WO2010074388A1 - 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

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WO2010074388A1
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bacteriophage
φcj2
gallinarum
seq
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PCT/KR2009/005061
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강인혜
박민태
조영욱
신수안
최향
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Definitions

  • the present invention relates to a novel bacteriophage, in particular Salmonella typhimurium ( Salmonella typhimurium ), Salmonella gallinarum ( Salmonella gallinarum ) or Salmonella pullorum ( Salmonella pullorum ) that can specifically kill the bacteriophage, Composition for the prevention or treatment of infectious diseases such as Salmonella and Salmonella food poisoning caused by Salmonella typhimurium comprising the bacteriophage as an active ingredient, Poultry typhoid caused by Salmonella gallinarum, Chubaekri caused by Salmonella florum, It relates to livestock feed, drinking water, cleaning agents and disinfectants comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • Salmonella typhimurium Salmonella typhimurium
  • Salmonella gallinarum Salmonella gallinarum
  • Salmonella pullorum Salmonella pullorum
  • Salmonella is a Gram-negative, common anaerobic bacterium 1 (conditional anaerobic bacterium) with no enterobacteria, which is a bacilli that do not form follicles, and usually has motility due to pectoral flagella.
  • the gene base constituents of Salmonella are 50-52% of GC content, similar to Escherichia coli and Shigella .
  • the genus Salmonella is a pathogenic microorganism that infects not only humans but also various livestock and causes various diseases.
  • Salmonella enterica (Salmonella enterica ) is distinguished according to the serological distinction of Gallinarum , Pullorum , Typhimurium , Enteritidis , Typhi , Cholera.
  • Galinarum and Florum which are peculiar to poultry, Typhi, peculiar to humans, Salmonella cholerasus and derby specific to pigs, and Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium, which are common serotypes of disease-causing animals. It can cause huge damage to farmers and consumers.
  • FT fowl typhoid
  • Salmonella Gallinarum SG
  • SG Salmonella Gallinarum
  • the frequency of occurrence is high in Europe, South America, Africa, and Southeast Asia, and the damage is increasing. In Korea, it has been spread nationwide mainly on brown laying hen farms since 1992.
  • Kim Ae-ran et al. 2003 Chubaek-ri, Korea. Poultry Typhoid Infection, Korean J Vet Res (2006) 46 (4): 347-353).
  • Chubaekri is also a disease caused by Salmonella and is caused by Salmonella Pullorum (hereinafter, SP).
  • SP Salmonella Pullorum
  • Chubaekri occurs regardless of age and season, it is characterized by the highest sensitivity in the early spring season. In the past century, the disease has been severe and severe in Korea and around the world. (Kwon, Yong-kuk, 2000. Analysis of avian disease search results in 2000. Information from National Veterinary Research and Quarantine Service, March 2001; Kim, Ae-ran, et al., 2003, Chubaekri-gaptypus Infections in Korean Origin and Breeding, Korean J Vet Res (2006) 46 (4): 347-353).
  • Salmonella Typhimurium (named ST), unlike SG and SP, is a common infectious disease that causes disease without host specificity (Zoobises Report; Unitied Kingdom 2003).
  • Salmonellosis is an acute or chronic gastrointestinal infectious disease caused by salmonella in livestock, mainly fever, enteritis and sepsis, and can also cause pneumonia, degenerative, arthritis, lactic acid and mastitis. It occurs worldwide and most commonly occurs seasonally, mainly in summer (T.R. Callaway et al. Gastrointestinal microbial ecology and the sagety of our food supply as related to Salmonella. J Anim Sci 2008.86: E163-E172).
  • Cows are usually characterized by anorexia, fever, yellow diarrhea or mucosal stool, but they die within days of acute infection of the calf, and during pregnancy, they may be infected by calving through the bloodstream and die from sepsis (www. livestock.co.kr). Pigs are divided into acute sepsis, acute enteritis and chronic latent type. Acute sepsis develops in piglets 2-4 months of age and most die within 2-4 days of onset. Acute enteritis develops during the finishing season, accompanied by diarrhea, high fever, pneumonia, and neurological symptoms. Chronic enteritis is accompanied by persistent diarrhea (www.livestock.co.kr).
  • ST can also cause salmonella food poisoning by infecting people through livestock and products as well as causing disease in livestock.
  • Infected livestock ie, meat, poultry, eggs and their by-products
  • Salmonella food poisoning in humans usually causes headache, fever, severe abdominal pain, diarrhea, nausea and vomiting. Symptoms often appear 6-72 hours after infection and symptoms last 4-7 days, sometimes even longer (Infectious Disease Information Sheet, NSW + HEALTH. 2008.01.14.).
  • Salmonella makes up 16% of the food-borne illnesses that occurred between 2005 and 2008, with ST accounting for 18%.
  • 5% of human salmonella food poisonings between 1973 and 1984 were mediated by chickens, 19% by beef, 7% by pork, 6% by dairy products, and 9% by turkey. I have reported it.
  • Microbiological studies of broiler chickens from 1974 to 1984 showed that salmonella accounted for more than 35% .
  • the presence of salmonella in chicken carcasses was 50.6%
  • turkey was 68.8%, 60% of the goose, 11.6% of pork, and 1.5% of beef.
  • 2007 statistics show that Salmonella was found in 5.5% and 1.1% of live poultry and pork.
  • Bacteriophage is a single or double-stranded DNA or RNA that consists of a nucleic acid as a genetic material, and the nucleic acid is a simple structure in which the protein envelope is wrapped, with the tail on the icosahedron head, the tail on the icosahedron head, And it is divided into three basic structure of filament type. Bacteriophages are classified according to their morphological structure and genetic material.
  • Bacteriophage which has a double linear DNA and is composed of icosahedral heads, has a contractile tail, Myoviridae, Siphoviridae, and a short tail. It is classified as Podoviridae.
  • bacteriophages without tails in icosahedral heads whose genetic material is RNA or DNA are classified according to the shape of the head, the composition of the head, and the presence or absence of skin.
  • filamentary bacteriophages with DNA as a genetic material are classified according to size, shape, envelope and filament composition (HWAckermann.Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146: 843-857) Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application; CRC press.
  • bacteriophages When infecting bacteria, bacteriophages adhere to the surface of bacteria, inject their genetic material into cells, and become lytic or lysogenic. If lytic, the bacteriophages break down or lyse the cells by making their own structures using cellular machinery and then releasing new bacteriophage particles. If lysogenic, its nucleic acid is incorporated into the chromosome of a bacterial host cell and replicates with the cell without destroying the bacterium, but under certain conditions it is converted to lytic (Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application.CRC press).
  • AGP antimicrobial growth promoter
  • the present inventors can selectively kill Salmonella causing the major diseases of livestock.
  • New bacteriophages were isolated from nature and their morphological, biochemical and genetic properties were identified. As a result, the bacteriophages can kill both Salmonella typhimurium (ST), Salmonella gallinarum (SG) and Salmonella pullorum (SP) without affecting their fungi. In addition, it was confirmed that the acid resistance, heat resistance and drying resistance is excellent.
  • composition which can be used for the purpose of preventing or treating livestock salmonella and livestock-derived salmonella food poisoning caused by Salmonella typhimurium, and diseases caused by Salmonella gallinarum or Salmonella florum in poultry, in particular poultry fever or Chubaekri, and
  • various products capable of controlling Salmonella namely, animal feed additives, animal drinking water, barn disinfectants, and meat cleaners, have been found to be applicable, and have completed the present invention.
  • One object of the present invention is to provide novel bacteriophages having killing ability against Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum or Salmonella florum.
  • Another object of the present invention to provide a composition for the prevention or treatment of Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious diseases comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • a prophylactic or therapeutic composition to be used as an antibiotic.
  • Still another object of the present invention is to provide livestock feed and drinking water containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a disinfectant and cleaning agent including the bacteriophage as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating Salmonella or livestock-derived Salmonella food poisoning caused by Salmonella typhimurium using the composition comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • It also provides a method for preventing or treating Salmonella gallinarum and Salmonella florum infectious diseases, such as poultry fever or Chubaekri.
  • the novel bacteriophages of the present invention have specific killing ability to Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, and Salmonella florum, and have excellent advantages of acid resistance, heat resistance and dry resistance. Therefore, the bacteriophage may be used for the prevention or treatment of Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious diseases such as Salmonella, Salmonella food poisoning, Poultry fever or Chubaekri, as well as Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum and Salmonella florina It can be used to control rum.
  • 1 is an electron micrograph of ⁇ CJ2. It belongs to the morphotype sipoviriridae, which consists of an isometric capsid and a long non-contractile tail.
  • Figure 2 is the SDS-PAGE results of isolated bacteriophage ⁇ CJ2.
  • the protein pattern of the bacteriophage was observed as a major protein of about 40 kDa and in addition to about 65 kDa, 17 kDa and 15 kDa. Invitrogen's See-blue plus 2 prestained-standard was used as a marker.
  • Figure 3 is the result of the PFGE of the isolated bacteriophage ⁇ CJ2.
  • the total genome of ⁇ CJ2 is about 43 kbp.
  • Bio-rad's 5 kbp DNA size standard was used as a size marker.
  • Figure 4 shows the PCR results using each primer set of genomic DNA of ⁇ CJ2.
  • A, B, and C lanes all have a PCR output of about 1 kbp.
  • 5 is an acid resistance test result of the bacteriophage ⁇ CJ2. Survival bacteriophage numbers at pH 2.1, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 6.9, 7.4, 8.0 and 9.0. Compared to the control, up to pH 2.5, the bacteriophage ⁇ CJ2 activity is not lost, but at pH 2.1 the activity is completely lost.
  • Figure 8 is the weight change of the rat single dose oral toxicity test bacteriophage ⁇ CJ2.
  • no significant weight change was observed even after 14 days.
  • Figure 9 is the weight change of the rat single dose intravenous toxicity test of bacteriophage ⁇ CJ2.
  • Male control group administered 20 mM Tris-HCl and 2 mM MgCl 2 mix solution
  • Male experimental group administered ⁇ CJ2 at a concentration of 1 ⁇ 10 12 pfu, ⁇
  • Female control group administered 20 mM Tris-HCl and 2 mM MgCl 2 mix solution
  • no significant weight change was observed even after 14 days.
  • the present invention relates to novel bacteriophages having specific killing ability to Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum or Salmonella florum.
  • the bacteriophage of the present invention belongs to a morphotype Siphoviridae consisting of an isometric capsid and a long non-contractile tail.
  • kbp the protein having a size of 40 kDa is characterized as having a major structural protein.
  • the bacteriophage of the present invention selectively infect Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, and Salmonella florum among Salmonella, and other species have species specificity that does not.
  • the bacteriophage of the present invention has a total genome size of 43 kbp and may include one or more nucleic acid molecules selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 as part of the entire genome, preferably SEQ ID NO: Nucleic acid molecules described as 1-3 are included as part of the entire genome.
  • PCR product of about 1 kbp a primer set genetically selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4 and 5, SEQ ID NOs: 6 and 7, and SEQ ID NOs: 8 and 9, a PCR product of about 1 kbp, respectively Has Preferably, when PCR is performed with all of the primer sets, each has a PCR output of about 1 kbp.
  • nucleic acid molecule is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusive, and the nucleotides that are the basic structural units in nucleic acid molecules are naturally occurring nucleotides, as well as analogs in which sugar or base sites are modified ( analogue).
  • the bacteriophage of the present invention is a genetically major structural protein having a 40 kDa protein.
  • the bacteriophage of the present invention has acid and heat resistance biochemical characteristics, and has acid resistance stably surviving in a wide pH range of pH 2.5 to pH 9.0, and even at a temperature ranging from 37 ° C. to 60 ° C., that is, at a high temperature. It has heat resistance to survive stably. In addition, it has a drying resistance that stably survives even after drying at high temperature.
  • the bacteriophage of the present invention can be applied to a variety of temperature and pH range in the use for the prevention and treatment of diseases that can be caused to livestock diseases derived from ST, SG and SP or people derived from livestock. do.
  • the present inventors sampled from sewage near the slaughterhouse, and identified the bacteriophage of the present invention having the specific killing ability for ST, SG and SP and the same characteristics as above, and named it Bacteriophage ⁇ CJ2, 2008 It was deposited on the 17th of March at the Korean Culture Center of Microorganisms (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul) under KCCM10976P.
