WO2010043558A1 - Herstellung und verwendung von methionylmethionin als futtermitteladditiv für fische und krustentiere - Google Patents

Herstellung und verwendung von methionylmethionin als futtermitteladditiv für fische und krustentiere Download PDF

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WO2010043558A1
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methionylmethionine
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methionyl
acid
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Christoph Kobler
Thomas HÄUSSNER
Christoph Weckbecker
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Evonik Degussa Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to novel chemical syntheses of methionyl methionine, the dipeptide of methionine, and its specific use as a feed additive alone or in admixture with methionine for the nutrition of fish and crustaceans.
  • Essential amino acids such as methionine, lysine or threonine
  • EAA Essential amino acids
  • the supplementation of natural protein sources, e.g. Soya, maize and wheat with EAAs enable faster animal growth and higher milk production in high-performance dairy cows, as well as more efficient utilization of the feed. This represents a huge economic advantage.
  • the markets for feed additives are of great industrial and economic importance. In addition, they are strong growth markets, not least due to the increasing importance of countries such as China and India.
  • L-methionine ((5) -2-amino-4-methylthiobutyric acid) is the first limiting amino acid for many animal species such as chickens, ducks, turkeys and also many fish and shellfish species and therefore plays a very important role in animal nutrition and as a feed additive important role (rose Berg et al. , J. Agr. Food Chem. 1957, 5, 694-700 and Lovell, TR, J. Anim. Be. 1991, 69, 4193-4200).
  • methionine is a racemate, a 50:50 mixture of D- and L-methionine.
  • this racemic DL-methionine can be used directly as a feed additive, since in some species under in vivo conditions a conversion mechanism exists that converts the unnatural D-enantiomer of methionine to the natural L-enantiomer.
  • the D-methionine is first deaminated with the aid of a non-specific D-oxidase to ⁇ -keto-methionine and then further converted with an L-transaminase to L-methionine (Baker, DH in "Amino acids in farm animal nutrition", D ' Mello, JPF (ed.), Wallingford (UK), CAB International, 1994, 37-61), which increases the amount of L-methionine available in the organism, which can then be made available to the animal for growth D- to L-methionine was found in chickens, pigs and cows, but especially in carnivorous and omnivorous fish, as well as in shrimp and prawns, for example Sveier et al.
  • Plasma which can lead to the asynchronicity of the simultaneous availability of all important amino acids.
  • some of the highly concentrated amino acids are rapidly excreted or rapidly metabolized in the organism and used, for example, as a pure source of energy.
  • there is little or no growth in the use of crystalline amino acids in carp Feed additives (Aoe et al., Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1970, 36, 407-413).
  • the supplementation of crystalline amino acids may lead to further problems.
  • the effective delivery of fish and shellfish kept in aquaculture thus requires, for certain species and applications, a specific product form of methionine, e.g. a suitably chemically or physically protected methionine.
  • a specific product form of methionine e.g. a suitably chemically or physically protected methionine.
  • the goal here is firstly that the product remains sufficiently stable during feeding in the aqueous environment and is not dissolved out of the feed.
  • the methionine product finally absorbed by the animal can be optimally and efficiently utilized in the animal organism.
  • WO8906497 describes the use of di- and tripeptides as a feed additive for fish and shellfish. This should promote the growth of the animals. Di- and tripeptides from nonessential and therefore not limiting amino acids such as glycine, alanine and serine were preferred. As methionine-containing dipeptides, only DL-alanyl-DL-methionine and DL-methionyl-DL-glycine have been described. As a result, however, only effectively 50% active ingredient (mol / mol) are contained in the dipeptide. points is to be classified as very disadvantageous.
  • WO02088667 the enantioselective synthesis and application of oligomers of MHA and amino acids such as methionine as feed additives, including for fish and krus- tteniere described. This is to a faster growth can be achieved.
  • the oligomers described are built up by an enzyme-catalyzed reaction and have a very broad distribution of the chain length of the individual oligomers. This makes the process unselective, expensive and expensive to carry out and purify.
  • Dabrowski et al. describes in US20030099689 the use of synthetic peptides as feed additives for growth promotion for aquatic animals. The peptides may account for 6-50% by weight of the total feed formulation.
  • the synthetic peptides preferably consist of essential and limiting amino acids.
  • the synthesis of such synthetic oligo- and polypeptides is very complicated, expensive and difficult to realize on an industrial scale.
  • the efficacy of polypeptides of a single amino acid is controversial, as these are often converted only very slowly or not at all under physiological conditions to free amino acids.
  • Baker et al. J. Nutr., 1982, 112, 1130-1132
  • poly-L-methionine because of the absolute insolubility in water, has no organic value in chickens, since absorption from the organism is not possible.
  • the surface coating of the finished coated methionine can be easily damaged by mechanical stress and abrasion during feed processing, which can lead to the reduction or even complete loss of physical protection.
  • the content of methionine is reduced by a coating or use of a matrix substance and thus often becomes uneconomical.
  • a general task was to provide a feed or feed additive for animal nutrition based on a new methionine substitute, which can be used alone or as a mixture with methionine, especially in the field of industrial fish and crustacean farming in aquaculture. At the same time, a simple and cost-effective chemical synthesis of this new methionine substitute should be developed.
  • the main object was to provide a chemically protected methionine product for various omni-, herbi- and carnivorous fish and crustacean species living in salt or fresh water.
  • this product should have a low solubility (leaching) from the total feed pellet or extrudate in the water and have a "slow release” mechanism, ie a slow and continuous release of free methionine under physiological conditions Mixture with DL-methionine can be used advantageously.
  • a further object was to find a methionine substitute as feed or a feed additive with a very high biopower rating, which is easy to handle and storable and stable under the usual conditions. conditions of compound feed processing, especially pelleting and extrusion.
  • the fish and crustaceans should be provided with a further efficient source of methionine which, if possible, does not have the disadvantages of the known products or only to a reduced extent.
  • DL-methionyl-DL-methionine methionylmethionine
  • typical by-products and by-products from the technical DL-methionine production process can be used as starting material.
  • a suitable method for the separation of diastereomeric pairs DD / LL and DL / LD-methionylmethionine should be developed, so that for special applications also an optimal and effective use of only one pair of diastereomers (DD / LL-I or DL / LD-I) possible is.
  • the object is achieved by the use of DL-methionyl-DL-methionine and its salts as a feed additive in feed mixtures for animals kept in aquaculture.
  • the feed mixture contains 0.01 to 5 wt .-%, preferably 0.05 to 0.5 wt .-% DL-methionyl-DL-methionine contains.
  • DL-methionyl-DL-methionine has proven to be particularly advantageous because the compound has an excellent leaching behavior due to the low solubility of the mixture of DD / LL / DL / LD-
  • DL-methionyl-DL-methionine is stable in mixtures with conventional components and feed such as cereals (eg maize, wheat, triticale, barley, millet, etc.), vegetable or animal protein carriers (eg soybeans and oilseed rape and their processed products, legumes (eg Peas, beans, lupins, etc.), fishmeal, etc.) and in combination with supplemented essential amino acids, proteins, peptides, carbohydrates, vitamins, minerals, fats and oils.
  • cereals eg maize, wheat, triticale, barley, millet, etc.
  • vegetable or animal protein carriers eg soybeans and oilseed rape and their processed products, legumes (eg Peas, beans, lupins, etc
  • the feed mixture contains proteins and carbohydrates, preferably based on fish, soya or maize flour, and may be supplemented with essential amino acids, proteins, peptides, vitamins, minerals, carbohydrates, fats and oils.
  • DL-methionyl-DL-methionine alone as DD / LL / LD / DL mixture, as DL / LD or DD / LL mixture is present, preferably in each case additionally in admixture with DL-methionine, preferably with a DL-methionine content of 0.01 to 20 wt .-%, particularly preferably from 1 to 10 wt .-%.
  • DL-methionyl-DL-methionine is present as the enantiomeric pair DL / LD-methionylmethionine.
  • the aquaculture animals are freshwater and saltwater fish and crustaceans selected from the group consisting of carp, trout, salmon, catfish, perch, flatfish, sturgeon, tuna, catfish Ie, bream, cod, shrimp, krill and prawns, in particular for silver (Hypophthalmichthys molitrix), grass (Ctenopharyngodon idella), scales (Cyprinus carpio) and bighead carp (Aristichthys nobilis), crucian carp (Carassius carassius), catla ( Catla Catla), Roho Labeo (Labeo rohita), Pacific and Atlantic salmon (Salmon salar and Oncorhynchus kisutch), rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), American catfish (Ictalurus punctatus), African catfish ⁇ Ciarias gariepinus), Pangasius (Pangasius bo-
  • dipeptide DL-methionyl-DL-methionine (I) exist four different stereoisomers (diastereomers) DD, LL, DL and LD-I, of which only the L-methionyl-L-methionine (LL-I) is natural, the three other dipeptides L-methionyl-D-methionine (LD-I), D-methionyl-L-methionine (DL-I) and D-
  • DD-I and LL-I behave with each other as image and mirror image, i. they are enantiomers and thus have the same physical properties.
  • the two pairs DD / LL-I and DL / LD-I are diastereomeric to one another, ie. are have different physical data.
  • the diastereomeric pair DD / LL-I has a solubility of 21.0 g / l in water at room temperature, whereas the solubility of the diastereomer pair DL / LD-I is 0.4 g / l.
  • the subject of the present invention is the use of DL-methionyl-DL-methionine as feed as a DD / LL / DL / LD, DD / LL or DL / LD diastereomer mixture as growth promoter for omni-, carni- and herbivorous fish and shellfish in aquaculture.
  • DL-methionyl-DL-methionine (I) under enzymological conditions enzymatically from fish and crustaceans to free D- and L- Methionine can be cleaved (Scheme 2) (see also Examples 22 to 24).
  • DL-methionyl-DL-methionine (I) the corresponding digestive enzymes from carp (omnivor), trout (karnivor) and Whiteleg shrimp (omnivor) were isolated and reacted in optimized in vitro experiments under physiologically comparable conditions with DL-methionyl-DL-methionine.
  • the peculiarity of the cleavage of DL-methionyl-DL-methionine (I) according to the invention lies in the fact that all four possible diastereomers, both the natural LL-I and the three unnatural diastereomers DD, DL and LD-1 physiological conditions can be split.
  • methionylmethionine as a feed additive and source of methionine is that D- or L-methionine can be released throughout the digestion time in the organism and thus in synchronism with the release of other amino acids derived from natural protein sources ("slow").
  • This special effect has the effect that the simultaneous availability of all important and essential amino acids is ensured in an ideal ratio in the blood plasma, which is absolutely necessary for optimal growth of the organism.
  • DL-methionyl-DL-methionine I
  • methionine hydantoin Hd
  • DL-methionyl-DL-methionine is synthesized directly from methionine hydantoin and comprises the methods G, H, and J. shown in Scheme 3.
  • Scheme 3 Preferably, a solution containing methionine hydantoin and water is reacted with methionine under basic conditions. Furthermore, it is preferred that the pH of the solution containing the urea derivative is adjusted to 8 to 14, preferably to 10 to 13.
  • the reaction is carried out at a temperature of 50 to 200 0 C, preferably at a temperature of 80 to 170 0 C and particularly preferably at a temperature of 130 to 160 ° C. It is further preferred that the reaction is carried out under pressure, preferably at a pressure of 3 to 20 bar, more preferably at a pressure of 6 to 15 bar.
  • a solution containing methionine hydantoin and water has previously been formed from one or more of the compounds IIa, IIb, Hc, Hd, He, Hf and Hg.
  • methionine hydantoin is obtained by reacting the compound He or Hf with a nitrogen-containing base, NH 4 HCO 3 , (NH 4 ) 2 CO 3 , NH 4 OH / CO 2 mixture or carbamate salts.
  • the reaction of the compound He is preferably carried out at a temperature of from 0 ° C. to 150 ° C., preferably from 0 ° C. to 100 ° C., and more preferably from 10 ° C. to 70 ° C.
  • the methionine hydantoin is obtained by reacting the compound Hf with CO 2 . It is preferred that the reaction takes place in the presence of a base, preferably selected from the group consisting of KHCO 3 , K 2 CO 3 , tertiary amines or their salts, alkali metal and Erdalkalibasen.
  • a base preferably selected from the group consisting of KHCO 3 , K 2 CO 3 , tertiary amines or their salts, alkali metal and Erdalkalibasen.
  • methionine hydantoin is obtained by reacting the compound Hg with a cyanide ion source and a base selected from Group containing nitrogen-containing bases, ammonium salts in the presence of CO 2 , NH 4 HCO 3 , (NH 4 ) 2CO 3, NH 4 OH / CO 2 mixture and carbamate salts.
  • the reaction takes place at a temperature of preferably -20 0 C to 150 0 C, preferably -10 ° C to 100 ° C and more preferably from 0 ° C to 70 0 C.
  • An alternative embodiment of the process according to the invention comprises the following steps: a) Reaction of the urea derivative according to the formulas IIa, IIb, Hc, Hd, He, Hf and Hg to give a diketopiperazine of the formula
  • reaction of the urea derivative to diketopiperazine at a temperature of 50 0 C to 200 0 C, preferably from 100 0 C to 180 0 C and particularly preferably from 140 ° C to 170 0 C is performed.
  • the reaction of the urea derivative to diketopiperazine takes place under pressure, preferably at a pressure of from 3 to 20 bar, more preferably at a pressure of from 6 to 15 bar.
  • the reaction of the urea derivative to diketopiperazine takes place in the presence of a base.
  • a base It is the Base preferably selected from the group nitrogen-containing bases, NH 4 HCO 3 , (NH 4 ) 2CO 3 , KHCO 3 , K 2 CO 3 , NH 4 OH / CO 2 - mixture, carbamate salts, alkali and Erdalkalibasen.
  • reaction of the urea derivative to diketopiperazine takes place by reaction with methionine.
  • a ratio of urea derivative to methionine of 1: 100 to 1: 0.5 is preferred.
  • reaction of diketopiperazine to DL-methionyl-DL-methionine by acid hydrolysis.
  • the acid hydrolysis is in
  • Presence of an acid is carried out, which is preferably selected from the group of mineral acids, HCl, H 2 CO 3 , CO 2 / H 2 O, H 2 SO 4 , phosphoric acids, carboxylic acids and hydroxycarboxylic acids.
  • the reaction of diketopiperazine to DL-methionyl-DL-methionine by basic hydrolysis is preferably carried out at a pH of 7 to 14, more preferably at a pH of 9 to 12, most preferably at a pH of 10 to 11 to obtain DL-methionyl-DL-methionine.
  • the basic conditions can be adjusted using a substance which is preferably selected from the group consisting of nitrogen-containing bases, NH 4 HCO 3 , (NH 4 ) 2 CO 3 , NH 4 OH / CO 2 mixture, carbamate salts, KHCO 3 , K 2 CO 3 , carbonates, alkali and alkaline earth bases.
  • the acidic or basic hydrolysis is preferably carried out at temperatures from 50 0 C to 200 0 C, preferably from 8O 0 C to 180 0 C and more preferably from 90 0 C to 160 0 C carried.
  • reaction of diketopiperazine to give DL-methionyl-DL-methionine by introducing CO 2 into a basic solution, preferably in a ba- ammonium, potassium or sodium hydroxide solution.
  • the diketopiperazine is isolated prior to hydrolysis. It is preferred that the Dike- topiperazine by crystallization from the reaction solution, preferably at a temperature of -30 to 120 0 C, particularly preferably at a temperature of 10 to 70 0 C, is isolated.
  • DD / LL / DL / LD-methionylmethionine are acidified and the methionylmethionine is obtained by crystallization or precipitation.
  • acids are preferably used from the group of mineral acids, HCl, H2CO3, CO2 / H2O, H 2 SO 4 , phosphoric acids, carboxylic acids and hydroxycarboxylic acids for acidification.
  • bases are preferably used for neutralization from the group NH 4 HCO 3 , (NH 4 ) 2 CO 3 , nitrogen-containing bases, NH 4 OH, carbamate salts, KHCO 3 , K 2 CO 3 , carbonates, alkali and alkaline earth bases.
  • the invention further provides a process for fractionating the diastereomeric mixture of DD / LL / DL / LD-methionylmethionine by fractional crystallization to give the two enantiomeric pairs DD / LL-methionylmethionine and DL / LD-methionylmethionine.
  • the procedure is as follows:
  • step a) the acidification takes place with an acid and a pH of 0.1 to 1.0, preferably a pH of about 0.6 is set, and the resulting clear solution then with a base to a pH of 5 to 6, preferably adjusted to a pH of about 5.6.
  • Mineral acids preferably phosphoric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid or carbonic acid or carbon dioxide, and / or carboxylic acids, in particular the dC 4 -carboxylic acids formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid or isobutyric acid, can be used as the acid.
