JP2023547758A - 二量体として発現される受容体結合ドメインに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン及び髄膜炎菌Ｂ群細菌の外膜小胞の組成物 - Google Patents
二量体として発現される受容体結合ドメインに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン及び髄膜炎菌Ｂ群細菌の外膜小胞の組成物 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、バイオテクノロジー、特に、ヒトの健康の分野に関する。記載されるワクチン組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する中和免疫応答を誘導する。これらの組成物は、抗原としてのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスの受容体結合タンパク質の一部、免疫増強成分としての髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｂ群細菌の外膜小胞、及びアジュバントを含む。本発明に記載されるワクチン組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染の予防に有用である。
Description
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に、ＣＯＶＩＤ－１９を予防するためのワクチンに関する。具体的には、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を予防するように設計された新規のワクチン組成物を記載する。これらの組成物は、安定な二量体として発現される関連抗原としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの受容体結合ドメイン（「ＲＢＤ」）、並びに髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂ群細菌の外膜小胞（「ＯＭＶ」）及びアジュバントを含む。そのような組合せは、高い抗体力価及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する細胞応答を誘導することができる。
ＣＯＶＩＤ－１９の大流行が近時生じている。ＣＯＶＩＤは、原因不明の肺炎の重篤な症例が最初に報告された２０１９年１２月に、中国の武漢で最初に同定された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされるこの疾患は、ヒトからヒトへの急速な拡散、並びに症候性患者にみられる発熱、鼻漏、喉の痛み及び呼吸困難を含む症状発現を特徴とし、症候性患者はＣＯＶＩＤ－１９症例全体の５０％未満を占めるが、ほとんどの患者において、この疾患は無症候性であり、これはウイルスの拡散における重要な要因であり、その制御の観点から疫学的課題を表している（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｍｅｒｇｅｎｃｉｅｓ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｎｏｖｅｌ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－２０１９／ｓｉｔｕａｔｉｏｎ－ｒｅｐｏｒｔｓ（２０２０年８月１３日参照）におけるＷＨＯ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＶＩＤ－２０１９）ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｒｅｐｏｒｔｓ。
ＭＥＲＳ及びＳＡＲＳとして知られるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に類似する他のコロナウイルスは、過去数十年に既に流行を引き起こしている。ＳＡＲＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とのより大きな相同性を示す。それらの間の主な類似性の１つは、両方のウイルスが、ヒト細胞に侵入するための受容体としてＡＣＥ２タンパク質を使用することである。したがって、ＳＡＲＳ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方において、Ｓ１ウイルスタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）タンパク質との相互作用が決定的なウイルス感染因子である。（Ｗａｌｌｓ Ａら（２０２０）Ｃｅｌｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０２．０５８）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤは、およそ１９５アミノ酸の断片（配列３３３～５２７）であり、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を含有し、ウイルスがＡＣＥ２受容体と相互作用する領域である。抗ＲＢＤ抗体の存在は、ＣＯＶＩＤ－１９回復期患者の血清にみられる中和活性と相関している（Ｄａｉ Ｌ．ら；２０２０ Ｃｅｌｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｉ．ｃｅｌｌ．２０２０．０６．０３５；Ｑｕｉｎｌａｎ Ｂ．Ｄ．ら；２０２０ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０４．１０．０３６４１８；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０５．２１．１０７５６５におけるＺａｎｇ Ｊ．ら２０２０）及びｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０４４６６０８５？ｔｅｒｍ＝ＮＣＴ０ＲＲ６６０８５＆ｄｒａｗ＝２＆ｒａｎｋ＝１、２０２０年８月１７日参照）。したがって、ＲＢＤに対する抗体を誘導するワクチンは、ウイルス中和抗体を誘導する可能性が高い。
ＲＢＤは、アルミニウム及び他の公知のアジュバントと組み合わせて、ＳＡＲＳに対するワクチンにおける特異的抗原として使用されてきた。この戦略は現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの調製に適用され、ウイルス細胞侵入から保護することができるＲＢＤに対する非常に特異的な抗体応答を引き起こす。
