CN117701512B - 一种沙门菌噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于噬菌体技术领域，具体涉及一种沙门菌噬菌体及其应用。本发明分离出一株在70‑80℃条件下保持活性的沙门菌噬菌体，对生物被膜清除作用优于商品化生物被膜杀菌试剂ε‑PL和其它噬菌体，且对固体和液体食品中的沙门菌均具有较好的杀灭效果。
Description
技术领域
本发明属于噬菌体技术领域，具体涉及一种沙门菌噬菌体及其应用。
背景技术
沙门菌宿主范围广泛，不仅能引起家畜家禽等多种动物发病，还能导致人患病。在感染沙门菌后，动物常常表现出伤寒、肠炎、败血症等临床症状。沙门菌还是重要的食源性病原菌，牛奶、生菜等食品较易被沙门菌污染，人食用污染有沙门菌的食品后会造成腹泻等症状，严重者甚至威胁生命。目前抗生素是防治沙门菌感染的首选药物，但是由于抗生素的大量使用，沙门菌耐药性问题越来越严重，多重耐药菌株也日益增多。因此，如何合理有效的控制食品中的沙门菌，防止其耐药现象日益严重是当今亟需解决的问题。目前已有许多沙门菌噬菌体的报道，但耐高温且对生物被膜具有较好清除作用的沙门菌噬菌体未有报道。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供一种沙门菌噬菌体及其应用。
为了实现上述目标，本发明的第一方面采用如下的技术方案：一种沙门菌噬菌体，该噬菌体于2023.10.25保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No: 63913-B1。
在优选的实施方案中，所述的沙门菌噬菌体在70-80℃条件下保持噬菌体活性。该噬菌体属于肌尾噬菌体科。
本发明的第二方面是提供该沙门菌噬菌体在清除沙门菌生物被膜中的应用，生物被膜本身也是由沙门菌组成的。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明分离出一株耐受70℃以上高温的沙门菌噬菌体，对生物被膜清除作用略优于商品化生物被膜杀菌试剂ε-PL或其它噬菌体。
现有技术中大多数有一定的抑菌功能的噬菌体，在高温下通常失去了活性，且一般缺乏对生物被膜的有效清除能力，其很难突破并裂解生物被膜；而本发明的噬菌体既耐高温（可达80℃）又对生物被膜具有较强清除作用，且为肌尾噬菌体科。
附图说明
图1 噬菌体ØDF6所形成的噬菌斑照片；
图2 噬菌体ØDF6的透射电镜照片；
图3 噬菌体ØDF6对温度的敏感性；
图4 噬菌体ØDF6对生物被膜的清除作用，A、噬菌体ØDF6对沙门菌生物被膜的清除作用；B、生物被膜下活菌数；
图5 噬菌体的杀菌效果，A、噬菌体ØDF6对牛奶中沙门菌的杀菌效果；B、噬菌体ØDF6对生菜中沙门菌的杀菌效果；C、噬菌体ØDF6对牛肉中沙门菌的杀菌效果；
图6 噬菌体ØDF8的透射电镜照片；
噬菌体ØDF6（Salmonella phageØDF6），于2023年10月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No: 63913-B1，保藏机构地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，分类命名为Salmonella phage；
噬菌体ØDF8（Salmonella phageØDF8），于2023年12月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No: 63914-B1，保藏机构地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，分类命名为Salmonella phage。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 噬菌体ØDF6的分离、纯化和观察
a.噬菌体ØDF6的分离与纯化过程
