WO2010126151A1 - 新規マラリアワクチン - Google Patents

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amino acid
adjuvant
seq
vaccine
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堀井　俊宏
石井　健
任弘 東岸
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国立大学法人大阪大学
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    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/822—Protozoa

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide useful as a malaria vaccine having high immunogenicity.
  • the present invention also relates to a vaccine useful for the prevention or treatment of Plasmodium infection and a diagnostic agent for Plasmodium infection.
  • malaria parasite infection infects 500 million people annually and kills 2 million to 3 million people, there is still no effective preventive vaccine. Therefore, malaria vaccine development is urgent.
  • SERA sinar repeat antigen
  • the main object of the present invention is to provide a polypeptide having high immunogenicity and useful as a malaria vaccine, and the use of the polypeptide as a vaccine against malaria parasite infection. Furthermore, an object of the present invention is to provide an antibody against the above polypeptide and use of the antibody or the polypeptide as a diagnostic agent for malaria parasite infection.
  • the present inventors have already identified that the 8-mer repeat region and / or the serine-rich region present at the N-terminus of SERA (serin repeat antigen) polypeptide is a protective epitope of an antibody against P. falciparum. Yes.
  • the present inventors have found a polypeptide that exhibits excellent immunogenicity and is useful as a malaria vaccine.
  • the inventors have found an optimal adjuvant to increase the immunogenicity of the malaria vaccine.
  • the present invention has been completed as a result of further research based on these findings.
  • the present invention includes the following embodiments.
  • A is an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2 to 8
  • B is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • (I-1) The polypeptide according to 1.
  • (I-6) A polynucleotide encoding at least one of the polypeptides according to any one of (I-1) to (I-5).
  • a vaccine for prevention and / or treatment of Plasmodium falciparum infection (II-1) containing at least one of the polypeptides according to any one of (I-1) to (I-5) as an active ingredient A vaccine for prevention and / or treatment of Plasmodium falciparum infection.
  • K3 K type CpG adjuvant
  • D35 D type CpG adjuvant
  • sHZ synthetic hemozoin adjuvant
  • (II-4) The polypeptide according to any one of (I-1) to (I-5), which is used as a vaccine for preventing and / or treating a Plasmodium falciparum infection.
  • polypeptide according to any one of (I-1) to (I-5), an aluminum hydroxide gel, K3, which is used as a vaccine for preventing and / or treating a Plasmodium falciparum infection A combination with at least one adjuvant selected from the group consisting of (K type CpG adjuvant), ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ D35 (D type CpG adjuvant), and sHZ (synthetic hemozoin adjuvant).
  • polypeptide according to any one of (I-1) to (I-5), an aluminum hydroxide gel, K3 (which is used as a vaccine for preventing and / or treating a Plasmodium falciparum infection
  • K3 which is used as a vaccine for preventing and / or treating a Plasmodium falciparum infection
  • K3 which is used as a vaccine for preventing and / or treating a Plasmodium falciparum infection
  • K3 which is used as a vaccine for preventing and / or treating a Plasmodium falciparum infection
  • K3 which is used as a vaccine for preventing and / or treating a Plasmodium falciparum infection
  • K3 which is used as a vaccine for preventing and / or treating a Plasmodium falciparum infection
  • the adjuvant is at least one selected from the group consisting of K3 (K type CpG adjuvant), D35 (D type CpG adjuvant), and sHZ (synthetic hemozoin adjuvant), or at least one of these
  • the vaccine according to (II-7) which is a combination of a seed and an aluminum hydroxide gel.
  • the adjuvant is at least one selected from the group consisting of K3 (K type CpG adjuvant), D35 (D type CpG adjuvant), and sHZ (synthetic hemozoin adjuvant), or at least one of these
  • K3 K type CpG adjuvant
  • D35 D type CpG adjuvant
  • sHZ synthetic hemozoin adjuvant
  • III A diagnostic agent for Plasmodium falciparum infection
  • III-1 An antibody against the polypeptide according to any one of (I-1) to (I-5).
  • (III-4) A tropical substance comprising as an active ingredient the polypeptide according to any one of (I-1) to (I-5) or the antibody according to any one of (III-1) to (III-3) A diagnostic agent for Plasmodium falciparum infections.
  • polypeptide (1) The polypeptide represented by the above general formula (1) (hereinafter sometimes abbreviated as “polypeptide (1)”) has high immunogenicity, and is used for a long time when used as a vaccine. High anti-SE36 antibody titer. Therefore, immunity can be acquired against the malaria parasite, and the acquired immunity can be maintained for a long time.
  • sputum polypeptide (1) sufficient immunity is obtained with an amount that is 10 to 1 / 100th of the amount of antigen polypeptide that is usually required to produce antibodies against Plasmodium in vivo. be able to. Accordingly, the polypeptide (1) is useful from an economical viewpoint because it requires a small dose.
  • the polypeptide (1) When the polypeptide (1) is used as a vaccine, an antibody against the protective epitope can be induced. Therefore, the polypeptide (1) of the present invention can be used as a highly immunogenic malaria vaccine (particularly a vaccine against P. falciparum).
  • polypeptide (2) an optimal combination with an adjuvant for the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter sometimes referred to as “polypeptide (2)” or “original SE36 polypeptide”) is provided.
  • polypeptide (2) itself has an antigenicity superior to that of natural SERA polypeptide, but it can exhibit a significantly superior antigenicity when combined with a specific adjuvant.
  • polypeptide (2) by combining the polypeptide (2) and a specific adjuvant (for example, a combination of a human type TLR9 ligand adjuvant and an aluminum hydroxide gel and a human type TLR9 ligand adjuvant, particularly K3 (K type CpG adjuvant)), An even higher anti-SE36 antibody titer can be induced.
  • a specific adjuvant for example, a combination of a human type TLR9 ligand adjuvant and an aluminum hydroxide gel and a human type TLR9 ligand adjuvant, particularly K3 (K type CpG adjuvant)
  • polypeptide (2) (original SE36 polypeptide) and polypeptide (1) (SE36-1 to 3). It represents the amino acid sequences of polypeptide (1) (SE36-4-5) and negative SE36 polypeptide. This represents the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of polypeptide (2) (original SE36 polypeptide). This represents the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of polypeptide (1) (SE36-1). This represents the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of polypeptide (1) (SE36-2).
  • 1 to 15 on the horizontal axis indicate polypeptides used for 15 epitope mapping shown in SEQ ID NOs: 23 to 37, respectively.
  • an adjuvant for polypeptide (2) only aluminum hydroxide gel (Alum) (upper left figure), aluminum hydroxide gel + K3 (K type CpG adjuvant) (Alum + K3) (upper right figure), aluminum hydroxide gel + D35 (D type CpG) Adjuvant) (Alum + D35) (lower left figure), aluminum hydroxide gel + sHZ (synthetic hemozoin adjuvant) (Alum + sHZ) (lower right figure) were used.
  • polypeptides (1) and (2) of the present invention useful as a vaccine against a malaria parasite infection of a SERA polypeptide are described in detail below. In the present specification, the polypeptides (1) and (2) may be collectively referred to as “the polypeptide of the present invention”.
  • SERA polypeptide SARA (serine-repeat antigen) polypeptide is a protein antigen with a molecular weight of 115kd consisting of a total of 989 amino acids expressed by the Pf gene at the inner erythrocyte stage, and its structure is from N-terminal to C-terminal. In the direction, it consists of three domains of 47kd-50kd-18kd. SERA as a precursor of these domains is processed by the release of merozoite at the inner erythrocytic stage after being expressed by four exons dispersed on the SERA gene (DNA) consisting of a total of 5868 bases and cleaved into the three domains.
  • SARA serine-repeat antigen
  • the full-length data of the SERA gene (DNA) and the amino acid sequence encoded by the SERA gene are publicly available at GenBank (Accession Number: J04000; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • GenBank accesion Number: J04000; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
  • the N-terminal region of SERA (hereinafter referred to as “47 kd region”) consists of a total of 382 amino acid residues. According to the homology search between Pf strains related to the sequence, about 20 amino acid deletions and additions were made. A variety of amino acid mutations (non-synonymous substitutions) and the like are observed and varied (Molecular and Biochemical Parasitology, ibid .; and Experimental Parasitology, ibid.).
  • Polypeptide (2) is the original SE36 polypeptide shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide (2) is a SE47 ′ antigen (Vaccine, based on the 47 kd region of SERA of the aforementioned Plasmodium falciparum Pf Honduras-1 strain (hereinafter sometimes abbreviated as “Hond-1”). 14, pp. 1069-1076, 1996; hereinafter abbreviated as “SE47 ′”).
  • Polypeptide (2) is the 16th amino acid (ordered sequentially from the N-terminal methionine of 382 amino acids constituting the 47kd of SERA of Hond-1 starting from the 1st amino acid) Asparagine) codon is replaced with start codon (methionine), translation stop codon is inserted after the 382nd amino acid (glutamic acid), and a total of 33 polymerized serines occupying the serine repeat region It is a polypeptide consisting of a total of 334 amino acids from which residues (from 193 to 225 serine) have been excised.
  • the amino acid sequence of this polypeptide (2) is specifically shown as SEQ ID NO: 1 in FIG. 1-1.
  • the polypeptide (2) represented by SEQ ID NO: 1 has higher immunogenicity than the natural SERA polypeptide.
  • Polypeptide (1) is an improved SE36 polypeptide that is further improved from the polypeptide (2) shown in SEQ ID NO: 1 and has higher immunogenicity.
  • the polypeptide (1) is represented by the following general formula (1).
  • X 1 represents the first to seventh amino acid residues of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1
  • X 2 represents amino acid residues 73 to 177 of the polypeptide
  • X 3 represents amino acid residues 178 to 258 of the polypeptide
  • X 4 represents amino acid residues 259 to 289 of the polypeptide
  • X 5 represents amino acid residues 290 to 334 of the polypeptide
  • Y is any one selected from AA, AB, and B.
  • n is an integer of 0 or 1.
  • A represents an 8mer repeat sequence in the 47 kd region of the SERA polypeptide of Plasmodium falciparum.
  • any sequence corresponding to the 8-mer repeat sequence can be used as the sequence of A without any limitation even if there is an amino acid mutation (non-synonymous substitution) between Pf strains.
  • Preferred examples of the amino acid sequence of A include the following specific sequences A 1 to A 7 (shown with the N-terminal side as the left end).
  • a 1 TGESQTGNTGGGQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGS (SEQ ID NO: 2)
  • a 2 TGESQTGNTGGGQAGNTGGDQAGSTGGSPQGSTGASPQGSTGASPQGSTGASQPGS (SEQ ID NO: 3)
  • a 3 TGESQTGNTGGGQAGNTVGDQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGS (SEQ ID NO: 4)
  • a 4 TGESQTGNTGGGQAGNTGGGQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGS (SEQ ID NO: 5)
  • a 5 TGESQTGNTGGGQVGNTGGGQAGSTGGSPQGSTGASQPGSSEPSNPVS (SEQ ID NO: 6)
  • a 6 TGESQTGNTGGGQAGNTVGGQAGNTGGGQAGNTGGDPQGSTGGSQPGS (SEQ ID NO: 7)
  • a 7 TGESQTGNAGGGQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTG
  • a 1 (SEQ ID NO: 2) is preferable as A linked to X 1 .
  • B represents the amino acid sequence of the serine-rich region in the 47 kd region of the SERA polypeptide of Plasmodium falciparum.
  • B sequence without any particular limitation.
  • Preferred examples of the sequence of B include the following specific sequences (shown with the N-terminal side as the left end).
  • B SEPSNPVSSGHSVSTVSVSQTSTSS (SEQ ID NO: 9).
  • a and B in the general formula (1) can be appropriately selected from the above specific sequences (SEQ ID NOs: 2 to 8 and SEQ ID NO: 9) and used in combination.
  • the amino acid sequence of A can be arbitrarily selected from the amino acid sequences of A 1 to A 7 described above.
  • the amino acid sequence of A may have two or more identical amino acid sequences selected from A 1 to A 7 or any combination of different amino acid sequences. May be.
  • Y can be arbitrarily selected from A-A, A-B, and B, but is preferably A-B or B.
  • More preferred polypeptides (1) in the present invention include polypeptides (1) shown in SEQ ID NOs: 10 to 14, that is, SE36-1 to SE36-5.