今日（２０２０年８月１０日）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する１３９の候補ワクチンが前臨床試験中であり、２８の候補ワクチンが臨床試験中である。これらの候補のうちの少なくとも８つ（臨床試験中の２つを含む）は、特異的抗原としてＲＢＤに基づいたものである。さらに、前臨床試験中の３つのワクチン候補は、ワクチンプラットフォームとしていくつかのＯＭＶを組み込んでいる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍ／ｉｔｅｍ／ｄｒａｆｔ－ｌａｎｄｓｃａｐｅ－ｏｆ－ｃｏｖｉｄ－１９－ｃａｎｄｉｄａｔｅ－ｖａｃｃｉｎｅｓにおけるＤＲＡＦＴ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ－Ａｕｇｕｓｔ １０，２０２０、２０２０年８月１０日参照）。
アルミナに吸収された単量体型のＲＢＤも動物実験で使用されており、抗体依存性増強なしに中和抗体を誘導できることが実証されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０４．１０．０３６４１８におけるＱｕｉｎｌａｎ Ｂ．Ｄ．ら２０２０；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０５．２１．１０７５６５におけるＺａｎｇ Ｊ．ら（２０２０））。ＲＢＤはまた、異なる宿主において産生されている。アスパラギン３３１及び３４３におけるグリコシル化の性質は、発現宿主に依存する（Ｃｈｅｎ Ｗ．Ｈ．ら２０１７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０６：１９６１－１９７０）。最大５０マイクログラムの濃度でＡｌ（ＯＨ）３に吸収されたＲＢＤ単量体は、ヒトのＳＡＲＳ－ＣｏＶに対するワクチンとして推奨されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０４４６６０８５？ｔｅｒｍ＝ＮＣＴ０４４６６０８５＆ｄｒａｗ＝２＆ｒａｎｋ＝１、２０２０年８月１７日参照）。他の製剤は、昆虫細胞及びバキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）で発現される３１９から５４５のアミノ酸残基を含むＲＢＤタンパク質を組み込んでいるが、二量体の産生は言及されていない（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２５９９－８におけるＹａｎｇ Ｊ．ら２０２０：Ｎａｔｕｒｅ）。
本発明に最も近い技術的解決策は、ＣＨＯ細胞中でタンデムとして発現されるＲＢＤ二量体とアジュバントとを組み合わせたＣＯＶＩＤ－１９ワクチン製剤である。このワクチンは、Ａｎｈｕｉ Ｚｈｉｆｅｉ Ｌｏｎｇｃｏｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓとの共同で、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発された。それらの製剤は、１０５の特異的抗体力価を有する強い免疫応答をもたらした（Ｄａｉ Ｌ．ら２０２０；Ｃｅｌｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０２０．０６．０３５）。その候補ワクチンは臨床試験中である。前記発明では、二量体コード配列をクローニングすることによって二量体を得た。すなわち、本明細書で後述する発明とは異なり、ＲＢＤの単量体の二量体化をもたらす単量体アミノ酸配列のクローニングに基づいている。
現在前臨床試験中の他のワクチン候補は、ウイルス断片を担持する精製された遺伝子改変小胞に基づいている。これは、Ｑｕａｄｒａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ及びＢｉＯＭＶｉＳＳｒｌの場合である（ｈｔｔｐｓ：／／ｑｕａｄｒａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｑｕａｄｒａｍ－ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ－ｗｏｒｋｉｎｇ－ｏｎ－ｃｏｖｉｄ－１９－ｖａｃｃｉｎｅ－ｊｏｉｎ－ｗｈｏ－ｅｘｐｅｒｔ－ｇｒｏｕｐｓ、２０２０年８月１７日参照）。Ｉｎｔｒａｖａｃｃなどの他の企業は、ＯＭＶの免疫原性特性をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のプロテインＳと組み合わせている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｏｓｐｉｍｅｄｉｃａ．ｃｏｍ／ｅｐｉｖａｘ－ａｎｄ－ｉｎｔｒａｖａｃｃ－ｔｏ－ｊｏｉｎｔｌｙ－ｄｅｖｅｌｏｐ－ｃｏｖｉｄ－１９－ｖａｃｃｉｎｅ－ｂａｓｅｄ－ｏｎ－ｎｏｖｅｌ－ｃｌｉｃｋ－ｏｎ－ｏｍｖ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／２９４７８２７８３／ ｅｐｉｖａｘ－ａｎｄ－ｉｎｔｒａｖａｃｃ－ｔｏ－ｊｏｉｎｔｌｙ－ｄｅｖｅｌｏｐ－ｃｏｖｉｄ－１９－ｖａｃｃｉｎｅ－ｂａｓｅｄ－ｏｎ－ｎｏｖｅｌ－ｃｌｉｃｋ－ｏｎ－ｏｍｖ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ、２０２０年８月１７日参照）。
髄膜炎菌Ｂ群細菌（meningococcal group B bacteria）のＯＭＶを安定な二量体の形態のＲＢＤと組み合わせることにより、本発明の著者らは、予想外にも、抗体産生動態及び免疫学的応答の強度、産生された抗体の親和性及びそれらの中和能、並びにＴ－ヘルパー１（「Ｔｈ－１」）細胞応答に関して、それらの候補がＲＢＤを使用する報告されたワクチン組成物よりも優れていることを見出した。これらは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックの中で極めて重要な特徴である。本発明に記載のワクチン組成物は、免疫化後７日目に、ＩＦＮγ及びＩｇＧ２ａアイソタイプの誘導を特徴とするＴｈ１パターンへの細胞応答の極性化を伴う抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体応答を誘発する。したがって、Ｔｈ２パターンを誘導するコロナウイルスワクチンについて報告された免疫病理学的効果は、この場合には観察されない。
