WO2018170760A1 - 一种靶向抑制 miR-140 、 miR-148a 和 miR-424 表达的重组腺相关病毒 - Google Patents

一种靶向抑制 miR-140 、 miR-148a 和 miR-424 表达的重组腺相关病毒 Download PDF

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Definitions

  • the present invention belongs to the field of molecular biology and biomedicine technology, and particularly relates to a recombinant adeno-associated virus which specifically inhibits the expression of miR-140, miR-148a and miR-424.
  • MicroRNAs are a class of endogenous, non-coding RNAs found in eukaryotes, typically between 22 and 25 nt in size. miRNAs are widely distributed in plants, animals, and multicellular organisms, and can Play an important regulatory role, and in the study of human miRNAs, it is found that the expression of miRNA in normal tissues and tumor tissues is significantly different, some miRNAs are lowly expressed in tumor tissues, and some are highly expressed in tumor tissues. This suggests that miRNAs play a crucial role in tumorigenesis.
  • miR-140 is closely related to the development of various diseases, such as bone and joint diseases, liver diseases, pituitary adenomas, testicular development, head and neck tumors, ovarian and breast diseases. miR-140 can inhibit the proliferation and invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by targeting TG FBR1 and other gene expression. miR-140 is highly expressed in articular cartilage and plays a vital role in the pathogenesis of osteoarthritis.
  • miR-148a is a study in recent years More micr 0 RNA is obtained. It is reported that miR-148a is closely related to exogenous substance metabolism, apoptosis, occurrence, development and epigenetics of various cancers; miR-424 is a miRNA discovered in recent years, which is found in various tumors.
  • miR-424 By acting on the target gene and participating in the signal pathway of target gene regulation, it affects the biological effects and development of tumor cells, plays a role similar to oncogenes and tumor suppressor genes, or promotes and inhibits tumor invasion and metastasis.
  • miR-424 is a multifunctional miRNA, which is associated with cell invasion and metastasis of cervical cancer, pancreatic cancer, etc.; it is associated with the expression of inflammatory factors such as IL-6 and TNF- ⁇ ; since the miR-424 promoter region has Cp G Island, which is also associated with methylation-induced gene silencing.
  • Tough Decoy RNA is a novel miRNA-inhibiting miRNA that inhibits miRNA by introducing double-stranded RNA to target miRNAs. Because the inserted RNA is double-stranded and has a secondary structure of stem-loops, it is resistant to intracellular nuclease degradation and inhibits miRNAs in a long-term, stable, and efficient manner.
  • Adeno-associated virus is a non-pathogenic human parvovirus that can infect a wide variety of cells, including mitotic and non-dividing cells, and is characterized by its safety, long-lasting, high-efficiency, and high specificity.
  • researchers are highly regarded and favored and are widely used in the field of biology.
  • the use of AAV as a gene therapy vector has potential advantages.
  • a recombinant adeno-associated virus which specifically inhibits the expression of miR-140, miR-148a and miR-424 is constructed by the following method:
  • RNA sequence ij ij the recombinant plasmid pAKD-Tud-140-148a-424 was constructed and subjected to DNA sequencing analysis;
  • the titer of the virus was determined by quantitative PCR.
  • Tud RNA sequences specific for miR-140, miR-148a and miR-424 in step a are: 5'- TGCCCAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTT -3,.
  • step a a Kpn I and Bg III endonuclease cleavage site sequence and a transcription termination sequence are added to the selected target sequence to synthesize a complete Tud DNA sequence:
  • Tud DNA-F 5'-
  • the present invention constructs a recombinant adeno-associated virus rA AV-Tud-140-148a-424 which targets miR-140, miR-148a and miR-424, and can stably express a target protein and a high organism for a long period of time.
  • the safe type 8 adeno-associated virus (AAV8) is a transduction vector that stably expresses Tud RNA in vivo for a long time, thereby knocking down the expression of miR-140, miR-148a and miR-424.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the results of quantitative PCR detection of miRNA expression levels in each group of cells, wherein a. miR-140 expression, b. miR-148a expression, c. miR-424 expression.