  • the schematic diagram is shown in FIG. SE36-1 to SE36-5 can be represented by the following formula after general formula (1): General formula: X 1 -AB-X 2 -Y -X 3 - (Y) n-X 4 - (Y) n-X 5 (1)
  • SE36-1 X 1 ⁇ A 1 ⁇ B ⁇ X 2 ⁇ (A 2 ⁇ B) ⁇ X 3 ⁇ (Y) 0 ⁇ X 4 ⁇ (Y) 0 ⁇ X 5
  • SE36-2 X 1 ⁇ A 1 ⁇ B ⁇ X 2 ⁇ (A 2 ⁇ B) ⁇ X 3 ⁇ (A 3 ⁇ B) ⁇ X 4 ⁇ (Y) 0 ⁇ X 5
  • SE36-3 X 1 ⁇ A 1 ⁇ B ⁇ X 2 ⁇ (A 2 ⁇ B) ⁇ X 3 ⁇ (A 3 ⁇
  • SE36-1 to SE36-5 SE36-3 to SE36-5 are preferable, SE36-3 and SE36-5 are more preferable, and SE36-3 is more preferable.
  • the SE36 gene (DNA) having the original Pf codon has low expression efficiency in E. coli. For this reason, when producing E. coli as a host, it is desirable to convert all the natural Pf codons encoding the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention into E. coli codons. Thereby, efficient production of the polypeptide of the present invention can be performed.
  • polypeptide (2) synthesis of polypeptide (2) will be described as an example, but polypeptide (1) can also be synthesized and obtained by the same method.
  • the base sequence of the SE36 gene on the desk of Pf (SE36 gene having a Pf codon) and the amino acid sequence encoded by it can be obtained from well-known gene database public organizations such as DDBJ, GenBank, and EMBL via the Internet.
  • the amino acid sequence of the polypeptide (2) is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 (see FIG. 1-3). Therefore, based on SEQ ID NO: 16, an SE36 gene (DNA) encoding the amino acid sequence of polypeptide (2) (SEQ ID NO: 1) is synthesized.
  • DNA is synthesized based on the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 22 encoding the amino acid sequences of SE36-1 to SE36-5 (SEQ ID NOs: 10 to 14).
  • a commercially available DNA synthesizer for example, a DNA / RNA synthesizer [Applied Biosystem Medel 392: manufactured by PE (USA)], an ASM-102U DNA synthesizer [BIOSSET (USA)], etc. may be used. it can.
  • this synthesizer after synthesizing both the sense (+) and antisense ( ⁇ ) DNA fragments of about 100 to about 200 nucleotides separately polymerized, each synthetic DNA fragment is purified by, for example, polyacrylamide electrophoresis. To do.
  • a synthetic double-stranded DNA fragment is prepared by annealing a complementary strand (pair) of the purified single-stranded DNA fragment.
  • a clone as a transformant can be obtained by transferring a restriction enzyme fragment of the above DNA fragment into a restriction enzyme site of a vector cleaved with the same enzyme and transferring the constructed vector to a host. can get.
  • each clone of the double-stranded DNA fragment is amplified by culturing the above transformant, and each of these base sequences is determined by the chain terminator method (dideoxy method) or the Maxam-Gilbert method.
  • a commercially available DNA sequencer for example, ABI PRISM 3700 (manufactured by PE (USA)) can be used. Based on the result, about 5 to 10 clones of double-stranded DNA fragments encoding SE36 gene (DNA) are selected.
  • the cloning of the SE36 gene is performed by linking the double-stranded DNA fragment clones. For example, when 8 clones (8 pairs) are selected in the above, SE36 gene DNA can be obtained by sequentially ligating these double-stranded DNA fragments. This full-length DNA is then cloned as described above. In the above ligation, it is desired to introduce restriction enzyme cohesive sites for ligation at both ends of each fragment of double-stranded DNA. However, for such introduction, it is necessary to match the base sequence as a codon so that the original amino acid sequence of Pf does not change. In polypeptide (1), the restriction enzyme cohesive site for ligation may remain at the ligation site in the full-length DNA, or may be translated as it is and remain in the amino acid sequence.
  • ⁇ Construction of SE36 gene expression system For the preparation of an expression vector for the SE36 gene (DNA), a known or commercially available host expression vector for Escherichia coli (“Cloning Vectors: A Laboratory Manual”, which has been introduced variously before), for example, a plasmid Combinations of pET-3a and Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS or Escherichia coli BL21 (DE3) pLysE [manufactured by Stratagene (USA)] can be used.
  • Such production is performed, for example, by excising a restriction enzyme fragment containing the SE36 gene (DNA) from the cloning vector and then inserting it into a restriction enzyme site of a vector cleaved with the same enzyme. It can also be produced from pET-SE47 ′ (the aforementioned Vaccine).
  • pET-SE47 ′ or the SE47 ′ synthetic gene held by pET-SE47 ′ can be prepared in the same manner as described above by excising all or part of the region encoding the serine repeat region with a restriction enzyme. it can.
  • a transformant is obtained by transferring the prepared expression vector into a host. From such transformants, an SE36 gene (DNA) expression system suitable for industrial use can be selected using the mass production of the polypeptide as an index.
  • Mass production of the polypeptide of the present invention is carried out by culturing the above-mentioned E. coli transformant.
  • a culture system is used from the viewpoint of increasing the production yield of the polypeptide of the present invention, for example, using an inducer such as IPTG (isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside), avoiding catabolite repression, It is possible to improve or improve the medium composition, culture temperature and time, removal of protease in the host cell, etc., which can be performed by remodeling the expression vector, further changing the promoter or host strain, etc. .
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • the sterilized culture solution of the transformant culture is used as a starting material for the SE36 polypeptide extraction.
  • the polypeptide is extracted from the cells collected and collected from the culture by centrifugation, filtration or the like.
  • digestion with enzymes, destruction by osmotic pressure, rapid pressure reduction, ultrasonic waves, various homogenizers, and the like can be used.
  • a means for separating the crushed cells physical low-speed centrifugation, ultracentrifugation, filtration, molecular sieve, membrane concentration, etc., chemical precipitation agents, solubilizers, adsorption / desorption agents, dispersing agents, etc.
  • Physicochemical electrophoresis, column chromatography, support, dialysis, salting out, and the like can be used in combination.
  • physicochemical conditions such as temperature, pressure, pH, and ionic strength can be appropriately set.
  • Detection and size confirmation of the polypeptide of the present invention obtained as described above can be performed, for example, by measurement of sedimentation coefficient, molecular sieving, SDS-polyacrylamide electrophoresis and the like.
  • the antigenicity of the polypeptide of the present invention can be confirmed by antigen-antibody reaction by Western blot analysis, ELISA, agglutination reaction, fluorescent antibody method, radioimmunoassay or the like using a polyclonal antibody or monoclonal antibody against 47 kd of SERA.
  • the immunogenicity of the polypeptide of the present invention and the ability of the anti-SE36 antibody to inhibit Pf protozoan proliferation include the serum of a Plasmodium falciparum infection patient, experimental small animals immunized with the polypeptide, such as rats and mice, etc. It can be confirmed by an antigen-antibody reaction using the serum of the antibody, a growth inhibition test of Pf merozoite in erythrocytes (so-called neutralization reaction), measurement of the Pf number in the blood of the holder of the anti-SE36 antibody, and the like.
  • the present invention provides a malaria vaccine comprising the polypeptide of the present invention.
  • the vaccine of the present invention is suitable as a falciparum malaria vaccine because of its significantly high specificity as an antigen of falciparum malaria. However, it does not limit the use against other Plasmodium infections.
  • the preparation method and the like of the vaccine will be described by taking the polypeptide (2) as an example, but even in the case of the polypeptide (1), the preparation and the like can be performed by the same method.
  • the above-mentioned vaccine antigen can be stabilized by fixing with a conventional inactivating agent.
  • a conventional inactivating agent for example, formalin, phenol, glutardialdehyde, ⁇ -propiolactone and the like can be added before or after preparing the vaccine stock solution.
  • formalin the amount added is about 0.005 to 0.1% (v / v)
  • the inactivation temperature is about 4 to 38 ° C.
  • the inactivation time is about 5 to 180 days.
  • an ingenuity for relaxing the inactivation condition is required.
  • Such relaxation can be achieved, for example, by reducing the amount of the inactivating agent, adding a neutral amino acid or a basic amino acid, or reducing the inactivation temperature.
  • the free formaldehyde remaining in the inactivation step can be neutralized by adding an equal amount of sodium bisulfite, if necessary, or removed by dialysis.
  • polypeptide (2) ie, antigen
  • the polypeptide (2) can be processed or modified for the purpose of inducing mucosal immunity or local immunity by oral or nasal vaccination of the vaccine.
  • a technique related to DDS (drug delivery system) using liposome, emulsion, microcapsule, microsphere, polylactic acid, polyglycolic acid or the like can be applied.
  • the preparation obtained as described above is subjected to the next step as a vaccine stock solution.
  • the vaccine stock solution is diluted with, for example, the PBS, and the amount of antigen in the vaccine is adjusted to an amount necessary for inducing antibody production and producing immunity.
  • a stabilizer for enhancing the heat resistance of the vaccine and an adjuvant as an adjuvant for enhancing the immunogenicity can be added and mixed.
  • the stabilizer can include saccharides and amino acids
  • the adjuvant includes mineral oil, vegetable oil, alum, aluminum compounds (eg, aluminum hydroxide gel), bentonite, silica, muramyl dipeptide. Derivatives, thymosins, interleukins and the like can be mentioned.
  • the adjuvant is preferably an aluminum hydroxide gel and a human type TLR9 ligand adjuvant, specifically K3 (K type CpG adjuvant), D35 (D type CpG ODN adjuvant), and sHZ (synthetic hemozoin, as described later) Adjuvant) and the like.
  • vaccines are not only liquid, but also by lyophilization after dispensing. It can be used as a dry formulation.
  • (2-3) Vaccine Usage Vaccination can be carried out according to a method commonly used in the art, and is not particularly limited.
  • 1 dose of 0.25 to 0.5 ml is inoculated subcutaneously.
  • Such inoculation is preferably performed 1 to 3 times at intervals of about 2 to 4 weeks.
  • polypeptide (1) may be used in combination with the polypeptide in combination with conventionally known adjuvants.
  • the adjuvant is not particularly limited as long as it can enhance the immune effect of the present invention.
  • aluminum hydroxide gel human type TLR9 ligand adjuvant K3 (K type CpG adjuvant), D35 (D type CpG ODN) Adjuvant), and sHZ (synthetic hemozoin adjuvant).
  • ligands having an innate immunity stimulating action can also be used as adjuvants.
  • any one selected from these adjuvants may be used, or two or more arbitrarily selected from these adjuvants may be used in combination.
  • Aluminum hydroxide gel has the property of forming an insoluble complex between an antigen and an adjuvant. Since this antigen-adjuvant complex stays locally, it is desirable to use aluminum hydroxide gel in combination with the other adjuvants.
  • Polypeptide (2) can also use a conventionally known adjuvant exemplified in (3-1) above in the preparation of a vaccine.
  • Preferred are K3 (K type CpG adjuvant), D35 (D type CpG ODN adjuvant), and sHZ (synthetic hemozoin adjuvant) which are human type TLR9 ligand adjuvants.
  • the polypeptide (2) has a remarkably excellent effect when a specific adjuvant is combined.
  • the adjuvant combination that exhibits particularly excellent immunogenicity when used in combination with the polypeptide (2) includes the combination of the above human TLR9 ligand adjuvants, (a) aluminum hydroxide gel and K3 (K (B) Aluminum hydroxide gel and D35 (D type CpG adjuvant); and (c) Aluminum hydroxide gel and sHZ (synthetic hemozoin adjuvant).
  • a combination of (a) aluminum hydroxide gel and K3 (K type CpG adjuvant) is used, a high anti-SE36 antibody titer can be maintained over a long period of time. Therefore, the combination of the polypeptide (2) and the specific adjuvant is effective as a malaria vaccine.
  • the antibody against the diagnostic polypeptide (1) or (2) can be used for diagnosis of malaria parasite infection. That is, according to the present invention, a diagnostic agent for a Plasmodium infection that contains an antibody against the polypeptide (1) or (2) as an active ingredient can be provided.
  • the antibody against the polypeptide (1) or (2) can be produced, for example, by inoculating the polypeptide into an animal, for example, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, etc. of a rabbit, guinea pig, mouse, etc. according to a conventional method. It can also be collected from the serum of these animals.
  • Such an antibody can be used for antigen detection, and if an antigen is detected in a test sample such as serum of a patient suspected of being infected with Plasmodium, it can be diagnosed as being infected with Plasmodium.
  • polypeptide (1) or (2) as an antigen serum of a patient suspected of being infected with malaria parasite, etc. as a test sample, precipitation reaction, agglutination reaction, neutralization reaction, fluorescent antibody method, enzyme immunoassay method, Anti-SE36 antibody can be detected by radioimmunoassay or the like. Thereby, if an antibody is detected in the test sample, it is diagnosed that the bacterium is infected with malaria parasite.
