WO2010047216A1 - microRNAの機能阻害法 - Google Patents

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WO2010047216A1
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英夫 伊庭
健 原口
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国立大学法人 東京大学
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    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently inhibiting the function of miRNA and a nucleic acid used therefor.
  • MicroRNA is a small (about 20-24 nucleotides) regulatory non-coding RNA that is expressed endogenously, post-transcription as a component of an RNA-induced silencing complex (RISC) It regulates the expression of many target genes at the level. If a miRNA and its target sequence in the mRNA are completely complementary, the miRNA induces cleavage of the mRNA, causing a rapid decrease in mRNA levels. However, most mammalian miRNAs have only a limited level of complementarity with target sequences located in the 3 'untranslated region (3'-UTR), in translational repression or cytoplasmic processing (bodies) (P-bodies) Causes either rapid deenylation of the target mRNA.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • More than 1/3 of human coding genes are predicted to be miRNA targets (Bartel, DP (2004) Cell, 116, 281-297; Lewis, BP et al. (2005) Cell, 120, 15- 20; Ambros, V. et 2003al. (2003) Rna, 9, 277-279), evidence still showing that miRNAs play an important role in cell defense against differentiation, development, tumorigenesis, and infection. (Li, QJ et al. (2007) Cell, 129, 147-161; Lu, J. et al. (2005) Nature, 435, 834-838; Lecellier, CH et al. (2005) Science, 308, 557-560).
  • reagents are chemically synthesized to be complementary to the mature miRNA, are resistant to cellular nucleases, and probably function as uncleaved substrates for RISC. Since they are designed to be introduced into cells by transfection, the inhibitory activity is necessarily transient.
  • microRNA sponge a DNA vector expressing the miRNA competitive inhibitor “microRNA sponge” has been reported (Ebert, M.S. et al. (2007) Nat Methods, 4, 721-726). Transient expression of microRNA sponge vectors efficiently inhibits miRNA function, but even if introduced by DNA-based vectors, the inhibitory effect is not maintained for more than a month. Therefore, it has been desired to establish a method for inhibiting miRNA over a longer period.
  • the present invention relates to an miRNA inhibitor for efficiently inhibiting miRNA, a vector for expressing the inhibitor in a cell, a method for constructing the vector, a method for inhibiting miRNA using the inhibitor or the vector, etc. About.
  • RNA having a miRNA binding sequence (MBS) bound to both strands at one end of double-stranded RNA exhibits strong miRNA inhibitory activity (FIGS. 1 and 2).
  • MBS miRNA binding sequence
  • RNA-inhibiting RNAs as linear single-stranded RNAs by closing one end of these RNA structures including the double-stranded part (for example, a loop structure). This allowed the RNA to be expressed from a single transcription unit.
  • a cassette containing the target MBS is inserted into the expression unit containing this constant region.
  • the present invention relates to an miRNA inhibitor for efficiently inhibiting miRNA, a vector for expressing the inhibitor in a cell, a method for constructing the vector, and a method for inhibiting miRNA using the inhibitor or the vector More specifically, [1] An miRNA-inhibiting complex comprising RNA or an analog thereof, wherein at least one strand comprising a double-stranded structure and comprising an miRNA binding sequence is present at least at one end of the double-stranded structure.
  • Bound, miRNA-inhibiting complex [2] Including a second multi-strand structure, one strand containing a miRNA binding sequence is bound to each of the two strands at one end, and sandwiched between the double-strand structure and the multi-strand structure The complex according to [1], wherein the other end of each of the chains is bonded to two chains of the second multi-stranded structure, [3] The complex according to [2], wherein the multiple strand is a double strand or a four strand.
  • Structure II is a hairpin, a complex comprising one miRNA binding sequence each in a and b of the structure; [10] RNA constituting the complex of any one of [1] to [9] or an analog thereof, [11] a nucleic acid encoding the RNA according to [10], [12] The nucleic acid according to [11], which is bound downstream of the promoter, [13] The nucleic acid according to [12], wherein the promoter is a polymerase III promoter, [14] The nucleic acid according to [12] or [13], which is mounted in a retroviral vector, [15] The method for producing the nucleic acid according to [12], wherein at least one miRNA binding is performed between a pair of nucleic acids encoding a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure downstream of the promoter.
  • the present invention also provides [1] An miRNA-inhibiting complex comprising RNA or an analog thereof, wherein at least one strand comprising a double-stranded structure and comprising an miRNA binding sequence is present at least at one end of the double-stranded structure.
  • Bound, miRNA-inhibiting complex [2] a second double-stranded structure, wherein one strand containing the miRNA binding sequence is bound to each of the two strands at one end, and the two double-stranded structures are sandwiched between the two double-stranded structures;
  • the complex according to [3] composed of linear single-stranded RNA or an analog thereof, [5]
  • [6] The complex according to [5], comprising two miRNA binding sequences, [7] RNA constituting the complex of any one of [1] to [6] or an analog thereof, [8] a nucleic acid encoding the
  • nucleic acid encoding the miRNA-binding sequence includes at least two miRNA-binding sequences and a sequence that forms a stem loop therebetween.
  • the present invention provides an miRNA inhibitor that can efficiently and specifically inhibit the function of miRNA.
  • the miRNA inhibitor of the present invention can stably inhibit miRNA for a long period of time, for example, by incorporating its expression unit into a retroviral vector. This allows for in vivo assays such as knockdown mice. Furthermore, since the U6 promoter system regulated by Cre-loxP has already been established, it is possible to perform miRNA knockdown in a time-specific and tissue-specific manner using this. As illustrated in FIG. 6, the miRNA-inhibiting RNA expression cassette of the present invention can be easily constructed, and thus an RNA library for comprehensive analysis of miRNA can be constructed. Thus, the present invention provides a very useful tool for miRNA research.
  • RNA-inhibiting RNA can be used to identify target mRNA candidates by exhaustively examining the expressed mRNA in cultured cells based on the presence or absence of expression of a specific miRNA-inhibiting RNA.
  • In vivo genes are also expected to be a significant proportion of miRNA targets, and miRNAs play an important role in a variety of settings, including differentiation, development, tumorigenesis, and cellular defense against infections.
  • the method of the present invention is useful for elucidating gene regulatory mechanisms and controlling the functions of miRNAs involved in gene therapy for tumors and infectious diseases.
  • I represents the first double-stranded structure
  • II represents the second double-stranded structure.
  • a and b each contain at least one MBS.
  • the end of the second double-stranded structure (the right end in the figure) may or may not form a loop.
  • the decoy RNA becomes a single strand.
  • a and b may contain a plurality of MBS, and a and b may not be completely in a single-stranded state but may partially form a double-stranded structure.
  • a plurality of the units may be connected in tandem (for example, # 15 and # 16 of panel A).
  • D A structure in which the end of the second double-stranded structure forms a loop in the unit shown in panel (C).
  • the number of bases contained in the loop is not particularly limited, and may be 0 to several, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 bases.
  • the vertical line of the double-stranded part of panels (A), (C), (D) represents that it has a double-stranded structure, and the number of bases is limited to the number of vertical lines Not what you want. It is a figure which shows that the MBS sequence of prototype decoy RNA influences an inhibitory effect significantly. Relative GFP expression was determined as indicated in the description of FIG. 1B. It is a figure which shows the comparison of the effect of the length of the linker sequence of a decoy RNA. (A) Structure of decoy RNA # 22 to # 26.
  • the curved arrow in black represents MBS (5 ' ⁇ 3'). ⁇ indicates a linker sequence.
  • Bold black curved arrows represent MBS.
  • A A diagram showing a typical structure of the miRNA-inhibiting RNA of the present invention. MBS represents the miRNA binding site.
  • Lentiviral vectors expressing these miRNA-inhibiting RNAs were introduced into HeLaS3 cells carrying both miR-140-5p reporter and miR140-5p / 140-3p vectors, and GFP expression levels were increased 8-12 days after introduction. Were determined. The expression level was normalized to the expression level of HeLaS3 cells carrying only the miR-140-5p reporter and expressed as mean ⁇ SEM.
  • Relative GFP expression levels were normalized to those of HeLaS3 cells carrying only the miR-140-3p reporter.
  • E Analysis of intracellular localization of miRNA-inhibiting RNA.
  • Y4 small plasmoplasm RNA Y4 scRNA, 93nt
  • ACA1 small nucleolar RNA ACA1 snoRNA, 130nt
  • Y4 scRNA and ACA1 snoRNA PA-1 were shown as cell fraction markers.
  • Un, 5p, 3p, N, and C represent uninfected cells, TuD-miR140-5p-infected cells, TuD-miR140-3p-infected cells, nuclear fraction, and cytoplasm fraction, respectively. It is a figure which shows the inhibitory effect with respect to endogenous miR21 activity of a miRNA inhibition complex.
  • RNA expression plasmid vector or LNA / DNA antisense oligonucleotide RNA antisense oligonucleotide
  • Renilla luciferase miR-21 reporter white bar
  • non-targeting control Renilla luciferase reporter black bar
  • Firefly for transfection control PA-1 cells (A) or HCT-116 (B) were transiently transfected with luciferase reporter. After dual luciferase assay, expression levels were normalized to those of PA-1 cells or HCT-116 cells transfected with TuD-NC vector and expressed as mean ⁇ SEM.
  • PA-1 cells were transfected with a miRNA-inhibiting RNA expression plasmid vector, and total protein was prepared 72 hours after transfection.
  • PDCD4 (top) and ⁇ -actin loading (control) (bottom) were determined by Western blot.
  • U6 snRNA was used as an endogenous control.
  • E The expression levels of pre-miR21 and mature-miR21 in cells treated in the same manner as in (B) were measured by northern blot.
  • Y4 scRNA was shown as a loading control. It is a figure which shows the comparison of the effect of a miRNA inhibition RNA expression plasmid vector, a CMV (sponge) expression plasmid vector, an H1-Antagomir expression plasmid vector, a miRNA (eraser) expression plasmid vector, and a LNA / DNA antisense oligonucleotide. Dual luciferase assay was performed 72 hours after transfection using HCT-116 cells.
  • Expression levels were normalized to those of HCT-116 cells transfected with the non-targeting control Renilla luciferase reporter and expressed as mean ⁇ SEM. It is a figure which shows the analysis of the miRNA inhibition RNA expression level by a Northern blot.
  • the expression levels of TuD-miR-21-4ntin and TuD-miR-21-pf were analyzed by Northern blotting in PA-1 cells (A) and HCT-116 cells (B) transfected with miRNA-inhibiting RNA expression vectors, respectively.
  • the mobility of Y4 scRNA and ACA1 snoRNA is indicated by triangles. Y4 scRNA was shown as a loading control.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the biological activity induced
  • A Analysis of cell proliferation activity of PA-1 cells by introduction of TuD-miR21. The miRNA-inhibiting RNA expression vector was introduced into PA-1 cells, and the number of cells was analyzed for 4 days after the introduction of the vector. Analysis of apoptosis induction in PA-1 cells by introduction of (B) TuD-miR21. The miRNA-inhibiting RNA expression vector was introduced into PA-1 cells, and the activities of caspase 3 and caspase 7 were analyzed 3 days after the introduction of the vector.
  • This activity was normalized with respect to the number of PA-1 cells into which each miRNA-inhibiting RNA expression vector was introduced, and expressed as mean ⁇ SEM. It is a figure which shows the inhibitory effect to the family of target miRNA of miRNA inhibitory RNA.
  • A The sequences of miR-16, 195, 497 and their homology were shown. The sequence indicated by the bracket is the seed site, and the black bar indicates the homologous site.
  • B The binding of MBS and miR-16 of TuD-miR-16-4ntin, TuD-miR-195-4ntin and TuD-miR497-4ntin was shown. Black dots indicate GU bonds.
  • C miRNA-inhibiting RNA expression plasmid vector together with Renilla luciferase miR-16 reporter (white bar) or non-targeting control Renilla luciferase reporter (black bar) and Firefly luciferase reporter for transfection control 116 cells were transfected and dual luciferase assay was performed.
  • MBS represents a miRNA binding site that is completely or partially complementary to miR140-3p.
  • FIG. 14 shows the structure and sequence of decoy RNA for miR140-3p (continuation of Fig. 13). It is a figure which shows the structure of the retroviral vector used for construction of the highly sensitive assay system of miR-140-3p (TM) or miR-140-5p (*).
  • TM highly sensitive assay system of miR-140-3p
  • miR-140-5p miR-140-5p
  • U3, R and U5 each represent the corresponding sequence from MoMLV long terminal repeat.
  • Retroviral vector packaging signal
  • R the R sequence of the lentivirus.
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of establishing a highly sensitive assay system for miR140-3p activity and introducing miRNA-inhibiting RNA (Panels A to E). FACS analysis of GFP expression level (autofluorescence) in HeLaS3 cells (A), FACS analysis of GFP expression level in HeLaS3 cells carrying only miR140-3p reporter (B), and miR140-3p reporter and miR140-5p / 140-3p FACS analysis of GFP expression levels in HeLaS3 cells carrying both expression vectors (C).
  • FIG. 1 A schematic diagram of Renilla luciferase reporter pGL4.74 without 4 insertion.
  • C Structure of a Renilla luciferase reporter pGL4.74-miR21T ⁇ ⁇ ⁇ with a 22 bp insertion completely complementary to mature miR-21 immediately downstream of the Renilla luciferase gene.
  • D Structure of Renilla luciferase reporter pGL4.74-miR16T with a 22 bp insertion that is completely complementary to mature miR-16 immediately downstream of the Renilla luciferase gene. It is a figure which shows the structure and arrangement
  • RNA-inhibiting RNA expression plasmid vector or LNA / DNA antisense oligonucleotide Renilla luciferase miR-21 reporter (white bar) or non-targeting control Renilla luciferase reporter (black bar) ⁇
  • Firefly for transfection control SW480 cells A
  • HT29 cells B
  • TIG-3 / E / TERT cells C
  • 3Y1 cells D
  • the result of comparing the miRNA inhibitory effect of the miRNA-inhibiting RNA of the present invention with normal LNA, PNA, and 2′-O-methylated oligo is shown.
  • the miRNA inhibitory effect of the miRNA inhibitory RNA of this invention is compared with miRIDIAN Inhibior et al. Transcription of miRNA-inhibiting RNA of the present invention using guanine quadruplex (G-quadruplex) and its effect.
  • G-quadruplex guanine quadruplex
  • FIG. 1 Schematic diagram of the structures of TuD-miR21-4ntin, TuD-miR21-4ntin-GqL111, and TuD-miR21-4ntin-GqL333.
  • C mi miRNA inhibitory activity by each RNA. The effect which the structure of miRNA inhibitory RNA exerts is shown.
  • FIG. 1 Schematic diagram of the structures of TuD-miR21-4ntin, TuD-miR21-4ntin-1MBS-1, and TuD-miR21-4ntin-1MBS-2. Dashed arrows indicate MBS reverse sequence in 1MBS-1 and TuD-NC (control sequence) in 1MBS-2.
  • B miRNA inhibitory activity by each RNA.
  • (A) shows the structure of an expression cassette that transcribes the miRNA-inhibiting RNA of the present invention from the human 7SK promoter. Since the transcription of the human 7SK promoter is enhanced by the sequence immediately below the transcription start point of 7SK RNA (especially the 1st to 8th nucleotides), the 1st to 13th nucleotide of 7SK RNA is replaced with the stem portion of the inhibitory RNA of the present invention. Incorporated.
  • A-D An expression plasmid for miRNA-inhibiting RNA of the present invention targeting miR200 was constructed, and the effect of miRNA-inhibiting RNA expressed from two types of promoters using a luciferase reporter assay system was shown.
  • E Epithelial-mesenchymal transition by DTuD-miR200c-4ntin.
  • a cell population that stably expresses miRNA-inhibiting RNA was prepared by introducing a miRNA-inhibiting RNA expression lentiviral vector into HCT-116 cells, and total protein was prepared 15 days after the introduction.
  • the present invention relates to a miRNA-inhibiting complex that can efficiently and specifically inhibit miRNA.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention comprises a double-stranded or multi-stranded structure, and at least one strand containing a miRNA-binding sequence (MBS) binds to two strands at least one end of the double-stranded or multi-stranded structure. is doing.
  • MFS miRNA-binding sequence
  • this double-stranded or multi-stranded structure is referred to as the “first” double-stranded structure so that it can be distinguished from the additional double-stranded or multi-stranded structure that can be included in the complex of the present invention. (See below).
  • the complex of the present invention may or may not be single-stranded (ie, a single molecule linked by a covalent bond), and is composed of, for example, a single strand, a double strand, or a plurality of more strands.
  • the present invention includes a complex composed of double-stranded RNA in which RNA strands containing MBS are bound to two strands at one end of a double-stranded structure one by one.
  • one RNA strand containing at least one MBS may be bound to two strands at one end of a double-stranded structure.
  • two strands at one end of the double-stranded structure are connected by an RNA strand containing MBS (for example, FIG.
  • the RNA connecting two strands of a double-stranded structure contains at least one MBS, but may contain, for example, two, three, or more (for example, FIG. 2A).
  • Double-stranded structures include stem loops or hairpins. That is, the double-stranded structure may be a double-stranded structure contained in a stem loop or hairpin.
  • the miRNA-inhibiting complex may be a structure having at least one RNA or an analog thereof having a double-stranded structure.
  • the complex preferably comprises one or two molecules comprising RNA or an analog thereof.
  • the miRNA binding sequence refers to a sequence that binds to miRNA.
  • MBS contains at least a portion complementary to miRNA so that it can bind to miRNA.
  • MBS may or may not be a completely complementary sequence to miRNA.
  • MBS may be a sequence of natural RNA targeted by miRNA.
  • MBS is, for example, at least 10 bases for miRNA, such as 11 bases or more, 12 bases or more, 13 bases or more, 14 bases or more, 15 bases or more, 16 bases or more, 17 bases or more, 18 bases or more, 19 bases or more, Complementary bases of 20 bases or more, 21 bases or more, 22 bases or more, 23 bases or more, or 24 bases or more are included consecutively or discontinuously.
  • the complementary bases are continuous or have a gap of 3 or less, 2 or less, preferably 1 site.
  • the gap may be MBS-side and / or miRNA-side unpairing (bulge), or one gap may have bulge bases on only one strand, and both strands are unpaired. It may have a paired base. Preferably, it is designed to include an unpaired base at least on the MBS side.
  • the number of bulge and mismatch bases is, for example, 6 bases or less, preferably 5 bases or less, 4 bases or less, 3 bases or less, 2 bases or less, or 1 base per strand, per bulge or mismatch, respectively.
  • MBS capable of forming a bulge showed a higher miRNA inhibitory effect than MBS consisting of a completely complementary sequence (Example 4). Therefore, in order to obtain a higher miRNA inhibitory effect, it is preferable to design MBS so as to form a bulge.
  • the 10th and / or 11th base from the 3 'end of MBS is not complementary to miRNA, or contains an extra base between 10th and 11th (or in miRNA
  • the 10th and / or 11th base from the 5 'end of the target sequence is not a complementary base to MBS, or is unpaired between the 10th and 11th nucleotides MBS containing a combined base is less susceptible to degradation and can be expected to have high activity.
  • the MBS may be designed so that bases including the 10th and 11th positions from the 5 ′ end of miRNA are unpaired, for example, 9th to 11th, 10th to 12th, or 9th to 12th
  • the MBS may be designed so that is unpaired. There is no unpaired base on the miRNA side, but on the MBS side, between the 10th and 11th positions from the 3 ′ end (or 5 ′ of the target sequence in miRNA (sequence that hybridizes with MBS)). An unpaired base may be present between the 10th and 11th sites from the end).
  • the unpaired base may be present on the miRNA side and / or MBS side, but is preferably present at least on the MBS side.
  • the number of unpaired nucleotides in each strand can be adjusted as appropriate, and is, for example, 1 to 6 nucleotides, preferably 1 to 5 nucleotides, more preferably 3 to 5, for example 3, 4 or 5 It is a nucleotide.
  • miRNA target recognition it is important for miRNA target recognition to match the 2-7th or 3-8th base (referred to as the seed region) from the 5 'end of miRNA (Jackson AL et al., RNA 12 (7): 1179-1187, 2006; Lewis BP et al., Cell 120: 15-20, 2005; Brennecke et al. PLoS BIOLOGY 3, 0404-0418, 2005; Lewis et al. Cell 115, 787-798, 2003; Kiriakidou et al. Genes & Development 18, 1165-1178, 2004).
  • the miRNA-inhibiting RNA of the present invention has been shown to be able to effectively inhibit miRNA even if it has MBS that only matches the seed region and has only a low complementarity to other regions. (Example 6, FIG. 12).
  • MBS MBS in the present invention
  • those in which the seed region of miRNA (bases 2 to 7 and / or 3 to 8 from the 5 ′ end of miRNA) are completely complementary are preferable.
  • G: U pairs (U: G pairs) may also be considered complementary, but preferably only G: C (C: G) and A: U (U: A) are considered complementary.
  • the MBS includes a miRNA seed region (2-7th and / or 3-8th base from the 5 ′ end of the miRNA) that is completely complementary and at least 8 bases relative to the miRNA. More preferably, those containing 9 bases, more preferably 10 bases of complementary bases in succession are preferred. Furthermore, the MBS in the present invention preferably contains a total of 11 bases or more, more preferably 12 bases or more, and more preferably 13 bases or more complementary bases for miRNA.
  • MBS is preferably a sequence that hybridizes with a miRNA sequence under physiological conditions.
  • Physiological conditions are, for example, 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0, 37 ° C. More preferably, the MBS is a sequence that hybridizes with the miRNA sequence under stringent conditions.
  • the stringent conditions are, for example, 1 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC is 150 mM NaCl, 15 mM sodium ⁇ citrate, pH 7.0) or 0.5 ⁇ SSC at 42 ° C, more preferably 1 ⁇ SSC or 0.5 ⁇ SSC. , 45 ° C., more preferably 1 ⁇ SSC or 0.5 ⁇ SSC, 50 ° C.
  • Hybridization for example, either RNA containing miRNA sequence or RNA containing MBS is labeled, the other is immobilized on a membrane, and both are hybridized.
  • Hybridization conditions are, for example, 5xSSC, 7% (W / V) SDS, 100 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 5x Denhardt's solution (1x Denhardt solution is 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% bovine serum albumin, and 0.2% For example, at 37 ° C., 45 ° C., or 50 ° C.
  • the nucleic acid After incubating for a sufficient period of time (eg, 3, 4, 5 or 6 hours or more), washing is performed under the above conditions, and by detecting whether the labeled nucleic acid is hybridized, the nucleic acid is hybridized under the condition. Or not.
  • a sufficient period of time eg, 3, 4, 5 or 6 hours or more
  • MBS preferably exhibits high homology with the complementary sequence of the miRNA sequence.
  • High homology means, for example, 70% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or higher, 86% or higher, 87% or higher, 88% or higher, 89% or higher, 90% or higher, 93% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, or 99% or higher It is a base sequence having sex. The identity of the base sequence can be determined using, for example, the BLAST program (Altschul, S. F. et al., J.
  • MBS preferably consists of a sequence in which one or several bases are inserted, substituted, and / or deleted from the complementary sequence of the miRNA sequence.
  • MBS is within 8 bases, within 7 bases, within 6 bases, within 5 bases, within 4 bases, within 3 bases, within 2 bases, or insertion, substitution of 1 base with respect to the complementary sequence of miRNA sequence, And / or consisting of sequences with deletions.
  • the MBS has an insertion of within 8 bases, within 7 bases, within 6 bases, within 5 bases, within 4 bases, within 3 bases, within 2 bases, or 1 base relative to the complementary sequence of the miRNA sequence. Consists of an array.
  • MBS has a higher miRNA inhibitory activity in a sequence having a mismatch than in a sequence completely complementary to the miRNA sequence. This is considered to be due to the fact that MBS is completely complementary and is cleaved by RISC containing miRNA, thereby reducing the expression level of miRNA-inhibiting RNA.
  • MBS when MBS hybridizes with miRNA, the 10th and / or 11th bases from the 3 ′ end of MBS are unpaired (or the 5 ′ end of the target sequence on the miRNA side that hybridizes with MBS) MBS designed to contain unpaired bases between the 10th and 11th nucleotides. Can be expected to have high activity.
  • Such unpairing may be, for example, the bulge on the MBS side, and the base that forms the bulge is 1 to 6 bases, preferably 1 to 5 bases, more preferably 3 to 5 bases (eg 3, 4 or 5). Base).
  • MBS may consist of RNA, or may contain a nucleic acid salt or consist of a nucleic acid salt (Example 7).
  • an increase in miRNA inhibitory effect can be expected by forming a nucleic acid salt at a site where MBS is cleaved (such as the 10th and / or 11th base from the 3 ′ end of MBS) so that cleavage does not occur.
  • a nucleic acid having a backbone or sugar such as phosphothioate or 2′-O-methyl (Krutzfeldt, J. et al., Nucleic Acids Res. 35: 2885-2892; Davis, S. et al ., 2006, Nucleic Acids Res. 34: 2294-2304).
  • the miRNA targeted by the miRNA inhibition complex of the present invention is not particularly limited. As long as it has an miRNA structure, it can be applied to any species such as plants, nematodes, vertebrates and the like.
  • the number of miRNA sequences is very well known in many organisms, including humans, mice, chickens, zebrafish, and Arabidopsis (see the miRBase :: Sequences web page: microrna.sanger.ac.uk / sequences /).
  • mammals such as mice, rats, goats, primates including monkeys, and human miRNAs can be targeted.
  • miR21 (Lagos-Quintana M et al., Science.
  • miR16 (Lagos-Quintana M et al., Science. 294: 853-858, 2001; Mourelatos Z et al., Genes Dev. 16: 720-728, 2002; Lim LP et al., Science. 299 : 1540, 2003; Calin GA et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 15524-15529, 2002; Michael MZ et al., Mol Cancer Res. 1: 882-891, 2003), miR497 (Bentwich I et al., Nat Genet. 37: 766-770, 2005; Landgraf P et al., Cell. 129: 1401-1414, 2007), etc. No.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention further includes a second multiple strand structure in addition to the first multiple strand structure, and an RNA strand containing MBS is present on two strands at one end of the first multiple strand structure.
  • Each of the RNA strands has a structure that binds one by one, and the other end of the RNA strand is sandwiched between the first multiple strand structure and the second multiple strand structure. Relates to miRNA-inhibiting complexes bound to two strands at one end of each.
  • the multi-stranded structure may be double stranded, or may be four stranded like G-quadruplex (G-quadruplex).
  • the first multi-stranded structure is double-stranded and the second multi-stranded structure is double-stranded or four-stranded.
  • the present invention further includes a second double-stranded structure in addition to the first double-stranded structure, and the two strands at the ends to which MBS is bound in the first double-stranded structure have MBS.
  • Each of the contained RNA strands is bonded to each other, and the other end of each RNA strand is inserted between the first double-stranded structure and the second double-stranded structure,
  • the present invention relates to a miRNA-inhibiting complex that binds to each of the two strands of the second double-stranded structure.
  • the RNA complex has, for example, at least two double-stranded structures, and each of the four RNA strands constituting the two double-stranded structures contains MBS without interposing any remaining three strands. It has a structure that binds to RNA.
  • the miRNA-inhibiting complex can be explained more simply by binding to each strand of the two double-stranded structures so that the two RNA strands containing MBS are sandwiched between the two double-stranded structures.
  • MiRNA inhibition complex (FIG. 2 (C)). That is, an RNA complex having the structure of FIG.
  • RNA strands a and b are sandwiched between double-stranded structures I and II, and RNAs containing one or more MBS in each of a and b are included in the present invention. Since the two RNA strands containing MBS are bound to each pair of double-stranded structures, the RNA strands are in opposite directions (Fig. 2, # 12 to # 16). . Thus, by adding MBS to each double-stranded chain, it is possible to exhibit higher miRNA inhibitory activity.
  • Two RNA strands including MBS present so as to be sandwiched between two double-stranded structures each contain one or more MBS. These MBSs may be the same sequence or different. Moreover, the same miRNA may be targeted and the sequence couple
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention may contain a total of two MBS, and the two MBS may be the same sequence or a sequence that binds to the same miRNA.
  • Each pair of duplexes included in the miRNA inhibition complex of the present invention may be a separate RNA molecule as described above, or one or both ends of the duplex are connected, It may be linear or cyclic.
  • linear is a term for a ring and only means that it has a terminal, and naturally does not mean that a secondary structure is not formed.
  • the miRNA inhibition complex composed of linear single-stranded RNA can be prepared, for example, by a single RNA synthesis, or can be expressed from one expression unit using an expression vector or the like.
  • two chains at one end of the second double-stranded structure can be connected by a loop to form a single strand as a whole.
  • One or more MBS may be included in the sequence connecting the double strands (FIG. 2, # 2, # 11, # 13, # 14, # 16).
  • the duplexes can be joined by short loops.
  • the double strand can be combined with a sequence of 1 to 10 bases, preferably 1 to 8 bases, 2 to 6 bases, 3 to 5 bases, for example 4 bases.
  • the arrangement is not particularly limited.
  • An example is 5′-GUCA-3 ′ (FIG. 6A).
  • the present invention relates to RNA having the structure of FIG. 2 (A) # 13 or FIG. 2 (D), in which RNA strands a and b are sandwiched between double-stranded structures I and II, II forms a hairpin (or stem loop), and a and b each contain RNA containing one or more MBS.
  • the double-stranded structure contained in the miRNA-inhibiting complex of the present invention is not particularly limited in sequence, but preferably has a length of 4 base pairs or more.
