CN115737690B - 约氏乳杆菌在制备用于缓解急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种约氏乳杆菌在制备用于缓解急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用。将约氏乳杆菌应用在制备用于缓解急性呼吸窘迫综合征的药物中，约氏乳杆菌可以通过有效调节肠道微生物、缓解肺部炎症、缓解肺部氧化损伤和降低肺部细胞浸润从而有效缓解急性呼吸窘迫综合征。

Description

约氏乳杆菌在制备用于缓解急性呼吸窘迫综合征的药物中的 应用

技术领域

本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种约氏乳杆菌在制备用于缓解急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用。

背景技术

急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是常见的呼吸危重症，全球每年诊断出300多万ARDS患者，占重症监护病房(ICU)住院人数的10％。ARDS的临床特征为双侧胸片不透明，伴有非心源性肺水肿引起的严重低氧血症。ARDS的临床治疗目前无特效药物，仅有小潮气量机械通气等辅助治疗手段，因此ARDS有着高达35％–45％的医院死亡率，即便迅速缓解死亡率也高达为31％。ARDS的病因复杂，其最常见的危险因素是肺炎。近年来新发突发呼吸道病毒如SARS-CoV、高致病性H5N1禽流感病毒、人感染H7N9禽流感病毒及SARS-CoV-2的不断出现，罹患ARDS的患者愈发增加，因此急需研发新的ARDS的有效干预药物。

发明内容

针对以上问题，本发明目的在于提供一种约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)在制备用于缓解急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用，将约氏乳杆菌应用在缓解急性呼吸窘迫综合征的应用中，可以通过有效调节肠道微生物、缓解肺部炎症、缓解肺部氧化损伤或降低肺部细胞浸润从而有效缓解急性呼吸窘迫综合征。

为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供一种约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)在制备用于缓解急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用。

在一些具体实施例中，上述应用包括：约氏乳杆菌在制备用于调节肠道微生物的药物中的应用。需要说明的是，肠道微生物群由大约100万亿个驻留在胃肠道中的微生物的集体基因组组成。作为人体最庞大、最复杂的微生态系统，肠道微生物群对宿主的代谢，营养和免疫功能都有着重要贡献，被认为是许多疾病新疗法的潜在来源。肠道微生物同时也是人体健康系统的重要组成部分，肠道菌群不仅能预防和治疗肠道疾病，同时对于其他器官的作用也是至关重要，肠道微生物可以通过肠-肺轴对呼吸系统进行调控，影响呼吸系统疾病的发生发展。本发明发现ARDS患者的肠道菌群与健康人群相比，ARDS患者肠道菌群的α多样性与β多样性均出现显著变化，显示出菌群差异明显，约氏乳杆菌可以通过调节肠道微生物，从而缓解急性呼吸窘迫综合征。

在一些具体实施例中，上述应用包括：约氏乳杆菌在制备用于缓解肺部炎症的药物中的应用。需要说明的是，本发明中的约氏乳杆菌可以通过缓解肺部炎症从而减缓急性呼吸窘迫综合征。

在一些具体实施例中，上述应用包括：约氏乳杆菌在制备用于降低Il-1β和/或IL-6和/或TNF-α基因和/或MPO蛋白表达水平药物中的应用。需要说明的是，在ARDS中巨噬细胞浸润炎性细胞因子IL1β和IL-6、TNF-α的释放，肺泡毛细血管屏障完整性丧失，通透性增加，使得微生物及产物发生位移，造成全身炎症放大，并导致多器官衰竭。上述的约氏乳杆菌可以降低Il-1β和/或IL-6和/或TNF-α基因表达和/或MPO蛋白表达，减缓炎性细胞因子IL1β和IL-6、TNF-α的释放，从而缓解肺部炎症，进而减缓急性呼吸窘迫综合征。

在一些具体实施例中，上述应用包括：约氏乳杆菌在制备用于降低HO1和/或TXN蛋白表达的药物中的应用。需要说明的是，本发明中的约氏乳杆菌可以通过缓解肺部氧化损伤从而缓解急性呼吸窘迫综合征。