  • Particular preference is given to using carbon dioxide or carbon dioxide.
  • the carbon dioxide or the carbon dioxide can be introduced into the reaction mixture under atmospheric pressure or under overpressure.
  • a base selected from the group NH 4 HCO 3 , (NH 4 ) 2 CO 3 , nitrogen-containing bases, NH 4 OH, carbamate salts, KHCO 3 , K 2 CO 3 , carbonates , Alkali bases and alkaline earth bases.
  • the procedure is as follows: a) by basifying the DD / LL / DL / LD-methionylmethionine-containing suspension until a clear solution is obtained and by stepwise addition of the basic solution with an acid precipitate until a precipitate, DL / LD-methionylmethionine is recovered as a precipitate.
  • step b) from the compound obtained from step a) the mother liquor is obtained on closing ⁇ DD / LL-methionylmethionine.
  • step a) the Ba ⁇ sischstellen with a base is carried out and a pH of 7.5 to 14, preferably a pH of about 9 to 13 is ⁇ sets and the resulting clear solution then adjusted with an acid to a pH of 5 to 6, preferably to a pH of about 5.6.
  • Suitable bases ⁇ preferably the bases from the group of NH 4 HCO 3, (NH 4) 2 CO3, nitrogen-containing bases, NH 4 OH, carbamate salts, KHCO 3, K 2 CO 3, carbonates, alkali metal and alkaline earth metal bases used.
  • an acid is preferably used from the group of the mine ⁇ ralklaren, preferably phosphoric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, or carbonic acid or carbon dioxide, and / or from the group of carboxylic acids, in particular Ci-C 4 - carboxylic acids formic acid, acetic acid, propionic acid, But ⁇ terklare and isobutyric acid.
  • the carbonic acid or carbon dioxide is particularly preferably used.
  • the method of fractional crystallization it is carried out at a temperature of 0 0 C to 100 0 C, preferably 5 ° C to 6O 0 C and particularly preferably from 10 0 C to 40 0 C.
  • the DD / LL-methionylmethionine obtained can be racemized and introduced into the separation process described above, with the two enantiomeric pairs DD / LL-methionylmethionine and DL / LD-methionylmethionine being separated from one another. All of the mentioned processes of the present invention are preferably carried out in an aqueous medium.
  • processes of the present invention can be carried out in batch processes known to those skilled in the art or in continuous processes.
  • FIG. 1 shows the schematic representation of the enzymatic cleavage of the methionylmethionine diastereomer mixtures DD / LL-I, DL / LD-I and DD / LL / DL / LD-I.
  • FIG. 2 shows the schematic representation of the enzymatic cleavage of the four methionylmethionine diastereomers DD-I, LL-I, DL-I and LD-I with different cleavage rates.
  • FIG. 3 shows the schematic representation of the enzymatic release of methionine (D- and L-Met together) from the four methionylmethionine diastereomers DD-I, LL-I, DL-I and LD-I.
  • FIG. 4 shows the biotransformation of D-methionine to L-methionine with an enzyme cocktail from mirror carp.
  • FIG. 5 shows the leaching behavior of methionylmethionine diastereomer mixtures DD / LL-I, DL / LD-I and LL / DD / LD / DL-I in comparison to methionine, MHA and MHA-Ca.
  • Figure 6 shows the in vitro digestion of four different methionylmethionine diastereomers LL-I, LD-I, DL-I and DD-I with digestive enzymes of the mirror carcass.
  • FIG. 7 shows the in vitro digestion of various methionylmethionine diastereomer mixtures LL / DD-I, DL / LD-I and LL / DD / LD / DL-I with digestive enzymes of the mirror carbene.
  • Figure 8 shows the in vitro digestion of four different methionylmethionine diastereomers LL-I, LD-I, DL-I and DD-I with digestive enzymes of the rainbow trout.
  • FIG. 9 shows the in vitro digestion of the methionylmethionine diastereomer mixtures LL / DD-I, DL / LD-I and
  • Figure 10 shows the in vitro digestion of four different ⁇ NEN methionylmethionine diastereomers LL-I, LD-I, DL-I and DD-I with digestive enzymes of the Whiteleg shrimp.
  • FIG. 11 shows the in vitro digestion of various substances
  • this compound is transformed to DL-methionyl-DL-methionine (I) (see Scheme 3).
  • the corresponding dietopiperazine (III) is formed as an intermediate.
  • G, H and J arises methionine hydantoin as an intermediate, which is transformed directly to DL-methionyl-DL-methionine (I).
  • fractional crystallization method K a separation of the two pairs of diastereomers DD / LL-I and DL / LD-I can be achieved (see Scheme 3).
  • Example 5 Synthesis of 3, 6-bis [2- (methylthio) ethyl] -2,5-piperazinedione (III) (methioninediketopiperazine, DKP) from 2-hydroxy-4- (methylthio) butanenitrile (3- (methylmercapto) propionaldehyde cyanohydrin, MMP-CH) (IIe) according to method C
  • Example 7 Synthesis of 3, 6-bis [2- (methylthio) ethyl] -2,5-piperazinedione (III) (methioninediketopiperazine, DKP) from 3- (methylthio) propanaldehyde (3- (methylmercapto) propionaldehyde, MMP) ( Hg) according to method D
  • a DD / LL / DL / LD-methionylmethionine (I) precipitates as a 50:50 mixture of the two pairs of diastereomers (DL / LD-Met-Met) (DL / DL-I) or (DD / LL-Met-Met ) (DD / LL-I) as a thick crystal pulp. Finally, it was dried in a drying oven at 60 ° C. in vacuo. Yield: 601.0 g (2.14 mol) (85.7%) DD / LL / DL / LD-methionylmethionine (I), slightly yellowish solid, purity 98% (HPLC).
  • the DD / LL / DL / LD-methionylmethionine (I) was subsequently precipitated at pH 6.
  • the sparingly soluble racemic pair of diastereomers DL / LD-methionylmethionine (DL / LD-I) preferably precipitates. This was centrifuged and the mother liquor concentrated together with washing water in the steam-jet vacuum at 40 0 C internal temperature to one fourth of the original volume.
  • Methionylmethionine (I) can be obtained as a mixture of diastereomers. Purity> 98% (HPLC).
  • the mixture was transferred to a 2 1 steel autoclave, heated to 160 0 C and stirred for 6 hours at this temperature. Thereafter, the autoclave was cooled in an ice bath, the resulting suspension was filtered off and the precipitated 3, 6-bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (I-II) (Methionindiketopiperazin, DKP) washed with a little water , The wash water and the mother liquor were combined, concentrated on a rotary evaporator at 40 0 C to a volume of 800 ml. A moderate CO 2 stream was subsequently introduced into the resulting solution until a pH of 6.0 was reached and a white solid precipitated.
  • the colorless mother liquor from a) was concentrated on a rotary evaporator at 35 ° C and water pump vacuum. A white suspension was obtained.
  • the white solid of ammonium sulfate, residues on DL / LD-I and target compound became then filtered off with suction and dried in vacuo at 50 0 C.
  • the mixture was suspended in DI water and stirred.
  • the undissolved DL / LD-I was aspirated and the mother liquor on a rotary evaporator at 50 0 C and water pump vacuum concentrated to about one-fifth.
  • DD / LL-methionylmethionine (DD / LL-I) crystallized out as a white solid.
  • the isolation of the digestive enzymes was carried out in accordance with the method of EID and MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111-119).
  • the intestine was exposed by five year old mirror carp (Cyprinus carpio morpha noblis), rinsed with water, cut longitudinally and each scraped off the intestinal mucosa. This was crushed together with crushed ice with a blender.
  • the resulting suspension was treated with an ultrasonic rod to disrupt still intact cells.
  • the suspension was for 30 minutes at 4 0 C centrifuged, decanted the homogenate and sterilized with a trace of thimerosal. From 5 mirror carp 260.7 ml of enzyme solution of the intestinal mucosa were obtained, the solution was stored at 4 0 C dark.
  • DL-methionyl-DL-methionine (I) or the corresponding diastereomeric pairs DD / LL-I and DL / LD-I were taken up in TRIS / HC1 buffer solution and mixed with the enzyme solution.
  • a blank value without enzyme solution was used. From time to time, a sample was taken and its composition was detected and quantified using a calibrated HPLC. The conversion was determined as the quotient of the area of methionine and the area of methionylmethionine (I) (see FIGS. 6 and 7).
  • the isolation of the digestive enzymes was carried out in accordance with the method of Ezquerra and Garcia-Carreno (J. Food Biochem., 1999, 23, 59-74).
  • the hepato- pancreas was from five kilograms Whiteleg shrimp (Whiteleg shrimp) away and crushed together with crushed ice with ei ⁇ nem mixer.
  • the further work-up was carried out analogously to Example 22.
  • the isolation of the digestive enzymes was carried out in accordance with the method of EID and MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111-119). For this purpose, the intestine of five year old mirror carp (Cyprinus carpio morpha noblis) was exposed and worked up as described in Example 22. To isolate liver enzymes, the livers were isolated, homogenized and treated analogously to the processing of the intestinal enzymes in Example 22. Analogously, the enzyme isolation from the pancreas was also used.
  • D-methionine was taken up in buffer solution and mixed with the enzyme solution. As a comparison and to estimate the purely chemical conversion rate, a blank value without enzyme solution was used in each case. After 24 hours, a sample was taken and the composition was detected and quantified using a calibrated HPLC. The conversion was determined as the quotient of the area of L-methionine and the area of D-methionine (see FIG. 4).
  • Citrate buffer pH 5, pH 6 and pH 7
  • Feed mixture As a feed matrix, a methionine-deficient feed mixture of common ingredients such as soybean meal, soybean oil, corn starch, wheat flour, fish meal, cellulose, crystalline essential amino acids and minerals and vitamins was used as premixes. This mixture was then supplemented batchwise in 20 kg batches each with the methionine derivatives listed in Table 5 at 0.25% supplementation rate (based on sulfur equivalents), homogenized and then pelletized under steam treatment. As a comparison to methionylmethionine (I), a pelletization experiment each with DL-methionine, MHA (methionine hydroxy analogues) and calcium MHA was made. In addition, as a control experiment, pelleting was carried out without addition of a methineine derivative (see Table 5).
  • the amino acid determination was carried out in accordance with EU method 98/64 / EC. After extraction of the free amino acids and methionylmethionine (I), these were subsequently determined by means of an amino acid analyzer by post-column derivatization with ninhydrin (see Table 6). Subsequently, the leaching behavior of the diastereomers of methionylmethionine (I) from the feed pellets under water was investigated. The dissolution of methionylmethionine under water was determined as a function of time, temperature, water composition (salt or fresh water).

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von DL-Methionyl-DL-methionin und dessen Salze als Futtermitteladditiv in Futtermittelmischungen für in Aquakulturen gehaltene Tiere, sowie ein Verfahren zur Herstellung von DL-Methionyl-DL-methionin (I) mit der Formel (I) unter Umsetzung eines Harnstoffderivates der allgemeinen Formel (I)I, wobei die Reste R1 und R2 in den Harnstoffderivaten IIa, IIb, IIc, IId, IIe, IIf und IIg wie folgt definiert sind: wobei IIa: R1 = COOH, R2 = NHCONH2 IIb: R1 = CONH2, R2 = NHCONH2 IIc: R1 = CONH2, R2 = NH2 IId: R1-R2 = -CONHCONH- IIe: R1 = CN, R2 = OH IIf: R1 = CN, R2 = NH2 IIg: R1= =O, R2 = H bedeutet, zu DL-Methionyl-DL-methionin.

Description

Herstellung und Verwendung von Methionylmethionin als Futtermitteladditiv für Fische und Krustentiere
Einleitung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue chemische Synthesen von Methionylmethionin, das Dipeptid von Methionin, und dessen spezielle Verwendung als Futtermitteladditiv allein oder in Mischung mit Methionin für die Ernährung von Fischen und Krustentieren.
Stand der Technik
Essentielle Aminosäuren (EAA) wie Methionin, Lysin oder Threonin sind als Futtermitteladditive sehr wichtige Bestandteile der Tierernährung und spielen bei der wirt- schaftlichen Aufzucht von Nutztieren wie z.B. Hühner, Schweinen und Wiederkäuern eine bedeutende Rolle. Die Supplementierung von natürlichen Eiweißquellen wie z.B. Soja, Mais und Weizen mit EAAs ermöglicht zum einen ein schnelleres Wachstum der Tiere bzw. eine höhere Milchpro- duktion bei Hochleistungsmilchkühen, zum anderen aber auch die effizientere Verwertung des Futters. Dies stellt einen sehr großen wirtschaftlichen Vorteil dar. Die Märkte für Futtermitteladditive sind von großer industrieller und wirtschaftlicher Bedeutung. Zudem sind sie starke Wachs- tumsmärkte, was nicht zuletzt auf die steigende Bedeutung von Ländern wie beispielsweise China und Indien zurückzuführen ist.
L-Methionin ( (5) -2-Amino-4-methylthiobuttersäure) stellt für viele Tierarten wie Hühner, Enten, Puten und auch für viele Fisch- und Schalentierarten die erste limitierende Aminosäure dar und spielt daher in der Tierernährung und als Futtermitteladditiv eine sehr bedeutende Rolle (Rosen- berg et al . , J. Agr . Food Chem. 1957, 5, 694-700 und Lovell, T. R., J. Anim. Sei. 1991, 69, 4193-4200) . Bei der klassischen chemischen Synthese fällt Methionin jedoch als Racemat, eine 50 : 50-Mischung aus D- und L-Methionin, an. Dieses racemische DL-Methionin kann jedoch direkt als Futtermitteladditiv eingesetzt werden, da bei einigen Tierarten unter in vivo-Bedingungen ein Umwandlungsmechanismus besteht, der das unnatürliche D-Enantiomer von Methionin in das natürliche L-Enantiomer überführt. Dabei wird das D- Methionin zuerst mit Hilfe einer unspezifischen D-Oxidase zu α-Keto-Methionin desaminiert und anschließend mit einer L-Transaminase zu L-Methionin weiter umgewandelt (Baker, D.H. in „Amino aeids in farm animal nutrition", D'Mello, J. P. F. (ed.), Wallingford (UK), CAB International, 1994, 37-61) . Dadurch wird die verfügbare Menge an L-Methionin im Organismus erhöht, die dann dem Tier zum Wachstum zur Verfügung stehen kann. Die enzymatische Umwandlung von D- zu L-Methionin wurde bei Hühnern, Schweinen und Kühen, insbesondere aber auch bei carni- und Omnivoren Fischen und auch bei Shrimps und Prawns festgestellt. So konnte beispielsweise Sveier et al . (Aquacult. Nutr. 2001, 7 (3), 169-181) und Kim et al . (Aquaculture 1992, 101 (1-2), 95-103) zeigen, dass die Umwandlung von D- in L-Methionin bei karnivo- ren atlantischen Lachsen und Regenbogenforellen möglich ist. Gleiches konnten Robinson et al . (J. Nutr. 1978, 108
(12), 1932-1936) und Schwarz et al . (Aquaculture 1998, 161, 121-129) für omnivore Fischarten wie zum Beispiel Catfish und Karpfen zeigen. Darüber hinaus konnten Forster und Do- miny (J. World Aquacult. Soc. 2006, 37 (4), 474-480) in Fütterungsversuchen von Omnivoren Shrimps der Art Litope- naeus vannamei zeigen, dass DL-Methionin die gleiche Wirksamkeit wie L-Methionin besitzt.