  • at least one of the double-stranded structures included in the RNA complex of the present invention (that is, the first double-stranded structure) has an important function for nuclear export of the RNA complex.
  • the chain length of this double strand may be, for example, 15 to 50 base pairs, and preferably 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, or 45 bases, or any one or more thereof, 50, 49, 48 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23 , 22, 21, 20, 19, or 18 bases, or any of them.
  • the length of the base pair of the double-stranded structure is, for example, 15-30, preferably 16-28, preferably 17-25, preferably 17-24, such as 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, or 24.
  • dsRNA exceeding 20 bp can be a potential target for cleavage by Dicer in the cytoplasm, so it is included in the complex of the present invention to avoid it.
  • the double-stranded structure can be 20 bp or less, such as 19 bp or less, or 18 bp or less.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention contains a second or more double-stranded structure
  • these double-stranded structures may be shorter than the length of the first double-stranded structure, for example, in order to make the entire miRNA inhibition complex compact.
  • the chain length of each double strand may be adjusted as appropriate, and is 4 bp to 20 bp, for example, and may be 5 bp to 15 bp, 5 bp to 12 bp, 5 bp to 10 bp, 6 bp to 9 bp, or 7 bp to 8 bp, for example.
  • the base pair sequence forming the double-stranded structure can be appropriately designed so that the duplex can be specifically and stably formed in the miRNA inhibition complex.
  • sequences in which several base sequences are repeated in tandem such as double base repeat sequences and 3-4 base repeat sequences.
  • the GC content of the double-stranded portion may be adjusted as appropriate, for example, 12% to 85%, preferably 15% to 80%, 20% to 75%, 25% to 73%, 32% to 72%, 35% ⁇ 70%, 37% -68%, or 40% -65%.
  • the stem I and stem II sequences shown in FIG. 6A can be exemplified, but are not limited thereto.
  • the four strands include G-quadruplex, and specifically, a sequence of GGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGG can be used.
  • the sequence of the loop can be appropriately selected. For example, all three loops can be made into one base (for example, M (A or C)), or both can be made into three bases (SEQ ID NOs: 167, 168, etc.) ).
  • the MBS and the double-stranded structure may be linked directly or via other sequences.
  • MBS can be attached to the end of a double stranded structure via a suitable linker or spacer sequence.
  • a linker also referred to as a spacer
  • a linker or spacer sequence between the MBS sequence and the double-stranded structure may increase accessibility to miRNAs where MBS is present in RISC. The length of the linker or spacer may be appropriately adjusted.
  • 1 to 10 bases preferably 1 to 9 bases, 1 to 8 bases, 1 to 7 bases, 1 to 6 bases, 1 to 5 bases, 1 to 4 Base, or 1-3 bases.
  • the sequence of the linker or spacer is not particularly limited, and can be, for example, a sequence consisting of A and / or C, or a sequence containing A and / or C more than other bases.
  • it is preferable to consider that the linker or spacer sequence does not form a stable base pair with the opposing linker or spacer sequence or MBS.
  • AAC, CAA, ACC, CCA, or a sequence including any of them can be exemplified.
  • a pair of linker or spacer sequences added to both sides of MBS may be an inverted sequence (mirror image sequence).
  • AAC can be added to the 5 'side of the MBS and CAA can be added to the 3' side.
  • the nucleic acid constituting the miRNA inhibition complex of the present invention may be modified.
  • the nucleotides making up the nucleic acid may be natural nucleotides, modified nucleotides, artificial nucleotides, or combinations thereof.
  • the nucleic acid contained in the miRNA-inhibiting complex of the present invention may be composed of RNA, may be an RNA / DNA chimera, or may contain other nucleic acid analogs, including any combination thereof. It's okay.
  • Nucleic acids include not only those linked by phosphodiester bonds but also those having amide bonds or other backbones (such as peptide nucleic acids (PNA)).
  • Nucleic acid analogs include, for example, natural and artificial nucleic acids, and may be nucleic acid derivatives, nucleic acid analogs, nucleic acid derivatives, and the like. Such nucleic acid analogs are well known in the art and include, but are not limited to, phosphorothioates, phosphoramidates, methylphosphonates, chiral methylphosphonates, 2'-O-methylribonucleotides, peptide nucleic acids (PNA), and the like. Not.
  • the backbone of PNA may include a backbone consisting of aminoethylglycine, polyamide, polyethyl, polythioamide, polysulfinamide, polysulfonamide, or a combination thereof (Krutzfeldt, J. et al., Nucleic Acids Res. 35: 2885-2892; Davis, S. et al., 2006, Nucleic Acids Res. 34: 2294-2304; Butla, A. et al., 2003), Nucleic Acids Res. 31: 4973-4980; Hutvagner, G. et al., 2004, PLoS Biol. 2: E98; Chan, JA et al., 2005, Cancer Res. 65: 6029-6033; Esau, C. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 52361- 52365; Esau, C. et al., 2006, Cell Metab. 3: 87-98).
  • Nucleic acid modification can be performed to inhibit degradation by endonucleases.
  • Particularly preferred modifications include 2 'or 3' sugar modifications such as 2'-O-methyl (2'-O-Me) ylated nucleotides or 2'-deoxynucleotides, or 2'-fluoro, difluorotoluyl, 5-Me -2'-pyrimidine, 5-allylamino-pyrimidine, 2'-O-methoxyethyl (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropyl (2'-O-AP), 2'-ON-methylacetamide (2'-O-NMA), 2'-O-dimethylaminoethyloxyethyl (2'-DMAEOE), 2'-O-dimethylaminoethyl (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimethylamino Propyl (2'-O-AP), 2'-hydroxy nucleotide, phosphorothio
  • DFT difluorotoluyl modification, for example, substitution of 2,4-difluorotoluyluracil or guanidine to inosine may be performed.
  • the nucleic acid may contain a conjugate at the end.
  • the conjugate include lipophilic substances, terpenes, protein binding substances, vitamins, carbohydrates, retinoids, peptides, and the like.
  • examples include cholesterol, dU-cholesterol, alkyl chains, aryl groups, heterocyclic complexes, and modified sugars (D-ribose, deoxyribose, glucose, etc.).
  • the conjugate and the nucleic acid can be bound via, for example, an arbitrary linker, and specific examples include a pyrrolidine linker, serinol linker, aminooxy, or hydroxyprolinol linker.
  • a cell permeation signal can be appropriately added to the nucleic acid.
  • many cell-permeable peptides for introducing nucleic acids into cells are known (WO2008 / 082885).
  • arginine-rich peptides such as polyarginine, such as HIV-1 Tat (48-60), HIV-1 (Rev (34-50), FHV Coat (35-49), BMV Gag ( 7-25), HTLV-II Rex (4-16), a partial peptide thereof, or an inverso or retro-inverso thereof.
  • amino acid d form may be used as appropriate.
  • a cell-penetrating peptide or the like may be bound to a nucleic acid by a known linker.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention can be designed to be composed of linear single-stranded nucleic acids (FIG. 2).
  • the present invention is particularly concentrated on one side (right side in FIG. 2) of the double-stranded structure (stem I in FIG. 2) where all MBS is present, and each strand of the double-stranded structure is closed on that side.
  • a complex in which both ends of a single-stranded RNA are on opposite sides of the double-stranded structure (FIG. 2).
  • the sequence containing MBS may contain additional multi-stranded (eg, double or quadruplex) structures (eg, stems II and III in FIG. 2).
  • the length of the single-stranded RNA may be determined as appropriate, for example, within 500 bases, preferably within 450 bases, within 420 bases, within 400 bases, within 380 bases, within 360 bases, within 340 bases, within 320 bases, within 300 bases, 300 bases Within base, within 280 base, within 260 base, within 240 base, within 220 base, within 200 base, within 180 base, within 160 base, within 140 base, within 120 base, within 100 base, or within 80 base.
  • the length of a single-stranded RNA forming a complex having two double-stranded structures and two MBS is, for example, 60 to 300 bases, preferably 70 to 250 bases, 80 to 200 bases, 90 to 180 bases, Or 100 to 150 bases.
  • the first double-stranded structure (double-stranded structure close to both ends of the single-stranded RNA) is, for example, 15-30 bp, preferably 16-28 bp, preferably 17-25 bp, preferably 17-24 bp, such as 17 bp, 18 bp.
  • the second double stranded structure (an additional double stranded structure included in sequences containing MBS) to make the whole compact
  • the length may be shorter than the length of the first double-stranded structure, for example, 4 bp to 20 bp, such as 5 bp to 15 bp, 5 bp to 12 bp, 5 bp to 10 bp, 6 bp to 9 bp, or 7 bp to 8 bp.
  • the present invention also relates to RNA constituting the miRNA-inhibiting complex of the present invention (herein, RNA includes natural RNA and nucleic acid analogs), and nucleic acid (DNA or RNA) encoding the RNA.
  • RNA includes natural RNA and nucleic acid analogs
  • DNA or RNA nucleic acid
  • the miRNA-inhibiting RNA complex is composed of one molecule of RNA, by annealing the RNA within the molecule, or when composed of two or more RNA molecules, annealing those RNAs.
  • the complex of the present invention can be constructed.
  • These RNAs can be appropriately synthesized.
  • desired RNA can be produced by chemical synthesis of RNA.
  • RNA can be expressed by an expression vector that expresses the RNA.
  • the expression vector is not particularly limited, and for example, a desired expression vector that is expressed in bacteria such as E. coli, eukaryotic cells such as yeast, insect cells, plant cells, or animal cells can be used.
  • a vector that is expressed in cells of higher eukaryotes such as plants, insects, animals and the like to express RNA in those cells and inhibit the function of miRNA.
  • the promoter for transcription of RNA is not particularly limited, and Pol I promoter, Pol II promoter, Pol III promoter, bacteriophage promoter, and the like can be used.
  • RNA polymerases and promoters of T4 phage and T7 phage can be exemplified.
  • the polymerase II (Pol II) promoter include CMV promoter and ⁇ -globin promoter.
  • a polymerase III (Pol III) promoter that can be expressed in a higher amount than Pol II.
  • Pol III promoters include U6 promoter, H1 promoter, tRNA promoter, 7SK promoter, 7SL promoter, Y3 promoter, 5S rRNA promoter, Ad2 VAI and VAII promoter (Das, G. et al., 1988).
  • human U6, human H1, human 7SK, or mouse U6 promoter can be preferably used.
  • the Pol III promoter can function as a transcription terminator by adding, for example, a poly (T) -tract of about 4 to 7 bases downstream of the DNA encoding the RNA to be transcribed.
  • the transcription unit constructed in this way can be used for expression as it is, or can be incorporated into another vector system.
  • a vector An expression plasmid, a desired viral vector, etc. can be utilized.
  • viral vectors include, but are not limited to, retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors (Miller, AD et al. (1991) J. Virol. 65, 2220-2224; Miyake, S Et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8802-8806; Samulski, R. J. et al. (1989) J. Virol. 63, 3822-3828).
  • a transcription unit containing a Pol III promoter may be used by being incorporated into a retrovirus (including lentivirus) LTR.
  • retrovirus including lentivirus
  • Incorporation into a retroviral vector makes it possible to introduce genes into target cells with high efficiency, and since the transgene is integrated into the chromosome, miRNA can be stably inhibited for a long period of time.
  • the retrovirus used is not particularly limited, and examples thereof include ecotropic virus vectors (Kitamura, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 9146-9150), amphotropic virus vectors, Virus vectors pseudotyped by VSV-G etc. (Arai, T. et al. (1998) J. Virol.
  • lentiviral vectors such as HIV vectors, SIV vectors, FIV vectors (Shimada, T. et al. (1991) J. Clin. Inv. 88, 1043-1047).
  • a MoMLV-based retroviral vector or an HIV-based lentiviral vector can be used.
  • LTR When incorporated into LTR, for example, it can be incorporated into the ⁇ U3 region of LTR having a deletion ( ⁇ U3) in the U3 region (FIG. 15).
  • the vector expresses miRNA-inhibiting RNA and inhibits miRNA function for at least 1 week, preferably at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, or at least 1 month after introduction into the cell. can do.
  • miRNA-inhibiting RNA complex when the miRNA-inhibiting RNA complex is designed to be composed of single-stranded linear RNA molecules, it is necessary to introduce a single expression vector that transcribes this RNA into the cell. Conveniently, miRNA-inhibiting RNA complexes can be formed and the miRNA of interest can be inhibited. In this case, as already described, all of one or more MBS contained in the miRNA-inhibiting RNA complex are only on one side of a certain double-stranded structure (first double-stranded structure; corresponding to stem I in FIG. 2).
  • the double strands on one side are designed to be linked by RNA containing MBS (ie, closed), and the opposite side of the double-stranded structure is at both ends of the linear RNA strand Can be.
  • the part forming the double-stranded structure and the part corresponding to both ends of the linear single-stranded RNA are constant regions not depending on MBS, and only the part of the single-stranded RNA is MBS.
  • the variable region can be changed depending on That is, RNA having such a structure has both the efficiency of miRNA inhibition and the ease of production.
  • the RNA containing MBS may contain two or more MBS, and may contain a sequence that forms a stem (or stem loop) between the MBS.
  • the stem may be, for example, a 2 or 4 strand stem.
  • a vector for example, a miRNA-inhibiting RNA expression cassette
  • a vector that expresses the miRNA-inhibiting RNA complex according to the target miRNA can be easily constructed (Fig. 6).
  • a promoter may be appropriately disposed upstream of the pair of complementary sequences (FIG. 6B). The promoter is not particularly limited, but the Pol III promoter is preferable.
  • a terminator can be arranged downstream of the pair of complementary sequences.
  • a DNA that expresses a pair of complementary sequences is extremely useful for expressing a single-stranded RNA constituting a miRNA-inhibiting RNA complex.
  • An insertion site can be appropriately designed between the pair of complementary sequences so that DNA encoding MBS can be inserted.
  • the insertion site may be a desired restriction enzyme recognition sequence (may be multi-cloning), a site-specific recombination sequence such as an att sequence, or may be cleaved in advance so that it can be inserted immediately.
  • the present invention also relates to a method for producing a nucleic acid (eg, DNA) encoding an RNA constituting the RNA complex of the present invention, which encodes a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure.
  • the present invention relates to a method comprising a step of inserting a double-stranded DNA encoding at least one miRNA binding sequence between double-stranded DNAs.
  • the present invention also relates to a method for producing a nucleic acid (for example, DNA) that expresses RNA constituting the RNA complex of the present invention, wherein a pair of complementary sequences forms at least one double-stranded structure downstream of a promoter. And inserting a double-stranded DNA encoding at least one miRNA binding sequence between the double-stranded DNAs encoding.
  • the present invention also provides a nucleic acid for producing a nucleic acid encoding the RNA constituting the RNA complex of the present invention, wherein the nucleic acid encodes a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure, and / or Or relates to its complementary strand.
  • the present invention also provides a composition for producing a nucleic acid encoding the RNA constituting the RNA complex of the present invention, the nucleic acid encoding a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure, and And / or a composition comprising its complementary strand.
  • the composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier as appropriate.
  • the present invention also provides a nucleic acid for producing a vector that expresses RNA constituting the RNA complex of the present invention, and encodes a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure downstream of a promoter. And / or its complementary strand.
  • the present invention also provides a composition for producing a vector that expresses RNA constituting the RNA complex of the present invention, comprising a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure downstream of a promoter. It relates to a composition comprising the encoding nucleic acid and / or its complementary strand.
  • the present invention also relates to a nucleic acid (for example, DNA) for producing a nucleic acid encoding the RNA constituting the RNA complex of the present invention, and relates to a nucleic acid encoding at least one miRNA binding sequence and / or its complementary strand.
  • a nucleic acid for example, DNA
  • the present invention also provides a composition for producing a nucleic acid (eg, DNA) encoding an RNA constituting the RNA complex of the present invention, the nucleic acid encoding at least one miRNA binding sequence and / or its complementary strand. It relates to the composition containing this.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure and / or a complementary strand thereof for producing a nucleic acid encoding the RNA constituting the RNA complex of the present invention.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure downstream of a promoter and / or for producing a vector that expresses RNA constituting the RNA complex of the present invention and / or Or the use of its complementary strand.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid encoding at least one miRNA binding sequence and / or its complementary strand for producing a nucleic acid encoding the RNA constituting the RNA complex of the present invention.
  • any combination of the above nucleic acids can be used as an element of a kit for producing a nucleic acid encoding RNA constituting the RNA complex of the present invention.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure and a kit comprising the complementary strand.
  • the nucleic acid and complementary strand may form a double stranded DNA.
  • a promoter and / or terminator may be operably linked to the double-stranded DNA containing a pair of complementary sequences.
  • the nucleic acid may be an expression plasmid, for example.
  • the kit may further include a nucleic acid encoding at least one miRNA binding sequence and / or a complementary strand thereof.
  • the present invention provides a kit for producing a vector that expresses the RNA complex of the present invention, comprising: (a) a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure downstream of a promoter;
  • the present invention relates to a kit comprising a nucleic acid comprising a site for inserting a nucleic acid between a pair of complementary sequences, and (b) a nucleic acid encoding at least one miRNA binding sequence.
  • a nucleic acid encoding the RNA complex of the present invention by inserting a nucleic acid encoding at least one miRNA binding sequence between the nucleic acids encoding a pair of complementary sequences forming the at least one double-stranded structure. Can be easily obtained.
  • the structure of each nucleic acid is as described in detail for the RNA complex of the present invention.
  • a pair of complementary sequences forming a double-stranded structure may be appropriately determined, and the chain length may be, for example, 15 to 50 base pairs, and preferably 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, or 45 bases, or any one or more thereof, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, or 18 bases, or any of them.
  • the length of the base pair of the double-stranded structure is, for example, 15-30, preferably 16-28, preferably 17-25, preferably 17-24, such as 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, or 24.
  • the nucleic acid is a double-stranded nucleic acid and a desired promoter is operably linked.
  • the promoter is preferably the Pol III promoter.
  • the present invention is a vector for producing a nucleic acid that expresses the RNA complex of the present invention, comprising a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure downstream of a promoter and the pair of complements.
  • the present invention relates to a vector comprising a nucleic acid comprising a site for inserting a nucleic acid between sequences.
  • a restriction enzyme recognition sequence a BsmBI sequence can be exemplified, but this is merely an example and can be appropriately selected.
  • a nucleic acid encoding at least one MBS may contain more than one MBS and may be a stretch of a set of one or more complementary sequences that may form a multi-stranded (eg, two or four stranded) structure. It may be included in the sequence.
  • the nucleic acid can be exemplified by a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure, and a nucleic acid containing at least one MBS at both ends of the pair of complementary sequences.
  • such a nucleic acid is a nucleic acid containing a pair of complementary sequences capable of forming a stem between two MBS. This stem corresponds to the second double-stranded structure.
  • a sequence that forms a G-quadruplex may be included as the second multiple chain structure.
  • the nucleic acid may include two or more structural units including a pair of complementary sequences that can form a double-stranded structure between two MBS.
  • the structural unit can be included in multiple nesting structures, and between a pair of complementary sequences that can form a double-stranded structure between a pair of MBS, and another pair of MBS and a double-stranded structure between them.
  • a sequence including a pair of complementary sequences that can form (# 15, # 16, etc. in FIG. 2) can be included. Multiple MBS sequences may be the same or different.
  • MBS-second multiple strands are inserted between a pair of complementary sequences (stem I in FIG. 6) forming the first double-stranded structure.
  • a nucleic acid having a structure in which a sequence having a structure-MBS structure is inserted is obtained.
  • MBS a pair of complementary sequences forming a second double-stranded structure (stem II in FIG. 6) —a nucleic acid having a structure in which a sequence having the MBS structure is inserted.
  • a nucleic acid encoding an RNA complex arranged so that two strands containing MBS are sandwiched between two multi-stranded (eg, double-stranded) structures can be obtained (FIG. 6).
  • a nucleic acid consisting of two multi-stranded (eg double-stranded) structures and a pair of opposing single strands (each containing MBS) is compact and exhibits sufficient miRNA inhibitory activity.
  • a pair of complementary sequences capable of forming a double-stranded structure and MBS can be appropriately linked via a linker or spacer. The length of the linker or spacer is as described in the specification. In addition, complementary sequences may be linked via a linker or spacer.
  • the linker or spacer becomes a loop, and the double strand is combined to form a stem loop.
  • the length of the loop may be appropriately adjusted, and details are as described in the specification.
  • a sequence forming a G-quadruplex can be used as appropriate.
  • a nucleic acid encoding MBS and its complementary strand are synthesized, and both are annealed (for example, the synthetic oligo DNA of FIG. 6B).
  • the end of the annealed double-stranded nucleic acid can have the same structure as the end cleaved with a restriction enzyme as appropriate when it is inserted into a restriction enzyme cleavage recognition site.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention or RNA constituting the complex (herein, RNA includes natural RNA and analogs), or a vector that expresses the RNA is a composition for inhibiting miRNA It can be. Since the composition of the present invention can specifically and efficiently inhibit a target miRNA, it is useful for controlling the function of a gene through miRNA inhibition.
  • the composition of the present invention can be combined with a desired pharmacologically acceptable carrier or vehicle as required. Examples thereof include a desired solution usually used for suspending nucleic acids, and examples thereof include distilled water, phosphate buffered saline (PBS), sodium chloride solution, Ringer's solution, and culture solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • composition of the present invention may be combined with organic substances such as biopolymers, inorganic substances such as hydroxyapatite, specifically collagen matrices, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers and chemical derivatives thereof as carriers. it can.
  • the composition of the present invention can be used as a desired reagent or as a pharmaceutical composition.
  • the present invention also provides use of the composition of the present invention, the miRNA-inhibiting complex of the present invention, or the RNA constituting the complex or a vector expressing the RNA for inhibiting miRNA.
  • the present invention also provides miRNA inhibitors comprising any of them.
  • Introducing into cells can be performed in vitro, ex vivo, or in vivo.
  • the cells When administered via cells, the cells are introduced into appropriate cultured cells or cells collected from the inoculated animal.
  • Examples of the introduction of nucleic acid include calcium phosphate coprecipitation method, lipofection, DEAE dextran method, a method of directly injecting a DNA solution into a tissue by an injection needle or the like, and introduction by a gene gun.
  • Viral vectors are preferred because genes can be introduced into target cells with high efficiency.
  • the dose varies depending on the disease, patient weight, age, sex, symptoms, administration purpose, administration composition form, administration method, transgene, etc., but it is adjusted appropriately according to the animal to be administered, administration site, administration frequency, etc.
  • the administration route can be appropriately selected.
  • the administration subject is preferably a mammal (including human and non-human mammals). Specifically, non-human primates such as humans and monkeys, rodents such as mice and rats, rabbits, goats, sheep, pigs, cows, dogs, cats, and other mammals are included.
  • Example 1 1.1 Plasmid construction The oligonucleotide shown in (1) below is annealed and cloned into pMXs-GIN (Haraguchi, T. et al. (2007) FEBS Lett, 581, 4949-4954) cleaved with NotI and SalI. pMXs-GIN-miR140-5pT and pMXs-GIN-miR140-3pT, which are GFP reporters of miR-140-5p and miR-140-3p, were prepared. A 0.7 kb BamHI-EcoRI fragment of pMXs-GFP (Kitamura, T.
  • a 1.3 kb HindIII-XbaI fragment of pIRES1Hyg (Clontech) was inserted into the HindIII-XbaI site of pcDNA3.1 to prepare pCMV-Hyg.
  • a 2.1 kb NruI-ApaI fragment of pCMV-Hyg was inserted into the NruI-EcoRV site of pSSCG to prepare pSSCH.
  • a miR-140-5p / 140-3p expression retroviral vector plasmid a 0.5-kb mouse miR-140-5p / 140-3p fragment was obtained by PCR from the mouse genome using the primer pairs shown in (1) below.
  • PCR product was cloned into pCR2.1 (Invitrogen).
  • the 0.5-kb BamHI-XhoI fragment of this plasmid was cloned into pSSCH digested with BamHI and SalI to prepare pSSCH-miR140-5p / 140-3p.
  • primer pair pMXs-GIN-miR140-3pT used to construct the GFP reporter vector the sense strand 5'- GGCCGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGGG-3 '(SEQ ID NO: 1) and the antisense strand 5'- TCGACCCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGC-3 '(SEQ ID NO: 2), for pMXs-GIN-miR140-5pT, sense strand 5'-GGCCGCTCTACCATAGGGTAAAACCACTGGGG -3' (SEQ ID NO: 3) and antisense strand 5'-TCGACCCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGAGC -3 ' SEQ ID NO: 4), for PCR-miR140-5p / 140-3p, sense strand 5'-TGCTTGCTGGTGGTGTAGTC-3 '(SEQ ID NO: 5) and antisense strand 5'-ACCAACACCCACCCAATAGA-3' (
  • the oligo pair shown in (2) below was annealed and cloned into pmU6 digested with BbsI and EcoRI to prepare pmU6-TuD-shuttle.
  • a series of oligonucleotide pairs shown in (3) below was synthesized. Each oligo pair was annealed and cloned into pmU6-TuD-shuttle digested with BsmBI. Each mU6-TuD RNA cassette was then subcloned into a lentiviral vector plasmid (pLSP) as previously described (Haraguchi, T. et al.
  • Each oligo pair (decoy RNA # 1-12, 17-21) was annealed and cloned into pmU6 digested with BbsI and EcoRI. Each oligo pair (decoy RNA # 13-16) was annealed and cloned into pmU6-protoshuttle digested with BsmBI. Each oligo pair (decoy RNA # 22-26) was annealed and cloned into pmU6-TuD-shuttle digested with BsmBI.
  • mU6-decoy RNA # 27 cassette the oligo pair shown in (4) below was used as a PCR primer and template, and the PCT product was cloned into pCR2.1.
  • Oligonucleotides used (2) Primer pair for constructing the RNA shuttle vector of the present invention
  • the sense strand 5'-TTTTGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGGTACCGTCTCGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3 '(SEQ ID NO: 7) and the antisense strand 5 '-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCGAGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGT-3' SEQ ID NO: 8
  • sense strand 5'- TTTGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG -3 CG (CT NO: GC) : 10 was used.
  • the sense strand sense strand 5'-CATCAACCTACCATAGGGTCATCAAAACCACTGCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCTACCATAGGGTCATCAAAACCACTGCAAG-3 '(SEQ ID NO: 11) and antisense
  • RNA # 2 sense strand 5'-TTTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3 '(SEQ ID NO: 25) and antisense strand 5'-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGGTCCTAGTACACAGCGTAGGTCC
  • decoy RNA # 3 the sense strand 5′-TTTTGACAGCGCTCTACGATGAAGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGTTCATCGTAGAGCGCTGTCTTTTTTG-3 ′ and the antisense strand 5′-AATTCAAAAAAGACAGCGCTCTACGACGCTTAGTAG-3
  • decoy RNA # 4 the sense strand 5′-TTTTGACAGCGCTCTACGATGCAAGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGTTGCATCGTAGAGCGCTGTCTTTTTTG-3 ′ and the antisense strand 5
  • RNA # 20 the sense strand 5'-TTTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3 '(SEQ ID NO: 55) and antisense strand 5'-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACACGGATC
  • decoy RNA # 21 the sense strand 5'-TTTTGACGGCGCTAGGATGCTTCCATCCCAGTACACATTTAAATCTGTGGTACCAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3 '(SEQ ID NO: 57) and the antisense strand 5'-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTGAGACCACAGATTTAGTAGCCGTACCACAGATTTAGTAGCC
  • decoy RNA # 22 the sense strand 5'-CATCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACGTATTCTGGTCACAGAATACCTCCGTGGTTCTAATCTCC
  • PCR product was cloned into pCR2.1 using the oligo pairs shown in (5) below as PCR primers and templates.
  • the 0.2-kb XhoI-AgeI fragment of this plasmid was cloned into pLenti6 / V5-GW / lacZ (Invitrogen) digested with XhoI and AgeI to prepare pLenti6 / CMV-sponge-miR21 / lacZ.
  • the pCS2-Venus 0.3-kb XbaI-ApaI fragment was cloned into the XbaI-ApaI site of pSL1180 to prepare pSL1180-polyA.
  • the 3.9-kb HindIII-AgeI fragment of pLenti6 / CMV-sponge-miR21 / lacZ was cloned into the HindIII-AgeI site of pSL1180-polyA to prepare pSL1180-CMVsponge21.
  • Antagomir21mir expression vector plasmid (Scherr, M. et al.
  • a luciferase reporter plasmid In order to construct a luciferase reporter plasmid, the 0.8-kb KpnI-HindIII fragment of pGL4.74 (Promega) was cloned into pGL4.12 (Promega) digested with KpnI and HindIII to prepare pTK4.12.
  • the oligonucleotide pair shown in (6) below was annealed and ligated to the 4.9-kb EcoRI-XbaI fragment of pTK4.12, creating pTK4.12C.P-.
  • the oligonucleotide pair shown in (6) below was annealed and cloned into pGL4.74 digested with XbaI and FseI to produce pGL4.74-miR21T.
  • Oligonucleotides used Sense strand 5'-CTCGAGTAACTCAACATCAGGACATAAGCTAAGTCTCAACATCAGGACATAAGCTATCAGTCAACATCAGGACATAAGCTACTGATCAACATCAGGACATAAGCTA-3 '(SEQ.GATCAACATCAGGACATAAGCTA-3') '-ACCGGTTAGCTTATGTCCTGATGTTGACCGATAGCTTATGTCCTGATGTTGACAGTTAGCTTATGTCCTGATGTTGAGTTCTAGCTTATGTCCTGATGTTGATCAG-3' (SEQ ID NO: 72) was used.