  • a sample was collected from sewage near the slaughterhouse to isolate bacteriophages that lyse the host cell ST from the sample, and confirmed that they could specifically lyse SG and SP (Table One).
  • these bacteriophages ( ⁇ CJ2) were observed morphologically through an electron microscope, and it was confirmed that they belonged to the morphotype Siphoviridae (FIG. 1).
  • primer sets specific for ⁇ CJ2 specifically, SEQ ID NOs 4 and 5, SEQ ID NOs 6 and 7 and SEQ ID NOs 8 and 9
  • outputs of about 1 kbp which are PCR outputs of a specific size, were obtained (FIG. 4).
  • ⁇ CJ2 was investigated for stability at various pH ranges and temperatures, and it not only stably survives a wide range of pH 2.5 to 9.0 (Fig. 5) and 37 ° to 60 ° C (Fig. 6), but also 60 ° C at high temperature drying. It was confirmed that the stability was maintained even at 120 minutes (Fig. 7). This means that the bacteriophage ⁇ CJ2 of the present invention can be easily applied to various products capable of controlling Salmonella.
  • the present invention is for the prevention or treatment of infectious diseases caused by one or more Salmonella bacteria selected from the group consisting of Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum and Salmonella florum comprising the bacteriophage as an active ingredient It relates to a composition.
  • the therapeutic composition may comprise an antibiotic.
  • the bacteriophage of the present invention has antibacterial activity that can specifically kill Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, and Salmonella florum, and thus can be used for the purpose of preventing or treating diseases caused by these bacteria.
  • diseases caused by Salmonella typhimurium include, but are not limited to, diseases caused by Salmonella or Salmonella food poisoning, Salmonella gallinarum, and diseases caused by poultice, Salmonella florum, but not limited thereto.
  • the term "salmonellosis” refers to symptoms accompanying fever headache, diarrhea, vomiting, etc. caused by Salmonella infection. That is, generically refers to diseases caused by bacteria in Salmonella bacteria, Salmonellosis is classified into sepsis type and typhoid-like symptoms such as acute gastroenteritis, enteritis, food poisoning, acute bacteremia.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of the disease by administration of the composition
  • treatment means that the symptoms of the disease are improved or the inhibition or alleviation of the disease by administration of the composition and It means every action that is beneficially changed.
  • composition of the present invention comprises 5 ⁇ 10 2 to 5 ⁇ 10 12 pfu / ml of ⁇ CJ2, preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 pfu / ml of ⁇ CJ2.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated with the carrier to provide food, pharmaceutical and feed additives.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not irritate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated as liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • the prophylactic or therapeutic composition of the present invention can be used as a method of applying or spraying on a diseased site, and can also be administered through oral or parenteral administration.
  • parenteral administration intravenous administration, intraperitoneal administration Administration may be by intramuscular administration, subcutaneous administration or topical administration.
  • Suitable applications, sprays, and dosages of the compositions of the present invention may include formulation methods, modes of administration, age, weight, sex, extent of disease symptoms, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response of the subject and patient. Depending on factors such as attenuation, usually a skilled doctor or veterinarian can readily determine and prescribe a dosage that is effective for the desired treatment.
  • Oral dosage forms containing the composition of the present invention as an active ingredient include, for example, tablets, troches, lozenges, water-soluble or oily suspensions, preparation powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, syrups or elixirs. can do.
  • lactose For formulation into tablets and capsules, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, binders such as cellulose or gelatin, excipients such as dicalcium phosphate, disintegrating agents such as corn starch or sweet potato starch, stearic acid masne It may include lubricating oils such as calcium, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax, and in the case of capsule formulations, it may further contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
  • lubricating oils such as calcium, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax
  • Formulations for parenteral administration comprising the composition of the present invention as an active ingredient, for injection, such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, a suppository injection method or aerosol for spraying by inhalation through the respiratory system It can be formulated as.
  • injection such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, a suppository injection method or aerosol for spraying by inhalation through the respiratory system It can be formulated as.
  • the compositions of the present invention may be mixed in water with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions, which may be formulated for unit administration of ampoules or vials.
  • a propellant or the like may be combined with the additives to disperse the dispersed dispersion or wet powder.
  • antibiotic refers to an agent that is provided to an animal in the form of a drug to kill bacteria, and generically refers to preservatives, fungicides and antibacterial agents.
  • the animal is a mammal including a human. Since the bacteriophage of the present invention has a very high specificity for Salmonella compared to conventional antibiotics, the fungi are not killed, only certain pathogens can be killed, and drug resistance or resistance is not induced. life cycling) can be used as a long novel antibiotic.
  • a single oral dose toxicity, intravenous toxicity, intestinal normal bacterial toxicity test was performed to evaluate the stability in rats, and a single oral dose toxicity test of ⁇ CJ2 at a concentration of 1 x 10 12 pfu was performed. No specific clinical symptoms or deaths occurred during the performance (Tables 4 and 5), and specific clinical symptoms or deaths occurred during the intravenous toxicity test with ⁇ CJ2 at a concentration of 1 x 10 12 pfu. (Table 6 and Table 7, Fig.
  • the present invention relates to livestock feed or drinking water comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • Feedstock antibiotics used in livestock and fisheries are used for prophylactic purposes.
  • Antibiotics for prophylaxis are a problem because they increase the likelihood of developing resistant bacteria and can deliver antibiotics in livestock to humans. When antibiotics are absorbed into the body through meat, they can cause antibiotic resistance, which can lead to the spread of disease.
  • there are many kinds of antibiotics to be mixed in the feed which has a problem that the probability of occurrence of multi-drug-resistant bacteria is more natural and can use the bacteriophage of the present invention as a new feed additive antibiotic to solve the problems caused by the use of existing antibiotics. It is.
  • Animal feed of the present invention may be prepared by separately mixing the feed bacteriophage in the form of feed additives, or when the feed is prepared directly.
  • Bacteriophage in the feed of the present invention may be a liquid or dried state, preferably in the form of a dry powder. Drying methods may be, but not limited to, ventilation drying, natural drying, spray drying and freeze drying.
  • the bacteriophage of the present invention may be mixed in the form of powder in a component ratio of 0.05 to 10% by weight, preferably 0.1 to 2% by weight of the feed weight.
  • the animal feed may further include conventional additives to increase the shelf life of the feed in addition to the bacteriophage of the present invention.
  • the feed additive of the present invention may further be added to other non-pathogenic microorganisms.
  • Microorganisms that may be added include lactobacillus, which has physiological activity and organic degradability under anaerobic conditions, such as Bacillus subtilis , which can produce proteolytic enzymes, lipolytic enzymes and sugar converting enzymes, and bovine stomach. strain, increasing the weight of livestock, such as increasing the milk yield of milk (Aspergillus oryzae) on Aspergillus duck characters showing the effect of increasing the absorption of digested food fungi (J AnimalSci 43 (Lactobacillus sp. ): 910-926, 1976 ) And yeasts such as Saccharomyces cerevisiae (J Anim Sci 56: 735-739, 1983).
  • the feed containing ⁇ CJ2 is a vegetable, such as grains, fruit, food processing by-products, algae, fiber oil, pharmaceutical by-products, oils, starches, gourds, grain by-products, etc. Proteins, inorganics, fats and oils, minerals, fats and oils, unicellular protein, zooplankton, food leftovers, and the like are not limited thereto.
  • Feed additives containing ⁇ CJ2 in the present invention include binders, emulsifiers, preservatives, etc. added to prevent quality deterioration, amino acids, vitamins, enzymes, probiotics, flavors, silk White nitrogen compounds, silicates, buffers, colorants, extractants, oligosaccharides, and the like, in addition to the feed may include a mixture, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a disinfectant or cleaning agent comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • Disinfectants containing the bacteriophage as an active ingredient has high utility value in food hygiene, such as food poisoning prevention.
  • the food industry may be used as an antiseptic and food additive for Salmonella contamination and may also be used to produce Salmonella clean livestock products in the livestock industry. It can also be used for spraying Salmonella in effluents from domestic sewage treatment plants and can be used in livestock areas, livestock slaughterhouses, livestock mortality areas, livestock cooking sites and cooking facilities, but is not limited thereto.
  • the cleaning agent containing the bacteriophage as an active ingredient may be used to remove Salmonella from the surface of the live animal, hair and parts of the body, or can be infected.
  • the present invention is to treat Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious diseases using bacteriophage having a specific killing ability to Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum or Salmonella florum. It is about a method.
  • the present invention is to treat Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious diseases using the composition for the prevention or treatment of Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious diseases It is about a method.
  • composition of the present invention may be administered to an animal in the form of a pharmaceutical preparation, or may be administered through a method of feeding the animal's feed or drinking water and feeding it, preferably mixed with the feed in the form of a feed additive. Can be.
  • the route of administration of the composition of the present invention may be administered via various routes orally or parenterally as long as it can reach the target tissue, and specifically, oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, It may be administered in a conventional manner via transdermal, nasal, inhalation, and the like.
  • the treatment method of the present invention includes administering a composition of the present invention in a pharmaceutically effective amount. It will be apparent to those skilled in the art that a suitable total daily dose may be determined by the practitioner within the correct medical judgment.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient, along with the type and severity of the response to be achieved, the patient's age, body weight, general health, sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, and specific composition It is desirable to apply differently depending on various factors including drugs used or co-used and similar factors well known in the medical field.
  • Selected bacteriophages were subjected to mass culture using ST.
  • the ST was shaken and cultured to 1.5 X 10 10 cfu (colony forming unit), centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes, and then resuspended in 4 ml SM solution.
  • DNase I and RNase A were added at a final concentration of 1 ⁇ g / ml and left at 37 ° C. for 30 minutes.
  • NaCl and PEG polyethylene glycol
  • the supernatant was removed after centrifugation for 20 minutes at 4 °C, 12000 rpm.
  • the precipitate was resuspended in 5 ml SM solution and left at room temperature for 20 minutes. 4 ml chloroform was added thereto, mixed well, and centrifuged at 4 ° C. and 4000 rpm for 20 minutes.
  • the supernatant was filtered through a 0.2 ⁇ m filter to purify bacteriophage by ultracentrifugation (35,000 rpm, 1 hour, 4 ° C.) using a glycerol density gradient method (density: 40%, 5% glycerol). Named.
  • Purified ⁇ CJ2 was resuspended in 300 ⁇ l SM solution and titer was measured.
  • the ⁇ CJ2 was deposited on December 17, 2008, with the accession number KCCM10976P to the Korean Culture Center of Microorganisms (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul).
  • Table 1 ⁇ CJ2 is infected with Salmonella> Sero type Strain name Gyunban formed for the presence or absence Sero type Strain name Gyunban formed for the presence or absence SG SGSC 2293 O SC ATCC 13312 X SP SGSC 2295 O SD SCSG 2467 X ST ATCC 14028 O SA ATCC 13314 X SE SGSC 2282 X SB ATCC 43975 X
  • ⁇ CJ2 Purified ⁇ CJ2 was diluted in 0.01% gelatin solution and fixed with 2.5% glutaraldehyde solution. It was dropped on a carbon-coated mica plate (ca. 2.5 X 2.5 mm) and acclimated for 10 minutes and then washed with sterile distilled water. Carbon film was placed on a copper grid, dyed for 30-60 seconds in 4% uranyl acetate, dried, and then passed through a transmission electron microscope (JEM-1011 transmission electron microscope, 80 kV, magnification X 120,000). X 200,000). As a result, the shape of the isolated ⁇ CJ2 is shown in Fig. 1, and is composed of a morphotype and sipoviride (morphotype) composed of an isometric capsid and a long non-contractile tail. siphoviridae).
  • morphotype sipoviride
  • Genomic DNA of ⁇ CJ2 purified through ultracentrifugation was extracted.
  • the purified ⁇ CJ2 culture medium contained ethylenediaminetetraacetic acid (pH8.0), proteinase K, and SDS (sodium dodecyl sulfate) at 20 mM, 50 ⁇ g / ml, and 0.5%, respectively.
