area)를 PB는 주세기관지(Primary bronchiole)를 각각 나타낸다.
도 7은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물의 폐 조직의 폐포 표면 면적 (Alveolar surface area) 변화를 나타내는 그래프이다. 여기서, Control은 정상적인 실험동물; LPS는 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물; DEXA는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물; LPS+WC는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체를 투여한 실험동물에서 도출한 결과이다.
도 8은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물의 폐 조직의 폐포 격벽의 평균 두께 (Mean alveolar septum thickness) 변화를 나타내는 그래프이다. 여기서, Control은 정상적인 실험동물; LPS는 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물; DEXA는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물; LPS+WC는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체를 투여한 실험동물에서 도출한 결과이다.
도 9는 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물의 폐 조직의 염증 세포 수 (Inflammatory cell numbers) 변화를 나타내는 그래프이다. 여기서, Control은 정상적인 실험동물; LPS는 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물; DEXA는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물; LPS+WC는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체를 투여한 실험동물에서 도출한 결과이다.
도 6 내지 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 급성호흡곤란증후군과 관련된 전형적인 조직병리학적 (histopathological) 특징인 심각한 폐포 표면 면적(alveolar surface area)의 감소(p<0.01), 폐포 격벽의 두께(thickness of alveolar septum (μm) 와 침윤된 염증 세포(infiltrated inflammatory cell numbers)의 증가가 정상 폐 세포와 비교하여 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유도된 쥐의 폐 조직에서 관찰되었다.
락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체의 급여는 급성호흡곤란증후군과 관련된 염증성 및 육종성의 조직병리학의 변화들 (inflammatory and sarcomatous histopathological changes)을 상당량 그리고 주입량과 비례하여 실험군에서 감소시켰다. 전배양체를 급여한 쥐에서의 병증 감소는 약제인 DEXA를 급여한 쥐에서의 감소 보다는 감소량이 적었다. ASA의 의미 있는 증가, 폐포 격벽 평균 두께의 감소, 침윤된 염증 세포 수(infiltrated inflammatory cell numbers)의 감소가 리포폴리사카라이드 만 처리한 실험군에 비해서 전배양체 200 mg/kg 및 300 mg/kg 처리 쥐의 폐 조직에서 통계적으로 유의성 있게 (각각 p<0.01 와 p<0.04) 관찰되었다.
실시예 3-7-4: 급성호흡곤란증후군 억제 1차 실험동물 폐 조직의 유전자 발현
리포폴리사카라이드로 급성호흡곤란증후군이 유도된 쥐 폐 조직에서 염증반응을 유발하는 IL-6 와 TNF-α 사이토카인 유전자의 발현량은 약제(Dexamethasone) 혹은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 구강섭취에 의해 큰 폭으로 변화하였다.
도 10은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(1차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의해 변화된 IL-6 mRNA 발현 정도를 나타내는 그래프이다. 여기서, Control은 무처리 실험군으로 정상적인 실험동물; LPS 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물; LPS+DEX는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물; LPS+whole cell culture 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 전배양체를 투여한 실험동물의 폐 조직에서 추출한 IL-6 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸다.
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 리포폴리사카라이드만을 처리한 실험동물에서는 무처리 대조군에 비해 약 280%의 IL-6 mRNA의 전사량 증가가 관찰되었으나, 리포폴리사카라이드에 의해 증가되는 IL-6 유전자 전사량은 dexamethasone 혹은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체의 급여로 급격하게 감소하였다. Dexamethasone 혹은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체의 급여시 무처리 실험군과 동일한 수준으로 낮은 양은 아니지만, LPS만 투여한 실험군에 비하여 50% 이하로 IL-6 유전자의 mRNA 발현량이 줄었다. 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체의 투여량을 비교하면 전배양체 300 mg/kg 투여 실험군에서 조금 더 많이 감소했으나, 200 mg/kg 투여한 실험군과 차이가 크지는 않았다.
도 11은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(1차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의해 변화된 TNF-α mRNA 발현 정도를 나타내는 그래프이다. 여기서, Control은 무처리 실험군으로 정상적인 실험동물; LPS 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물; LPS+DEX는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물; LPS+whole cell culture 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 전배양체를 투여한 실험동물의 폐 조직에서 추출한 TNF-α 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸다.