  • the diagnostic antigens and antibodies according to the present invention are used after being diluted with a solvent, for example, the PBS, so that the content in these diagnostic agents is an amount necessary for exhibiting an antigen-antibody reaction.
  • the vaccine of the present invention has a high antibody titer as described above, in order to prevent infection with malaria parasite, the subject (for example, malaria) It is possible to effectively prevent malaria parasite infection by administering it to those who need to prevent protozoan infection.
  • the vaccine of the present invention since the vaccine of the present invention is particularly effective against Plasmodium falciparum infection, it can be effectively treated by administering it to a patient infected with Plasmodium falciparum infection. be able to. Therefore, the present invention also provides a method for preventing and / or treating malaria using the malaria vaccine.
  • the preparation method, dosage and the like of the malaria vaccine are as described above.
  • the preventive and / or therapeutic effect of malaria can be further enhanced by administering the polypeptide (1) or (2) of the present invention together with the adjuvant.
  • Test example 1 The present inventors have previously shown from the results of epitope mapping for SE36 (SEQ ID NO: 1) that the 8-mer repeat or serine-rich region present in the N-terminal region, or both regions are important as protective epitopes. (The name of the document that discloses this is listed.)
  • polypeptides (1) SEQ ID NOs: 10 to 14
  • SE36 polypeptide (2) SEQ ID NO: 1
  • SE36 having no N-terminal region negative SE36: SEQ ID NO: 15
  • FIGS. 1-1 to 1-2 The amino acid sequences of these polypeptides are shown in FIGS. 1-1 to 1-2, and the nucleotide sequences of the nucleotides encoding the amino acid sequences are shown in FIGS. 1-3 to 1-9 (SEQ ID NOs: 16 to 22).
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the structures of five types of polypeptides (1), polypeptide (2), and negative SE36 polypeptide.
  • the method for preparing the polypeptide used in this test example is as follows.
  • the preparation method of polypeptide (2) is explained in full detail, the preparation of the other polypeptide was also performed by the same method.
  • the full-length SE36 gene DNA base sequence converted from Pf codon to E. coli codon is divided into 8 parts, and a total of 16 single-stranded DNA fragments (8 pairs) of sense (+) strand and antisense (-) strand of each divided fragment After synthesizing and annealing, a total of 8 pairs of double-stranded DNAs were prepared, and these were ligated together to create a full-length SE36 gene, and its expression vector was constructed.
  • Each of the single-stranded DNA fragments was synthesized using a DNA / RNA synthesizer “Applied Biosystem model 392” (manufactured by PE (USA)). These synthetic fragments were purified by electrophoresis on 10% (W / V) polyacrylamide (containing 50 mM Tris-borate, pH 8.3, 1 mM EDTA, and 8 M urea). Then, after mixing the + and-complementary strands of the purified fragment DNA of 20 p moles, in buffer (20 ⁇ l of 20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 50 mM NaCl, and 2 mM MgCl 2 ) at 85 ° C. for 5 minutes. , Kept warm.
  • Zymoreactor II manufactured by ATTO (Japan) was used, and the temperature was increased to 55 ° C. at a rate of 5 ° C./5 minutes, and then at a rate of 5 ° C./10 minutes. At 25 ° C.
  • an equal volume of buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.8, 10 mM MgCl 2 , 5 mM dithiothreitol (DTT), 4 mM nucleoside-5'-triphosphate (NTP) each 1 mM NTP, And 3 units of T4 DNA polymerase] were added and mixed, and the mixture was kept warm at 4 ° C. for 5 minutes, at 25 ° C. for 5 minutes, and further at 37 ° C. for 120 minutes.
  • buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.8, 10 mM MgCl 2 , 5 mM dithiothreitol (DTT), 4 mM nucleoside-5'-triphosphate (NTP) each 1 mM NTP, And 3 units of T4 DNA polymerase] were added and mixed, and the mixture was kept warm at 4 ° C. for 5 minutes, at 25 ° C. for 5 minutes, and further at 37 ° C. for 120 minutes.
  • Each double-stranded DNA fragment obtained from this was digested with restriction enzymes KpnI and BamHI for use in the construction of the SE36 gene, cloned and amplified with pBluescriptII SK + and E. coli XL1-Blue, and the above DNA fragment of each clone was cloned.
  • the base sequence was determined by the dideoxy method, and 8 clones covering the full-length SE36 gene were selected.
  • Double-stranded DNA of the full-length SE36 gene was prepared by ligating these 8 clones (8 pairs) of synthetic double-stranded DNA fragments.
  • polypeptide Escherichia coli BL / SE36 obtained above is LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin (Bacto-trypton 1% (W / V), Bacto-yeast extract 0.5% (W / V), and NaCl 1 % (W / V)] at 37 ° C. for 18 hours to prepare seeds. Next, 50 ml of the seed was inoculated into 5 L of the above-mentioned fresh LB medium, and cultured at 37 ° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • ice-cold lysis buffer 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, and 1 mM EDTA
  • the adsorbed component was eluted with a GF buffer solution not containing (NH 4 ) 2 SO 4 for confirmation.
  • the unadsorbed fraction on this column was put in a dialysis bag and dialyzed at 4 ° C. for 10 hours using 1 L of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) (containing 1 mM EDTA) as an external solution. During this dialysis, the external solution was changed twice.
  • This fraction pool was stirred and added to dilution buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, and 2 M urea], and diluted so that the concentration of SE36 protein was 25 ⁇ g / ml.
  • This diluted solution was dialyzed at 4 ° C. for 10 hours using 2 L of PBS [9 mM NaHPO 4 , 3 mM NaH 2 PO 4 , and 137 mM NaCl (pH 7.4)] as an external solution. During this dialysis, the external solution was changed twice.
  • the internal solution after completion of dialysis was concentrated with Centprep 30 and then sterilized by filtration with a Durapore 0.22 ⁇ m-filter (Millipore (USA)) to obtain 10 ml of a sterile preparation containing 1 mg / ml of SE36 protein. This was stored at 4 ° C. as an SE36 vaccine stock solution.
  • amino acid sequence determination The amino acid sequence of the polypeptide (2) obtained as described above was determined by Edman degradation using a protein sequencer Applied Biosystems 473A [manufactured by PE (USA)], and the amino acid described in SEQ ID NO: 1 It was confirmed to have a sequence.
  • Test example 2 The following tests were performed using polypeptide (1) (SE36-1 to SE36-5 polypeptide), polypeptide (2) and negative SE36 polypeptide as antigens.
  • mice were immunized with each of these purified polypeptides (antigens), and the induction of antibody titer was monitored. Specifically, 35 C57BL / 6_tlr4KO mice were divided into 7 groups of 5 mice, and aluminum hydroxide gel + K3 adjuvant was added to each antigen and immunized by subcutaneous injection. The results are shown in FIG.
  • the amount of immunization was aluminum hydroxide gel (13 ⁇ g) and K3 (50 ⁇ g) against the antigen (1 ⁇ g). As indicated by arrows in FIG. 3, the second immunization was performed 2 weeks after the first immunization. Blood was collected every week to obtain serum, and the anti-SE36-IgG antibody titer was measured by ELISA. The ELISA method was performed as follows.
  • Blocking Buffer was dispensed in 150 ⁇ l for the first well and 100 ⁇ l each. In 1 well, 1.5 ⁇ l of standard serum was added and mixed well (diluted 1/100). Transfer 50 ⁇ l of the first well to the next well and mix well (1/3 dilution). This was repeated until the last well (this allows serial dilution to 1/100, 1/300, 1/900, 1/2700, .
  • Secondary antibody (Goat Anti-Mouse IgG (H + L)) (1031-05: SouthernBiotech)) is mixed with Blocking Buffer at a dilution of 100 ⁇ l per well. After pouring, it was incubated for 2-3 hours at room temperature or overnight at 4 ° C. Thereafter, it was washed 4-5 times with Wash Buffer. The dilution ratio of the secondary antibody can be arbitrarily set.
  • polypeptide (1) SE36-1 to SE36-5
  • an antibody titer higher than that of polypeptide (2) was obtained.
  • significant antibody titer induction was observed in SE36-3 to SE36-5.
  • Epitope mapping was performed using the serum of the 4th week. Epitope mapping was carried out by coating each well with 15 peptides shown in SEQ ID NOs: 23 to 37 (see FIG. 1-9) at a concentration of 0.03 mM and subjecting them to the ELISA method described above. The results are shown in FIG. As a result of epitope mapping, it was shown that polypeptide (1) (SE36-1 to SE36-5) promoted the induction of antibodies against the N-terminal region important as a protective epitope.
  • polypeptide (2) original SE36 polypeptide
  • antibody induction against the N-terminal region of SE36 polypeptide is as shown in the upper left corner of FIG.
  • Polypeptide (1) of 5 especially SE36-3 to 5
  • epipe polypeptides 1 to 3 polypeptides of SEQ ID NOs: 23 to 25
  • Test example 3 As shown below, an immunogen of polypeptide (2) is combined with an adjuvant (aluminum hydroxide gel, K3 (K type CpG adjuvant), D35 (D type CpG adjuvant), sHZ (synthetic hemozoin adjuvant)). The enhancement effect on sex was evaluated.
  • an adjuvant aluminum hydroxide gel, K3 (K type CpG adjuvant), D35 (D type CpG adjuvant), sHZ (synthetic hemozoin adjuvant)
  • 12 cynomolgus monkeys were divided into 4 groups of 3 each, and as an adjuvant for polypeptide (2), only aluminum hydroxide gel, aluminum hydroxide gel + K3 (K type CpG adjuvant), aluminum hydroxide gel + D35 (D type CpG) Adjuvant) and aluminum hydroxide gel + sHZ (synthetic hemozoin adjuvant) were used for immunization by subcutaneous injection.
  • polypeptide (2) (10 ⁇ g) + aluminum hydroxide gel (125 ⁇ g) added with 500 ⁇ g of K3 or D35, respectively, or 1.5 ⁇ mM of sHZ was used.
  • immunization is performed at the time points indicated by arrows (0th day, 22nd day and 101st day), 0th day, 7th day, 14th day, 22nd day, 28th day, 36th day, Blood was collected on Day 42, Day 56, Day 73, Day 86, Day 101, Day 112, Day 140, Day 175, Day 205, Day 238, Day 268, Day 365. Serum was collected.
  • the anti-SE36-IgG antibody titer in serum was measured by ELISA.
  • the ELISA method is in accordance with the method described in Test Example 2.
  • Anti-Monkey IgG (whole molecule) -Peroxidase, and antibody produced in rabbit (A2054: Sigma) were used as secondary antibodies. The results are shown in FIG.
  • the polypeptide (2) was obtained by combining K3 (K-type CpG adjuvant), D35 (D-type CpG adjuvant) or sHZ (synthetic hemozoin adjuvant) rather than aluminum hydroxide gel alone. It was shown that the immunogenicity can be enhanced, in particular, when an aluminum hydroxide gel and K3 are used in combination, a high antibody titer is exhibited, and at the same time, the effect can be maintained over a long period of time.
  • K3 K-type CpG adjuvant
  • D35 D-type CpG adjuvant
  • sHZ synthetic hemozoin adjuvant
  • Epitope mapping was performed using the serum with the highest antibody titer (indicated by (*) in FIG. 6). For epitope mapping, each well was coated with 15 peptides (SEQ ID NO: 23 to 37) (concentration: 0.03 mM) shown in FIG. 1-9 and subjected to the ELISA method described above. A comparison was made between one individual with the highest antibody titer for the N-terminal region in each group, and the results showed that the antibody titer for the N-terminal region was enhanced by adding K3 (K-type CpG adjuvant) ( Fig. 7: Frame part).
  • TLR9 ligand adjuvant [K3 (K type CpG adjuvant), D35 (D type CpG adjuvant) or sHZ (synthetic hemozoin adjuvant)]
  • K3 K type CpG adjuvant
  • D35 D type CpG adjuvant
  • sHZ synthetic hemozoin adjuvant
  • the experimental animals were all healthy after vaccination, and no abnormal weight loss / behavior / excretion / appearance or death was observed. That is, the safety of the vaccine used in this test example was confirmed.
  • Test example 4 The polypeptide (2) was combined with an adjuvant (aluminum hydroxide gel, K3 (K type CpG adjuvant)) to immunize squirrel monkeys, and the protective effect against Plasmodium was evaluated.
  • an adjuvant aluminum hydroxide gel, K3 (K type CpG adjuvant)
  • K3 K-type CpG adjuvant
  • aluminum hydroxide gel alone can enhance the immunogenicity of polypeptide (2) and suppress the growth of malaria parasites. It has been shown that it can prevent death.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of polypeptide (2).
  • SEQ ID NO: 2 represents the amino acid sequence of A 1.