  • ethylenediaminetetraacetic acid pH8.0
  • proteinase K proteinase K
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • ⁇ CJ2 5 ⁇ g of genomic DNA of ⁇ CJ2 was simultaneously treated with EcoR V restriction enzyme.
  • pCL Promega
  • CIP calf intestinal alkaline phosphatase
  • the transformant was transformed into a normal white colony screening method on an LB plate containing spectinomycin and X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside). Dog colonies were selected. Selected colonies were shaken for 16 hours in a culture medium containing spectinomycin.
  • plasmid was extracted using a plasmid purification kit (Promega). These plasmids were cloned by PCR using the M13 forward and M13 reverse primer sets, and the base fragments were analyzed using M13 forward and M13 reverse primer sets. .
  • ⁇ CJ2 has about 90% homology with the coat protein of BPKS7gp07 and SETP3 of salmonella phage KS7 at the front of the detox base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the latter part of SEQ ID NO: 1 also has 75% and 66% homology to salmonella phage KS7 and BPKS7gp04 and SPSV3_gp41 of phage SET3, respectively.
  • the first detoxification sequence of SEQ ID NO: 2 showed 91% homology with the hypothetical protein SPSV3_gp02 of salmonella phage SETP3.
  • the latter part also showed 94% homology with the tail component protein of salmonella phage SETP3.
  • the detoxification sequence of SEQ ID NO: 3 also showed 69% homology with the DNA polymerase of BPKS7gp41 and phage SETP3 of salmonella phage KS7.
  • the DNA sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 were analyzed using the NCBI blastn program. As a result, the homology with salmonella phage KS7, SETP3 was about 60-70%. But not exactly the same, ⁇ CJ2 was considered a new bacteriophage infected with Salmonella.
  • ⁇ CJ2 specific primers were prepared based on SEQ ID NOs: 1, 2, and 3. PCR was performed using SEQ ID NOs: 4 and 5, SEQ ID NOs: 6 and 7, and SEQ ID NOs: 8 and 9, respectively, as a preset. Bacteriophage whole genomic DNA of 0.1 ⁇ g and 0.5 pmol of primer was added to the pre-mix (Bioneer) and the final volume was adjusted to 20 ⁇ l. Denaturation it; 94 ° C. 1 min, annealing; 53 ° C. 1 min, polymeration; 30 cycles PCR was performed at 72 ° C. for 1 minute. As a result, when using SEQ ID NO: 4 and 5, SEQ ID NO: 6 and 7, and SEQ ID NO: 8 and 9 as a primer set, a PCR product of about 1 kbp was obtained. The results are shown in FIG.
  • the treated experimental culture was diluted in steps, and 10 ⁇ l of the diluted solution of each step was dropped by soft agar overlay method, followed by incubation at 37 ° C. for 18 hours to determine titer. It was found that the activity did not decrease when the relative stability with the original titer after drying. The results are shown in FIG.
  • each strain of SG and SP in Korea was isolated from SG (SG SGSC2293), SP (SP SGSC2295), and ST (ST ATCC14028), which were used in the ⁇ CJ2 test, in Korea. It was checked whether there was activity.
  • ⁇ CJ2 is a bacteriophage specific to SG, SP and ST.
  • Toxicity evaluation was performed by carrying out a safety evaluation in rats of ⁇ CJ2. Toxicity studies were conducted with single oral toxicity, intravenous toxicity, and intestinal normal bacterial toxicity.
  • Single oral dose toxicity studies were conducted to investigate acute toxicity from single oral doses in rats and to obtain an approximate lethal dose.
  • Twelve male and female 7-week-old males and females of specific pathogenic (SPF) rats (Rat, SD) were fasted the day before ⁇ CJ2 administration.
  • ⁇ CJ2 at a concentration of 1 X 10 12 pfu was orally administered to each 6 males and females, and 6 mice were orally administered with 20 mM Tris-HCl and 2 mM MgCl 2 mix solution for 4 hours. Feeding was started again later. On the day of dosing, observation was started every 30 minutes after dosing and every hour up to 4 hours, and the general symptoms were observed and recorded once a day for 14 days.
  • a Values are expressed as number of dead animal / total number of animals.
  • b Values are expressed as number of animals with clinical signs / total number of animals.
  • Intravenous toxicity studies were performed to investigate the toxicity of bacteriophages in the blood. Experiments were carried out on each of 10 male and 7 week-old males and females of specific pathogenic (SPF) rats (Rat, SD). ⁇ CJ2 at a concentration of 1 ⁇ 10 12 pfu was administered to 5 male and female veins each using a 3 ml syringe on the day of administration, and 20 mM Tris-HCl and 2 mM MgCl 2 mix solutions were administered to 5 microvenous veins as a control. It was. Under the same conditions as the oral administration test, the number of deaths, general symptoms, weight change, and autopsy results were confirmed, and the results are shown in Tables 6, 7, and 9, respectively.
  • a Values are expressed as number of dead animal / total number of animals.
  • b Values are expressed as number of animals with clinical signs / total number of animals.
  • the intestinal normal bacterial toxicity test is representative of the human intestinal bacteria and the 9 bacteria ( Bacteroides fragilis (ATCC25285), Bacteroides ovatus (ATCC8483), Fusobacterium prausnitzii (ATCC 27766), Bifidobacterium Longum (KACC 20597, ATCC15697), Clostridium perfringens (ATDD13124), Peptococcus anaerobius (ATCC27337), Enterococcus faecalis (KACC 11304, ATCC35308), Lactovacillus acidophilus (KACC12419, ATCC 4356 ), Escherichia coli (KACC 10005, ATCC 35607)) was conducted to predict the toxicity of ⁇ CJ2.
  • Bacteroides fragilis ATCC25285)
  • Bacteroides ovatus ATCC8483
  • Fusobacterium prausnitzii ATCC 27766
  • Bifidobacterium Longum KACC 20597
  • Bacteriophage of the present invention has specific killing ability against Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum, and Salmonella florum, but does not kill fungi, and is excellent in acid resistance, heat resistance, and dry resistance, therefore, Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum And Salmonella florum infectious diseases, in particular Salmonella, Salmonella food poisoning, poultry fever, and treatment for the purpose of preventing or treating Chukli, antibiotics, livestock feed, livestock drinking water, disinfectants and cleaning agents.

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Abstract

본 발명은 신규한 박테리오파지(bacteriophage)에 관한 것으로, 상세하게는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 또는 살모넬라 플로럼(Salmonella pullorum)을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피뮤리움에 의해 유발되는 살모넬라증과 살모넬라 식중독, 살모넬라 갈리나룸에 의하여 유발되는 가금티푸스, 살모넬라 플로럼에 의해 유발되는 추백리 등의 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 가축용 사료, 음용수, 세척제 및 소독제에 관한 것이다.

Description

신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
본 발명은 신규한 박테리오파지(bacteriophage)에 관한 것으로, 상세하게는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 또는 살모넬라 플로럼(Salmonella pullorum)을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피뮤리움에 의해 유발되는 살모넬라증과 살모넬라 식중독, 살모넬라 갈리나룸에 의하여 유발되는 가금티푸스, 살모넬라 플로럼에 의해 유발되는 추백리 등의 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 가축용 사료, 음용수, 세척제 및 소독제에 관한 것이다.
살모넬라균은 장내균과의 그람 음성의 보통 혐기성 세균 1속(조건 무산소균임)으로 아포를 형성하지 않는 간균이며, 보통 주모성 편모에 의한 운동성을 갖는다. 살모넬라균의 유전자 염기 구성 성분을 보면 GC 포함 정도가 50-52%로 대장균 (Escherichia coli)과 쉬겔라 (Shigella)와 유사하다. 살모넬라균 속은 사람에게뿐만 아니라 여러 가축에 감염하여 다양한 질병을 일으키는 병원성 미생물이다. 살모넬라종인 살모넬라 엔테리카 (Salmoneall enterica)는 혈청학적 구별에 의한 구분을 통해 갈리나룸 (Gallinarum), 플로럼 (Pullorum), 티피뮤리움 (Typhimurium), 엔테리티디스 (Enteritidis), 티피 (Typhi), 콜레라수이스 (Choleraesuis), 더비 (derby) 등을 포함한 많은 혈청종 (serovar)를 가진다 (Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA. Escherichia, Shigella, Salmonella. In Murry PR, Baron EJ, et al eds Manual of clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999;467-74 ; Ryan KJ. Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9). 이들 중 가금에 특이한 갈리나룸과 플로럼, 사람에게 특이한 티피, 돼지 특이의 살모넬라 콜레라수이스와 더비, 그리고 질병을 일으키는 대상 동물이 다양한 인수공통 혈청종인 살모넬라 엔테리티디스과 살모넬라 티피뮤리움 등이 질병을 일으켜 농가와 소비자에게 막대한 피해를 주기도 한다.
가금에서 살모넬라균이 일으키는 질병의 예로써 가금티푸스 (Fowl typhoid, FT)가 있다. 이 질병은 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum, 이하 SG로 명명함)이 원인체로 닭 및 칠면조 등의 조류에서 발생하는 급?만성의 전염병으로 모든 일령에 나타나는 패혈증에 의한 높은 폐사율이 특징이다. 최근에 유럽, 남미, 아프리카 및 동남아시아 등지에서는 발생빈도가 높은 것으로 보고 되어 그 피해가 증가되고 있다. 한국에서는 1992년 이래로 주로 갈색 산란계 농장에 전국적으로 확산되어 왔다 (권용국. 2000년도 조류질병 검색결과 분석. 국립수의과학검역원 정보지. 2001년 3월 ; 김애란 외, 2003년 한국 원종계 및 종계의 추백리-가금티푸스 감염실태, Korean J Vet Res(2006) 46(4) : 347~353).
추백리 (Pullorum Disease) 또한 살모넬라균이 원인이 되는 질병으로써 살모넬라 플로럼 (Salmonella Pullorum, 이하 SP로 명명함)에 의하여 발병된다. 추백리는 일령, 계절에 관계없이 발병하지만, 초생추 시기에 가장 감수성이 높은 것이 특징이다. 지난 1 세기 동안 한국은 물론 전세계적으로 모계로부터 난계대 전염에 의한 1-2 주령 미만의 일령 병아리에서 발생 및 피해가 심각하였던 질병으로 지난 `80년대 이후에 그 발생이 매우 감소하였으나 근년 90년대 중반 이후 다시 증가하는 추세에 있다 (권용국. 2000년도 조류질병 검색결과 분석. 국립수의과학검역원 정보지. 2001년 3월 ; 김애란 외, 2003년 한국 원종계 및 종계의 추백리-가금티푸스 감염실태, Korean J Vet Res(2006) 46(4) : 347~353).
우리 나라에서는 ‘90년대 이후 가금티푸스와 추백리의 발병이 증가하고 있는 추세로 농가에 큰 경제적 손실을 주고 있다. 이 때문에 2004년부터 약독화된 SG 생균 백신을 육계 (broiler)에 사용해 가금티푸스에 대하여 예방하려 하였지만 (김애란 외, 2003년 한국 원종계 및 종계의 추백리-가금티푸스 감염실태, Korean J Vet Res(2006) 46(4) : 347~353), 백신의 효과에 대한 사용자의 의구심이 제기고 있으며, 산란계 (Layer)에서는 난계대 전염 우려로 생균 백신의 사용이 불허되고 있다. 가금티푸스와는 달리 추백리의 경우에는 현재 상업화된 예방책은 없다. 따라서 가금티푸스와 추백리를 예방할 수 있는 방법 모색이 시급한 상황이다.
한편, 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella Typhimurium, 이하 ST로 명명함)은 SG나 SP와는 달리 숙주 특이성 없이 질병을 일으키는 인수공통 감염균이다 (Zoobises Report; Unitied Kingdom 2003).