2007 wurden weltweit über 700.000 t kristallines DL- Methionin bzw. racemisches, flüssiges Methionin-Hydroxy- Analog (MHA, rac-2-Hydroxy-4- (methylthio) butansäure (HMB)) und festes Calcium-MHA produziert und erfolgreich bei mono- gastrischen Tieren wie z.B. Geflügel und Schweinen direkt als Futtermitteladditiv eingesetzt. Durch die rasante wirtschaftliche Entwicklung der Fisch- und Krustentierzucht in hoch industrialisierten Aquakulturen gewinnt eine optimale, wirtschaftliche und effiziente Supplementierungsmöglichkeit von Methionin gerade in diesem Bereich in den letzten Jahren eine immer bedeutendere Rolle (Food and Agriculture Or- ganization of the United Nation (FAO) Fisheries Department „State of World Aquaculture 2006", 2006, Rome . Interna- tional Food Policy Research Institute (IFPRI) „Fish 2020: Supply and Demand in Changing Markets", 2003, Washington, D. C.) . Dabei kann es im Gegensatz zu Hühnern und Schweinen bei der Verwendung von Methionin, MHA oder Ca-MHA als Futtermitteladditiv jedoch bei bestimmten Fisch- und Krusten- tiersorten zu unterschiedlichen Problemen kommen. So berichten Rumsey und Ketola (J. Fish. Res. Bd. Can. 1975, 32, 422-426), dass die Verwendung von Sojamehl in Verbindung mit einzeln supplementierten, kristallinen Aminosäuren zu keiner Wachstumssteigung bei Regenbogenforellen führte. Mu- rai et al . (Bull. Japan. Soc. Sei. Fish. 1984, 50 (11),
1957) konnte zeigen, dass die tägliche Fütterung von Fischdiäten mit hohen Raten an supplementierten kristallinen A- minosäuren bei Karpfen dazu führten, dass über 40% der freien Aminosäuren über die Kiemen und Nieren ausgeschieden werden. Aufgrund der schnellen Resorption von supplementierten Aminosäuren kurz nach der Futteraufnahme, kommt es zu einem sehr schnellen Anstieg der Aminosäurenkonzentration im Blutplasma des Fisches (Fast-Response) . Zu dieser Zeit befinden sich aber die anderen Aminosäuren aus den na- türlichen Proteinquellen wie z.B. Sojamehl noch nicht im
Plasma, was zur Asynchronität der gleichzeitigen Verfügbarkeit aller wichtigen Aminosäuren führen kann. Ein Teil der hochkonzentrierten Aminosäuren wird in Folge dessen schnell ausgeschieden bzw. im Organismus schnell metabolisiert und z.B. als reine Energiequelle genutzt. Dadurch kommt es beim Karpfen nur zu einer geringen bzw. keiner Wachstumssteigerung bei der Verwendung von kristallinen Aminosäuren als Futtermitteladditive (Aoe et al . , Bull. Jap. Soc. Sei. Fish. 1970, 36, 407-413) . Bei Krustentieren kann die Supplementierung von kristallinen Aminosäuren noch zu weiteren Problemen führen. Durch das langsame Fressverhalten von bestimmten Krustentieren wie z.B. Shrimps der Art Lito- penaeus Vannamei kommt es, aufgrund der langen Verweilzeit des Futters unter Wasser, zum Herauslösen der supplemen- tierten, wasserlöslichen Aminosäuren (Leaching) , was zur Eutrophierung des Gewässers und nicht zu einer Wachstums- Steigerung der Tiere führt (Alam et al . , Aquaculture 2005, 248, 13-16) .
Die effektive Versorgung von Fischen und Krustentieren, die in Aquakulturen gehalten werden, erfordert somit für bestimmte Arten und Anwendungen eine spezielle Produktform von Methionin wie z.B. ein entsprechend chemisch oder physikalisch geschütztes Methionin. Dabei ist das Ziel zum einen, dass das Produkt während der Fütterung in der wässri- gen Umgebung hinreichend stabil bleibt und nicht aus dem Futter herausgelöst wird. Zum anderen, dass das schließlich vom Tier aufgenommene Methioninprodukt im tierischen Organismus optimal und mit hoher Effizienz verwertet werden kann .
In der Vergangenheit wurden viele Anstrengungen unternommen, um geeignete Futtermitteladditive, im Besonderen auf Methioninbasis, für Fische und Krustentiere zu entwickeln. So wird beispielsweise in WO8906497 die Verwendung von Di- und Tripeptiden als Futtermitteladditiv für Fisch- und Krustentieren beschrieben. Dadurch soll das das Wachstum der Tiere gefördert werden. Dabei kamen aber bevorzugt Di- und Tripeptide aus nicht essentiellen und daher auch nicht limitierenden Aminosäuren wie z.B. Glycin, Alanin und Serin zum Einsatz. Als Methionin haltige Dipeptide wurde nur DL- Alanyl-DL-Methionin und DL-Methionyl-DL-Glycin beschrieben. Dadurch sind im Dipeptid aber nur effektiv 50% Wirkstoff (mol/mol) enthalten, was unter wirtschaftlichen Gesichts- punkten als sehr nachteilig einzustufen ist. In WO02088667 wird die enantioselektive Synthese und Anwendung von Oligo- meren aus MHA und Aminosäuren wie z.B. Methionin als Futtermitteladditive, unter anderem auch für Fische und Krus- tentiere, beschrieben. Dadurch soll ein schnelleres Wachstum erzielt werden können. Die beschriebenen Oligomere werden durch eine enzymkatalysierte Reaktion aufgebaut und weisen eine sehr breite Verteilung der Kettenlänge der einzelnen Oligomere auf. Dadurch wird das Verfahren unselek- tiv, teuer und aufwendig in der Durchführung und Aufreinigung. Dabrowski et al . beschreibt in US20030099689 die Verwendung von synthetischen Peptiden als Futtermitteladditive zur Wachstumsförderung für aquatische Tiere. Dabei können die Peptide einen Gewichtsanteil von 6-50% der gesamten Futterformulierung ausmachen. Die synthetischen Peptide bestehen bevorzugt aus essentiellen und limitierenden Aminosäuren. Die Synthese solcher synthetischer Oligo- und Polypeptide ist jedoch sehr aufwendig, teuer und großtechnisch schwer umsetzbar. Zudem ist die Wirksamkeit von Polypepti- den einer einzelnen Aminosäure umstritten, da diese oft nur sehr langsam oder gar nicht unter physiologischen Bedingungen zu freien Aminosäuren umgesetzt werden. So beschreibt beispielsweise Baker et al . (J. Nutr. 1982, 112, 1130- 1132), dass Poly-L-Methionin aufgrund der absoluten Unlös- lichkeit in Wasser keine Biowertigkeit bei Hühnern aufweist, da eine Resorption vom Organismus nicht möglich ist.
Neben dem Einsatz neuer chemischer Methioninderivate wie z.B. methioninhaltige Peptide und Oligomere wurden auch verschiedene physikalische Schutzmöglichkeiten wie z.B Coa- tings bzw. die Einbettung einer Aminosäure in einer Schutzmatrix untersucht. So konnten beispielsweise Alam et al . (Aquacult. Nutr. 2004, 10, 309-316 und Aquaculture 2005, 248, 13-19) zeigen, dass gecoatetes Methionin und Lysin im Gegensatz zu nicht gecoatetem einen sehr positiven Einfluss auf das Wachstum von jungen Kuruma Shrimps besitzt. Obwohl die Verwendung eines speziellen Coatings das Leaching von Methionin und Lysin aus dem Futterpellet unterdrücken konnte, gibt es einige gravierende Nachteile. Die Herstellung bzw. die Beschichtung von Methionin stellt meist ein technisch kompliziertes und aufwendiges Verfahren dar und ist daher teuer. Zudem kann die oberflächliche Beschichtung des fertig gecoateten Methionins leicht durch mechanische Belastung und Abrieb während der Futterverarbeitung beschädigt werden, was zur Verminderung bzw. bis zum vollständigen Verlust des physikalischen Schutzes führen kann. Hinzu- kommt, dass durch ein Coating oder Verwendung einer Matrixsubstanz der Gehalt an Methionin verringert und damit oft unwirtschaftlich wird.
Neben der erfinderischen neuen Anwendung von DL-Methionyl- DL-methionin als Futtermitteladditiv mit geringem Leaching- verhalten aus Futterpellets und -extrudaten, sowie einer optimalen Methioninversorgung im Organismus durch „Slow Release" Spaltung von Methionylmethionin, konnten auch neue Verfahren zur Darstellung von Methionylmethionin entwickelt werden, die viele Vorteile gegenüber der in der Literatur beschriebenen Darstellungsvarianten besitzen. Die meisten literaturbekannten Synthesen von Dipeptiden verwenden teure Schutzgruppen wie z.B. Boc- ( tert-Butoxycarbonyl-) oder Z- (Benzyloxycarbonyl-) Schutzgruppen, die vor der eigentlichen Dipeptidsynthese an die entsprechende Aminosäure ange- bracht und später wieder abgespalten werden müssen. Zudem ist meist eine Aktivierung der zu koppelnden Aminosäuren nötig. So lässt sich Methionylmethionin durch Kopplung von N-Boc-Methionin mit dem Methylester von Methionin mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) darstellen. Die großen Nachteile dieses Darstellungsverfahren sind die Verwendung von teuren Schutzgruppen, großer Syntheseaufwand und nicht recyclierbare und teure Kopplungsreagentien wie z.B. DCC. Eine andere Alternative zur technischen Synthese von Methionylmethionin wird in DE2261926 beschrieben. Durch Erhitzen des Isopropylesters von Methionin wird in der ersten Stufe das 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (Methio- nindiketopiperazin, DKP) gebildet, welches anschließend zu Methionylmethionin verseift werden kann. Dabei konnten für den Verseifungsschritt lediglich befriedigende Ausbeuten von 62-65% erzielt werden. Zudem ist die Verwendung von Methioninisopropylester als Ausgangsmaterial zu teuer und daher unwirtschaftlich.
Aufgabe der Erfindung
Eine generelle Aufgabe war es, ein Futtermittel bzw. einen Futtermittelzusatzstoff für die Tierernährung auf Basis eines neuen Methioninersatzstoffes bereitzustellen, der alleine oder als Mischung mit Methionin besonders im Bereich der industriellen Fisch- und Krustentierzucht in Aquakultu- ren eingesetzt werden kann. Gleichzeitig sollte eine einfa- che und kostengünstige chemische Synthese dieses neuen Methioninersatzstoffes entwickelt werden.
Vor dem Hintergrund der Nachteile des Standes der Technik war es vor allem die Aufgabe, ein chemisch geschütztes Methioninprodukt für verschiedene omni-, herbi- und karni- vore Fisch- und Krustentierarten, die in Salz- oder Süßwasser leben, bereitzustellen. Insbesondere sollte dieses Produkt ein geringes Löslichkeitsverhalten (Leaching) aus dem Gesamtfutterpellet bzw. -extrudat im Wasser aufweisen und einen „Slow Release"-Mechanismus, also eine langsame und kontinuierliche Freisetzung von freiem Methionin unter physiologischen Bedingungen besitzen. Außerdem sollte das neue Methioninprodukt auch als Mischung mit DL-Methionin vorteilhaft eingesetzt werden können.
Eine weitere Aufgabe war es, ein Methioninersatzstoff als Futtermittel bzw. einen Futtermittelzusatzstoff mit sehr hoher Biowertigkeit aufzufinden, der gute Handhabbarkeit und Lagerfähigkeit sowie Stabilität unter den üblichen Be- dingungen der Mischfutterverarbeitung, insbesondere der Pelletierung und Extrusion aufweisen sollte.
Auf diese Weise sollte den Fischen und Krustentieren neben kristallinem DL-Methionin eine weitere effiziente Methio- ninquelle zur Verfügung gestellt werden, welche möglichst die Nachteile der bekannten Produkte nicht oder nur in verringertem Umfang aufweist.
Des Weiteren sollte eine neue, flexible Syntheseroute für Methionylmethionin (DL-Methionyl-DL-methionin) entwickelt werden, bei der typische Vor- und Nebenprodukten aus dem technischen DL-Methionin Produktionsprozess als Startmaterial verwendet werden können. Außerdem sollte ein geeignetes Verfahren zur Trennung der Diastereomerenpaare DD/LL- und DL/LD-Methionylmethionin entwickelt werden, damit für spezielle Anwendungen auch ein optimaler und effektiver Einsatz von nur einem Diastereomerenpaar (DD/LL-I oder DL/LD-I) möglich ist.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von DL- Methionyl-DL-methionin und dessen Salze als Futtermitteladditiv in Futtermittelmischungen für in Aquakulturen gehaltene Tiere.
In bevorzugter Weise enthält die Futtermittelmischung 0,01 bis 5 Gew.-%, bevorzugt 0,05 bis 0,5 Gew.-% DL-Methionyl- DL-methionin enthält.
Die Verwendung von DL-Methionyl-DL-methionin hat sich hierbei als besonders vorteilhaft erwiesen, weil die Verbindung ein hervorragendes Leaching-Verhalten aufgrund der niedri- gen Löslichkeit der Mischung aus DD/LL/DL/LD-
Methionylmethionin bzw. des Diastereomerenpaars DL/LD- Methionylmethionin (0,4 g/l) aufweist. Weiterhin zeigt die Verbindung eine gute Pelletier- und Extrusionsstabilität bei der Futtermittelherstellung. DL- Methionyl-DL-methionin ist stabil in Mischungen mit üblichen Komponenten und Futtermitteln wie z.B. Getreide (z.B. Mais, Weizen, Tritikale, Gerste, Hirse, u.a.), pflanzliche oder tierische Eiweißträger (z.B. Sojabohnen und Raps und deren Weiterverarbeitungsprodukte, Leguminosen (z.B. Erbsen, Bohnen, Lupinen, etc.), Fischmehl, u . a . ) und in Kombination mit supplementierten essentiellen Aminosäuren, Pro- teinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Vitaminen, Mineralien, Fetten und Ölen.
Weiterhin ist von Vorteil, dass durch den hohen Wirkstoffanteil von Methionylmethionin pro kg Substanz, im Vergleich zu DL-Methionin pro Mol Methionylmethionin ein Mol Wasser eingespart wird.
In einer bevorzugten Verwendung enthält die Futtermittelmischung Proteine und Kohlehydrate, vorzugsweise auf Basis von Fisch-, Soja- oder Maismehl, und können mit essentiellen Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Vitaminen, Minera- lien, Kohlenhydraten, Fetten und Ölen supplementiert sein.
Insbesondere ist bevorzugt, dass in der Futtermittelmischung DL-Methionyl-DL-methionin allein als DD/LL/LD/DL- Mischung, als DL/LD- oder DD/LL-Mischung vorliegt, bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit DL-Methionin, vor- zugsweise mit einem DL-Methioninanteil von 0,01 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt von 1 bis 10 Gew.-%.
In einer besonders bevorzugten Verwendung liegt DL- Methionyl-DL-methionin als Enantiomerenpaar DL/LD- Methionylmethionin vor.
In einer bevorzugten Verwendung sind die in Aquakulturen gehaltene Tiere Süß- und Salzwasserfische und -krustentiere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Karpfen, Forellen, Lachse, Welse, Barsche, Plattfische, Störe, Thunfische, Aa- Ie, Brassen, Dorsche, Shrimps, Krill und Prawns, ganz besonders für Silver- (Hypophthalmichthys molitrix) , Gras- (Ctenopharyngodon idella) , Schuppen- (Cyprinus carpio) und Bigheadkarpfen (Aristichthys nobilis) , Karausche (Carassius carassius) , Catla (Catla Catla) , Roho Labeo (Labeo rohita) , pazifischer und atlantischer Lachs (Salmon salar und On- corhynchus kisutch) , Regenbogenforelle (Oncorhynchus my- kiss) , amerikanischer Wels (Ictalurus punctatus) , afrikanischer Wels {Ciarias gariepinus) , Pangasius (Pangasius bo- courti und Pangasius hypothalamus) , Niltilapie (Oreochromis niloticus) , Milchfisch (Chanos chanos) , Cobia (Rachycentron canadum) , Whiteleg Shrimp (Litopenaeus vannamei) , Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon) und Giant River Prawn (Mac- robrachium rosenbergii) . Gemäß der Erfindung wird DL-Methionyl-DL-methionin (I) (kurz Methionylmethionin oder Met-Met) oder dessen Alkali- und Erdalkalisalze wie z.B. das schwerlösliche Calcium- oder Zinksalz als Zusatz in Futtermittelgemischen als DD/LL/DL/LD-, DD/LL- oder DL/LD-Diastereomerengemisch, al- leine oder in Mischung mit DL-Methionin, vorzugsweise für Fische und Krustentiere, verwendet:
Figure imgf000012_0001
(I)
Vom Dipeptid DL-Methionyl-DL-methionin (I) existieren vier verschiedene Stereoisomere (Diastereomere) DD-, LL, DL- und LD-I, wovon nur das L-Methionyl-L-methionin (LL-I) natürlich ist, die drei anderen Dipeptide L-Methionyl-D- methionion (LD-I) , D-Methionyl-L-methionin (DL-I) und D-
Methionyl-D-methionin (DD-I) alle nichtnatürlich sind (siehe Schema 1) .
Figure imgf000013_0001
Schema 1
Dabei verhalten sich DD-I und LL-I untereinander wie Bild und Spiegelbild, d.h. es sind Enantiomere und besitzen damit auch die gleichen physikalischen Eigenschaften. Gleiches gilt für das Paar DL-I und LD-I.
Die beiden Paare DD/LL-I und DL/LD-I sind dagegen diastere- omer zueinander, d.h. sind haben unterschiedliche physikalische Daten. So besitzt beispielsweise das Diastereomeren- paar DD/LL-I bei Raumtemperatur eine Löslichkeit von 21,0 g/l in Wasser, wohingegen die Löslichkeit vom Diastereome- renpaar DL/LD-I bei 0,4 g/l liegt.