  • SEQ ID NO: 3 represents the amino acid sequence of A 2.
  • SEQ ID NO: 4 represents the amino acid sequence of the A 3 represents the amino acid sequence of A 4.
  • SEQ ID NO: 6 represents the amino acid sequence of A 5.
  • SEQ ID NO: 7 represents the amino acid sequence of the A 6.
  • SEQ ID NO: 8 represents the amino acid sequence of A 7.
  • SEQ ID NO: 9 represents the amino acid sequence of B.
  • SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of SE36-1 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of SE36-2 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of SE36-3 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 13 is the amino acid sequence of SE36-4 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 14 is the amino acid sequence of SE36-5 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence of negative SE36 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 16 is the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of polypeptide (2).
  • SEQ ID NO: 17 is the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of SE36-1 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 18 is the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of SE36-2 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 19 is the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of SE36-3 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 20 is the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of SE36-4 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 21 is the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of SE36-5 polypeptide.
  • SEQ ID NO: 22 is the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid sequence of negative SE36 polypeptide.
  • SEQ ID NOs: 23 to 37 are amino acid sequences of polypeptides 1 to 15 for epitope mapping.

Abstract

　本発明は、配列番号１または下記一般式(1)で表されるポリペプチド、及びアジュバントを含有する熱帯熱マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療用ワクチンを提供する:　X1-A-B-X2-Y-X3-(Y)n-X4-(Y)n-X5　(１) (式中、　X1は配列番号１で示されるポリペプチドの第1～7アミノ酸残基を表し、　X2は第73～177アミノ酸残基を表し、　X3は第178～258アミノ酸残基を表し、　X4は第259～289アミノ酸残基を表し、　X5は第290～334アミノ酸残基を表し、　Aは熱帯熱マラリア原虫のSERAポリペプチドの47kd領域内の8merリピート配列を表し、　Bは熱帯熱マラリア原虫のSERAポリペプチドの47kd領域内のセリンリッチ領域の配列を表し、　Yは、A-A、A-B及びBから選択されるいずれかである。　ただし、nは０又は１の整数である。)。

Description

新規マラリアワクチン
　本発明は、高い免疫原性を有する、マラリアワクチンとして有用なポリペプチドに関する。また本発明はマラリア原虫感染症の予防または治療に有用なワクチン、並びにマラリア原虫感染症の診断剤に関する。
　感染症は、途上国等において年間多大な人的、社会的損害を生じさせている。なかでも、マラリア原虫感染症は年間５億人が感染し、２００万～３００万人が死亡するにもかかわらず、未だ有効な予防ワクチンが存在しない。従って、マラリアワクチン開発は急務である。
　しかしながら、過去３０～４０年に亘って、数多くのワクチン臨床試験が行われて来たにもかかわらず、いずれも有効性が示せず頓挫してきた。そのなかで、感染防御を獲得した成人の血清中に、抗マラリア活性を持つ抗体が認識する分子としてSERA（serin repeat antigen）タンパクが同定された（例えば非特許文献１を参照）。
　その後、リコンビナントSERAタンパクを抗原としてワクチン開発が行われてきた。しかしながら、抗SERAタンパク抗体の抗体価は、マラリア原虫感染症に対して感染防御（免疫）を獲得したアフリカ人に比較して低かったため、更なる改善が望まれていた。
Bzik DJ, Li WB, Horii T, Inselburg J.Mol Biochem Parasitol. 1988 Sep;30(3):279-88.
　本発明は、高い免疫原性を有し、マラリアワクチンとして有用なポリペプチド、ならびに当該ポリペプチドのマラリア原虫感染症に対するワクチンとしての用途を提供することを主な目的とする。さらに本発明は、上記ポリペプチドに対する抗体、ならびに当該抗体または上記ポリペプチドのマラリア原虫感染症の診断剤としての用途を提供することを目的とする。
　本発明者らは、既にSERA（serin repeat antigen）ポリペプチドのN-末端に存在する8 merリピート領域および／又はセリンリッチ領域が、熱帯熱マラリア原虫に対する抗体の防御エピトープであることを同定している。
　今般、本発明者らは、優れた免疫原性を示し、マラリアワクチンとして有用なポリペプチドを見出した。加えて、本発明者らは、マラリアワクチンの免疫原性を高めるために最適なアジュバントを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に研究を重ねた結果完成されたものである。
　本発明は、以下の実施態様を包含する。
　（Ｉ）マラリアワクチンとして有用なポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド
（I-1）下記一般式(1)で表されるポリペプチド：
　X1－A－B－X2－Y－X3－（Y）n－X4－（Y）n－X5　　　(1)
（式中、
　X1は配列番号１で示されるポリペプチドの第1～7アミノ酸残基を表し、
　X2は上記ポリペプチドの第73～177アミノ酸残基を表し、
　X3は上記ポリペプチドの第178～258アミノ酸残基を表し、
　X4は上記ポリペプチドの第259～289アミノ酸残基を表し、
　X5は上記ポリペプチドの第290～334アミノ酸残基を表し、
　Aは熱帯熱マラリア原虫のSERAポリペプチドの47kd領域内の8merリピート配列を表し、
　Bは熱帯熱マラリア原虫のSERAポリペプチドの47kd領域内のセリンリッチ領域の配列を表し、Yは、A-A、A-B及びBから選択されるいずれかである。
　ただし、nは０又は１の整数である。）。
　（I-2）前記一般式(1)において、YがA-B又はBである、（I-1）に記載のポリペプチド。
　（I-3）前記一般式(1)において、Aが配列番号２～８から選択される１種のアミノ酸配列であり、Bが配列番号９で示されるアミノ酸配列である、（I-1）に記載のポリペプチド。
　（I-4）一般式(1)で示されるポリペプチドが、下記式(2)～(6)で表されるポリペプチドである（I-1）に記載のポリペプチド：
X1－A1-B－X2－（A2-B）－X3－X4－X5　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(2)
X1－A1-B－X2－（A2-B）－X3－（A3-B）－X4－X5　　　　　　　　　　　(3)
X1－A1-B－X2－（A2-B）－X3－（A3-B）－X4－（A4-B）－X5　　　(4)
X1－A1-B－X2－（A2-A5）－X3－（A3-A6）－X4－（A4-A7）－X5　　(5)
X1－A1-B－X2－（B）－X3－（B）－X4－（B）－X5　　　　　　　　　　(6)
（式中、
　X1は配列番号１で示されるポリペプチドの第1～7アミノ酸残基を表し、
　X2は上記ポリペプチドの第73～177アミノ酸残基を表し、
　X3は上記ポリペプチドの第178～258アミノ酸残基を表し、
　X4は上記ポリペプチドの第259～289アミノ酸残基を表し、
　X5は上記ポリペプチドの第290～334アミノ酸残基を表し、
　A1～A7はそれぞれ配列番号２～８に示すアミノ酸配列を表し、
　Bは配列番号９に示すアミノ酸配列を表す。）。
　（I-5）配列番号１０～１４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する（I-1）～（I-4）のいずれかに記載のポリペプチド。
　（I-6）（I-1）～（I-5）のいずれかに記載のポリペプチドの少なくとも１種をコードするポリヌクレオチド。
　（II）熱帯熱マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療用ワクチン
（II-1）（I-1）～（I-5）のいずれかに記載のポリペプチドの少なくとも１種を有効成分として含有する、熱帯熱マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療用ワクチン。
　（II-2）さらに、水酸化アルミニウムゲル、K3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpGアジュバント）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）からなる群より選択される少なくとも１種のアジュバントを含む、（II-1）に記載のワクチン。
　（II-3）さらに、自然免疫賦活作用を有するリガンドを含む、（II-1）又は（II-2）記載のワクチン。
　（II-4）熱帯熱マラリア原虫感染症を予防及び／又は治療するワクチンとして用いられる（I-1）～（I-5）のいずれかに記載のポリペプチド。
　（II-5）熱帯熱マラリア原虫感染症を予防及び／又は治療するワクチンとして用いられる、（I-1）～（I-5）のいずれかに記載のポリペプチドと、水酸化アルミニウムゲル、K3（KタイプCpGアジュバント）、 D35（DタイプCpGアジュバント）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）からなる群より選択される少なくとも１種のアジュバントとの組み合わせ。
　（II-6）熱帯熱マラリア原虫感染症を予防及び／又は治療するワクチンとして用いられる、（I-1）～（I-5）のいずれかに記載のポリペプチド、水酸化アルミニウムゲル、K3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpGアジュバント）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）からなる群より選択される少なくとも１種のアジュバント、及び自然免疫賦活作用を有するリガンドとの組み合わせ。
　（II-7）配列番号１で表されるポリペプチド、及びアジュバントを含有する熱帯熱マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療用ワクチン。
　（II-8）前記アジュバントが、K3（KタイプCpGアジュバント）、 D35（DタイプCpGアジュバント）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）からなる群より選択される少なくとも１種、又はこれらの少なくとも１種と水酸化アルミニウムゲルとの組み合わせである、（II-7）に記載するワクチン。
　（II-9）さらに自然免疫賦活作用を有するリガンドを含む、（II-7）又は（II-8）に記載するワクチン。
　（II-10）熱帯熱マラリア原虫感染症を予防及び／又は治療するワクチンとして用いられる配列番号１で表されるポリペプチドとアジュバントとの組み合わせ。
　（II-11）熱帯熱マラリア原虫感染症を予防及び／又は治療するワクチンとして用いられる、配列番号１で表されるポリペプチド、アジュバンド、及び自然免疫賦活作用を有するリガンドとの組み合わせ。
　（II-12）前記アジュバントが、K3（KタイプCpGアジュバント）、 D35（DタイプCpGアジュバント）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）からなる群より選択される少なくとも１種、又はこれらの少なくとも１種と水酸化アルミニウムゲルとの組み合わせである、（II-10）または（II-11）に記載する組み合わせ。
　（III）熱帯熱マラリア原虫感染症の診断剤
（III-1）（I-1）～（I-5）のいずれかに記載のポリペプチドに対する抗体。
　（III-2）配列番号２３～３７に記載するポリペプチドに対して結合性を有する（III-1）に記載する抗体。
　（III-3）配列番号２３～２５に記載するポリペプチドに対して結合性を有する（III-1）に記載する抗体。
　（III-4）（I-1）～（I-5）のいずれかに記載のポリペプチド、又は（III-1）～（III-3）のいずれかに記載する抗体を有効成分とする熱帯熱マラリア原虫感染症の診断剤。
　(i)上記一般式(1)で示されるポリペプチド（以下、「ポリペプチド(1)」と略記することがある）は、高い免疫原性を有し、ワクチンとして使用した場合に長期に亘って高い抗SE36抗体価を維持することができる。従って、マラリア原虫に対して免疫を獲得することができ、獲得した免疫を長期間維持することができる。
