WO2010128672A1 - 遺伝子組み換えゼラチンを含む血管新生誘導剤 - Google Patents

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amino acid
acid sequence
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gly
genetically modified
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荻原　一隆
乃梨子 石川
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Fujifilm Corp
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Definitions

  • the present invention relates to an angiogenesis inducer using genetically modified gelatin.
  • Angiogenesis mainly represents a phenomenon in which new blood vessels are formed from existing blood vessels.
  • angiogenesis there are angiogenesis related to angiogenesis in the embryonic period, endometrium and corpus luteum formation, wound healing and the like. Utilizing an angiogenic event for treatment is practiced as an angiogenic therapy.
  • the importance of angiogenesis has been clarified as a therapeutic method for wound healing, ischemic diseases, etc., and in treatments widely called regenerative medicine such as organ regeneration, cell transplantation, and natural healing effects. Because of the therapeutic effect of angiogenesis itself, or because angiogenesis enhances the therapeutic effect, therapeutic agents targeting angiogenesis have been developed.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • bovine pituitary gland a protein that strongly stimulates the proliferation of fibroblasts from bovine pituitary gland, and research was conducted energetically thereafter.
  • fibroblasts but also vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, corneal endothelial cells It has been shown to stimulate cell proliferation on many types of cells such as osteoblasts and chondrocytes.
  • angiogenesis inducer the growth factor is expensive, and it has been pointed out that the risk of canceration is expected because it actively induces blood vessels. There has been a demand for a material that can induce blood vessels without using the.
  • Patent Document 3 discloses a bFGF preparation using a cross-linked gelatin gel, but gelatin itself is a carrier for inclusion of bFGF, and no mention is made of the angiogenesis function of gelatin itself.
  • the present invention has been made to provide an angiogenesis-inducing agent that is safe for a living body and excellent in bioadhesiveness.
  • an angiogenesis-inducing agent comprising a genetically modified gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen.
  • the genetically modified gelatin has a repetition of a sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen (X and Y each independently represents one of amino acids) (a plurality of Gly-XY are the same)
  • the molecular weight is 2 KDa or more and 100 KDa or less.
  • the genetically modified gelatin has a repetition of a sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen (X and Y each independently represents one of amino acids) (a plurality of Gly-XY are the same)
  • the molecular weight is 10 KDa or more and 90 KDa or less.
  • the genetically modified gelatin has a repetition of a sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen (X and Y each independently represents one of amino acids) (a plurality of Gly-XYs are the same) Or may be different), including two or more cell adhesion signals per molecule.
  • the cell adhesion signal is an amino acid sequence represented by Arg-Gly-Asp.
  • the amino acid sequence of the recombinant gelatin does not include serine and threonine.
  • the amino acid sequence of the genetically modified gelatin does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine, and cysteine.
  • the amino acid sequence of the recombinant gelatin does not include the amino acid sequence represented by Asp-Arg-Gly-Asp.
  • the genetically modified gelatin is Formula: A-[(Gly-XY) n ] m -B (In the formula, A represents an arbitrary amino acid or amino acid sequence, B represents an arbitrary amino acid or amino acid sequence, n Xs independently represent any of the amino acids, and n Ys each independently represent an amino acid. N represents an integer of 3 to 100, and m represents an integer of 2 to 10. Note that n Gly-XY may be the same or different.
  • the genetically modified gelatin is Formula: Gly-Ala-Pro-[(Gly-XY) 63 ] 3 -Gly (In the formula, 63 X's each independently represent any amino acid, and 63 Y's each independently represent any amino acid. The n Gly-XY may be the same or different. Good.) Indicated by
  • the genetically modified gelatin is (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (2) an amino acid sequence having an angiogenic action having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the genetically modified gelatin is cross-linked.
  • crosslinking is performed with aldehydes, condensing agents, or enzymes.
  • the angiogenesis inducer of the present invention induces angiogenesis by accumulating at an angiogenesis site.
  • the present invention further provides a method for inducing angiogenesis, comprising administering a recombinant gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen to a subject in need of inducing angiogenesis. .
  • a genetically modified gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen for the production of an angiogenesis inducer.
  • angiogenesis-inducing agent of the present invention is characterized by containing genetically modified gelatin, it has no risk of canceration, is safe for the living body, and has excellent bioadhesiveness.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the amount of hemoglobin contained in blood in order to quantify the angiogenic effect.
  • FIG. 2 shows the results of the HUVEC cell adhesion test.
  • FIG. 3 shows the results of the HUVEC cell adhesion test.
  • FIG. 4 shows HUVEC cell photographs on plates coated with various proteins.
  • FIG. The area comparison of one HUVEC cell on the plate coated with various proteins is shown.
  • FIG. 6 shows inhibition of HUVEC cell adhesion by anti- ⁇ V antibody.
  • a genetically modified gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen can be used, for example, those described in EP1014176A2, US6992172, WO2004-85473, WO2008 / 103041, etc. However, it is not limited to these.
  • Preferred as the genetically modified gelatin used in the present invention is the genetically modified gelatin of the following embodiment.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention is excellent in biocompatibility due to the inherent performance of natural gelatin, and is not naturally derived.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention is more uniform than natural ones and the sequence is determined, the strength and degradability can be precisely designed with less blur due to cross-linking described later. It is.
  • the molecular weight of the genetically modified gelatin used in the present invention is preferably from 2 to 100 KDa. More preferably, it is 2.5 to 95 KDa. More preferably, it is 5 to KDa. Most preferably, it is 10 KDa or more and 90 KDa or less.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-X-Ys may be the same or different.
  • Gly-XY Gly represents glycine
  • X and Y represent any amino acid (preferably any amino acid other than glycine).
  • the GXY sequence characteristic of collagen is a very specific partial structure in the amino acid composition and sequence of gelatin / collagen compared to other proteins. In this part, glycine accounts for about one third of the whole, and in the amino acid sequence, it is one in three repeats. Glycine is the simplest amino acid, has few constraints on the arrangement of molecular chains, and greatly contributes to the regeneration of the helix structure upon gelation.
  • the amino acids represented by X and Y are rich in imino acids (proline, oxyproline), and preferably account for 10% to 45% of the total.
  • 80% or more of the sequence, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more of the amino acids are GXY repeating structures.