ST는 가금, 양돈, 소 등에서 살모넬라증 (salmonellosis)을 일으킨다. 살모넬라증은 가축에서 살모넬라균에 의하여 급성 또는 만성의 소화기 전염병으로 발열, 장염 및 패혈증상을 주 증으로 하고 폐렴, 퇴염, 관절염, 유산 및 유방염도 일으킬 수 있다. 전세계적으로 발생되며 계절적으로 주로 여름에 가장 흔하게 발병한다 (T.R.Callaway et al. Gastrointestinal microbial ecology and the sagety of our food supply as related to Salmonella. J Anim Sci 2008.86:E163-E172). 소의 경우 일반적으로 식욕부진, 발열, 황색 설사변 또는 점혈변이 특징이나, 송아지의 급성감염 시 수일 내에 폐사되고 임신 중에는 혈류를 통하여 태우에 감염되어 패혈증으로 인해 폐사되어 조유산이 발생할 수 있다(www.livestock.co.kr). 양돈의 경우 급성패혈증형, 급성장염형과 만성잠염형으로 나뉜다. 급성패혈증형은 2~4 개월령의 자돈에서 발생하여 발병 2~4일 이내에 대부분이 폐사된다. 급성 장염형은 비육기에 발병되며 설사와 고열, 폐염 및 신경증상을 동반하며 중증의 경우 피부 변색이 나타난다. 만성장염의 경우 계속된 설사를 동반한다 (www.livestock.co.kr).
ST로 인하여 가금, 양돈, 소에서 살모넬라증이 발병하면 치료약제로 완치시키기가 매우 어렵다. 이는 살모넬라균이 여러 가지 약제에 강한 내성을 가지며, 임상증상을 보이는 동안 일반적인 항균제가 침투할 수 없는 세포 내로 기생하기 때문에 현재까지 항생제를 포함하여 ST로 인하여 발병되는 살모넬라증을 억제하기 위한 효과적인 방법이 없다 (www.lhca.or.kr).
또한 ST는 가축에서 질병을 일으킬 뿐만 아니라 가축 및 제품을 통하여 사람에게 감염하여 살모넬라 식중독을 일으킬 수 있다. 감염된 가축 (즉, 육류, 가금류, 달걀 및 이들의 부산물)을 식자재로 사용한 덜 익힌 음식을 섭취했을 때 인체에 전염된다. 사람에게 살모넬라 식중독이 발병하면 보통 두통과 발열, 심한 복통, 설사, 오심, 구토의 증상이 생긴다. 증상은 종종 감염되고 나서 6-72 시간이 경과한 후에 나타나고 증상들은 4-7 일간 지속되며 때로는 훨씬 오래 가기도 한다 (전염성 질병 정보지. NSW+HEALTH. 2008.01.14.).
미국의 질병관리센터 (CDC)통계에 따르면 2005년에서부터 2008년 사이에 발생된 사람의 식중독을 일으키는 원인 균 중에서 살모넬라가 16%를 차지하고 있으며, 그 중에서도 ST가 18% 나 된다. 또한 1973년에서 1984년 사이에 발생된 사람의 살모넬라 식중독 중에서 닭이 중간매개체로 작용한 경우가 5%, 쇠고기는 19%, 돼지고기는 7% 낙농제품이 6%, 칠면조가 9% 비율을 보였다고 보고한 바 있다. 1974~1984년 도계처리 단계에서 육용계에서 미생물학적 조사를 한 것을 보면 살모넬라균이 35% 이상을 차지한 것이 보고되었고, 1983년에는 닭의 도체에서의 살모넬라균 존재는 50.6%, 칠면조는 68.8%, 거위는 60%, 돼지고기는 11.6%, 쇠고기는 1.5%로 나타났다. 이와 더불어 2007년 통계에 따르면 살모넬라는 생가금육과 생돈육에서 각 5.5, 1.1% 발견되었다. 특히 ST 는 대부분 오염된 돼지고기, 가금육, 소고기에서 유래된다고 밝혔다 (www.cdc.gov (Centers for Disease Control and Prevention(CDC)). 2002년 FAO와 WHO가 수행한 위해 평가에서는 달걀과 가금육을 통해 전파된 살모넬라 식중독 발병률이 가금류의 살모넬라 유병률과 밀접한 관계가 있다고 밝혔다. 즉 가금류의 살모넬라 유병률이 감소하면 사람의 살모넬라 식중독 발병률도 감소한다는 의미이다 (Salmonella control at the source; World Health Organigation. International Food Safety Authorities Network(INFOSAN) Information Note No. 03/2007). 최근에는 가축뿐 아니라 땅콩, 시금치, 토마토, 피스타치오, 후추를 포함해 쿠키 반죽에 걸친 다양한 음식재료로부터 온 살모넬라균이 야기시키는 발병에 의해 음식물 안전에 대한 염려가 제기되고 있다 (Jane Black and Ed O'Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday, July 8, 2009).
이처럼 살모넬라균에 의한 피해 때문에 독일에서는 살모넬라균에 의한 감염이 보고되도록 의무화되어 있다 (독일 감염질환 예방법, Infektionsschutzgesetz에 6항, 7항에 의거). 1990년에서 2005년까지 20만건에서 약 5만건으로 감소된 것으로 공식적으로 기록되었지만, 5명 중 1명 정도가 살모넬라균 보균자로 추정되고 있고, 미국에서는 살모넬라균 감염이 대략 4만건 정도가 매년 보고되고 있는 추세이다 (en.wikipedia.org/wiki/Salmonella#cite_note-2).
따라서 가축의 살모넬라증 및 가축 유래 사람에서의 살모넬라 식중독을 일으킬 수 있는 ST의 통제 방법 모색이 시급한 상황이다. 미 FDA와 USDA는 미국내에서 100만건이 넘는 병을 유발하는 원인균인 살모넬라균을 예방하기 위한 다양한 조치들을 구체화하였다. 이와 더불어 덴마크 사육장에서의 살모넬라균 관리 비용 대비 비용효과 분석 결과 살모넬라균을 관리함으로써 2001년도 한해에 최소 1410 만 달러를 절약할 수 있었다는 보고가 있다(Salmonella control at the source. World Health Organigation. International Food Safety Authorities Network(INFOSAN) Information Note No. 03/2007).
한편, 박테리오파지는 특정 세균에만 감염하여 세균의 성장을 통제하는 세균특이적 바이러스로 세균 숙주 없이는 자가 증식이 불가능하다. 박테리오파지는 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA가 유전물질로써 핵산을 구성하고 있으며, 이 핵산을 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조로 20면체의 머리에 꼬리가 있는 형태, 20면체 머리에 꼬리가 없는 형태, 그리고 필라멘트형의 3가지 기본형 구조로 나뉜다. 박테리오파지는 형태학적인 구조, 유전물질에 따라서 분류된다. 이중 선형의 DNA를 유전물질로 가지고 있고 20면체 머리로 구성된 박테리오파지는 꼬리의 모양에 따라 수축성 꼬리 형태의 마이오비리데 (Myoviridae), 길고 수축성이 없는 꼬리의 시포비리데 (Siphoviridae), 그리고 짧은 꼬리의 포도비리데(Podoviridae)로 분류된다. 반면 유전물질이 RNA 또는 DNA을 가진 20면체 머리에 꼬리가 없는 박테리오파지는 머리의 형태, 머리의 구성 성분 및 외피 유무에 따라 분류된다. 마지막으로 DNA를 유전물질로 가진 필라멘트 형태의 박테리오파지는 크기, 모양, 외피 및 필라멘트 구성 성분에 따라 분류된다 (H.W.Ackermann. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146:843-857; Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application; CRC press).
세균을 감염시킬 때 박테리오파지는 세균의 표면에 달라붙어 자신의 유전물질을 세포 내로 주입한 후 용균성 (lytic) 또는 용원성(lysogenic)을 띠게 된다. 용균성인 경우 박테리오파지가 세포 기구들을 이용하여 자신의 구조물들을 만든 후 새로운 박테리오파지 입자들을 방출시킴으로써 세포를 파괴하거나 용해한다. 용원성인 경우 자신의 핵산을 세균 숙주세포의 염색체에 편입시켜 세균을 파괴하지 않고 세포와 함께 복제되지만 일정 조건이 되면 용균성으로 전환된다 (Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application. CRC press).
박테리오파지의 발견 이후 이를 감염질병 치료제로 이용하기 위한 연구가 진행되었지만 광범위한 숙주범위 (broad target spectrum)를 갖는 항생제의 특성에 비해 숙주특이성 (specific target spectrum)을 갖는 박테리오파지가 경쟁에서 밀려나 관심을 받지 못했다. 하지만 항생제의 오·남용으로 항생제 내성균의 문제가 심각해 지고, 식품내의 항생제 잔류에 의한 인체에 미칠 영향에 대한 우려가 더해지고 있다 (Cislo, M et al. Bacteriophage treatment of suppurative skin infections. Arch Immunol.Ther.Exp. 1987.2:175-183; 김성훈 외. 박테리오파지, 새로운 대체항생제. biological research information center. BRIC). 특히 동물의 성장촉진을 위해 사료에 첨가하는 항생제 (antimicrobial growth promoter, AGP)가 항생제 내성유발의 주요원인임이 밝혀짐에 따라 AGP의 사용을 금지하는 정책들이 입안되어 유럽연합은 2006년부터 모든 AGP의 사용이 금지되었고 한국은 2009년 현재 일부 AGP의 사용금지가 시행되고 있으며 향후 2013~2015년에 전면금지가 예상되고 있다.
이러한 흐름을 바탕으로 박테리오파지의 연구가 다시 관심을 모으고 있다. 박테리오파지를 이용하여 E.coli O157:H 균을 통제하기 위한 박테리오파지 7개가 2002년도에 미국 특허등록 (미국 등록특허 제6,485,902호 - Use of bacteriophages for control of Escherichia coli O157)되었으며, Nymox 사에서는 다양한 종의 미생물을 통제하는 박테리오파지 2종에 대하여 2005년도에 미국 특허등록 (미국 등록특허 제6,942,858호)을 받았다. 박테리오파지에 관한 연구가 활발히 진행됨에 따라 산업계에서 또한 박테리오파지를 이용한 다양한 상품을 개발하고 있다. 유럽의 EBI food system 사는 박테리오파지를 이용하여 리스테리아균에 의한 식중독을 방지하는 식품첨가제 제품인 Listerix-P100을 개발하여 최초로 미국 FDA의 승인을 받았고 동일한 개념의 리스테리아균 통제 식품첨가형 박테리오파지 제품 LMP-102를 개발하여 GRAS (Generally regarded as safe)의 인증을 받았다. 또한 2007년에는 OmniLytics 사에서 도축과정 중에 E.coli O157이 소고기 제품으로 오염되는 것을 막기 위한 세척액으로 박테리오파지를 이용한 제품이 개발되어 USDA's Food Safety and Inspection Service(FSIS)로부터 승인되었다. Clostridium sporogenes phage NCIMB 30008과 Clostridium tyrobutiricum phage NCIMB 30008는 각각 2003년과 2005년에 유럽에서 사료보존제로써 등록되어 사료 내 오염된 클로스트리디움균의 통제를 목적하는 제품으로 개발되었다. 이러한 연구는 박테리오파지는 항생제 치료가 어려운 세균의 통제나 축산물 등에 오염된 인수공통 전염균 등을 식품단계에서 통제할 수 있는 연구가 지속적으로 이루어지고 있음을 보여준다.
하지만 대부분의 박테리오파지 연구는 대장균, 리스테리아균, 클로스트리디움균 통제하는데 주력하고 있다. 살모넬라균 또한 인수공통 전염균으로 이에 대한 피해가 줄어들지 않고 있다. 또한 위에서 언급하였지만, ST 는 여러 약제에 대하여 내성을 갖기 쉽기 때문에 현재 우리 나라에서는 전염병예방법 시행령 (대통령령 제 16961호), 전염병예방법 시행규칙 (보건복지부령 제179호), 및 국립보건원 직제 (대통령령 제17164호)에 의해 내성감시를 실시하고 있다. 따라서 살모넬라균을 통제할 수 있는 박테리오파지 개발이 필요하다.