噬菌体由江苏大方生物工程有限公司卞金辉于2021年6月13日分离于江苏省盐城某鸡场。采集该鸡场污水，10000 r/min，10 min离心后上清液用0.22 μm滤器过滤。将沙门菌ATCC13076接种于含5 mL无菌LB液体试管中，37 ℃，180 r/min条件下震荡培养过夜。取100 μL菌液与100 μL上述滤液混合，加入5 mL半固体LB培养基（加热液化后置于55 ℃，10min）中震荡混匀，倒于固体LB培养基上。待半固体培养基凝固后于37 ℃静置条件下倒置培养过夜。次日取出平板观察成斑情况。若出现透明空斑，则挑取空斑放入1mL SM液中静置过夜，次日10000 r/min，10 min离心后上清液用0.22 μm滤器过滤，重复上述双层琼脂平板培养，再挑取单斑，重复三次，当最后一次挑取空斑放入1mL SM液中静置过夜后，10000 r/min，10 min离心，将液体用0.22 μm滤器过滤，所得滤液即为ØDF6噬菌体悬液。
结果：分离出一株沙门菌噬菌体，命名为ØDF6，该噬菌体与沙门菌ATCC13076铺双层琼脂平板可出现透亮的噬菌斑，斑直径大小约为0.4mm（图1）。
b.噬菌体ØDF6的电镜形态观察
使用磷钨酸（PTA，2％）对噬菌体进行负染色。取10μL 实施例1步骤a中的噬菌体悬液转移至铜网格上，静置10 min待其吸附于铜网格上，滤纸去除多余液体，滴加10μL磷钨酸（PTA，2%，w/v），自然风干5 min后使用H7650透射电子显微镜（TEM；Hitachi，Japan）观察噬菌体形态。
经透射电镜观察，噬菌体ØDF6具有一个正多面体的头部，直径约为50nm，和一个可伸缩的尾部，长度约为110nm，属于肌尾噬菌体科，如图2所示。
实施例2 噬菌体ØDF8的分离、纯化和观察
a.噬菌体ØDF8的分离与纯化过程
噬菌体ØDF8由江苏大方生物工程有限公司卞金辉于2022年6月20日分离于湖北黄冈市某鸡场。采集该鸡场污水，10000 r/min，10 min离心后上清液用0.22 μm滤器过滤。将鼠伤寒沙门菌CVCC3757（购自国家兽医微生物菌种保藏中心）接种于含5 mL无菌LB液体试管中，37 ℃，180 r/min条件下震荡培养过夜。取100 μL菌液与100 μL上述滤液混合，加入5mL半固体LB培养基（加热液化后置于55 ℃，10 min）中震荡混匀，倒于固体LB培养基上。待半固体培养基凝固后于37 ℃静置条件下倒置培养过夜。次日取出平板观察成斑情况。若出现透明空斑，则挑取空斑放入1mL SM液中静置过夜，次日10000 r/min，10 min离心后上清液用0.22μm滤器过滤，重复上述双层琼脂平板培养，再挑取单斑，重复三次，当最后一次挑取空斑放入1mL SM液中静置过夜后，10000 r/min，离心10 min，将液体用0.22 μm滤器过滤，所得滤液即为ØDF8噬菌体悬液。
b.噬菌体ØDF8的电镜观察：
使用磷钨酸（PTA，2％）对噬菌体进行负染色。取10μL步骤a中的ØDF8噬菌体悬液转移至铜网格上，静置10 min待其吸附于铜网格上，滤纸去除多余液体，滴加10μL磷钨酸（PTA，2%，w/v），自然风干5 min后使用H7650透射电子显微镜（TEM；Hitachi，Japan）观察噬菌体形态。
经透射电镜观察，噬菌体ØDF8具有一个长型的多面体头部，头部长约为80nm，和一个可伸缩的尾部，长度约为110nm，属于肌尾噬菌体科，如图6所示。
实施例3 噬菌体ØDF6的温度敏感性检测
将实施例1步骤a得到的ØDF6噬菌体悬液用双层琼脂平板法进行复苏，通过稀释将其效价调整为5×108PFU/mL，取1mL初始效价为5×108PFU/mL的噬菌体分别在70℃，80℃，90℃水浴中孵育。每10 min 取出样品，双层琼脂法测滴度。
如图3所示，噬菌体ØDF6在70℃作用1h后，效价保持稳定，80 ℃作用1h后噬菌体效价仅下降了1个数量级，90℃作用1h后，噬菌体活性完全失活。目前已报道的噬菌体一般无法耐受70℃高温，而该噬菌体在70℃高温下仍能保持很好的稳定性，在80 ℃也能保持相当的活力，表明该噬菌体是罕见的耐高温的噬菌体。