  • Example 1 Construction of recombinant adeno-associated virus with targeted inhibition of miR-140, miR-148a and miR-424 expression
  • the Tud DNA template is annealed, and after annealing, a double-stranded oligonucleotide fragment having a Kpn I and Bgl II restriction sites at both ends is formed, which is labeled as T U d-140-148a-424.
  • the pAKD-shRNA plasmid vector was obtained by linear digestion with Kpn I and Bgl II, and an appropriate amount of the product was detected by 1% agarose gel electrophoresis and recovered.
  • the double-stranded DNA was ligated into the restriction vector according to the ligation reaction system, ligated and incubated at 4 ° C overnight, and transformed into competent E. coli DH5oc, which was plated and incubated overnight. Single colonies were picked for cultivation and sent to Shanghai Yingjun Biotechnology for sequencing. Culture the bacteria with the correct sequencing results, and extract the pAKD-Tud- using the Promega plasmid extraction kit (endotoxin). 140-148a-424 plasmid.
  • AAV-293 cell culture is carried out by a conventional method, and when the cells reach 70-80% fusion, the calcium phosphate method is used for virus transfection, and rAAV8 expressing Tud-140-148a-424 can be obtained, and virus collection is performed. Concentrate and purify.
  • the virus was titrated by a quantitative PCR method.
  • the number of viral particles of rAAV is determined by detecting the genomic copy number of the rAAV vector in the viral genome, and the titer unit is expressed in vg/ml, that is, the number of viral genomes per ml (Vims Genome).
  • the virus sample to be tested was digested with DNase and RNase at 37 ° C for 2 ⁇ 3 h, and the virus DNA was extracted and denatured in a boiling water bath for 5 min, immediately placed on ice for 2 min, and the virus sample and the standard product were diluted to different concentrations.
  • the primers used were: upstream: 5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3', downstream: 5,-GCAGAATCCAGGTGGCAAC A-3.
  • the reaction conditions were: denaturation at 94 ° C for 15 s, annealing at 52 ° C for 30 s, and extension at 72 ° C for 30 s, for a total of 40 cycles.
  • a standard curve was drawn based on the standard and the virus sample titer was calculated.
  • the average virus titer was calculated to be 4.07 x 1011 vg/ml.
  • MCF-7 cells were seeded in a six-well plate, 1000000 cells per well, and the cell density was about 50% after 12 hours.
  • the virus solution was taken separately, and the virus was diluted 1000 times with DMEM complete medium to remove the 6-well plate.
  • DMEM complete medium containing 10% fetal bovine serum
  • the miRcute miRNA extraction and isolation kit was used to extract miRNAs from normal MCF-7 cells and TuD-140-148a-424 cells, followed by S-Poly(T) hsa-miR-140 qPCR-assay primer
  • the set kit reverse-transcribes and tails the miRNA to obtain the corresponding cDNA.
  • the expression levels of miR-140, miR-148a and miR-424 were detected by real-time PCR using 2 ⁇ of cDNA from 2 cells. The experiment was repeated 3 times, and 3 parallel samples were set for each well, and snord 44 was used as an internal reference. The results are shown in Fig. 2. It can be seen that the expression level of miR-140 in TuD-140-148a-424 cells is 44 ⁇ 3 ⁇ 4 lower than that of MCF-7 cells, and the expression level of miR-148a is 59% lower than that of MCF-7 cells. The expression level of miR-424 was 60% lower than that of MCF-7 cells. The difference was statistically significant (/? ⁇ 0.01), indicating that the TuD-140-148a-424 cell line was successfully constructed. Industrial applicability
  • the present invention constructs a recombinant adeno-associated virus AV-Tud-140-148a-424 which targets and inhibits miR-140, 1 ⁇ 1 -148 & 1 ⁇ 1 -424, and can stably express the target protein and height for a long time.
  • the biosafety type 8 adeno-associated virus (AAV8) is a transduction vector that stably expresses Tud RNA in vivo for a long time, thereby knocking down the expression of miR-140, miR-148a and miR-424.