Neben der Entwicklung neuer Synthesenmethoden für Methio- nylmethionin ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von DL-Methionyl-DL-methionin als Futtermittel als DD/LL/DL/LD-, DD/LL- oder DL/LD- Diastereomerengemisch als Wachstumspromotor für omni-, car- ni- und herbivore Fische und Krustentiere in Aquakulturen . So konnte erfinderisch gezeigt werden, dass DL-Methionyl- DL-methionin (I) unter physiologischen Bedingungen enzyma- tisch von Fischen und Krustentieren zu freiem D- bzw. L- Methionin gespalten werden kann (Schema 2) (siehe auch Beispiele 22 bis 24) . Dazu wurden die entsprechenden Verdauungsenzyme aus Karpfen (omnivor) , Forelle (karnivor) und Whiteleg Shrimp (omnivor) isoliert und in optimierten in vitro Versuchen unter physiologisch vergleichbaren Bedingungen mit DL-Methionyl-DL-methionin umgesetzt. Die erfindungsgemäße Besonderheit der Spaltung von DL-Methionyl-DL- methionin (I) liegt darin, dass alle vier möglichen Diaste- reomere, sowohl das natürliche LL-I, als auch die drei unnatürlichen Diastereomere DD-, DL- und LD-I unter physiologischen Bedingungen gespalten werden können. Dies gilt sowohl für die Verwendung der Gesamtmischung aller Diastereomere (DD/LL/DL/LD-I) , als auch jeweils für die beiden Di- astereomerenpaare DD/LL-I bzw. DL/LD-I (siehe Figur 1) .
Figure imgf000014_0001
D-Methionin
Trans- aminierung
NH2
^CO2H
L-Methionin
Schema 2 Die Spaltung der einzelnen Diastereomere von Methionyl- methionin geschieht jedoch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Dies verdeutlicht die schematische Darstellung der enzymatischen Spaltung der einzelnen Diastereomere von Methionylmethionin mit Verdauungsenzymen von Fischen und Krustentieren in Figur 2. Durch die verzögerte Spaltung wird damit aber auch die Freisetzung von D- und L-Methionin ebenfalls verzögert (siehe Figur 3) . Dies hat den großen Vorteil, dass es zu keiner „Fast-Response"-Resorption von freiem D- bzw. L-Methionin im Verdauungstrakt und damit auch nicht zu einer Konzentrationsspitze von freiem Methio- nin im Blutplasma kommen kann.
Der Vorteil bei der Verwendung von Methionylmethionin als Futtermitteladditiv und Methioninquelle ist damit, dass D- bzw. L-Methionin über die gesamte Verdauungszeit im Organismus freigesetzt werden kann und damit synchron mit der Freisetzung anderer, aus natürlichen Proteinquellen stammender Aminosäuren verläuft (,,Slow-Release"-Mechanismus) (siehe Figur 3) . Dieser besondere Effekt hat zur Folge, dass die gleichzeitige Verfügbarkeit aller wichtigen und essentiellen Aminosäuren in einem idealen Verhältnis im Blutplasma sichergestellt ist, was für ein optimales Wachstum des Organismus absolut nötig ist.
Bei der enzymatischen Dipeptidspaltung von DL-Methionyl-DL- methionin (I) wird neben dem natürlichen L-Methionin auch das unnatürliche D-Methionin freigesetzt (siehe Schema 2) . Dieses kann sowohl von karni-, omni- und herbivoren Salzbzw. Süßwasserfischen und -krustentieren enzymatisch zum natürlichen L-Methionin transaminiert werden. Dies konnte in Beispiel 25 am Beispiel von Karpfen gezeigt werden. Mit Hilfe eines Enzymcocktail aus Verdauungs- und Leberenzymen aus Karpfen konnte D- in L-Methionin unter physiologisch entsprechenden Bedingungen umgewandelt werden (siehe Figur 4) . Damit ist eine optimale Versorgung des Organismus von natürlichem L-Methionin bei der Verwendung von DL- Methionyl-DL-methionin (I) gewährleistet.
Die Pelletier- und Extrusionsversuche mit verschiedenen Mischungen aus DL-Methionyl-DL-methionin (I) und natürlichen Protein- und Kohlehydratquellen wie beispielsweise Fisch-, Mais- und Sojamehl sowie in Mischungen mit anderen essentiellen Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Vitaminen, Mineralien, Fetten und Ölen zeigen, dass DL-Methionyl-DL- methionin (I) während und nach dem Produktionsprozess abso- lut stabil ist und es zu keinerlei Abbau oder Zersetzung kommt (siehe Beispiel 26) .
Um das Leachingverhalten der Diastereomere von Methionyl- methionin (I) aus Mischfutterpellets unter Wasser zu untersuchen, wurde die zeitliche Abhängigkeit des Herauslösens von Methionylmethionin gemessen (siehe Beispiel 26) . Als
Vergleich wurde das Leachingverhalten von DL-Methionin, MHA und Calcium-MHA (MHA-Ca) unter den identischen Bedingungen untersucht. Dabei zeigte sich, dass sowohl die Gesamtmischung aller Diastereomere (DD/LL/DL/LD-I) , als auch die Diastereomerenpaare DD/LL-I und DL/LD-I ein deutlich niedrigeres Leaching zeigen als DL-Methionin, MHA und Calcium- MHA (MHA-Ca) (siehe Figur 5) . Damit wird über die Zeit viel weniger Methionylmethionin aus den Futterpellets gelöst als bei allen anderen Methioninderivaten . Besonders niedrige Leachingraten zeigt das Diastereomerenpaar DL/LD-I, welches auch nach über 200 Min. Verweilzeit nur zu maximal 5% aus den Futterpellets herausgelöst wurde (siehe Figur 5) . Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von DL-Methionyl-DL-methionin (I) mit der Formel
Figure imgf000017_0001
(D unter Umsetzung eines Harnstoffderivates der allgemeinen Formel II,
Figure imgf000017_0002
(II) wobei die Reste R1 und R2 in den Harnstoff derivaten IIa, IIb, Hc, Hd, He, Hf und Hg wie folgt definiert sind:
wobei IIa: R1 = COOH, R2 = NHCONH2
Hb: R1 = CONH2, R2 = NHCONH2
Hc: R1 = CONH2, R2 = NH2
Hd: R1^-R2 = -CONHCONH-
He: R1 = CN, R2 = OH
Hf: R1 = CN, R2 = NH2
Hg: R1 = =0, R2 = H
bedeutet,
zu DL-Methionyl-DL-methionin (I) . In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dabei bevorzugt, dass Methioninhydantoin (Hd) als Ausgangsprodukt verwendet wird oder als Zwischenprodukt intermediär gebildet wird. Bei diesem Verfahren wird DL- Methionyl-DL-methionin direkt aus Methioninhydantoin synthetisiert und umfasst die in Schema 3 aufgezeigten Methoden G, H, und J.
Methode A
Figure imgf000018_0001
für Hc, He und Hf DD /LL / DL / LD- ( I )
Methode J für Hg
Methode K
DD/LL-I DL/LD-I
Schema 3 Bevorzugt, wird dabei eine Methioninhydantoin und Wasser enthaltende Lösung mit Methionin unter basischen Bedingungen umgesetzt wird. Weiterhin ist bevorzugt, dass der pH- Wert der das Harnstoffderivat enthaltenden Lösung auf 8 bis 14, bevorzugt auf 10 bis 13 eingestellt wird.
In bevorzugter Weise erfolgt die Umsetzung bei einer Temperatur von 50 bis 2000C, bevorzugt bei einer Temperatur von 80 bis 1700C und besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 130 bis 160 °C. Weiterhin ist bevorzugt, dass die Umsetzung unter Druck, bevorzugt bei einem Druck von 3 bis 20 bar, besonders bevorzugt bei einem Druck von 6 bis 15 bar durchgeführt wird.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren ist eine Methioninhydantoin und Wasser enthaltende Lösung zuvor aus einer o- der mehrerer der Verbindungen IIa, IIb, Hc, Hd, He, Hf und Hg gebildet worden.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren wird Methioninhydantoin durch Umsetzung der Verbindung He oder Hf mit einer Stickstoff haltigen Base, NH4HCO3, (NH4) 2CO3, NH4OH/CO2- Mischung oder Carbamatsalzen erhalten.
Die Umsetzung der Verbindung He wird bevorzugt bei einer Temperatur von 00C bis 1500C, vorzugsweise 00C bis 1000C und besonders bevorzugt von 100C bis 700C durchgeführt.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren wird das Methionin- hydantoin durch Umsetzung der Verbindung Hf mit CO2 erhalten. Dabei ist bevorzugt, dass die Umsetzung in Anwesenheit einer Base erfolgt, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe enthaltend KHCO3, K2CO3, tertiäre Amine oder deren Salze, Alkali- und Erdalkalibasen.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren wird Methioninhydantoin durch Umsetzung der Verbindung Hg mit einer Cyani- dionenquelle und einer Base erhalten ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Stickstoff haltige Basen, Ammoniumsalze in Gegenwart von CO2, NH4HCO3, (NH4) 2CO3, NH4OH/CO2-Mischung und Carbamatsalze . Die Umsetzung erfolgt dabei bei einer Temperatur von vorzugsweise -200C bis 1500C, bevorzugt -10°C bis 100°C und besonders bevorzugt von 0°C bis 700C.
Eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Schritte: a) Umsetzung des Harnstoffderivates gemäß den Formeln IIa, IIb, Hc, Hd, He, Hf und Hg zu einem Diketopiperazin der Formel
Figure imgf000020_0001
(III)
b) Umsetzung des Diketopiperazins zum DL-Methionyl-DL- methionin. Dieses Verfahren umfasst die in Schema 3 aufgezeigten Methoden A, B, C und D. Bei diesen Verfahren wird Diketopiperazin (III) als Zwischenprodukt gebildet.
Dabei ist bevorzugt, dass die Umsetzung des Harnstoffderivates zum Diketopiperazin bei einer Temperatur von 500C bis 2000C, vorzugsweise von 1000C bis 1800C und besonders bevorzugt von 140°C bis 1700C durchgeführt wird.
In einem bevorzugten Verfahren erfolgt die Umsetzung des Harnstoffderivates zum Diketopiperazin unter Druck, bevorzugt bei einem Druck von 3 bis 20 bar, besonders bevorzugt bei einem Druck von 6 bis 15 bar.
Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung des Harnstoffderivates zum Diketopiperazin in Gegenwart einer Base. Dabei ist die Base vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff haltiger Basen, NH4HCO3, (NH4) 2CO3, KHCO3, K2CO3, NH4OH/CO2- Mischung, Carbamatsalze, Alkali- und Erdalkalibasen.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren erfolgt die Umset- zung des Harnstoffderivates zum Diketopiperazin durch Reaktion mit Methionin. Dabei ist ein Verhältnis von Harnstoffderivat zu Methionin von 1:100 bis 1:0,5 bevorzugt.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren erfolgt die Umsetzung des Diketopiperazin zum DL-Methionyl-DL-methionin durch saure Hydrolyse. Die saure Hydrolyse wird dabei in
Gegenwart einer Säure durchgeführt, die vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe der Mineralsäuren, HCl, H2CO3, CO2/H2O, H2SO4, Phosphorsäuren, Carbonsäuren und Hydroxycar- bonsäuren .
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Umsetzung des Diketopiperazin zum DL- Methionyl-DL-methionin durch basische Hydrolyse. Hierbei wird die basische Hydrolyse bevorzugt bei einem pH von 7 bis 14, besonders bevorzugt bei einem pH von 9 bis 12, ganz besonders bevorzugt bei einem pH von 10 bis 11 durchgeführt, um DL-Methionyl-DL-methionin zu erhalten. Dabei können die basischen Bedingungen unter Verwendung einer Substanz eingestellt werden, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe Stickstoff haltiger Basen, NH4HCO3, (NH4) 2CO3, NH4OH/CO2-Mischung, Carbamatsalze, KHCO3, K2CO3, Carbonate, Alkali- und Erdalkalibasen.
Die saure bzw. basische Hydrolyse wird vorzugsweise bei Temperaturen von 500C bis 2000C, vorzugsweise von 8O0C bis 1800C und besonders bevorzugt von 900C bis 1600C durchge- führt.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Umsetzung des Diketopiperazin zum DL-Methionyl-DL-methionin durch Einleiten von CO2 in eine basische Lösung, bevorzugt in eine ba- sische Ammonium-, Kalium- oder Natriumhydroxidlösung durchgeführt .
In einem bevorzugten Verfahren wird das Diketopiperazin vor der Hydrolyse isoliert. Bevorzugt ist dabei, dass das Dike- topiperazin durch Kristallisation aus der Reaktionslösung, bevorzugt bei einer Temperatur von -30 bis 1200C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 10 bis 700C, isoliert wird.
Zur Isolation des Diastereomerengemisches aus DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin aus basischen Reaktionslösungen wird diese angesäuert und das Methionylmethionin durch Kristallisation bzw. Fällung erhalten. Bevorzugt ist dabei ein pH- Wert von 5 bis 9, besonders bevorzugt ein pH-Wert von 5 bis 7, ganz besonders bevorzugt ein pH-Wert von ca. 5,6. Dabei können Säuren bevorzugt aus der Gruppe der Mineralsäuren, HCl, H2CO3, CO2/H2O, H2SO4, Phosphorsäuren, Carbonsäuren und Hydroxycarbonsäuren zur Ansäuerung verwendet werden.
Zur Isolation des Diastereomerengemisches aus DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin aus sauren Reaktionslösungen wird durch Zugabe von Basen neutralisiert und das Methionylmethionin durch Kristallisation bzw. Fällung erhalten. Bevorzugt ist dabei ein pH-Wert von 5 bis 9, besonders bevorzugt ein pH- Wert von 5 bis 7, ganz besonders bevorzugt ein pH-Wert von ca. 5,6. Dabei werden zur Neutralisation Basen bevorzugt aus der Gruppe NH4HCO3, (NH4) 2CO3, Stickstoff haltige Basen, NH4OH, Carbamatsalze, KHCO3, K2CO3, Carbonate, Alkali- und Erdalkalibasen verwendet.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Auftrennung des Diastereomerengemisches aus DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin durch fraktionierte Kristallisation bereit, wobei die beiden Enantiomerenpaare DD/LL- Methionylmethionin und DL/LD-Methionylmethionin erhalten werden . In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der fraktionierten Kristallisation durch Ansäuern wird wie folgt vorgegangen:
a) durch Ansäuern der DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin ent- haltenden Suspension bis eine klare Lösung erhalten wird und durch schrittweises Versetzen der sauren Lösung mit einer Base bis ein Niederschlag ausfällt, wird DL/LD- Methionylmethionin als Niederschlag gewonnen,
b) aus der aus Schritt a) erhaltenen Mutterlauge wird DD/LL-Methionylmethionin gewonnen.
Dabei ist besonders bevorzugt, dass in Schritt a) das Ansäuern mit einer Säure erfolgt und ein pH-Wert von 0,1 bis 1,0, vorzugsweise ein pH-Wert von ca. 0,6 eingestellt wird, und die erhaltene klare Lösung anschließend mit einer Base auf einen pH-Wert von 5 bis 6, vorzugsweise auf einen pH- Wert von ca. 5,6 eingestellt wird. Als Säure können dabei Mineralsäuren, bevorzugt Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salzsäure oder Kohlensäure bzw. Kohlendioxid, und/oder Carbonsäuren, insbesondere die d-C4-Carbonsäuren Ameisensäu- re, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder Isobuttersäure, eingesetzt werden. Besonders bevorzugt wird Kohlensäure bzw. Kohlendioxid verwendet. Dabei kann die Kohlensäure bzw. das Kohlendioxid in die Reaktionsmischung unter Normaldruck oder unter Überdruck eingeleitet werden.
Zur Einstellung der basischen Bedingungen in Schritt a) wird vorzugsweise eine Base verwendet ausgewählt aus der Gruppe NH4HCO3, (NH4) 2CO3, Stickstoff haltige Basen, NH4OH, Carbamatsalze, KHCO3, K2CO3, Carbonate, Alkalibasen und Erdalkalibasen .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der fraktionierten Kristallisation durch Basischstellen wird wie folgt vorgegangen: a) durch Basischstellen der DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin enthaltenden Suspension bis eine klare Lösung erhalten wird und durch schrittweises Versetzen der basischen Lösung mit einer Säure bis ein Niederschlag ausfällt, wird DL/LD- Methionylmethionin als Niederschlag gewonnen.
b) aus der aus Schritt a) erhaltenen Mutterlauge wird an¬ schließend DD/LL-Methionylmethionin gewonnen.