  • forward 5′-AGATCTAATTCATATTTGCATGTCGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 73) and reverse 5′-GAATTCAAAAAATAGCTTATGTCCTGATGTTGAGGATCCGAGTGGTCTCATACAGAACTTATA-3 ′ (SEQ ID NO: 74) were used.
  • HeLaS3 cells Puck et al., J. Exp. Med. 103: 273-284 (1956)
  • PA-1 cells Gaovanella, BC et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 10: 382, 1974, 10: 382; Giovanella, BC. Et al., J Natl Cancer Inst, 1974, 52: 921-30
  • HCT-116 cells Cancer Res 1981; 41: 1751; J Nat Cancer Inst 1982; 69: 767
  • SW480 cells Leibovitz et al., Cancer Res.
  • HT29 cells Fogh & Trempe in Human Tumor Cells in Vitro (ed. Fogh J.), Plenum Press, New York, 1975, pp. 115-159), TIG-3 / E / TERT cells (Akagi T et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100, 13567-13572. (2003)), and 3Y1 cells (Ushijima T et al., Jpn. J. Cancer Res. 85: 455-458, 1994; Kimura G et al., Int. J. Cancer, 15: 694-706, 1975) is 10% foetal bovine serum (FBS ) In DMEM containing 37).
  • FBS foetal bovine serum
  • HeLaS3 cells were seeded at 1x10 5 cells per well in a 6-well plate.After 24 hours, pMXs-GIN, pMXs-GIN-miR140-5pT and pMXs-GIN-miR140-3pT virus stocks ( ⁇ 1x10 4 TU) were added at 8 ⁇ g / It was introduced in the presence of ml of polybrene and selected with G418 (1 mg / ml) from 24 hours after transduction. After selection for 2 weeks, G418 was removed from the medium.
  • HeLaS3 cells harboring miR-140-5p reporter or miR-140-3p reporter are seeded into 6-well plates at 1x10 5 cells per well, and 24 hours later, pSSCH-miR140-5p / 140-3p virus stock ( ⁇ 1x10 4 TU) was introduced in the presence of 8 ⁇ g / ml polybrene, and was selected with Hygromycin (0.5 mg / ml) 24 hours after transduction. After 2 weeks of selection, Hygromycin was removed from the medium.
  • HeLaS3 cells carrying both miR-140-5p reporter and miR140-5p / 140-3p vector, and both miR-140-3p reporter and miR140-5p / 140-3p vector HeLaS3 cells are plated in 6-well plates at 1x10 5 cells per well in DMEM containing 10% foetal bovine serum (FBS), 24 hours later, each miRNA-inhibiting RNA-expressing virus stock (2x10 5 TU) or each decoy RNA-expressing virus Stock (2 ⁇ 10 5 TU) was introduced in the presence of 8 ⁇ g / ml polybrene.
  • FBS foetal bovine serum
  • Total RNA was prepared using miRNA Isolation Kit (Ambion). Expression of mature miRNA was determined by miR-qRT-PCR using miRNA specific looped RT primers and TaqMan probe according to manufacturer's recommendations (Applied Biosystems, Foster City, USA). U6 snRNA was used as an internal control. PCR was performed in triplicate using the 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems).
  • Luciferase assay PA-1 cells, HCT-116 cells, SW480 cells, HT29 cells, TIG-3 / E / TERT cells, and 3Y1 cells were each 1.5x10 in DMEM containing 10% foetal bovine serum (FBS).
  • LNA / DNA antisense oligonucleotides are synthesized by ThermoELECTRON and contain locked nucleic acids at eight consecutive centrally located bases (Naguibneva, I. et al. (2006) Biomed Pharmacother, 60, 633-638).
  • the LNA / DNA antisense oligonucleotide has the sequence shown in (7) below. All assays were performed with GLOMAX TM (Promega) by dual luciferase assay (Promega) 48 hours after transfection.
  • Oligonucleotide (7) Sequence of LNA / DNA antisense oligo
  • LNA-miR21 5'-TCAACAT CAGTCTGA TAAGCTA-3 '(SEQ ID NO: 79) was used.
  • LNA-NC 5′-CATTAAT GTCGGACA ACTCAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 80) was used. LNA is underlined.
  • PA-1 cells were seeded in 48-well plates at 1x10 4 cells per well in DMEM containing 10% foetal bovine serum (FBS), and 24 hours later, TuD-miR21-4ntin and TuD-NC expressing lentiviral stock (1 ⁇ 10 5 TU) was introduced in the presence of 8 ⁇ g / ml polybrene and the medium was changed 24 hours after transduction.
  • the cell proliferation was measured by measuring the metabolic activity of the cells with GLOMAX TM by CellTiter-Glo TM (Promega) immediately before the transduction and 24, 48, 72, 96 hours after the transduction.
  • PA-1 cells were seeded in 48-well plates at 3x10 3 cells per well in DMEM containing 10% foetal bovine serum (FBS), and 18 hours later, TuD-miR21-4ntin and TuD-NC-expressing lentiviral stocks (3x10 4 TU) was introduced in the presence of 8 ⁇ g / ml polybrene and the medium was changed 24 hours after transduction. It was further carried out at GLOMAX TM by Caspase-Glo TM 3/7 (Promega) measuring the activity of caspase 3 and 7 72 hours after transduction.
  • GLOMAX TM by Caspase-Glo TM 3/7 (Promega) measuring the activity of caspase 3 and 7 72 hours after transduction.
  • the cell pellet was suspended in NP40 lysis buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2 , 0.5% Nonidet P-40), allowed to stand on ice for 10 minutes, and then incubated at 1500 rpm at 4 ° C for 5 minutes. Centrifuge for minutes. The supernatant was recovered as a cytoplasmic fraction, and cytoplasmic RNA was recovered by ISOGEN (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan). Further, the precipitate, which is a nuclear fraction, was washed twice with 4 ml of NP40 lysis buffer.
  • NP40 lysis buffer 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2 , 0.5% Nonidet P-40
  • RNA smaller than 200 bp was purified from the cytoplasmic RNA and nuclear fraction precipitate using mirVana TM miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX). In order to compare and compare the number of original cells, 5% of the recovered RNA was used for Northern blot analysis.
  • TAKARA T4 polynucleotide kinase
  • Oligonucleotide 8 DNA Probe Sequence Used for Northern Blot 5′-GTTGATGATCCTAGCCGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 135) was used as a miRNA-inhibiting RNA detection probe. 5′-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3 ′ (SEQ ID NO: 136) was used as the miR-21 detection probe. 5′-GCAGTGGGGGGTTGTATACCAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 137) was used as a Y4 scRNA detection probe. As the ACA1 snoRNA detection probe, 5′-GTGATGGAAGCATAACCTGTCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 138) was used.
  • Example 2 Highly sensitive assay system for detecting miR-140-3p activity HeLaS3 (Landgraf, P. et al. 2007) Cell, 129, 1401-1414) was used to construct an extremely sensitive assay system for miR-140-3p activity.
  • a retrovirus-based GFP reporter was constructed (miR-140-3p reporter) with a 21 bp insert completely complementary to mature miR-140-3p immediately downstream of the GFP gene (FIG. 15A). These were introduced into HeLaS3 cells to establish mixed cell populations that stably express GFP.
  • a retroviral vector was constructed (miR140-5p / 140-3p vector) that drives RNA containing the entire pre-miRNA containing both miR140-5p and miR140-3p from the Pol II promoter (FIG. 15C). This was introduced into HeLaS3 cells with a miR-140-3p reporter to establish mixed cell populations. Compared to non-transfected HeLaS3 cells with the miR-140-3p reporter, GFP expression levels were less than 20% (FIGS. 16A, B, and C).
  • Example 3 Design and effectiveness of prototype decoy RNA As a prototype of a decoy RNA, a simple two sequence expected to expose a completely complementary RNA sequence to the RNA sequence of mature miR-140-3p. A decoy RNA with the following structure was designed. These prototype decoy RNAs (FIG. 1A) form a stem loop structure, which is composed of a mature miR-140-3p and a fully complementary MBS and a three-base linker at each end. To stably express these decoy RNAs in cells, use a lentiviral vector equipped with a short RNA expression cassette driven by the polymerase III promoter (mU6) present in both LTRs after integration. Selected (Figure 15D).
  • mU6 polymerase III promoter
  • RNA decoys are expected to have a 3'-overhanging end of 2 ( ⁇ 4) nucleotides in the stem ( Figure 1A) .
  • the synthesized decoy RNA should be transported from the cell nucleus to the cytoplasm, where it will act on the RISC containing the corresponding miRNA, miR-140-3p.
  • the nuclear transport of small-RNA with a stem-loop structure has been studied in detail so far, and it has been shown that the length of the stem is important for the efficiency of nuclear export by Exp-5 (Zeng , Y. andullCullen, BR (2004) Nucleic Acids Res, 32, 4776-4785). It has been shown that the binding activity of hairpinExpRNA to Exp-5 decreases dramatically when the stem sequence length is shorter than 16 bp, so the stem length of the prototype RNA decoy varies from 17bp to 24bp.
  • RNA decoy with an 18 bp stem is slightly more inhibitory than others, and dsRNA greater than 20 bp can be a potential target for Dicer cleavage in the cytoplasm. It was decided to use a stem length of 18 bp.
  • Example 4 Optimization of inhibitory power by modifying the secondary structure of the prototype decoy RNA and MBS
  • the decoy RNA was designed to have a more complex secondary structure than the prototype (Fig. 2A)
  • the expression cassette was inserted into a lentiviral vector and introduced into the same assay cells used in FIG. 1B.
  • These RNAs tested here (decoy # 10- # 16, FIG. 2A) were more efficient than the prototype decoy RNA (decoy RNA # 2) (FIG. 2AB).
  • MBS that contains four extra nucleotides between the 8th and 9th nucleotides from the 3 'end of the fully complementary MBS provides attenuation of translation rather than RNA cleavage.
  • decoy # 27 was generated by inserting a 3-nucleotide linker between the stem sequence and MBS, and further substituting MBS-pf with MBS-4ntin. Decoy # 27 was greatly improved (55.2% to 80.1%, Figures 2 and 5).
  • decoy # 13 was modified on the same principle to produce decoy # 24, but this did not improve the inhibition ability. This is probably because the decoy activity of decoy # 24 was already almost saturated, completely offsetting the exogenously introduced miR-140-3p activity.
  • decoy RNAs having the structure of decoy # 13 and # 24 are extremely promising because these RNAs inhibit miRNA functions very efficiently.
  • This decoy RNA has two MBS, which are flanked by two stem structures. For example, two MBSs are each sandwiched between the two stem structures, and each MBS has the nucleic acid strands in opposite directions.
  • the two stem structures may be double-stranded or four-stranded.
  • an expression cassette for this RNA can be easily constructed.
  • TuD a decoy RNA having two MBSs and sandwiched between two stem structures has a particularly strong miRNA inhibitory effect.
  • Example 5 Versatility, specificity and duration of the inhibitory effect of the RNA complex of the present invention
  • insertion of a miR-140-3p reporter A reporter cell line for miR-140-5p was constructed in which the sequence was simply replaced with a sequence completely complementary to miR-140-5p (FIG. 15 (B)).
  • TuD-miR-140-3p TuD-miR-140-3p (TuD-miR-140-3p-4ntin) (decoy # 24) or TuD-miR-140-5p-4ntin (Figure 18) contains 4 extra nucleotides in the MBS The inhibitory effect of was determined using both of these reporter cell lines.
  • TuD-miR-140-3p-4ntin vector was introduced into HeLaS3 cells with both miR-140-3p reporter and miR140-5p / 140-3p vector, and the GFP expression level over time was changed over one month. Was monitored (FIG. 7C). From these results, TuD-miR-140-3p-4ntin efficiently inhibits the target miR-140-3p in HeLaS3 cells for over a month, and TuD-miR-140-5p-4ntin does not It was shown that the state of not being maintained is maintained.
  • TuD-miR-140-5p-4ntin reduced the apparent expression level of miR-140-5p by about 65% as long as it was detected by this method, but not TuD-miR-140-3p-4ntin (FIG. 7D). This result showed that the amount of free miR-140-5p was reduced to about 1/3, but dsRNA formed between RNA decoy and mature miRNA was not Even so, it may be too stable to detect mature miRNA by real-time PCR.
  • RNA expressed in HeLaS3 cells expressing TuD-miR-140-3p-4ntin or TuD-miR-140-5p-4ntin was examined. 14 days after introduction of TuD-miR-140-3p-4ntin vector or TuD-miR-140-5p-4ntin vector, cell nuclear fraction RNA and cytoplasmic fraction RNA were prepared, and intramolecular and intermolecular bonds were prepared. To minimize, PAGE was performed at high temperature and analyzed by Northern blot. A 120 nt band and a broad band around 90 nt were observed by the probe for the expressed miRNA-inhibiting RNA (FIG. 7E).
  • TuD-miR-140-3p-4ntin and TuD-miR-140-5p-4ntin were mainly present in the cytoplasm, and TuD-miR-140-5p-4ntin was slightly present in the nucleus. This confirmed that the transcribed RNA was efficiently transported out of the nucleus.
  • MBS sequence has some influence on RNA export efficiency to some extent, but the effect is minor.
  • Example 6 Inhibitory effect of the RNA complex of the present invention on endogenous miRNA
  • a comparison with a conventional synthetic miRNA inhibitor was performed next.
  • Several experiments were performed using different target miRNAs (endogenous miR-21) and different assay systems. Using the same principles as TuD-miR-140-3p-4ntin and TuD-miR-140-3p-pf, we constructed two TuD-miR21s, TuD-miR-21-4ntin and TuD-miR21-pf, respectively ( Figure 18).
  • a DNA-based vector expressing TuD-miR-21-4ntin or TuD-miR-21-pf ( Figure 18)
  • a PA with a Renilla luciferase reporter with or without a 21 bp DNA sequence fully complementary to mature miR-21 in -UTR and a control Firefly luciferase reporter ( Figure 17 (AC)) as a transfection control.
  • -1 cells were transiently transfected.
  • TuD-miR21-4ntin The cell population expressing TuD-miR21-4ntin is expressed by miR21 reporter expression, ie, Renilla luciferase activity normalized with Firefly luciferase activity, and expression of cells transfected with DNA-based vector (TuD-NC) expressing negative control. It was raised about 25 times (Fig. 8A). TuD-miR-21-pf showed a lower inhibitory effect but still resulted in a significant recovery corresponding to about 14-fold activity. Importantly, the level of reporter activity recovered was close to that of the control reporter without the miR-21 target sequence. The activity of this control reporter was almost constant independently of the introduced decoy RNA, as expected.
  • the inhibitory effect of the expression vector producing the transiently transfected RNA complex of the present invention was compared with that of the LNA / DNA antisense oligonucleotide as described in section 1.5 of Example 1 ( FIG. 8A).
  • Transfection of PA-1 cells with locked nucleic acid (LNA / DNA) antisense oligonucleotide (LNA-miR21) compared to that of PA-1 cells transfected with LNA / DNA-NC ⁇ ⁇ used as a negative control.
  • Increased the expression of the target reporter by a factor of two.
  • the cell line for the assay is changed from PA-1 used above to HCT-116, and the plasmid vector expressing the RNA complex of the present invention, CMV sponge expression plasmid vector, H1-Antagomir expression plasmid vector, miRNA eraser expression Comparison of miRNA inhibitory effects of plasmid vectors and LNA / DNA antisense oligonucleotides was performed as described in Section 1.5 of Example 1 ( Figure 9). As a result, it was shown that the RNA complex of the present invention is extremely effective as compared with other methods.
  • TuD-miR-21-4ntin and TuD-miR- in PA-1 cells and HCT-116 cells transfected with miRNA-inhibiting RNA (TuD-miR-21-4ntin and TuD-miR-21-pf) expression vectors, respectively
  • the expression level of 21-pf was analyzed by Northern blot.
  • both TuD-miR-21-4ntin and TuD-miR-21-pf were strongly expressed (FIG. 10A).
  • TuD-miR-21-4ntin was strongly expressed, whereas TuD-miR-21-pf showed only weaker expression than that (FIG. 10B). This phenomenon is consistent with the above hypothesis that TuD-miR-21-4ntin is stable to degradation by miRNA under conditions where miR-21 concentration is high, whereas TuD-miR-21-pf is susceptible to degradation. Match.
  • the miR-21 level was examined using quantitative real-time RT-PCR.
  • TuD-miR-21-4ntin and TuD-miR-21-pf significantly reduced the apparent expression level of miR-21 (FIG. 8D).
  • FIG. 8E As a result of examining the miR-21 level by Northern blot, no decrease was observed in both pre-miR-21 and mature-miR-21 (FIG. 8E).
  • the actual amount of miR-21 did not decrease, but it was thought that detection by RT-PCR was inhibited due to the strong binding of miR-21 and TuD-miR-21. It is done. This phenomenon has been pointed out by other research groups.
  • FIGS. 8A, 9B, ⁇ and 9 were performed at 500 ng / well in a 24-well plate, but when the amount dependency was examined, the effect was saturated at 300 ng / well, and 1/3 of that at 10 ng / well. A moderate miRNA inhibitory effect was observed (FIG. 19).
  • RNA of the present invention also showed a high miRNA inhibitory effect in colon cancer cells (SW480, HT29), immortalized human lung embryonic fibroblasts (TIG-3 / E / TERT) and rat fibroblasts (3Y1) ( (Figure 20).
  • RNA complex of the present invention can specifically inhibit the function of endogenous miRNA.
  • RNA-inhibiting RNA induces biological activity by suppressing the miRNA function.
  • Lentiviral vectors expressing TuD-miR21-4ntin and TuD-NC were introduced into PA-1 cells at an MOI of 10 and the cell proliferation activity was measured (FIG. 11A).
  • the cells into which TuD-NC was introduced proliferated 5 times or more in 4 days, whereas the cells into which TuD-miR21-4ntin was introduced proliferated only to about 1.6 times.
  • apoptosis was evaluated by measuring the activities of caspases 3 and 7 using a similar culture kit (FIG. 11B).
  • the cells into which TuD-miR21-4ntin was introduced were up to about 3 times the cells into which TuD-NC was introduced. This is because apoptosis was induced due to the low degree of cell proliferation in the cells into which TuD-miR21-4ntin was introduced. From the above, it was confirmed that the RNA of the present invention sufficiently suppressed the miRNA function, thereby inhibiting the growth-stimulating activity and apoptosis-suppressing activity of miR-21 (Corsten, MF, (2007) Cancer Res. 67, 8994-9000 )It has been shown.
  • MiRNA has a miRNA family that has the same seed sequence and is thought to have a common target gene. Therefore, in order to investigate whether the miRNA-inhibiting RNA of the present invention has an inhibitory effect on the target miRNA family, experiments were conducted targeting miRNA-15a, 15b, 16, 195, 424, and 497 families.
  • a luciferase reporter vector for miR-16 was constructed in which the insertion sequence of the miR-21 luciferase reporter was replaced with a sequence completely complementary to miR-16 (FIG. 17D).
  • HCT-116 cells in which miRNA-15a, 15b, and 16 were expressed and miRNA-195, 424, and 497 were not expressed were observed by miRNA micro array (FIG. 21). As shown in FIG.
  • the homology of miRNA-16 and 195 is high, and the homology of miRNA-16 and 497 is low except for the seed site. Therefore, TuD-miR-16-4ntin, TuD-miR-195-4ntin and TuD-miR497-4ntin were constructed (FIGS. 18 and 12B). Since miRNA-195 and 497 are not expressed under these conditions, the inhibitory effect of TuD-miR-195-4ntin and TuD-miR497-4ntin on miRNA-15a, 15b, and 16 can be observed.
  • TuD-miR16-4ntin, TuD-miR-195-4ntin and TuD-miR497-4ntin cell populations expressed miR16 reporter expression, namely Renilla luciferase activity normalized with Firefly luciferase activity, The expression was increased by 3.1-fold, 5.2-fold and 2.6-fold, respectively, compared to the expression of the cell population transfected with TuD-NC (FIG. 12C).
  • the level of reporter activity recovered by TuD-miR-16-4ntin and TuD-miR-195-4ntin was the same level as that of the control reporter without the miR-16 target sequence.
  • the activity of the control reporter was almost constant regardless of the introduced miRNA-inhibiting RNA. From this experiment, it was confirmed that the inhibitory effect of the RNA of the present invention extends not only to the target miRNA but also to its family. Moreover, although the inhibitory effect on the family having high homology is higher than that on the family having low homology, it was shown that the inhibitory effect is obtained even if the homology is low.
  • RNA complex of the present invention was produced using an oligonucleotide, and the inhibitory effect on endogenous miRNA was examined.
  • Cell Culture HCT-116 cells (Cancer Res 1981; 41: 1751; J Nat Cancer Inst 1982; 69: 767) were cultured at 37 ° C. in DMEM containing 10% foetal bovine serum (FBS). Luciferase assay The day before transfection, HCT-116 cells were seeded in 24-well plates at 1.0x10 5 cells per well in DMEM containing 10% foetal bovine serum (FBS), Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 10 ng of pTK4.12C.P.
  • LNA / DNA antisense oligonucleotides are synthesized by ThermoELECTRON and contain locked nucleic acids at eight consecutive centrally located bases (Naguibneva, I. et al. (2006) Biomed Pharmacother, 60, 633-638).
  • TuD-2'-O-Methyl-RNA oligonucleotide, 2'-O-Methyl-RNA antisense oligonucleotide, LNA / DNA antisense oligonucleotide, PNA antisense oligonucleotide have the sequence shown in (1) below .
  • miRIDIAN Inhibitor is a synthetic oligo purchased from Thermo scientific Dharmacon. All assays were performed with GLOMAX TM (Promega) by dual luciferase assay (Promega) 48 hours after transfection.
  • Oligonucleotides used (1) 2'-O-Methyl antisense oligo and LNA / DNA antisense oligo sequences For 2'-O-Methyl-TuD-miR21, 5'-GACGGCGCUAGGAUCAUCAACUCAACAUCAGUCAAUGUGAUAAGCUACAAGUAUUCUGGU -3 '(SEQ ID NO: : 148) and 5′-ACCAGAAUACAACUCAACAUCAGUCAAUGUGAUAAGCUACAAGAUGAUCCUAGCGCCGUC-3 ′ (SEQ ID NO: 149) were used after annealing. All bases are 2'-O-Methylated.
  • PNA-miR21 5'- RRRQRRKKR-OO- ATTAATGTCGGACAA-3 '(SEQ ID NOs: 152, 153) was used.
  • PNA-NC 5'- RRRQRRKKR-OO- TCAACATCAGTCTGA-3 '(SEQ ID NOs: 152, 154) was used. All bases are PNA. Cell penetrating peptide and AEEA linker (AEEA: 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid) are underlined.
  • the cell population transfected with 2'-O-Methyl-TuD-miR21 shows the expression of miR21 reporter, that is, Renilla luciferase activity normalized by Firefly luciferase activity, and expression of cells transfected with 2'-O-Methyl-NC. More than about 21 times, about 43 times, about 51 times, about 58 times, and about 69 times at each concentration of 1 nM, 3 nM, 10 nM, 50 nM, and 200 nM (FIGS. 22 and 23).
  • 2′-O-Methyl-miR21, LNA-miR21, and PNA-miR21 showed only about 6-fold, about 2-fold, and about 11-fold increases at 200 nM, respectively.
  • the miR-21 inhibitory effect of 2'-O-Methyl-TuD-RNA oligonucleotide and miRIDIAN Inhibitor was compared at concentrations of 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM, and 3 nM.
  • -Methyl-TuD-miR21 shows about 3.0 times, about 9.1 times, about 28.9 times, about 45.9 times rise, miRIDIAN Inhibitor-miR21 is about 2.5 times, about 5.2 times, about 11.6 times, about 20.1 times An increase was shown (Figure 24). On the other hand, the activity of the Renilla luciferase reporter without the target sequence was almost constant independently of the introduced antisense oligo at low concentrations. These results indicate that 2'-O-Methyl-TuD-miR21 has a much higher ability to inhibit miRNA under these transfection conditions than conventional synthetic reagents.
  • Example 8 Construction of miRNA-inhibiting plasmid using other promoters PCR was performed from human genomic DNA using the primers shown in (2) below, and cloned into pCR2.1 to prepare ph7SK-protoshuttle (Fig. 27 (A) )). ph7SK-protoshuttle was digested with KpnI-HindIII, and the oligonucleotide shown in (2) below was annealed and cloned to prepare ph7SK-TuD-shuttle.
  • Each oligo pair shown in (3) below was annealed and cloned into ph7SK-TuD-shuttle digested with BsmBI to prepare ph7SK-TuD-miR21-4ntin. Thereafter, the BamHI-EcoRI fragment of ph7SK-TuD-miR21-4ntin was inserted into the BamHI-EcoRI site of pSL1180 (Pharmacia) to prepare a miRNA-inhibiting RNA expression plasmid vector pSL1180-TuD-miR21-4ntin.
  • Oligonucleotides used (2) Primer pair for constructing the shuttle vector of RNA of the present invention
  • sense strand 5'- CTCGGATGTGAGGGCGTCATCGGAGACGACACCATCCACAGCCAGCGTCTCGATGACGCCCTCACATCCTTTTTTGAATTCA -3' SEQ ID NO: 157) and antisense strand 5'- AGCTTGAATTGCAATGGTGCTG 158) was used.
  • TuD RNA-miR21-4ntin has a sense strand 5'-CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTGTGTTTT -3 ′ (SEQ ID NO: 18) was used.
  • HCT-116 cells contain miRNA-inhibiting RNA expression plasmid vector. Overtransfected.
  • the cell population transfected with mU6 promoter-TuD-miR21 is approximately 59 times more miR21 reporter expression, ie, Renilla luciferase activity normalized by Firefly luciferase activity than that of cells transfected with mU6 promoter-TuD-NC. It was raised (FIG. 27 (B)).
  • h7SK promoter-TuD-miR21 increased about 77 times the expression of cells transfected with h7SK promoter-TuD-NC.
  • the BamHI-EcoRI fragments of these plasmids were inserted into the BamHI-EcoRI site of pSL1180 (Pharmacia), and miRNA-inhibiting RNA expression plasmid vectors pSL1180-TuD-miR21-4ntin-GqL111, pSL1180-TuD-miR21-4ntin-GqL333, pSL1180- TuD-miR21-4ntin-1MBS-1 and pSL1180-TuD-miR21-4ntin-1MBS-2 were prepared.
  • Oligonucleotides used (4) For the primer pair TuD RNA-miR21-4ntin-GqL111 for constructing the expression vector of the RNA of the present invention, the sense strand 5′-CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGGGAGGGCGGGAGGGAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 159) and The sense strand 5′-TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTCCCTCCCGCCCTCCCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 160) was used.
  • G-quadruplex Comparison of effects of each structure on inhibitory effect (G-quadruplex)
  • a miRNA-inhibiting RNA was prepared by replacing the shorter one of the two stem structures with a G-quadruplex known as a strong structure (FIG. 25).
  • G-quadruplex has the sequence GGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGG.
  • the loop array length 1-1-1 takes a structure called Parallel, and the loop 3-3-3 transitions between the Parallel structure and the Antiparallel structure. These were designated as GqL111 and GqL333, respectively.
  • the effect of miRNA-inhibiting RNA of each structure was compared by a luciferase reporter assay system using HCT-116 cells.
  • mU6-TuD-miR21-4ntin increased the expression of miR21 reporter by about 40 times compared to mU6 promoter-TuD-NC.
  • mU6-TuD-miR21-4ntin-GqL111 and mU6-TuD-miR21-4ntin-GqL333 increased about 33 times and about 20 times (FIG. 25 (C)).
  • mU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-1, mU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-2 increased about 22 times and about 6.5 times (FIG. 26 (B)).
  • the number of MBS greatly affects the inhibitory effect.
  • MiRNA inhibitory RNAs with one or three MBS also showed a high inhibitory effect, but miRNA inhibitory RNAs with two MBS were most effective.
  • TuD-miR21 which has two MBS, exhibits significantly higher inhibitory effects than TuD-miR21-4ntin-1MBS-1 and TuD-miR21-4ntin-1MBS-2, which have one MBS. did. It was shown that when the region facing MBS is not MBS, its nucleotide sequence can greatly influence the inhibitory effect.
  • Example 10 Biological activity by miR-200 family inhibition 1.1 Plasmid construction Each oligo pair shown in (5) below is annealed and cloned into pmU6-TuD-shuttle and ph7SK-TuD-shuttle digested with BsmBI. -4ntin-3pL, ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L, and ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL were prepared.
  • the BamHI-EcoRI fragment of these plasmids was inserted into the BamHI-EcoRI site of pSL1180 (Pharmacia), and miRNA-inhibiting RNA expression plasmid vectors pSL1180-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L, pSL1180-mU6-TuD-miR200c-4ntin- 3pL, pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L, and pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL were prepared.
  • HCT-116 cells (Cancer Res 1981; 41: 1751; J Nat Cancer Inst 1982; 69: 767) were cultured at 37 ° C in DMEM containing 10% foetal bovine serum (FBS) did.
  • HCT-116 cells are seeded at 1x10 5 cells per well in a 6-well plate.
  • pLCG-h7SK-TuD-NC virus stock (1 ⁇ 10 6 TU) was introduced in the presence of 8 ⁇ g / ml polybrene, and GFP-expressing cells were sorted using a FACS Area 8 days after transduction.