实施例4 噬菌体ØDF6对生物被膜清除能力的测定
测定方法：取200μL 沙门菌ATCC13076菌液在96孔板中培养24 h，用 PBS 洗涤3次去除浮游菌和培养基，之后加入200 μL噬菌体ØDF6或ØDF8（107 PFU/mL）悬液或用200μL 10μg/mL 商品化生物被膜清除剂ε-PL培养24 h（对照组不加噬菌体）。噬菌体处理的生物被膜样品用 PBS 缓慢洗涤3次，除去浮游细菌和培养基。之后，向各孔中加入200 μL 95%甲醇溶液，室温固定30 min，然后用 PBS 冲洗3次。加0.1%结晶紫溶液至孔内30 min，每孔用流水漂洗3次，最后每孔加200 μL 30%冰醋酸15 min，使用分光光度计测量 OD600 nm并记录数据。为检测生物被膜中活菌数量，将样品置于含20 mL 0.01M PBS缓冲液的6孔板中，并在 20kHz下超声处理10 min，以促进生物被膜分离。之后，将100 μL溶液稀释至适当浓度，在 LB平板上培养，37℃孵育过夜进行活细胞 (CFU/mL) 计数。
试验结果显示，与对照组相比，噬菌体ØDF6可有效清除沙门菌ATCC13076 在24 h形成的生物被膜（P＜0.005），且对生物被膜的清除效果略优于商品化的细菌生物被膜清除剂ε-PL，而噬菌体ØDF8对生物被膜的清除效果较差（图4中的A）。对生物被膜下活菌数也进行了测定，结果表明，经噬菌体ØDF6处理后，生物被膜下活菌数从 5Log CFU/cm2 下降到2Log CFU/cm2 (P <0.005)，也略优于商品化的细菌生物被膜清除剂ε-PL，而噬菌体ØDF8处理后被膜下活菌数显著高于噬菌体ØDF6处理组（图4中的B）。
实施例5 噬菌体ØDF6对牛奶、生菜和牛肉中沙门菌的杀菌效果评价
本发明调查了3种不同类型的食品，包括牛奶、鲜生菜和新鲜牛肉，所有产品均购自南京超市。将牛肉和生菜切成小块（表面积1.5 cm2，厚度0.5 cm），置于培养皿中；取5 mL牛奶置于 15 mL 试管中。制备污染沙门菌的牛奶、生菜和牛肉（沙门菌ATCC13076的终浓度为 105 CFU/mL 或105 CFU/cm2），将牛奶、生菜和牛肉分别分为2组：(1)污染沙门菌的牛奶、生菜或牛肉+ PBS；(2)污染沙门菌的牛奶、生菜或牛肉 + 噬菌体ØDF6（噬菌体终浓度为106 PFU/mL 或106 PFU/cm2）。2组处理的食品均在37℃下孵育，孵育2 h、4 h、6 h、8 h、12 h后，计算各组细菌数和噬菌体数。
用噬菌体ØDF6处理人工污染沙门菌ATCC13076的牛奶，结果表明，与对照组相比，噬菌体处理的牛奶中活菌数量下降7个数量级（Logs）以上(P <0.001)（图5中的A），提示该噬菌体在液体食品中可高效去除沙门菌。在生菜试验中，噬菌体处理组生菜上沙门菌比对照组下降 2 个数量级（Logs）以上 (P <0.01) （图5中的B）；在牛肉试验中，噬菌体处理组牛肉上沙门菌比对照组下降7个数量级（Logs）以上 (P <0.01) （图5中的C），提示该噬菌体对固体食物中沙门菌也具有较好的杀菌效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种沙门菌噬菌体，其特征在于，该噬菌体于 2023 年 10 月 25 日保藏于广东省微生物菌 种保藏中心，保藏编号为 GDMCC No: 63913-B1。
2.根据权利要求 1 所述的一种沙门菌噬菌体，其特征在于，所述的沙门菌噬菌体在70-80℃条件下保持噬菌体活性。
3.根据权利要求 1 所述的一种沙门菌噬菌体，其特征在于，该噬菌体属于肌尾噬菌体科。
4.权利要求 1-3 任一项所述的沙门菌噬菌体在制备清除沙门菌生物被膜的抑菌剂中的应用。
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