Dabei ist besonders bevorzugt, dass in Schritt a) das Ba¬ sischstellen mit einer Base erfolgt und ein pH-Wert von 7,5 bis 14, vorzugsweise ein pH-Wert von ca. 9 bis 13 einge¬ stellt wird und die erhaltene klare Lösung anschließend mit einer Säure auf einen pH-Wert von 5 bis 6, vorzugsweise auf einen pH-Wert von ca. 5,6 eingestellt wird. Als Basen wer¬ den dabei bevorzugt Basen aus der Gruppe NH4HCO3, (NH4) 2CO3, Stickstoff haltige Basen, NH4OH, Carbamatsalze, KHCO3, K2CO3, Carbonate, Alkali- und Erdalkalibasen verwendet.
Zur Einstellung der sauren Bedingungen in Schritt a) wird vorzugsweise eine Säure verwendet aus der Gruppe der Mine¬ ralsäuren, bevorzugt die Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, oder Kohlensäure bzw. Kohlendioxid, und/oder aus der Gruppe der Carbonsäuren, insbesondere der Ci-C4- Carbonsäuren Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, But¬ tersäure und Isobuttersäure. Besonders bevorzugt wird die Kohlensäure bzw. Kohlendioxid verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der fraktionierten Kristallisation erfolgt diese bei einer Temperatur von 00C bis 1000C, vorzugsweise 5°C bis 6O0C und besonders bevorzugt von 100C bis 400C.
Das erhaltene DD/LL-Methionylmethionin kann dabei racemi- siert werden, und in das oben beschriebene Trennungsverfahren eingeführt werden, wobei die beiden Enantiomerenpaare DD/LL-Methionylmethionin und DL/LD-Methionylmethionin voneinander getrennt werden. Alle genannten Verfahren der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in einem wässrigen Medium durchgeführt.
Weiterhin können die Verfahren der vorliegenden Erfindung in dem Fachmann bekannten Batch-Verfahren oder in kontinu- ierlichen Verfahren ausgeführt werden.
Figuren
Figur 1 zeigt die schematische Darstellung der enzymati- schen Spaltung der Methionylmethionin- Diastereomerengemische DD/LL-I, DL/LD-I und DD/LL/DL/LD-I .
Figur 2 zeigt Die schematische Darstellung der enzymati- schen Spaltung der vier Methionylmethionin-Diastereomere DD-I, LL-I, DL-I und LD-I mit unterschiedlichen Spaltungsgeschwindigkeiten .
Figur 3 zeigt die schematische Darstellung der enzymati- sehen Freisetzung von Methionin (D- und L-Met zusammen) aus den vier Methionylmethionin-Diastereomeren DD-I, LL-I, DL-I und LD-I.
Figur 4 zeigt die Biotransformation von D-Methionin zu L- Methionin mit einem Enzymcocktail aus Spiegelkarpfen. Figur 5 zeigt das Leachingverhalten von Methionylmethionin- Diastereomerengemischen DD/LL-I, DL/LD-I und LL/DD/LD/DL-I im Vergleich zu Methionin, MHA und MHA-Ca.
Figur 6 zeigt die in vitro Verdauung von vier verschiedenen Methionylmethionin-Diastereomeren LL-I, LD-I, DL-I und DD-I mit Verdauungsenzymen des Spiegelkarpfens.
Figur 7 zeigt die in vitro Verdauung von verschiedenen Methionylmethionin-Diastereomerengemischen LL/DD-I, DL/LD-I und LL/DD/LD/DL-I mit Verdauungsenzymen des Spiegelkarpfens . Figur 8 zeigt die in vitro Verdauung von vier verschiedenen Methionylmethionin-Diastereomeren LL-I, LD-I, DL-I und DD-I mit Verdauungsenzymen der Regenbogenforelle.
Figur 9 zeigt die in vitro Verdauung der Methionylmethio- nin-Diastereomerengemische LL/DD-I, DL/LD-I und
LL/DD/LD/DL-I mit Verdauungsenzymen der Regenbogenforelle.
Figur 10 zeigt die in vitro Verdauung von vier verschiede¬ nen Methionylmethionin-Diastereomeren LL-I, LD-I, DL-I und DD-I mit Verdauungsenzymen der Whiteleg Shrimps .
Figur 11 zeigt die in vitro Verdauung von verschiedenen
Methionylmethionin-Diastereomerengemischen LL/DD-I, DL/LD-I und LL/DD/LD/DL-I mit Verdauungsenzymen der Whiteleg Shrimps .
Beispiele
A) Übersicht über die einzelnen Schritte und Methoden des erfindungsgemäßen Verfahrens
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von DL- Methionyl-DL-methionin (I) und die Trennung in die Diaste- reomerenpaare DD/LL-I und DL/LD-I werden nachfolgend einge¬ hend beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von DL- Methionyl-DL-methionin (I) geht dabei aus von einer Verbin- düng der allgemeinen Formel II
Figure imgf000026_0001
(ii: wobei IIa: R1 = COOH, R2 = NHCONH2
IIb: R1 = CONH2, R2 = NHCONH2
Hc: R1 = CONH2, R2 = NH2
Hd: R1^-R2 = -CONHCONH-
He: R1 = CN, R2 = OH
Hf: R1 = CN, R2 = NH2
Hg: R1 = =0, R2 = H bedeutet .
Über unterschiedliche Synthesemethoden (A, B, C, D, E, F,
G, H und J) wird diese Verbindung zu DL-Methionyl-DL- methionin (I) transformiert (siehe Schema 3) . Dabei entsteht bei den Methoden A, B, C, und D das entsprechende Di- ketopiperazin (III) als Zwischenprodukt. Bei den Synthesemethoden G, H und J entsteht Methioninhydantoin als Zwischenprodukt, das direkt zu DL-Methionyl-DL-methionin (I) transformiert wird. Anschließend kann mit Hilfe von Methode K durch fraktionierte Kristallisation eine Trennung der beiden Diastereomerenpaare DD/LL-I und DL/LD-I erreicht werden (siehe Schema 3) .
Methode A
Figure imgf000028_0001
für Hc, He und Hf DD/LL/DL/LD- (I)
Methode J für Hg
Methode K
DD /LL -I DL /LD-I
Schema 3 B) Synthesebeispiele:
Beispiel 1:
Synthese von 3 , 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 , 5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) aus N- Carbamoylmethionin (IIa) nach Methode A
17,5 g (90,0 mmol, Reinheit: 99%) N-Carbamoylmethionin (IIa) wurden in 150 ml Wasser gelöst und in einem 200 ml Roth-Stahlautoklav mit Magnetrührung 6 Stunden lang bei 160°C gerührt. Der Druck steigt hierbei an. Von Zeit zu Zeit wurde immer wieder so lange Gas abgelassen bis ein
Druck von 7 bar erreicht wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt. Die erhaltene Suspension wurde anschließend filtriert, der abfiltrierte Feststoff mehrmals mit Wasser gewaschen und im Trocken- schrank bei 500C im Vakuum getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 8,1 g (30,9 mmol) (69%) Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (III), weißgelbliche Kristalle, Reinheit > 98% (HPLC), Schmelzpunkt 234-236°C.
1H-NMR von 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (III) (500 MHz, D6-DMSO) : δ = 1,85-2,05 (m, 4H, 2 x
SCH2CH2); 2,049 (s, 6H, 2 x SCH3); 2,46-2,60 (m, 4H, 2 x SCH2); 3,92-3,99 (m, 2H, 2 x CH); 8,213 (s, 2H, 2 x NH)
13C-NMR von 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (III) (125.8 MHz, D6-DMSO) : δ = 14, 35 (CH3) ; 14, 38 (CH3) ; 28, 50 (CH2S) ; 28, 68 (CH2S) ; 31, 92 (CH2CH2S) ; 32, 33 (CH2CH2S) ; 52, 92 (CH) ; 52, 96 (CH) ; 167, 69 (C=O) ; 167, 71 (C=O)
Elementaranalyse für Ci0H18N2O2S2 (M = 262, 39 g/mol) : Berechnet: C 45, 77; H 6, 91; N 10, 68; S 24, 44 Gefunden: C 45, 94; H 6, 96; N 10, 64; S 24, 38 Bei spiel 2 :
Synthese von 3 , 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 , 5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) aus 2- [ (Aminocarbonyl) amino] -4- (methylthio) butansäureamid (N- Carbamoylmethioninamid) (IIb) nach Methode A
17,4 g (90 mmol, Reinheit: 98,5%) 2- [ (Aminocarbonyl) amino] - 4- (methylthio) butansäureamid (IIb) wurden in 150 ml Wasser gelöst und in einem 200 ml Roth-Stahlautoklav mit Magnetrührung 7 Stunden lang bei 1600C gerührt. Der Druck steigt hierbei an. Von Zeit zu Zeit wurde immer wieder so lange
Gas abgelassen bis ein Druck von 7 bar erreicht wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt. Die erhaltene Suspension wurde anschließend filtriert, der abfiltrierte Feststoff mehrmals mit Wasser gewa- sehen und im Trockenschrank bei 500C im Vakuum getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 9,2 g (35,1 mmol) (78%) Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (III), weißgelbliche Kristalle, Reinheit > 98% (HPLC) .
Der Schmelzpunkt und die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 1 überein.
Beispiel 3:
Synthese von 3 , 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 , 5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) aus 5- [2- (methylthio) ethyl] -2 , 4-imidazolidindion (Hd) (Methioninhy- dantoin) nach Methode A und anschließendem Wiedereinsatz der Mutterlauge (Kaskadenumsetzung)
Erster Ansatz:
Eine Suspension aus 13,4 g (0,09 mol) Methionin, 17,2 g (0,09 mol, Reinheit: 91%) Methioninhydantoin (Hd) und 150 g Wasser wurden in einem 200 ml Roth-Stahlautoklav mit Mag- netrührung vorgelegt und 6 Stunden bei 1600C gerührt, wobei der Druck auf 15 bar ansteigt. Von Zeit zu Zeit wurde der Autoklav entspannt, bis sich der Druck bei konstant 10 bar einpendelte. Danach wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt, die erhaltene Suspension abfiltriert und der Feststoff mit 75 ml Wasser gewaschen. Abschließend wurde der Feststoff im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Bis [2- (methylthio) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (III) wurde als weißgelbliche Kristalle isoliert.
Nachfolgende Ansätze:
Das Waschwasser und die Mutterlauge aus dem vorherigen Ansatz wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer bei 500C auf 90 ml eingedickt. 17,2 g (0,09 mol, Reinheit: 91%) Methioninhydantoin (Hd) wurde mit der aufkonzentrierten Mutterlauge aufgenommen und mit Wasser auf 150 g Lösung aufgefüllt. Die resultierende Lösung wurde in einem 200 ml Roth-Stahlautoklav mit Magnetrührung vorgelegt und 6 Stunden bei 1600C gerührt, wobei der Druck auf 15 bar ansteigt. Von Zeit zu Zeit wurde der Autoklav entspannt, bis der Druck bei konstant 10 bar blieb. Die weitere Aufarbeitung erfolgte analog dem ersten Ansatz.
Beispiel 4 :
Synthese von 3 , 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 , 5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) aus 2-Amino-4-
(methylthio)butansäureamid (Methioninamid) (Hc) nach Methode B
16,6 g (0,09 mol) 2-Amino-4- (methylthio) butansäureamid Hydrochlorid (Hc) und 8,7 g (0,09 mol) (NH4) 2CO3 wurden in 150 g Wasser gelöst und in einem 200 ml Roth-Stahlautoklav mit Magnetrührung 6 Stunden lang bei 1600C gerührt. Danach wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt. Die erhaltene Suspension wurde anschließend filtriert, der abfiltrierte Feststoff mehrmals mit Wasser gewaschen und im Trockenschrank bei 500C im Vakuum getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 6,5 g (24,8 mmol) (55%) Bis [2- (methylthio) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (III), weißgelbliche Kristalle, Reinheit > 98% (HPLC) .
Der Schmelzpunkt und die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 1 überein.
Beispiel 5: Synthese von 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 ,5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) aus 2-Hydroxy-4- (methylthio)butannitril (3- (Methylmercapto)propionaldehyd- cyanhydrin, MMP-CH) (IIe) nach Methode C
Eine Lösung aus 30,5 g (0,232 mol) 2-Hydroxy-4- (methylthio) butannitril (He) und 360 g Wasser wurde bei RT langsam zu einer Suspension aus 22,4 g (0,283 Mol = 1,22 eq.) NH4HCO3 in 20 g Wasser zugetropft und 2 h lang gerührt. Das NH4HCO3 ging dabei in Lösung. Anschließend wurde die erhaltene Lösung 7 h lang bei 500C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einen 500 ml-Stahlautoklav überführt, auf 160 0C aufgeheizt und 6 Stunden lang bei dieser Temperatur gerührt. Danach wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt, die erhaltene Suspension abfiltriert und der Feststoff mit 50 ml Wasser gewaschen. Abschließend wurde der helle Feststoff im Vaku- umtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 17,8 g (67,8 mmol) (58%) Bis [2- (methylthio) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (III), weißgelbliche Kristalle, Reinheit > 98% (HPLC) .
Der Schmelzpunkt und die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 1 überein. Bei spiel 6 :
Synthese von 3 , 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 , 5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) aus 2-Amino-4- (methylthio)butannitril (Methioninnitril) (Uf) nach Metho- de C
In eine Lösung aus 26,2 g (0,201 mol) 2-Amino-4- (methylthio) butannitril (Hf) in 330 g Wasser wurde über einen Zeitraum von 3 Stunden ein mäßiger Cθ2-Strom eingeleitet, wobei die Temperatur auf 45°C anstieg und sich der pH-Wert bei 8 einpendelte. Anschließend wurde über Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde am nächsten Morgen in einen 500 ml-Stahlautoklav überführt, auf 1600C aufgeheizt und 6 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Danach wurde der Autoklav im Eisbad abge- kühlt, die erhaltene Suspension abfiltriert, der Feststoff mit 50 ml Wasser gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 15,7 g (59,7 mmol) (59%) Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5- piperazindion (III) , weißgelbliche Kristalle, Reinheit > 98% (HPLC) .
Der Schmelzpunkt und die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 1 überein.
Beispiel 7: Synthese von 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 ,5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) aus 3- (methylthio)propanaldehyd (3- (Methylmercapto)propionaldehyd, MMP) (Hg) nach Methode D
66,0 g (0,68 mol) (NH4) 2CO3 wurden in 100 g Wasser vorgelegt und im Eisbad auf 5°C abgekühlt. Anschließend wurden innerhalb von 25 Minuten 16,6 g (0,61 mol) frisch destillierte Blausäure zugetropft, wobei die Temperatur der Suspension im Bereich von 5 bis 100C gehalten wurde. Nach Zugabe von 860 g Wasser wurden bei 100C 60,3 g (0,58 Mol) 3- (Methylthio) propionaldehyd (Hg) über einen Zeitraum von 80 Min. zugetropft. Der pH-Wert blieb dabei konstant im Be- reich von 8,5 bis 9. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 500C aufgewärmt und 7 Stunden lang bei dieser Temperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch im Eisbad auf 5°C abgekühlt und über Nacht im Kühlschrank gelagert. Am nächsten Morgen wurde das Ge- misch in einen 2 1-Stahlautoklav überführt, auf 1600C aufgeheizt und 6 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Danach wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt, die erhaltene Suspension abfiltriert, mit 150 ml Wasser gewaschen und der Feststoff im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht ge- trocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 48,6 g (185,2 mmol) (64%) Bis [2- (methylthio)ethyl] -2, 5-piperazindion (III), weißgelbliche Kristalle, Reinheit > 98% (HPLC) .
Der Schmelzpunkt und die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 1 überein.
Beispiel 8:
Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 3,6- Bis [2- (methylthio)ethyl] -2 ,5-piperazindion (III) (Methio- nindiketopiperazin, DKP) mit konzentrierter Salzsäure nach Methode E
655,9 g (2,50 mol) 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5- piperazindion (III) (DKP) wurden mit 1661 g Wasser suspendiert. Unter Rühren wurden 271,0 g konz. Salzsäure ganz langsam zugetropft und anschließend vorsichtig unter sehr starkem Rühren bis zum Rückfluss erhitzt. Dabei kann es zu starker Schaumbildung kommen. Die Reaktionsmischung wurde 5,5 Stunden lang am Rückfluss erhitzt, wodurch der gesamte Feststoff in Lösung ging. Während dem anschließenden Abküh- len fiel nichtumgesetztes DKP (III) aus, welches abfiltriert wurde. Dieses DKP kann für weitere Verseifungen in späteren Umsetzungen wieder eingesetzt werden. Das Filtrat wurde anschließend in einem Becherglas mit Eisbad mit 32%igem Ammoniakwasser auf pH 6 eingestellt. Dabei fällt ein DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) als 50 : 50-Gemisch der beiden Diastereomerenpaare (DL/LD-Met-Met) (DL/DL-I) bzw. (DD/LL-Met-Met) (DD/LL-I) als dicker Kristallbrei aus. Abschließend wurde im Trockenschrank bei 600C im Vakuum ge- trocknet. Ausbeute: 601,0 g (2,14 mol) (85,7%) DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin (I) , leicht gelblicher Feststoff, Reinheit 98% (HPLC) .