  • Luciferase assay HCT-116 cells were plated on 24-well plates at 1.0x10 5 cells per well in DMEM containing 10% foetal bovine serum (FBS) the day before transfection, Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 10 ng of pTK4.12C.
  • P- (Firefly luciferase plasmid; internal control), 100 ng pGL4.74-miR200cT (RLuc target reporter plasmid), or pGL4.74 without target sequence (Figure 28A), 1 ng, 10 ng pSL1180-mU6-TuD- miR200c-4ntin-3L and pSL1180-mU6-TuD-NC • pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL • pSL1180-h7SK-TuD-NC were transfected in triplicate.
  • pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L, pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL cells introduced 21 days after introduction of lentivirus, respectively, in DMEM containing 10% foetal bovine serum (FBS), 1.0x10 5 cells per well in 24-well plates, Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and 10 ng pTK4.12C.P- (Firefly luciferase plasmid; internal control), 100 ng pGL4.74-miR200cT (RLuc target reporter plasmid), or PGL4.74 without the target sequence (FIG. 28A) was transfected in triplicate. All assays were performed with GLOMAX TM (Promega) by dual luciferase assay (Promega) 48 hours after transfection.
  • GLOMAX TM Promega
  • the membranes were incubated with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody for 1 hour at room temperature. The signal was detected using ECL reagent (Amersham).
  • Oligonucleotide used (5) Primer pair for constructing expression vector of RNA of the present invention pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3L and ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L, sense strand 5'-CATCAACTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTGGCATCA -3 ′ (SEQ ID NO: 179) and antisense strand 5′-TCATCTTGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 180) were used.
  • sense strand 5'-CTAGACCGGAATTCTCCATCATTACCCGGCAGTATTACTCGAGCGGAGGCCGG-3 '(SEQ ID NO: 183) and antisense strand 5'-CCTCCGCTCGAGTAATACTGCCGGGTAATGATGGAGAATTCCGGT-3' (SEQ ID NO: 184) were used.
  • mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L In an experiment in which 1 ng of the miRNA-inhibiting RNA (TuD200) expression plasmid vector of the present invention targeting miR200 was transfected, mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L, mU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL, h7SK-TuD-miR200c -4ntin-3L and h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL increased the expression of the miR200c reporter by about 5.7 times, about 6.7 times, about 6.1 times, and about 6.7 times, respectively, compared with mU6-TuD-NC.
  • h7SK-TuD-NC was almost equivalent (FIG. 28B).
  • mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L, mU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL, h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L, h7SK-TuD-miR200c-4ntin -3pL increased the expression of the miR200c reporter by about 8.2 times, about 8.7 times, about 8.0 times, and about 8.5 times than mU6-TuD-NC, respectively.
  • h7SK-TuD-NC was almost equivalent.
  • 1 ng of transfection exhibited an effect that is not inferior to that of 10 ng (FIG. 28C).
  • TuD-200c can sufficiently inhibit endogenous miR-200 with a small introduction amount.
  • mU6 promoter, h7SK promoter, TuD-miR200c-4ntin-3L, and TuD-miR200c-4ntin-3pL all showed high inhibitory activity.
  • the TuD-miR200c expression lentiviral vector was also introduced into TuD RNA stable expression cells, and luciferase reporter assay was performed 23 days after the virus introduction.
  • -4ntin-3pL-expressing cells increased miR200c reporter expression by about 6.9 and 6.9 times, respectively, compared to mU6-TuD-NC-expressing cells.
  • h7SK-TuD-NC expressing cells were almost equivalent (FIG. 28D). From these results, it was shown that miR-200 can be efficiently inhibited for a long period of time by using the TuD-miR200c expression lentiviral vector.
  • RNA-inhibiting RNA-expressing lentiviral vectors pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L, pLCG-mU6-TuD-NC, pLCG-h7SK- TuD-miR200c-4ntin-3pL and pLCG-h7SK-TuD-NC were introduced, and GFP-expressing cells were collected.
  • the proteins of these cells were collected, and the expression levels of E-cadherin and Vimentin, which are gene markers of epithelial cells and mesenchymal cells, were analyzed by Western blotting.
  • E-cadherin is expressed in pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L, pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin compared to cells transfected with pLCG-mU6-TuD-NC -3pL was significantly reduced in cells, and vimentin was not expressed in cells transfected with pLCG-mU6-TuD-NC and pLCG-h7SK-TuD-NC, but pLCG-mU6- It was expressed in cells transfected with TuD-miR200c-4ntin-3L and pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL (FIG. 28E). These results indicated that the inhibition of miR-200 family by TuD-miR200c transformed HCT116, an epithelial cell, into a mesenchymal cell.
  • the present invention provides a miRNA-inhibiting complex that can efficiently and specifically inhibit miRNA.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention can stably inhibit miRNA for a long period of time, for example, by expressing it from a retroviral vector, and enables an in vivo assay such as a knockdown mouse. Furthermore, it is possible to perform miRNA knockdown in a time-specific and tissue-specific manner using Cre-loxP. As illustrated in FIG. 6, since the expression cassette of miRNA-inhibiting RNA of the present invention can be easily constructed, an RNA library for comprehensive analysis of miRNA can also be constructed. Thus, the present invention provides a very useful tool for miRNA research.
  • miRNAs In vivo genes are also expected to be a significant proportion of miRNA targets, and miRNAs play an important role in a variety of settings, including differentiation, development, tumorigenesis, and cellular defense against infections. Has been suggested. The method of the present invention is useful for controlling the functions of these miRNAs in elucidation of gene regulatory mechanisms and gene therapy for tumors and infectious diseases.

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Abstract

【課題】本発明は、miRNA を効率的に阻害するためのRNA、該RNA を細胞内で発現させるためのベクター、該ベクターの構築方法、および該RNA を利用したmiRNA の阻害方法等を提供する。 【解決手段】二本鎖構造を含み、miRNA 結合配列を含む少なくとも１つのRNA鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2 つの鎖に結合しているmiRNA 阻害RNA 複合体により、効率的にmiRNA を阻害できることを見出した。特に、miRNA結合配列を含む2 本のRNA が、２つの二本鎖構造に挟まれるように配置されたRNA は、miRNA を強力に阻害することができた。当該RNA は、例えばPol IIIプロモーターから発現させることができ、レトロウイルスベクターに組み込むことにより、miRNA を長期間安定に阻害することができる。本発明はmiRNAの制御のための有用なツールを提供するものであり、miRNA が関与する分化、発生、腫瘍形成、および感染症などにおける遺伝子調節や遺伝子治療等においての利用が期待される。

Description

microRNAの機能阻害法
　本発明は、miRNAの機能を効率的に阻害する方法、およびそのために用いられる核酸に関する。
　マイクロRNA（miRNA）は内在性に発現される小さな（約20～24ヌクレオチド）調節性の非コードRNAであって、RNA誘導サイレンシング複合体（RNA-induced silencing complex; RISC）の成分として転写後レベルで数多くの標的遺伝子の発現を調節している。あるmiRNAとmRNA中にあるその標的配列とが完全に相補的である場合は、miRNAはそのmRNAの切断を誘導し、mRNAレベルの急速な減少を引き起こす。しかしながら、哺乳動物のmiRNAの大半は、3'非翻訳領域（3'-UTR）に位置する標的配列と限られたレベルの相補性しか持たず、翻訳抑制またはcytoplasmic processing bodies (P-bodies) における標的mRNAの急速な脱アデニル化（deadenylation）のどちらかを引き起こす。ヒトのコード遺伝子の1/3以上がmiRNAの標的であると予想されており（Bartel, D.P. (2004) Cell, 116, 281-297; Lewis, B.P. et al. (2005) Cell, 120, 15-20; Ambros, V. et al. (2003) Rna, 9, 277-279）、分化、発生、腫瘍形成、および感染に対する細胞防御において、miRNAは重要な役割を果たしていることを示す証拠が現在なお出され続けている（Li, Q.J. et al. (2007) Cell, 129, 147-161; Lu, J. et al. (2005) Nature, 435, 834-838; Lecellier, C.H. et al. (2005) Science, 308, 557-560）。
　miRNA分子の包括的な機能解析のためには、その活性を特異的に阻害する技術が不可欠であると考えられる。miRNAの機能を阻害する幾つかの方法は既に存在しており、例えば、2'-O methyl (2'-OMe) RNAなどの化学的に修飾された単鎖オリゴヌクレオチド（Hutvagner, G. et al. (2004) PLoS Biol, 2, E98; Meister, G. et al. (2004) Rna, 10, 544-550）、locked nucleic acid (LNA) および「アンタゴミア」（‘antagomirs’）（Orom, U.A. et al. (2006) Gene, 372, 137-141; Krutzfeldt, J. et al. (2005) Nature, 438, 685-689）が存在する。これらの試薬は成熟miRNAに対して相補性を持つように化学合成されたもので、細胞性のヌクレアーゼに耐性であり、恐らくはRISCの切断されない基質として機能する。それらはトランスフェクションにより細胞に導入されるように設計されているので、阻害活性は必然的に一過性となる。
　最近、miRNAの競合阻害剤「microRNA sponge」を発現するDNAベクターが報告された（Ebert, M.S. et al. (2007) Nat Methods, 4, 721-726）。microRNA spongeベクターの一過的発現はmiRNAの機能を効率的に阻害するが、DNAベースのベクターにより導入されたとしても、その阻害効果は一箇月を超えては維持されない。従って、より長期間にわたってmiRNAを阻害する方法を確立することが望まれていた。
Bartel, D.P. (2004) Cell, 116, 281-297 Lewis, B.P. et al. (2005) Cell, 120, 15-20 Ambros, V. et al. (2003) Rna, 9, 277-279 Li, Q.J. et al. (2007) Cell, 129, 147-161 Lu, J. et al. (2005) Nature, 435, 834-838 Lecellier, C.H. et al. (2005) Science, 308, 557-560 Hutvagner, G. et al. (2004) PLoS Biol, 2, E98 Meister, G. et al. (2004) Rna, 10, 544-550 Orom, U.A. et al. (2006) Gene, 372, 137-141 Krutzfeldt, J. et al. (2005) Nature, 438, 685-689 Ebert, M.S. et al. (2007) Nat Methods, 4, 721-726
　本発明は、miRNAを効率的に阻害するためのmiRNA阻害体、該阻害体を細胞内で発現させるためのベクター、該ベクターの構築方法、および該阻害体またはベクターを利用したmiRNAの阻害方法等に関する。
　miRNAのより効率的かつ長期間の抑制を確立するため、本発明者らは、miRNAを阻害し得るRNAを新たに設計し、miRNA阻害活性を評価した。その結果、二本鎖RNAの片端の両鎖にmiRNA結合配列（MBS）を結合させたRNAが、強いmiRNA阻害活性を示すことを見出した（図１および２）。特に、２つの二本鎖RNA部分を含み、その２つの二本鎖に挟まれるように、二本鎖の各鎖にそれぞれMBSが結合しているRNA（図２、#12～#16）は、極めて強いmiRNA阻害活性を示した。そして本発明者らは、二本鎖部分を含むこれらのRNA構造の一方の端を閉じた構造（例えばループ構造）にして、直鎖状の１本鎖RNAとしてこれらのmiRNA阻害RNAを構成させることにより、このRNAを１つの転写ユニットから発現できるようにした。また、二本鎖構造の片側にMBSを集約させ、その反対側および該二本鎖構造部分は定常領域とすることにより、この定常領域を含む発現ユニットに、目的のMBSを含むカセットを挿入することで、目的のmiRNAに応じて特異的阻害活性を示すRNAの発現ベクターを、極めて簡便に構築する系を生み出した。当該発現ベクターを導入した細胞では、標的miRNAを強力に阻害することが可能で、しかも目的のmiRNAに応じて簡単にベクターを構築することが可能である。
　すなわち本発明は、miRNAを効率的に阻害するためのmiRNA阻害体、該阻害体を細胞内で発現させるためのベクター、該ベクターの構築方法、および該阻害体またはベクターを利用したmiRNAの阻害方法等に関し、より具体的には、
〔１〕RNAまたはその類縁体を含むmiRNA阻害複合体であって、二本鎖構造を含み、かつmiRNA結合配列を含む少なくとも１つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に結合している、miRNA阻害複合体、
〔２〕第２の多重鎖構造を含み、該片端の２つの鎖にmiRNA結合配列を含む鎖がそれぞれ１本ずつ結合しており、該二本鎖構造と多重鎖構造とに挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該第２の多重鎖構造の2つの鎖にそれぞれ結合している、〔１〕に記載の複合体、
〔３〕該多重鎖が二本鎖または四本鎖である、〔２〕に記載の複合体、
〔４〕該片端の2つの鎖が、該片端側でつながっている、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の複合体、
〔５〕直鎖状一本鎖RNAまたはその類縁体から構成される、〔４〕に記載の複合体、
〔６〕2から5つのmiRNA結合配列を含む、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の複合体、
〔７〕2つのmiRNA結合配列を含む、〔６〕に記載の複合体、
〔８〕〔５〕に記載の複合体であって、図２(C)に示された構造を含み、該構造のIおよびIIは二本鎖構造であって、該構造のaおよびbにそれぞれ１つのmiRNA結合配列を含む複合体、
〔９〕〔５〕に記載の複合体であって、図２(D)に示された構造を含み、該構造のIは二本鎖構造であって片側に各鎖の末端があり、該構造のIIはヘアピンであって、該構造のaおよびbにそれぞれ１つのmiRNA結合配列を含む複合体、
〔１０〕〔１〕から〔９〕のいずれかの複合体を構成するRNAまたはその類縁体、
〔１１〕〔１０〕に記載のRNAをコードする核酸、
〔１２〕プロモーターの下流に結合している、〔１１〕に記載の核酸、
〔１３〕プロモーターがポリメラーゼIIIプロモーターである、〔１２〕に記載の核酸、
〔１４〕レトロウイルスベクター中に搭載されている、〔１２〕または〔１３〕に記載の核酸、
〔１５〕〔１２〕に記載の核酸を作製する方法であって、プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸の間に、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸を挿入する工程を含む方法、
〔１６〕miRNA結合配列をコードする核酸が、少なくとも２つのmiRNA結合配列を含み、その間にステムを形成する配列を含む、〔１５〕に記載の方法、
〔１７〕〔１２〕に記載の核酸を作製するためのキットであって、下記（ａ）および（ｂ）の核酸を含むキット、
（ａ）プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列と、該１対の相補配列の間に核酸を挿入するための部位とを含む核酸、
（ｂ）少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸、
〔１８〕miRNA結合配列をコードする核酸が、少なくとも２つのmiRNA結合配列を含み、その間にステムを形成する配列を含む、〔１７〕に記載のキット、に関する。
　また本発明は、
〔１〕RNAまたはその類縁体を含むmiRNA阻害複合体であって、二本鎖構造を含み、かつmiRNA結合配列を含む少なくとも１つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に結合している、miRNA阻害複合体、
〔２〕第２の二本鎖構造を含み、該片端の２つの鎖にmiRNA結合配列を含む鎖がそれぞれ１本ずつ結合しており、前記２つの二本鎖構造に挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該第２の二本鎖構造の2つの鎖にそれぞれ結合している、〔１〕に記載の複合体、
〔３〕該片端の2つの鎖が、該片端側でつながっている、〔１〕または〔２〕に記載の複合体、
〔４〕直鎖状一本鎖RNAまたはその類縁体から構成される、〔３〕に記載の複合体、
〔５〕2から5つのmiRNA結合配列を含む、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の複合体、
〔６〕2つのmiRNA結合配列を含む、〔５〕に記載の複合体、
〔７〕〔１〕から〔６〕のいずれかの複合体を構成するRNAまたはその類縁体、
〔８〕〔７〕に記載のRNAをコードする核酸、
〔９〕プロモーターの下流に結合している、〔８〕に記載の核酸、
〔１０〕プロモーターがポリメラーゼIIIプロモーターである、〔９〕に記載の核酸、
〔１１〕レトロウイルスベクター中に搭載されている、〔９〕または〔１０〕に記載の核酸、
〔１２〕〔９〕に記載の核酸を作製する方法であって、プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸の間に、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸を挿入する工程を含む方法、
〔１３〕miRNA結合配列をコードする核酸が、少なくとも２つのmiRNA結合配列を含み、その間にステムループを形成する配列を含む、〔１２〕に記載の方法、
〔１４〕〔９〕に記載の核酸を作製するためのキットであって、下記（ａ）および（ｂ）の核酸を含むキット、
（ａ）プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列と、該１対の相補配列の間に核酸を挿入するための部位とを含む核酸、
（ｂ）少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸、
〔１５〕miRNA結合配列をコードする核酸が、少なくとも２つのmiRNA結合配列を含み、その間にステムループを形成する配列を含む、〔１４〕に記載のキット、にも関する。
　なお上記の各項において、同一の項を引用する各項に記載の発明の２つまたはそれ以上を任意に組み合わせた発明は、それらに引用される上位の項に記載の発明において、既に意図されている。また、本明細書に記載した任意の発明要素およびその任意の組み合わせは、本明細書において意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の要素またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本明細書は、明細書中に例えば好ましいとしてある特定の態様を記載した場合、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。
　本発明により、miRNAの機能を効率的かつ特異的に阻害することができるmiRNAインヒビターが提供された。本発明のmiRNAインヒビターは、例えばその発現ユニットをレトロウイルスベクターに組み込むことにより、miRNAを長期間安定に阻害することができる。これは、例えばノックダウンマウスのようなin vivoアッセイを可能にする。さらに、Cre-loxPにより調節されるU6プロモーター系が既に確立しているので、これを利用して時間特異的かつ組織特異的にmiRNAノックダウンを実施することも可能である。図６に例示した通り、本発明のmiRNA阻害RNAの発現カセットは容易に構築することができるので、これを利用してmiRNAを包括的に解析するためのRNAライブラリーを構築することもできる。このように、本発明はmiRNAの研究に極めて有用なツールを提供するものである。例えば、特定のmiRNA阻害RNAの発現の有無により培養細胞中の発現mRNAを網羅的に調べることにより、標的mRNA候補を同定するために使用できる。また生体内の遺伝子は、かなりの割合でmiRNAの標的であると予想されており、分化、発生、腫瘍形成、および感染症に対する細胞防御を含む様々な場面においてmiRNAは重要な役割を果たしていることが示唆されている。本発明の方法は、遺伝子調節機構の解明や、腫瘍や感染症の遺伝子治療等において、これらに関与するmiRNAの機能を制御するために有用である。
プロトタイプデコイRNAのステムの長さの効果を示す図である。（Ａ）プロトタイプデコイRNAの構造。黒の太字の曲がった矢印はMBS（5'→3'）を表す。（Ｂ）miR-140-3pレポーターおよびmiR140-5p/140-3pベクターの両方を保持するHeLaS3細胞に、これらのデコイRNAを発現するレンチウイルスベクターをそれぞれ導入し、導入の6～10日後に、FACS解析により、全集団のGFP発現レベルの中央値を決定した。発現レベルは、miR-140-3pレポーターのみを保持するHeLaS3細胞のそれらに対してノーマライズし、平均±SEMで表した。Cre recombinase遺伝子を標的とするshRNAをネガティブコントロール（NC）として用いた。 様々なステム構造を有する一連のデコイRNAの阻害効果の比較を示す図である。（Ａ）デコイ RNA #2 および #10～#16 の構造。黒の太字の曲がった矢印はMBSを表す。I、II、III、およびIVはデコイRNAに存在するステムを示す。（Ｂ）図１Bの説明中に示したのと同じレポーター細胞系を用いてこれらのデコイを発現するレンチウイルスベクターの効果を決定した。発現レベルは、図１Bと同様にノーマライズした。デコイRNAの各ステム配列（I、II、III、およびIV）の長さが示されている。（Ｃ）本発明のデコイRNAを構成するユニットの一形態。Iは第1の二本鎖構造、IIは第2の二本鎖構造を表す。aおよびbはそれぞれ少なくとも1つのMBSを含む。第2の二本鎖構造の末端（図中の右端）はループを形成していてもしていなくてもよい。ループを形成する場合、デコイRNAは一本鎖となる。aおよびbは複数のMBSを含んでいてもよく、また、aおよびbは完全に一本鎖状態でなくても、部分的に二本鎖構造を形成してもよい。このユニットは、複数がタンデムにつながっていてもよい（例えばパネルAの#15および#16）。（Ｄ）パネル（Ｃ）に示したユニットにおいて、第2の二本鎖構造の末端がループを形成している場合の構造。ループ中に含まれる塩基数は特に限定はなく、0～数個、例えば1, 2, 3, 4, 5, 6, 7塩基であり得る。なお、パネル(A)、(C)、(D) の二本鎖部分の縦線は、二本鎖構造を取っていることを表したものであって、縦線の数に塩基数を限定するものではない。 プロトタイプデコイRNAのMBS配列は、阻害効果に有意に影響を及ぼすことを示す図である。相対GFP発現を、図１Bの説明中に示したように決定した。 デコイRNAのリンカー配列の長さの効果の比較を示す図である。（Ａ）デコイRNA #22～#26の構造。黒の太字の曲がった矢印はMBS (5' →3')を表す。→はリンカー配列を指し示している。（Ｂ）相対GFP発現を、図1Bの説明中に示したように決定した。また、リンカー配列の長さもパネルに示した。 MBS配列内のバルジおよびMBSとステムの間をつなぐリンカーの効果を示す図である。相対GFP発現を、図１Bの説明中に示したように決定した。太字の黒の曲線矢印はMBSを表す。 (A) 本発明のmiRNA阻害RNAの代表的な構造を示す図である。MBSはmiRNA結合部位を表す。(B) マウスU6プロモーターにより駆動されるmiRNA阻害RNA発現用カセットの生成の模式図。約80～90merの合成オリゴヌクレオチド対がアニールされ、BamHI-EcoRI断片（もともとのカセット）にある2つのBsmBI 部位の間にクローニングされ、miRNA阻害RNA発現カセットが生成される。 本発明のmiRNA阻害複合体の阻害効果の汎用性、特異性、および持続期間を示す図である。(A) 図１Bに記載されているGFPレポーター細胞系により検出された、TuD-miR140-5p-4ntinまたはTuD-miR140-3p-4ntinのmiR140-3p活性に対する効果。但しGFP発現レベルは導入後8～12日に決定された（図16D および E）。(B) TuD-miR140-5p-4ntin または TuD-miR140-3p-4ntin の miR140-5p活性に対する効果。miR-140-5p レポーターおよびmiR140-5p/140-3pベクターの両方を保持するHeLaS3細胞にこれらのmiRNA阻害RNAを発現するレンチウイルスベクターをそれぞれ導入し、導入後8～12日にGFP発現レベルを決定した。発現レベルは、miR-140-5pレポーターのみを保持するHeLaS3細胞の発現レベルに対してノーマライズし、平均±SEMで表した。(C) 図１Bに記載したTuD-miR140-3p-4ntin の miR140-3p活性に対する阻害効果の経時変化。相対GFP発現レベルは、miR-140-3pレポーターのみを保持するHeLaS3細胞のそれらに対してノーマライズされた。(D) 定量リアルタイムRT-PCRにより決定された、パネル(B)に記載の細胞中における成熟miR140-5pのレベル。miR140-5p発現レベルはmiR-140-5pレポーターおよびmiR140-5p/140-3pベクターを両方を保持するHeLaS3細胞のそれに対してノーマライズし、平均±SEMで表した (n = 3)。U6 snRNAを内在性コントロールとした。(E) miRNA阻害RNAの細胞内局在の解析。Y4 small cytoplasmic RNA (Y4 scRNA, 93nt)とACA1 small nucleolar RNA (ACA1 snoRNA, 130nt)の移動度を三角印で示した。Y4 scRNAとACA1 snoRNA PA-1を細胞分画マーカーとして示した。Un, 5p, 3p, N, Cはそれぞれ非感染細胞、TuD-miR140-5p感染細胞、TuD-miR140-3p感染細胞、核分画、細胞質分画を示す。 miRNA阻害複合体の内在性miR21 活性に対する阻害効果を示す図である。miRNA阻害RNA発現プラスミドベクターまたはLNA/DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Renilla luciferase miR-21 レポーター (白のバー) または非標的化コントロールRenilla luciferase レポーター (黒のバー) と、トランスフェクションのコントロールのためのFirefly luciferase レポーターと共に、PA-1細胞 (A) またはHCT-116 (B) に一過的にトランスフェクトした。dual luciferaseアッセイの後、発現レベルはTuD-NC ベクターをトランスフェクトしたPA-1細胞またはHCT-116細胞のそれらに対してノーマライズし、平均±SEMで表した。(C) miR21の標的である内在性PDCD4 蛋白質の発現に対する、一過的にトランスフェクトしたmiRNA阻害RNA発現プラスミドベクターの効果。PA-1細胞にmiRNA阻害RNA発現プラスミドベクターをトランスフェクトし、トランスフェクションの72時間後に全蛋白質を調製した。PDCD4 (上) およびβ-actin loading コントロール (下) をウェスタンブロットにより決定した。(D) リアルタイムRT-PCRにより、(B)と同様の操作をした細胞におけるmiR21発現レベルを測定した。miR21発現レベルはTuD-NCベクターをトランスフェクションしたHCT-116細胞のmiR21発現レベルに対してノーマライズし、平均±SEMで表した (n = 3)。U6 snRNAを内在性コントロールとした。(E) ノザンブロットにより、(B)と同様の操作をした細胞におけるpre-miR21およびmature-miR21の発現レベルを測定した。Y4 scRNAをloading コントロールとして示した。 miRNA阻害RNA発現プラスミドベクターとCMV sponge発現プラスミドベクター、H1-Antagomir発現プラスミドベクター、miRNA eraser発現プラスミドベクター、LNA/DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果の比較を示す図である。HCT-116細胞を用いてトランスフェクションから72時間後にdual luciferaseアッセイを行った。発現レベルは非標的化コントロールRenilla luciferase レポーターをトランスフェクトしたHCT-116細胞のそれらに対してノーマライズし、平均±SEMで表した。 ノザンブロットによるmiRNA阻害RNA発現レベルの解析を示す図である。miRNA阻害RNA発現ベクターをトランスフェクションしたPA-1細胞(A)、HCT-116細胞(Ｂ)においてそれぞれTuD-miR-21-4ntinおよびTuD-miR-21-pfの発現レベルをノザンブロットにより解析した。Y4 scRNAとACA1 snoRNAの移動度を三角印で示した。Y4 scRNAをloading コントロールとして示した。 miRNA阻害RNAの導入により誘導された生物的活性を示す図である。(A) TuD-miR21の導入によるPA-1細胞の細胞増殖活性の解析。PA-1細胞へmiRNA阻害RNA発現ベクターを導入し、細胞数をベクター導入から4日間解析した。 (B) TuD-miR21の導入によるPA-1細胞のアポトーシス誘導の解析。PA-1細胞へmiRNA阻害RNA発現ベクターを導入し、カスパーゼ3およびカスパーゼ7の活性をベクター導入から3日後に解析した。この活性をそれぞれのmiRNA阻害RNA発現ベクターを導入したPA-1細胞の細胞数に対してノーマライズし、平均±SEMで表した。 miRNA阻害RNAの標的miRNAのfamilyへの阻害効果を示す図である。(Ａ) miR-16, 195, 497の配列およびその相同性を示した。ブラケットで示した配列はseed部位であり、黒のバーは相同部位を示す。(Ｂ) TuD-miR-16-4ntin、TuD-miR-195-4ntinおよびTuD-miR497-4ntin のMBSとmiR-16の結合を示した。黒点はG-U結合を示す。(Ｃ)miRNA阻害RNA発現プラスミドベクターを、Renilla luciferase miR-16 レポーター (白のバー) または非標的コントロールRenilla luciferase レポーター (黒のバー) と、トランスフェクションのコントロールのためのFirefly luciferase レポーターと共に、HCT-116細胞にトランスフェクションし、Dual luciferaseアッセイを行った。発現レベルはTuD-NC ベクターをトランスフェクションしたHCT-116細胞の値に対してノーマライズし、平均±SEMで表した(n = 3)。 miR140-3pのためのデコイRNAの構造および配列を示す図である。MBSは、miR140-3pと完全または部分的に相補的なmiRNA結合部位を表す。 miR140-3pのためのデコイRNAの構造および配列を示す図である（図１３の続き）。 