在一些具体实施例中，上述应用包括：约氏乳杆菌在制备用于降低HO1和/或TXN和/或MPO蛋白表达的药物中的应用。需要说明的是，本发明中的约氏乳杆菌可以通过降低HO1和/或TXN和/或MPO蛋白表达从而缓解急性呼吸窘迫综合征。

在一些具体实施例中，上述应用包括：约氏乳杆菌在制备用于降低肺部细胞浸润的药物中的应用。需要说明的是，本发明中的约氏乳杆菌可以通过降低肺部细胞浸润从而缓解急性呼吸窘迫综合征。

在一些具体实施例中，上述应用中的约氏乳杆菌优选保藏编号为ATCC33200的菌株，其保藏于美国菌种保藏中心。

还需要说明的是，约氏乳杆菌，革兰阳性菌。约氏乳杆菌常被认为是一种与乳类制品相关的细菌，在人体中发挥“益生菌”的作用。约氏乳杆菌的补充能改善多种疾病。在LPS诱导的ARDS小鼠中，约氏乳杆菌显著降低。曾有报道显示，约氏乳杆菌能够改善饮食引起的高胆固醇血症。在细胞实验中，约氏乳杆菌能够提高免疫反应。在动物实验中，约氏乳杆菌可以减轻炎症和应激来减轻结肠炎。然而，目前尚未有约氏乳杆菌能否改善急性呼吸窘迫综合征的研究报道。当前市场上的益生菌产品，多仅以补充益生菌为目标，没有深入研究益生菌株的功能，远远低估了益生菌的作用，更没有与ARDS相关的益生菌产品。本发明经过多轮的菌株功能的筛选，并在动物体内验证其健康效果，采用LPS气管滴注诱导ARDS模型联合约氏乳杆菌处理，进行测定肺泡灌洗液细胞计数、蛋白质浓度及肺组织炎症基因、组织病理学和氧化损伤及炎症蛋白表达，在给予C57小鼠两周约氏乳杆菌菌液灌胃后，气管滴注LPS，相较LPS诱发ARDS小鼠，肺泡灌洗液细胞浸润、肺部氧化损伤及炎症蛋白表达、病理组织损伤、肺组织炎症均下降。即说明本发明中筛选的约氏乳杆菌能通过减少了肺部细胞浸润，改善了肺组织的氧化损伤和组织损伤，从而改善减缓急性呼吸窘迫综合征。

本发明有益效果包括：将约氏乳杆菌应用在制备用于缓解急性呼吸窘迫综合征的药物中，约氏乳杆菌可以通过有效调节肠道微生物、缓解肺部炎症、缓解肺部氧化损伤和降低肺部细胞浸润从而有效缓解急性呼吸窘迫综合征。

附图说明

图1为LPS处理1天后诱导ARDS小鼠引起的肠道菌群的变化；

图2为约氏乳杆菌对LPS诱导ARDS小鼠的肺部细胞浸润的肺泡灌洗液中的细胞计数情况；

图3为约氏乳杆菌对LPS诱导ARDS小鼠的肺部细胞浸润的肺泡灌洗液的蛋白含量；

图4为约氏乳杆菌对LPS诱导ARDS小鼠肺组织病理学的影响。

图5为约氏乳杆菌对LPS诱导ARDS小鼠肺组织炎症基因IL-1β表达的影响；

图6为约氏乳杆菌对LPS诱导ARDS小鼠肺组织炎症基因IL-6表达的影响；

图7为约氏乳杆菌对LPS诱导ARDS小鼠肺组织炎症基因TNF-α表达的影响；

图8为约氏乳杆菌对LPS诱导ARDS小鼠的肺组织氧化应激及炎症蛋白表达的影响。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

以下实施例中，统计分析的方法为：数据用平均值±标准差(SEM)表示，采用独立样本T检验评估两组间差异，所有的图表都是由GraphPadPrism 8.0创建。

以下实施例中，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，保藏于美国菌种保藏中心，保藏机构简称：ATCC，菌株编号：ATCC33200。