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 리포폴리사카라이드를 처리한 실험동물에서는 무처리 대조군에 비해 약 300% 이상의 TNF-α mRNA의 전사량 증가가 관찰되었으나, 리포폴리사카라이드에 의해 증가되는 TNF-α 유전자 전사량은 dexamethasone 혹은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체의 급여로 급격하게 감소하였다. Dexamethasone 혹은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체의 급여시 무처리 실험군과 동일한 수준으로 낮은 양은 아니지만, 리포폴리사카라이드 만 투여한 실험군에 비하여 55% 이하로 TNF-α 유전자의 mRNA 발현량이 줄었다. 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체의 투여량을 비교하면 전배양체 300 mg/kg 투여 실험군에서 조금 더 많이 감소했다.
실시예 3-8: 락토바실러스 프란타럼 Probio -091에 의한 급성호흡곤란증후군 억제 (2차 동물실험)
실시예 3-8-1: 급성호흡곤란증후군 억제 2차 동물실험의 실험군
이차 동물실험의 실험군은 8개로 급성호흡곤란증후군 유발하지 않은 정상대조군(Normal Control), 리포폴리사카라이드로 급성호흡곤란증후군 유발 한 급성호흡곤란증후군 대조군 (ARDS Control), 리포폴리사카라이드로 급성호흡곤란증후군 유발 후 급성호흡곤란증후군 치료물질인 dexamethasone을 5mg/kg 혹은 15mg/kg의 농도로 희석하여 경구 투여한 급성호흡곤란증후군 치료 대조군, 리포폴리사카라이드로 급성호흡곤란증후군 유발 후 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 생균을 107 CFU/g 혹은 108 CFU/g 처리한 실험군, 리포폴리사카라이드로 급성호흡곤란증후군 유발 후 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 요구르트를 107 CFU/g 혹은 108 CFU/g 처리한 실험군으로 구성하였다.
표 11는 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 효과를 확인하기 위해 진행한 2차 실험의 각 실험군을 나타내는 표이다. Control은 정상 대조군, LPS는 리포폴리사카라이드 처리 대조군, LPS+DEX는 dexamethasone 처리 실험군, LPS+live cells은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 live cell 처리 실험군, LPS+Yogurt는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 요구르트를 포함한 실험군을 나타낸다. 각 실험군은 6마리의 쥐로 구성되었다.
Group name Number of mice Treatment Dose
Control 6 PBS 1X
LPS 6 LPS 20 mg/kg
LPS+DEX 6 Dexamethasone 5 mg/kg
LPS+DEX 6 Dexamethasone 15 mg/kg
LPS+Live cells 107 6 PROBIO 091 live cells 107 CFU/g
LPS+Live cells 108 6 PROBIO 091 live cells 108 CFU/g
LPS+Yogurt 107 6 PROBIO 091 yogurt 107 CFU/g
LPS+Yogurt 108 6 PROBIO 091 yogurt 108 CFU/g
실시예 3-8-2: 급성호흡곤란증후군 억제 2차 실험동물의 폐 무게의 변화
쥐를 대상으로 수행한 동물실험에서 리포폴리사카라이드 투여 후 7~8시간 후 모든 실험동물이 살아있었다. 모든 실험동물을 희생시켜 폐를 절게 하였다. 폐 수분을 측정하여 부종의 정도를 측정하였다. 리포폴리사카라이드 투여로 폐의 건조 전/건조 후 무게 비율(wet/dry weight ratio)이 대조구와 비교하여 약 50% 증가하였으나, 약제인 DEX, live cell, 요구르트의 투여로 건조 전/건조 후 무게 비율의 증가 폭이 상당량 감소하였다.
도 12는 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(2차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의한 실험동물 폐 무게의 변화를 나타내는 그래프이다. 여기서, Control은 무처리 실험군으로 정상적인 실험동물; LPS 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물; LPS+DEX는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물; LPS+Live cell 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 live cell를 투여한 실험동물; LPS+Yogurt 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 요구르트를 투여한 실험동물에서 도출한 폐 무게 비율이다.
도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, DEX (15mg/kg)와 live cells (107 CFU/g)의 효과는 비슷하였고, live cells (108 CFU/g)의 건조 전/건조 후 무게 비율 감소 효과가 다른 실험군과 비교했을 경우 가장 높게 나타났다.
실시예 3-8-3: 급성호흡곤란증후군 억제 2차 실험동물 폐 조직의 유전자 발현
리포폴리사카라이드의 비강 투여로 급성호흡곤란증후군이 유도된 쥐 폐 조직에서 염증반응을 유발하는 사이토카인 유전자 발현 정도는 약제 혹은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091의 구강섭취에 의해 큰 폭으로 변화하여, 병증이 유발되지 않은 무처리 대조구와 비슷한 수준으로 사이토카인 유전자의 mRNA가 발현 되었다.