  • General gelatin has 1: 1 polar amino acids, both charged and uncharged.
  • the polar amino acid specifically means cysteine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, arginine, and among these polar uncharged amino acids are cysteine, asparagine, glutamine, serine. , Threonine, tyrosine.
  • the proportion of polar amino acids is 10 to 40%, preferably 20 to 30%, of all the constituent amino acids.
  • the ratio of the uncharged amino acid in the polar amino acid is 5% or more and less than 20%, preferably less than 10%. Furthermore, it is preferable that any one amino acid among serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine is not included in the sequence, preferably two or more amino acids.
  • the minimum amino acid sequence that acts as a cell adhesion signal in a polypeptide is known (for example, “Pathophysiology”, Vol. 9, No. 7 (1990), page 527, published by Nagai Publishing Co., Ltd.).
  • the genetically modified gelatin used in the present invention preferably has two or more of these cell adhesion signals in one molecule.
  • IKVAV sequence, LRE sequence, DGEA sequence, and HAV sequence are preferable, RGD sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, LGTIPG sequence, IKVAV sequence, and HAV sequence, and particularly preferably RGD sequence.
  • RGD sequences an ERGD sequence is preferred.
  • the number of amino acids between RGDs is not uniform between 0 and 100, preferably between 25 and 60.
  • the content of the minimum amino acid sequence is preferably 3 to 50, more preferably 4 to 30, and particularly preferably 5 to 20 per protein molecule from the viewpoint of cell adhesion and proliferation. Most preferably, it is 12.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is preferably at least 0.4%.
  • each stretch of 350 amino acids has at least 1 stretch.
  • it contains two RGD motifs.
  • the ratio of RGD motif to the total number of amino acids is more preferably at least 0.6%, more preferably at least 0.8%, more preferably at least 1.0%, more preferably at least 1.2%. And most preferably at least 1.5%.
  • the number of RGD motifs in the genetically modified gelatin is preferably at least 4, more preferably 6, more preferably 8, more preferably 12 or more and 16 or less per 250 amino acids.
  • a ratio of 0.4% of the RGD motif corresponds to at least one RGD sequence per 250 amino acids. Since the number of RGD motifs is an integer, a gelatin of 251 amino acids must contain at least two RGD sequences to meet the 0.4% feature.
  • the recombinant gelatin of the present invention comprises at least 2 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably comprises at least 3 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably at least 4 per 250 amino acids. Contains one RGD sequence.
  • it contains at least 4 RGD motifs, preferably 6, more preferably 8, more preferably 12 or more and 16 or less.
  • the genetically modified gelatin may be partially hydrolyzed.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention preferably has a repeating structure of A-[(Gly-XY) n ] m -B.
  • m is preferably 2 to 10, and preferably 3 to 5.
  • n is preferably 3 to 100, more preferably 15 to 70, and most preferably 50 to 65.
  • the naturally occurring collagen referred to here may be any naturally occurring collagen, but is preferably type I, type II, type III, type IV, and type V. More preferred are type I, type II and type III.
  • the collagen origin is preferably human, cow, pig, mouse, rat. More preferably, it is a human.
  • the isoelectric point of the genetically modified gelatin used in the present invention is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 10, and further preferably 7 to 9.5.
  • the genetically modified gelatin is not deaminated.
  • the genetically modified gelatin does not have procollagen and procollagen.
  • the genetically modified gelatin has no telopeptide.
  • the genetically modified gelatin is a substantially pure collagen material prepared with a nucleic acid encoding natural collagen.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; or (2) 80% or more (more preferably 90% or more, most preferably 95% or more) of homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, An amino acid sequence having an angiogenic effect; A genetically modified gelatin having
  • the genetically modified gelatin used in the present invention can be produced by a genetic recombination technique known to those skilled in the art, for example, according to the method described in EP1014176A2, US6992172, WO2004-85473, WO2008 / 103041, and the like. Specifically, a gene encoding the amino acid sequence of a predetermined recombinant gelatin is obtained, and this is incorporated into an expression vector to produce a recombinant expression vector, which is then introduced into a suitable host to produce a transformant. To do. By culturing the obtained transformant in an appropriate medium, genetically modified gelatin is produced.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention is prepared by recovering the genetically modified gelatin produced from the culture. be able to.
  • the performance of the genetically modified gelatin alone is insufficient, it may be mixed with other materials or combined.
  • different types of genetically modified gelatin other biopolymers or synthetic polymers may be mixed.
  • the biopolymer include polysaccharides, polypeptides, proteins, nucleic acids, antibodies and the like. Preferred are polysaccharides, polypeptides, and proteins.
  • polysaccharides, polypeptides, and proteins include collagen, gelatin, albumin, fibroin, and casein. Furthermore, these may be partially chemically modified as necessary. For example, hyaluronic acid ethyl ester may be used.
  • polysaccharide examples include glycosaminoglycans represented by hyaluronic acid and heparin, chitin, and chitosan.
  • polyamino acids examples include poly- ⁇ -glutamic acid.
  • the genetically modified gelatin used in the present invention can be chemically modified depending on the application.
  • Chemical modifications include the introduction of low molecular weight compounds or various polymers (biopolymers (sugars, proteins), synthetic polymers, polyamides) into the carboxyl group or amino group of the side chain of genetically modified gelatin, Examples include cross-linking between gelatins.
  • Examples of the introduction of the low molecular weight compound into the genetically modified gelatin include a carbodiimide-based condensing agent.
  • the crosslinking agent used in the present invention is not particularly limited as long as the present invention can be carried out, and may be a chemical crosslinking agent or an enzyme.
  • the chemical cross-linking agent include formaldehyde, glutaraldehyde, carbodiimide, cyanamide and the like. Preferred are formaldehyde and glutaraldehyde.
  • examples of cross-linking of genetically modified gelatin include light irradiation on gelatin into which a photoreactive group has been introduced, or light irradiation in the presence of a photosensitizer.
  • the photoreactive group include a cinnamyl group, a coumarin group, a dithiocarbamyl group, a xanthene dye, and camphorquinone.
  • the enzyme When performing cross-linking by an enzyme, the enzyme is not particularly limited as long as it has a cross-linking action between genetically modified gelatin chains.
  • trans-glutaminase and laccase most preferably trans-glutaminase is used for cross-linking. it can.