本発明に先行する技術的解決策及び／又は科学刊行物のいずれも、髄膜炎菌Ｂ群細菌の二量体化ＲＢＤとＯＭＶとの組合せに基づくワクチンを記載していなかった。この組合せは、ＲＢＤに対する誘導された免疫応答が、これらの小胞を含有しないワクチンによって誘導される応答よりも強いという顕著な特性を有する。したがって、本発明の新規性は、ウイルスに対する強い免疫応答を誘導する新規のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物に関する。
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する防御免疫応答を誘導する、抗原としてのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスのＳタンパク質の受容体結合ドメイン（「ＲＢＤ」）の二量体、並びに免疫増強物質としての髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂ群細菌の外膜小胞（「ＯＭＶ」）を含む、ワクチン組成物を提供する。特に、ＲＢＤ抗原は、配列番号１に示されるように、残基３１９～５４１を含む。ＲＢＤの二量体構造の形成を可能にする５３８位に遊離システイン（free cysteine）が存在する。これらのワクチン組成物はまた、とりわけ、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムなどの任意の無機塩を含む群から選択されるアジュバントを含んでもよい。
本発明の別の実施形態は、以下の工程：ｉ）ＯＭＶを、医薬品グレードの水に撹拌することによって可溶化する、及びｉｉ）次いで、ＯＭＶを１０℃未満の温度で超音波処理する、からなるＯＭＶの製造のための手順を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を予防するための上述のワクチン組成物の適用、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する初期のＩｇＧ抗体応答を誘導するための前記ワクチン組成物の適用に関する。ワクチン組成物は、１～３回の筋肉内注射、好ましくは２回の注射で適用される、用量あたり５～５０μｇのＲＢＤ濃度範囲、１０～１００μｇのＯＭＶ濃度範囲及び０．５～２．０ｍｇ／ｍＬのアジュバント濃度範囲を有する。
別の具体的な実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるワクチン組成物の、１～３回の注射又は好ましくは２回の注射で５～５０μｇのＲＢＤ及び１０～１００μｇのＯＭＶ、並びに０．５～２．０ｍｇ／ｍＬの水酸化アルミニウムを含有する好ましくは２回の用量の筋肉内免疫化スキームにおいて、ＴＨ－１パターンに偏るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する細胞応答を誘導するための、使用を扱う。
発明の詳細な説明
ＲＢＤ抗原を得るための方法 ＲＢＤタンパク質をコードする配列を合成し、ｐｃＤＮＡ－３．１発現ベクターにサブクローニングする。ＲＢＤアミノ酸配列は領域３１９～５４１である。標的タンパク質を含有する構築物をＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。
ＲＢＤ抗原を得るための方法 ＲＢＤタンパク質をコードする配列を合成し、ｐｃＤＮＡ－３．１発現ベクターにサブクローニングする。ＲＢＤアミノ酸配列は領域３１９～５４１である。標的タンパク質を含有する構築物をＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。
標的タンパク質は、遠心分離及び濾過によって回収される。次いで、回収した材料をＮｉ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティーカラムにロードし、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムで精製する。適切な方法を使用して、精製タンパク質を分析する（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び／又はＭＳとしての技術を使用した分子サイズ、純度、同一性及びアミノ酸配列）。
空気（すなわち、穏やかな酸化条件）の存在下でのＲＢＤの精製の過程で、ＲＢＤは、両方の単量体において５３８位の２つの遊離システインを連結するジスルフィド架橋を介して二量体化される。この分子間ジスルフィド架橋は安定であり、還元条件下でのみ切断することができる。
ＯＭＶを髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から抽出し、ＣＵ２１８８８Ａ１に従って精製する。
ワクチン組成物
この製剤は、ＲＢＤ二量体、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｂ群細菌の外膜小胞（ＯＭＶ）及びアジュバントとしての水酸化アルミニウムを含有する注射可能な懸濁液である。
この製剤は、ＲＢＤ二量体、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｂ群細菌の外膜小胞（ＯＭＶ）及びアジュバントとしての水酸化アルミニウムを含有する注射可能な懸濁液である。
本明細書で論じられる新たに開発されたワクチンは、関連抗原として、安定な二量体として発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのプロテインＳのＲＢＤを含有する。ＲＢＤアミノ酸配列は領域３１９～５４１である。この領域には９つのシステイン残基があり、そのうちの８つは４つの分子内ジスルフィド架橋を形成して安定ドメイン構造を形成する。天然タンパク質では、システイン５３８（「Ｃ５３８」）は分子内ジスルフィド架橋を形成する。この構築物では、残基５４１において切断された配列の結果として、Ｃ５３８は遊離している。結果として、分子間ジスルフィド架橋が、２つの遊離Ｃ５３８の間に形成される場合があり、対応する単量体よりも免疫原性が高い安定な二量体を生成する。