도 13은 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(2차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의해 변화된 IL-6 유전자 발현 정도를 나타내는 그래프이다. 여기서, Control은 무처리 실험군으로 정상적인 실험동물; LPS 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물; LPS+DEX는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물, LPS+Live cell 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 live cell를 투여한 실험동물; LPS+Yogurt 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 요구르트를 투여한 실험동물의 폐 세포에서 IL-6 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸다.
도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, IL-6의 전사 변화가 락토바실러스 프란타럼 Probio-091를 섭취한 실험동물의 폐 조직에 나타났다. 약제를 처리하지 않고 리포폴리사카라이드만 처리한 실험군과 비교했을 때, DEX 처리, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 생균 혹은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 요구르트 섭취는 쥐 실험동물 모델에서 IL-6 유전자의 mRNA가 발현을 투여량 의존적으로 줄이는 것으로 나타났다. 급성호흡곤란증후군 병증 감소를 위해 사용된 DEX, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 생균, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 요구르트 실험군 각각에서 IL-6 유전자의 mRNA가 발현을 감소는 투여량에 의존하여 감소폭이 증가하였다. DEX 5mg/kg 실험군보다 DEX 15mg/kg 실험군에서 IL-6 유전자가 적게 발현되었고, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 생균 107 CFU/g 처리 실험군보다 108 CFU/g 처리 실험군에서 IL-6 유전자가 적게 발현되었고, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 요구르트 107 CFU/g 처리 실험군보다 108 CFU/g 실험군에서 IL-6 유전자가 적게 발현되었다.
도 14는 리포폴리사카라이드에 의해 급성호흡곤란증후군이 유발된 실험동물에서(2차 동물실험) 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의해 변화된 TNF-α 유전자 발현 정도를 나타내는 그래프이다. 여기서, Control은 무처리 실험군으로 정상적인 실험동물; LPS 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 실험동물, LPS+DEX는 급성호흡기곤란증후군 발생 후 약제처리 실험동물; LPS+Live cell 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 live cell를 투여한 실험동물; LPS+Yogurt 실험군은 급성호흡기곤란증후군 발생 후 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 요구르트를 투여한 실험동물의 폐 세포에서 TNF-α 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸다.
도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, TNF-α는 주로 마크로파지에 의해 생성되어 면역세포의 조절로 염증반응에 관여한다. 급성호흡곤란증후군이 유발된 쥐 폐 조직의 TNF-α 유전자 전사량의 변화도 IL-6 유전자의 mRNA가 발현을 감소와 유사하게 약제인 DEX나 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 섭취에 의해 투여량 의존적으로 감소하였다. TNF-α mRNA의 발현양은 병증이 발현되지 않은 대조구와 비슷하게 DEX 처리, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 생균 혹은 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 요구르트 섭취한 실험군에서 나타났다. LPS로 급성호흡곤란증후군이 유발되어 증가하는 TNF-α 발현량이 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 투여에 의해 감소하는 것으로 나타났다. TNF-α 발현량이 유전자의 mRNA가 발현을 감소는 DEX, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 생균, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 요구르트 투여량에 의존하여 감소폭이 증가하였다. DEX 5mg/kg 실험군보다 DEX 15mg/kg 실험군에서 TNF-α 유전자 mRNA가 적게 발현되었고, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 생균 107 CFU/g 처리 실험군보다 108 CFU/g 처리 실험군에서 TNF-α 유전자 mRNA가 적게 발현되었고, 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 요구르트를 107 CFU/g 처리 실험군보다 108 CFU/g 실험군에서 TNF-α 유전자 mRNA가 적게 발현되었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정 실시예에 한정되지 아니한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능하며, 그러한 모든 적절한 변경 및 수정은 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원(KRIBB) KCTC13625BP 20180817

Claims (6)

  1. 락토바실러스 프란타럼 Probio-091(Lactobacillus plantarum Probio-091) 균주(KCTC13625BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료 효능이 있는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091(Lactobacillus plantarum Probio-091) 균주(KCTC13625BP).
  3. 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주(KCTC13625BP)를 포함하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주(KCTC13625BP)는 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 전배양체인 것을 특징으로 하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주(KCTC13625BP)는 배양액을 원심분리한 후 세포만 회수하여 동결보호제와 혼합 후 동결 건조하여 제조된 생균인 것을 특징으로 하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 락토바실러스 프란타럼 Probio-091 균주(KCTC13625BP)는 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 균주를 우유에서 발효한 요구르트를 포함한 락토바실러스 프란타럼 PROBIO 091 발효식품인 것을 특징으로 하는 조류독감 및 급성호흡곤란증후군의 예방 또는 치료용 조성물.
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