  • a specific example of a protein that is enzymatically cross-linked with transglutaminase is not particularly limited as long as it has a lysine residue and a glutamine residue.
  • the transglutaminase may be derived from a mammal or may be derived from a microorganism. Specifically, transglutaminase derived from a mammal that has been marketed as an Ajinomoto Co., Ltd.
  • Human-derived blood coagulation factors Factor XIIIa, Haematologic Technologies, Inc.
  • Factor XIIIa Haematologic Technologies, Inc.
  • guinea pig liver-derived transglutaminase goat-derived transglutaminase
  • rabbit-derived transglutaminase manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd., Upstate USA Inc., Biodesign International, etc. Etc.
  • the cross-linking of genetically modified gelatin has two processes: a process of mixing a genetically modified gelatin solution and a cross-linking agent and a process of reacting these uniform solutions.
  • the mixing temperature when the genetically modified gelatin is treated with the crosslinking agent is not particularly limited as long as the solution can be uniformly stirred, but is preferably 0 ° C. to 40 ° C., more preferably 0 ° C. to 30 ° C. More preferably, it is 3 ° C to 25 ° C, more preferably 3 ° C to 15 ° C, still more preferably 3 ° C to 10 ° C, and particularly preferably 3 ° C to 7 ° C.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the crosslinking proceeds, but is substantially 0 ° C. to 60 ° C., more preferably 0 ° C. to 40 ° C. in view of denaturation and degradation of the recombinant gelatin.
  • the temperature is preferably 3 ° C to 25 ° C, more preferably 3 ° C to 15 ° C, still more preferably 3 ° C to 10 ° C, and particularly preferably 3 ° C to 7 ° C.
  • a drug can be encapsulated as desired.
  • the drug is a physiologically active ingredient.
  • Specific examples include transdermal absorption agents, topical therapeutic agents, oral therapeutic agents, cosmetic ingredients, and supplement ingredients.
  • Specific examples of the drug include anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antibiotic agents, immunosuppressive agents, antioxidant agents, anticancer agents, vitamins, nucleic acids, and antibodies. Particularly preferred are anti-inflammatory agents.
  • As the anti-inflammatory agent either steroidal or non-steroidal may be used.
  • anti-inflammatory agents include, for example, aspirin, acetaminophen, phenachicene, indomethacin, diclofenac sodium, piroxicam, fenoprofen calcium, ibuprofen, chlorpheniramine maleate, diflunisal, dexamethasone sodium phosphate, paclitaxel, docetaxel, 5 -Fluorouracil, topotensin, cisplatin, rapamycin, tacrolimus, cyclosporine.
  • vitamins both water-soluble and fat-soluble are used.
  • Specific examples of the vitamin include vitamin A, vitamin B group, vitamin C, vitamin D group, vitamin E, and vitamin K, for example.
  • Specific drugs have been listed above, but as long as the genetically modified gelatin used in the present invention is used, the present invention is not limited to the drugs listed above.
  • an angiogenesis is achieved by administering a genetically modified gelatin having an amino acid sequence derived from the above-described partial amino acid sequence of collagen to a subject (for example, a mammal such as a human) in need of angiogenesis induction. Can be induced.
  • the angiogenesis-inducing agent of the present invention can be appropriately determined in dosage, usage, and dosage form according to the intended use.
  • the angiogenesis-inducing agent of the present invention may be directly administered to a target site in a living body, or distilled water for injection, physiological saline for injection, pH 5-8 buffer (phosphate system, citric acid) It may be suspended in a liquid excipient such as an aqueous solvent such as a system and administered by injection, coating, or the like. Further, it may be applied after mixing with an appropriate excipient to form an ointment, gel or cream.
  • the administration form of the angiogenesis inducer of the present invention may be oral or parenteral (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, etc.).
  • parenteral for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, etc.
  • direct injection into the heart muscle from the intraventricular lumen using a catheter, or catheter in the stenosis or occlusion part in the coronary artery It is also possible to release or apply them locally using.
  • Examples of the dosage form include orally administered drugs such as tablets, powders, capsules, granules, extracts and syrups, or injections (for example, intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections). Etc.) and the like.
  • the form of the angiogenesis-inducing agent of the present invention is not particularly defined, and examples thereof include sponges, films, nonwoven fabrics, fibers (tubes), particles, meshes and the like.
  • the formulation of the angiogenesis-inducing agent of the present invention can be performed according to methods known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutical carrier when the pharmaceutical carrier is a liquid, it can be dissolved or dispersed, and when the pharmaceutical carrier is a powder, it can be mixed or adsorbed.
  • pharmaceutically acceptable additives for example, preservatives, stabilizers, antioxidants, excipients, binders, disintegrants, wetting agents, lubricants, coloring agents, fragrances
  • Flavoring agents skin coats, suspending agents, emulsifiers, solubilizers, buffering agents, tonicity agents, plasticizers, surfactants or soothing agents, and the like.
  • the dose of the genetically modified gelatin is not particularly limited, but is, for example, 1 to 100 mg, preferably 1 to 50 mg per 1 cm 2 of the surface area of the organism to be administered.
  • Examples of the target diseases of the angiogenesis-inducing agent of the present invention include malignant tumor, ischemic disease, angiogenesis therapy, cell / tissue regeneration therapy, cell transplantation treatment, diabetic necrosis, ulcer, hearing loss, heart disease, arteriosclerosis, acute Examples include coronary syndrome, acute myocardial infarction, unstable angina, and sudden cardiac death.
  • CBE3 described below was prepared as a genetically modified gelatin (described in WO2008-103041).
  • the amino acid sequence of CBE3 does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine.
  • CBE3 has an ERGD sequence. Isoelectric point: 9.34
  • Amino acid sequence (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) (same as SEQ ID NO: 3 in WO2008 / 103041, except that X at the end is corrected to “P”)
  • GAP GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGAPG
  • the resulting gel was quenched at ⁇ 50 ° C. and lyophilized at ⁇ 10 ° C. for 48 hours.
  • the water content of the gel was measured from the change in the weight of the crosslinked R-Gel before and after the swelling treatment with PBS for 24 hours at 4 ° C., and was 95.4%.
  • the obtained gel was cut out at 5 mg.
  • vascular endothelial cells cannot be efficiently adhered in the PI-5 gel administration group.