髄膜炎菌Ｂ細菌（１５０～３００ｎｍ）の外膜小胞（ＯＭＶ）は、本発明の予想される効果のための重要な成分である。溶液中では、ＯＭＶは通常、広範囲の粒径を有するクラスターを形成する。ＯＭＶの調製は重要な方法であり、指定されたサイズ範囲を有する再現性のある免疫原性クラスターを生じさせる（国際公開第２００６／００８５０４号パンフレット）。本発明は、最大１０℃、好ましくは２～８℃の温度で少なくとも１０日間安定なままであり、最大５００ｎｍ、好ましくは１００～３００ｎｍ又は１５０～３００ｎｍの粒径を有するＯＭＶ調製物を供給し、本発明はＯＭＶ製造のための手順を供給する。ＯＭＶを安定化する目的で、本発明は、７０％エタノール中に沈殿したＯＭＶに依存し、これは、５００ｒｐｍ、又は好ましくは１００～３００ｒｐｍで、少なくとも３時間、又は好ましくは１０～２５℃で１～２時間撹拌することによって医薬品グレードの水に可溶化される。この方法の後に、２０～４０ｋＨｚの周波数範囲及び１０℃未満、又は好ましくは２～８℃未満の温度で、３０分間～４時間、又は好ましくは１～３時間、超音波浴中での脱クラスター化（de-clustering）工程が続く。ＯＭＶ脱クラスター化の速度は、調製物中の粒子の平均サイズ及びサイズ分布を決定する動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して測定される。
安定な二量体として発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質ＲＢＤ及びＯＭＶの２つの成分を、１８℃～２５℃の周囲温度で３０分間、又は好ましくは１０～３０分間撹拌することによって一緒にブレンドする。このＲＢＤ－ＯＭＶ混合物を、５００ｒｐｍ未満、好ましくは１００～３００ｒｐｍで３０分間～１時間撹拌することによって、水酸化アルミニウムゲル中に７０～１００％で吸着させる。ワクチンは、０．５～１．０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液を含むがこれに限定されないｐＨ調節医薬賦形剤、５０～１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含むがこれに限定されない等張溶液、及びチオメルサールを含むがこれに限定されない防腐剤を含有する。本発明によって包含されるワクチンは、現在のパンデミックの状況において特に重要である３つの特徴、すなわち、抗原産生の動態及び強度、抗体親和性及びウイルス中和能、並びにＴＨ－１細胞応答において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのプロテインＳ ＲＢＤを抗原として使用する報告されたワクチンよりも優れている。
投与経路
ＲＢＤ二量体及び髄膜炎菌ＢのＯＭＶに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、２１～２８日間隔で投与される２回の注射の処置において、５～５０μｇ、好ましくは１０～２０μｇのＲＢＤ用量及び２０～５０μｇのＯＭＶ用量で筋肉内又は皮下注射によって投与される。これらのワクチンは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムを含むがこれらに限定されない無機塩を、５００～２５００μｇ、好ましくは５００～１０００μｇの濃度で含有してもよい。
ＲＢＤ二量体及び髄膜炎菌ＢのＯＭＶに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、２１～２８日間隔で投与される２回の注射の処置において、５～５０μｇ、好ましくは１０～２０μｇのＲＢＤ用量及び２０～５０μｇのＯＭＶ用量で筋肉内又は皮下注射によって投与される。これらのワクチンは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムを含むがこれらに限定されない無機塩を、５００～２５００μｇ、好ましくは５００～１０００μｇの濃度で含有してもよい。
これらの製剤は、２１～２８日ごとに、１～３回の用量のスケジュールに従って投与される。
例１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの製剤
抗原としての、図１Ａに示す配列を有する、１０～２０μｇの濃度のＲＢＤ二量体と、１５０～３００ｎｍの粒子を有し、２０～４０μｇの濃度の脱クラスター化ＯＭＶと、５００μｇの濃度のアジュバントとしての水酸化アルミニウムとを含有する２つの製剤を得た。
抗原としての、図１Ａに示す配列を有する、１０～２０μｇの濃度のＲＢＤ二量体と、１５０～３００ｎｍの粒子を有し、２０～４０μｇの濃度の脱クラスター化ＯＭＶと、５００μｇの濃度のアジュバントとしての水酸化アルミニウムとを含有する２つの製剤を得た。
ＯＭＶをエタノール中で沈殿させ、ＣＵ２１８８８Ａ１に記載されているように抽出する。ＯＭＶ沈殿物の塊を秤量し、水中でホモジナイズし、周囲温度で（約１時間）機械的撹拌によって完全に溶解させる。ＯＭＶが溶解したら、溶液に粒子及び／又は濁りがないことを確認し、続いて超音波処理方法中に≦１０℃で超音波浴中で脱クラスター化方法を行う。脱クラスター化の終わりに、サンプルを採取してＤＬＳによりＯＭＶ粒径を決定する（図１Ｂ）。サイズが１５０～３００ｎｍの粒子は、この方法のための対照として機能する。脱クラスター化されたＯＭＶを、２°～８℃で保存する。
ＲＢＤと脱クラスター化ＯＭＶ（ＯＭＶ－ＲＢＤ）との混合物を、穏やかな撹拌（１００～３００ｒｐｍ）によって１５分間ホモジナイズする。
最後に、ＯＭＶ－ＲＢＤを水酸化アルミニウムと混合し、上記パラメータを０．５～１時間維持しながら製剤を濾過する。製剤を２°～８℃で保存する。
優良医薬品製造基準（図１Ｃ）に従って製造されたＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３（図１Ｃ）中のＲＢＤ二量体の製剤は、プラセボ（ワクチン抗原なし）で処置した動物で得られるよりも強力に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体応答を誘導する。
例２ Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤とは異なり、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて初期の抗体応答を誘導する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、以下の製剤：
－第１群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第２群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第３群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶ、及び