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Abstract

一种靶向抑制miR-140、miR-148a和miR-424表达的重组腺相关病毒。

Description

说明书
发明名称：一种靶向抑制 miR-140、 miR-148a和 miR-424表达的重组 腺相关病毒
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学与生物医药技术领域， 具体涉及一种靶向抑制 miR-140 、 miR- 148a和 miR-424表达的重组腺相关病毒。
背景技术
[0002] MicroRNA (miRNA) 是在真核生物中发现的一类内源性的非编码 RNA， 大小 一般在 22-25 nt之间， miRNA广泛分布于植物、 动物和多细胞生物中， 并且能发 挥重要的调节作用， 而在人类 miRNA的研究中， 发现 miRNA在正常组织和肿瘤 组织中的表达有着显著差异， 有些 miRNA会在肿瘤组织中有低表达， 有些则在 肿瘤组织中有高表达， 这说明 miRNA在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。
[0003] miR-140与多种疾病的发生发展密切相关， 如骨、 关节疾病， 肝脏疾病， 垂体 腺瘤， 睾丸发育， 头颈部肿瘤， 卵巢与乳腺疾病等。 miR-140能通过靶向调节 TG FBR1等基因表达抑制肝细胞癌增殖和侵袭转移， miR-140特异性高表达于关节软 骨中， 并在骨关节炎的发病机制中发挥至关重要的作用， 在多种机制调控下， m iR-140在一些肿瘤中发挥癌基因作用， 而在另一些肿瘤中发挥抑癌作用， 并且与 多种肿瘤化疗耐药性有关； miR- 148a是近几年研究得较多的一种 micr0RNA。 据 报道， miR-148a与外源性物质代谢、 细胞凋亡、 多种癌症的发生、 发展和表观 遗传等都密切有关； miR-424是近年来发现的一个 miRNA, 其在多种肿瘤中通过 作用于靶基因， 参与靶基因调控的信号通路， 从而影响肿瘤细胞生物学效应和 发生发展， 发挥类似于癌基因、 抑癌基因的作用， 或促进、 抑制肿瘤的侵袭转 移。 有研究表明 miR-424是多功能 miRNA, 它与宫颈癌， 胰腺癌等细胞侵袭转移 相关； 与炎性因子如 IL-6、 TNF-α的表达相关； 由于 miR-424启动子区域具有 Cp G岛， 它与甲基化诱导的基因沉默也相关。 通过控制 miR-140、 miR-148afPmiR-4 24的表达， 同吋与其他药物协同作用， 能为治疗癌症提供新的表观遗传思路。 技术问题 [0004] MiRNA的功能研究主要通过 miRNA干扰和过表达技术完成。 现有 miRNA干扰 技术中， anti-miR和 antagomiR为瞬吋转染技术， 其干扰效果不能稳定保持， 而 m iRNA sponge效果远未达到最优， 现有技术缺乏一种干扰效果好且能实现长期稳 定干扰的技术。
[0005] Tough Decoy RNA (Tud RNA) 是一种新幵发出的 miRNA抑制手段， 其通过引 入双链 RNA对目标 miRNA进行吸附， 达到抑制 miRNA的目的。 由于弓 |入的 RNA 为双链并且带有茎环的二级结构， 因此其够抵抗胞内核酸酶的降解， 能长期、 稳定和高效地抑制 miRNA。
[0006] 腺相关病毒 （AAV) 是一种非致病性人类细小病毒， 可广泛感染各种细胞包括 分裂期与非分裂期细胞， 因具有安全、 持久、 高效、 高特异性等特性受到广大 研究人员高度关注和青睐， 在生物学领域中被广泛使用。 以 AAV为基因治疗载 体极具潜在优势。
问题的解决方案
技术解决方案
[0007] 本发明的目的是提供一种靶向抑制 miR-140、 miR- 148a和 miR-424表达的重组腺 相关病毒。
[0008] 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是： 一种靶向抑制 miR-140、 miR- 148 a和 miR-424表达的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的：
[0009] a.