  • the R-Gel preparation of the present invention when used, vascular endothelial cells can be actively adhered without using growth factors such as bFGF, and an angiogenic effect can be obtained.
  • hemoglobin B-Test Wako kit (Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • the R-Gel preparation 5 mg impregnated with 50 ⁇ l of the prepared PBS solution was implanted subcutaneously in the back of the mouse.
  • 50 ⁇ l of PBS solution was subcutaneously administered.
  • PI-5 gel (medgel) 5 mg impregnated with 50 ⁇ l of PBS solution was subcutaneously implanted.
  • HUVEC was cultured using endothelial cell basic medium-2 (serum-free) (EBM TM- 2) and endothelial cell medium kit-2 (2% FBS) (EGM TM- 2 BulletKit TM ) (Takara Bio Inc.) .
  • EBM TM- 2 endothelial cell basic medium-2
  • EBM TM- 2 BulletKit TM endothelial cell medium kit-2
  • An EDTA-containing 0.25% trypsin solution was used at the time of passage and cell detachment.
  • HUVEC grown to a sufficient amount in a T-75 flask was peeled from the bottom of the flask, and the supernatant was removed by centrifugation. Thereafter, the cells were washed with endothelial cell culture medium-2 containing the above endothelial cell culture medium kit-2, and the supernatant was again removed by centrifugation.
  • 0.1% BSA was added to endothelial cell culture medium-2 without
  • R-Gel various proteins (R-Gel, fibronectin, collagen manufactured by Fibrogen (hereinafter referred to as Fibrogen), pig skin-derived gelatin (hereinafter referred to as PSK), cow bone-derived gelatin (hereinafter referred to as The plate coated with G1917P))) was prepared.
  • Fibrogen pig skin-derived gelatin
  • PSK cow bone-derived gelatin
  • the plate coated with G1917P cow bone-derived gelatin
  • Fibrogen was dissolved in PBS (phosphate buffer) at a concentration of 1 mg / mL to prepare a Fibrogen solution.
  • PSK was dissolved in PBS (phosphate buffer) at a concentration of 1 mg / mL to prepare a PSK solution.
  • G1917P was dissolved in PBS (phosphate buffer) at a concentration of 1 mg / mL to prepare a G1917P solution. The above lysate was diluted with PBS at any time and used for plate addition.
  • ⁇ Non-treated 96-well plate (IWAKI) was used for the plate.
  • a solution obtained by diluting the above lysate with PBS was added to a non-treated 96-well plate at 50 ⁇ L / well so that the protein concentration was 0.02, 0.1, 0.2, 2.0 ⁇ g / well. Thereafter, incubation was performed at 37 ° C. for 2 hours, and after removing the solution, 100 ⁇ L of PBS was added to all wells and washed to remove PBS (washing step). The washing step was performed 3 times. This resulted in coating plates with different coating proteins and coating concentrations.
  • DNA assay was used.
  • 100 ⁇ L of SDS solution (20 mg of SDS dissolved in 100 mL of 1 ⁇ SSC solution: 1 ⁇ SSC solution is 17.999 g NaCl and 8.823 g Na 3 Citrate in 2 L ultrapure (Dissolved in water) and leave at 37 ° C. for 1 hour.
  • Transfer the total amount of each individual solution to a 96-well black plate (Non-treated) and add 100 ⁇ L of Hoechst solution (20 ⁇ L of Hoechst 33258 and 20 mL of 1 ⁇ SSC solution) to all wells.
  • the fluorescence intensity was measured with a reader.
  • the plate reader used was Gemini EM (Molecular Devices), and the fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 355 nm and a measurement wavelength of 460 nm.
  • a calibration curve was prepared from a suspension of HUVEC cells with the number of cells adjusted.
  • FIG. 2 and FIG. 3 The results of the obtained cell adhesion test (DNA assay) are shown in FIG. 2 and FIG. As a result, R-Gel showed better cell adhesion to HUVEC than fibronectin, fibrogen, PSK and G1917P. Moreover, the state of cell adhesion on the R-Gel coating plate, cell adhesion on the Fibrogen coating plate, cell adhesion on the PSK coating plate, and cell adhesion on the G1917P coating plate is shown in FIG. In the R-Gel coated plate, it can be visually confirmed that the number of adherent cells is large. At the same time, from this photograph, the area of one individually attached cell was determined with the software ImageJ. The result is shown in FIG. This indicates that R-Gel has a significantly larger cell area than Fibrogen, PSK, and G1917P, so there is a stronger bond between R-Gel and HUVEC than the others. I found out.
  • the coating concentration was 0.2 ⁇ g / well, and the experiment was conducted using an R-Gel coating plate and a fibronectin coating plate.
  • the prepared HUVEC cells were incubated with a sufficient concentration of anti-human ⁇ V monoclonal antibody (MAB1980: CHEMICON) at 37 ° C for 30 minutes, and the same amount of PBS was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes, respectively. It indicated as antibody-treated HUVEC and untreated HUVEC.
  • Cell seeding was performed by adding a solution prepared so that the antibody-treated HUVEC or untreated HUVEC was 1 million cells / mL to the plate at 100 ⁇ L / well.
  • the cell adhesion time was 1 hour at 37 ° C. as in (2) above. Quantification of the number of cells was also performed by DNA assay in the same manner as in (2) above.