－第４群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３
のうちの１つ０．１ｍＬで時間０において筋肉内免疫化した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、以下の製剤：
－第１群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第２群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第３群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶ、及び
－第４群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３
のうちの１つ０．１ｍＬで時間０において筋肉内免疫化した。
第３群及び第４群は陰性対照として機能する。
免疫化後、時間０及び７日目に採血する。免疫化された動物からの血清を間接ＥＬＩＳＡで試験して、抗ＲＢＤ抗体力価を決定する。Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）高タンパク質結合能９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、炭酸－重炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中３μｇ／ｍＬの濃度の５０μＬのＲＢＤでコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄液を用いて３回洗浄した。非コーティング部位を、１００μＬの５％脱脂乳ブロッキング溶液を使用して３７℃で１時間ブロッキングし、続いて上記のように別の洗浄工程を行った。リン酸緩衝液（ｐＨ７．２、１％ＢＳＡ）中の血清連続希釈物を、一般に１／５０及び５０μＬ／ウェルのベースラインから（１：３）で添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、再び洗浄した。次に、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧの希釈液５０μＬを、調節リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１％ＢＳＡ（１：５０００）中に添加し、１時間インキュベートした。最後に１回洗浄した後、ペルオキシダーゼ酵素基質溶液（５０μＬ／ウェル）を適用した。次いで、これを暗所で２０分間インキュベートし、５０μＬ／ウェルの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ ＥＬＩＳＡリーダ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＩｇＧ力価は、１：５０希釈で免疫前血清（Ｔ０）の平均吸光度の値の４倍に達する各個々の動物血清の血清希釈率の逆数として定義した。結果の分析及び提示のために、各個々の動物の力価のＬｏｇ１０を計算した。応答動物を定義するために、１．７０より大きいｌｏｇ力価をカットオフ値とし、これは１：５０より大きい血清希釈率に相当した。力価がアッセイ検出限界よりも低い動物について、２５に等しい力価値及び１．４のｌｏｇ１０を設定した。
図２は、ＯＭＶ／Ａｌ／（ＯＨ）３中にＲＢＤ二量体を含有する第１群の製剤、及びＡｌ／（ＯＨ）３中にＲＢＤ二量体を含有する第２群の製剤によって誘導された初期のＩｇＧ抗体応答を示す。免疫化の７日後、誘導されたＲＢＤ抗体応答は、Ａｌ（ＯＨ）３中にＲＢＤ二量体を含有する製剤で免疫化されたマウスと比較して、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中にＲＢＤ二量体を含有する製剤で免疫化されたマウス１０匹中９匹で有意に高かった（ｐ≦０，０５、一元配置ＡＮＯＶＡ検定及びテューキーの多重比較検定）。この違いは、第１群の製剤中に存在するＯＭＶの免疫増強能力に起因する。
例３ ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ単量体の製剤とは異なり、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて初期の抗体応答を誘導する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、以下の製剤：
－第１群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第２群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第３群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした１０μｇのＲＢＤ単量体、
－第４群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された１０μｇのＲＢＤ単量体、
－第５群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶ、及び
－第６群８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３
のうちの１つ０．１ｍＬで時間０において筋肉内免疫化した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、以下の製剤：
－第１群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第２群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第３群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした１０μｇのＲＢＤ単量体、
－第４群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された１０μｇのＲＢＤ単量体、
－第５群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶ、及び
－第６群８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３
のうちの１つ０．１ｍＬで時間０において筋肉内免疫化した。