본 발명자들은 항생제의 오·남용으로 인한 항생제 내성균의 문제점 및 식품 내의 항생제의 잔류 문제 및 과거 항생제와 같이 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결하기 위해, 가축의 주요질병을 일으키는 살모넬라균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 신규 박테리오파지를 자연계에서 분리하고, 이들의 형태적, 생화학적 및 유전적 특성을 확인하였다. 그 결과, 상기 박테리오파지가 이들의 익균에는 영향을 주지 않고 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium, ST), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum, SG) 및 살모넬라 플로럼(Salmonella pullorum, SP) 모두를 사멸시킬 수 있을 뿐만 아니라, 내산성, 내열성 및 내건성이 뛰어남을 확인하였다. 또한, 살모넬라 티피뮤리움에 의해 유발되는 가축 살모넬라증 및 가축 유래 살모넬라 식중독, 및 가금에서 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼에 의해 유발되는 질환, 특히 가금티푸스 또는 추백리의 예방 또는 치료 목적으로 이용할 수 있는 조성물 및, 살모넬라균을 통제할 수 있는 다양한 제품 즉, 동물 사료 첨가제, 동물 음용수, 축사 소독제 및 육가공 세척제에도 적용이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼에 대하여 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 구체적으로 항생제로 사용되는 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 가축용 사료 및 음용수를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 및 세척제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 살모넬라 티피뮤리움으로 인해 유발되는 가축의 살모넬라증 또는 가축 유래 살모넬라 식중독을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 가금에서 살모넬라 갈리나룸과 살모넬라 플로럼 감염성 질병인 가금티푸스 또는 추백리를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 신규한 박테리오파지는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼에 특이적 사멸능을 가지며, 내산성, 내열성 및 내건성이 뛰어난 장점을 가진다. 따라서 상기 박테리오파지는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병인 살모넬라증, 살모넬라 식중독, 가금티푸스 또는 추백리의 예방 또는 치료 용도로 이용이 가능할 뿐만 아니라 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼의 통제 용도로 이용이 가능하다.
도 1은 ΦCJ2 의 전자 현미경 사진이다. 형태학상 정이십면체의 머리 (an isometric capsid)와 수축성이 없는 꼬리 (a long non-contractile tail)로 구성된 형태형 (morphotype) 시포비리데 (siphoviridae)에 속한다
도 2는 분리된 박테리오파지 ΦCJ2의 SDS-PAGE 결과이다. 박테리오파지의 단백질 패턴을 나타낸 것으로 약 40 kDa 의 주 단백질로 관찰되고 그 외에도 약 65 kDa, 17 kDa 및 15 kDa 의 단백질이 관찰된다. 인비트로젠 (Invitrogen) 사의 See-blue plus 2 prestained-standard를 마커로 사용하였다.
도 3은 분리된 박테리오파지 ΦCJ2의 PFGE 결과이다. ΦCJ2의 전체 게놈의 크기는 약 43 kbp 정도이다. 바이오라드 (Bio-rad)사의 5 kbp DNA size standard를 크기 마커 (size marker)로 사용하였다
도 4는 ΦCJ2의 게놈 DNA의 각 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다. A; 서열번호 4와 5번 프라이머 세트로 PCR 증폭, B; 서열번호 6과 7번 프라이머 세트로 PCR 증폭, C; 서열번호 8와 9번 프라이머 세트로 PCR 증폭. A, B, 및 C lane 모두 약 1 kbp 정도의 PCR 산출물을 가진다.
도 5는 박테리오파지 ΦCJ2의 내산성 실험 결과이다. pH 2.1, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 6.9, 7.4, 8.0 및 9.0에서의 생존 박테리오파지 수를 나타낸다. Control과 비교하여 pH 2.5 까지는 박테리오파지 ΦCJ2의 활성을 잃지 않으나 pH 2.1에서는 활성을 완전히 잃는다.
도 6은 박테리오파지 ΦCJ2의 내열성 실험 결과이다. 37, 45, 53, 60, 70 및 80℃에서 0, 10, 30, 60 및 120 분마다 시간별로 장치해 두었을 때, 생존 박테리오파지 수를 나타낸다. 60℃에서 2 시간까지 노출이 되어도 활성을 잃지 않는다. 70℃ 이상에서는 10 분 노출 후 활성을 완전히 잃는다.
도 7은 박테리오파지 ΦCJ2의 내건성 실험결과이다. 스피드 베큠 드라이어 (speed vacuum dryer, SVD)를 이용하여 60℃에서 120 분 동안 건조 처리한 것이다. 건조 후 원래 타이터와 상대적인 안정성을 비교하였을 때 활성이 감소하지 않는 것을 알 수 있다.
도 8은 박테리오파지 ΦCJ2의 단회 경구투여독성시험 랫트의 체중 변화이다. ○; 20 mM Tris-HCl과 2 mM MgCl2 mix 용액을 투여한 수컷 대조군, ●; 1 x 1012 pfu 농도의 ΦCJ2를 투여한 수컷 실험군, ■; 20 mM Tris-HCl과 2 mM MgCl2 mix 용액을 투여한 암컷 대조군, □; 1 x 1012 pfu 농도의 ΦCJ2를 투여한 암컷 실험군이다. 실험 결과 14일이 지나도 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중변화의 차이는 관찰되지 않았다.
도 9는 박테리오파지 ΦCJ2의 단회 정맥투여독성시험 랫트의 체중 변화이다. ○; 20 mM Tris-HCl과 2 mM MgCl2 mix 용액을 투여한 수컷 대조군, ●; 1 x 1012 pfu 농도의 ΦCJ2를 투여한 수컷 실험군, ■; 20 mM Tris-HCl과 2 mM MgCl2 mix 용액을 투여한 암컷 대조군, □; 1 x 1012 pfu 농도의 ΦCJ2를 투여한 암컷 실험군이다. 실험 결과 14일이 지나도 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중변화의 차이는 관찰되지 않았다.
하나의 양태로서, 본 발명은 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼에 특이적 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지에 관한 것이다.
본 발명의 박테리오파지는 형태학상 정이십면체의 머리 (isometric capsid)와 수축성이 없는 꼬리 (long non-contractile tail)로 구성된 형태형 (morphotype) 시포비리데 (Siphoviridae)에 속하고, 전체 게놈 크기가 43 kbp이며, 40 kDa 크기의 단백질을 주요 구조단백질로 갖는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 박테리오파아지는 살모넬라균들 중 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼을 선택적으로 감염시키며, 다른 종들은 감염시키지 않는 종 특이성을 갖는다.
본 발명의 박테리오파지는 유전학적으로 전체 게놈 크기가 43 kbp이고, 서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 전체 게놈의 일부로서 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 내지 3으로 기재된 핵산 분자를 전체 게놈의 일부로서 포함한다.
본 발명의 박테리오파지는 유전학적으로 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7 및 서열번호 8과 9로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 또는 그 이상의 프라이머 세트로 PCR을 진행하였을 경우 각각 약 1 kbp 정도의 PCR 산출물을 갖는다. 바람직하게는 상기 프라이머 세트 모두로 PCR을 진행하였을 경우 각각 약 1 kbp 정도의 PCR 산출물을 갖는다.
본 발명에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미이며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)를 포함하는 개념이다.
본 발명의 박테리오파지는 유전학적으로 주요 구조단백질로 40 kDa 크기의 단백질을 갖는다.
또한, 본 발명의 박테리오파지는 내산성 및 내열성의 생화학적 특징을 가지는데, pH 2.5 내지 pH 9.0 의 넓은 pH 범위에서 안정하게 생존하는 내산성을 가지며, 37℃ 내지 60℃ 범위의 온도, 즉, 높은 온도에서도 안정하게 생존할 수 있는 내열성을 가진다. 또한 고온 건조한 후에도 안정하게 생존하는 내건성을 가진다. 이러한 내산성, 내열성 및 내건성은 본 발명의 박테리오파지를 ST, SG 및 SP 유래의 가축 질병 또는 가축 유래 사람에게 유발될 수 있는 질병 예방 및 치료용으로 사용함에 있어, 다양한 온도 및 pH 범위의 적용이 가능하게 한다.
본 발명자는 도계장 근처의 하수로부터 시료를 채취하여, ST, SG 및 SP에 대한 특이적 사멸능을 갖고 상기와 같은 특징을 같은 본 발명의 박테리오파지를 동정하고, 이를 Bacteriophage ΦCJ2로 명명하고, 2008년 12월 17일 한국미생물 보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM10976P호로 기탁하였다.
본 발명의 구체적 일 실시예에 따르면, 도계장 근처의 하수로부터 시료를 채취하여 시료에서 숙주세포인 ST를 용균하는 박테리오파지를 분리하고, 이들이 SG 및 SP를 특이적으로 용균시킬 수 있음을 확인하였다 (표 1). 또한, 이들 박테리오파지 (ΦCJ2)를 전자현미경을 통해 형태학적으로 관찰한 결과, 형태형 (morphotype) 시포비리데 (Siphoviridae)에 속하는 것을 확인하였다 (도 1).
또한, ΦCJ2의 단백질 패턴을 분석한 결과, 박테리오파지의 주요 구조단백질로서 약 40 kDa의 단백질을 포함하는 것으로 나타났다 (도 2).
또한, ΦCJ2의 전체 게놈 크기를 분석한 결과, 약 43 kbp의 크기를 갖는 것을 확인하였다 (도 3). 이들의 유전적 특성을 분석한 결과, 서열번호 1 내지 3의 핵산 분자를 전체게놈의 일부로서 포함하는 것을 확인하였으며 (실시예 6), 상기 서열번호 1 내지 3을 바탕으로 타종간 유사성을 비교한 결과, 현재까지 알려진 박테리오파지와 유사성이 매우 낮아, 신규한 박테리오파지임을 확인하였다 (표 2). 유전적 특성을 좀 더 구체적으로 분석한 결과, ΦCJ2에 특이적인 프라이머 세트 (primer set), 구체적으로, 서열번호 4번과 5번, 서열번호 6번과 7번 및 서열번호 8번과 9번 프라이머 세트로 PCR을 진행하였을 때, 특정 크기의 PCR 산출물인 각각 1 kbp 정도의 산출물이 얻어지는 것을 확인하였다 (도 4).
또한, ΦCJ2를 SG 및 SP에 감염시켰을 때, 용균반 (phage plaque로 soft agar에서 하나의 박테리오파지에 의해 숙주세포가 용균되어 형성되는 clear zone)의 크기와 탁도 등이 동일하였다.
또한, ΦCJ2를 다양한 pH 범위 및 온도에서 안정성을 조사한 결과, pH 2.5 내지 9.0 (도 5) 및 37℃ 내지 60℃ 범위의 넓은 범위에서 안정하게 생존 (도 6)할 뿐만 아니라, 고온 건조 시 60℃에서 120분에도 안정성을 유지하는 것을 확인하였다 (도 7). 이는 본 발명의 박테리오파지 ΦCJ2를 살모넬라균을 통제할 수 있는 다양한 제품으로의 적용이 용이하다는 것을 의미하는 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 살모넬라균으로 유발된 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
바람직한 일 실시태양으로 상기 치료용 조성물은 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 항균 활성을 가지므로, 이들 균들에 의해 유발되는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움에 의한 질병으로는 살모넬라증 또는 살모넬라균 식중독, 살모넬라 갈리나룸에 의한 질병의 예는 가금티푸스, 살모넬라 플로럼에 의한 질병은 추백리를 들 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “살모넬라증”은 살모넬라균 감염에 의해 발열두통, 설사, 구토 등을 수반하는 증상을 총칭한다. 즉, 살모넬라균 속의 세균에 의해 일어나는 질병을 총칭하며 살모넬라증은 장티푸스와 같은 증세를 나타내는 패혈증형과 식중독인 급성위장염형으로 대별되며, 장염, 식중독, 급성 균혈증 등이 포함된다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질병의 증세가 호전되거나 상기 질병의 억제 또는 경감 및 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.
본 발명의 상기 조성물은 5 x 102 내지 5 x 1012 pfu/ml 의 ΦCJ2를 포함하며, 바람직하게는 1 x 106 내지 1 x 1010 pfu/ml 의 ΦCJ2를 포함한다.
본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품 및 사료첨가제로 제공될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 도 있다.
본 발명의 상기 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감음성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명에서 용어 "항생제"는 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 것이다. 상기 동물은 인간을 포함한 포유동물이다. 본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 비하여 살모넬라균에 대한 특이성이 매우 높으므로, 익균은 죽이지 않고, 특정 병원균만 사멸시킬 수 있고, 약물 내성 내지 저항성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명 (life cycling)이 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다.