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Abstract

　本発明の目的は、生体にとって安全かつ生体付着性に優れている血管新生誘導剤を提供することである。本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む、血管新生誘導剤が提供される。

Description

遺伝子組み換えゼラチンを含む血管新生誘導剤
　本発明は、遺伝子組み換えゼラチンを用いた血管新生誘導剤に関する。
　血管新生とは、主に、既存の血管から新しい血管を形成する現象のことを表している。正常な生理的血管新生として、胎生期における血管形成や、子宮内膜や黄体形成、創傷治癒等に関与する血管新生が存在する。血管新生のイベントを治療へ利用することが、血管新生療法等として実施されている。創傷治癒、虚血性疾患等の治療法として、又、臓器再生や細胞移植、自然治癒効果の増強など、広く再生医療といわれる治療においても、血管新生の重要性が明らかとなっている。血管新生そのものの治療効果を示す、あるいは血管新生が治療効果を増強するため、血管新生を標的とした治療薬が開発されている。
　このうち、広く利用されているものに塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）がある。bFGFはウシ脳下垂体から繊維芽細胞の増殖を強く刺激するタンパク質として見出され、その後研究が精力的に行われ、繊維芽細胞だけでなく、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、角膜内皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの多種類の細胞に対する細胞増殖を刺激することが明らかになってきた。しかし、bFGFを血管新生誘導剤と用いる場合には、増殖因子は高価であり、また積極的に血管を誘導するため癌化の危険性が予想されるという欠点が指摘されているため、増殖因子を用いることなく血管を誘導することを可能とする素材が求められていた。
　一方、ゼラチンをはじめとする生体高分子はこれまで広く医療材料として用いられている。近年の遺伝子工学手法の進歩により、大腸菌や酵母に遺伝子を導入することによるタンパク質の合成が行われている。該手法により、種々の遺伝子組み換えコラーゲン様タンパク質が合成（例えば特許文献１及び２）されており天然のゼラチンと比較して、非感染性には優れ、均一であり、配列が決定されているので強度、分解性を精密に設計することが可能であるなどの優位点を有するとされる。しかし、これまで提案されている遺伝子組み換えゼラチンの用途としては、天然ゼラチンの代替の域を超えるものではなく、当然ながら血管新生誘導剤としての用途も知られていなかった。
　特許文献３においては、架橋ゼラチンゲルを利用したbFGF製剤を開示しているが、ゼラチン自身はbFGFを含包させるための担体であり、ゼラチン自体の血管新生機能については何ら言及されていない。
米国特許６９９２１７２号 ＷＯ２００８/１０３０４１号公報 ＷＯ１９９４/０２７６３０号公報
　本発明は、生体にとって安全かつ生体付着性に優れている血管新生誘導剤を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンが、血管新生部位に集積して血管新生を誘導する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む、血管新生誘導剤が提供される。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、分子量が2 KDa以上100 KDa以下である。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、分子量が10 KDa以上90 KDa以下である。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含む。
　好ましくは、細胞接着シグナルはArg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列である。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列は、セリン及びスレオニンを含まない。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列は、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、及びシステインを含まない。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列は、Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、
式：Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、
式：Gly-Ala-Pro-［（Gly－Ｘ－Ｙ）63］3－Gly
（式中、63個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示される。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、血管新生作用を有するアミノ酸配列を有する。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは架橋されている。
　好ましくは、架橋はアルデヒド類、縮合剤、又は酵素により施される。
　好ましくは、本発明の血管新生誘導剤は、血管新生部位に集積して血管新生を誘導する。
　本発明によればさらに、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを、血管新生誘導を必要とする対象者に投与することを含む、血管新生を誘導する方法が提供される。
　本発明によればさらに、血管新生誘導剤の製造のための、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンの使用が提供される。
　本発明の血管新生誘導剤は、遺伝子組み換えゼラチンを含むことを特徴とするため、癌化の危険性などがなく、生体にとって安全であり、かつ生体付着性に優れている。
図１は、血管新生効果を定量するために血中に含まれるヘモグロビン量を測定した結果を示す。 図２は、HUVEC細胞接着性試験の結果を示す。 図３は、HUVEC細胞接着性試験の結果を示す。 図４は、各種蛋白質でコーティングしたプレート上のHUVEC細胞写真を示す。 図５は。各種蛋白質でコーティングしたプレート上のHUVEC細胞一つの面積比較を示す。 図６は、抗αV抗体によるHUVEC細胞接着阻害を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを用いることができ、例えばEP1014176A2、US6992172、WO2004-85473、WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンとして好ましいものは、以下の態様の遺伝子組み換えゼラチンである。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは天然のゼラチン本来の性能から、生体適合性に優れ、且つ天然由来ではないことでＢＳＥなどの懸念がなく、非感染性に優れている。また、本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは天然のものに比して均一であり、配列が決定されているので、強度、分解性においても後述の架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンの分子量は2 KDa以上100 KDa以下であることが好ましい。より好ましくは2.5 KDa以上95KDa以下である。より好ましくは5 KDa以上90 KDa以下である。最も好ましくは、10 KDa以上90KDa以下である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、好ましくはコラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有する。ここで、複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙにおいて、Ｇｌｙはグリシン、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧＸＹ配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ，Ｙであらわされるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくはその配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造であることが好ましい。