1H-NMR von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) (500 MHz, D6- DMSO+HC1) : δ = 1,86-2,16 (m, 4H, 2 x SCH2CH2); 2,050 (s, 3H, SCH3); 2,060 (s, 3H, SCH3); 2,44-2,64 (m, 4H, 2 x SCH2); 2,90-4,00 (m, IH, CH); 4,32-4,42 (m, IH, CH); 8,45 (bs, 3H, NH3 +); 8,98-9,08 (m, IH, 2 x NH)
13C-NMR von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) (125.8 MHz, D6-DMSO+HC1) : δ = 14,33 (CH3); 14,38 (CH3); 27,74; 27,94; 29,51; 30,04; 30,13; 30,89; 30,95; 51,00; 51,29; 51,54 (CH, CH2); 168,05 (CONH); 168,19 (CONH); 172,55 (COOH); 172,62 (COOH)
Elementaranalyse für Ci0H20N2O3S2 (M = 280,41 g/mol) : Berechnet: C 42,83; H 7,19; N 9,99; S 22,87 Gefunden: C 42,61; H 7,19; N 10,06; S 22,72
Beispiel 9:
Technische Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 ,5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) mit konzentrierter Salzsäure nach Methode E In einem 500 1 emaillierten Rührwerksbehälter wurden 500 1 Wasser vorgelegt, 32 1 konzentrierte Salzsäure sowie 78,6 kg 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (III) (DKP) zugegeben und der Apparat dicht verschlossen. Dann wurde 2 Stunden lang unter Rühren auf 110 0C erhitzt, wobei der Druck auf 2,5 bar anstieg und das DKP (III) praktisch vollständig in Lösung ging. Nach beendeter Reaktion wurde auf 20 0C abgekühlt und das nicht umgesetzte DKP auf einer Zentrifuge abgeschleudert. Der Feststoff wurde mit 10 1 Wasser nachgewaschen. Das Filtrat und Waschwasser wurden dann in einem 800 1 Container gesammelt und anschließend wieder in einen 500 1 Rührwerksbehälter eingezogen. Nach Zugabe von 2 kg Aktivkohle wurde bei 200C 30 Min. lang gerührt. Die Suspension wurde anschließend über eine Filter- presse in einen weiteren 500 1 Rührwerksbehälter filtriert. Durch Zugabe von ca. 28 1 konzentrierter Ammoniaklösung wurde bei pH 6 anschließend das DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin (I) ausgefällt. Dabei fällt zu Beginn bevorzugt das schwerlöslichere racemische Diastereomeren- paar DL/LD-Methionylmethionin (DL/LD-I) aus. Dieses wurde abgeschleudert und die Mutterlauge zusammen mit Waschwasser im DampfStrahlvakuum bei maximal 400C Innentemperatur auf ein Viertel des ursprünglichen Volumens eingeengt. Dabei kristallisierte das leichtlöslichere racemische Diastereo- merenpaar DD/LL-Methionylmethionin (DD/LL-I) zusammen mit geringen Mengen des schwerlöslichen DL/LD-I aus. Nach beendeter Destillation wurde auf 200C abgekühlt und geschleudert. Die abgetrennte Mutterlauge und Waschwasser wurden verworfen. Beide Fraktionen werden bei 700C im Vakuum ge- trocknet. Ingesamt konnten 64,2 kg (78%) DD/LL/DL/LD-
Methionylmethionin (I) als Diastereomerengemisch erhalten werden. Reinheit > 98% (HPLC) .
Der Schmelzpunkt und die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein. Bei spiel 10 :
Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 3,6- Bis [2- (methylthio)ethyl] -2 ,5-piperazindion (III) (Methio- nindiketopiperazin, DKP) unter alkalischen Bedingungen z.B. mit Ammoniak nach Methode F
65,6 g (0,25 Mol) 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5- piperazindion (III) (DKP) , 70 ml 25%ige Ammoniaklösung und 500 ml Wasser werden 2 Stunden in einem Autoklaven auf 150°C erhitzt. Nach Abkühlen wird das nicht umgesetzte DKP (III) (16,0 g = 24,4%) abgesaugt. Dieses kann in einem nächsten Ansatz wieder eingesetzt werden. Das Filtrat wurde im Rotationsverdampfer bei einer Wassertemperatur von 80- 900C soweit eingeengt, bis die ersten Kristalle ausfielen. Nach Abkühlen und Stehenlassen über Nacht konnten nach Filtration und Trocknung ingesamt 49,3 g (70,3%)
DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) als 50 : 50-Gemisch der beiden Diastereomerenpaare DL/DL-I bzw. DD/LL-I als weißer Feststoff isoliert werden. Reinheit 98% (HPLC) .
Der Schmelzpunkt und die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein.
Beispiel 11:
Aufreinigung von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I)
500 g DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) wurden in 7800 g VE-Wasser suspendiert (pH 5,3) . Bei 26°C wurde mit 346,6 g 50 Gew.-% Schwefelsäure auf pH 1,0 eingestellt. Das Methio- nylmethionin löste sich dabei vollständig auf. Zur Klärung wurden 18 g Aktivkohle zur gelblichen, trüben Lösung gegeben und 60 Minuten lang gerührt. Die Aktivkohle wurde ab- filtriert und die wasserklare, farblose Lösung mit 228 g 32 Gew.-% Ammoniaklösung auf pH 5,6 eingestellt. Die Lösung wurde über Nacht stehen gelassen. Der ausgefallene weiße Feststoff wurde abgesaugt und im Trockenschrank bei 500C im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 460,5 g (92%) DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin (I) , strahlend weißer Feststoff, Reinheit > 99% (HPLC) .
Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein.
Beispiel 12 :
Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus N- Carbamoylmethionin (IIa) und DL-Methionin mit KOH nach Me- thode G
13,4 g (0,09 mol) DL-Methionin, 17,5 g (0,09 mol, Reinheit: 99%) N-Carbamoylmethionin (IIa) und 11,9 g (0,18 mol) 85%iges KOH wurden in 150 ml Wasser gelöst und in einem 200 ml Roth-Stahlautoklav mit Magnetrührung 5 Stunden bei 1500C gerührt, wobei der Druck auf 6 bar anstieg. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Autoklav abgekühlt, das ausgefallene 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) abfiltriert und mit etwas Wasser gewaschen. Das Waschwasser und die Mutterlauge wur- den vereinigt und am Rotationsverdampfer bei 400C auf ein
Volumen von 130 ml eingeengt. In die erhaltene Lösung wurde anschließend ein mäßiger Cθ2-Strom eingeleitet, bis ein pH- Wert von 6,4 erreicht wurde und ein weißer Feststoff ausfiel. Dieser wurde abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser ge- waschen und im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 11,4 g (40,6 mmol) (45%) DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I), weißer Feststoff, Reinheit > 98% (HPLC) .
Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein. Bei spiel 13 :
Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 5- [2- (methylthio) ethyl] -2 , 4-imidazolidindion (Hd) (Methioninhy- dantoin) und DL-Methionin mit KOH nach Methode G
13,4 g (0,09 mol) DL-Methionin, 17,2 g (0,09 mol, Reinheit: 91%) Methioninhydantoin (Hd) und 8,9 g (0,135 mol) 85%iges KOH wurden in 150 ml Wasser gelöst und in einem 200 ml Roth-Stahlautoklav mit Magnetrührung 5 Stunden bei 1500C gerührt, wobei der Druck auf 8 bar ansteigt. Nach Beendi- gung der Reaktion wurde der Autoklav abgekühlt, die erhaltene Suspension abfiltriert und das ausgefallene 3,6-Bis[2- (methylthio) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (III) (Methionindike- topiperazin, DKP) mehrmals mit wenig Wasser gewaschen. Mutterlauge und Waschwasser wurden vereinigt und die resultie- rende Lösung am Rotationsverdampfer bei 400C auf ein Volumen von 125 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit konzentrierter Salzsäure vorsichtig neutralisiert. Bei einem pH- Wert von 5,8 fiel während des Rührens über Nacht bei Raumtemperatur ein weißer Feststoff aus. Dieser wurde abfilt- riert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und im Vakuumtro- ckenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 17,5 g (62,4 mmol) (69%) DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin (I) , weißer Feststoff, Reinheit > 98% (HPLC) . Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein.
Beispiel 14 :
Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 5- [2- (methylthio) ethyl] -2 , 4-imidazolidindion (Hd) (Methioninhy- dantoin) und DL-Methionin mit K2CO3 nach Methode G
13,4 g (0,09 mol) DL-Methionin, 17,2 g (0,09 mol, Reinheit: 91%) Methioninhydantoin (Hd) und 12,4 g (0,09 mol) K2CO3 wurden in 150 ml Wasser gelöst und in einem 200 ml Roth- Stahlautoklav mit Magnetrührung 5 Stunden bei 1500C gerührt, wobei der Druck auf 12 bar ansteigt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Autoklav abgekühlt, das ausgefallene 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (III)
(Methionindiketopiperazin, DKP) abfiltriert und mit etwas Wasser gewaschen. Das Waschwasser und die Mutterlauge wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer bei 400C auf ein Volumen von 135 ml eingeengt. In die erhaltene Lösung wurde anschließend ein mäßiger Cθ2-Strom eingeleitet, bis ein pH- Wert von 6, 8 erreicht wurde und ein weißer Feststoff ausfiel. Dieser wurde abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Ausbeute: 14,3 g (60,0 mmol) (57%) DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin (I) , weißer Feststoff, Reinheit > 99% (HPLC) .
Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein.
Beispiel 15: Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 5- [2-
(methylthio) ethyl] -2 , 4-imidazolidindion (Hd) (Methioninhy- dantoin) und DL-Methionin mit KHCO3 nach Methode G
13,4 g (0,09 mol) DL-Methionin, 17,2 g (0,09 mol, Reinheit: 91%) Methioninhydantoin (Hd) und 9, 1 g (0,09 mol) KHCO3 wurden in 150 ml Wasser gelöst und in einem 200 ml Roth- Stahlautoklav mit Magnetrührung 5 Stunden bei 1500C gerührt, wobei der Druck auf 12 bar ansteigt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Autoklav abgekühlt, das ausgefallene 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) abfiltriert und mit etwas Wasser gewaschen. Das Waschwasser und die Mutterlauge wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer bei 400C auf ein Volumen von 120 ml eingeengt. In die erhaltene Lösung wurde anschließend ein mäßiger Cθ2~Strom eingeleitet, bis ein pH- Wert von 6,3 erreicht wurde und ein weißer Feststoff ausfiel. Dieser wurde abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Ausbeute: 16,0 g (57,1 mmol) (63%) DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin (I) , weißer Feststoff, Reinheit > 99% (HPLC) .
Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein.
Beispiel 16:
Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 2- Amino-4- (methylthio)butansäureamid (Hc) (Methioninamid) und DL-Methionin mit (NH4) 2CO3 nach Methode H
8,3 g (0,045 mol) 2-Amino-4- (methylthio) butansäureamid (Hc) Hydrochlorid, 6,7 g (0,045 mol) Methionin, 4,3 g
(0,045 mol) (NH4)2CO3 und 3,0 g (0,045 mol) 85%iges KOH wurden in 75 g Wasser gelöst und in einem 200 ml Roth- Stahlautoklav mit Magnetrührung 6 Stunden bei 1600C gerührt. Danach wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt, die erhaltene Suspension abfiltriert und das ausgefallene 3, 6- Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (III) (Methio- nindiketopiperazin, DKP) mit wenig Wasser gewaschen. Das Waschwasser und die Mutterlauge wurden vereinigt, am Rotationsverdampfer bei 400C auf ein Volumen von 70 ml einge- engt. In die erhaltene Lösung wurde anschließend ein mäßiger Cθ2-Strom eingeleitet, bis ein pH-Wert von 6,3 erreicht wurde und ein weißer Feststoff ausfiel. Dieser wurde abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Ausbeute: 7,8 g (27,8 mmol) (62%) DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I), weißer Feststoff, Reinheit > 98% (HPLC) .
Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein. Beispiel 17 :
Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 2- Hydroxy-4- (methylthio)butannitril (He) (3- (Methylmercapto)propionaldehydcyanhydrin, MMP-CH) und DL- Methionin mit NH4HCO3 nach Methode H
15,2 g (0,116 mol) 2-Hydroxy-4- (methylthio) butannitril (He) wurden bei RT langsam zu einer Suspension aus 11,1 g (0,141 Mol = 1,22 eq.) NH4HCO3 in 10 g Wasser zugetropft und 2 h lang gerührt. Das NH4HCO3 ging dabei in Lösung. An- schließend wurden 180 g Wasser zugegeben und die erhaltene Lösung 7 h bei 500C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Am nächsten Morgen wurden 17,3 g (0,116 mol) Methionin, 7,7 g (0,116 mol) 85%iges KOH sowie weitere 180 g Wasser zugegeben und das Reaktionsgemisch in einen 1 1- Stahlautoklav überführt, auf 1600C aufgeheizt und 6 Stunden lang bei dieser Temperatur gerührt. Danach wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt, die erhaltene Suspension abfiltriert und das ausgefallene 3,6-Bis[2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (III) (Methionindike- topiperazin, DKP) mit 100 ml Wasser gewaschen. Mutterlauge und Waschwasser wurden vereinigt und die resultierende Lösung am Rotationsverdampfer bei 400C auf ein Volumen von 160 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 50%iger Schwefelsäure vorsichtig neutralisiert. Bei einem pH-Wert von 5,4 fiel während des Rührens über Nacht bei Raumtemperatur ein weißer Feststoff aus. Dieser wurde abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Ausbeute: 15,2 g (54,2 mmol) (47%) DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I), weißer Feststoff, Reinheit > 99% (HPLC) .
Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein. Bei spiel 18 :
Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 2- Amino-4- (methylthio)butannitril (Uf) (Methioninnitril) mit CO2 und DL-Methionin nach Methode H
In eine Lösung von 26,2 g (0,201 mol) 2-Amino-4-
(methylthio) butannitril (Uf) in 330 g Wasser wurde über einen Zeitraum von 3 Stunden ein mäßiger Cθ2~Strom eingeleitet, wobei die Temperatur auf 45°C anstieg und der pH- Wert sich bei 8 einpendelte. Anschließend wurde über Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde am nächsten Morgen mit 30,0 g (0,201 mol) Methionin und 13,3 g (0,201 mol) 85%iges KOH versetzt und in einen 1 1- Stahlautoklav überführt, auf 1600C aufgeheizt und 6 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Danach wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt, die erhaltene Suspension abfiltriert und das ausgefallene 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5- piperazindion (III) (Methionindiketopiperazin, DKP) mit wenig Wasser gewaschen. Das Waschwasser und die Mutterlauge wurden vereinigt, am Rotationsverdampfer bei 400C auf ein Volumen von 280 ml eingeengt. In die erhaltene Lösung wurde anschließend ein mäßiger Cθ2-Strom eingeleitet, bis ein pH- Wert von 6, 0 erreicht wurde und ein weißer Feststoff ausfiel. Dieser wurde abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht ge- trocknet. Ausbeute: 32,7 g (116,6 mmol) (58%) DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin (I) , weißer Feststoff, Reinheit > 98% (HPLC) .
Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein.