一、约氏乳杆菌筛选、培养和ARDS小鼠模型建立

(1)约氏乳杆菌培养

(a)氏乳杆菌的增菌：约氏乳杆菌的增菌在厌氧操作台进行，准备1只15mLMRS肉汤(蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉8.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2)的试管。将购买的装有约氏乳杆菌菌株的试管表面消毒后，用酒精灯灼烧约氏乳杆菌菌株试管口，吸取0.1mL-0.2mL的菌液加入到含MRS肉汤的试管中，封口后放于15×30cm的密封厌氧培养袋，并立刻放入厌氧产气袋，在37℃厌氧培养箱(湿度65％)中静置培养至菌液浑浊或底部有大量菌体生长。

(b)约氏乳杆菌的菌液浓度计算：吸取0.1mL混合液于盛有10mLMRS肉汤的试管中，此稀释度为10^-1，重复以上过程作10倍比稀释，至10^-8稀释度，选择10^-6，10^-7，10^-8三个稀释度，吸取0.1mL菌液滴于MRS琼脂培养基(蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、Tween801.0g、醋酸5.0g、K₂HPO₄·7H₂O2.0g、柠檬酸三铵2.0g、MgSO₄·7H₂O0.2g、MnSO₄·4H₂O0.05g和琼脂15.0g，pH6.2±0.1，25℃)平板上，平板涂布后采用厌氧培养法(5％CO₂)将涂好的培养皿置37℃培养箱过夜培养。平板过夜长至菌落清晰不相连(12-24h)，数菌落个数(n)；根据计数结果绘制标准曲线，计算菌浓度。

计算公式：N(CFU/mL)＝n*d/v

N:平均菌落数d：稀释浓度v：涂板菌液体积。

(c)约氏乳杆菌的传代培养与保存：准备10支装有MRS肉汤培养基的试管，取500μL活化好的约氏乳杆菌菌液接种于试管，封口后放于15×30cm的密封厌氧培养袋，并放入厌氧产气袋；在37℃厌氧箱中静置培养1天后，明显可见液体培养基中菌液浑浊。菌种冻存管和60％无菌甘油(体积分数)高压灭菌后放入厌氧培养箱中，然后取菌液和甘油按照1：1的比例移入冻存管中，每管中加入1mL左右的细菌悬液，使甘油最终浓度达到30％，置-80℃保存。

(d)约氏乳杆菌菌菌液配置：约氏乳杆菌在培养后的72-80h达到对数期，用移液枪从对数生长期培养物中吸取1mL菌液于分光光度计样品池中，用紫外分光光度计检测OD600值(Optical Density)并确定菌液浓度。当OD600≈1时，菌液浓度约为10⁸-10⁹CFU/mL。细菌原液以6000×g离心5分钟后，去除上清液并将沉淀重悬于无菌PBS中制成约10⁸-10⁹CFU/mL细菌悬液。将该稀释菌液样本分装于灭菌离心管内密封，按照无菌传递要求将该样品对实验动物进行灌胃。

(2)ARDS小鼠模型构建

(a)选取40只6周龄的C57BL/6J雄性小鼠，室温保持在23±1℃，湿度保持在50±60％，光暗循环12小时，可随意获取清洁食品和水进行训化。

(b)将C57BL/6J小鼠分为PBS灌胃组、LPS气管滴注组、约氏乳杆菌灌胃组和约氏乳杆菌灌胃及LPS气管滴注组，每组10只；其中，PBS灌胃组联合LPS气管滴注组每天灌胃200uLPBS；约氏乳杆菌灌胃组和约氏乳杆菌灌胃联合LPS气管滴注组每天灌胃给予200uL(5*10⁷CFU/mL)菌液，每日给药时间固定，连续给予14天，每天收集小鼠粪便；LPS气管滴注于第11天进行，LPS气管滴注后72h，眼球取血，3000r/min离心，保留血清备用；取肺组织和肺泡灌洗液备用。