miR-140-3p または miR-140-5p の高感度アッセイ系の構築のために使用したレトロウイルスベクターの構造を示す図である。(A) レポーターMLVベースレトロウイルスベクター pMXs-GIN-miR140-3pT のプロウイルスの構造。GFP遺伝子のすぐ下流に、成熟miR-140-3pと完全に相補的な21bpのインサーションを持つ。U3、RおよびU5はそれぞれMoMLV long terminal repeat由来の対応する配列を示す。Ψ, レトロウイルスベクターのパッケージングシグナル。(B) レポーターMLVベースレトロウイルスベクター pMXs-GIN-miR140-5pT のプロウイルスの構造。(C) MoMLVベースのmiR140-5p/140-3p発現ベクター pSSCH-miR140-5p/140-3p のプロウイルスの構造。内部のCMVプロモーターから転写されるようにPri-miR140-5p/140-3p配列がΔU3配列中に挿入されている。ΔU3, 主要エンハンサー配列（major enhancer sequences）が除去されたU3配列。(D) HIVベースの自己不活性化デコイRNA発現ベクターの構造。ΔU3, 主要エンハンサー配列（major enhancer sequences）が除去されたU3配列。R, レンチウイルスのR配列。U5, レンチウイルスのU5配列。Ψ, レンチウイルスのパッケージングシグナル。 miR140-3p活性の高感度アッセイ系の樹立、およびmiRNA阻害RNAの導入の効果を示す図である(パネルA～E)。　HeLaS3細胞のGFP発現レベル（自家蛍光）のFACS解析(A)、miR140-3pレポーターのみを保持するHeLaS3細胞のGFP発現レベルのFACS解析(B)およびmiR140-3pレポーターとmiR140-5p/140-3p発現ベクターの両方を保持するHeLaS3細胞のGFP発現レベルのFACS解析(C)。miR140-3pレポーター細胞にそれぞれTuD-miR140-3p-4ntin(D)またはTuD-miR140-5p-4ntin(E)のいずれかを導入して8日後のGFP発現レベルのFACS解析。太い実線および点線は、それぞれmiR140-3pレポーターのみを保持するHeLaS3細胞のGFP発現プロフィール、miR140-3pレポーターとmiR140-5p/140-3p発現ベクターの両方を保持するHeLaS3細胞のGFP発現プロフィールを表す。 ルシフェラーゼ発現ベクターの構造を示す図である。(A) Firefly luciferase 発現プラスミドベクターpTK4.12C.P-の構造。(B) 挿入を持たないRenilla luciferaseレポーター pGL4.74の構造。(C) Renilla luciferase遺伝子のすぐ下流に成熟miR-21と完全に相補的な22bp の挿入を持つRenilla luciferaseレポーター pGL4.74-miR21T の構造。(D) Renilla luciferase遺伝子のすぐ下流に成熟miR-16と完全に相補的な22bpの挿入を持つRenilla luciferaseレポーター pGL4.74-miR16Tの構造。 本発明のmiRNA阻害RNAの構造および配列を示す図である。MBSは、対応するmiRNAに対して完全または部分的に相補的なmiRNA結合部位を表す。 miR-21阻害効果におけるTuD-miR-21-4ntin 発現ベクターの量依存性を示す図である。HCT-116細胞にTuD-NC、TuD-miR-21-4ntin発現プラスミドの量のみを変更し、その他は図８(B)と同様の条件でトランスフェクションした。発現レベルはTuD-NC ベクターをトランスフェクションしたHCT-116細胞の値に対してノーマライズし、平均±SEMで表した(n = 3)。 miRNA阻害複合体の内在性miR21 活性に対する阻害効果を示す図である。miRNA阻害RNA発現プラスミドベクターまたはLNA/DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Renilla luciferase miR-21 レポーター (白のバー) または非標的化コントロールRenilla luciferase レポーター (黒のバー) と、トランスフェクションのコントロールのためのFirefly luciferase レポーターと共に、SW480細胞(A)、HT29細胞(B)、TIG-3/E/TERT細胞(C)または3Y1細胞(D)に一過的にトランスフェクトした。dual luciferaseアッセイの後、発現レベルはTuD-NC ベクターをトランスフェクトしたSW480細胞、HT29細胞、TIG-3/E/TERT細胞または3Y1細胞のそれらに対してノーマライズし、平均±SEMで表した(n = 3)。 HCT-116細胞におけるmiR-15a/15b/16/195/424/497ファミリーの発現レベルを示す図である。発現レベルはアジレント社のmiRNA-microarrayにより解析した。 2'-O-メチル合成オリゴヌクレオチドによる本発明のmiRNA阻害RNAとその効果。(A) デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイ用レポータープラスミド。実施例7～9の実験は、すべてHCT-116細胞を使って行った。(B) 2'-O-メチル合成オリゴヌクレオチドによる本発明のmiRNA阻害RNAの構造。すべてのヌクレオチドが2'-O-メチル化修飾されている2本の合成オリゴヌクレオチドをアニールして使用した。(C) 2'-O-メチル合成オリゴヌクレオチドによる合成RNAのmiRNA阻害効果を示す。この阻害RNAによるmiRNA阻害効果を、濃度を変えて測定し、従来の2'-O-メチル合成オリゴヌクレオチドと比較した。 本発明のmiRNA阻害RNAのmiRNA阻害効果を、通常のLNA、PNA、および2'-O-メチル化オリゴと比較した結果を示す。 本発明のmiRNA阻害RNAのmiRNA阻害効果を、miRIDIAN Inhibior他を比較した結果を示す。 グアニン四重鎖（G-quadruplex）を利用した本発明のmiRNA阻害RNAの転写とその効果。(A) G-quadruplex-Loop111のパラレル四重鎖構造と、G-quadruplex-Loop333のパラレルおよびアンチパラレル四重鎖構造。(B) TuD-miR21-4ntin、TuD-miR21-4ntin-GqL111、およびTuD-miR21-4ntin-GqL333の構造の模式図。(C) 各RNAによるmiRNA阻害活性。 miRNA阻害RNAの構造が及ぼす効果を示す。(A) TuD-miR21-4ntin、TuD-miR21-4ntin-1MBS-1、および TuD-miR21-4ntin-1MBS-2 の構造の模式図。破線の矢印は、1MBS-1ではMBSリバース配列、1MBS-2では TuD-NC（コントロール配列）を示す。(B) 各RNAによるmiRNA阻害活性。 ヒト7SKプロモーターからの本発明のmiRNA阻害RNAの転写とその効果。(A) 本発明のmiRNA阻害RNAをヒト7SKプロモーターから転写させる発現カセットの構造を示す。ヒト7SKプロモーターは7SK RNAの転写開始点直下の配列（特に1番目～8番目のヌクレオチド）によって転写が強化されるので、7SK RNAの1番目～13番目のヌクレオチドを本発明の阻害RNAのステム部分に組み込んだ。(B) HCT-116細胞におけるmiR-21阻害効果。図22(A) に記載のデュアル・ルシフェラーゼ・アッセイにより測定した。 本発明のmiRNA阻害RNAによるmiR200の阻害効果を示す。(A-D) miR200を標的とする本発明のmiRNA阻害RNAの発現プラスミドを構築し、ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を用いて２種類のプロモーターから発現させたmiRNA阻害RNAの効果を示した。(E) TuD-miR200c-4ntinによる上皮-間充織転換の様子。HCT-116細胞にmiRNA阻害RNA発現レンチウイルスベクターを導入してmiRNA阻害RNAを安定に発現する細胞集団を作製し、導入の15日後に全蛋白質を調製した。上皮細胞、間充織細胞それぞれの遺伝子マーカーであるE-カドヘリン(上)、ビメンチン (中)、およびβ-actin loading コントロール (下) をウェスタンブロットにより決定した。
　本発明は、miRNAを効率的かつ特異的に阻害することができるmiRNA阻害複合体に関する。本発明のmiRNA阻害複合体は、二本鎖または多重鎖構造を含み、miRNA結合配列（MBS）を含む少なくとも１つの鎖が、該二本鎖または多重鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に結合している。なお本発明においては、この二本鎖または多重鎖構造を「第一の」二本鎖構造と呼ぶことで、本発明の複合体に含まれ得るさらなる二本鎖または多重鎖構造と区別できるようにすることがある（後述）。本発明の複合体は、一本鎖（すなわち共有結合で結合した１分子）であってもなくてもよく、例えば一本鎖、二本鎖、またはそれ以上の複数の鎖で構成されていてよい。例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、MBSを含むRNA鎖が、それぞれ一本ずつ結合した、二本鎖RNAからなる複合体は本発明に含まれる。また、例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、少なくとも1つのMBSを含む一本のRNA鎖が結合していてもよい。この場合、MBSを含むRNA鎖により、二本鎖構造の片端の2つの鎖はつながれることになる（例えば図１）。二本鎖構造の2つの鎖をつなぐRNAには、MBSが少なくとも１つ含まれているが、例えば2つ、3つ、またはそれ以上含まれていてもよい（例えば図２A）。二本鎖構造は、ステムループまたはヘアピンを含む。すなわち、二本鎖構造は、ステムループまたはヘアピンに含まれる二本鎖構造であってもよい。
　本発明においてmiRNA阻害複合体は、二本鎖構造を持つ、少なくとも1本のRNAまたはその類縁体を含む構造体であってよい。該複合体は、好ましくはRNAまたはその類縁体を含む分子を1分子または2分子含む。
　本発明においてmiRNA結合配列（MBS）とは、miRNAに結合する配列を言う。MBSは、miRNAに結合できるように、miRNAに相補的な部分を少なくも含んでいる。実施例に示す通り、MBSは、miRNAに完全に相補的な配列であってもなくてもよい。例えばMBSは、miRNAが標的とする天然のRNAの配列であってもよい。MBSは、例えばmiRNAに対して、少なくとも10塩基、例えば11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上、14塩基以上、15塩基以上、16塩基以上、17塩基以上、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、21塩基以上、22塩基以上、23塩基以上、または24塩基以上の相補的な塩基を連続または非連続に含む。好ましくは、該相補的な塩基は連続しているか、あるいは3箇所以下、2箇所以下、好ましくは1箇所のギャップを有する。ギャップは、MBS側および/またはmiRNA側の不対合（バルジ）であってよく、１箇所のギャップについても、片方の鎖のみにバルジ塩基があるものであってもよく、両方の鎖に不対合の塩基を有していてもよい。好ましくは、少なくともMBS側に不対合塩基を含むように設計する。バルジおよびミスマッチの塩基数は、それぞれ１箇所のバルジおよびミスマッチあたり、片鎖あたり例えば6塩基以下、好ましくは5塩基以下、4塩基以下、3塩基以下、2塩基以下、または1塩基である。本発明において、バルジを形成し得るMBSは、完全に相補的な配列からなるMBSよりも高いmiRNA阻害効果を示した（実施例４）。従って、より高いmiRNA阻害効果を得るためには、バルジを形成するようにMBSを設計することが好ましい。例えば、MBSの3’末端から10番目および/または11番目の塩基が、miRNAと相補的になっていないか、あるいは10番目と11番目の間に余計な塩基を含むMBS（あるいは、miRNA中の標的配列（MBSとハイブリダイズする配列）の5'末端から10番目および/または11番目の塩基がMBSと相補的な塩基となっていないか、あるいは10番目と11番目のヌクレオチドの間に不対合の塩基を含むMBS）は、分解を受けにくく、高い活性が期待できる。この場合、例えばmiRNAの5'末端から10番目および11番目を含む塩基が不対合となるようにMBSを設計してもよく、例えば9～11番目、10～12番目、または9～12番目が不対合となるようにMBSを設計してもよい。また、miRNA側には不対合となる塩基はないが、MBS側に、3'末端から10番目と11番目の間（あるいは、miRNA中の標的配列（MBSとハイブリダイズする配列）の5'末端から10番目および11番目に相当する部位の間）に不対合となる塩基を有していてもよい。不対合となる塩基は、miRNA側および/またはMBS側に存在してよいが、好ましくは少なくともMBS側に存在する。各鎖で不対合になるヌクレオチドの数は適宜調整することができるが、例えば1～6ヌクレオチドであり、好ましくは1～5ヌクレオチドであり、より好ましくは3～5、例えば3、4または5ヌクレオチドである。
　また、miRNAのターゲットの認識には、miRNAの5'端から2～7番目あるいは3～8番目の塩基（seed領域と呼ばれる）がマッチすることが重要であることが知られている（Jackson AL et al., RNA 12(7):1179-1187, 2006; Lewis BP et al., Cell 120: 15-20, 2005; Brennecke et al. PLoS BIOLOGY 3, 0404-0418, 2005; Lewis et al. Cell 115, 787-798, 2003; Kiriakidou et al. Genes & Development 18, 1165-1178, 2004）。実際、本発明のmiRNA阻害RNAは、seed領域しかマッチしておらず、他の領域とは低い相補性しか有さないMBSを持つものであっても、miRNAを効果的に阻害できることが示された（実施例６、図12）。本発明におけるMBSとしては、miRNAのseed領域（miRNAの5'端から2～7番目および/または3～8番目の塩基）が完全に相補的であるものが好ましい。この場合、G:U対（U:G対）も相補的とみなしてよいが、好ましくはG:C（C:G）およびA:U（U:A）のみを相補的とみなす。また本発明におけるMBSとしては、miRNAのseed領域（miRNAの5'端から2～7番目および/または3～8番目の塩基）が完全に相補的であって、miRNAに対して、少なくとも8塩基、より好ましくは9塩基、より好ましくは10塩基の相補的な塩基を連続して含むものが好ましい。さらに本発明におけるMBSは、miRNAに対して、合計11塩基以上、より好ましくは12塩基以上、より好ましくは13塩基以上の相補的な塩基を含むことが好ましい。
　MBSは、好ましくは、miRNA配列と生理的条件下でハイブリダイズする配列である。生理的条件下とは、例えば150 mM NaCl、15 mM sodium citrate、pH 7.0、37℃ である。より好ましくは、MBSは、miRNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列である。ストリンジェントな条件とは、例えば1×SSC（1×SSCは150 mM NaCl、15 mM sodium citrate、pH 7.0）または0.5×SSC、42℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、45℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、50℃の条件である。ハイブリダイゼーションにおいては、例えばmiRNA配列を含むRNAまたはMBSを含むRNAのどちらかを標識し、他方を膜に固定して、両者をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100 μg/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、例えば37℃、または45℃、または50℃で行えばよい。十分な時間（例えば3、4、5または6時間以上）インキュベートした後、上記の条件で洗浄を行い、標識した核酸がハイブリダイズしているかを検出することにより、当該条件で核酸がハイブリダイズするか否かを決定することができる。
　あるいはMBSは、好ましくは、miRNA配列の相補配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、93%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の同一性を有する塩基配列である。塩基配列の同一性は、例えばBLASTプログラム（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメータを用いて検索を行うことができる（Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。miRNA配列の塩基配列の外側のギャップは無視し、内側のギャップは例えばミスマッチと同様に扱い、アライメントにおけるmiRNA配列の塩基配列全体（配列の内側に入れたギャップを加算したトータルの塩基の長さ）に対する同一性の値を計算する。但し、実施例に示した通り、MBSとmiRNAとのミスマッチはmiRNAの阻害活性を上昇させ得る。従って、例えばアライメントの内側においてmiRNA配列に挿入したギャップは無視して同一性を算出することが好ましい。
　あるいはMBSは、好ましくは、miRNA配列の相補配列に対して、1または数個の塩基を挿入、置換、および/または欠失させた配列からなる。好ましくは、MBSは、miRNA配列の相補配列に対して8塩基以内、7塩基以内、6塩基以内、5塩基以内、4塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、または1塩基の挿入、置換、および/または欠失を有する配列からなる。より好ましくは、MBSは、miRNA配列の相補配列に対して8塩基以内、7塩基以内、6塩基以内、5塩基以内、4塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、または1塩基の挿入を有する配列からなる。本発明において、MBSは、miRNA配列と完全に相補的な配列よりも、ミスマッチを有する配列の方がmiRNAの阻害活性が高いことが示された。これはMBSが完全に相補的であると、miRNAを含むRISCにより切断を受け、それによりmiRNA阻害RNAの発現レベルが低下することに起因すると考えられる。特に、MBSがmiRNAとハイブリダイズしたときに、MBSの3'末端から10番目および/または11番目の塩基が不対合となる（あるいは、MBSとハイブリダイズするmiRNA側の標的配列の5'末端から10番目および/または11番目の塩基がMBSとハイブリダイズさせたときに不対合となる）か、あるいは10番目と11番目のヌクレオチドの間に不対合の塩基を含むように設計したMBSは高い活性が期待できる。このような不対合は、例えばMBS側のバルジであってよく、バルジを形成する塩基は1～6塩基、好ましくは1～5塩基、より好ましくは3～5塩基（例えば3、4または5塩基）である。
　MBSは、RNAからなっていてもよく、あるいは核酸類塩体を含んだり、または核酸類塩体からなっていてもよい（実施例７）。特にMBSの切断される部位（MBSの3'末端から10番目および/または11番目の塩基等）を、切断が起こらないように核酸類塩体することで、miRNA阻害効果の上昇が期待できる。また、ホスホチオエートや2'-O-メチルなどのバックボーンや糖を有する核酸を用いることも好適である（Krutzfeldt, J. et al., Nucleic Acids Res. 35: 2885-2892; Davis, S. et al., 2006, Nucleic Acids Res. 34: 2294-2304）。
　本発明のmiRNA阻害複合体が標的とするmiRNAに特に制限はない。miRNA構造をとるものであれば、植物、線虫、脊椎動物等のいかなる種由来のものにも適用可能である。miRNAの配列は、ヒト、マウス、ニワトリ、ゼブラフィシュ、シロイヌナズナをはじめとする数多くの生物において、非常に多数が知られている（miRBase::Sequencesのウェブページを参照：microrna.sanger.ac.uk/sequences/）。例えば、マウス、ラット、ヤギ等の含む哺乳動物、サルを含む霊長類、およびヒトのmiRNAを標的とすることができる。例えば、miR21（Lagos-Quintana M et al., Science. 294:853-858, 2001; Mourelatos Z et al., Genes Dev. 16:720-728, 2002; Michael MZ et al., Mol Cancer Res. 1:882-891, 2003; Dostie J et al. RNA. 9:180-186, 2003）、miR140（Lagos-Quintana M et al., Curr Biol. 12:735-739, 2002; Cai X et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102:5570-5575, 2005）、miR1995（Lagos-Quintana M et al., RNA. 9:175-179, 2003; Landgraf P et al., Cell. 129:1401-1414, 2007）、miR16（Lagos-Quintana M et al., Science. 294:853-858, 2001; Mourelatos Z et al., Genes Dev. 16:720-728, 2002; Lim LP et al., Science. 299:1540, 2003; Calin GA et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 99:15524-15529, 2002; Michael MZ et al., Mol Cancer Res. 1:882-891, 2003）、miR497（Bentwich I et al., Nat Genet. 37: 766-770, 2005; Landgraf P et al., Cell. 129:1401-1414, 2007）等が例示できるが、これらに限定されない。
　また本発明の上記miRNA阻害複合体は、第１の多重鎖構造に加え第２の多重鎖構造をさらに含み、第１の多重鎖構造の一端にある２つの鎖に、MBSを含むRNA鎖がそれぞれ１本ずつ結合する構造となっており、第１の多重鎖構造と第２の多重鎖構造の間に挟まれるように、該RNA鎖のそれぞれの他端が、該第２の多重鎖構造の一端にある2つの鎖にそれぞれ結合しているmiRNA阻害複合体に関する。多重鎖構造は2本鎖であってもよく、あるいはG-quadruplex（G-クアドルプレックス）のような4本鎖であってもよい。第１の多重鎖構造は2本鎖で、第2の多重鎖構造は2本鎖または4本鎖とすることが好適である。例えば本発明は、第１の二本鎖構造に加え第２の二本鎖構造をさらに含み、第１の二本鎖構造においてMBSが結合している方の末端の２つの鎖は、MBSを含むRNA鎖がそれぞれ１本ずつ結合する構造となっており、第１の二本鎖構造と第２の二本鎖構造の間に挟まれるように、該RNA鎖のそれぞれの他端が、該第２の二本鎖構造の2つの鎖にそれぞれ結合しているmiRNA阻害複合体に関する。当該RNA複合体は、例えば少なくとも２つの二本鎖構造を有し、該２つの二本鎖構造を構成する4つのRNA鎖のそれぞれが、残る3つのいずれの鎖も介することなく、MBSを含むRNAに結合している構造を有している。このようなmiRNA阻害複合体をより分かりやすく言えば、MBSを含む２本のRNA鎖が、２つの二本鎖構造に挟まれるように、２つの二本鎖構造の各鎖にそれぞれ結合しているmiRNA阻害複合体である（図２(C)）。すなわち図２(C)の構造を持つRNA複合体であって、二本鎖構造IおよびIIにRNA鎖aおよびbが挟まれており、該aおよびbにそれぞれ１つ以上のMBSを含むRNAは、本発明に含まれる。MBSを含む２本のRNA鎖は、二本鎖構造の対合しているそれぞれの鎖に結合しているので、RNA鎖の方向は互いに反対方向となる（図２、#12～#16）。このように二本鎖の各鎖にそれぞれMBSを付加することにより、より高いmiRNA阻害活性を発揮させることが可能となる。
　２つの二本鎖構造に挟まれるように存在するMBSを含む2本のRNA鎖には、それぞれ１つ以上のMBSが含まれている。それらのMBSは同じ配列であってもよく、違っていてもよい。また同じmiRNAを標的とするものであってもよく、異なる標的miRNAに結合する配列であってもよい。例えば、１つの鎖に2つ以上、例えば2、3、4、または5個のMBSが含まれていてよい（図２、#12～#16）。例えば、2つの二本鎖構造に挟まれた各鎖に1つまたは2つのMBSを含んでよい。例えば、本発明のmiRNA阻害複合体は、トータルで2つのMBSを含むものであってよく、それら2つのMBSは、同一の配列、または同一のmiRNAに結合する配列であってよい。
　本発明のmiRNA阻害複合体に含まれる二本鎖の対合するそれぞれの鎖は、上述の通り別々のRNA分子であってもよいし、二本鎖の一方または両方の末端がつながっており、直鎖状または環状となっていてもよい。なお直鎖状とは環状に対する言葉であって、末端を有していることを意味するに過ぎず、当然のことながら、二次構造を形成していないことを意味するものではない。直鎖状一本鎖RNAにより構成されるmiRNA阻害複合体は、例えば一回のRNA合成により作製し得るし、また発現ベクター等を用いて１つの発現ユニットから発現させることもできる。例えば、２つの二本鎖構造を含む場合、第２の二本鎖構造の一端（MBSが結合していない側）の２つの鎖をループにより連結して全体を一本鎖とすることができる。二本鎖をつなぐ配列中には、1つまたはそれ以上のMBSが含まれていてよい（図２、#2、#11、#13、#14、#16）。配列をなるべくコンパクトにするには、二本鎖を短いループにより連結させることができる。例えば1～10塩基、好ましくは1～8塩基、2～6塩基、3～5塩基、例えば4塩基の配列で二本鎖を結合させることができる。配列は特に制限はない。例えば 5'-GUCA-3' が挙げられる（図６A）。例えば本発明は、図２(A)#13または図２(D)の構造を持つRNAであって、二本鎖構造IおよびIIにRNA鎖aおよびbが挟まれており、二本鎖構造IIはヘアピン（またはステム・ループ）を形成しており、該aおよびbにそれぞれ１つ以上のMBSを含むRNAが含まれる。
　本発明のmiRNA阻害複合体に含まれる二本鎖構造は、配列に特に制限はないが、好ましくは4塩基対以上の長さを有する。特に、本発明のRNA複合体に含まれる二本鎖構造の少なくとも１つ（すなわち第一の二本鎖構造）は、RNA複合体の核外輸送に重要な機能を持つ。この二本鎖の鎖長は、例えば15～50塩基対であってよく、好ましくは15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、または45塩基、あるいはそれらのいずれか以上であり、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、または18塩基、あるいはそれらのいずれか以下である。より好ましい態様では、二本鎖構造の塩基対の長さは、例えば15～30、好ましくは16～28、好ましくは17～25、好ましくは17～24、例えば17、18、19、20、21、22、23、または24である。20bpを超えても高い活性を発揮することはできるが、20bpを超えるdsRNAは、細胞質においてDicerによる切断の潜在的な標的となり得ることから、それを避けるために、本発明の複合体に含まれる二本鎖構造は20bp以下、例えば19bp以下、または18bp以下とすることができる。
　本発明のmiRNA阻害複合体に第二またはそれ以上の二本鎖構造が含まれる場合においては、これらの二本鎖構造の配列やその長さに特に制限はない。これらの二本鎖構造は、例えばmiRNA阻害複合体全体をコンパクトにするために、第一の二本鎖構造の長さよりも短くしてもよい。各二本鎖の鎖長は適宜調整してよいが、例えば4bp～20bpであり、例えば5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp、または7bp～8bpとしてよい。
　二本鎖構造を形成する塩基対の配列は、miRNA阻害複合体の中で特異的かつ安定に二本鎖を形成できるように適宜設計することができる。例えば、同じ塩基が長く（例えば8塩基以上、好ましくは7塩基以上、より好ましくは5塩基以上、より好ましくは4塩基以上、より好ましくは3塩基以上）連続するホモポリメリックな配列は避けることが好ましい。また、二塩基繰り返し配列や3～4塩基繰り返し配列などの、数塩基の配列がタンデムに繰り返す配列も避けることが好ましい。二本鎖部分のGC含量は適宜調整してよいが、例えば12％～85％、好ましくは15％～80％、20％～75％、25％～73％、32％～72％、35％～70％、37％～68％、または40％～65％である。一例を挙げれば、図６Aに示されているステムIおよびステムIIの配列を例示することができるが、それらに限定されるものではない。4本鎖としてはG-quadruplexが挙げられ、具体的にはGGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGGという配列とすることができる。ここでloopの配列は適宜選択することができ、例えば3つのループを共に1塩基（例えばM (AまたはC)）としたり、共に3塩基としたりすることができる（配列番号：167、168など）。
　MBSと二本鎖構造は、直接連結させてもよいし、他の配列を介して連結させてもよい。例えば、適当なリンカーまたはスペーサー配列を介して、MBSを二本鎖構造の端に結合させることができる。MBSを二本鎖部分に直接繋げても有意な阻害活性を得ることができるが、リンカー（またはスペーサーとも言う）を付加することにより、miRNAに対する阻害効果がより上昇する（実施例４）。MBS配列と二本鎖構造との間のリンカーまたはスペーサー配列は、MBSがRISCに存在するmiRNAへのアクセシビリティーを増加させる可能性がある。リンカーまたはスペーサーの長さは適宜調整してよいが、例えば1～10塩基、好ましくは1～9塩基、1～8塩基、1～7塩基、1～6塩基、1～5塩基、1～4塩基、または1～3塩基である。例えば、2つ以上のMBSをつなげる場合であっても、リンカーまたはスペーサーを介して連結させるとよい。リンカーまたはスペーサーの配列は特に制限はないが、例えばAおよび/またはCからなる配列、あるいはAおよび/またはCをその他の塩基よりも多く含む配列とすることができる。またリンカーまたはスペーサー配列は、向かい合ったリンカーまたはスペーサー配列や、MBSとの間で安定な塩基対を形成しないよう配慮することが好ましい。一例を挙げれば、AAC、CAA、ACC、CCA、またはそれらのいずれかを含む配列等を例示できる。MBSに両側に付加する一対のリンカーまたはスペーサー配列は、インバートした配列（鏡像配列）にしてもよい。例えばMBSの5’側にAAC、3’側にCAAを付加することができる。
　また本発明のmiRNA阻害複合体を構成する核酸は修飾されていてもよい。例えば核酸を構成するヌクレオチドは、天然のヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、人工のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであってよい。また本発明のmiRNA阻害複合体に含まれる核酸は、RNAからなっていてもよく、またはRNA・DNAキメラであってよく、あるいはその他の核酸類縁体を含んでもよく、それらの任意を組み合わせを含んでよい。核酸には、リン酸ジエステル結合により結合しているもののみならず、アミド結合やその他のバックボーンを有するもの（ペプチド核酸(PNA)等）が含まれる。核酸類縁体には、例えば天然および人工の核酸が含まれ、核酸誘導体、核酸アナログ、核酸派生体等であってよい。そのような核酸類縁体は当該分野において周知であり、例えばホスホロチオエート、ホスホアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2'-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）が含まれるが、これらに限定されない。PNAの骨格には、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィナミド、ポリスルホンアミド、またはそれらの組み合わせからなる骨格を含んでよい（Krutzfeldt, J. et al., Nucleic Acids Res. 35: 2885-2892; Davis, S. et al., 2006, Nucleic Acids Res. 34: 2294-2304; Boutla, A. et al., 2003), Nucleic Acids Res. 31: 4973-4980; Hutvagner, G. et al., 2004, PLoS Biol. 2: E98; Chan, J.A. et al., 2005, Cancer Res. 65: 6029-6033; Esau, C. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 52361-52365; Esau, C. et al., 2006, Cell Metab. 3: 87-98）。
　核酸の修飾は、エンドヌクレアーゼによる分解を阻害するために行われ得る。特に好ましい修飾には、2'または3'糖修飾、例えば2'-O-メチル（2'-O-Me）化ヌクレオチドまたは2'-デオキシヌクレオチド、または2'-フルオロ、ジフルオロトルイル、5-Me-2'-ピリミジン、5-アリルアミノ-ピリミジン、2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE）、2'-O-アミノプロピル（2'-O-AP）、2'-O-N-メチルアセタミド（2'-O-NMA）、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル（2'-DMAEOE）、2'-O-ジメチルアミノエチル（2'-O-DMAOE）、2'-O-ジメチルアミノプロピル（2'-O-AP）、2'-ヒドロキシヌクレオチド、ホスホロチオエート、4'-チオヌクレオチド、2'-O-トリフルオロメチルヌクレオチド、2'-O-エチル-トリフルオロメトキシヌクレオチド、2'-O-ジフルオロメトキシ-エトキシヌクレオチド、または2'-アラ－フルオロヌクレオチド、Locked核酸（LNA）、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸 (2'-O,4'-C-ethylene bridged nucleic acid (ENA)) などのエチレン核酸、その他の bridged nucleic acid (BNA)、ヘキシトール核酸（hexitol nucleic acid; HNA）、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA（tcDNA）、ポリエーテル核酸（US Pat. No. 5,908,845）、シクロヘキセン核酸（CeNA）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。またジフルオロトルイル（DFT）修飾、例えば2,4-ジフルオロトルイルウラシル、またはグアニジンのイノシンへの置換を行ってもよい。
　また、核酸は末端に結合体を含んでよい。結合体としては、例えば親油性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイド、およびペプチド等が挙げられる。具体的には、C5-アミノアルキルdT、ナプロキセン、ニトロインドール、葉酸、コラン酸、イブプロフェン、レチノイド、ポリエチレングリコール（PEG）、C5ピリミジンリンカー、グリセリド脂質（例えばジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンE、コレステロール、チオコレステロール、dU-コレステロール、アルキル鎖、アリール基、複素環式複合体、および修飾糖（D-リボース、デオキシリボース、グルコースなど）が例示できる。結合体と核酸は、例えば任意のリンカーを介して結合させることができ、具体的には、ピロリジンリンカー、セリノールリンカー、アミノオキシ、またはヒドロキシプロリノールリンカー等が挙げられる。また、核酸には適宜、細胞透過シグナルを付加することができる。例えば、核酸を細胞に導入するための細胞透過性ペプチドが多数知られている（WO2008/082885）。具体的には、例えばポリアルギニンなどのアルギニンリッチなペプチドが挙げられ、例えばHIV-1 Tat(48-60)、HIV-1 Rev(34-50)、FHV Coat(35-49)、BMV Gag(7-25)、HTLV-II Rex(4-16)、それらの部分ペプチド、またはそのインベルソ（inverso）又はレトロインベルソ（retro-inverso）などであってよい。好適な一例は、配列番号：152に示したHIV-1 Tat 57-49である。アミノ酸は、適宜d体を用いてよい。細胞透過性ペプチド等は、周知のリンカーにより、核酸に結合させればよい。
　本発明のmiRNA阻害複合体は直鎖状の一本鎖核酸により構成されるように設計することができる（図２）。本発明は特に、MBSの全てがある二本鎖構造（図２のステムI）の片側（図２においては右側）に集中しており、該二本鎖構造の各鎖は、その側で閉じた構造となっており（すなわちMBSを含む配列によりつながっており）、該二本鎖構造の反対側に一本鎖RNAの両端があるような複合体に関する（図２）。MBSを含む配列中には、さらなる多重鎖（例えば二または四本鎖）構造（図２のステムIIやIIIなど）を含んでもよい。一本鎖RNAの長さは適宜決めてよいが、例えば500塩基内、好ましくは450塩基以内、420塩基以内、400塩基以内、380塩基以内、360塩基以内、340塩基以内、320塩基以内、300塩基以内、280塩基以内、260塩基以内、240塩基以内、220塩基以内、200塩基以内、180塩基以内、160塩基以内、140塩基以内、120塩基以内、100塩基以内、または80塩基以内である。例えば２つの二本鎖構造と２つのMBSを持つ複合体を形成する一本鎖RNAの長さは、例えば60～300塩基、好ましくは70～250塩基、80～200塩基、90～180塩基、または100～150塩基である。第一の二本鎖構造（一本鎖RNAの両端に近い二本鎖構造）は、例えば15～30bp、好ましくは16～28bp、好ましくは17～25bp、好ましくは17～24bp、例えば17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、または24bpとすることができ、第二の二本鎖構造（MBSを含む配列中に含まれるさらなる二本鎖構造）は、全体をコンパクトにするために、第一の二本鎖構造の長さよりも短くしてもよく、例えば4bp～20bpであり、例えば5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp、または7bp～8bpとしてよい。