第５群及び第６群は陰性対照として機能する。
採血及び血清評価の手順は、例２と同様である。
図３は、同じ混合物中にＲＢＤ単量体を含有する製剤と比較して、ＯＭＶ／Ａｌ／（ＯＨ）３中にＲＢＤ二量体を含有する製剤によって誘導された初期のＩｇＧ抗体応答を示す。免疫化の７日後、ＲＢＤ抗体応答は、同じ混合物中にＲＢＤ単量体を含有する第３群の製剤と比較して、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中にＲＢＤ二量体を含有する第１群の製剤の投与を受けたマウスにおいて有意に高い（ｐ≦０，０５、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定）。この特性は、単量体に対する二量体のより強い免疫原性に起因する。
例３ ２回の用量投与後、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３に製剤化されたＲＢＤ二量体は、マウスにおいて高度に免疫原性である。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２回のワクチン用量、すなわち、時間０及び１４日後において、以下の製剤：
－第１群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された２０μgの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした３μｇのＲＢＤ二量体、
－第２群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された２０μgの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第３群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された３μｇのＲＢＤ二量体、
－第４群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第５群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶ、
－第６群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３
のうちの１つ０．１ｍＬで筋肉内免疫化した。
－第１群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された２０μgの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした３μｇのＲＢＤ二量体、
－第２群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３に共吸収された２０μgの非クラスター化ＯＭＶとブレンドした１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第３群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された３μｇのＲＢＤ二量体、
－第４群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された１０μｇのＲＢＤ二量体、
－第５群：８００μgのＡｌ（ＯＨ）３に吸収された２０μｇの非クラスター化ＯＭＶ、
－第６群：８００μｇのＡｌ（ＯＨ）３
のうちの１つ０．１ｍＬで筋肉内免疫化した。
第５群及び第６群は陰性対照である。
０、７、１４、２１及び２８日目に血清用に血液を採取する。換言すれば、免疫前血清、並びに各注射の７及び１４日後。この免疫化スケジュールの目的は、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３及びＡｌ／（ＯＨ）３を含む製剤中の３及び１０μｇのＲＢＤ二量体の用量を比較すること、並びにこれらの製剤によって誘導される抗体動態を評価すること、の２通りに分けられる。
抗ＲＢＤ抗体を、例２に記載されているようにＥＬＩＳＡで評価した。
図４に示すように、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中にＲＢＤ二量体を含有する製剤は、２回目の用量投与後に急激に増加する用量依存的動態を引き起こす。しかし、ワクチンの２回目の用量投与後、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤とＡｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤との間に有意差は観察されない。２１及び２８日目の抗体力価は、両方の製剤について高く、１０４～１０６である。
例５ ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤及びＡｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤によって誘導された抗体の親和性
誘導された抗体の親和性を評価するために、カオトロピック剤であるチオシアン酸アンモニウム（ＮＨ４ＳＣＮ）の添加によって抗原抗体反応を妨害することによって、それらのアビディティー（Avidity）を決定した。プレートを炭酸－重炭酸塩コーティング緩衝液ｐＨ９．６中の５０μｇのＲＢＤ（３μｇ／ｍＬ）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄液を用いて３回洗浄した。非コーティング部位を１００μＬの５％脱脂乳ブロッキング溶液で３７℃で１時間ブロッキングした。血清（ＥＬＩＳＡでおよそ１の吸光度値を与える希釈で）を添加した。その部位を３７℃で１時間インキュベートした後、２Ｍ ＮＨ４ＳＣＮを周囲温度で１５分間添加した。例２に記載したように手順を続けた。
誘導された抗体の親和性を評価するために、カオトロピック剤であるチオシアン酸アンモニウム（ＮＨ４ＳＣＮ）の添加によって抗原抗体反応を妨害することによって、それらのアビディティー（Avidity）を決定した。プレートを炭酸－重炭酸塩コーティング緩衝液ｐＨ９．６中の５０μｇのＲＢＤ（３μｇ／ｍＬ）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄液を用いて３回洗浄した。非コーティング部位を１００μＬの５％脱脂乳ブロッキング溶液で３７℃で１時間ブロッキングした。血清（ＥＬＩＳＡでおよそ１の吸光度値を与える希釈で）を添加した。その部位を３７℃で１時間インキュベートした後、２Ｍ ＮＨ４ＳＣＮを周囲温度で１５分間添加した。例２に記載したように手順を続けた。