　 (ii) ポリペプチド(1)によれば、通常マラリア原虫に対する抗体を生体内で生産させるために必要とされる抗原ポリペプチドの量の10～100分の1の量で十分な免疫を獲得することができる。従って、当該ポリペプチド(1)は、一回投与量が少なくてすむため、経済的な観点からも有用である。
　(iii) ポリペプチド(1)をワクチンとして使用した場合、防御エピトープに対する抗体を誘導することができる。従って、本発明のポリペプチド(1)は、免疫原性のより高いマラリアワクチン（特に熱帯熱マラリアに対するワクチン）として使用できる。
　(iv)本発明によれば、配列番号１で示されるポリペプチド（以下、「ポリペプチド(2)」又は「オリジナルSE36ポリペプチド」と記載することがある）に対する最適なアジュバントとの組み合わせを提供することができる。ポリペプチド(2)自身も、天然のSERAポリペプチドを上回る抗原性を有しているが、特定のアジュバントと組み合わせることによって、さらに顕著に優れた抗原性を発揮することができる。従って、ポリペプチド(2)と特定のアジュバント（例えば、ヒト型TLR9リガンドアジュバント、および水酸化アルミニウムゲルとヒト型TLR9リガンドアジュバント、特にK3（KタイプCpGアジュバント）との組み合わせ）を併用することによって、より一層高い抗SE36抗体価を誘導することができる。
ポリペプチド(2)（オリジナルSE36ポリペプチド）とポリペプチド(1)（SE36-1～3）のアミノ酸配列を表す。 ポリペプチド(1)（SE36-4～5）とネガティブSE36ポリペプチドのアミノ酸配列を表す。 ポリペプチド(2)（オリジナルSE36ポリペプチド）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列を表す。 ポリペプチド(1)（SE36-1）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列を表す。 ポリペプチド(1)（SE36-2）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列を表す。 ポリペプチド(1)（SE36-3）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列を表す。 ポリペプチド(1)（SE36-4）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列を表す。 ポリペプチド(1)（SE36-5）及びネガティブSE36ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列を表す。 エピトープマッピング用ポリペプチドのアミノ酸配列を表す。 ポリペプチド(2)（オリジナルSE36ポリペプチド）、ポリペプチド(1)（SE36-1～5ポリペプチド）、及びネガティブSE36ポリペプチドについて、8 merリピート領域及びセリンリッチ領域の配置及び位置関係を表す図である。 ポリペプチド(2)（オリジナルSE36ポリペプチド）、ポリペプチド(1)（SE36-1～5ポリペプチド）、及びネガティブSE36ポリペプチドをそれぞれ接種した後のSE36に対する全IgGの抗体価を測定した結果を表す。 ポリペプチド(2)（オリジナルSE36ポリペプチド）、及びポリペプチド(1)（SE36-1～5ポリペプチド）に関するエピトープマッピングの結果を示す（試験例２）。図中、横軸の1～15は、それぞれ配列番号２３～３７に示される１５個のエピトープマッピングに使用されたポリペプチドを示す。 ポリペプチド(2)（オリジナルSE36ポリペプチド）とアジュバント（水酸化アルミニウムゲル（Alum）、K3、水酸化アルミニウムゲル（Alum）＋K3）の併用による抗体誘導の結果を示すグラフである。 各種アジュバント（水酸化アルミニウムゲル（Alum）、水酸化アルミニウムゲル（Alum）＋K3、水酸化アルミニウムゲル（Alum）＋D35、水酸化アルミニウムゲル（Alum）＋sHZ）とポリペプチド(2)（オリジナルSE36ポリペプチド）との使用後のポリペプチド(2)（オリジナルSE36ポリペプチド）に対する全IgGの抗体価の経時的変化を表すグラフである。 試験例３におけるエピトープマッピングの結果を示すグラフである。図中、横軸の1～15は、それぞれ配列番号２３～３７に示される１５個のエピトープマッピングに使用されたポリペプチドを示す。ポリペプチド(2)のアジュバントとして、水酸化アルミニウムゲルのみ（Alum）（左上図）、水酸化アルミニウムゲル＋K3（KタイプCpGアジュバント）（Alum＋K3）（右上図）、水酸化アルミニウムゲル＋D35（DタイプCpGアジュバント）（Alum＋D35）（左下図）、水酸化アルミニウムゲル＋sHZ（合成ヘモゾインアジュバント）（Alum＋sHZ）（右下図）を用いた。 ポリペプチド(2)＋水酸化アルミニウムゲル（Alum）（n=2）（左図）、ポリペプチド(2)（SE36）＋水酸化アルミニウムゲル（Alum）＋K3（n=3）（中央図）、水酸化アルミニウムゲル（Alum）＋K3（n=2）（右図）を用いて、リスザルを免疫化した後、マラリア原虫を接種して、14日間に亘って血中原虫感染赤血球数（Parasitemia（％））を測定した結果を示す。図中、「dt」はリスザルの倫理的死亡を意味する。
　１．SERAポリペプチドの改変体
　マラリア原虫感染症のワクチンとして有用な本発明のポリペプチド(1)及び(2)について、以下に詳述する。なお、本明細書において、ポリペプチド(1)及び(2)を、「本発明のポリペプチド」と総称することがある。
　(1-1)SERAポリペプチド
　SARA（serine-repeat antigen）ポリペプチドは、赤血球内期のPf遺伝子により発現される合計989アミノ酸からなる分子量115kdのタンパク抗原であり、その構造はＮ末端からＣ末端方向に順に、47kd－50kd－18kdの３つのドメインからなる。これらのドメインの前駆体としてのSERAは、合計5868塩基からなるSERA遺伝子（DNA）上に分散する４つのエキソンによる発現後、赤血球内期でのメロゾイト放出の際にプロセッシングされ、上記３ドメインに開裂する（Molecular and Biochemical Parasitology,86,pp.249-254,1997;及びExperimental Parasitology,85,pp.121-134,1997）。なお、SERA遺伝子（DNA）とこれがコードするアミノ酸配列の完全長データはGenBankで公開され入手可能である（Accession Number:J04000;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。また、SERAのＮ末端領域（以下「47kd領域」と表記する）は、合計382アミノ酸残基からなり、その配列に係るPf株間のホモロジー検索によれば、アミノ酸の欠失や付加、約20ヵ所におけるアミノ酸の変異（非同義置換）等の散在がみられ、多様である（Molecular and Biochemical Parasitology,同前;及びExperimental Parasitology,同前）。
　(1-2) ポリペプチド(2)
　ポリペプチド(2)は、配列番号１で示されるオリジナルSE36ポリペプチドである。
　当該ポリペプチド(2)は、前述した熱帯熱マラリア原虫PfのHonduras-1株（以下、「Hond-1」と略記することがある）のSERAの47kd領域を基礎とするSE47’抗原（Vaccine,14,pp.1069-1076,1996；以下、「SE47’」と略記する）に由来する。ポリペプチド(2)は、Hond-1のSERAの47kdを構成する合計382アミノ酸のＮ末端のメチオニンを起点（第１番アミノ酸）としてＣ末端方向に順次、序数付けした第16番めのアミノ酸（アスパラギン）のコドンを、開始コドン（メチオニン）に置換し、かつ、第382番めのアミノ酸（グルタミン酸）の後に翻訳停止コドンを隣接挿入し、更に、そのセリン反復領域を占める合計33個の重合セリン残基（第193番から第225番セリンまで）を切除した合計334アミノ酸からなるポリペプチドである。このポリペプチド(2)のアミノ酸配列は図１－１において配列番号１として具体的に示される。配列番号１で示されるポリペプチド(2)は、天然型の上記SERAポリペプチドよりも高い免疫原性を有している。
　(1-3) ポリペプチド(1)
　ポリペプチド(1)は、上記配列番号１で示されるポリペプチド(2)にさらに改良を加え、より高い免疫原性を有する改良型のSE36ポリペプチドである。
　ポリペプチド(1)は、下記一般式(1)で表される。
　X1－A-B－X2－Y－X3－（Y）n－X4－（Y）n－X5　　　(1)
式中、
　X1は配列番号１で示されるポリペプチドの第1～7アミノ酸残基を表し、
　X2は上記ポリペプチドの第73～177アミノ酸残基を表し、
　X3は上記ポリペプチドの第178～258アミノ酸残基を表し、
　X4は上記ポリペプチドの第259～289アミノ酸残基を表し、
　X5は上記ポリペプチドの第290～334アミノ酸残基を表し、
　Yは、A-A、A-B及びBから選択されるいずれか一つである。
　ただし、nは０又は１の整数である。
　上記一般式(1)においてAは、熱帯熱マラリア原虫のSERAポリペプチドの47kd領域内の8merリピート配列を表す。本発明においては、当該8merリピート配列に相当するものであれば、Pf株間のアミノ酸の変異（非同義置換）があっても、Aの配列として特に制限なく採用することができる。Aのアミノ酸配列として、好ましくは以下の具体的配列A1～A7（Ｎ端側を左端として示される）を例示することができる。
A1：TGESQTGNTGGGQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGS（配列番号２）
A2：TGESQTGNTGGGQAGNTGGDQAGSTGGSPQGSTGASPQGSTGASPQGSTGASQPGS（配列番号３）
A3：TGESQTGNTGGGQAGNTVGDQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGS（配列番号４）
A4：TGESQTGNTGGGQAGNTGGGQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGS（配列番号５）
A5：TGESQTGNTGGGQVGNTGGGQAGSTGGSPQGSTGASQPGSSEPSNPVS（配列番号６）
A6：TGESQTGNTGGGQAGNTVGGQAGNTGGGQAGNTGGDPQGSTGGSQPGS（配列番号７）
A7：TGESQTGNAGGGQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASPQGSTGASPQGSTGASQPGS（配列番号８）。
　前記一般式(1)中、X1に連結するAとしては、A1（配列番号２）が好ましい。
　上記一般式(1)において、Bは、熱帯熱マラリア原虫のSERAポリペプチドの47kd領域内のセリンリッチ領域のアミノ酸配列を表す。本発明においては、前記セリンリッチ領域のアミノ酸配列に相当するものであれば、Pf株間のアミノ酸の変異（非同義置換）があっても、特に制限なくBの配列として採用することができる。Bの配列として、好ましくは以下の具体的配列（Ｎ端側を左端として示される）を例示することができる。
B: SEPSNPVSSGHSVSTVSVSQTSTSS（配列番号９）。
　一般式(1)のA及びBとしては、上記具体的配列（配列番号２～８及び配列番号９）から適宜選択し、組み合わせて用いることができる。また、Aのアミノ酸配列は、上記A1～A7のアミノ酸配列の中から任意に選択することができる。一つのポリペプチドのアミノ酸配列において、Aのアミノ酸配列として、A1～A7から選択される同一のアミノ酸配列を２以上有していてもよいし、異なるアミノ酸配列を任意に組み合わせて有していてもよい。
　YはA-A、A-B、及びBから任意に選択することができるが、好ましくはA-BまたはBである。
　本発明においてより好ましいポリペプチド(1)として、配列番号１０～１４に示されるポリペプチド(1)、すなわちSE36-1～SE36-5を挙げることができる。その模式図を図２に示す。SE36-1～SE36-5を一般式(1)にならって式で示すと下記のようになる：
一般式：X1－A-B－X2－Y－X3－（Y）n－X4－（Y）n－X5　　　　　　(1)
SE36-1：X1－A1-B－X2－（A2-B）－X3－（Y）0－X4－（Y）0－X5
SE36-2：X1－A1-B－X2－（A2-B）－X3－（A3-B）－X4－（Y）0－X5
SE36-3：X1－A1-B－X2－（A2-B）－X3－（A3-B）－X4－（A4-B）－X5
SE36-4：X1－A1-B－X2－（A2-A5）－X3－（A3-A6）－X4－（A4-A7）－X5
SE36-5：X1－A1-B－X2－（B）－X3－（B）－X4－（B）－X5
（上記式中、（Y）0は、Yに該当するアミノ酸残基がないこと、すなわちシングルボンドを意味する。）。
　これらのSE36-1～SE36-5のなかでも、好ましくはSE36-3～SE36-5、より好ましくはSE36-3及びSE36-5、さらに好ましくはSE36-3である。
　(1-4)本発明のポリペプチドの合成
　本発明のポリペプチドの合成には、従来公知の方法を採用することができる。特に限定されないが、例えば、ポリペプチド(2)を合成する場合には、まずポリペプチド(2)をコードするDNA断片（以下、「SE36遺伝子（DNA）」と記載することがある）を合成し、クローニングした後、その合成遺伝子クローンの発現ベクターを構築し、次いで、これを宿主（例えば大腸菌）にトランスフェクションして、作製された形質転換体を培養することにより行うことができる。
　本来のPfコドンを有するSE36遺伝子（DNA）は、大腸菌での発現効率が低い。このため、大腸菌を宿主として製造する場合は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする自然界のPfコドンを全て大腸菌コドンに変換することが望ましい。これにより、本発明のポリペプチドの効率的な産生を行うことができる。
　以下、ポリペプチド(2)の合成を例に説明するが、ポリペプチド(1)についても同様の方法で合成して取得することができる。
　＜SE36遺伝子（DNA）の合成とクローニング＞
　Pfの机上のSE36遺伝子（Pfコドンを有するSE36遺伝子）の塩基配列とそれがコードするアミノ酸配列は、周知の遺伝子データベース公開機関、例えば、DDBJ、GenBank、EMBL等からインターネットにより入手可能である。ポリペプチド(2)のアミノ酸配列は、配列番号１６に示される塩基配列によってコードされる（図１－３参照）。従って、配列番号１６に基づいて、ポリペプチド(2)のアミノ酸配列（配列番号１）をコードするSE36遺伝子（DNA）を合成する。なお、ポリペプチド(1)については、例えばSE36-1～SE36-5のアミノ酸配列（配列番号１０～１４）をコードする配列番号１７～２２に示される塩基配列に基づいてDNAを合成する。