　また本発明は、本発明のmiRNA阻害複合体を構成するRNA（ここでRNAとしては、天然のRNAおよび核酸類縁体を含む）、および該RNAをコードする核酸（DNAまたはRNA）に関する。miRNA阻害RNA複合体が1分子のRNAにより構成されている場合は、そのRNAの分子内アニーリングにより、また2本以上のRNA分子により構成されている場合は、それらのRNAをアニールさせることにより、本発明の複合体を構築することができる。これらのRNAは適宜合成することができる。例えば、RNAの化学合成により所望のRNAを製造することができる。あるいは、該RNAを発現する発現ベクターにより、RNAを発現させることもできる。発現ベクターは特に制限はなく、例えば大腸菌などのバクテリア、酵母等の真核細胞、昆虫細胞、植物細胞、または動物細胞等で発現する所望の発現ベクターを用いることができる。例えば、植物、昆虫、動物等の高等真核生物の細胞で発現するベクターを用いて、それらの細胞中でRNAを発現させ、miRNAの機能を阻害することが考えられる。RNAを転写させるためのプロモーターは特に制限はなく、Pol Iプロモーター、Pol IIプロモーター、Pol IIIプロモーター、バクテリオファージのプロモーター等を用いることができる。例えばバクテリオファージの転写酵素とそのプロモーターを有するベクターを同時に導入して用いる場合には、T4ファージやT7ファージのRNAポリメラーゼやプロモーターを例示することができる。またポリメラーゼII（Pol II）プロモーターとしては、例えばCMVプロモーターやβ-globinプロモーター等を例示することができる。数百塩基以内の比較的短いRNAを発現させるためには、Pol IIよりも高い発現量が見込めるポリメラーゼIII（Pol III）プロモーターを利用することが好ましい。Pol IIIプロモーターとしては、U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーター、7SKプロモーター、7SLプロモーター、Y3プロモーター、5S rRNAプロモーター、Ad2 VAIおよびVAIIプロモーター等を例示することができる（Das, G. et al., 1988, EMBO J. 7:503-512; Hernandez, N., 1992, pp. 281-313, In S. L. McKnight and K. R. Yamamoto (ed.), Transcriptional regulation, vol. 1. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Kunkel, G. R., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:1-9; Lobo, S. M., and N. Hernandez, 1989, Cell 58:55-67; Mattaj, I. W. et al., 1988, Cell 55:435-442; Geiduschek, E.P. and G.A. Kassavetis, 1992, pp.247-280, In Transcriptional regulation. Monograph 22 (ed. S.L. McKnight and K.R. Yamamoto), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.）。特に、数多くのsnRNAや細胞質RNA遺伝子に見出されるClass 3プロモーターが例示でき、例えばU6, 7SK, hY1 および hY3, H1, および MRP/Th RNA遺伝子のプロモーターが挙げられる（Hernandez, N., 1992, pp. 281-313, In Transcriptional regulation. Monograph 22 (ed. S. McKnight and K.R. Yamamoto), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。例えばhuman U6、human H1、human 7SKあるいは mouse U6プロモーター等を好適に用いることができる。特に、7SKプロモーターを用いて本発明のmiRNA阻害RNAを発現させた場合、極めて高い効率で標的miRNAを阻害できることが実施例において示された。Pol IIIプロモーターを用いる場合、転写させるRNAをコードするDNAの下流に、例えば4～7塩基程度のポリ(T) tractを付加することにより、転写のターミネーターとして機能させることができる。
　このようにして構築した転写ユニットは、そのまま発現に用いることもできるし、さらに別のベクター系に組み込んで用いることもできる。ベクターとしては、特に制限はなく、発現プラスミドや所望のウイルスベクター等を利用することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに制限されない（Miller, A.D. et al. (1991) J. Virol. 65, 2220-2224; Miyake, S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8802-8806; Samulski, R. J. et al. (1989) J. Virol. 63, 3822-3828）。例えば、Pol IIIプロモーターを含む転写ユニットは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）のLTR中に組み込んで用いられてもよい。レトロウイルスベクターに組み込むことにより、標的細胞へ高い効率で遺伝子を導入することができるようになる他、導入遺伝子が染色体に組み込まれるため、長期間安定してmiRNAを阻害することが可能となる。用いられるレトロウイルスとしては特に制限はなく、例えばエコトロピックウイルスベクター（Kitamura, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 9146-9150）、アンフォトロピックウイルスベクター、VSV-G等によりシュードタイプ化されたウイルスベクター（Arai, T. et al. (1998) J. Virol. 72, 1115-1121）、HIVベクター、SIVベクター、FIVベクター等のレンチウイルスベクター（Shimada, T. et al. (1991) J. Clin. Inv. 88, 1043-1047）などが含まれる。例えばMoMLVベースのレトロウイルスベクターや、HIVベースのレンチウイルスベクターを用いることができる。LTRに組み込む場合、例えばU3領域に欠失（ΔU3）を有するLTRのΔU3領域に組み込むことができる（図15）。このましい態様においては、ベクターは、細胞に導入後1週間以上、好ましくは2週間以上、3週間以上、4週間以上、または1箇月以上にわたり、miRNA阻害RNAを発現し、miRNAの機能を阻害することができる。
　前述の通り、miRNA阻害RNA複合体を一本鎖の直鎖状RNA分子から構成されるように設計した場合、このRNAを転写する一種類の発現ベクターを細胞に導入するだけで、細胞内でmiRNA阻害RNA複合体を形成させ、目的のmiRNAを阻害することができるので好都合である。この場合、既に述べた通り、miRNA阻害RNA複合体に含まれる１または複数のMBSの全てが、ある二本鎖構造（第一の二本鎖構造；図２のステムIに相当）の片側のみに存在し、該片側の二本鎖は、MBSを含むRNAによりつながれるように（すなわち閉じたように）設計し、該二本鎖構造の反対側は、直鎖状RNA鎖の両端となるようにすることができる。こうすることで、該二本鎖構造を形成する部分および直鎖状一本鎖RNAの両端に相当する部分は、MBSによらない定常領域であり、該一本鎖RNAの部分だけが、MBSにより変わりうる可変領域とすることができる。すなわち、このような構造を持つRNAは、miRNA阻害の効率性と製造のしやすさを兼ね備えたものである。該MBSを含むRNAは、2つ以上のMBSを含んでよく、MBSの間にステム（またはステムループ）を形成する配列を含んでよい。ステムは例えば2または4本鎖のステムであってよい。
　miRNA阻害RNA複合体を構成する一本鎖RNAをこのように設計すれば、定常領域となる二本鎖構造を構成する一対の相補配列をコードするベクター（例えばmiRNA阻害RNA発現用カセット）を予め構築しておき、その一対の相補配列の間に、目的のmiRNAに結合するMBSをコードするDNAを挿入することにより、目的のmiRNAに応じてmiRNA阻害RNA複合体を発現するベクターを簡便に構築することが可能となる（図６）。一対の相補配列の上流には、適宜プロモーターを配置してよい（図６B）。プロモーターとしては、特に制限はないが、Pol IIIプロモーターは好適である。また、一対の相補配列の下流には、ターミネーターを配置することができる。一対の相補配列を発現するDNAは、miRNA阻害RNA複合体を構成する一本鎖RNAを発現させるために極めて有用である。一対の相補配列の間には、MBSをコードするDNAを挿入することができるように、適宜挿入部位を設計することができる。挿入部位としては、所望の制限酵素認識配列（マルチクローニングでもよい）や、att配列などの部位特異的組み換え配列などであってもよく、あるいは直ぐに挿入できるように予め切断されていてもよい。
　また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAをコードする核酸（例えばDNA）を製造する方法であって、少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする2本鎖DNAの間に、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする2本鎖DNAを挿入する工程を含む方法に関する。また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAを発現する核酸（例えばDNA）を製造する方法であって、プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする2本鎖DNAの間に、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする2本鎖DNAを挿入する工程を含む方法に関する。
　また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAをコードする核酸を製造するための核酸であって、少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸および/またはその相補鎖に関する。また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAをコードする核酸を製造するための組成物であって、少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸および/またはその相補鎖を含む組成物に関する。組成物は、適宜薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAを発現するベクターを製造するための核酸であって、プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸および/またはその相補鎖に関する。また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAを発現するベクターを製造するための組成物であって、プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸および/またはその相補鎖を含む組成物に関する。
　また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAをコードする核酸を製造するための核酸（例えばDNA）であって、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸および/またはその相補鎖に関する。また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAをコードする核酸（例えばDNA）を製造するための組成物であって、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸および/またはその相補鎖を含む組成物に関する。
　また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAをコードする核酸を製造するための、少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸および/またはその相補鎖の使用に関する。また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAを発現するベクターを製造するための、プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸および/またはその相補鎖の使用に関する。また本発明は、本発明のRNA複合体を構成するRNAをコードする核酸を製造するための、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸および/またはその相補鎖の使用に関する。
　また上記の核酸の任意の組み合わせは、本発明のRNA複合体を構成するRNAをコードする核酸を製造するためのキットの要素とすることができる。特に本発明は、少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸およびその相補鎖を含むキットに関する。該核酸および相補鎖は、2本鎖DNAを形成していてよい。また１対の相補配列を含む2本鎖DNAには、プロモーターおよび/またはターミネーターが機能的に連結されていてよい。該核酸は、例えば発現プラスミドであってよい。またキットには、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸および/またはその相補鎖をさらに含んでいてよい。例えば本発明は、本発明のRNA複合体を発現するベクターを製造するためのキットであって、（ａ）プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列と、該一対の相補配列の間に核酸を挿入するための部位とを含む核酸、および（ｂ）少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸、を含むキットに関する。
　上記少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸の間に、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸を挿入することにより、本発明のRNA複合体をコードする核酸を簡便に得ることができる。各核酸の構造は、本発明のRNA複合体について詳述した通りである。例えば二本鎖構造を形成する１対の相補配列は、適宜決められてよく、その鎖長は、例えば15～50塩基対であってよく、好ましくは15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、または45塩基、あるいはそれらのいずれか以上であり、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、または18塩基、あるいはそれらのいずれか以下である。より好ましい態様では、二本鎖構造の塩基対の長さは、例えば15～30、好ましくは16～28、好ましくは17～25、好ましくは17～24、例えば17、18、19、20、21、22、23、または24である。好ましい態様では、当該核酸は二本鎖核酸であり所望のプロモーターが機能的に連結されている。プロモーターは、好ましくはPol IIIプロモーターである。１対の相補配列の間には、核酸を挿入するための部位を有することができ、例えば核酸を挿入しやすいように制限酵素認識配列を持つことができる。すなわち本発明は、本発明のRNA複合体を発現する核酸を製造するためのベクターであって、プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列と、該一対の相補配列の間に核酸を挿入するための部位とを含む核酸を含むベクターに関する。制限酵素認識配列としてはBsmBI配列を例示することができるが、これは例示に過ぎず適宜選択することができる。
　少なくとも１つのMBSをコードする核酸は、2つ以上のMBSを含んでもよく、また多重鎖（例えば二または四本鎖）構造を形成し得る１対またはそれ以上の相補配列のセットを一続きの配列中に含んでいてもよい。例えば、当該核酸としては少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列と、該一対の相補配列の両端にそれぞれ少なくとも１つのMBSをと含む核酸が例示できる。このような核酸は、具体的には、2つのMBSの間に、ステムを形成し得る一対の相補配列を含んでいる核酸である。このステムは、上記第二の二本鎖構造に相当する。あるいは第二の多重鎖構造としてG-quadruplexを形成する配列を含んでもよい。
　また当該核酸は、2つのMBSの間に二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列を含む構造単位を、2個以上含んでいてもよい。その構造単位は複数入れ子状に含むことができ、1対のMBSの間にある二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列の間に、さらに1対のMBSとその間に二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列を含む配列を含むことができる（図２の#15や#16等）。複数含まれているMBSの配列は同一であっても異なっていてもよい。
　このような核酸を上記の1対の相補配列の間に挿入すると、第一の二本鎖構造を形成する一対の相補配列（図６のステムI）の間に、MBS－第二の多重鎖構造を形成する配列－MBSの構造を持つ配列が挿入された構造を持つ核酸が得られる。具体的には、例えばMBS－第二の二本鎖構造を形成する一対の相補配列（図６のステムII）－MBSの構造を持つ配列が挿入された構造を持つ核酸である。これを転写させることで、MBSを含む2本の鎖が２つの多重鎖（例えば二本鎖）構造に挟まれるように配置されたRNA複合体をコードする核酸を得ることができる（図６）。2つの多重鎖（例えば二本鎖）構造とその間の一対の対向する一本鎖（それぞれにMBSを含む）からなる核酸は、コンパクトでかつ十分なmiRNA阻害活性を示す。
　二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列とMBSは、適宜リンカーやスペーサーを介して連結させることができる。リンカーやスペーサーの長さは明細書に記載した通りである。また、相補配列はリンカーやスペーサーを介して連結してよく、二本鎖を形成したときに、当該リンカーやスペーサーはループとなり、二本鎖を合わせてステムループを形成する。ループの長さも適宜調整してよく、詳細は明細書に記載した通りである。あるいは4本鎖とする場合は、G-quadruplexを形成する配列を適宜用いることができる。
　MBSをコードする核酸と、その相補鎖を合成し、両者をアニールする（例えば図６Bの合成オリゴDNA）。アニールした2本鎖核酸の末端は、制限酵素切認識部位に挿入する場合には、それに合わせて、適宜制限酵素で切断された末端と同じ構造にすることができる。
　本発明のmiRNA阻害複合体、または該複合体を構成するRNA（ここでRNAとしては、天然のRNAおよび類縁体を含む）、あるいは該RNAを発現するベクターは、miRNAを阻害するための組成物とすることができる。本発明の組成物は、標的miRNAを特異的かつ効率的に阻害できるので、miRNAの阻害を介した遺伝子の機能制御に有用である。本発明の組成物は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。それらには、通常核酸の懸濁に用いられる所望の溶液が挙げられ、例えば蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。また植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。また本発明の組成物は、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などを担体として組み合わせることもできる。本発明の組成物は、所望の試薬として、または医薬組成物として使用できる。また本発明は、本発明の組成物、本発明のmiRNA阻害複合体、または該複合体を構成するRNAもしくは該RNAを発現するベクターの、miRNAを阻害するための使用を提供する。また本発明は、それらのいずれかを含むmiRNA阻害剤を提供する。
　細胞への導入はin vitro、ex vivoまたはin vivoで行うことができる。細胞を介して投与する場合は、適当な培養細胞または接種対象動物から採取した細胞などに導入する。核酸の導入としては、リン酸カルシウム共沈殿法、リポフェクション、DEAEデキストラン法、注射針等により直接DNA溶液を組織に注入する方法、ジーンガンによる導入などが挙げられる。ウイルスベクターは、標的細胞に対して高い効率で遺伝子を導入することができるため好ましい。投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、投与対象動物、投与部位、投与回数などに応じて適宜調整してよく、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができる。投与対象は、好ましくは哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む）である。具体的には、ヒト、サル等の非ヒト霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびその他の哺乳動物が含まれる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
[実施例１]
1.1 プラスミド構築
　下記（１）に示したオリゴヌクレオチドをアニールさせ、NotIおよびSalIで切断したpMXs-GIN（Haraguchi, T. et al. (2007) FEBS Lett, 581, 4949-4954）にクローニングし、それぞれmiR-140-5p および miR-140-3pのGFPレポーターであるpMXs-GIN-miR140-5pT および pMXs-GIN-miR140-3pTを作製した。pMXs-GFP（Kitamura, T. (1998) Int J Hematol, 67, 351-359）の0.7kb BamHI-EcoRI断片をpcDNA3.1 (Invitrogen)のBamHI-EcoRI部位に挿入し、pcDNA3.1-GFPを作製した。pcDNA3.1-GFPのBamHI 部位および EcoRI部位を、Klenow fragmentでそれぞれフィルインした。このプラスミドの1.7kb BglII-EcoRV 断片をpQCXIH (Clontech)のBglII-EcoRV部位に挿入してpSSCGを作製した。pIRES1Hyg (Clontech)の1.3kb HindIII-XbaI断片をpcDNA3.1のHindIII-XbaI部位に挿入してpCMV-Hygを作製した。pCMV-Hygの2.1kb NruI-ApaI断片をpSSCGのNruI-EcoRV部位に挿入してpSSCHを作製した。miR-140-5p/140-3p発現レトロウイルスベクタープラスミドを構築するため、下記（１）に示したプライマー対を用いてマウスゲノムからPCRにより 0.5-kb マウス miR-140-5p/140-3p断片を増幅し、PCR産物をpCR2.1 (Invitrogen)にクローニングした。このプラスミドの0.5-kb BamHI-XhoI断片をBamHIおよびSalIで消化したpSSCH にクローニングし、pSSCH-miR140-5p/140-3pを作製した。
用いたオリゴヌクレオチド
（１）GFPレポーターベクター構築のためのプライマー対
　pMXs-GIN-miR140-3pT のためには、センス鎖 5'- GGCCGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGGG -3'（配列番号：1）およびアンチセンス鎖 5'- TCGACCCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGC-3'（配列番号：2）、pMXs-GIN-miR140-5pT のためには、センス鎖 5'- GGCCGCTCTACCATAGGGTAAAACCACTGGGG -3'（配列番号：3）およびアンチセンス鎖 5'- TCGACCCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGAGC -3'（配列番号：4）、PCR-miR140-5p/140-3p のためには、センス鎖 5'- TGCTTGCTGGTGGTGTAGTC -3'（配列番号：5）およびアンチセンス鎖 5'- ACCAACACCCACCCAATAGA -3'（配列番号：6）である。
　下記（２）に示したオリゴペアをアニールさせ、BbsI および EcoRIで消化したpmU6 にクローニングし、pmU6-TuD-shuttleを作製した。miRNA阻害RNA発現レンチウイルスベクタープラスミドを構築するため、下記（３）に示した一連のオリゴヌクレオチド対を合成した。各オリゴペアをアニールし、BsmBIで消化したpmU6-TuD-shuttleにクローニングした。その後、各mU6-TuD RNAカセットをレンチウイルスベクタープラスミド（pLSP）に、以前記載したようにサブクローニングした（Haraguchi, T. et al. (2007) FEBS Lett, 581, 4949-4954）。これらのカセットをpSL1180 (Pharmacia)のBamHI-EcoRI 部位にも挿入し、miRNA阻害RNA発現プラスミドベクターを作製した。下記（２）に示されているオリゴペアをアニールさせ、BbsI および EcoRIで消化したpmU6にクローニングし、pmU6-protoshuttleを作製した。阻害RNA発現レンチウイルスベクタープラスミドを構築するため、下記（４）に示した一連のオリゴヌクレオチド対を合成した。オリゴペア（デコイ RNA #1-12, 17-21）それぞれをアニールし、BbsI および EcoRIで消化したpmU6にクローニングした。オリゴペア（デコイ RNA #13-16）それぞれをアニールし、BsmBIで消化したpmU6-protoshuttleにクローニングした。オリゴペア（デコイ RNA #22-26）それぞれをアニールし、BsmBIで消化したpmU6-TuD-shuttleにクローニングした。mU6-デコイ RNA #27カセットの構築のために、下記（４）に示したオリゴペアをPCRのプライマーおよびテンプレートとして用い、PCT産物をpCR2.1にクローニングした。このプラスミドの0.2-kb BsmBI断片をBsmBIで消化したpmU6-TuD-shuttleにクローニングした。その後、各mU6-デコイ RNAカセットをレンチウイルスベクタープラスミド（pLSP）に、以前の通りにサブクローニングした（Haraguchi, T. et al. (2007) FEBS Lett, 581, 4949-4954）。
用いたオリゴヌクレオチド
（２）本発明のRNAのシャトルベクター構築のためのプライマー対
　pmU6-TuD-shuttleのためには、センス鎖 5'- TTTGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGGTACCGTCTCGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG -3'（配列番号：7）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCGAGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGT-3'（配列番号：8）、pmU6-protoshuttleのためには、センス鎖 5'- TTTGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG -3'（配列番号：9）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGT-3'（配列番号：10）を用いた。
（３）本発明のRNAの発現ベクター構築のためのプライマー対
　TuD-miR-140-5p-4ntinのためには、センス鎖 センス鎖 5'- CATCAACCTACCATAGGGTCATCAAAACCACTGCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCTACCATAGGGTCATCAAAACCACTGCAAG -3'（配列番号：11）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCTTGCAGTGGTTTTGATGACCCTATGGTAGGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGCAGTGGTTTTGATGACCCTATGGTAGGTT -3'（配列番号：12）を用いた。TuD-miR-140-3p-4ntinのためには、センス鎖 5'- CATCAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAG -3'（配列番号：13）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTT-3'（配列番号：14）を用いた。TuD RNA-miR140-3p-pfのためには、センス鎖 5'- CATCAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAA -3'（配列番号：15）およびアンチセンス鎖 5'- CATCTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTT -3'（配列番号：16）を用いた。TuD RNA-miR21-4ntinのためには、センス鎖 5'- CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG -3'（配列番号：17）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT -3'（配列番号：18）を用いた。TuD RNA-miR21-pfのためには、センス鎖 5'- CATCAACTCAACATCAGTCTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCTGATAAGCTACAAG -3'（配列番号：19）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCTTGTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGTT-3'（配列番号：20）を用いた。TuD RNA-NCのためには、センス鎖 5'- CATCAACAAGCCACAACGAATCTCTATATCATCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACAAGCCACAACGAATCTCTATATCATCAAG -3'（配列番号：21）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCTTGATGATATAGAGATTCGTTGTGGCTTGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGATGATATAGAGATTCGTTGTGGCTTGTT-3'（配列番号：22）を用いた。
（４）デコイRNA発現ベクターの構築のためのプライマー対
　デコイRNA #1のためには、センス鎖 5'- TTTGACGGCGCTGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCAGCGCCGTCTTTTTTG -3'（配列番号：23）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACGGCGCTGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCCAAGCATCCAGCGCCGT -3'（配列番号：24）を用いた。
　デコイRNA #2のためには、センス鎖 5'- TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG -3'（配列番号：25）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT -3'（配列番号：26）を用いた。
　デコイRNA #3のためには、センス鎖 5'- TTTGACAGCGCTCTACGATGAAGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGTTCATCGTAGAGCGCTGTCTTTTTTG -3'（配列番号：27）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACAGCGCTCTACGATGAACCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCTTCATCGTAGAGCGCTGT -3'（配列番号：28）を用いた。
　デコイRNA #4のためには、センス鎖 5'- TTTGACAGCGCTCTACGATGCAAGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGTTGCATCGTAGAGCGCTGTCTTTTTTG -3'（配列番号：29）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACAGCGCTCTACGATGCAACCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCTTGCATCGTAGAGCGCTGT -3'（配列番号：30）を用いた。
　デコイRNA #5のためには、センス鎖 5'- TTTGACAGCGCTCGCAGGATGCTTGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTGCGAGCGCTGTCTTTTTTG -3'（配列番号：31）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACAGCGCTCGCAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCAAGCATCCTGCGAGCGCTGT -3'（配列番号：32）を用いた。
　デコイRNA #6のためには、センス鎖 5'- TTTGACAGCGCTCAAAGCAGGATGCTTGGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTGCTTTGAGCGCTGTCTTTTTTG -3'（配列番号：33）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACAGCGCTCAAAGCAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCAAGCATCCTGCTTTGAGCGCTGT -3'（配列番号：34）を用いた。
　デコイRNA #10のためには、センス鎖 5'-TTTGACGGCGCTAGGATCATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGGTCACAGAATACGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3'（配列番号：35）およびアンチセンス鎖 5'-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCGTATTCTGTGACCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGAGATGATCCTAGCGCCGT-3'（配列番号：36）を用いた。
　デコイRNA #11のためには、センス鎖 5'-TTTGACGGCGCTAGGATCATCGTATTCTGGTCACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTATCTTCTCTAACGAGAGAAGAGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3'（配列番号：37）およびアンチセンス鎖 5'-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCTCTTCTCTCGTTAGAGAAGATACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTGACCAGAATACGATGATCCTAGCGCCGT-3'（配列番号：38）を用いた。
　デコイRNA #12のためには、センス鎖 5'-TTTGACGGCGCTAGGATCATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGGTCACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3'（配列番号：39）およびアンチセンス鎖 5'-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTGACCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGAGATGATCCTAGCGCCGT-3'（配列番号：40）を用いた。
　デコイRNA #13のためには、センス鎖 5'- CATCAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAA -3'（配列番号：41）およびアンチセンス鎖 5'- CATCTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTT -3'（配列番号：42）を用いた。
　デコイRNA #14のためには、センス鎖 5'- CATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGAGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTA -3'（配列番号：43）およびアンチセンス鎖 5'- CATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCTCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGA -3'（配列番号：44）を用いた。
　デコイRNA #15のためには、センス鎖 5'- CATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGGTCACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTA -3'（配列番号：45）およびアンチセンス鎖 5'- CATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTGACCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGA -3'（配列番号：46）を用いた。
　デコイRNA #16のためには、センス鎖 5'- CATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGAGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTA -3'（配列番号：47）およびアンチセンス鎖 5'- CATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCTCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGA -3'（配列番号：48）を用いた。