根据人 miR- 140、 miR- 148a和 miR-424序列， 设计针对 miR- 140、 miR- 148a和 miR- 424特异性的 Tud
RNA序歹 ij， 构建重组质粒 pAKD-Tud-140-148a-424， 并进行 DNA测序分析；
[0010] b.将重组质粒 pAKD-Tud-140-148a-424、 包装质粒 pAAV-RC和辅助质粒 pHelper 用磷酸钙法共转染 AAV-293细胞， 收获重组腺相关病毒 rAAV- Tud-140-148a-424
， 采用定量 PCR方法对病毒进行滴度测定。
[0011] 所述的步骤 a中针对 miR-140、 miR-148a和 miR-424特异性 Tud RNA序列为： 5'- TGCCCAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTT -3，。
[0012] 所述的步骤 a中在选定的靶点序列基础上添加 Kpn I和 Bg III内切酶的酶切位点序 列与转录终止序列， 合成完整的 Tud DNA序列：
[0013] Tud DNA-F: 5'-
Figure imgf000004_0001
TGGTGCCCAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTGTAC -3'
Tud DNA-R: 5，-
Figure imgf000004_0002
ATGAGTGCAAAACGTTGATGATCCTAGCGCC -3，。
发明的有益效果
有益效果
[0015] 本发明构建了一种靶向抑制 miR-140、 miR- 148a和 miR-424的重组腺相关病毒 rA AV-Tud-140-148a-424, 采用可以长期稳定表达目的蛋白以及高度的生物安全性 的 8型腺相关病毒 （AAV8) 为转导载体， 能在体内长期稳定表达 Tud RNA， 从 而起到敲低 miR- 140、 miR- 148a和 miR-424表达的作用。
对附图的简要说明
附图说明
[0016] 图 1为定量 PCR检测各组细胞的 miRNA表达水平结果示意图， 其中， a. miR- 140 的表达情况， b. miR- 148a的表达情况， c. miR-424的表达情况。 实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0017] 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解 ， 实施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而 不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。 下述实施例中所用的方 法如无特别说明均为常规方法； 所述试剂如无特殊说明， 均为市售产品。 具体 步骤可参见： 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook, J., Russell, David W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor) °
[0018] 实施例一： 构建靶向抑制 miR-140、 miR-148a和 miR-424表达的重组腺相关病 毒
[0019] 1、 构建重组质粒 pAKD-Tud-140-148a-424
[0020] 根据 TuD RNA设计序列和 miRBase中提供的 miR-140、 miR-148a和 miR-424的序 列信息， 设计出针对 miR-140、 miR- 148a和 miR-424特异性 Tud RNA序列： 5'-
Figure imgf000005_0001
TGCCCAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTT -3，。 在选定的靶点序列基础上添 加 Kpn I和 Bgl II内切酶的酶切位点序列与转录终止序列， 委托上海英骏生物技 术有限公司合成完整的 Tud DNA序歹 ij。
[0021] 进行 Tud DNA模板的退火， 经退火反应后， 形成两端带有 Kpn I和 Bgl II酶切 位点的双链寡核苷酸片段， 标记为 TUd-140-148a-424。
[0022] 取 pAKD-shRNA质粒载体， 利用 Kpn I和 Bgl II酶切使其线性化， 取适量产物进 行 1%琼脂糖凝胶电泳检测并进行回收。 按照连接反应体系将双链 DNA连接入酶 切载体， 连接后于 4 °C孵育过夜， 并转化至感受态大肠杆菌 DH5oc， 涂布平板后 培育过夜。 挑取单菌落进行培育并送至上海英骏生物技术进行测序。 培养测序 结果完全正确的菌， 并用 Promega质粒抽提试剂盒 （去内毒素） 提取 pAKD-Tud- 140-148a-424质粒。
[0023] 2、 病毒包装、 纯化及滴度测定
[0024] 常规方法进行 AAV-293细胞培养， 当细胞达到 70-80%融合吋采用磷酸钙法进 行病毒转染， 即可得到表达 Tud-140-148a-424的 rAAV8， 并进行病毒的收集、 浓 缩和纯化。