　Pfコドンから大腸菌コドンへの机上の変換は、例えば、GenBankのCoden Usageデータベースや発明者の既報（前述のVaccine；及びMolecular Biochemistry of Parasitology、63、265-273、1994）等を参考に用いることにより行うことができる。大腸菌コドンへの変換においては、Ｎ末端アミノ酸を開始コドンのMetに置換する以外は、自然界におけるPf本来のアミノ酸配列を十分に重視し、その抗原性がアミノ酸の非同義置換により損なわれないよう留意する。
　DNA合成は、市販のDNA合成機、例えば、DNA/RNA合成機［Applied Biosystem Medel 392:PE社（米国）製］、ASM-102U DNA合成機［BIOSSET社（米国）製］等を用いることができる。かかる合成機により、約100ないし約200ヌクレオチドが重合のセンス（＋）とアンチセンス（－）の両鎖DNA断片を別途に合成の後、各合成DNA断片は、例えば、ポリアクリルアミド電気泳動により精製する。次いで、精製された単鎖DNA断片の相補鎖（対）のアニーリングにより合成２本鎖DNA断片を調製する。
　合成２本鎖DNA断片のクローニングには、既知又は市販の、宿主が大腸菌のクローニング用ベクター（“Cloning Vectors:A Laboratory Manual”、I-1~I-D-i-8、P.H.Pouwelsら著、Elsevier1988発行に多種多様に紹介されている）、例えば、プラスミドpBluescriptII SK＋と大腸菌XL1-Blueとの組合せ［Stratagene社（米国）製］を用いることができる。かかるクローニングでは、例えば、上記DNA断片の制限酵素断片を、これと同一の酵素で開裂したベクターの制限酵素サイトに挿入連係し構築したベクターを宿主に移入することにより、形質転換体としてのクローンが得られる。次いで、２本鎖DNA断片の各クローンは、上記形質転換体の培養により増幅の後、これ等の各塩基配列をチェインターミネーター法（dideoxy法）やマクサム・ギルバート法により決定する。尚、これには、市販のDNAシーケンサー、例えば、ABI PRISM 3700［PE社（米国）製］を用いることができる。その結果に基づき、SE36遺伝子（DNA）をコードする２本鎖DNA断片を約５～１０クローンを選択する。
　SE36遺伝子（DNA）のクローニングは、前記２本鎖DNA断片クローンの連結により行う。例えば、前記において８クローン（８対）が選択された場合には、これ等の２本鎖DNA断片を順次、連結することによりSE36遺伝子DNAを得ることができる。次いで、この全長DNAを、前述と同様にしてクローニングする。尚、上記連結の際には、２本鎖DNAの各断片の両末端に連結用の制限酵素cohesiveサイトの導入が望まれる。但し、かかる導入には、Pf本来のアミノ酸配列が変化しないよう、コドンとしての塩基配列を整合させる必要がある。また、ポリペプチド(1)において、連結用の制限酵素cohesiveサイトは、全長DNA中の連結部分に残存していてもよく、そのまま翻訳されてアミノ酸配列中に残存してもよい。
　＜SE36遺伝子の発現系の構築＞
　SE36遺伝子（DNA）の発現ベクターの作成には、既知又は市販の、宿主が大腸菌の発現用ベクター（“Cloning Vectors:A Laboratory Manual”、同前に多種多様に紹介されている）、例えば、プラスミドpET-3aと、大腸菌BL21(DE3)pLysS、又は大腸菌BL21(DE3)pLysEとの組合せ［Stratagene社（米国）製］を用いることができる。かかる作製は、例えば、前記クローニングベクターからSE36遺伝子（DNA）を含む制限酵素断片を切出した後、これと同一の酵素で開裂したベクターの制限酵素サイトに挿入連係することにより行う。また、pET-SE47’（前述のVaccine）からも作製することができる。この場合には、例えば、pET-SE47’又はこれが保有のSE47’合成遺伝子からセリン反復領域をコードする全領域ないしは一部領域を制限酵素で切除することにより、上記と同様にして作成することができる。次いで、作成した発現ベクターを宿主に移入することにより形質転換体が得られる。かかる形質転換体から、ポリペプチドの量産を指標として、SE36遺伝子（DNA）の発現系として産業上利用の観点から適確なものを選別することができる。
　本発明のポリペプチドの量産は、上記の大腸菌形質転換体の培養により行う。尚、かかる培養系は、本発明のポリペプチドの生産収率を高める観点から、インデューサー、例えば、IPTG（isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside）の使用、カタボライト・リプレッションの回避、培地組成、培養の温度と時間、宿主細胞内プロテアーゼの除去等につき改良あるいは改善することが可能であり、これ等は、発現ベクターの改造、更に、プロモーターや宿主菌株の変更等により行うことができる。
　＜ポリペプチドの精製＞
　本発明のポリペプチドが細胞外へ分泌される場合には、上記の形質転換体の培養物の除菌培養液を上記SE36ポリペプチド抽出の出発材料として用いる。細胞内に蓄積される場合は、例えば、培養物から遠心、濾過等により集菌し採取した菌体から上記ポリペプチドを抽出する。先ず、抽出第一段階としての菌体の破砕には、酵素による消化、浸透圧による破壊、急激な加圧減圧、超音波、種々のホモジナイザー等々を用いることができる。次いで、菌体破砕物を分別するための手段として、物理的な低速遠心、超遠心、濾過、分子ふるい、膜濃縮等、化学的な沈殿剤、可溶化剤、吸脱着剤、分散剤等、物理化学的な電気泳動、カラムクロマトグラフィー、支持体、透析、塩析等を、それぞれ組合せて用いることができる。また、これ等の手段の適用においては、温度、圧力、ｐＨ、イオン強度等の物理化学的条件を適宜、設定できる。
　＜本発明のポリペプチドとその抗原性の確認＞
　上記のようにして得られた本発明のポリペプチドの検出とサイズの確認は、例えば、沈降係数の測定、分子ふるい、SDS－ポリアクリルアミド電気泳動等により行うことができる。また、本発明のポリペプチドの抗原性は、SERAの47kdに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いるWestern blot分析、ELISA、凝集反応，蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ等での抗原抗体反応により確認できる。更に、本発明のポリペプチドの免疫原性、及び抗SE36抗体のPf原虫増殖阻害能は、熱帯熱マラリア原虫感染症患者の血清や、当該ポリペプチドで免疫した実験小動物、例えば、ラットやマウス等の血清等を用いる抗原抗体反応、Pf merozoiteの赤血球内での増殖阻止試験（いわゆる中和反応）、抗SE36抗体の保有者の血中Pf数の測定等により確認することができる。
　２.マラリアワクチン
　本発明は、上記本発明のポリペプチドを含むマラリアワクチンを提供する。マラリア原虫感染症には、三日熱マラリア、四日熱マラリア、卵形マラリア及び熱帯熱マラリアが知られている。本発明のワクチンは、熱帯熱マラリアの抗原としての特異性が顕著に高いことから、熱帯熱マラリアワクチンとして好適である。但し、他のマラリア原虫感染症に対する使用を制限するものではない。
　以下、ポリペプチド(2)を例にワクチンの調製方法等を説明するが、ポリペプチド(1)の場合であっても同様の方法で調製等を行うことができる。
　(2-1)ワクチンの調製
　前記の精製されたポリペプチド(2)を抗原として、これを溶媒、例えば、等張のPBS（phosphate buffer saline）に溶解させ、ワクチン原液を調製する。
　尚、上記ワクチン抗原は常用の不活化剤で固定化することにより立体構造を安定化できる。不活化剤としては、例えば、ホルマリン、フェノール、グルタルジアルデヒド、β－プロピオラクトン等をワクチン原液の調製の前又は後に添加して用いることができる。ホルマリンを使用の場合、その添加量は約0.005～0.1％（v/v）、不活化温度は約4～38℃、不活化時間は約5～180日である。但し、不活化により抗原性が損なわれる場合には、不活化条件を緩和するための創意工夫を要する。かかる緩和は、例えば、不活化剤の減量、中性アミノ酸や塩基性アミノ酸等の添加、不活化温度の低下等により達成できる。また、不活化工程で残存する遊離ホルムアルデヒドは、必要に応じて、等量の亜硫酸水素ナトリウムを添加してこれを中和するか、透析により除去できる。
　また、ワクチンの経口や経鼻接種による粘膜免疫あるいは局所免疫の誘導を目的として、上記ポリペプチド(2)（すなわち抗原）を加工あるいは修飾できる。これには、例えば、リポソーム、エマルジョン、マイクロカプセル、マイクロスフェアー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等を用いるDDS（drug delivery system）に係る技術を適用できる。以上により得られた調製物をワクチン原液として次の工程に供する。
　上記ワクチン原液を、例えば、前記PBSで希釈し、ワクチン中の抗原量が、抗体産生を誘導し、免疫を奏するに必要な量になるよう調整する。その際、ワクチンの耐熱性を増強する安定化剤や、免疫原性を高める補助剤としてのアジュバントを添加混合することができる。例えば、安定化剤としては、糖類やアミノ酸類を挙げることができ、また、アジュバントとしては、鉱物油、植物油、ミョウバン、アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウムゲル等）、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インターロイキン等を挙げることができる。アジュバントとして好ましくは、後述するように、水酸化アルミニウムゲル、及びヒト型TLR9リガンドアジュバント、具体的にはK3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpG ODNアジュバント ）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）等を挙げることができる。
　次いで、適当な量、例えば、約1～20ｍｌ容のバイアルに分注し、密栓・密封の後、ワクチンとして使用に供する。かかるワクチンは、液状のみならず、分注後に凍結乾燥を行うことにより。乾燥製剤として使用に供することができる。
　(2-2)ワクチンの検定
　ワクチンの工程管理及び品質管理に係る検定は、薬事法（昭和35年法律第145号）第42条第1項の規定に基づく日本国の規程「生物学的製剤基準」、ＷＨＯの勧告“Requirements for Biological Substances”[WHO Technical Report Series(TRS)、No.889、pp.105-111、1999]等に準拠して行われる。マラリアワクチンは、未だ実用化されておらず、その製剤基準が存在しないので、その検定は、これに類似のワクチンに係る基準、例えば、上記ＷＨＯの勧告“Requirements for Hepatitis B Vaccines Made by Recombinant DNA Techniques”(上記TRS、No.786、1898、及びNo.889、1999)、“Requirements for Japanese Encephalitis Vaccine(Inactivated)for Human Use”（上記TRS、No.771、1988）等に記載の安全性と有効性に関する種々の規定に準拠し行うことができる。例えば、無菌、異常毒性否定、タンパク質含量、純度、水素イオン濃度、抗原確認、抗原ポリペプチド等、要求あるいは勧告される種々の試験規定に準拠して検定を行い、これ等の全ての検定試験に合格した製造ロットを適格なマラリアワクチン製剤として実用に供する。
　(2-3)ワクチンの用法
　ワクチン接種は、当業界において通常の方法に従って行うことができ、特に限定されないが、例えば、１ドーズ0.25～0.5ｍｌを皮下接種する。尚、かかる接種は、約２～４週間隔で１～３回行うことが好ましい。
　３.アジュバント及びこれを組み合わせてなるワクチン
　(3-1)上記ワクチンの製造において、ポリペプチド(1)は、当該ポリペプチドと共に、従来公知のアジュバントを組み合わせて用いても良い。アジュバントとしては、本発明の免疫効果を増強し得るものであれば特に限定されないが、例えば、水酸化アルミニウムゲル、ヒト型TLR9リガンドアジュバントであるK3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpG ODNアジュバント ）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）等が挙げられる。さらに、これらのアジュバントの他にも、自然免疫賦活作用を有するリガンドをアジュバントとして用いることもできる。
　本発明においては、これらのアジュバントのなかから選択されるいずれか１種を用いてもよいし、またこれらから任意に選択される２種以上を組み合わせて用いてもよい。水酸化アルミニウムゲルは、抗原とアジュバントとの不溶性複合体を形成させる性質を有する。この抗原－アジュバント複合体は、局所に滞留することから、水酸化アルミニウムゲルとその他の前記アジュバントとを組み合わせて用いることが望ましい。
　(3-2)ポリペプチド(2)も、ワクチンの調製において、上記(3-1)に例示した従来公知のアジュバントを用いることができる。好ましくはヒト型TLR9リガンドアジュバントであるK3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpG ODNアジュバント）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）である。しかし、当該ポリペプチド(2)は、特定のアジュバントを組み合わせた場合に顕著に優れた効果を奏する。
　ここでポリペプチド(2)と併用した場合に特に優れた免疫原性を発揮するアジュバントの組み合わせとしては、上記ヒト型TLR9リガンドアジュバント同士の組み合わせのほか、(a)水酸化アルミニウムゲルとK3（KタイプCpGアジュバント）；(b)水酸化アルミニウムゲルとD35（DタイプCpGアジュバント）；及び(c)水酸化アルミニウムゲルとsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）の組み合わせを挙げることができる。なかでも、(a)水酸化アルミニウムゲルとK3（KタイプCpGアジュバント）の組み合わせを用いた場合には、長期間に亘って高い抗SE36抗体価を維持することができる。従って、ポリペプチド(2)と前記特定のアジュバントの組み合わせは、マラリアワクチンとして有効である。