アビディティーは、カオトロピック剤による処理後に抗原に結合したままであるＩｇＧ抗体の割合を示す。このアビディティーは、以下の式：（ＮＨ４ＳＣＮありでのＩｇＧ力価／ＮＨ４ＳＣＮなしでのＩｇＧ力価）＊１００を使用して計算される。５０％を超えるアビディティーを有する抗体は、良好なアビディティーを有すると考えられる。アビディティーの割合は、応答動物（力価＞１．７０）についてのみ決定され、ＥＬＩＳＡで決定される。
図５に示すように、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤの製剤によって誘導された抗体は、Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体によって誘導された抗体よりも高い親和性（ｐ≦０．０５）を有し、本発明によって包含される製剤の誘導された免疫応答の優れた品質を示している。
例６ ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３に製剤化されたＲＢＤ二量体によって誘導された抗ＲＢＤ抗体の機能的活性
ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用は、誘導された抗体によって阻害される
ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用の阻害を決定するために、例２に記載のように免疫化したマウスから２８日目に採取した血清をＥＬＩＳＡに供した。
ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用は、誘導された抗体によって阻害される
ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用の阻害を決定するために、例２に記載のように免疫化したマウスから２８日目に採取した血清をＥＬＩＳＡに供した。
ＥＬＩＳＡプレートをマウスＡＣＥ－Ｆｃ（炭酸－重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを洗浄溶解液を用いて３回洗浄した。非コーティング部位を、２００μＬの２％脱脂乳ブロッキング溶液を使用して３７℃で１時間ブロッキングした。ヒトＲＢＤ－Ｆｃを調製した（４０ｎｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２、２％乳含有）。免疫前マウス及び免疫化マウスからの血清を１：２５～１：４００の範囲の希釈で調製した。陰性対照として、無関係のタンパク質、ヒトＰＤＬ１－Ｆ抗体を使用した。
希釈血清をヒトＲＢＤ－Ｆｃと１：１の比で３７℃で１時間プレインキュベートし、プレートに適用し（５０μＬ／ウェル）、３７℃で１．３０時間インキュベートし、１回洗浄した。
別の洗浄工程の後、２％乳（１：１０００）を含有するリン酸緩衝液ｐＨ７．２中のアルカリホスファターゼにコンジュゲートした５０μＬのヒトＩｇＧ抗体及びプレートを３７℃で１時間インキュベートした。最後の１回の洗浄工程の後、ジエタノールアミン緩衝液中のＰＮＰＰ（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した（５０μＬ／ウェル）。プレートを暗所で２０分間インキュベートし、ＮａＯＨ ３Ｍ（５０μＬ／ウェル）を添加することによって反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダを使用して４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。阻害を以下の式：（１－Ａｂｓ４０５ｎｍヒトＲＢＤ Ｆｃ＋マウス血清／Ａｂｓ４０５ｎｍヒトＲＢＤ Ｆｃ）＊１００を使用して計算した。図６Ａは、本発明に記載の製剤で免疫化したマウスから抽出した血清のＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用を阻害する能力を示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して誘発された抗ＲＢＤ抗体の中和能
例２に記載のスケジュールに従って免疫化したマウスから得た血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和能を、ニュートラルレッドを使用した比色アッセイで評価した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、ＭＥＭ＋２％ウシ胎児血清、２５ｍＭ／ｍＬ Ｌ－グルタミン、２μｇ／ｍＬ重炭酸塩、８０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ中のプレートで培養した。上清を除去し、０．０２％ニュートラルレッドを含有する１００μＬのＰＢＳｐＨ－７．２を各ウェルに添加した。プレートを周囲温度で１時間インキュベートした。ニュートラルレッド溶液を廃棄した。細胞単層をＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。各ウェルに１００μＬの溶解液（無水エタノール５０部、超純水４９部及び氷酢酸１部）を添加した。プレートを周囲温度で１５分間インキュベートし、吸光度を５４０ｎｍで測定した。カットオフ値を超える光学密度値を有する血清の最高希釈を中和力価とみなした。カットオフ値は、細胞コーティング対照ウェルの平均光学密度の半分の値として計算した。ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤によって誘導された血清中和能をウイルス中和アッセイで実証した。図６Ｂに示すように、免疫化後２８日目に平均で１：６４０の中和力価に達する。