본 발명의 구체적 일 실시예에 따르면, 랫트에서의 안정성 평가를 위하여 단회 경구투여 독성, 정맥 주사 독성, 장내 정상 세균 독성 시험을 수행하였고, 1 x 1012 pfu 농도의 ΦCJ2를 단회 경구투여 독성 시험을 수행시 특이할 만한 임상 증상이나 사망개체는 발생하지 않았으며 (표4 및 표5), 1 x 1012 pfu 농도의 ΦCJ2로 정맥 주사 독성 시험시 상기와 마찬가지로 특이할 만한 임상 증상이나 사망개체는 발생하지 않았으며 (표 6 및 표7, 도 9), 1 x 1011 pfu/ml 농도의 ΦCJ2를 단계 희석하여 장내 정상 세균 독성 시험을 수행시 ΦCJ2의 최고 농도에서도 장내 세균의 성장이 억제되지 않은 것을 확인하여 (표 8), 안정성이 있음을 확인하였다.
또한, ΦCJ2를 SG로 감염시킨 닭의 사료로 사용한 실험을 통하여, ΦCJ2 투약군이 무투약군보다 유의적으로 높은 방어율을 보이는 것을 확인하여 (표 9), 예방 및 치료의 가능성이 있음을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효 성분으로 포함하는 가축용 사료 또는 음용수에 관한 것이다.
축산, 수산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제는 예방 목적으로 사용되고 있는데, 예방 목적의 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이고 가축에 잔류하는 항생제가 사람에게 전달될 수 있어서 문제이다. 항생제가 육류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있다. 또한 사료에 섞여 먹이는 항생제의 종류가 많고 이는 다제 내성균 발생 확률이 높아지는 문제점이 있기 때문에 좀더 자연 친화적이면서도 기존의 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결할 새로운 사료첨가제용 항생물질로서 본 발명의 상기 박테리오파지를 이용할 수 있는 것이다.
본 발명의 가축용 사료는 박테리오파지를 사료첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 박테리오파지는 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파지는 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 가축용 사료는 본 발명의 박테리오파지 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물분해능이 있는 락토바실러스 균주 (Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에 (Aspergillus oryzae)와 같은 사상균 (J AnimalSci 43: 910-926, 1976) 및 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모 (J Anim Sci 56:735-739, 1983)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서의 ΦCJ2를 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질유, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단밸질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단밸질, 동물성플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에서의 ΦCJ2를 포함하는 사료 첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
또한 음용수에 혼합하여 공급함으로써 지속적으로 장내 살모넬라균의 숫자를 감소시킬 수 있으며, 살모넬라 청정 가축 생산을 모색할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효 성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제에 관한 것이다.
상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제는 식중독 예방 등 식품위생에 그 활용가치가 높다. 구체적으로 식품산업에서 살모넬라균 오염 방지용 소독제 및 식품첨가제로 활용될 수 있으며 또한 축산업 분야에서 살모넬라균 청정 축산물 생산에 활용될 수 있다. 또한 생활하수처리장에서 방류수 내 살모넬라 제거를 위한 살포에도 활용될 수 있으며 가축의 활동 영역, 가축 도축장, 가축 폐사 지역, 가축 조리 장소 및 조리 설비에 사용될 수 있으며 장소는 이에 국한된 것은 아니다.
또한 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 세척제는 살아있는 가축의 피부 표면, 털 및 신체 각 부위에 묻어있거나 혹은 감염 가능한 살모넬라균을 제거하는데 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지를 이용하여 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 이용하여 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음용수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 사료첨가제의 형태로 사료에 혼합되어 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 살모넬라균에 감염하는 박테리오파지의 분리
1-1. 박테리오파지 스크리닝 및 단일 박테리오파지 분리
도계장 및 근처 하수 종말 처리장 시료 50 ml를 원심분리관으로 옮겨 4000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후, 상등액을 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. ST 진탕 배양액 (OD600=2) 150 ㎕와 10 X Luria-Bertani 배지 (이하 LB 배지라고 명명함, tryptone 10 g; yeast extract 5 g; NaCl 10 g; 최종부피가 1 L 되도록) 2 ml 에 시료 여과액 18 ml를 섞어주었다. 이를 37℃에서 18 시간 동안 배양한 후, 배양액을 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하고, 그 상등액을 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. LB plate에 0.7% 한천 (agar) (w/v) 3 ml, ST 진탕 배양액 (OD600=2) 150 ㎕를 섞어 부어 굳힌 후, 그 위에 시료 배양 여과액 10 ㎕를 떨어뜨려 37℃에서 18 시간 동안 배양하였다 (0.7% 한천을 이용해 고체 배지 위에 붙는 것을 탑-아가 (top-agar)라고 하고, 탑-아가에서 성장하는 숙주세포를 이용해 박테리오파지가 용균하는 것을 관찰하는 방법을 소프트 아가 오버레이 (soft agar overlay) 방법이라고 정의한다).
용균이 일어난 시료 배양 여과액을 적당히 희석하여 ST 진탕 배양액 (OD600=2) 150 ㎕와 섞은 후, 소프트 아가 오버레이를 진행하여 단일 용균반을 획득하였다. 하나의 용균반은 하나의 박테리오파지로 이루어 졌다고 보기 때문에, 단일 박테리오파지를 순수분리 하기 위해 하나의 용균반을 취해서 400 ㎕ SM 용액 (NaCl, 5.8 g; MgSO47H2O, 2 g; 1 M Tris-Cl (pH7.5), 50 ml; H2O, 최종부피가 1 L 되도록)에 넣고 4 시간 동안 실온에 정치하여 단일 박테리오파지를 순수분리하였다. 분리된 박테리오파지를 대량확보하기 위해 단일 박테리오파지 용액의 상등액 100 ㎕를 취한 후, 0.7% 한천 12 ml, ST 진탕 배양액 500 ㎕와 혼합하여, 150 mm 지름의 LB 배지에서 소프트 아가 오버레이를 실시하였다. 완전히 용균이 일어난 플레이트 (plate)에 15 ml SM 용액을 부운 후, 4 시간 동안 실온에서 살며시 흔들어 주어 탑-아가 속의 박테리오파지를 유출시켰다. 박테리오파지가 유출된 SM 용액을 회수한 뒤 최종부피의 1%가 되도록 클로로포름(chloroform)을 첨가해서 10 분간 잘 섞어준 후, 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 여기서 얻어진 상등액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 냉장 보관하였다.
1-2. 박테리오파지의 대량배양
선별된 박테리오파지를 ST를 이용하여 대량배양을 실시하였다. ST를 진탕 배양하여 1.5 X 1010 cfu (colony forming unit)가 되도록 분주하여 4000 rpm 에서 10 분간 원심분리한 후, 이를 4 ml SM 용액에 재부유시켰다. 여기에 박테리오파지를 7.5 X 107 pfu (plaque forming unit)로 접종해 MOI (multiplicity of infection)=0.005로 만든 후, 37℃에서 20 분간 정치하였다. 이를 150 ml LB 배지가 들어있는 플라스크에 접종한 후 5 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 최종 부피의 1%가 되도록 클로로포름을 첨가하고 20 분간 흔들어 주었다. DNase I과 RNase A를 각각 최종농도 1 ㎍/ml 되도록 첨가하고 30 분간 37℃에서 정치시켰다. 최종 농도가 각각 1 M과 10% (w/v)이 되도록 NaCl과 PEG (polyethylene glycol)를 넣어 준 뒤 4℃에서 3 시간 추가 정치시켰다. 4℃, 12000 rpm 에서 20분간 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 5 ml SM용액으로 침전물을 재부유시킨 후 20 분간 실온에 정치시켰다. 여기에 4 ml 클로로포름을 첨가한 후 잘 섞어주고 4℃, 4000 rpm에서 20 분간 원심분리하였다. 상등액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 글리세롤 (glycerol) 밀도 구배법 (밀도: 40%, 5% 글리세롤)을 이용한 초원심분리 (35,000rpm, 1시간, 4℃)를 통하여 박테리오파지를 정제하였고, 이를 Bacteriophage ΦCJ2로 명명하였다. 정제한 ΦCJ2는 300 ㎕의 SM 용액으로 재부유한 후 타이터를 측정하였다. 상기 ΦCJ2는 2008년 12월 17일 한국미생물 보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM10976P호로 기탁하였다.
실시예 2 : ΦCJ2의 살모넬라균 감염 여부 조사
선별된 박테리오파지가 ST 외에 다른 종의 살모넬라균에 대하여 용균 활성을 하기 위해 다른 종의 살모넬라균에 교차감염을 시도하였다. 그 결과 ΦCJ2는 SE (Salmonella enterica Serotype Enteritis), SC (Salmonella enterica Serotype Choleraesuis), SD (Salmonella enterica Serotype Derby) 및 SA (Salmonella enterica subsp. Arizonae), SB(Salmonella enterica subsp. Bongori)에는 감염하지 않았다. ST ATCC14028 균주 이외에 다른 ST 균주에 대하여 교차감염을 실시하였을 경우 SG와 SP에서와는 달리 용균율이 40% 미만인 것을 확인하였고, 이로써 ΦCJ2는 SG 및 SP 특이적 박테리오파지라고 할 수 있었다 (실시예 11 참조). 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다. SG를 숙주로 이용하여 생산한 ΦCJ2은 ST에서 생산된 것과 동일한 용균반 모양, 형성된 용균의 투명성 정도, 단백질 패턴 및 게놈 크기를 보였다.
표 1 < ΦCJ2의 살모넬라균 감염여부 >
Sero type Strain name 용균반형성 유무 Sero type Strain name 용균반형성 유무
SG SGSC 2293 O SC ATCC 13312 X
SP SGSC 2295 O SD SCSG 2467 X
ST ATCC 14028 O SA ATCC 13314 X
SE SGSC 2282 X SB ATCC 43975 X
* ATCC : The Global Bioresource Center
* SGSC : salmonella genetic stock center
실시예 3 : ΦCJ2의 형태관찰
정제된 ΦCJ2를 0.01% 젤라틴 용액에 희석한 후, 2.5% 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 carbon-coated mica plate (ca.2.5 X 2.5 mm)에 떨어뜨려 10 분간 적응시킨 후, 멸균증류수로 세척하였다. 카본 필름 (Carbon film)을 copper grid에 끼워 4% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)에서 30-60 초간 염색하고, 건조를 수행한 후, 투과전자현미경 (JEM-1011 transmission electron microscope, 80kV, 배율 X 120,000 ~ X 200,000)으로 검경하였다. 그 결과 분리된 ΦCJ2의 형태는 도 1과 같으며, 형태학상 정이십면체의 머리 (isometric capsid)와 수축성이 없는 꼬리 (a long non-contractile tail)로 구성된 형태형 (morphotype), 시포비리데 (siphoviridae)에 속하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4 : ΦCJ2의 단백질 패턴 분석
1011 pfu/ml 타이터 (titer)의 정제된 ΦCJ2 용액 15 ㎕와 5X SDS 시료 용액 3 ㎕을 섞은 후 5분간 끓였다. 이를 4-12% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen 사) 젤에서 ΦCJ2의 전체 단백질을 전개하였다. 쿠마시블루(Coomassie blue) 염색 용액을 이용하여 젤을 1 시간 동안 상온에서 염색하였다. 그 결과 단백질 패턴은 도 2와 같이 약 40 kDa의 주요 단백질이 관찰되었다. 그 외에도 약 65 kDa, 17 kDa, 그리고 15 kDa의 단백질이 관찰되었다.