Beispiel 19:
Synthese von DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) aus 3- (Methylthio)propanaldehyd (Hg) (MMP) mit Blausäure, Ammo- niumcarbonat und DL-Methionin nach Methode J 66,0 g (0,68 mol) (NH4) 2CO3 wurden in 100 g Wasser vorgelegt und im Eisbad auf 5°C abgekühlt. Anschließend wurden innerhalb 25 Min. 16,55 g (0,612 Mol) frisch destillierte Blausäure zugetropft, wobei die Temperatur der Suspension auf 5 bis 10°C gehalten wurde. Nach Zugabe von 500 g Wasser wurden 60,3 g (0,58 Mol) 3- (Methylthio) propionaldehyd (Hg) über einen Zeitraum von 80 Min. bei 100C zugetropft. Der pH-Wert blieb dabei konstant im Bereich von 8,5 bis 9. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 500C aufgewärmt und 7 Stunden lang bei dieser Temperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch im Eisbad auf 50C abgekühlt und über Nach im Kühlschrank gelagert. Am nächsten Morgen wurden 86,5 g (0,58 mol) 2-Amino-4- (methylthio) butansäure (Methionin) , 38,3 g (0,58 mol) 85%iges KOH (0,58 mol), sowie weitere 530 g Wasser zugegeben. Das Gemisch wurde in einen 2 1-Stahlautoklav überführt, auf 1600C aufgeheizt und 6 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Danach wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt, die erhaltene Suspension abfiltriert und das ausge- fallene 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (I- II) (Methionindiketopiperazin, DKP) mit wenig Wasser gewaschen. Das Waschwasser und die Mutterlauge wurden vereinigt, am Rotationsverdampfer bei 400C auf ein Volumen von 800 ml eingeengt. In die erhaltene Lösung wurde anschlie- ßend ein mäßiger Cθ2-Strom eingeleitet, bis ein pH-Wert von 6,0 erreicht wurde und ein weißer Feststoff ausfiel. Dieser wurde abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Ausbeute: 85,1 g (0,30 mol) (52%) DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin (I) , weißer Feststoff, Reinheit > 98% (HPLC) .
Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein Bei spiel 20 :
Trennung der beiden Diastereomerenpaare DD/LL- Methionylmethionin (DD/LL-I) und DL/LD-Methionylmethionin (DL/LD-I) durch fraktionierte Kristallisation aus DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) nach Methode K
a) DL/LD-Methionylmethionin (DL/LD-I) :
290,4 g DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) (50:50 Mischung aus DD/LL-I und DL/LD-I) wurden in 2614 g VE-Wasser suspendiert und mit 381,7 g 50 Gew.-% Schwefelsäure auf pH 0,6 eingestellt. Die klare, farblose Lösung wurde mit 265,9 g 32 Gew.-% Ammoniak-lösung auf pH 5,6 eingestellt und der entstandene weiße Niederschlag abgesaugt (580,9 g feucht) . Abschließend wurde der Feststoff im Trockenschrank bei 500C im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 126,2 g (86,9%) DL/LD-Methionylmethionin (DL/LD-I) , weißer Feststoff, Reinheit > 98% (HPLC), Schmelzbereich 232-233°C (Zers.) .
1H-NMR von DL/LD-Methionylmethionin (DL/LD-I) (500 MHz, D6- DMSO+HC1) : 1,88-2,12 (m, 4H, 2 x SCH2CH2); 2,031 (s, 3H, CH3); 2,041 (s, 3H, CH3); 2,48-2,56 (m, 4H, 2 x SCH2); 3,87- 3,95 (m, IH, CH); 4,30-4,38 (m, IH, CH); 8,429 (d, 3H, 3J = 4,4Hz, NH3 +); 9,034 (d, IH, 3J = 8,0Hz, NH)
13C-NMR von DL/LD-Methionylmethionin (DL/LD-I) (125.8 MHz, D6-DMSO+HC1) : 14,57 (CH3); 14,62 (CH3); 28,19; 29,75; 30,28; 31,19; 51,25 (CH); 51,79 (CH); 168,29 (CONH); 172,80 (COOH) Löslichkeit (Wasser, 200C) : 0,4 g/l
b) DD/LL-Methionylmethionin (DD/LL-I) :
Die farblose Mutterlauge aus a) wurde am Rotationsverdampfer bei 35°C und Wasserpumpenvakuum aufkonzentriert . Man erhielt eine weiße Suspension. Der weiße Feststoff aus Ammoniumsulfat, Resten an DL/LD-I und Zielverbindung wurde anschließend abgesaugt und im Vakuum bei 500C getrocknet. Zur Trennung der drei Feststoffe wurde das Gemisch in VE- Wasser suspendiert und ausgerührt. Das ungelöste DL/LD-I wurde abgesaugt und die Mutterlauge am Rotationsverdampfer bei 500C und Wasserpumpenvakuum auf ca. ein Fünftel aufkonzentriert. Nach längerem Stehen kristallisierte DD/LL- Methionylmethionin (DD/LL-I) als weißer Feststoff aus. Abschließend wurde abgesaugt und im Vakuumtrockenschrank bei 500C getrocknet. Die Ausbeute betrug 78,2 g (53,9%) bezogen auf DD/LL-Methionylmethionin (DD/LL-I), weißer Feststoff, > 96% (HPLC), Schmelzbereich 226-227°C (Zersetzung) .
1H-NMR von DD/LL-Methionylmethionin (DD/LL-I) (500 MHz, D6- DMSO+HC1) : 1,84-2,12 (m, 4H, 2 x SCH2CH2); 2,044 (s, 3H, CH3); 2,046 (s, 3H, CH3); 2,48-2,62 (m, 4H, 2 x SCH2); 3,89- 3,97 (m, IH, CH); 4,33-4,40 (m, IH, CH); 8,422 (d, 3H, 3J = 4,0Hz, NH3 +); 9,065 (d, IH, 3J = 7,5Hz, NH)
13C-NMR von DD/LL-Methionylmethionin (DD/LL-I) (125.8 MHz, D6-DMSO+HC1) : 14,56 (CH3); 14,57 (CH3); 27,97; 29,73; 30,35; 31,11; 51,22 (CH); 51,50 (CH); 168,41 (CONH); 172,83 (COOH)
Löslichkeit (Wasser, 200C) : 21,0 g/l
Beispiel 21:
Racemisierung der beiden Diastereomerenpaare DD/LL- Methionylmethionin (DD/LL-I) und DL/LD-Methionylmethionin (DL/LD-I) unter basischen Bedingungen
a) Racemisierung von DL/LD-Methionylmethionin (DL/LD-I)
12,6 g (45,0 mmol) des Diastereomerenpaars DL/LD- Methionylmethionin (DL/LD-I) wurden zusammen mit 3,1 g (22,5 mmol) K2CO3 in einem 200 ml Roth-Laborreaktor in 75 ml Wasser gelöst und unter Rühren auf 1600C erhitzt. Der Druck stieg dabei auf 7 bar an. Nach 6 Stunden bei dieser Temperatur wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt. Die erhaltene Suspension wurde anschließend filtriert, der abfiltrierte Feststoff mehrmals mit Wasser gewaschen und im Trockenschrank bei 500C im Vakuum getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 6,5 g (24,8 mmol) (55%) Bis [2-
(methylthio) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (III), weißgelbliche Kristalle, Reinheit > 98%, Schmelzpunkt 234-236°C; Diaste- reomerenverhältnis : 52:48 (DD/LL-III : meso-III) . Das Waschwasser und die Mutterlauge wurden vereinigt und am Ro- tationsverdampfer bei 400C auf ein Volumen von 25 ml eingeengt. In die erhaltene Lösung wurde anschließend ein mäßiger Cθ2-Strom eingeleitet, bis der pH-Wert bei 6, 0 erreicht wurde und ein weißer Feststoff ausfiel. Dieser wurde abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum- trockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 5,7 g (20,3 mmol) (45%) DD/LL/DL/LD- Methionylmethionin (I) , weißer Feststoff, Reinheit > 98% (HPLC) .
Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein
a) Racemisierung von DL/LD-Methionylmethionin (DD/LL-I)
12,6 g (45,0 mmol) DD/LL-Methionylmethionin (DD/LL-I) wurden zusammen mit 4,5 g (45,0 mmol) KHCO3 in einem 200 ml Roth-Laborreaktor in 75 ml Wasser gelöst und unter Rühren auf 160°C erhitzt. Der Druck stieg auf 7 bar an, nach 6
Stunden bei dieser Temperatur wurde der Autoklav im Eisbad abgekühlt. Die erhaltene Suspension wurde anschließend filtriert, der abfiltrierte Feststoff mehrmals mit Wasser gewaschen und im Trockenschrank bei 500C im Vakuum getrock- net. Die isolierte Ausbeute betrug 6, 0 g (22,9 mmol) (51%) Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5-piperazindion (III), weißgelbliche Kristalle, Reinheit > 98% (HPLC) , Schmelzpunkt 233- 236°C; Diastereomerenverhältnis : 54:46 (DD/LL-III : meso- III) . Das Waschwasser und die Mutterlauge wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer bei 400C auf ein Volumen von 25 ml eingeengt. In die erhaltene Lösung wurde anschließend ein mäßiger Cθ2~Strom eingeleitet, bis ein pH-Wert von 6, 0 erreicht wurde und ein weißer Feststoff ausfiel. Dieser wurde abfiltriert, mit wenig kaltem Wasser gewaschen und im Vakuumtrockenschrank bei 500C über Nacht getrocknet. Die isolierte Ausbeute betrug 5,5 g (19,6 mmol) (44%) DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin (I) , weißer Feststoff, Reinheit > 98% (HPLC) . Die NMR-Daten stimmten mit denen aus Beispiel 8 überein.
Beispiel 22:
In vitro Verdauungsversuche von DL-Methionyl-DL-methionin (I) mit Verdauungsenzymen aus Omnivoren Karpfen
a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio morpha noblis)
Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von EID und MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111- 119) durchgeführt. Dazu wurde der Darm von fünf einjährigen Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio morpha noblis) freigelegt, mit Wasser gespült, längs aufgeschnitten und jeweils die Darmschleimhaut abgekratzt. Diese wurde zusammen mit zerstoßenem Eis mit einem Mixgerät zerkleinert. Die resultierende Suspension wurde mit einem Ultraschallstab behandelt, um noch intakte Zellen aufzuschließen. Zur Abtrennung der Zellbestandteile und Fett wurde die Suspension 30 Minuten lang bei 40C zentrifugiert, das Homogenat abdekantiert und mit einer Spur Thimerosal sterilisiert. Aus 5 Spiegelkarpfen wurden 260,7 ml Enzymlösung der Darmschleimhaut gewon- nen, die Lösung wurde bei 40C dunkel gelagert. b) Durchführung der in vitro Verdauungsuntersuchungen
DL-Methionyl-DL-methionin (I) bzw. die entsprechenden Di- astereomerenpaare DD/LL-I und DL/LD-I wurden in TRIS/HC1- Pufferlösung aufgenommen und mit der Enzymlösung versetzt. Als Vergleich und zur Abschätzung der rein chemischen Spaltungsgeschwindigkeit wurde jeweils ein Blindwert ohne Enzymlösung angesetzt. Von Zeit zu Zeit wurde eine Probe entnommen und deren Zusammensetzung mit Hilfe eines kalibrierten HPLCs detektiert und quantifiziert. Der Umsatz wurde als Quotient der Fläche von Methionin und der Fläche von Methionylmethionin (I) bestimmt (siehe Figur 6 und 7) .
Tabelle 1
Probe Blindwert
Vorlage Substrat 0,143 mmol 0,143 mmol Met-Met (I) (40, 1 mg) (40, 1 mg)
TRIS/HC1- 5,7 ml 8,3 ml Pufferlösung, pH 9,5
Reaktionsstart Enzymlösung 2,6 ml
(= 5% Karpfenlsg. )
Reaktion 37 0C 37 0C
Reaktionsabbr . 0,2 ml Reaktionslösung wurde in 9,8 ml
10%iger H3PO4-Lösung aufgenommen. Beispiel 23 :
In vitro Verdauungsversuche von DL-Methionyl-DL-methionin (I) mit Verdauungsenzymen aus karnivoren Forellen
a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss)
Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von EID und MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111- 119) durchgeführt. Dazu wurde der Darm von sechs einjähri¬ gen Regenbogenforellen {Oncorhynchus mykiss) freigelegt und wie in Beispiel 22 beschrieben aufgearbeitet.
b) Durchführung der in vitro Verdauungsuntersuchungen
Die in vitro Untersuchungen wurden analog zu Beispiel 22 durchgeführt (siehe Figur 8 und 9) .
Tabelle 2
Probe Blindwert
Vorlage Substrat 0, 143 mmol 0, 143 mmol Met-Met (I) (40, 1 mg) (40, 1 mg)
TRIS/HC1- 5,7 ml 9, 8 ml
Pufferlösung, pH 9, 5
Reaktionsstart Enzymlösung 4,2 ml
(A 10% Forel- lelsg. )
Reaktion 37 0C 37 0C
Reaktionsabbr . 0,2 ml Reaktionslösung wurde in 9,8 ml
10%iger H3PO4-Lösung aufgenommen. Beispiel 24 :
In vitro Verdauungsversuche von DL-Methionyl-DL-methionin (I) mit Verdauungsenzymen aus Omnivoren Shrimps
a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Whiteleg Shrimps (Litopenaeus Vannamei)
Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von Ezquerra und Garcia-Carreno (J. Food Bio- chem. 1999, 23, 59-74) durchgeführt. Dazu wurde das Hepato- pankreas aus fünf Kilogramm Whiteleg Shrimps (Litopenaeus Vannamei) entfernt und zusammen mit zerstoßenem Eis mit ei¬ nem Mixer zerkleinert. Die weitere Aufarbeitung wurde ana¬ log Beispiel 22 durchgeführt.
b) Durchführung der in vitro Verdauungsuntersuchungen
Die in vitro Untersuchungen wurden analog zu Beispiel 22 durchgeführt (siehe Figur 10 und 11) .
Tabelle 3
Probe Blindwert
Vorlage Substrat 0, 143 mmol 0, 143 mmol Met-Met (I) (40, 1 mg) (40, 1 mg)
TRIS/HC1- 5,7 ml 7, 9 ml
Pufferlösung, pH 9, 5
Reaktionsstart Enzymlösung 2,2 ml
(A 2 Shrimps)
Reaktion 37 0C 37 0C
Reaktionsabbr . 0,2 ml Reaktionslösung wurde in 9,8 ml
10%iger HsPC^-Lösung aufgenommen. Beispiel 25 :
Biotransformation von D- zu L-Methionin mit Enzymen aus Darm, Leber und Pankreas aus Spiegelkarpfen
a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio morpha noblis)
Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von EID und MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111- 119) durchgeführt. Dazu wurde der Darm von fünf einjährigen Spiegelkarpfen ( Cyprinus carpio morpha noblis) freigelegt und wie in Beispiel 22 beschrieben aufgearbeitet. Zur Isolation von Leberenzymen wurden die Lebern isoliert, homogenisiert und analog der Verarbeitung der Darmenzyme in Beispiel 22 behandelt. Analog dazu wurde auch mit der Enzymisolation aus der Pankreas verfahren.
b) Durchführung der in vitro Biotransformation von D- zu L- Methionin
D-Methionin wurde in Pufferlösung aufgenommen und mit der Enzymlösung versetzt. Als Vergleich und zur Abschätzung der rein chemischen Umwandlungsgeschwindigkeit wurde jeweils ein Blindwert ohne Enzymlösung angesetzt. Nach 24 Stunden wurde eine Probe entnommen und die Zusammensetzung mit Hilfe eines kalibrierten HPLCs detektiert und quantifiziert. Der Umsatz wurde als Quotient der Fläche von L-Methionin und der Fläche von D-Methionin bestimmt (siehe Figur 4) .
Tabelle 4
Probe Blindwert
Vorlage Substrat 0,143 mmol 0,143 mmol D-Methionin (21,3 mg) (21,3 mg)
Pufferlösung 11,7 ml 23,4 ml
Reaktionsstart Enzymcocktail 11,7 ml
(= 5% Karpfenlsg. )
Reaktion 37 0C 37 0C
Reaktionsabbr . 0,2 ml Reaktionslösung wurde in 9,8 ml
10%iger H3PO4-Lösung aufgenommen.
Pufferlösungen :
Citrat-Puffer: pH 5, pH 6 und pH 7
Phosphat-Puffer: pH 8
TRIS/HCl-Puffer: pH 9
Enzymcocktail aus Darm-, Leber- und Pankreasenzymen (= 55
Karpfenlösung) :
2,6 ml Enzymlösung aus Darmschleimhaut
3.5 ml Enzymlösung aus Leber
5.6 ml Enzymlösung aus Pankreas
Beispiel 26:
Leaching-Verhalten der Diastereomerengemisehe von Methio- nylmethionin LL/DD/LD/DL-I , DD/LL-I bzw. DL/LD-I aus Futterpellets im Vergleich zu DL-Methionin, MHA und Calcium- MHA
Futtermischung : Als Futtermittelmatrix wurde eine Methionin defiziente Futtermischung aus gängigen Zutaten wie z.B. Sojaschrot, Sojaöl, Maisstärke, Weizenmehl, Fischmehl, Cellulose, kristalline essentielle Aminosäuren und Mineralien und Vitamine als Premixe verwendet. Diese Mischung wurde anschließend batchweise in 20 kg Ansätzen jeweils mit den in der Tabelle 5 aufgeführten Methioninderivaten mit 0,25% Supplementie- rungsrate (bezogen auf Schwefeläquivalente) supplementiert, homogenisiert und anschließend unter Dampfbehandlung pelletiert. Als Vergleich zu Methionylmethionin (I) wurde je ein Pelletierungsversuch mit DL-Methionin, MHA (Methionin Hydroxy Analoges) und Calcium-MHA gemacht. Als Kontrollversuch wurde zudem eine Pelletierung ohne Zugabe eines Methi- oninderivats durchgeführt (siehe Tabelle 5) .