　デコイRNA #17のためには、センス鎖 5'- TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG -3'（配列番号：49）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT -3'（配列番号：50）を用いた。
　デコイRNA #18のためには、センス鎖 5'- TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAATCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG -3'（配列番号：51）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGATTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT -3'（配列番号：52）を用いた。
　デコイRNA #19のためには、センス鎖 5'- TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAACTCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG -3'（配列番号：53）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGAGTTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT -3'（配列番号：54）を用いた。
　デコイRNA #20のためには、センス鎖 5'- TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG -3'（配列番号：55）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT -3'（配列番号：56）を用いた。
　デコイRNA #21のためには、センス鎖 5'- TTTGACGGCGCTAGGATGCTTCCATCCCAGTACACATTTAAATCTGTGGTACCAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG -3'（配列番号：57）およびアンチセンス鎖 5'- AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATGCTTGGTACCACAGATTTAAATGTGTACTGGGATGGAAGCATCCTAGCGCCGT -3'（配列番号：58）を用いた。
　デコイRNA #22のためには、センス鎖 5'- CATCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACGTATTCTGGTCACAGAATACCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACG -3'（配列番号：59）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGTATTCTGTGACCAGAATACGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAG -3'（配列番号：60）を用いた。
　デコイRNA #23のためには、センス鎖 5'- CATCCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCGTATTCTGGTCACAGAATACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCG -3'（配列番号：61）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTATTCTGTGACCAGAATACGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGG -3'（配列番号：62）を用いた。
　デコイRNA #24 のためには、センス鎖 5'- CATCAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAG -3'（配列番号：63）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTT-3'（配列番号：64）を用いた。
　デコイRNA #25のためには、センス鎖 5'- CATCACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCAGTATTCTGGTCACAGAATACACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCAG -3'（配列番号：65）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTGTATTCTGTGACCAGAATACTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGT -3'（配列番号：66）を用いた。
　デコイRNA #26のためには、センス鎖 5'- CATCAACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCAAG-3'（配列番号：67）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCTTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTT-3'（配列番号：68）を用いた。
　デコイRNA #27のためには、センス鎖 5'- CGTCTCACATCAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAGCGACAAGAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAGTATTCTGAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGT-3'（配列番号：69）およびアンチセンス鎖 5'- CGTCTCATCATCTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTTGCGACAAGTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGG-3'（配列番号：70）を用いた。
　microRNA CMV sponge miR21発現ベクタープラスミドの構築のために、下記（５）に示したオリゴペアをPCRのプライマーおよびテンプレートとして用い、PCR産物をpCR2.1にクローニングした。このプラスミドの0.2-kb XhoI-AgeI断片をXhoI および AgeIで消化したpLenti6/V5-GW/lacZ (Invitrogen)にクローニングし、pLenti6/CMV-sponge-miR21/lacZを作製した。pCS2-Venusの 0.3-kb XbaI-ApaI 断片をpSL1180のXbaI-ApaI部位にクローニングしてpSL1180-polyAを作製した。pLenti6/CMV-sponge-miR21/lacZ の3.9-kb HindIII-AgeI断片をpSL1180-polyAのHindIII-AgeI 部位にクローニングしてpSL1180-CMVsponge21を作製した。Antagomir21 発現ベクタープラスミドを構築するため（Scherr, M. et al. (2007) Nucleic Acids Res, 35(22):e149）、下記（５）に示したオリゴペアをPCRのプライマーとして用い、 pSilencer 3.1-H1 hygro (Ambion) をテンプレートとして用いた。PCR産物をpCR2.1にクローニングし、このプラスミドの0.2-kb BglII-EcoRI断片をpSL1180のBamHI-EcoRI断片にクローニングしてpSL1180-H1Antagomir21を作製した。miR-21 eraser発現ベクタープラスミドを構築するため（Sayed, D. et al. (2008) Mol Biol Cell, 19(8):3272-82）、下記（５）に示したオリゴペアをPCRのプライマーとして用い、 pmU6 をテンプレートとして用いた。PCR産物をBamHI および EcoRIで消化し、pSL1180のBamHI-EcoRI断片にクローニングしてpSL1180-miR-21 eraserを作製した。
　ルシフェラーゼレポータープラスミドを構築するため、pGL4.74 (Promega)の0.8-kb KpnI-HindIII 断片をKpnI および HindIIIで消化したpGL4.12 (Promega) にクローニングしpTK4.12を作製した。下記（６）に示したオリゴヌクレオチド対をアニールし、pTK4.12の4.9-kb EcoRI-XbaI断片にライゲーションしてpTK4.12C.P-を作製した。下記（６）に示したオリゴヌクレオチド対をアニールさせ、XbaI および FseI で消化したpGL4.74にクローニングしてpGL4.74-miR21Tを作製した。
用いたオリゴヌクレオチド
（５）AntagomiR, miRNA eraser およびCMV sponge発現ベクター構築のために用いたプライマー対
　CMVsponge21のためには、センス鎖 5'- CTCGAGTAACTCAACATCAGGACATAAGCTAAGTCTCAACATCAGGACATAAGCTATCAGTCAACATCAGGACATAAGCTACTGATCAACATCAGGACATAAGCTA -3'（配列番号：71）およびアンチセンス鎖 5'- ACCGGTTAGCTTATGTCCTGATGTTGACCGATAGCTTATGTCCTGATGTTGACAGTTAGCTTATGTCCTGATGTTGAGTTCTAGCTTATGTCCTGATGTTGATCAG -3'（配列番号：72）を用いた。AntagomiR21のためには、フォワード 5'- AGATCTAATTCATATTTGCATGTCGCT -3'（配列番号：73）およびリバース 5'- GAATTCAAAAAATAGCTTATGTCCTGATGTTGAGGATCCGAGTGGTCTCATACAGAACTTATA -3'（配列番号：74）を用いた。miR-21 eraserのためには、フォワード 5'- CGGGATCCATCCGACGCCGCCATCTCTA -3'（配列番号：133）およびリバース 5'- GGAATTCAAAAAATAGCTTATCAGACTGATGTTGATAGCTTATCAGACTGATGTTGAAAACAAGGCTTTTCTCCAA -3'（配列番号：134）を用いた。
（６）ルシフェラーゼレポーターベクター構築のために用いたプライマー対
　pTK4.12C.P-のインサートのためには、センス鎖 5'- AATTAATAATGACTCGAGT-3'（配列番号：75）およびアンチセンス鎖 5'- CTAGACTCGAGTCATTATT-3'（配列番号：76）を用いた。pGL4.74-miR21Tのためには、センス鎖 5'- AATTCTCAACATCAGTCTGATAAGCTAC-3'（配列番号：77）およびアンチセンス鎖 5'- TCGAGTAGGCTTATCAGACTGATGTTGAG-3'（配列番号：78）を用いた。
1.2 細胞培養および安定細胞株の構築
　HeLaS3細胞（Puck et al., J. Exp. Med. 103: 273-284 (1956)）、PA-1細胞（Giovanella, BC et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 10: 382, 1974, 10:382; Giovanella, BC. et al., J Natl Cancer Inst, 1974, 52:921-30）、HCT-116細胞（Cancer Res 1981;41:1751; J Nat Cancer Inst 1982;69:767）、SW480細胞（Leibovitz et al., Cancer Res. 36: 4562-4569 (1976)）、HT29細胞（Fogh & Trempe in Human Tumor Cells in Vitro (ed. Fogh J.), Plenum Press, New York, 1975, pp. 115-159）、TIG-3/E/TERT細胞（Akagi T et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 13567-13572. (2003)）、および3Y1細胞（Ushijima T et al., Jpn. J. Cancer Res. 85:455-458, 1994; Kimura G et al., Int. J. Cancer, 15: 694-706, 1975）は10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、37℃で培養した。HeLaS3細胞は6well プレートに1x105 cells per wellでまき、24時間後に、それぞれpMXs-GIN, pMXs-GIN-miR140-5pT および pMXs-GIN-miR140-3pT ウイルスストック (<1x104 TU) を、8μg/ml のポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後からG418 (1mg/ml) で選択した。2週間の選択の後、培地から G418 を除去した。miR-140-5pレポーターまたはmiR-140-3pレポーターを保持するHeLaS3 細胞を、1x105 cells per wellで6well プレートにまき、24時間後に、pSSCH-miR140-5p/140-3pウイルスストック（<1x104 TU）を8μg/ml のポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後から、Hygromycin (0.5mg/ml) で選択した。2週間の選択の後、培地から Hygromycin を除去した。
1.3 ウイルス導入およびFACS解析
　miR-140-5p レポーターおよびmiR140-5p/140-3pベクターの両方を保持するHeLaS3細胞、およびmiR-140-3p レポーターおよびmiR140-5p/140-3pベクターの両方を保持するHeLaS3細胞は、10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、1x105 cells per wellで6wellプレートにまき、24時間後に、各miRNA阻害RNA発現ウイルスストック (2x105 TU) または各デコイ RNA発現ウイルスストック (2x105 TU) を、8μg/ml のポリブレンの存在下で導入した。さらに24時間後に、10% foetal bovine serum (FBS) および puromycin (1μg/ml) を含むDMEM に培地を交換した。7日の選択後、puromycin を培地から除去した。GFP発現レベルをFACS Calibur (BD) を用いて測定した。
1.4 RNA単離、miR-qRT-PCR
　miR-140-5p レポーターおよび miR140-5p/140-3p ベクターの両方を保持する、miRNA阻害RNA発現レンチウイルスベクターを導入したHeLaS3細胞およびmiRNA阻害RNA発現ベクターを導入したHCT-116細胞から、mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Ambion) を用いて全RNAを調製した。成熟miRNAの発現は、miRNA特異的looped RTプライマーおよびTaqMan プローブを用いた miR-qRT-PCRにより、製造元の推奨に従って決定した (Applied Biosystems, Foster City, USA)。内部コントロールとしてU6 snRNAを用いた。PCRは7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems)を用いてトリプリケートで行った。
1.5 ルシフェラーゼアッセイ
　PA-1細胞、HCT-116細胞、SW480細胞、HT29細胞、TIG-3/E/TERT細胞、および3Y1細胞を、10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、それぞれ、1.5x105 cells per well、1.7x105 cells per well、3.5x105 cells per well、3.0x105 cells per well、7.0x104 cells per wellおよび1.2x105 cells per well で導入の前日に24well プレートにまき、Lipofectamine 2000 (Invitrogen) および 10ng の pTK4.12C.P- (Firefly luciferase プラスミド), 100ng の RLuc target レポータープラスミド、および500ng の miRNA阻害RNA 発現プラスミドをトリプリケートでトランスフェクトした。locked nucleic acid (LNA/DNA)アンチセンスオリゴヌクレオチドは50 nMでコトランスフェクトした。LNA/DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドはThermoELECTRON社で合成され、8つの連続的に中央に位置する塩基にlocked核酸を含む（Naguibneva, I. et al. (2006) Biomed Pharmacother, 60, 633-638）。LNA/DNA アンチセンスオリゴヌクレオチドは下記（７）に示した配列を有する。全てのアッセイはトランスフェクションの48時間後にdual luciferase assay (Promega) によりGLOMAXTM (Promega) で実施した。
用いたオリゴヌクレオチド
（７）LNA/DNAアンチセンスオリゴの配列
　LNA-miR21のためには、5'- TCAACATCAGTCTGATAAGCTA -3'（配列番号：79）を用いた。LNA-NCのためには、5'- CATTAATGTCGGACAACTCAAT -3'（配列番号：80）を用いた。LNAを下線で示した。
1.6 ウェスタンブロット
　1.5 x SDS Bufferにより細胞から全蛋白質を抽出し、Bio-Rad protein assay kitを用いて蛋白質濃度を測定した。蛋白質抽出物は10% SDS-PAGEで分離させ、PVDF-membrane (Milipore)に転写した。イムノブロッティングはmembraneをanti-PDCD4 (ab51495, Abcam)抗体およびanti-Actin (612656, BD transduction)抗体と室温で1時間インキュベートすることにより実施した。Tween 20含有phosphate-buffered salineで3回洗浄した後、horseradish peroxidase結合2次抗体と室温で1時間membranes をインキュベートした。シグナルはECL reagent (Amersham)を用いて検出した。
1.7 　細胞増殖測定およびアポトーシス活性の測定
　PA-1細胞を、10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、1x104 cells per wellで48well プレートにまき、24時間後に、それぞれTuD-miR21-4ntinおよびTuD-NC発現レンチウイルスストック (1x105 TU) を、8μg/ml のポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後に培地を交換した。トランスダクションの直前およびトランスダクションから24, 48, 72, 96時間後に細胞の代謝活性をCellTiter-GloTM (Promega) によりGLOMAXTMで測定することにより細胞増殖の測定を実施した。
　PA-1細胞を、10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、3x103 cells per wellで48well プレートにまき、18時間後に、それぞれTuD-miR21-4ntinおよびTuD-NC発現レンチウイルスストック (3x104 TU) を、8μg/ml のポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後に培地を交換した。さらにトランスダクションの72時間後にカスパーゼ3および7の活性の測定をCaspase-GloTM 3/7 (Promega)によりGLOMAXTMで実施した。
1.8 ノザンブロット
　非感染HeLaS3細胞またはTuD-miR-140-3p-4ntin、TuD-miR-140-5p-4ntinを発現しているHeLaS3細胞から核画分、細胞質画分をベクター導入から１４日後に分離、回収した。細胞は10cm dish14枚分を用いた。dishを冷PBSで2回洗い、さらに2mlの冷PBS をdishに加えスクレイパーで細胞を回収し、1500 rpm,4℃で5分間遠心した。細胞沈殿をNP40 lysis Buffer (10mM Tris-HCl (pH 7.4), 10mM NaCl, 3mM MgCl2, 0.5% Nonidet P-40)に懸濁し、氷上に10分間静置した後、1500 rpm,4℃で5分間遠心した。上清を細胞質画分として回収し、ISOGEN (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)によって細胞質RNAを回収した。また核画分である沈澱を4mlのNP40 lysis Bufferで2回洗浄した。mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX)を用いて細胞質RNAと核画分である沈澱から200bpよりも小さいRNAのみを精製した。元の細胞の数を揃えて比較するために回収したRNAの5%相当量をノザンブロット解析に用いた。
　small RNAを18%変性アクリルアミドゲルで分離した。この際、電気泳動は80℃のインキュベーター内で行った。そしてHybond-XL membranes (Amersham BioSciences)へ転写を行い、60 mJ/cm2 UVでクロスリンクした。DNAプローブをT4 polynucleotide kinase (TAKARA)を用いて[γ-32P] ATPで5'端をラベルした。ハイブリダイゼーションはUltrahyb-Oligo buffer (Ambion)を用いて37℃で行った。メンブレンは2X SSC, 0.5% SDS bufferで洗った。RIシグナルはFLA-5100 (FUJIFILM)を用いて測定した。また0.5% SDS水溶液を用いて、脱プローブを行った。
用いたオリゴヌクレオチド
（８）ノザンブロットに用いたDNAプローブの配列
　miRNA阻害RNA検出プローブとして 5’- GTTGATGATCCTAGCGCCGTC -3’（配列番号：135）を用いた。miR-21検出プローブとして 5’- TCAACATCAGTCTGATAAGCTA -3’（配列番号：136）を用いた。Y4 scRNA検出プローブとして 5’- GCAGTGGGGGGTTGTATACCAAC -3’（配列番号：137）を用いた。ACA1 snoRNA検出プローブとして 5’- GTGATGGAAGCATAACCTGTCTC -3’（配列番号：138）を用いた。
[実施例２]　miR-140-3p活性を検出するための高感度アッセイ系
　miR-140-3pおよびmiR-140-5pを内在性に僅かにしか発現しないHeLaS3（Landgraf, P. et al. (2007) Cell, 129, 1401-1414）を用いて、miR-140-3p活性の極めて高感度なアッセイ系を構築した。このために、成熟miR-140-3pと完全に相補的な21bpの挿入をGFP遺伝子のすぐ下流に持つ、レトロウイルスベースのGFPレポーターを構築した（miR-140-3pレポーター）（図15A）。これらをHeLaS3細胞に導入し、GFPを安定に発現するmixed cell populationsを樹立した。
　次に、miR140-5p および miR140-3pの両方を内包するpre-miRNA全体を含むRNAをPol IIプロモーターから駆動するレトロウイルスベクターを構築した（miR140-5p/140-3pベクター）（図15C）。これをmiR-140-3pレポーターを持つHeLaS3細胞に導入し、mixed cell populationsを樹立した。miR-140-3pレポーターを持つ非導入のHeLaS3細胞と比較して、GFPの発現レベルは20％未満であった（図16A, B, およびC）。
[実施例３]　プロトタイプデコイRNAの設計および有効性
　デコイRNAのプロトタイプとして、成熟miR-140-3pのRNA配列に対して完全に相補的なRNA配列を露出することが期待される、単純な二次構造を持つデコイRNAを設計した。これらのプロトタイプデコイRNA（図1A）は、ステムループ構造を形成し、そのループは成熟miR-140-3pと完全に相補的なMBSとその両端にある3塩基のリンカーとから構成される。これらのデコイRNAを細胞内で安定に発現させるために、インテグレーション後の両LTR中に存在するpolymerase IIIプロモーター（mU6）により駆動されるshort RNA発現用カセットを搭載するレンチウイルスベクターを使用することを選択した（図15D）。RNAポリメラーゼIIIによるRNA転写産物はUU（またはUUUU）で終わるように設計されるため、RNAデコイは2（～4）ヌクレオチドの3'-突出末端をステム中に持つことが見込まれる（図１A）。
　合成されたデコイRNAは細胞核から細胞質に輸送されるはずで、そこで対応するmiRNAであるmiR-140-3pを含むRISCに作用することになる。ステム－ループ構造を持つsmall RNAの核輸送については、これまでに詳細に調べられており、ステムの長さがExp-5による核外移送の効率に重要であることが示されている（Zeng, Y. and Cullen, B.R. (2004) Nucleic Acids Res, 32, 4776-4785）。hairpin RNAのExp-5への結合活性は、ステム配列の長さが16 bpより短くなると劇的に低下することが示されているので、プロトタイプRNAデコイのステムの長さを17bp～24bpで変化させた（デコイ #1～#6, 図1B）。バクテリオファージ遺伝子Cre recombinase のコード領域を標的とするshRNA (shCre) をデコイRNAベクターのネガティブコントロール（NC）として使用した。18bpのステムを持つプロトタイプRNAデコイが他のものよりも僅かに高い阻害効果を示し、さらに20bpを超えるdsRNAは細胞質においてDicerによる切断の潜在的な標的となり得ることから、その後の全ての試験においては、18bpのステム長を使用することとした。
[実施例４]　プロトタイプデコイRNAの二次構造およびMBSの改変による阻害力の最適化
　阻害効力を上昇させるために、デコイRNAをプロトタイプよりもより複雑な二次構造を持つように設計し（図2A）、その発現カセットをレンチウイルスベクターに挿入し、図１Bで用いたのと同じアッセイ細胞に導入した。ここで試験したこれらのRNA（デコイ #10～#16、図2A）は、プロトタイプデコイRNA（デコイ RNA #2）よりも効率が高かった（図2AB）。重要なことに、デコイ RNA #12のMBSの両端に3ヌクレオチドのリンカー配列を挿入すると（デコイ RNA #13）、GFPの発現はほぼ完全な回復を示し、デコイ #13の導入によるGFPレベルは、miR-140-3pレポーターだけを持つHeLa S3のそれと同レベルに達した（99.5%）（図２B）。この回復は、miR-140-5p/miR-140-3pベクターにより供給されるmiR-140-3p活性が、完全に相殺されたことを示す。
　次に、より効率的なデコイ活性を達成するために、MBSのための幾つかの配列をスクリーニングした。哺乳動物においては、完全に相補的なMBSの3'末端から8番目のヌクレオチドと9番目のヌクレオチドの間に4つの余分なヌクレオチドを含むMBSで、RNA切断よりも翻訳の減弱化（attenuation）が起こることが報告されている（Kiriakidou, M. et al. (2004) Genes Dev, 18, 1165-1178; Vermeulen, A. et al. (2007) RNA, 13: 723-730）。従って、4つの余分なヌクレオチドを含むMBSは、デコイRNA分子自身の切断が回避されるので、完全に相補的なMBS (MBS-pf) よりもmiRNAの機能をより効率的に阻害する可能性がある。阻害に効率的なMBSをスクリーニングするため、RISC中のAgo2蛋白質が標的mRNAを切断する部位である完全に相補的なMBSの3'末端から10番目のヌクレオチドと11番目のヌクレオチドの間に、1～4ヌクレオチドの余計な配列を挿入することにより、プロトタイプデコイ（図1A）を改変した。これらのデコイの効果を調べることにより、4ヌクレオチドの挿入を有するMBS（MBS-4ntin）は、調べたデコイの中で最大のGFP発現の回復を示すことが見出された（52%）（図3）。
　プロトタイプデコイのMBSとステムとの間にリンカーを挿入することでも阻害効果は劇的に改善したことから（図２B、デコイRNA#12と #13とを比較のこと）、MBSがMBS-4ntinに置換されているデコイ #12型のRNAを用いて、リンカーの長さを1～5ヌクレオチドに注意深く変化させた。1～3ヌクレオチドの挿入は、高い阻害効果をもたらし、4ヌクレオチドまたは5ヌクレオチドの挿入も、それより低いものの、中程度の活性を示した（図４）。そこで以後の解析では、MBSとステムRNAとの間のリンカーの長さは3ヌクレオチドとした。
　上記の結果を統合することにより、図２に示したデコイ #16 の阻害効果の向上を試みた。ステム配列とMBSとの間に3ヌクレオチドのリンカーを挿入し、さらにMBS-pfをMBS-4ntinに置換することにより、デコイ #27 を生成させた。デコイ#27 は極めて改善された（55.2% から80.1%、図2および5）。一方、デコイ#13に対して同じ原理で構造を改変して、デコイ#24を作成したが、これは阻害能力を向上させなかった。これは恐らく、デコイ#24のデコイ活性がすでにほとんど飽和していて、外来的に導入したmiR-140-3p活性を完全に相殺していたためであろう。
　暫定的には、デコイ #13 および #24の構造を持つデコイRNA（図6A）は、これらのRNAはmiRNAの機能を非常に効率的に阻害することから、極めて有望と結論される。このデコイRNAは２つのMBSを持ち、それらは２つのステム構造に隣接されている。例えば、２つのMBSは、それぞれが該２つのステム構造に挟まれており、それぞれのMBSは、核酸鎖の方向が逆向きとなっている。２つのステム構造は、2本鎖であっても4本鎖であってもよい。図６Bに示す通り、このRNAのための発現カセットは容易に構築することが可能である。このように、２つのMBSを持ち、それらが２つのステム構造に挟まれている構造を持つデコイRNA（Tough Decoy；TuDと呼ぶ）は、特に強いmiRNA阻害効果をもたらすことが判明した。
[実施例５]　本発明のRNA複合体の阻害効果の汎用性、特異性および持続期間
　本発明のRNA複合体の阻害効果の汎用性および特異性を調べるため、miR-140-3pレポーターの挿入配列を、単にmiR-140-5pと完全に相補的な配列に置換した、miR-140-5pのためのレポーター細胞系を構築した（図15(B)）。MBSに4ヌクレオチドの余分なヌクレオチドを含むTuD-miR-140-3p（TuD-miR-140-3p-4ntin）（デコイ #24）またはTuD-miR-140-5p-4ntin（図18）のいずれかの阻害効果を、これらのレポーター細胞系の両方を使用して決定した。miR-140-3pレポーター系においては、TuD-miR-140-3p-4ntinの導入はGFP発現の完全な回復を示したが、TuD miR-140-5p-4ntinの発現では効果を示さなかった（図7A）。miR-140-5pレポーター系においては、TuD miR-140-5p-4ntin ベクターの導入は、GFP発現の完全な回復を示したが、TuD-miR-140-3p-4ntinベクターの導入では、このレポーターに対して効果を示さなかった（図7B）。これらの結果は、これらのRNAの阻害効果は、その標的miRNAに対して高度に効率的かつ特異的であることを示しており、本発明のRNA複合体が様々なmiRNAに対して高い特異性をもって適用できることを示唆している。
　レンチウイルスベースのベクターの重要な利点の１つは、デコイRNAの発現を長期間維持でき得ることである。そこで、TuD-miR-140-3p-4ntinベクターを、miR-140-3pレポーターおよびmiR140-5p/140-3pベクターの両方を持つHeLaS3細胞に導入し、一箇月を超えてGFP発現レベルの経時変化をモニターした（図７C）。それらの結果から、TuD-miR-140-3p-4ntinはHeLaS3細胞において標的であるmiR-140-3pを一箇月を超えて効率的に阻害し、TuD-miR-140-5p-4ntinでは一切阻害しない状態が維持されることが示された。
　次に定量的リアルタイムRT-PCRを用いて、miR-140-5pレベルを直接調べた。TuD-miR-140-5p-4ntinは、この方法で検出する限り、miR-140-5pの見かけ上の発現レベルを約65％減少させたが、TuD-miR-140-3p-4ntinでは減少させないことが示された（図７D）。この結果により、フリーのmiR-140-5pの量が約1/3に減少したことが明らかとなったが、RNAデコイと成熟miRNAとの間で形成されたdsRNAは、例えRNAの調製後であっても、リアルタイムPCRにより成熟miRNAを検出するには安定すぎる可能性はある。
　TuD-miR-140-3p-4ntinまたはTuD-miR-140-5p-4ntinを発現しているHeLaS3細胞において発現したRNAの細胞内局在を調べた。TuD-miR-140-3p-4ntinベクターまたはTuD-miR-140-5p-4ntinベクターの導入から14日後に細胞の核画分RNAと細胞質画分RNAをそれぞれ調製し、分子内、分子間結合を最小化するために高温にてPAGEを行い、ノザンブロットにより解析した。発現させたmiRNA阻害RNAに対するプローブにより120ntのバンドおよび90nt付近にブロードなバンドが観察された（図７E）。同じRNAサンプルを室温にてPAGEを行いノザンブロットにより解析するとこのブロードなバンドはより強くなるので、これは分子内結合している全長RNAである。TuD-miR-140-3p-4ntinおよびTuD-miR-140-5p-4ntinは主に細胞質に存在しており、TuD-miR-140-5p-4ntinはわずかに核に存在していた。これにより転写されたRNAが核外に効率的に輸送されることを確認した。またMBS配列はRNAの核外輸送効率に影響をある程度与えるが、その影響は軽微であることが示された。
[実施例６]　内在性miRNAに対する本発明のRNA複合体の阻害効果
　本発明のRNA複合体の阻害機能が汎用性を有することを確かめるため、次に、従来の合成miRNA阻害剤との比較ができる、異なる標的miRNA（内在性miR-21）および異なるアッセイ系を用いて幾つかの実験を行った。TuD-miR-140-3p-4ntin および TuD-miR-140-3p-pf と同じ原理を用いて、２つのTuD-miR21、それぞれTuD-miR-21-4ntin および TuD-miR21-pf を構築した（図18）。次にPA-1細胞における内在性のmiR-21活性の抑制を試みるために、TuD-miR-21-4ntin または TuD-miR-21-pf （図18）を発現するDNAベースのベクターを、 3'-UTR中に成熟miR-21と完全に相補的な21bp DNA配列の挿入を持つまたは持たないRenilla luciferase レポーターと、トランスフェクションのコントロールとしてのコントロールFirefly luciferaseレポーター（図17(A-C)）と共に、PA-1細胞に一過的にトランスフェクトした。TuD-miR21-4ntinを発現する細胞集団は、miR21レポーターの発現、すなわち Firefly luciferase活性でノーマライズしたRenilla luciferase活性を、ネガティブコントロールを発現するDNAベースのベクター（TuD-NC）をトランスフェクションした細胞の発現よりも、約25倍上昇させた（図８A）。TuD-miR-21-pfはより低い阻害効果を示したが、約14倍の活性に相当する依然として有意な回復をもたらした。重要なことに、回復したレポーター活性のレベルは、miR-21標的配列を持たないコントロールレポーターのそれと近かった。このコントロールレポーターの活性は、期待された通り、導入したデコイRNAと独立してほぼ一定していた。
　次に、一過的にトランスフェクトした本発明のRNA複合体を生成する発現ベクターの阻害効果を、実施例１のセクション1.5に記載したように、LNA/DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれと比較した（図８A）。locked nucleic acid (LNA/DNA) アンチセンスオリゴヌクレオチド（LNA-miR21）によるPA-1細胞のトランスフェクションは、ネガティブコントロールとして用いたLNA/DNA-NC をトランスフェクトしたPA-1細胞のそれに比べ、miR21標的レポーターの発現を2倍上昇させた。これらの結果は、本発明のRNA複合体は、これらの従来の合成試薬よりも、これらのトランスフェクションの条件下において、miRNAを阻害するはるかに高い能力を持つことを示している。
　アッセイのための細胞株を上記で使用したPA-1からHCT-116に変え、本発明のRNA複合体を発現するプラスミドベクターと、CMV sponge発現プラスミドベクター、H1-Antagomir発現プラスミドベクター、miRNA eraser発現プラスミドベクター、および LNA/DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドのmiRNA阻害効果の比較を、実施例１のセクション1.5に記載したように行った（図９）。その結果、本発明のRNA複合体が他の手法に比べてきわめて効果が高いことが示された。
　次に、アッセイのための細胞株をPA-1からHCT-116に替えて類似した実験を行った。HCT-116は、内在性のmiR-21がPA-1のそれよりも高いことが報告されている。全体的な結果は、TuD-miR-21-pfの阻害効果が劇的に低下した以外は非常に類似していた（図８B）。これらの結果は、大量の内在性miR-21がきわめて効率的にTuD-miR-21-pf分子を切断することにより、このデコイの物理的濃度が、TuD-miR-21-4ntinの濃度に比べて有意に低下することを明らかにしているのかも知れない。
　miRNA阻害RNA（TuD-miR-21-4ntinおよびTuD-miR-21-pf）の発現ベクターをトランスフェクションしたPA-1細胞、HCT-116細胞においてそれぞれTuD-miR-21-4ntinおよびTuD-miR-21-pfの発現レベルをノザンブロットにより解析した。PA-1細胞においてはTuD-miR-21-4ntin、TuD-miR-21-pfともに強く発現していた（図10Ａ）。HCT-116細胞においてはTuD-miR-21-4ntinは強く発現していたが、TuD-miR-21-pfはそれに比べて弱い発現しか見られなかった（図10Ｂ）。この現象は、miR-21濃度が高い条件下ではTuD-miR-21-4ntinがmiRNAによる分解に対して安定である一方、TuD-miR-21-pfは分解を受けやすいという上記の仮説とよく一致している。