实施例1约氏乳杆菌筛选

差异菌株的筛选仅使用气管滴注LPS及PBS构建ARDS及对照小鼠模型，气管滴注后24h，收集小鼠粪便，分别检测小鼠粪便中的细菌16srRNA的变化，如图1所示，数据为气管滴注LPS后第一天组(LPS1组)与气管滴注PBS组(Vehicle)的粪便中细菌16srRNA的变化，筛选出ARDS中具有保护作用的菌株为约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)，如红框标记，相较于Vehicle组，LPS1组的(Lactobacillusjohnsonii)丰度显著降低。

实施例2肺组织细胞浸润参数评价

使用约氏乳杆菌菌株按照ARDS小鼠构建模型中内容进行建模，将得到的肺泡灌洗液立即检测细胞计数(Cellcounts)，结果如图2所示，Johnsonii+LPS组的肺泡灌洗液中细胞浸润减少(数据表示为平均值±标准差，N＝5，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；

另外，将上述得到的肺泡灌洗液2000r/min离心两次，储存在-80℃下进行蛋白质浓度(BCA)的分析，分析图3所示，Johnsonii+LPS组的肺泡灌洗液中蛋白含量降低(数据表示为平均值±标准差，N＝5，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；相较于PBS组，Johnsonii组的细胞总数和蛋白含量均无差异；与LPS组相比Johnsonii+LPS组小鼠的细胞总数和蛋白含量均减少。相比之下，Johnsonii+LPS处理显著降低了由LPS引起的肺部细胞浸润。

实施例3组织学分析

将采集的肺组织样品用新鲜制备的4％多聚甲醛固定，然后使用苏木精伊红染色(HE)，具体如下：取肺组织石蜡切片在65℃的烤箱中烘烤至少1.5小时，以确保组织切片上的石蜡充分融化；然后，将切片置于二甲苯中两次，以去除融化的石蜡，并在梯度乙醇中脱水。切片依次用苏木精和伊红染色，然后用乙醇脱水；染色后，切片在二甲苯澄清两次，用中性树脂固定；染色切片在光学显微镜下进行观察，分别放大100倍及400倍。

苏木精和伊红(H&E)染色的代表性图片如图4所示(上图，100×，比例尺＝100μm；下图，400×，比例尺＝100μm)，由图可知，相较于PBS组，Johnsonii组处理后小鼠肺组织没有发现显著的变化，LPS引起了肺部的病理损伤，相较于LPS组中肺部的病理损伤，在Johnsonii+LPS组中显示其得到缓解。因此Johnsonii的补充能减轻LPS引起的小鼠肺组织病理损伤。

实施例4肺组织中炎症相关基因分析

使用Quantitative-PCR测定肺组织样品中炎症基因(白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α))的表达，结果如图5、图6和图7(数据表示为平均值±标准差，N＝4，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)所示，Johnsonii+LPS组小鼠肺组织中Il-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著低于LPS处理小鼠，因此Johnsonii的补充能减轻LPS引起的小鼠肺组织炎症(P＜0.05)。

实施例5肺组织中氧化损伤及炎症相关蛋白分析

使用蛋白质印迹(WesternBlot)测定肺组织样品中氧化损伤及炎症蛋白(血红素加氧酶1(HO1)，硫氧还蛋白(TXN)，髓过氧化物酶(MPO))表达，检测结果如图8所示，在PBS和LPS组中HO1、TXN和MPO的蛋白表达无显著趋势；相较于LPS组小鼠，Johnsonii+LPS组小鼠的HO1、TXN、MPO的蛋白表达降低，蛋白质印迹结果表明Johnsonii+LPS组中Johnsonii的补充能够缓解LPS处理引起的肺部炎症和氧化损伤。

综上所述，本发明表明约氏乳杆菌对LPS诱发ARDS小鼠具有缓解作用，在LPS诱发ARDS小鼠中约氏乳杆菌丰度降低，同时约氏乳杆菌可以降低LPS引起的肺部细胞浸润、肺部炎症增加、肺组织氧化损伤和肺组织病理损伤，这种有益的作用是通过减轻氧化损伤、抑制炎症反应来实现的。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims (1)

1.约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)在制备用于缓解急性呼吸窘迫综合征的药物中的应用，其特征在于，约氏乳杆菌保藏于美国菌种保藏中心，保藏编号为ATCC33200。