Tabelle 5
Figure imgf000054_0001
Während des gesamten Pelletierungsprozesses und Dampfbehandlung blieben alle Diastereomere von Methionylmethionin (I) stabil (siehe Tabelle 6) . Tabelle 6
Figure imgf000055_0001
(Ex: lösliche Bestandteile)
Dabei wurde die Aminosäurenbestimmung in Anlehnung an die EU-Methode 98/64/EC durchgeführt. Nach Extraktion der freien Aminosäuren und Methionylmethionin (I) wurden diese anschließend mit Hilfe eines Aminosäureanalysators durch Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin bestimmt (siehe Tabelle 6) . Anschließend wurde das Leachingverhalten der Diastereomere von Methionylmethionin (I) aus den Futterpellets unter Wasser untersucht. Dabei wurde das Herauslösen von Methionylmethionin unter Wasser in Abhängigkeit der Zeit, Temperatur, Wasserzusammensetzung (Salz- oder Süßwasser) bestimmt. Dazu wurden 20,0 g der Futterpellets in einen engmaschigen Siebbeutel gegeben und in einen Erlenmeyerkolben mit 200 g Wasser vollständig eingetaucht. Anschließend wurde gesamte Erlenmeyerkolben bei einer konstanten Temperatur von 200C mit einem Laborschüttelgerät kontinuierlich bewegt. In definierten Zeitabständen wurde dann jeweils eine Wasserprobe entnommen und der Gehalt der einzelnen Diastereomerenpaare von Methionylmethionin im Wasser mittels HPLC bestimmt (siehe Tabelle 7) .
Tabelle 7
Figure imgf000056_0001
Als Vergleich wurden jeweils die Futterpellets, die mit DL- Methionin, MHA bzw. Calcium-MHA supplementiert waren, unter den gleichen Bedingungen untersucht und damit deren Leachingverhalten unter Wasser unter den jeweiligen Bedingungen bestimmt (siehe Figur 5 und Tabelle 7) .

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von DL-Methionyl-DL-methionin und dessen
Salze als Futtermitteladditiv in Futtermittelmischungen für in Aquakulturen gehaltene Tiere.
2. Verwendung nach Anspruch 1 als Salz bevorzugt Kationen aus der Gruppe der Alkali- und Erdalklimetalle, sowie Ammonium, Cu2+, Zn2+ und Co2+.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Futtermittelmischung 0,01 bis 5 Gew.-%, bevorzugt 0,05 bis 0,5 Gew.-% DL-Methionyl-DL-methionin enthält.
4. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Futtermittelmischung Protein und Kohlehydrate enthält, vorzugsweise auf Basis von Fisch-, Soja- oder Maismehl, und mit essentiellen Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Vitaminen, Mineralien, Kohlenhydraten, Fetten und Ölen supplementiert sein kann.
5. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei DL-Methionyl-DL-methionin allein oder als Salz als DD/LL/LD/DL-Mischung, als DL/LD- oder DD/LL-Mischung vorliegt, bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit DL-Methionin, vorzugsweise mit einem DL- Methioninanteil von 0,01 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt von 1 bis 10 Gew.-%.
6. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wo- bei DL-Methionyl-DL-methionin als Enantiomerenpaar
DL/LD- Methionylmethionin vorliegt.
7. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die in Aquakulturen gehaltene Tiere Süß- und Salzwasserfische und -krustentiere sind, vorzugsweise aus- gewählt aus der Gruppe bestehend aus Karpfen, Forellen, Lachse, Welse, Barsche, Plattfische, Störe, Thunfische, Aale, Brassen, Dorsche, Shrimps, Krill und Prawns, ganz besonders für Silver- (Hypophthalmichthys molitrix) , Gras- (Ctenopharyngodon idella) , Schuppen-
(Cyprinus carpio) und Bigheadkarpfen (Aristichthys no- bilis) , Karausche (Carassius carassius) , Catla (Catla Catla) , Roho Labeo (Labeo rohita) , pazifischer und atlantischer Lachs (Salmon salar und Oncorhynchus ki- sutch) , Regenbogenforelle {Oncorhynchus mykiss) , amerikanischer Wels (Ictalurus punctatus) , afrikanischer Wels {Ciarias gariepinus) , Pangasius (Pangasius bo- courti und Pangasius hypothalamus) , Niltilapie (Ore- ochromis niloticus) , Milchfisch (Chanos chanos) , Cobia
(Rachycentron canadum) , Whiteleg Shrimp (Litopenaeus vannamei) , Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon) und Giant River Prawn (Macrobrachium rosenbergii) .
Verfahren zur Herstellung von DL-Methionyl-DL- methionin (I) mit der Formel
Figure imgf000058_0001
(i:
unter Umsetzung eines Harnstoffderivates der allgemeinen Formel II,
Figure imgf000058_0002
(ii: wobei die Reste R1 und R2 in den Harnstoffderivaten IIa, IIb, Hc, Hd, He, Hf und Hg wie folgt definiert sind: wobei IIa: R1 = COOH, R2 = NHCONH2
Hb: R1 = CONH2, R2 = NHCONH2
Hc: R1 = CONH2, R2 = NH2
Hd: R1^-R2 = -CONHCONH-
He: R1 = CN, R2 = OH
Hf: R1 = CN, R2 = NH2
Hg: R1 = =0, R2 = H
bedeutet, zu DL-Methionyl-DL-methionin .
9. Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei Methioninhydan- toin als Ausgangsprodukt verwendet wird oder als Zwi- schenprodukt gebildet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei eine Methio- ninhydantoin und Wasser enthaltende Lösung mit Methio- nin unter basischen Bedingungen umgesetzt wird.
11. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der pH-Wert der das Harnstoffderivat enthaltenden Lösung auf 8 bis 14, bevorzugt auf 10 bis 13 eingestellt wird.
12. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Umsetzung bei einer Temperatur von 50 bis 2000C, bevorzugt bei einer Temperatur von 80 bis 1700C und besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 130 bis 160 °C erfolgt.
13. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Umsetzung unter Druck, bevorzugt bei einem Druck von 3 bis 20 bar, besonders bevorzugt bei einem Druck von 6 bis 15 bar durchgeführt wird. 14. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 13, wobei eine Methioninhydantoin und Wasser enthaltende Lösung zuvor aus einer oder mehrerer der Verbindungen IIa, IIb, Hc, Hd, He, Hf und Hg gebildet worden ist. 15. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 13, wobei Methioninhydantoin durch Umsetzung der Verbindung He oder Hf mit einer Stickstoff haltigen Base, NH4HCO3, (NH4) 2CO3, NH4OH/CO2-Mischung oder Carbamatsalze erhalten wird.
16. Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Umsetzung der Verbindung He bei einer Temperatur von 00C bis 1500C, vorzugsweise 00C bis 1000C und besonders bevorzugt von 10°C bis 70°C durchgeführt wird.
17. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 13, wo- bei Methioninhydantoin durch Umsetzung der Verbindung
Hf mit CO2 erhalten wird.
18. Das Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Umsetzung in Anwesenheit einer Base erfolgt, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe enthaltend KHCO3, K2CO3, tertiäre Amine oder deren Salze, Alkali- und Erdalkalibasen.
19. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 13, wobei Methioninhydantoin durch Umsetzung der Verbindung Hg mit einer Cyanidionenquelle und einer Base ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Stickstoff haltige Ba- sen, Ammoniumsalze in Gegenwart von CO2, NH4HCC>3,
(NH4) 2CO3, NH4OH/CO2-Mischung und Carbamatsalze, erhalten wird.
20. Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Umsetzung bei einer Temperatur von -200C bis 1500C, vorzugsweise -100C bis 1000C und besonders bevorzugt von 00C bis 700C durchgeführt wird.
21. Das Verfahren nach Anspruch 8 umfassend die folgenden Schritte :
a) Umsetzung des Harnstoffderivates gemäß den Formeln IIa, IIb, Hc, Hd, He, Hf und Hg zu einem Diketopiperazin (III) der Formel
Figure imgf000061_0001
(III) b) Umsetzung des Diketopiperazins (III) zum DL- Methionyl-DL-methionin (I) .
22. Das Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Umsetzung des Harnstoffderivates zum Diketopiperazin bei einer Temperatur von 50°C bis 2000C, vorzugsweise von 1000C bis 180°C und besonders bevorzugt von 140°C bis 170°C durchgeführt wird.
23. Das Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Umsetzung des Harnstoffderivates zum Diketopiperazin unter Druck, bevorzugt bei einem Druck von 3 bis 20 bar, besonders bevorzugt bei einem Druck von 6 bis 15 bar durchgeführt wird.
24. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Umsetzung des Harnstoffderivates zum Diketopiperazin in Gegenwart einer Base erfolgt.
25. Das Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Base ausgewählt ist aus der Gruppe Stickstoff haltiger Basen, NH4HCO3, (NH4) 2CO3, KHCO3, K2CO3, NH4OH/CO2-Mischung, Car- bamatsalze, Alkali- und Erdalkalibasen. 26. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 25, wobei die Umsetzung des Harnstoffderivates zum Diketo- piperazin durch Reaktion mit Methionin erfolgt.
27. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 26, wobei die Umsetzung des Diketopiperazin zum DL- Methionyl-DL-methionin durch saure Hydrolyse erfolgt.
28. Das Verfahren nach Anspruch 27, wobei die saure Hydrolyse in Gegenwart einer Säure erfolgt, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Mineralsäuren, HCl, H2CO3, CO2/H2O, H2SO4, Phosphorsäuren, Carbonsäuren und Hydro- xycarbonsäuren .
29. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 26, wobei die Umsetzung des Diketopiperazin zum DL- Methionyl-DL-methionin durch basische Hydrolyse erfolgt.
30. Das Verfahren nach Anspruch 29, wobei die basische Hydrolyse bei einem pH von 7 bis 14, besonders bevorzugt bei einem pH von 9 bis 12, ganz besonders bevorzugt bei einem pH von 10 bis 11 durchgeführt wird, um DL- Methionyl-DL-methionin zu erhalten.
31. Das Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei die basischen Bedingungen unter Verwendung einer Substanz eingestellt werden ausgewählt aus der Gruppe Stickstoff haltiger Basen, NH4HCO3, (NH4) 2CO3, NH4OH/CO2-Mischung, Carbamatsalze, KHCO3, K2CO3, Carbonate, Alkalibasen und Erdalkalibasen.
32. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 27 bis 31, wobei die Umsetzung bei einer Temperatur von 500C bis 200°C, vorzugsweise 800C bis 1800C und besonders bevorzugt von 900C bis 1600C durchgeführt wird.
33. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 26, wobei die Umsetzung des Diketopiperazin zum DL- Methionyl-DL-methionin durch Einleiten von CO2 in eine basische Lösung, vorzugsweise in eine basische Ammonium-, Kalium- oder Natriumhydroxidlösung erfolgt.
34. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 33, wobei das Diketopiperazin vor der Hydrolyse isoliert wird.
35. Das Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Diketopiperazin durch Kristallisation aus der Reaktionslösung, bevorzugt bei einer Temperatur von -30 bis 1200C, ganz besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 10 bis 70°C isoliert wird.
36. Verfahren zur Isolation des Diastereomerengemisches aus DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin durch Kristallisation aus basischen Reaktionslösungen, die nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 20 und 29 bis 35 erhalten wurden. 37. Das Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Lösung mit einer Säure auf einen pH-Wert von 5 bis 9, bevorzugt auf einen pH-Wert von 5 bis 7, vorzugsweise auf einen pH-Wert von ca. 5,6 eingestellt wird.
38. Das Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, wobei die Kris- tallisation in Gegenwart einer Säure erfolgt, ausgewählt aus der Gruppe der Mineralsäuren, HCl, H2CO3, CO2/H2O, H2SO4, Phosphorsäuren, Carbonsäuren, Hydroxy- carbonsäuren .
39. Verfahren zur Isolation des Diastereomerengemisches aus DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin durch Kristallisation aus sauren Reaktionslösungen, die nach den Ansprüchen 27 oder 28 erhalten wurden.
40. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Lösung mit einer Base auf einen pH-Wert von 5 bis 9, bevorzugt auf einen pH-Wert von 5 bis 7, vorzugsweise auf einen pH- Wert von ca. 5,6 eingestellt wird. 41. Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, wobei die Base ausgewählt ist aus der Gruppe NH4HCO3, (NH4) 2CO3, Stickstoff haltige Basen, NH4OH, Carbamatsalze, KHCO3, K2CO3, Carbonate, Alkali- und Erdalkalibasen.
42. Verfahren zur Auftrennung des Diastereomerengemisches aus DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin durch fraktionierte
Kristallisation, wobei die beiden Enantiomerenpaare DD/LL-Methionylmethionin und DL/LD-Methionylmethionin erhalten werden.
43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei
a) durch Ansäuern der DD/LL/DL/LD-Methionylmethionin enthaltenden Suspension bis eine klare Lösung erhalten wird und durch schrittweises Versetzen der sauren Lösung mit einer Base bis ein Niederschlag ausfällt, DL/LD-Methionylmethionin als Nieder- schlag gewonnen wird, sowie
b) aus der aus Schritt a) erhaltenen Mutterlauge DD/LL-Methionylmethionin gewonnen wird.
44. Verfahren nach Anspruch 43, wobei in Schritt a) das Ansäuern mit einer Säure erfolgt und ein pH-Wert von 0,1 bis 1,0, vorzugsweise ein pH-Wert von ca. 0,6 eingestellt wird, und die erhaltene klare Lösung anschließend mit einer Base auf einen pH-Wert von 5 bis 6, vorzugsweise auf einen pH-Wert von ca. 5,6 eingestellt wird. 45. Verfahren nach Anspruch 43 oder 44, wobei als Säure Mineralsäuren, bevorzugt Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salzsäure oder Kohlensäure bzw. Kohlendioxid, besonders bevorzugt Kohlensäure bzw. Kohlendioxid, und/oder Carbonsäuren eingesetzt werden.
46. Verfahren nach Anspruch 43 oder 44, wobei die Base ausgewählt ist aus der Gruppe NH4HCO3, (NH4) 2CO3, Stick- Stoff haltige Basen, NH4OH, Carbamatsalze, KHCO3, K2CO3, Carbonate, Alkali- und Erdalkalibasen.
47. Verfahren nach Anspruch 42, wobei
a) durch Basischstellen der DD/LL/DL/LD-
Methionylmethionin enthaltenden Suspension bis eine klare Lösung erhalten wird und durch schrittweises Versetzen der basischen Lösung mit einer Säure bis ein Niederschlag ausfällt, DL/LD- Methionylmethionin als Niederschlag gewonnen wird, sowie
b) aus der aus Schritt a) erhaltenen Mutterlauge DD/LL-Methionylmethionin gewonnen wird.
48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei in Schritt a) das Basischstellen mit einer Base erfolgt und ein pH-Wert von 7,5 bis 14, vorzugsweise ein pH-Wert von ca. 9 bis 13 eingestellt wird, und die erhaltene klare Lösung anschließend mit einer Säure auf einen pH-Wert von 5 bis 6, vorzugsweise auf einen pH-Wert von ca. 5,6 eingestellt wird.
49. Verfahren nach Anspruch 47 oder 48, wobei die Base aus- gewählt ist aus der Gruppe NH4HCO3, (NH4) 2CO3, Stickstoff haltige Basen, NH4OH, Carbamatsalze, KHCO3, K2CO3, Carbonate, Alkali- und Erdalkalibasen.
50. Verfahren nach Anspruch 47 oder 48, wobei als Säure Mineralsäuren, bevorzugt Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salzsäure oder Kohlensäure bzw. Kohlendioxid, besonders bevorzugt Kohlensäure bzw. Kohlendioxid, und/oder Carbonsäuren eingesetzt werden.
51. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 42 bis 50, das bei einer Temperatur von 00C bis 1000C, vorzugsweise 5°C bis 600C und besonders bevorzugt von 100C bis 40°C durchgeführt wird. 52. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 42 bis 51, wobei das erhaltene DD/LL-Methionylmethionin racemisiert wird, und die beiden Enantiomerenpaare DD/LL- Methionylmethionin und DL/LD-Methionylmethionin voneinander getrennt werden.
53. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 52, wobei das Verfahren in einem wässrigen Medium durchgeführt wird.
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