例２に記載のスケジュールに従って免疫化したマウスから得た血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和能を、ニュートラルレッドを使用した比色アッセイで評価した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、ＭＥＭ＋２％ウシ胎児血清、２５ｍＭ／ｍＬ Ｌ－グルタミン、２μｇ／ｍＬ重炭酸塩、８０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ中のプレートで培養した。上清を除去し、０．０２％ニュートラルレッドを含有する１００μＬのＰＢＳｐＨ－７．２を各ウェルに添加した。プレートを周囲温度で１時間インキュベートした。ニュートラルレッド溶液を廃棄した。細胞単層をＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。各ウェルに１００μＬの溶解液（無水エタノール５０部、超純水４９部及び氷酢酸１部）を添加した。プレートを周囲温度で１５分間インキュベートし、吸光度を５４０ｎｍで測定した。カットオフ値を超える光学密度値を有する血清の最高希釈を中和力価とみなした。カットオフ値は、細胞コーティング対照ウェルの平均光学密度の半分の値として計算した。ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤によって誘導された血清中和能をウイルス中和アッセイで実証した。図６Ｂに示すように、免疫化後２８日目に平均で１：６４０の中和力価に達する。
例７ 誘導されたＩＦＮγ及びＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比によって決定される細胞性免疫応答のＴＨ－１パターン
例２に記載のスケジュールに従って以前に接種したマウスの細胞性免疫応答を、２８日目に抽出した血清で評価した。ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤又はＡｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を単離し、ＲＢＤ（５μｇ／ｍＬ）の存在下でインビボで刺激した。細胞濃度は１×１０６細胞／ｍＬであった。刺激の７２時間後に、定量的ＥＬＩＳＡを使用して培養上清中のＩＬ－４及びＩＦＮγを決定した。
例２に記載のスケジュールに従って以前に接種したマウスの細胞性免疫応答を、２８日目に抽出した血清で評価した。ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤又はＡｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の製剤で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を単離し、ＲＢＤ（５μｇ／ｍＬ）の存在下でインビボで刺激した。細胞濃度は１×１０６細胞／ｍＬであった。刺激の７２時間後に、定量的ＥＬＩＳＡを使用して培養上清中のＩＬ－４及びＩＦＮγを決定した。
図７Ａに示すように、ＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体は、Ａｌ／（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体よりも高レベルのＩＦＮγを誘導する。Ｔ細胞応答はＴＨ－１パターンに偏っていた。ＩｇＧ応答 ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、Ａｌ／（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体よりもＯＭＶ／Ａｌ（ＯＨ）３中のＲＢＤ二量体の方が高く、ＴＨ－１パターンを支持する応答バイアスを証明している。
配列表１ ＜２２３＞ＤＮＡ組換え技術による
Claims (13)
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫応答を誘導するワクチン組成物であって、
抗原としての、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質の受容体結合ドメインの一部、
免疫増強成分としての、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂ群細菌の外膜小胞（ＯＭＶ）、及び
アジュバント
を特徴とする、前記ワクチン組成物。 - 抗原が配列番号１の配列を有する、請求項１に記載のワクチン組成物。
- ＲＢＤが二量体の形態である、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
- 二量体が、２つの遊離システイン（Ｃ５３８）間のジスルフィド架橋を介して形成されている、請求項３に記載のワクチン組成物。
- アジュバントが、以下の群から選択される、請求項１に記載のワクチン組成物：
－水酸化アルミニウム、
－リン酸アルミニウム、及び
－リン酸カルシウム。 - 免疫増強成分として使用される髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂ群の外膜小胞（ＯＭＶ）が、１５０～３００ｎｍの範囲の粒径を有する、請求項１に記載のワクチン組成物。
- ＲＢＤの用量範囲が５～５０μｇである、請求項１に記載のワクチン組成物。
- 薬学的に適切な賦形剤をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
- 以下の段階を含む、請求項６に記載のＯＭＶを得るための方法：
ａ）ＯＭＶを、医薬品グレードの水に撹拌により可溶化すること、及び
ｂ）ＯＭＶを１０℃未満の温度で超音波処理すること。 - 請求項１～８のいずれかに記載のワクチン組成物の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を予防するための使用。
- 請求項１～８のいずれかに記載のワクチン組成物の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を予防するための使用であって、ウイルスに対する、誘発された特異的抗体が、免疫化の７日後に必要とされる、前記使用。
- 請求項１～８のいずれかに記載のワクチン組成物の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を予防するための使用であって、２回の用量の投与後に、ウイルスに対する中和抗体応答及びＴｈ－１パターン細胞応答が必要とされる、前記使用。
- 請求項１～８のいずれかに記載のワクチン組成物の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する抗体応答を誘導するための使用であって、筋肉内経路による、５～５０μｇの用量範囲のＲＢＤ及び１０～１００μｇの用量範囲の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＭＶの、１～３回の用量の免疫化スケジュールにおける、前記使用。
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