　４.診断剤
　ポリペプチド(1)又は(2)に対する抗体は、マラリア原虫感染症の診断に使用することができる。すなわち、本発明によれば、上記ポリペプチド(1)または(2)に対する抗体を有効成分として含有するマラリア原虫感染症の診断剤を提供することができる。ポリペプチド(1)または(2)に対する抗体は、例えば、前記ポリペプチドを、常法に従って、動物、例えば、ウサギ、モルモット、マウス等の腹腔内、皮下や筋肉内等に接種し、抗体産生させたこれらの動物の血清から採取することができる。かかる抗体は、抗原検出用として使用でき、マラリア原虫の感染が疑われる患者の血清等の被験試料中に抗原が検出されれば、マラリア原虫に感染していると診断することができる。
　また、ポリペプチド(1)又は(2)を抗原とし、マラリア原虫の感染が疑われる患者の血清等を被験試料として、沈降反応、凝集反応、中和反応、蛍光抗体法、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ等によって抗SE36抗体を検出することができる。これにより、被験試料に抗体が検出されればマラリア原虫に感染していると診断される。
　本発明に係る診断用の抗原や抗体は、これらの診断剤中の含量が、抗原抗体反応を呈するに必要な量となるよう、溶媒、例えば、前記PBSで希釈調整し使用に供する。
　５.マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療方法
　本発明のワクチンは、前述のように、高い抗体価を有していることから、マラリア原虫の感染を防止するために予め、被験者（例えばマラリア原虫の感染を予防する必要がある者）に投与することによって効果的にマラリア原虫感染症を予防することができる。
　また、本発明のワクチンは、特に熱帯熱マラリア原虫感染症に対して有効であることから、熱帯熱マラリア原虫に感染した患者に投与することによって、効果的に熱帯熱マラリア原虫感染症を治療することができる。従って、本発明は、上記マラリアワクチンを用いたマラリアの予防及び/又は治療方法をも提供するものである。マラリアワクチンの調製方法、投与量等については前述の通りである。
　また、前述するように本発明のポリペプチド(1)または(2)と前記アジュバントを共に投与することによって、より一層、マラリアの予防及び/又は治療効果を高めることができる。
　以下に試験例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　試験例１
　本発明者らは、以前に、SE36（配列番号１）に対するエピトープマッピングの結果から、Ｎ端領域に存在する8 merリピートまたはセリンリッチ領域、あるいはその両方の領域が防御エピトープとして重要であるという結果を得ている（これを開示する文献名を記載します。）。
　本試験例では、前記知見に基づいて、これらの領域を複数含めた5種類のポリペプチド(1)（配列番号１０～１４）を設計した。同時に、オリジナルSE36ポリペプチド（ポリペプチド(2)：配列番号１）と、ネガティブコントロールとしてN端領域を持たないSE36（ネガティブSE36：配列番号１５）を設計した。これらのポリペプチドのアミノ酸配列を図１－１～１－２に、当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列を図１－３～１－９（配列番号１６～２２）に示される。また、５種類のポリペプチド(1)、ポリペプチド(2)及びネガティブSE36ポリペプチドの構造の概略図を図２に示す。
　本試験例において使用されたポリペプチドの調製方法は、以下のとおりである。なお、ポリペプチド(2)の調製方法について詳述するが、その他のポリペプチドの調製も同様の方法にて行った。
　ポリペプチド発現系の構築
　ポリペプチド(2)（配列番号１）の発現系の構築は、次のように行った。
　Pfコドンから大腸菌コドンに机上で変換した全長SE36遺伝子DNA塩基配列を8分割し、各分割断片のセンス(+)鎖とアンチセンス(-)鎖の単鎖DNA断片を合計16本(8対)合成すると共にアニーリングし、合計8対の2本鎖DNAを調製の後、これ等を相互に連結し、全長SE36遺伝子を作成し、その発現ベクターを構築した。
　尚、合成DNA断片のクローニングと連結の基本操作は、Sambrookらの方法(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)により行った。
　前記の単鎖DNA断片はそれぞれ、DNA/RNAシンセサイザー“Applied Biosystem model 392”[PE社(米国)製]を用いて合成した。これ等の合成断片は、10%(W/V)ポリアクリルアミド(50mM Tris-ホウ酸塩、pH8.3,1mM EDTA,及び8M 尿素を含有)の電気泳動により精製した。次いで、20p molesの精製断片DNAの各+と-の相補鎖を混合の後、緩衝液(20μlの20mM Tris-HCl、pH7.0、50mM NaCl、及び2mM MgCl2)中で85℃、5分間、保温した。
　更に、上記両鎖の相補領域をアニーリングするため、ZymoreactorII[ATTO社(日本)製]を用い、その温度を5℃/5分の割合で55℃まで、次に、5℃/10分の割合で25℃まで下げた。アニーリング終了の後、等量の緩衝液[20mM Tris-HCl、pH7.8、10mM MgCl2、5mMのジチオスレイトール(DTT)、4種のnucleoside-5'-triphosphate(NTP)の各1mM NTP、及び3unitsのT4 DNAポリメラーゼ]を添加混合し、4℃で5分、25℃で5分、更に、37℃で120分、順次、保温した。
　これより得られた各2本鎖DNA断片は、SE36遺伝子の構築に用いるため、制限酵素KpnI及びBamHIで消化し、pBluescriptII SK+と大腸菌XL1-Blueでクローニングかつ増幅し、各クローンの上記DNA断片の塩基配列をdideoxy法で決定すると共に、全長SE36遺伝子をカバーする8クローンを選定した。これ等の8クローン(8対)の合成2本鎖DNA断片を連結することにより全長SE36遺伝子の2本鎖DNAを調製した。
　尚、その際、Pf本来のアミノ酸配列が変化しないよう配慮された塩基配列を利用して、連結用の制限酵素サイトが各対DNAの両末端に導入された。次いで、全長SE36遺伝子は、pBluescriptII SK+でクローニングの後、大腸菌XL1-Blueに移入し増幅すると共に、その塩基配列をdideoxy法で決定した。その結果を配列表の配列番号１０に示す。
　次いで、上記クローンの制限酵素NdeI-BamHI断片をプラスミドpET-3aのNdeI及びBamHI両切断サイトに挿入連係し、SE36発現ベクターpET-SE36を構築した。この発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)pLysSに移入することにより形質転換体、大腸菌BL21(DE)pLysS/pET-SE36を作製し、これを大腸菌BL/SE36と命名した。
　ポリペプチドの発現と精製
　上記で得た大腸菌BL/SE36をアンピシリン50μg/ml含有のLB培地[Bacto-trypton 1%(W/V)、Bacto-yeast extract 0.5%(W/V)、及びNaCl 1%(W/V)]で37℃にて18時間培養しシードを調製した。次いで、上述の新鮮LB培地5Lに上記シード50mlを接種した後、37℃で培養した。菌数が1×108/mlに達した時点で、IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を、最終濃度が50μg/mlになるよう添加混合の後、更に、37℃にて3時間培養した。培養終了後、遠心(5,000rpm、10分)により集菌し、細胞ペースト3.2gを得た。このペーストを、9.6mlの氷冷した溶菌(lysis)緩衝液(50mM Tris-HCl、pH8.0、及び1mM EDTA)に懸濁の後、以下(1)-(6)の操作を記載の順に、4℃で行った。
　(1)超音波処理
　超音波(19.5kHz、50W)で20秒間、6回処理により上記ペースト細胞を破砕の後、その遠心(15,000rpm、30分)上清を採取し、20ml容のビーカーに移注した。
　(2)硫安塩析I
　上記ビーカー内液に、攪拌下で2.37gの結晶(NH4)2SO4を35%(W/W)飽和になるよう添加混合し、更に、30分間撹拌を続け塩析を行った。次いで、これを遠心(12,000rpm、10分)し、その上清を捨て、沈渣に、30%(W/W)硫安飽和になるよう9mlの氷冷硫安溶液[1.1M(NH4)2SO4を含有の前記lysis緩衝液]を加え、懸濁した。この懸濁液を遠心(12,000rpm、10分)し、その上清を捨てた後、8.8mlの溶解緩衝液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA,50mM 2-メルカプトエタノール、9M 尿素、及び1%(W/V)Tween 80]を添加し、沈渣を再懸濁し回収した。この再懸濁液の1/2量(4.4ml)を60℃で10分間保温し、再び氷冷の後、0.45μm-フィルター[Millipore社(米国)製]で濾過した。
　(3)カラム精製I
　上記濾液を、GF緩衝液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、50mM 2-メルカプトエタノール、及び8M 尿素]で平衡化したSephacryl S-300(26/60)カラムクロマトグラフィー(流速0.3ml/分、4℃)で分画(3.5ml/分画)した後、第22-43各分画をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その泳動像に基づき検出されるSE36タンパク質を多量に含む第32-37分画をプールした。残りの再懸濁液(4.4ml)も上記と同様に処理した後、前記の分画プールと併せて次(4)の操作に用いた。
　(4)カラム精製II
　上記の分画プールを室温に置き、攪拌下でこの分画プール1ml当たり0.093gの(NH4)2SO4を添加混合し、硫安の最終濃度が0.7Mになるよう調整した。一方、容量13mlの水性カラムOctyl Sepharose(Pharmacia Biotech)を10倍量のHlC緩衝液[0.7M(NH4)2SO4を含有の前記GF緩衝液]で平衡化した。このカラムに上記の硫安濃度調整の分画プールを流速0.5ml/分にて流入した。更に、吸光度が下がるまで、HlC緩衝液を流入の後、確認のため、(NH4)2SO4を含有しないGF緩衝液により吸着成分を溶出した。このカラムでの未吸着分画を透析バッグに入れ、1Lの20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)(1mM EDTA含有)を外液に用い4℃で10時間、透析した。尚、この透析の間、外液を2回交換した。
　(5)硫安塩析II
　透析済みバッグを更に、0.3Lの50%(W/W)飽和(NH4)2SO4溶液[20mM Tris-HCl(pH8.0)及び1mM EDTA含有]を外液に用い4℃で10時間、透析することにより、タンパク質を沈澱させた。この沈殿物は、遠心(12,000rpm、10分)により、沈渣として回収の後、2mlのGF緩衝液に懸濁した。
　(6)カラム精製III
　上記の懸濁液を60℃で10分間保温の後、4℃に戻した。これを前記0.45μm-フィルターで濾過し、その濾液を流速0.3ml/分にて、GF緩衝液2[10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA、20mM 2-メルカプトエタノール、及び8M 尿素]で平衡化した前記S-300カラム(26/60)にかけ分画した。前述(3)と同様にして、各分画のSDS-ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、SE36タンパク質の分画を選別の後、これ等をプールして該分画12mlを得た。この分画プールを希釈用緩衝液[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、及び2M尿素]に撹拌添加し、SE36タンパク質の濃度が25μg/mlとなるように希釈した。この希釈液を2LのPBS[9mM NaHPO4、3mMNaH2PO4、及び137mM NaCl(pH7.4)]を外液に用い4℃で10時間、透析した。尚、この透析の間、外液を2回交換した。次いで、透析終了後の内液を、Centprep 30で濃縮した後、Durapore 0.22μm-フィルター[Millipore社(米国)製]で濾過滅菌し、SE36タンパク質を1mg/mlを含有の無菌標品10mlを得、これをSE36ワクチン原液として4℃に保存した。
　アミノ酸配列決定
　前述のようにして得られたポリペプチド(2)のアミノ酸配列は、タンパク質シークエンサーApplied Biosystems 473A[PE社(米国)製]を用いるエドマン分解により決定し、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有することが確認された。
　試験例２
　抗原として、ポリペプチド(1)（SE36-1～SE36-5ポリペプチド）、ポリペプチド(2)及びネガティブSE36ポリペプチドを用いて、下記に試験を行った。
　精製したこれらの各ポリペプチド（抗原）をマウスに免疫し、抗体価の誘導をモニターした。具体的には、C57BL/6_tlr4KOマウス35匹を5匹ずつ7グループに分け、それぞれの抗原に水酸化アルミニウムゲル＋K3アジュバントを加え、皮下注射で免疫した。結果を図３に示す。
　免疫量は抗原（1μg）に対して水酸化アルミニウムゲル（13μg）とK3（50μg）とした。図３に矢印で示すように、最初の免疫から2週間後に2回目の免疫を行った。毎週採血を行って血清を取得し、抗SE36-IgG抗体価をELISA法により測定した。ELISA法は以下の通り実施した。
　ELISAプレートの調製
　96-well MaxiSorp NUNC-Immuno plate (442404: Nunc)にCoating Buffer （（pH9.6）:１Lの蒸留水中、3.4 g Na2CO3及び5.7 g NaHCO3）でSE36を希釈(1μg/ml, 100μl/well)した、希釈されたSE36を1 wellに100 μlずつ分注し、Wash Buffer（0.05% Tween 20を含有するPBS(-)）で2回洗浄した。その後、Blocking Buffer（5% Skim Milk及び0.05% Tween 20を含むPBS(-)）でブロッキングし、4℃、2時間、インキュベートした。ブロッキング後のELISAプレートを、Wash Bufferで４～５回洗浄し、使用する迄の間、－20℃で保存した。
　試験血清との反応
　(a)スタンダード血清