　一般的なゼラチンは極性アミノ酸のうち、電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、アルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンを指す。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。且つ該極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、システインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
　一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましく、さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置として、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間、好ましくは２５～６０の間で均一でないことが好ましい。
　この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３～５０個が好ましく、さらに好ましくは４～３０個、特に好ましくは５～２０個である。最も好ましくは１２個である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましく、遺伝子組み換えゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合に、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。遺伝子組み換えゼラチン内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明の遺伝子組み換えゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明の遺伝子組み換えゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
　また、遺伝子組み換えゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂの繰り返し構造を有することが好ましい。ｍとして好ましくは２～１０、好ましくは３～５である。ｎは３～１００が好ましく、１５～７０がさらに好ましく、５０～６５が最も好ましい。
　繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンの等電点は、好ましくは5～10であり、より好ましくは6～10であり、さらに好ましくは7～9.5である。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは脱アミン化されていない。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンはプロコラーゲンおよびプロコラーゲンを有さない。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンはテロペプタイドを有さない。
　好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の相同性を有し、血管新生作用を有するアミノ酸配列；
を有する遺伝子組換えゼラチンである。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばEP1014176A2、US6992172、WO2004-85473、WO2008/103041等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定の遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組み換えゼラチンが産生されるので、培養物から産生された遺伝子組み換えゼラチンを回収することにより、本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンを調製することができる。
　遺伝子組み換えゼラチン単独では性能が不十分である場合は、他の材料と混合や複合化を行っても構わない。例えば、種類の異なる遺伝子組み換えゼラチンや他の生体高分子や合成高分子と混合しても構わない。生体高分子としては、多糖、ポリペプチド、タンパク質、核酸、抗体等があげられる。好ましくは、多糖、ポリペプチド、タンパク質である。多糖、ポリペプチド、タンパク質としては例えば、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、フィブロイン、カゼインが挙げられる。さらにこれらは必要に応じて部分的に化学修飾を施されていても構わない。例えば、ヒアルロン酸エチルエステルを用いてもよい。多糖としては、例えば、ヒアルロン酸やヘパリンに代表されるグリコサミノグリカン、キチン、キトサンが挙げられる。さらに、ポリアミノ酸の例としては、ポリーγ―グルタミン酸が挙げられる。
　本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンは用途に応じて、化学的に修飾することができる。化学的な修飾としては、遺伝子組み換えゼラチンの側鎖のカルボキシル基やアミノ基への低分子化合物あるいは各種高分子（生体高分子（糖、タンパク質）、合成高分子、ポリアミド）の導入や、遺伝子組み換えゼラチン間の架橋が挙げられる。該遺伝子組み換えゼラチンへの低分子化合物の導入としては、例えばカルボジイミド系の縮合剤が挙げられる。
　本発明で用いる架橋剤は本発明を実施可能である限りは特に限定はなく、化学架橋剤でも酵素でもよい。化学架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、シアナミドなどが挙げられる。好ましくは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドである。さらに、遺伝子組み換えゼラチンの架橋としては、光反応性基を導入したゼラチンへの光照射、あるいは光増感剤の存在化での光照射によるものが挙げられる。光反応性基としては、例えば、シンナミル基、クマリン基、ジチオカルバミル基、キサンテン色素、カンファキノンが挙げられる。
　酵素による架橋を行う場合、酵素としては、遺伝子組み換えゼラチン鎖間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
　遺伝子組み換えゼラチンの架橋には、遺伝子組み換えゼラチンの溶液と架橋剤を混合する過程とそれらの均一溶液の反応する過程の２つの過程を有する。
　本発明において遺伝子組み換えゼラチンを架橋剤で処理する際の混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃～４０℃であり、より好ましくは０℃～３０℃であり、より好ましくは３℃～２５℃であり、より好ましくは３℃～１５℃であり、さらに好ましくは３℃～１０℃であり、特に好ましくは３℃～７℃である。
　遺伝子組み換えゼラチンと架橋剤を攪拌した後は温度を上昇させることができる。反応温度としては架橋が進行する限りは特に限定はないが、遺伝子組み換えゼラチンの変性や分解を考慮すると実質的には０℃～６０℃であり、より好ましくは０℃～４０℃であり、より好ましくは３℃～２５℃であり、より好ましくは３℃から１５℃であり、さらに好ましくは３℃～１０℃であり、特に好ましくは３℃～７℃である。
　本発明の遺伝子組み換えゼラチンには、所望により、薬剤を封入することができる。薬剤は生理活性成分である。具体的には経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤、化粧品成分、サプリメント成分が挙げられる。薬剤の具体例としては、抗炎症剤、抗菌剤、抗生剤、免疫抑制剤、抗酸化剤、抗癌剤、ビタミン、核酸、抗体が挙げられる。特に好ましくは抗炎症剤である。抗炎症剤としては、ステロイド系、非ステロイド系のいずれを用いても構わない。抗炎症剤の例としては、例えば、アスピリン、アセトアミノフェン、フェナチセン、インドメタシン、ジクロフェナクナトリウム、ピロキシカム、フェノプロフェンカルシウム、イブプロフェン、マレイン酸クロルフェニラミン、ジフルニサル、リン酸デキサメタゾンナトリウム、パクリタキセル、ドセタキセル、5-フルオロウラシル、トポテンシン、シスプラチン、ラパマイシン、タクロリムス、シクロスポリンが挙げられる。ビタミンとしては水溶性、脂溶性ともに用いられる。該ビタミンの具体例としては、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ，ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫが挙げられる。以上、具体的な薬剤を列挙したが、本発明で用いる遺伝子組み換えゼラチンを使用する限りは、上記に挙げる薬剤に限定されることはない。
　本発明においては、上記したコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを、血管新生誘導を必要とする対象者（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することによって、血管新生を誘導することができる。