　定量的リアルタイムRT-PCRを用いて、miR-21レベルを調べた。その結果TuD-miR-21-4ntinおよびTuD-miR-21-pfは、miR-21の見かけ上の発現レベルを大きく減少させた（図８D）。しかし、ノザンブロットによりmiR-21レベルを調べた結果では、pre-miR-21、mature-miR-21ともに減少は見られなかった（図８E）。この結果の説明として、miR-21の実際の量は減少していないが、miR-21とTuD-miR-21が強力に結合しているためにRT-PCRによる検出が阻害されたことが考えられる。この現象は他の研究グループによっても指摘されている。
　HCT-116細胞においてmiR-21阻害効果におけるTuD-miR-21-4ntin発現プラスミドの量依存性を調べた。図８A, B, および９の実験は24穴プレートにおいて500ng/wellで行っていたが、量依存性を調べたところ、300ng/wellにおいて効果が飽和しており、10ng/wellでもその１/３程度のmiRNA阻害効果が観察された（図19）。
　本発明のRNAは大腸癌細胞(SW480, HT29)、不死化ヒト肺胚性繊維芽細胞(TIG-3/E/TERT)およびラット繊維芽細胞(3Y1)においても高いmiRNA阻害効果を示した（図20）。
　miR21の内在性の標的であるPDCD4 蛋白質に対する効果を直接的にモニターするため、一連のmiRNA阻害RNA発現ベクターをそれぞれPA-1細胞にトランスフェクトし、全蛋白質を回収してPDCD4 の発現レベルをウェスタンブロッティングにより調べた（図８C）。PDCD4の発現はTuD-miR21-4ntin または TuD-miR21-pf により上昇したが、TuD-NC は効果を示さなかった。この結果は、本発明のRNA複合体は内在性のmiRNAの機能を特異的に阻害できることを示している。
　PA-1細胞株において、上記miRNA阻害RNAがmiRNAの機能を抑制することにより生物的活性を誘導するかどうかを調べた。TuD-miR21-4ntinおよびTuD-NCを発現するレンチウイルスベクターをPA-1細胞にMOI 10で導入し、細胞増殖活性を測定した（図11A）。TuD-NCを導入した細胞は４日間で5倍以上にまで増殖したが、TuD-miR21-4ntinを導入した細胞は1.6倍程度にまでしか増殖しなかった。さらに同様のculture をもちいてカスパーゼ３及び７の活性を測定してアポトーシスについて評価した（図11B）。TuD-miR21-4ntinを導入した細胞はTuD-NCを導入した細胞に比べ、3倍程度にまで上昇していた。このことはTuD-miR21-4ntinを導入した細胞において細胞増殖の程度が低かったことの一因にアポトーシスが誘導されたことがあげられる。以上より、本発明のRNAがmiRNAの機能を十分に抑制し、それによりmiR-21の増殖刺激活性、アポトーシス抑制活性を阻害したこと（Corsten, M.F., (2007) Cancer Res. 67, 8994-9000）が示された。
　miRNAには、seed配列が同一であり、共通の標的遺伝子を有すると考えられているmiRNA familyが存在する。そこで本発明のmiRNA阻害RNAが標的miRNAのfamilyに対しても阻害効果を有するかどうかを調べるため、miRNA-15a, 15b, 16, 195, 424, 497 familyを標的として実験を行った。miR-21ルシフェラーゼレポーターの挿入配列を、miR-16と完全に相補的な配列に置換した、miR-16のためのルシフェラーゼレポーターベクターを構築した（図17Ｄ）。miRNA-15a, 15b, 16が発現しており、miRNA-195, 424, 497は発現していないことがmiRNA micro arrayにより観察されているHCT-116細胞を用いた（図21）。図12Ａに示したようにmiRNA-16, 195の相同性は高く、miRNA-16, 497の相同性はseed部位以外は低い。そこでTuD-miR-16-4ntin、TuD-miR-195-4ntinおよびTuD-miR497-4ntinを構築した（図18、12Ｂ）。この条件下ではmiRNA-195, 497が発現していないため、TuD-miR-195-4ntinおよびTuD-miR497-4ntinのmiRNA-15a, 15b, 16に対する阻害効果を観測できる。ルシフェラーゼアッセイを行ったところ、TuD-miR16-4ntin、TuD-miR-195-4ntinおよびTuD-miR497-4ntinを発現する細胞集団は、miR16レポーターの発現、すなわち Firefly luciferase活性でノーマライズしたRenilla luciferase活性を、TuD-NCをトランスフェクションした細胞集団の発現よりも、それぞれ3.1倍、5.2倍、2.6倍上昇させた（図12Ｃ）。とくに、TuD-miR-16-4ntinおよびTuD-miR-195-4ntinにより回復したレポーター活性のレベルは、miR-16標的配列を持たないコントロールレポーターの活性と同レベルであった。また、コントロールレポーターの活性は導入したmiRNA阻害RNAによらず、ほぼ一定であった。この実験により本発明のRNAの阻害効果は標的miRNAだけではなくそのfamilyにも及ぶものであることが確認された。また相同性の高いfamilyへの阻害効果の方が相同性の低いfamilyに対する阻害効果よりも高いが、相同性が低くても阻害効果があることが示された。
[実施例７]　合成オリゴヌクレオチドによるmiRNA阻害
　本発明のRNA複合体をオリゴヌクレオチドで製造し、内在性miRNAに対する阻害効果を調べた。
細胞培養
　HCT-116細胞（Cancer Res 1981;41:1751; J Nat Cancer Inst 1982;69:767）は10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、37℃で培養した。
ルシフェラーゼアッセイ
　導入の前日にHCT-116細胞を、10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、1.0x105 cells per wellで24well プレートにまき、Lipofectamine 2000 (Invitrogen) および 10ng の pTK4.12C.P- (Firefly luciferase プラスミド; 内部コントロール), 100ng のpGL4.74-miR21T(RLuc target レポータープラスミド)、または標的配列をもたないpGL4.74、および1, 3, 10, 50, 200nM の 2'-O-Methyl-TuD-RNAオリゴヌクレオチド、および2'-O-Methyl-RNAアンチセンスオリゴヌクレオチド・LNA/DNAアンチセンスオリゴヌクレオチド・PNAアンチセンスオリゴヌクレオチドをトリプリケートでトランスフェクトした。LNA/DNAアンチセンスオリゴヌクレオチドはThermoELECTRON社で合成され、8つの連続的に中央に位置する塩基にlocked核酸を含む（Naguibneva, I. et al. (2006) Biomed Pharmacother, 60, 633-638）。TuD-2'-O-Methyl-RNAオリゴヌクレオチド、2'-O-Methyl-RNAアンチセンスオリゴヌクレオチド、LNA/DNA アンチセンスオリゴヌクレオチド、PNAアンチセンスオリゴヌクレオチドは下記（1）に示した配列を有する。miRIDIAN InhibitorはThermo scientific Dharmacon社から購入した合成オリゴである。全てのアッセイはトランスフェクションの48時間後にdual luciferase assay (Promega) によりGLOMAXTM (Promega) で実施した。
用いたオリゴヌクレオチド
（1）2'-O-MethylアンチセンスオリゴおよびLNA/DNAアンチセンスオリゴの配列
　2'-O-Methyl-TuD-miR21のためには、5'- GACGGCGCUAGGAUCAUCAACUCAACAUCAGUCAAUGUGAUAAGCUACAAGUAUUCUGGU -3'（配列番号：148）と5'- ACCAGAAUACAACUCAACAUCAGUCAAUGUGAUAAGCUACAAGAUGAUCCUAGCGCCGUC -3'（配列番号：149）を混合したものをアニーリングして用いた。全ての塩基が2'-O-Methyl化されている。
　2'-O-Methyl-miR21のためには、5'- GUCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA -3'（配列番号：150）を用いた。2'-O-Methyl-NCのためには、5'- AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU -3'（配列番号：151）を用いた。全ての塩基が2'-O-Methyl化されている。
　LNA-miR21のためには、5'- TCAACATCAGTCTGATAAGCTA -3'（配列番号：79）を用いた。LNA-NCのためには、5'- CATTAATGTCGGACAACTCAAT -3'（配列番号：80）を用いた。LNA修飾を行った配列を下線で示した。
PNA-miR21のためには、5'- RRRQRRKKR-OO-ATTAATGTCGGACAA -3'（配列番号：152, 153）を用いた。PNA-NCのためには、5'- RRRQRRKKR-OO-TCAACATCAGTCTGA -3'（配列番号：152, 154）を用いた。全ての塩基がPNAである。cell penetrating peptideおよびAEEA linker（AEEA: 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid）を下線で示した。
結果
　2'-O-Methyl-TuD-RNAオリゴヌクレオチドの阻害機能を調べるため、3'-UTR中に成熟miR-21と完全に相補的な21bp DNA配列の挿入を持つ、または持たないRenilla luciferaseレポーターと、トランスフェクションの内部コントロールとしてのFirefly luciferaseレポーターpTK4.12C.P-と共に、HCT-116細胞に各種アンチセンスオリゴを一過的にトランスフェクトした（図22）。2'-O-Methyl-TuD-miR21をトランスフェクトした細胞集団は、miR21レポーターの発現、すなわち Firefly luciferase活性でノーマライズしたRenilla luciferase活性を、2'-O-Methyl-NCをトランスフェクションした細胞の発現よりも、1nM, 3nM, 10nM, 50nM, 200nM それぞれの濃度において約21倍、約43倍、約51倍、約58倍、約69倍上昇させた（図22、23）。一方、2'-O-Methyl-miR21, LNA-miR21, PNA-miR21は200nMにおいてでもそれぞれ約6倍、約2倍、約11倍程度の上昇しか示さなかった。また、0.1nM, 0.3nM, 1nM, 3nM の濃度において2'-O-Methyl-TuD-RNAオリゴヌクレオチドとmiRIDIAN InhibitorのmiR-21阻害効果の比較を行ったところ、それぞれの濃度で2'-O-Methyl-TuD-miR21は約3.0倍、約9.1倍、約28.9倍、約45.9倍程度の上昇を示し、miRIDIAN Inhibitor-miR21は約2.5倍、約5.2倍、約11.6倍、約20.1倍程度の上昇を示した（図24）。一方、標的配列を持たないRenilla luciferaseレポーターの活性は、低濃度においては、導入したアンチセンスオリゴと独立してほぼ一定していた。これらの結果は、2'-O-Methyl-TuD-miR21は、従来の合成試薬よりも、これらのトランスフェクションの条件下において、miRNAを阻害するはるかに高い能力を持つことを示している。
[実施例８]　他のプロモーターを用いたmiRNA阻害
プラスミド構築
　下記（2）に示したプライマーを用いてヒトゲノムDNAからPCRを行い、pCR2.1にクローニングしph7SK-protoshuttleを作製した（図27(A)）。ph7SK-protoshuttleをKpnI-HindIIIで消化し、下記（2）に示したオリゴヌクレオチドをアニールさせてクローニングし、ph7SK-TuD-shuttleを作製した。下記（3）に示した各オリゴペアをアニールし、BsmBIで消化したph7SK-TuD-shuttleにクローニングしてph7SK-TuD-miR21-4ntinを作製した。その後、pSL1180 (Pharmacia)のBamHI-EcoRI 部位にph7SK-TuD-miR21-4ntinのBamHI-EcoRI断片を挿入し、miRNA阻害RNA発現プラスミドベクターpSL1180-TuD-miR21-4ntinを作製した。
用いたオリゴヌクレオチド
（２）本発明のRNAのシャトルベクター構築のためのプライマー対
　ph7SK-protoshuttleのためには、フォワードプライマー 5'- GGATCCTGCAGTATTTAGCATGCCCCA -3'（配列番号：155）およびリバースプライマー 5'-GAATTCAAAAAAGGATGTGAGGGCGTCATCGAGACGGTACCGTCTCCGATGACGCCCTCACATCCGAGGTACCCAGGCGGCGCACAAGC -3'（配列番号：156）、ph7SK-TuD-shuttleのためには、センス鎖 5'- CTCGGATGTGAGGGCGTCATCGGAGACGACACCATCCACAGCCAGCGTCTCGATGACGCCCTCACATCCTTTTTTGAATTCA -3'（配列番号：157）およびアンチセンス鎖 5'- AGCTTGAATTCAAAAAAGGATGTGAGGGCGTCATCGAGACGCTGGCTGTGGATGGTGTCGTCTCCGATGACGCCCTCACATCCGAGGTAC -3'（配列番号：158）を用いた。
（３）本発明のRNAの発現ベクター構築のためのプライマー対
　TuD RNA-miR21-4ntinのためには、センス鎖 5'- CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG -3'（配列番号：17）およびアンチセンス鎖 5'- TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT -3'（配列番号：18）を用いた。
結果
mU6 promoterとh7SK promoterの阻害効果の比較
　mU6 promoterとh7SK promoterの阻害効果の比較を行うため、3'-UTR中に成熟miR-21と完全に相補的な21bp DNA配列の挿入を持つまたは持たないRenilla luciferase レポーター(それぞれpGL4.74-miR21TとpGL4.74)と、トランスフェクションの内部コントロールとしてのFirefly luciferaseレポーター(pTK4.12C.P-)と共に、HCT-116細胞にmiRNA阻害RNA発現プラスミドベクターを一過的にトランスフェクトした。mU6 promoter-TuD-miR21をトランスフェクトした細胞集団は、miR21レポーターの発現、すなわち Firefly luciferase活性でノーマライズしたRenilla luciferase活性を、mU6 promoter-TuD-NCをトランスフェクションした細胞の発現よりも、約59倍上昇させた（図27(B)）。一方、h7SK promoter-TuD-miR21はh7SK promoter-TuD-NCをトランスフェクションした細胞の発現よりも、約77倍上昇させた。これらの結果は、これらのトランスフェクションの条件下において、h7SK promoterの方が高い能力を持つことを示している。
[実施例９]　高次構造の効果
プラスミド構築
　下記（４）に示した各オリゴペアをアニールし、BsmBIで消化したpmU6-TuD-shuttleにクローニングしてpmU6-TuD-miR21-4ntin-GqL111、pmU6-TuD-miR21-4ntin-GqL333、pmU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-1、pmU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-2を作製した。これらのプラスミドのBamHI-EcoRI断片をpSL1180 (Pharmacia)のBamHI-EcoRI 部位に挿入し、miRNA阻害RNA発現プラスミドベクターpSL1180-TuD-miR21-4ntin-GqL111、pSL1180-TuD-miR21-4ntin-GqL333、pSL1180-TuD-miR21-4ntin-1MBS-1、pSL1180-TuD-miR21-4ntin-1MBS-2を作製した。
用いたオリゴヌクレオチド
（4）本発明のRNAの発現ベクター構築のためのプライマー対
　TuD RNA-miR21-4ntin-GqL111のためには、センス鎖 5'- CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGGGAGGGCGGGAGGGAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG -3'（配列番号：159）およびアンチセンス鎖5'- TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTCCCTCCCGCCCTCCCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT -3'（配列番号：160）を用いた。
　TuD RNA-miR21-4ntin-GqL333のためには、センス鎖 5'- CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGGGAGAGGGGCGGGGCGCGGGAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG -3'（配列番号：161）およびアンチセンス鎖5'- TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTCCCGCGCCCCGCCCCTCTCCCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT -3'（配列番号：162）を用いた。
　TuD RNA-miR21-4ntin-1MBS-1のためには、センス鎖 5'- CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACATCGAATAGTGTAACTGACTACAACTCAAG -3'（配列番号：163）およびアンチセンス鎖5'- TCATCTTGAGTTGTAGTCAGTTACACTATTCGATGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT -3'（配列番号：164）を用いた。
　TuD RNA-miR21-4ntin-1MBS-2のためには、センス鎖 5'- CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACAAGCCACAACGAATCTCTATATCATCAAG -3'（配列番号：165）およびアンチセンス鎖5'- TCATCTTGATGATATAGAGATTCGTTGTGGCTTGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT -3'（配列番号：166）を用いた。
結果
(i) 各構造の阻害効果へ与える影響の比較 (G-quadruplex)
　２つのステム構造のうち長さの短い方を強固な構造として知られるG-quadruplexで置き換えたmiRNA阻害RNAを作製した（図25）。G-quadruplexはGGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGGという配列である。このloopの配列の長さを1-1-1としたものはParallelと呼ばれる構造をとり、3-3-3としたものはParallel構造とAntiparallel構造の間を遷移する。これらをそれぞれGqL111、GqL333とした。HCT-116細胞を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイ系により、各構造のmiRNA阻害RNAの効果を比較した。mU6-TuD-miR21-4ntinは、miR21レポーターの発現を、mU6 promoter-TuD-NCよりも、約40倍上昇させた。一方、mU6-TuD-miR21-4ntin-GqL111, mU6-TuD-miR21-4ntin-GqL333は約33倍、約20倍上昇させた（図25(C)）。
(ii) 各構造の阻害効果へ与える影響の比較 (1MBS)
　１分子中に互いに向かい合って存在する２つのMBSのうち一方を、標的miRNAと結合しない配列に置換してMBSが１つのmiRNA阻害RNAを２種類作製した（図26(A)）。HCT-116細胞を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイ系により、各構造のmiRNA阻害RNAの効果を比較した。mU6 promoter-TuD-miR21は、miR21レポーターの発現を、mU6 promoter-TuD-NCよりも、約59倍上昇させた。一方、mU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-1, mU6-TuD-miR21-4ntin-1MBS-2は約22倍、約6.5倍上昇させた（図26(B)）。
　以上の結果からMBSの数は阻害効果に大きく影響する。MBSが１つ、または３つであるmiRNA阻害RNAも高い阻害効果を示したが、２つのMBSを持つmiRNA阻害RNAが最も効果的であった。特に、MBSを2つ持つTuD-miR21は、MBSを1つ持つTuD-miR21-4ntin-1MBS-1やTuD-miR21-4ntin-1MBS-2に比べ、2倍を有意に超える高い阻害作用を発揮した。MBSと向かい合って存在する領域がMBSでない場合、その塩基配列は阻害効果に大きな影響を与え得ることが示された。
[実施例１０]　miR-200 family阻害による生物学的活性
1.1 プラスミド構築
　下記（5）に示した各オリゴペアをアニールし、BsmBIで消化したpmU6-TuD-shuttleおよびph7SK-TuD-shuttleにクローニングしてpmU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL、ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L、ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLを作製した。これらのプラスミドのBamHI-EcoRI断片をpSL1180 (Pharmacia)のBamHI-EcoRI 部位に挿入し、miRNA阻害RNA発現プラスミドベクターpSL1180-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pSL1180-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL、pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L、pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLを作製した。同様のBamHI-EcoRI断片をpLCG(HIV-1 基盤のGFP遺伝子搭載レンチウイルスベクター)のBamHI-EcoRI 部位に挿入し、miRNA阻害RNA発現レンチウイルスベクターpLCG- mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLを作製した。
　ルシフェラーゼレポータープラスミドを構築するため、下記に示したオリゴヌクレオチド対をアニールさせ、XbaI および FseI で消化したpGL4.74(Promega)にクローニングしてpGL4.74-miR200cTを作製した。
1.2 細胞培養および安定細胞株の構築
　HCT-116細胞（Cancer Res 1981;41:1751; J Nat Cancer Inst 1982;69:767）は10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、37℃で培養した。
　HCT-116細胞は6well プレートに1x105 cells per wellでまき、24時間後に、それぞれpLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL、pLCG-h7SK-TuD-NC ウイルスストック (1x106 TU) を、8μg/ml のポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの8日後にFACS Areaを用いてGFP発現細胞を分取した。
1.3 ルシフェラーゼアッセイ
　導入の前日にHCT-116細胞を、10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、1.0x105 cells per wellで24well プレートにまき、Lipofectamine 2000 (Invitrogen) および 10ng の pTK4.12C.P- (Firefly luciferase プラスミド;内部コントロール), 100ng のpGL4.74-miR200cT(RLuc target レポータープラスミド)、または標的配列をもたないpGL4.74（図28A）、1ng,10ng のpSL1180-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、およびpSL1180-mU6-TuD-NC・pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL・pSL1180-h7SK-TuD-NCをトリプリケートでトランスフェクトした。またpLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLレンチウイルス導入から21日後にそれぞれ導入した細胞を、10% foetal bovine serum (FBS)を含むDMEM 中、1.0x105 cells per wellで24well プレートにまき、Lipofectamine 2000 (Invitrogen) および 10ng の pTK4.12C.P- (Firefly luciferase プラスミド;内部コントロール), 100ng のpGL4.74-miR200cT(RLuc target レポータープラスミド)、または標的配列をもたないpGL4.74（図28A）をトリプリケートでトランスフェクトした。全てのアッセイはトランスフェクションの48時間後にdual luciferase assay (Promega) によりGLOMAXTM (Promega) で実施した。
1.4 ウェスタンブロット
　レンチウイルス導入から15日後に1.5 x SDS Bufferにより細胞から全蛋白質を抽出し、Bio-Rad protein assay kitを用いて蛋白質濃度を測定した。蛋白質抽出物は10% SDS-PAGEで分離させ、PVDF-membrane (Milipore)に転写した。イムノブロッティングはmembraneをanti-E-cadherin (ab76055, Abcam)抗体、anti-Vimentin (sc6260, Santa cruz)抗体およびanti-Actin (612656, BD transduction)抗体と室温で2時間インキュベートすることにより実施した。Tween 20含有phosphate-buffered salineで3回洗浄した後、horseradish peroxidase結合2次抗体と室温で1時間membranes をインキュベートした。シグナルはECL reagent (Amersham)を用いて検出した。
用いたオリゴヌクレオチド
（5）本発明のRNAの発現ベクター構築のためのプライマー対
　pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3Lおよびph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3Lのためには、センス鎖 5'- CATCAACTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACAAG -3'（配列番号：179）およびアンチセンス鎖5'- TCATCTTGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAGTT -3'（配列番号：180）を用いた。
　pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3pLおよびph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLのためには、センス鎖 5'- CATCTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACGTATTCTGGTCACAGAATACTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACG -3'（配列番号：181）およびアンチセンス鎖5'- TCATCGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAGTATTCTGTGACCAGAATACGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGA -3'（配列番号：182）を用いた。
　pGL4.74-miR200cTのためには、センス鎖 5'- CTAGACCGGAATTCTCCATCATTACCCGGCAGTATTACTCGAGCGGAGGCCGG -3'（配列番号：183）およびアンチセンス鎖5'- CCTCCGCTCGAGTAATACTGCCGGGTAATGATGGAGAATTCCGGT -3'（配列番号：184）を用いた。
結果
ルシフェラーゼアッセイによるTuD200のmiR200阻害効果の検討
　ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を用いてmU6プロモーターとh7SKプロモーターの２種類のプロモーターから発現されるmiRNA阻害RNAの効果を調べた。さらにリンカー配列の長さが異なる２種類のmiRNA阻害RNA、TuD-miR200c-4ntin-3LとTuD-miR200c-4ntin-3pLを試験した。miR200を標的とする本発明のmiRNA阻害RNA（TuD200）発現プラスミドベクターを1ngトランスフェクションした実験において、mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、mU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL, h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L, h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLは、miR200cレポーターの発現を、mU6-TuD-NCよりも、それぞれ約5.7倍、約6.7倍、約6.1倍、約6.7倍上昇させた。一方、h7SK-TuD-NCはほぼ同等であった（図28B）。TuD RNA発現プラスミドベクターを10ngトランスフェクションした実験において、mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、mU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL, h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L, h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLは、miR200cレポーターの発現を、mU6-TuD-NCよりも、それぞれ約8.2倍、約8.7倍、約8.0倍、約8.5倍上昇させた。一方、h7SK-TuD-NCはほぼ同等であった。また1ngのトランスフェクションでも、10ngの結果と比較してもさほど劣らない効果が発揮された（図28C）。以上の結果からTuD-200cは少ない導入量で充分に内在のmiR-200 を阻害し得ることが分かった。また、miR-200での実験においてもmU6プロモーター,h7SKプロモーターおよびTuD-miR200c-4ntin-3L、TuD-miR200c-4ntin-3pLともに高い阻害活性を示すことが分かった。
　さらにTuD-miR200c発現レンチウイルスベクターを導入して作製したTuD RNA安定発現細胞においてもウイルス導入から23日後にルシフェラーゼレポーターアッセイを行ったところ、mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L, h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL発現細胞はmU6-TuD-NC発現細胞よりも、miR200cレポーターの発現をそれぞれ約6.9倍、約6.9倍上昇させた。一方、h7SK-TuD-NC発現細胞はほぼ同等であった（図28D）。この結果からTuD-miR200c発現レンチウイルスベクターを用いることにより長期間、高効率にmiR-200を阻害できることが示された。
miR200阻害による上皮-間充織転換の誘導
　上皮系細胞であるHCT116細胞にmiRNA阻害RNA発現レンチウイルスベクターpLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLおよびpLCG-h7SK-TuD-NCをそれぞれ導入し、GFP発現細胞を分取した。これらの細胞のタンパク質を回収し、上皮細胞・間充織細胞の遺伝子マーカーであるE-cadherin,Vimentinの発現量をウェスタンブロット法により解析した。E-cadherinの発現量はpLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD-NCを導入した細胞に比べ、pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLを導入した細胞において顕著に減少しており、VimentinについてはpLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD-NCを導入した細胞においては発現が認められなかったが、pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLを導入した細胞においては発現していた（図28E）。以上の結果からTuD-miR200cによるmiR-200 familyの阻害によって上皮系細胞であるHCT116が間充織系細胞へと転換されたことが示された。
　本発明により、miRNAを効率的かつ特異的に阻害することができるmiRNA阻害複合体が提供された。本発明のmiRNA阻害複合体は、例えばレトロウイルスベクターから発現させることにより、miRNAを長期間安定に阻害することができ、例えばノックダウンマウスのようなin vivoアッセイを可能にする。さらに、Cre-loxPを利用して時間特異的かつ組織特異的にmiRNAノックダウンを実施することも可能である。図６に例示した通り、本発明のmiRNA阻害RNAの発現カセットは容易に構築することができるので、miRNAを包括的に解析するためのRNAライブラリーを構築することもできる。このように、本発明はmiRNAの研究に極めて有用なツールを提供するものである。また生体内の遺伝子は、かなりの割合でmiRNAの標的であると予想されており、分化、発生、腫瘍形成、および感染症に対する細胞防御を含む様々な場面においてmiRNAは重要な役割を果たしていることが示唆されている。本発明の方法は、遺伝子調節機構の解明や腫瘍や感染症の遺伝子治療等において、これらのmiRNAの機能を制御するために有用である。

Claims (18)

  1. 　RNAまたはその類縁体を含むmiRNA阻害複合体であって、二本鎖構造を含み、かつmiRNA結合配列を含む少なくとも１つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に結合している、miRNA阻害複合体。
  2. 　第２の多重鎖構造を含み、該片端の２つの鎖にmiRNA結合配列を含む鎖がそれぞれ１本ずつ結合しており、該二本鎖構造と多重鎖構造とに挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該第２の多重鎖構造の2つの鎖にそれぞれ結合している、請求項１に記載の複合体。
  3. 　該多重鎖が二本鎖または四本鎖である、請求項２に記載の複合体。
  4. 　該片端の2つの鎖が、該片端側でつながっている、請求項１から３のいずれかに記載の複合体。
  5. 　直鎖状一本鎖RNAまたはその類縁体から構成される、請求項４に記載の複合体。
  6. 　2から5つのmiRNA結合配列を含む、請求項１から５のいずれかに記載の複合体。
  7. 　2つのmiRNA結合配列を含む、請求項６に記載の複合体。
  8. 　請求項５に記載の複合体であって、図２(C)に示された構造を含み、該構造のIおよびIIは二本鎖構造であって、該構造のaおよびbにそれぞれ１つのmiRNA結合配列を含む複合体。
  9. 　請求項５に記載の複合体であって、図２(D)に示された構造を含み、該構造のIは二本鎖構造であって片側に各鎖の末端があり、該構造のIIはヘアピンであって、該構造のaおよびbにそれぞれ１つのmiRNA結合配列を含む複合体。
  10. 　請求項１から９のいずれかの複合体を構成するRNAまたはその類縁体。
  11. 　請求項１０に記載のRNAをコードする核酸。
  12. 　プロモーターの下流に結合している、請求項１１に記載の核酸。
  13. 　プロモーターがポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項１２に記載の核酸。
  14. 　レトロウイルスベクター中に搭載されている、請求項１２または１３に記載の核酸。
  15. 　請求項１２に記載の核酸を作製する方法であって、プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列をコードする核酸の間に、少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸を挿入する工程を含む方法。
  16. 　miRNA結合配列をコードする核酸が、少なくとも２つのmiRNA結合配列を含み、その間にステムを形成する配列を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 　請求項１２に記載の核酸を作製するためのキットであって、下記（ａ）および（ｂ）の核酸を含むキット。
    （ａ）プロモーターの下流に少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列と、該１対の相補配列の間に核酸を挿入するための部位とを含む核酸。
    （ｂ）少なくとも１つのmiRNA結合配列をコードする核酸。
  18. 　miRNA結合配列をコードする核酸が、少なくとも２つのmiRNA結合配列を含み、その間にステムを形成する配列を含む、請求項１７に記載のキット。
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