[0025] 采用定量 PCR的方法对病毒进行滴度测定。 通过检测病毒基因组中 rAAV载体 的基因组拷贝数来测定 rAAV的病毒颗粒数， 滴度单位用 vg/ml来表示， 即每 ml含 有的病毒基因组数 （Vims Genome) 。 将待测病毒样品用 DNase和 RNase于 37°C 消化 2〜3h， 提取病毒 DNA， 沸水浴 5min使之变性， 立即置于冰上 2min， 将病毒 样品与标准品做倍比稀释成不同浓度， 进行定量 PCR检测， 所用引物为： 上游： 5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' , 下游： 5，-GCAGAATCCAGGTGGCAAC A-3，。
[0026] 反应条件为： 94°C变性 15s， 52°C退火 30s， 72°C延伸 30s， 共进行 40循环。 PCR 结束后， 根据标准品绘制标准曲线并计算病毒样品滴度。 经计算， 病毒平均滴 度为 4.07x1011 vg/ml。
[0027] 实施例二： AAV转染 MCF-7细胞
[0028] 接种 MCF-7细胞于六孔板中， 每孔 1000000个细胞， 12h后细胞密度约为 50% ， 分别取病毒液， 用 DMEM完全培养基 1000倍稀释病毒， 去除 6孔板中的培养 基， 加入含病毒的 DMEM完全培养基（含 10%胎牛血清)， 24h
后弃去含病毒的 DMEM完全培养基， 更换新鲜的 DMEM
完全培养基， 继续培养 96 h。
[0029] 实施例三： 荧光定量 PCR检测 miRNA的表达水平变化
[0030] 用 miRcute miRNA提取分离试剂盒提取正常 MCF-7细胞和 TuD-140-148a-424细 胞细胞的 miRNA， 然后用 S-Poly(T) hsa-miR-140 qPCR-assay primer
set S-Poly(T) hsa-miR-148a qPCR-assay primer set和 S-Poly(T) hsa-miR-424 qPCR-assay primer
set试剂盒对 miRNA进行逆转录和加尾， 得到相应的 cDNA。 取 2种细胞的 cDNA 各 2 μί为模板， 荧光定量 PCR检测 miR-140、 miR- 148a和 miR-424表达水平的变化 ， 实验重复 3次， 每孔设置 3个平行样，以 snord 44作为内参。 结果如图 2所示， 可 以看到与 TuD-140-148a-424细胞的 miR-140的表达水平比 MCF-7细胞低 44<¾， miR -148a的表达水平比 MCF-7细胞低 59%， miR-424的表达水平比 MCF-7细胞低 60% 。 差异有统计学意义 （/?<0.01) ， 说明 TuD-140-148a-424细胞株构建成功。 工业实用性
本发明构建了一种靶向抑制 miR-140、 1^1 -148&和1^1 -424的重组腺相关病毒^ AV-Tud-140-148a-424, 采用可以长期稳定表达目的蛋白以及高度的生物安全性 的 8型腺相关病毒 （AAV8) 为转导载体， 能在体内长期稳定表达 Tud RNA, 从 而起到敲低 miR- 140、 miR- 148a和 miR-424表达的作用。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种靶向抑制 miR-140、 miR-148a和 miR-424表达的重组腺相关病毒
， 其特征在于， 所述的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的： a.
根据人 miR-140、 miR- 148a和 miR-424序列， 设计针对 miR-140、 miR- 148a和 miR-424特异性的 Tud
RNA序歹 ij， 构建重组质粒 pAKD-Tud-140-148a-424， 并进行 DNA测序 分析；
b.将重组质粒 pAKD-Tud-140-148a-424、 包装质粒 pAAV-RC和辅助质 粒 pHelper用磷酸钙法共转染 AAV-293细胞， 收获重组腺相关病毒 rAA V- Tud-140-148a-424, 采用定量 PCR方法对病毒进行滴度测定。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的靶向抑制 miR-140、 miR- 148a和 miR-424表达的 重组腺相关病毒， 其特征在于， 所述的腺相关病毒载体的血清型为 8
[权利要求 3] 根据权利要求 1所述的靶向抑制 miR- 140、 miR- 148a和 miR-424表达的 重组腺相关病毒， 其特征在于， 步骤 a中针对 miR-140、 miR-148a和 mi R-424特异性 Tud RNA序列为： 5 ' -
Figure imgf000008_0001
AGCGCCACCTTTTT -3，。
[权利要求 4] 根据权利要求 1所述的靶向抑制 miR- 140、 miR- 148a和 miR-424表达的 重组腺相关病毒， 其特征在于， 步骤 a中在选定的靶点序列基础上添 加 Kpnl和 Bglll内切酶的酶切位点序列与转录终止序列， 合成完整的 T ud DNA序歹 'J:
Tud DNA-F: 5'- TCCTAGCGCCACCTTTTTGTAC -3' Tud DNA-R: 5，-
Figure imgf000009_0001
TGATGATCCTAGCGCC -3' =
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