실시예 5 : ΦCJ2의 전체 게놈 DNA 크기 분석
초원심분리를 통해 정제된 ΦCJ2의 게놈 DNA를 추출하였다. 구체적으로 정제된 ΦCJ2 배양액에 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid(pH8.0)), 프로테네이즈 케이 (proteinase K), 및 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 각각 최종 농도가 20 mM, 50 ㎍/ml, 및 0.5% (w/v) 되도록 첨가한 후 50℃에서 1 시간 동안 정치하였다. 동일 양의 페놀(phenol (pH8.0))을 첨가한 후 잘 섞어준 다음, 실온에서 12000 rpm으로 10 분간 원심분리 하였다. 상등액을 수득해서 동일양의 PC(phenol:chloroform=1:1)를 첨가하고 잘 섞어준 후, 실온에서 12000 rpm으로 10 분간 원심분리 하였다. 그 후, 상등액을 수득해서 동일 양의 클로로포름을 잘 섞어준 후 실온에서 12000 rpm으로 10 분간 원심분리한 후, 상등액을 수득한 후 3 M 초산나트륨 (sodium acetate)을 전체 부피의 1/10로 섞고 2배 양의 차가운 95% 에탄올 (ethanol)을 첨가한 후 -20℃에서 1 시간 정치시켰다. 그 후, 0℃에서 10 분간 12,000 rpm으로 원심분리 후 상등액을 완전히 제거한 후, 바닥의 DNA를 50 ㎕ TE (Tris-EDTA (pH 8.0)) 용액에 녹였다. 추출한 DNA를 10배 희석하여 OD260에서 흡광도를 측정해 농도를 측정하였다. 전체 게놈 DNA 1 ㎍를 1% PFGE (pulse-field gel electrophoresis) 아가로즈 젤에 로딩한 후 BIORAD PFGE system 7번 프로그램 (size range 25-100 kbp; switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape; forward voltage 180 V; reverse voltage 120 V)을 이용하여 상온에서 20 시간 동안 전개하였다. ΦCJ2의 게놈 DNA의 크기는 도 3에서 보는 것과 같이 약 43 kbp 정도이었다.
실시예 6 : ΦCJ2의 유전적 특성 분석
분리한 ΦCJ2의 유전적 특성을 알아보기 위해서 ΦCJ2의 게놈 DNA 5 ㎍을 EcoR V 제한효소로 동시에 처리하였다. 벡터로는 pCL (Promega 사)를 Sma I 제한효소로 자른 후 CIP (calf intestinal alkaline phosphatase) 처리한 것을 사용하였다. 절편된 gDNA와 벡터의 양이 3:1이 되도록 반응조건을 맞추어 섞은 후, 16℃에서 5시간 동안 라이게이션 (ligation)을 진행하였다. 이를 대장균의 한 종인 DH5α 세포에 도입시켰다. 이렇게 형질전환된 전환체를 스펙티노마이신 (spectinomycin)과 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)이 포함된 LB plate에서 통상의 청백 콜로니 선별법을 통해 3개 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 스펙티노마이신이 포함된 배양배지에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. 여기서 플라스미드 정제키트 (Promega 사)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 이 플라스미드들을 M13 forward와 M13 reverse 프라이머세트 (primer set)를 이용하여 PCR로 클로닝 여부를 확인하였으며, 삽입조각 크기가 1 kbp 이상 되는 것을 골라 M13 forward 와 M13 reverse 프라이머세트를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 이렇게 얻어진 유전자 염기서열이 서열번호 1, 2 및 3에 나타나 있고, 각각의 크기는 약 3.1 kbp, 1.7 kbp 및 800 bp 정도이다. 이를 NCBI blastx 프로그램을 이용하여 해독염기서열의 유사성을 분석한 결과가 하기 표 2에 나타나있다.
하기 표 2에서 보는 바와 같이 ΦCJ2은 서열번호 1의 해독염기서열의 앞부분은 salmonella phage KS7의 BPKS7gp07, 그리고 SETP3의 coat protein과 약 90% 상동성을 가진다. 서열번호 1의 해독염기서열의 뒷부분 또한 salmonella phage KS7, phage SET3의 BPKS7gp04와 SPSV3_gp41에 각각 75%, 66% 상동성을 가진다. 서열번호 2의 해독염기서열 앞부분은 salmonella phage SETP3의 hypothetical protein SPSV3_gp02와 91% 상동성을 보였다. 뒷부분 역시 salmonella phage SETP3의 tail component protein과 94% 상동성을 보였다. 서열번호 3의 해독염기서열 또한 salmonella phage KS7의 BPKS7gp41, phage SETP3의 DNA polymerase와 69% 상동성을 가지는 것을 알 수 있었다. 서열번호 1, 2 및 3을 NCBI blastn 프로그램을 이용하여 DNA 염기서열을 분석한 결과를 살펴보면 salmonella phage KS7, SETP3와 약 60~70% 정도 상동성이 있는 것을 알 수 있었다. 하지만 완벽하게 동일한 것이 아니므로 ΦCJ2은 살모넬라균에 감염하는 신규 박테리오파지로 판단되었다.
표 2 < ΦCJ2의 염기서열과 다른 박테리오파지 해독염기 서열 상동성 비교 >
organism protein Accession number Subject location Query location identities E value
1 Salmonella phage KS7 hypothetical protein BPKS7gp09 AAW51212 123 - 349 3 - 683 205/227 (90%) 7e-115
Salmonella phage SETP3 putative coat protein ABN47366 123 - 349 3 - 683 203/227 (89%) 6e-114
Salmonella phage SETP3 hypothetical protein SPSV3_gp41 ABN47370 1 - 169 1630 - 2136 112/169 (66%) 1e-49
Salmonella phage KS7 hypothetical protein BPKS7gp04 AAW51207 1 - 199 2142 - 2747 153/202 (75%) 2e-79
2 Salmonella phage KS7 hypothetical protein AAW51256 1 - 433 372 - 1670 402/433 (92%) 0.0
Salmonella phage SETP3 tail component protein ABN47332 9 - 322 729 - 1670 296/314 (94%) 5e-164
Bacteriophage MB78 hypothetical protein CAB36893 21 - 287 3 - 803 248/267 (92%) 3e-143
Salmonella phage SETP3 hypothetical protein SPSV3_gp02 ABN47331 21 - 267 3 - 743 225/247 (91%) 6e-129
3 Salmonella phage KS7 hypothetical protein BPKS7gp41 AAW51246 176 - 417 789 - 1 182/263 (69%) 1e-87
Salmonella phage SETP3 DNA polymerase ABN47339 176 - 417 789 - 1 182/263 (69%) 2e-87
실시예 7 : ΦCJ2 특이적 프라이머 염기서열 제작
ΦCJ2를 동정하기 위하여 ΦCJ2 특이적인 프라이머를 서열번호 1, 2 및 3을 바탕으로 하여 제작하였다. 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7, 및 서열번호 8과 9를 각각 프라이세트로 하여 PCR을 진행하였다. 박테리오파지 전체 게놈 DNA 0.1 ㎍와 0.5 pmol의 프라이머를 pre-mix (Bioneer 사)에 첨가하고 최종부피가 20 ㎕이 되도록 맞추었다. 이를 denaturation; 94℃ 1 분, annealing; 53℃ 1 분, polymeration; 72℃ 1 분의 조건으로 30 cycles PCR을 진행하였다. 그 결과 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7 및 서열번호 8과 9를 프라이머 세트로 이용했을 경우 모두 약 1 kbp 정도의 PCR 산물을 얻었다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
실시예 8 : 박테리오파지의 pH에 따른 안정성 조사
ΦCJ2의 닭 위장 내 낮은 pH에서 안정성을 보유할 수 있는지 확인하기 위하여 다양한 pH 범위 (pH 2.1, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 6.9, 7.4, 8.2 및 9.0)에서 안정성 조사 실험을 하였다. 다양한 pH 용액 (소디움아세테이트 용액(Sodium acetate buffer (pH 2.1, pH 4.0, pH 5.5 및 pH 6.4)), 소디움시트레이트 용액 (Sodium citrate buffer (pH 2.5, pH 3.0 및 pH 3.5)), 소디움포스페이트 용액(Sodium phosphate buffer (pH 6.9 및 pH 7.4)), 트리스 용액(Tris-HCl (pH 8.2 및 pH 9.0))을 각각 2 M로 제작하였다. pH 용액 100 ㎕와 동량의 1.0 X 1011 pfu/ml 타이터의 박테리오파지용액을 섞어 각 pH 용액의 농도가 1 M이 되게 한 후, 1 시간 동안 상온에서 정치하였다. 이들을 단계 희석하고, 소프트 아가 오버레이 (soft agar overlay) 방법을 이용하여 각 단계의 희석액을 10 ㎕ 씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. 원래의 ΦCJ2의 타이터와 비교하여 pH 변화에 따른 타이터 변화를 통하여 상대적 안정성을 확인하였는데, 실험 결과 pH 2.5까지는 활성을 잃지 않고 매우 안정적임을 알 수 있었다. 하지만 pH 2.1에서는 활성을 잃었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 9 : 박테리오파지의 온도에 따른 안정성 조사
박테리오파지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 발생하는 열에 대한 안정성을 확인하기 위한 실험을 하였다. 1.0 X 1011 pfu/ml 타이터의 ΦCJ2의 용액 200 ㎕ 를 37℃, 45℃, 53℃, 60℃, 70℃ 및 80℃의 온도 조건 하에서 각각 0 분, 10 분, 30 분, 60 분 및 120 분 동안 정치시켰다. 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여, 소프트 아가 오버레이 방법으로 각 단계의 희석액 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. 원래 타이터와 온도 및 노출 시간 변화에 따른 상대적 안정성을 확인하였는데 60℃에서 2시간까지 노출이 되어도 활성을 많이 잃지 않는 것을 알 수 있었다. 하지만 70℃이상에서는 10 분 노출 후 활성이 급격하게 감소하지만 일정 비율 활성을 유지하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
실시예 10 : 박테리오파지의 건조에 대한 안정성 조사
박테리오파지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 발생하는 건조 조건에 대한 안정성을 확인하였다. 내열성 확인 실험을 통해 도출한 결과를 바탕으로, 60℃ 120 분 조건 하에서의 고온 건조 실험을 진행하였다. 1.0 X 1011 pfu/ml 타이터의 ΦCJ2의 용액 200 ㎕를 스피드 베큠 (Speed vacuum, Speed - Vacuum Concentrator 5301, Eppendorf)을 이용하여 건조하였다. 건조 후 얻어진 펠렛(pellet)을 초기 용액과 동량의 SM 용액를 넣어 4℃에서 하루 동안 완전히 재부유시켰다. 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여, 소프트 아가 오버레이 방법으로 각 단계의 희석액을 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. 건조 후 원래 타이터와 상대적인 안정성을 비교하였을 때 활성이 감소하지 않는 것을 알 수 있었다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
실시예 11 : 박테리오파지의 야생 분리주에 대한 감염범위 조사
ΦCJ2가 실험에 사용된 SG(SG SGSC2293), SP(SP SGSC2295) 그리고 ST(ST ATCC14028) 이외 서울대학교 수의과대학 조류질병학실에서 분리한 우리 나라의 야생 분리주 SG, SP에 대하여 각각 20주에 대하여 용균 활성이 있는지 여부를 확인하였다. 각 균주의 진탕 배양액 (OD600=2) 150 ㎕를 섞어 소프트 아가 오버레이 방법을 진행하여 1010 pfu/ml 타이터의 ΦCJ2의 용액 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균반 형성 유무를 관찰하였다. 야생 분리주 SG와 SP에 대하여 100% 용균율을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 또한 하기 표 3에는 언급하지 않았지만, 야생분리주 ST 20주에 대하여 용균활성 여부도 확인한 결과 용균율이 80% 인 것을 알 수 있었다. 따라서 ΦCJ2는 SG, SP 및 ST에 특이적인 박테리오파지라고 할 수 있다.