　本発明の血管新生誘導剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の血管新生誘導剤は、生体内の目的部位に直接投与してもよいし、あるいは注射用蒸留水、注射用生理食塩水、ｐＨ５～８の緩衝液（リン酸系、クエン酸系等）等の水性溶媒等の液状賦形剤に懸濁して、例えば注射、塗布等により投与してもよい。また、適当な賦形剤と混合し、軟膏状、ゲル状、クリーム状等にしてから塗布してもよい。即ち、本発明の血管新生誘導剤の投与形態は、経口でもよいし、非経口（例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与等）でもよい。また、冠動脈疾患・閉塞性末梢動脈硬化症、血管形成不全などの治療のためには、カテーテルを用いての心室内腔より心筋肉への直接注入や、冠状動脈内の狭窄又は閉塞部分にカテーテルを用いて局所的に放出又は塗布することも挙げられる。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤（例えば静脈内注射剤、筋肉内注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤等）等の非経口投与剤を挙げることができる。例えば、局所的に投与する場合、本発明の血管新生誘導剤の形態は特に規定はないが、例えばスポンジ、フィルム、不織布、ファイバー（チューブ）、粒子、メッシュなどが挙げられる。
　本発明の血管新生誘導剤を製剤化は、当業者に公知の方法に従って行うことができる。例えば、製剤用担体が液体の場合は、溶解又は分散させ、また、製剤用担体が粉末の場合は、混合又は吸着させることができる。さらに必要に応じて、薬学的に許容される添加物（例えば、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、剤皮、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、塑性剤、界面活性剤又は無痛化剤等）を含有させることもできる。
　遺伝子組み換えゼラチンの投与量は、特に限定されないが、例えば、投与される生体の表面積１ｃｍ2当たり１～１００ｍｇであり、好ましくは１～５０ｍｇである。
　本発明の血管新生誘導剤の対象疾患としては例えば、悪性腫瘍、虚血性疾患、血管新生療法、細胞・組織再生療法、細胞移植治療、糖尿病性壊死、潰瘍、難聴、心疾患、動脈硬化、急性冠症候群、急性心筋梗塞、不安定狭心症、心臓突然死などが挙げられる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　遺伝子組み換えゼラチンとして以下記載のCBE3を用意した（ＷＯ2008-103041に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：51.6kD
構造： GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数：571個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。
ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。
ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：9.34
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（WO2008／103041号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
　以下の実施例では、特に断りのない限り、上記CBE3として表される遺伝子組み換えゼラチンをR-Gelと記載している。
（１）マウスを用いた血管新生試験
　R-Gel水溶液（5．５６%）2.43mlに、グルタルアルデヒド（和光純薬製）水溶液（1%）を0.27ml加えた後、3cm×3cm×4mmのシリコン鋳型に流し込み、室温で１時間、その後４℃で２４時間保って、架橋反応を行った。反応終了後、鋳型からゲルをはずし、0.1Mグリシン水溶液30ml中で架橋反応を停止し、得られた架橋R-Gelを蒸留水で室温、１時間洗浄を３回行った。得られたゲルを－50℃で急冷させ、-10℃で48時間凍結乾燥させた。4℃で24時間にわたるPBSでの膨潤処理前後での架橋R-Gel重量の変化からゲルの含水率を測定したところ、95.4%であった。得られたゲルを5mgで切り出した。
　作製したPBS溶液50μlを含浸させたR-Gel製剤5mgをマウス背部皮下に埋入した。別に対照群として、PBS溶液50μlを皮下投与した。さらに別の対照群としてPBS溶液50μlを含浸させたPI-5ゲル（メドジェル）5mgの皮下埋入を行った。投与から３日後、マウスの皮膚を剥離し、製剤埋入およびPBS溶液投与部位をそれぞれ観察した。PBS溶液投与群では、投与部位周辺の組織の状態は未処理群と同じであり、肉眼的変化は認められなかった。PI-5ゲル投与群の埋入部位も未処理群と同様、ほとんど血管新生像は認められなかった。しかしながら、R-Gel製剤を埋入した場合には、製剤埋入部位周辺の組織は肉眼的にも赤く、明らかにRGDリッチなR-Gelと血管内皮細胞との高親和性によるものと考えられる血管新生効果が確認された。
　上記の結果から、PI-5ゲル投与群では血管内皮細胞を効率的に接着させることができていない。これに対し、本発明のR-Gel製剤を用いれば、bFGFなどの増殖因子を用いることなく血管内皮細胞を積極的に接着させ、血管新生効果を出すことができる。
　血管新生効果を定量するために、血中に含まれるヘモグロビン量を測定した。測定にはヘモグロビンB―テストワコーキット（和光純薬）を用いた。
　作製したPBS溶液50μlを含浸させたR-Gel製剤5mgをマウス背部皮下に埋入した。別に対照群として、PBS溶液50μlを皮下投与した。さらに別の対照群としてPBS溶液50μlを含浸させたPI-5ゲル（メドジェル）5mgの皮下埋入を行った。投与から2週間後、マウスの皮膚を剥離し、製剤埋入およびPBS溶液投与部位を中心に1.5cm×1.5cmの周辺組織を取り出し、チューブに入れた。チューブ内で周辺組織を細かく切断し、抽出液（10mM Tris, 1mM EDTA, pH7.8）300μlを加えた。4℃で一晩ローテーターにて攪拌し、その後遠心にて上清を分離した。その上清を用いて、キットのプロトコルに従いヘモグロビン量を測定した。
　結果を図１に示す。その結果、R-Gel製剤投与群は、PBS溶液投与群とPI-5ゲル投与群と比較し、明らかにヘモグロビン量が増加していた。したがって、R-Gelによる血管新生効果が確認した。
（２）細胞接着性試験（αVβ3インテグリンとの相互作用）
R-Gelの新生血管集積メカニズムの詳細を得る為、R-Gelの血管内皮細胞への細胞接着性試験、及びαVβ3インテグリンとの相互作用を調べるための実験を行った。
　使用した血管内皮細胞としては、HUVEC（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞：タカラバイオ社）を用いた。該細胞はその細胞表面に多数のαVβ3インテグリンを恒常的に発現していることが知られており、該細胞との細胞接着性を試験することは、新生血管で活性化される血管内皮細胞への結合性を明らかにするとともに、新生血管部位で高発現されることが報告されているαVβ3インテグリンへの結合性を明らかにすることにもなる。
　HUVECの培養には、内皮細胞基本培地-2（無血清）（EBMTM-2）及び内皮細胞培地キット-2（2% FBS）（EGMTM-2 BulletKitTM）を用いた（タカラバイオ社）。継代時、及び細胞剥離時には、EDTA含有0.25%trypsin溶液を使用した。T-75フラスコにて十分量まで増殖させたHUVECをフラスコ底面から剥離し、遠心によって上清を除去した。その後、上記内皮細胞培地キット-2入りの内皮細胞基本培地-2で洗浄し、再度遠心によって上清を除去、内皮細胞培地キット-2を含まない内皮細胞基本培地-2に0.1%BSAを加えた溶液を添加・懸濁し、細胞計数盤にて生細胞の数をカウント、最終細胞濃度を50万cells/mLに調整した。
　一方、細胞接着性試験のため、各種蛋白質（R-Gel、フィブロネクチン、Fibrogen社製コラーゲン（以後Fibrogenと記載する）、豚皮由来ゼラチン（以後、PSKと記載する）、牛骨由来ゼラチン（以後、G1917Pと記載する））でコーティングしたプレートの準備を行った。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度でR-Gelを溶解させ、R-Gel溶解液を作製した。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度でフィブロネクチンを溶解させ、フィブロネクチン溶解液を作製した。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度でFibrogenを溶解させ、Fibrogen溶解液を作製した。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度でPSKを溶解させ、PSK溶解液を作製した。PBS（リン酸緩衝液）に1mg/mL濃度でG1917Pを溶解させ、G1917P溶解液を作製した。上記、溶解液は随時PBSで希釈しプレート添加に使用した。