　横12 well又は縦8 wellプレートを使用し、1 well目を150 μl、それ以降を100 μlずつBlocking Bufferを分注した。1 well目に1.5 μlのスタンダードとなる血清を入れ、良く混合した（1/100希釈）。1 well目の50μlを隣のwell移し、良く混合した（1/3希釈）。これを最後のwellまで繰り返し行った（これにより、1/100, 1/300, 1/900, 1/2700,…と段階希釈できる）。
　(b)試験血清
　Blocking Bufferによるサンプル（血清）の希釈（1/100, 1/500, 1/1000など：必ずスタンダードの範囲内にO.D.値が来るようにした）し、1 wellに100μlずつ分注した。室温で２～３時間、又は4℃で一晩インキュベートした。その後、Wash Bufferで４～５回洗浄した。
　2次抗体との反応
　2次抗体（Anti-Mouse IgG (Goat Anti-Mouse IgG (H+L)) (1031-05: SouthernBiotech)）を希釈倍率でBlocking Bufferと混合し、1 wellに100μlずつ分注した後、室温で２～３時間、又は4℃で一晩インキュベートした。その後、Wash Bufferで４～５回洗浄した。なお、二次抗体の希釈倍率は、任意に設定することができる。
　検出
　発色基質であるTMB（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine：SIGMA: T8665-100ML）を1 wellに50μlずつ分注し、適当な濃さに青色になったところで、1 mol/l-硫酸（ナカライテスク: 95626-06）を50μlずつ分注した。その後、プレートリーダーを用いて、450 nmで検出し、540 nmでBackgroundを引いた。
　図３に示されるように、ポリペプチド(1)（SE36-1～SE36-5）を用いた場合、いずれもポリペプチド(2)よりも高い抗体価が得られた。特に、SE36-3～SE36-5において優位な抗体価の誘導が見られた。この結果から、改良型SE36ポリペプチドである本発明のポリペプチド(1)は、オリジナルSE36ポリペプチド（ポリペプチド(2)）よりも、数十倍から数百倍の抗SE36抗体を誘導することが可能であることが示された。
　エピトープマッピング
　さらに第4週目の血清を用いてエピトープマッピングを行った。エピトープマッピングには、配列番号２３～３７に示される15本のペプチド（図１－９参照）をそれぞれ、0.03mMの濃度で各ウェルをコートし、上記ELISA法に供することで実施した。結果を図４に示す。エピトープマッピングの結果、ポリペプチド(1) （SE36-1～SE36-5）は防御エピトープとして重要なＮ端領域に対する抗体の誘導を優位に促進していることが示された。
　すなわち、ポリペプチド(2)（オリジナルSE36ポリペプチド）を抗原として用いた場合には、SE36ポリペプチドのＮ端領域に対する抗体の誘導は図４の上段左端に示すとおりであるが、SE36-1～5（特にSE36-3～5）のポリペプチド(1)は、SE36ポリペプチドのＮ端領域（エピトープ用ポリペプチド１～３（配列番号２３～２５のポリペプチド））に対する抗体の誘導を顕著に高めることが示された。
　試験例３
　下記に示すように、アジュバント（水酸化アルミニウムゲル、K3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpGアジュバント）、sHZ（合成ヘモゾインアジュバント））を組み合わせて、ポリペプチド(2)の免疫原性に対する増強作用を評価した。
　（１）アジュバントの併用による抗体誘導能の向上
　抗原として、ポリペプチド(2)のみ、水酸化アルミニウムゲルとポリペプチド(2)の組み合わせ、K3とポリペプチド(2)の組み合わせ、ならびに、水酸化アルミニウムゲル及びK3とポリペプチド(2)の組み合わせを用いて免疫を行った。試験方法は、上記試験例２に準じて行った。最初の免疫から第４週目に抗SE36-IgG抗体価を測定した。その結果を図５に示す。図５の結果から、抗原のみを投与した場合（図５中「none」で示される）、水酸化アルミニウムゲル単独をアジュバントとして用いた場合（図５中「Alum 」で示される）、及びK3単独をアジュバントとして用いた場合（図５中「K3」で示される）に比べ、水酸化アルミニウムゲルとK3をアジュバントとして併用することによって（図５中「Alum＋K3」で示される）、顕著に抗SE36抗体が誘導されることが示された。
　（２）アジュバントの併用による抗体誘導能の向上
　さらに、本発明者らは、水酸化アルミニウムゲルとK3の組み合わせ以外のアジュバントによる、ポリペプチド(2)の免疫原性の向上を評価した。また、本試験においては、長期に亘って被験動物における抗体価を評価した。具体的な試験方法は以下の通りである。
　カニクイザル12頭を3頭ずつ4グループに分け、それぞれ、ポリペプチド(2)のアジュバントとして、水酸化アルミニウムゲルのみ、水酸化アルミニウムゲル＋K3（KタイプCpGアジュバント）、水酸化アルミニウムゲル＋D35（DタイプCpGアジュバント）、水酸化アルミニウムゲル＋sHZ（合成ヘモゾインアジュバント）を用いて、それぞれ皮下注射で免疫した。
　免疫にはポリペプチド(2)（10μg）＋水酸化アルミニウムゲル（125μg）に、K3あるいはD35を各々500μｇ、あるいはsHZを1.5 mM加えたものを用いた。図６中、矢印で示す時点（0日目、22日目及び101日目）で免疫を行い、0日目、7日目、14日目、22日目、28日目、36日目、42日目、56日目、73日目、86日目、101日目、112日目、140日目、175日目、205日目、238日目、268日目、365日目に採血し、血清を採取した。血清中の抗SE36-IgG抗体価をELISA法により測定した。ELISA法は、試験例２に記載される方法に従って。本試験例においては、二次抗体としてAnti-Monkey IgG (whole molecule)-Peroxidase, antibody produced in rabbit (A2054: Sigma)を用いた。結果を図６に示す。
　本試験の結果より、水酸化アルミニウムゲル単独よりも、これにK3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpGアジュバント）またはsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）を組み合わせることで、ポリペプチド(2)の免疫原性を増強させることができること、特に水酸化アルミニウムゲルとK3を併用した場合に高い抗体価を示すと同時に、その効果が長期に亘って維持できることが示された。
　エピトープマッピング
　最も抗体価の高かった時（図６中（*）で示す）の血清を用いてエピトープマッピングを行った。エピトープマッピングは、図１－９に示す15本のペプチド（配列番号２３～３７）（濃度0.03mM）で各ウェルをコートし、上記ELISA法に供した。各グループの中で最もＮ端領域に対する抗体価が高かった1個体ずつで比較したところ、K3（KタイプCpGアジュバント）を加えることでＮ端領域に対する抗体価が亢進するという結果が得られた（図７：枠部分）。
　この試験例の結果より、TLR9リガンドアジュバント〔K3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpGアジュバント）またはsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）〕を添加することにより、ポリペプチド(2)の免疫原性が高められ、さらに優れたマラリアワクチンとして使用できることが示唆された。
　なお、以上の試験例を通して、実験動物は、ワクチン接種の後、いずれも健常であり、異常な体重減少・行動・排泄物・外観、及び死亡例は認められなかった。すなわち、本試験例において使用されたワクチンの安全性が確認された。
　試験例４
　ポリペプチド(2)にアジュバント（水酸化アルミニウムゲル、K3（KタイプCpGアジュバント））を組み合わせて、リスザルを免疫し、マラリア原虫に対する防御効果を評価した。
　リスザル7頭をランダムに3群に分け、各群に、ポリペプチド(2)＋水酸化アルミニウムゲル（n=2）、ポリペプチド(2)＋水酸化アルミニウムゲル＋K3（KタイプCpGアジュバント）（n=3）、水酸化アルミニウムゲル＋K3（KタイプCpGアジュバント）（n=2）を、3週間間隔を置いて2回、皮下注射し、免疫した。なお、免疫には各成分〔ポリペプチド(2)（10μg）、水酸化アルミニウムゲル（125μg）、K3（500μg）〕の投与量が合計0.5mlになるように調整して用いた。免疫後、5×108の生マラリア原虫を大腿部静脈から接種し、14日間に亘って毎日、各リスザルの血中の原虫感染赤血球数を測定した。
　結果を図８に示す。図８に示すように、［ポリペプチド(2)＋水酸化アルミニウムゲル］投与群（n=2）のうち一匹、並びに［水酸化アルミニウムゲル＋K3］投与群（n=2）は二匹とも、原虫感染赤血球数が約40～50％もの高値を示し、9日目までに倫理的に死亡した。一方、［ポリペプチド(2)＋水酸化アルミニウムゲル＋K3］投与群（n=3）は３匹とも、原虫感染赤血球数が30％より低く、致死的な状態にはならなかった。
　この結果より、水酸化アルミニウムゲル単独よりも、これにK3（KタイプCpGアジュバント）を組み合わせることで、ポリペプチド(2)の免疫原性が増強して、マラリア原虫の増殖が抑制でき、感染者の死を防止できることが示された。
配列番号１は、ポリペプチド(2)のアミノ酸配列である。
配列番号２は、A1のアミノ酸配列を表す。
配列番号３は、A2のアミノ酸配列を表す。
配列番号４は、A3のアミノ酸配列を表す
配列番号５は、A4のアミノ酸配列を表す。
配列番号６は、A5のアミノ酸配列を表す。
配列番号７は、A6のアミノ酸配列を表す。
配列番号８は、A7のアミノ酸配列を表す。
配列番号９は、Bのアミノ酸配列を表す。
配列番号１０は、SE36-1ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、SE36-2ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、SE36-3ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、SE36-4ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１４は、SE36-5ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ネガティブSE36ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１６は、ポリペプチド(2)のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号１７は、SE36-1ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号１８は、SE36-2ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号１９は、SE36-3ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号２０は、SE36-4ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号２１は、SE36-5ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号２２は、ネガティブSE36ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号２３～３７は、エピトープマッピング用ポリペプチド１～１５のアミノ酸配列である。

Claims (11)

  1. 　配列番号１で表されるポリペプチド、及びアジュバントを含有する熱帯熱マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療用ワクチン。
  2. 　前記アジュバントが、K3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpGアジュバント）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）からなる群より選択される少なくとも１種、又はそれらの少なくとも１種と水酸化アルミニウムゲルとの組み合わせである、請求項１に記載するワクチン。
  3. 　下記一般式(1)で表されるポリペプチド：
    　X1－A-B－X2－Y－X3－（Y）n－X4－（Y）n－X5　　　(1)
    （式中、
    　X1は配列番号１で示されるポリペプチドの第1～7アミノ酸残基を表し、
    　X2は上記ポリペプチドの第73～177アミノ酸残基を表し、
    　X3は上記ポリペプチドの第178～258アミノ酸残基を表し、
    　X4は上記ポリペプチドの第259～289アミノ酸残基を表し、
    　X5は上記ポリペプチドの第290～334アミノ酸残基を表し、
    　Aは熱帯熱マラリア原虫のSERAポリペプチドの47kd領域内の8merリピート配列を表し、
    　Bは熱帯熱マラリア原虫のSERAポリペプチドの47kd領域内のセリンリッチ領域の配列を表し、
    　Yは、AA、AB及びBから選択されるいずれかである。
    　ただし、nは０又は１の整数である。）。
  4. 　前記一般式(1)において、YがA-B又はBである、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 　前記一般式(1)において、Aが配列番号２～８から選択される１種のアミノ酸配列であり、Bが配列番号９で表されるアミノ酸配列である、請求項３に記載のポリペプチド。
  6. 　配列番号１０～１４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載のポリペプチド。
  7. 　請求項３～６のいずれかに記載するポリペプチドの少なくとも１種をコードするポリヌクレオチド。
  8. 　請求項３～６のいずれかに記載のポリペプチドの少なくとも１種を有効成分として含有するか、または当該ポリペプチドとアジュバンドを有効成分として含有する、熱帯熱マラリア原虫感染症の予防及び／又は治療用ワクチン。
  9. 　上記アジュバンドが、水酸化アルミニウムゲル、K3（KタイプCpGアジュバント）、D35（DタイプCpGアジュバント）、及びsHZ（合成ヘモゾインアジュバント）からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載のワクチン。
  10. 　請求項３～６のいずれかに記載のポリペプチドに対する抗体。
  11. 　請求項３～６のいずれかに記載するポリペプチド、又は請求項１０に記載する抗体を含有する熱帯熱マラリア原虫感染症の診断剤。
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