표 3 < 야생 분리주 SG, SP, 그리고 ST에 대한 용균 형성 여부 조사 >
Sero type Strain name 용균반 형성 유무 Sero type Strain name 용균반 형성 유무 Sero type Strain name 용균반 형성 유무
SG SNU SG1 O ST SNU ST1 X SP SNU SP1 O
SG SNU SG2 O ST SNU ST2 O SP SNU SP 4 O
SG SNU SG3 O ST SNU ST3 X SP SNU SP 5 O
SG SNU SG4 O ST SNU ST4 O SP SNU SP 8 O
SG SNU SG5 O ST SNU ST7 O SP SNU SP 11 O
SG SNU SG6 O ST SNU ST8 O SP SCSG 2294 O
SG SNU SG7 O ST SNU ST11 O SP SCSG 2295 O
SG SNU SG8 O ST SNU ST12 O SP SCSG 2737 O
SG SNU SG9 O ST SNU ST13 O SP SCSG 2739 O
SG SNU SG10 O ST SNU ST14 O SP SCSG 2742 O
SG SNU SG11 O ST SNU ST17 O SP SCSG 2743 O
SG SNU SG12 O ST SNU ST18 X SP SCSG 2745 O
SG SNU SG13 O ST SNU ST19 O SP SCSG 2751 O
SG SNU SG14 O ST SNU ST20 O SP SCSG 4663 O
SG SNU SG15 O ST SNU ST25 O SP SCSG 4664 O
SG SCSG9184 O ST SNU ST26 O SP SCSG 4665 O
SG SCSG 2292 O ST SNU ST37 O SP SCSG 4666 O
SG SCSG 2293 O ST SNU ST38 X SP SCSGSA1684 O
SG SCSG 2744 O ST SNU ST41 O SP
SG SCSG 2296 O ST SNU ST42 O SP
* SG/SP source : 서울대학교 수의과대학 조류질병학실
* SGSC : salmonella genetic stock center
실시예12 : 박테리오파지의 독성 평가
ΦCJ2의 랫트 (Rat)에서의 안전성 평가를 실시하여 독성 평가를 수행하였다. 독성 시험은 단회 경구투여 독성, 정맥 주사 독성, 장내 정상 세균 독성으로 진행되었다.
단회 경구투여 독성 시험은 랫드에서 단회 경구투여에 의한 급성독성을 조사하고 개략의 치사량을 얻기 위하여 실시하였다. 특정 병원성 부재 (SPF) 랫드(Rat, SD) 7주령 암수 각각 12마리를 ΦCJ2 투여 전날 절식 시켰다. 투여 당일 경구 투여용 존대를 이용하여 1 X 1012 pfu 농도의 ΦCJ2를 암수 각각 6마리에 경구투여하고 대조군으로 6마리에는 20 mM Tris-HCl과 2 mM MgCl2 mix 용액을 경구투여 한 후 4시간 후에 다시 사료 급여를 시작하였다. 투여 당일에는 투여 후 30분에 관찰을 시작하여 4 시간까지 매 시간 관찰하며, 14일간은 1일 1회 일반증상을 관찰하여 기록하였다. 실험 결과 사망개체는 발생하지 않았고, ΦCJ2에 의한 독성 증상과 특이할 만한 임상증상도 나타나지 않았으며, 그 결과는 표 4와 표 5에 나타내었다. 체중은 투여 전, 투여 후 1, 3, 7, 10 및14일에 체중을 측정하여 기록하였고 그 결과 대조군에 비교하여 유의성 있는 체중 변화의 차이는 관찰되지 않았고 그 결과는 도 8에 나타냈다. 체중 변화 관찰 결과 ΦCJ2가 식욕을 감소시키거나 체중을 변화시키는 독성반응을 유발하지 않은 것을 알 수 있었다. 생존 동물을 부검하여 육안으로 모든 장기를 검사를 한 결과 특이한 이상은 관찰되지 않았다.
표 4 <ΦCJ2의 경구투여독성 시험에 따른 사망 개체수 관찰 결과>
Sex Dose (pfu) Hours after treatment Days after treatment Final mortaliy
0.5 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Male 대조군 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6
1x1012 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6
Female 대조군 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6
1x1012 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/6
표 5 <ΦCJ2의 경구투여독성 시험에 따른 일반증상 관찰 결과>
Sex Dose (pfu) Final mortality Clinical signs
Male Female Male Female
Male 대조군 0/6a 0/6 0/6b 0/6
1x1012 0/6 0/6 0/6 0/6
Female 대조군 0/6 0/6 0/6 0/6
1x1012 0/6 0/6 0/6 0/6
aValues are expressed as number of dead animal/total number of animals.
bValues are expressed as number of animals with clinical signs/total number of animals.
정맥 주사 독성 시험은 박테리오파지가 혈액에 존재할 경우 독성을 조사하기 위하여 실시하였다. 특정 병원성 부재 (SPF) 랫트 (Rat, SD) 7주령 암수 각각 10마리에 실험을 진행하였다. 투여 당일 3 ml 주사기를 이용하여 1 X 1012 pfu 농도의 ΦCJ2를 암수 각각 5마리의 미정맥에 투여하였고, 20 mM Tris-HCl과 2 mM MgCl2 mix 용액을 대조군으로 5마리의 미정맥에 투여하였다. 경구투여 시험과 같은 조건으로 사망 개체수와 일반증상, 체중 변화 및 부검 결과를 확인하였고, 그 결과는 각각 표 6 및 표 7, 및 도 9에 나타내었다. 시험 기간 동안 사망개체는 발생하지 않았고, ΦCJ2에 의한 독성증상과 임상증상도 나타나지 않았다. 또한 ΦCJ2 대조군과 비교하여 유의성있는 체중변화의 차이는 관찰되지 않은 것으로 보아 ΦCJ2의 투여가 독성반응을 유발하지 않는 다는 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 생존동물을 부검 후 내부장기를 검사한 결과 특이한 이상은 관찰되지 않았다.
표 6 <ΦCJ2의 경구투여독성 시험에 따른 사망 개체수 관찰 결과>
Sex Dose (pfu) Hours after treatment Days after treatment Final mortaliy
0.5 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Male 대조군 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5
1x1012 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5
Female 대조군 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5
1x1012 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5
표 7 <ΦCJ2의 경구투여독성 시험에 따른 일반증상 관찰 결과>
Sex Dose (pfu) Final mortality Clinical signs
Male Female Male Female
Male 대조군 0/5a 0/5 0/5b 0/5
1x1012 0/5 0/5 0/5 0/5
Female 대조군 0/5 0/5 0/5 0/5
1x1012 0/5 0/5 0/5 0/5
aValues are expressed as number of dead animal/total number of animals.
bValues are expressed as number of animals with clinical signs/total number of animals.
마지막으로 장내 정상 세균 독성 시험은 박테리오파지가 장내세균 대표 종에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 인체 장내 정상세균을 대표하는 균주로 동물의약품 독성시험 지침에 고시된 9종의 세균 (Bacteroides fragilis (ATCC25285), Bacteroides ovatus (ATCC8483), Fusobacterium prausnitzii (ATCC 27766), Bifidobacterium Longum (KACC 20597, ATCC15697), Clostridium perfringens (ATDD13124), Peptococcus anaerobius (ATCC27337), Enterococcus faecalis (KACC 11304, ATCC35308), Lactovacillus acidophilus (KACC12419, ATCC 4356), Escherichia coli (KACC 10005, ATCC 35607))에 대하여 ΦCJ2의 독성을 예측하는 실험을 실시하였다. 1 x 1011 pfu/ml ΦCJ2를 단계희석하여 96 well plate에 100 ㎕ 씩 분주한 후 9종 세균 배양액을 첨가하여 정해진 배양조건에서 18~48 시간 동안 배양하였다. 균의 농도를 측정하여 균의 성장에 억제된 최저 농도를 확인한 결과 ΦCJ2의 최고 농도에서도 균의 성장이 억제되지 않은 것으로 보였으며, 이를 표 8에 나타내었고 장내 대표적인 정상 세균에 대한 통제능력이 없는 것으로 확인되었다.
표 8 <ΦCJ2의 장내 정상세균에 대한 최저 농도 결정>
미생물 배지 배양조건 ΦCJ2 MIC
Bacteroides fragilis (ATCC25285) Thioglycollate혐기성 배지 37℃,Strict anaerobic(GasPak) 1x102~1x1012CFU/ml10배수 간격 9개 농도 Not determined (ND)
Bacteroides ovatus (ATCC8483) Thioglycollate혐기성 배지 37℃,Strict anaerobic(GasPak) ND
Fusobacterium prausnitzii (ATCC 27766) Thioglycollate혐기성 배지 37℃,Strict anaerobic(GasPak) ND
Bifidobacterium Longum (KACC 20597, ATCC15697) Reinforced clostridial medium혐기성 배지 37℃,Strict anaerobic(GasPak) ND
Clostridium perfringens (ATDD13124) Reinforced clostridial medium혐기성 배지 37℃,Strict anaerobic(GasPak) ND
Peptococcus anaerobius (ATCC27337) Thioglycollate혐기성 배지 37℃,Strict anaerobic(GasPak) ND
Enterococcus faecalis (KACC 11304, ATCC35308) Muller Hinton Broth 37℃,aerobic ND
Lactovacillus acidophilus (KACC12419, ATCC 4356) Lactobacilli MRS Broth 37℃,5% CO2(GasPak) ND
Escherichia coli (KACC 10005, ATCC 35607) Muller Hinton broth 37℃,aerobic ND
실시예13 : 박테리오파지의 효능 평가
ΦCJ2의 ST, SG 및 SP 대한 예방 및 치료 정도 가능성을 보기 위하여 닭에서 효능 평가 실험을 진행하였다.
1일령 갈색산란계 20수를 10수씩 10개 시험군 (ΦCJ2투약군 + 무투약 공격군 1개)에 할당하였고, 시험계에 ΦCJ2를 g당 107 pfu를 혼합한 사료와 ml당 107 pfu 를 혼합한 음수를 1주일 간 공급하였고, 1주일째에 수당 SG0197 106 cfu와 각 파지 107 pfu (MOI=10) 를 500㎕의 TSB에 혼합한 후 얼음에 박았다가 1시간 이내에 구강으로 접종하였다. 2주간 폐사율을 관찰하였고, 생존한 시험계는 부검하여 병변유무 확인하였고, 세균을 분리하였다. 그 결과는 표 9와 같으며, ΦCJ2투약군은 무투약군 대비 유의적으로 높은 (P<0.05) 방어율을 보이는 것을 알 수 있었다.
표 9 <CJ2 의 닭에서의 효능 시험 >
ΦCJ2 투약 공격군 무투약 공격군
생존수 9 3
폐사율 10% 70%
병변 1/9 1/3
SG 재분리 0/9 0/3
방어율 80% 20%
본 발명의 박테리오파지는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼에 대하여 특이적 사멸능을 가지는 반면, 익균을 사멸시키지 않으며, 내산성, 내열성 및 내건성이 뛰어나므로, 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼 감염성 질병, 특히 살모넬라증, 살모넬라 식중독, 가금티푸스 그리고 추백리 예방 또는 치료 목적의 치료제, 항생제, 가축용 사료, 가축 음용수, 소독제 및 세척제 등에 광범위하게 이용될 수 있다.
Figure PCTKR2009005061-appb-I000001
Figure PCTKR2009005061-appb-I000002

Claims (13)

  1. 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella Gallinarum) 또는 살모넬라 플로럼 (Salmonella Pullorum)에 특이적 사멸능을 갖고, 형태학상 정이십면체의 머리 (isometric capsid) 및 수축성이 없는 꼬리 (long non-contractile tail)를 갖는 형태형(morphotype) B1, 시포비리데 (siphoviridae)에 속하고, 전체 게놈 크기가 43 kbp이며, 40 kDa 크기의 단백질을 주요 구조단백질로 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 형태학적으로 도 1에 도시된 형태형을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
  3. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 전체 게놈의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
  4. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 서열번호 4와 5, 서열번호 6과 7 및 서열번호 8와 9로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 또는 그 이상의 프라이머 세트로 PCR을 진행하였을 경우 각각 1 kbp 정도의 PCR 산출물을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
  5. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 pH 2.5 내지 pH 9.0 범위에서 내산성을 가지고, 37℃ 내지 60℃ 범위에서 내열성을 갖으며, 60℃에서 120분 동안 건조하였을 때 내건성을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지.
  6. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 제 KCCM10976P호인 박테리오파지.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 살모넬라균으로 유발된 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 살모넬라 티피뮤리움 감염성 질병은 살모넬라증 또는 살모넬라 식중독이고, 살모넬라 갈리나룸 감염성 질병은 가금티푸스이며, 살모넬라 플로럼 감염성 질병은 추백리인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 항생제로 사용되는 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 가축용 사료 또는 음용수.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제
  12. 제1항 내지 제6항의 박테리오파지를 이용하여 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 살모넬라균으로 유발된 감염성 질병을 치료하는 방법.
  13. 제7항의 조성물을 이용하여 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 살모넬라균으로 유발된 감염성 질병을 치료하는 방법.
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