　プレートには、Non-treated 96穴プレート（IWAKI）を使用した。Non-treated 96穴プレートに蛋白質濃度が0.02, 0.1, 0.2, 2.0μg/wellとなるように、PBSで上記溶解液を希釈した溶液を50μL/wellで添加した。その後、37℃で2時間インキュベート、溶液を除去した後に全てのwellに100μLのPBSを添加・洗浄し、PBSを除去（洗浄工程）した。該洗浄工程を3回行った。　これによって、コーティング蛋白質及びコーティング濃度の異なるコーティングプレートを得た。
　本コーティングプレートに、上記で用意したHUVEC懸濁液（50万cells/mL）を100μLずつ播種した。37℃で1時間インキュベートした後、培地を吸引除去、100μLのPBSを添加して洗浄、PBSは吸引により除去した（PBS洗浄）。本PBS洗浄を3回行い、PBSを除去した状態のプレートを得た。
　得られたプレート上の細胞数定量には、DNA assayを使用した。得られたプレートのwellにそれぞれ100μLのSDS溶液（20mgのSDSを100mLの1×SSC溶液に溶解したもの：１×SSC溶液とは17.999gのNaClと8.823gのNa3Citrateを2Lの超純水に溶解したものである）を加え、37℃で1時間静置する。　得られた個々の溶液全量をそれぞれ96穴ブラックプレート（Non-treated）へ移し、100μLのHoechst溶液（Hoechst 33258を20μLと1×SSC溶液20mLを混合したもの）を全てのwellに添加し、プレートリーダーにて蛍光強度を測定した。用いたプレートリーダーはGemini EM（モレキュラーデバイス社）、励起波長355nm、測定波長460nmで蛍光強度を測定した。検量線は、細胞数を調整したHUVEC細胞の懸濁液で作成した。
　得られた細胞接着性試験（DNA assay）の結果を図２及び図３に示した。これによって、R-Gelはフィブロネクチン、Fibrogen、PSK、G1917Pと比較してHUVECへの細胞接着が良いことを示した。又、R-Gelコーティングプレート上での細胞接着、Fibrogenコーティングプレート上での細胞接着、PSKコーティングプレート上での細胞接着、G1917Pコーティングプレート上での細胞接着の様子を図４に写真で示した。R-Gelでコーティングされたプレートでは、接着細胞数が多いことが視覚的にも確認出来る。同時に、本写真から、個々接着した細胞一つの面積をソフトウェアImageJで求めた。その結果を、図５に示す。これにより、R-GelはFibrogen、PSK、G1917Pと比較して、有意に細胞一つの面積が大きいことが示されたため、R-GelとHUVECの間には他の物よりも強い結合が生じていることが分かった。
（３）HUVEC接着でαVβ3インテグリン阻害実験
　R-GelとHUVECの結合が、αVβ3インテグリンを介した結合であることを確認するため上記（２）で行ったR-Gelの細胞接着性試験について、αVβ3インテグリンを抗αV抗体によってブロックすることで、当該接着が抑制されるかの実験を行った。
　細胞接着実験の詳細は、上記（２）と同様にして行った。コーティング濃度は0.2μg/well、R-Gelコーティングプレートとフィブロネクチンコーティングプレートで実験を行った。調整したHUVEC細胞に対して、十分濃度の抗ヒトαVモノクローナル抗体（MAB1980：CHEMICON）と37℃で30分インキュベートしたものと、同量のPBSを添加し37℃で30分インキュベートしたもの、をそれぞれ抗体処理HUVEC、未処理HUVECと表記した。細胞播種は上記、抗体処理HUVECあるいは未処理HUVECが100万cells/mLとなるように調整した液を100μL/wellでプレートへ添加することで実施した。　細胞接着時間は上記（２）と同様に37℃で1時間とした。　細胞数の定量も上記（２）と同様にして、DNA assayで行った。
　得られた結果を、図６に示した。これによって、抗ヒトαV抗体によって、R-Gel及びフィブロネクチンのHUVECへの細胞接着が有意に抑制されることが分かった。フィブロネクチンについては、HUVECへ対して、αVβ3インテグリンを介して結合することが知られており、本実施例において、R-Gelでもフィブロネクチンと同様にαVβ3インテグリンを介してHUVECへ結合することが示された。
　これは、R-GelがαVβ3インテグリンと結合することを示しており、上記（２）と（３）の結果は、R-GelがαVβ3インテグリンと良い結合を示すこと、その結合が他のコラーゲン・ゼラチンよりも強いこと、及びR-Gelが血管内皮細胞へ良い結合を示すこと、その結合が他のコラーゲン・ゼラチンよりも強いことを示しており、新生血管への高い結合力・特異性を細胞・分子レベルで示した結果である。
　上記の実験より、遺伝子組み換えゼラチンが血管内皮細胞に対して良い結合を示し、かつ血管新生が誘導することが示された。

Claims (16)

  1. コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む、血管新生誘導剤。
  2. 遺伝子組み換えゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、分子量が2 KDa以上100 KDa以下である、請求項１に記載の血管新生誘導剤。
  3. 遺伝子組み換えゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、分子量が10 KDa以上90 KDa以下である、請求項１又は２に記載の血管新生誘導剤。
  4. 遺伝子組み換えゼラチンが、コラーゲンに特徴的なGly-X-Yで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有し（複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）、細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含む、請求項１から３の何れかに記載の血管新生誘導剤。
  5. 細胞接着シグナルがArg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列である、請求項４に記載の血管新生誘導剤。
  6. 遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列が、セリン及びスレオニンを含まない、請求項１から５の何れかに記載の血管新生誘導剤。
  7. 遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列が、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、及びシステインを含まない、請求項１から６の何れかに記載の血管新生誘導剤。
  8. 遺伝子組み換えゼラチンのアミノ酸配列が、Asp-Arg-Gly-Aspで示されるアミノ酸配列を含まない、請求項１から７の何れかに記載の血管新生誘導剤。
  9. 遺伝子組み換えゼラチンが、
    式：Ａ－［（Gly－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
    （式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される、請求項１から８の何れかに記載の血管新生誘導剤。
  10. 遺伝子組み換えゼラチンが、
    式：Gly-Ala-Pro-［（Gly－Ｘ－Ｙ）63］3－Gly
    （式中、63個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
    で示される、請求項１から９の何れかに記載の血管新生誘導剤。
  11. 遺伝子組み換えゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、血管新生作用を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から１０の何れかに記載の血管新生誘導剤。
  12. 遺伝子組み換えゼラチンが架橋されている、請求項１から１１の何れかに記載の血管新生誘導剤。
  13. 架橋がアルデヒド類、縮合剤、又は酵素により施される、請求項１２に記載の血管新生誘導剤。
  14. 血管新生部位に集積して血管新生を誘導する、請求項１から１３の何れかに記載の血管新生誘導剤。
  15. コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを、血管新生誘導を必要とする対象者に投与することを含む、血管新生を誘導する方法。
  16. 血管新生誘導剤の製造のための、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンの使用。
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