MX2011003946A - Produccion y uso de metionilmetionina como aditivo alimenticio para peces y crustaceos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de DL-metionil-DL-metionina y sales de la misma como un aditivo para piensos en mezclas de piensos para animales reproducidos en acuicultivos, y a un método para producir DL-metionil-DLmetionina (I) que tiene la fórmula (I) (Ver fórmula (I)). al convertir un derivado de urea de la fórmula general (II) (Ver fórmula (II)). en DL-metionil-DL-metioni na, en donde los grupos R1 y R2 en los derivados de urea derivados de urea IIa, lIb, IIc, IId, Ile, IIf e IIg se definen como sigue: IIa: R1 = COOH, R2 = NHCQNH2, IIb: R1 = CONH2, R2 = NHCONH2, lIc: R1 = CONH2, R2 = NH2, lId: R1-R2 = -CONHCONH-, Ile: R1 = CN, R2 = OH,IIf: R1 = CN, R2 = NH2, IIg: R1 = =0, R2 = H.

Description

PRODUCCION Y USO DE METIONILMETIONINA COMO ADITIVO ALIMENTICIO PARA PECES Y CRUSTACEOS Campo de la invención La presente invención se refiere a novedosas síntesis químicas de metionilmetionina, al dipéptido de metionina y al uso específico de las mismas como aditivo para alimentos solo o mezclado con metionina o para la nutrición de peces y crustáceos.

Antecedentes de la invención Los aminoácidos esenciales (EAA) tales como metionina, lisina o treonina son constituyentes muy importantes como aditivos para piensos en la nutrición de animales y juegan una parte significativa en la crianza comercial de animales productivos tales como, por ejemplo, pollos, cerdos y rumiantes. La suplementación de fuentes proteicas naturales tales como, por ejemplo, soya, maíz y trigo con EAAs hace posible por un lado que los animales crezcan más rápido, o que la producción de leche sea más alta en vacas lecheras de alta producción, pero por otro lado para la que la utilización del pienso sea más eficiente. Esto representa una ventaja comercial muy grande. Los mercados para los aditivos para piensos son de gran importancia industrial y comercial. Además, son mercados de alto crecimiento, atribuible no sólo a la importancia cada vez más REF . : 219099 alta de países tales como, por ejemplo, China e India.

L-metionina (ácido (S) -2-amino-4-metiltiobutírico) representa el primer aminoácido limitante para muchas especies tales como pollos, patos, pavos y también para muchos peces y especies de crustáceos y por lo tanto juega una parte muy significativa en la nutrición de animales y como un aditivo para piensos (Rosenberg et al., J. Agr . Food Chem. 1957, 5, 694-700 y Lovell, T. . , J. Anim. Sci . 1991, 69, 4193-4200). Sin embargo, en la síntesis química clásica, la metionina resulta como racemato, una mezcla 50:50 de D- y L-metionina. Esta DL-metionina racémica puede, sin embargo, ser empleada directamente como aditivo para piensos toda vez que en algunas especies está bajo condiciones in vivo un mecanismo de transformación que convierte al enantiómero D no natural de metionina en el enantiómero L natural. Esto implica antes que nada que la D-metionina sea desaminada con la ayuda de una D-oxidasa no especifica a a-cetometionina, y posteriormente que sea transformada más con una L-transaminasa en L-metionina (Baker, D.H. en "Amino acids in farm animal nutrition", D' Mello, J.P.F. (ed.), Wallingford (Reino Unido), CAB International, 1994, 37-61). La cantidad disponible de L-metionina en el cuerpo es incrementada de esta manera y puede entonces estar disponible para el crecimiento del animal. La transformación enzimática de D-en L-metionina ha sido detectada en pollos, cerdos y vacas, pero especialmente también en peces carnívoros y omnívoros y también en camarones y langostinos. De esta manera, por ejemplo, Sveier et al. (Aquacult, Nutr. 2001, 7 (3), 169-181) y Kim et al. (Aquaculture 1992, 101 (1-2), 95-103) fueron capaces de mostrar que la transformación de D- en L-metionina es posible en salmón del atlántico y trucha arcoíris carnívoros. Robinson et al. (J. Nutr. 1978, 108 (12), 1932-1936) y Schwarz et al. (Aquaculture 1998, 161, 12-129) fueron capaces de demostrar lo mismo para especies de peces omnívoros tales como, por ejemplo, bagre y carpa. Además, Forster y Dominy (J. World Aquacult. Soc . 2006, 37 (4), 474-480) fueron capaces de demostrar en experimentos de alimentación en camarones omnívoros de la especie Litopenaeus vannamei que DL-metionina tiene la misma actividad que L-metionina .

La producción mundial en 2007 de DL-metionina cristalina y análogo hidroxi de metionina líquido y racémico (MHA, ácido rae- 2 -hidroxi-4- (metiltio) butanoico (HMB) ) y MHA de calcio sólido fue de más de 700,000 toneladas, lo cual se empleó exitosamente de manera directa como aditivo para piensos en animales monogástricos tales como, por ejemplo, aves de corral y cerdos. Debido al rápido desarrollo comercial de la crianza de peces y crustáceos en acuicultivos altamente industrializados, en años recientes una opción de suplementacion con metionina óptima, económica y eficiente se ha vuelto cada vez más importante precisamente en esta área (Food and Agriculture Organization of the United Nation (FAO) Fisheries Department "State of World Aquaculture 2006", 2006, Rome, International Food Policy Research Institute (IFPRI) "Fish 2020: Supply and Demand in Changing Markets" , 2003, Washington, D.C.). Sin embargo, en contraste con pollos y cerdos, ocurren varios problemas con el uso de la metionina, MHA o Ca-MHA como aditivo para piensos en ciertas variedades de peces y crustáceos. Así, Rumsey y Ketola (J. Fish, Res. Bd. Can. 1975, 32, 422-426) reportan que el uso de harina de soya en conjunto con aminoácidos cristalinos individualmente suplementados no llevó a ningún incremento en el crecimiento de trucha arcoíris. Murai et al. (Bull. Japan. Soc . Sci. Fish. 1984, 50, (11), 1957) fueron capaces de demostrar que la alimentación diaria de dietas para peces con altas cantidades de aminoácidos cristalinos suplementados en carpa llevó a que más de 40% de los aminoácidos libres fueran excretados por medio de las agallas y ríñones. Debido a la rápida absorción de aminoácidos suplementados justamente después del consumo del pienso, existe una elevación muy rápida en la concentración de aminoácidos en el plasma sanguíneo del pez (respuesta rápida) . Sin embargo, en este tiempo, los demás aminoácidos de las fuentes proteicas naturales tales como, por ejemplo, harina de soya aún no están presentes en el plasma, llevando posiblemente a asincronía de la disponibilidad concurrente de todos los aminoácidos importantes. Como resultado de lo mismo, parte de los aminoácidos altamente concentrados es rápidamente excretada rápidamente metabolizada en el cuerpo, y se usa por ejemplo como fuente de energía pura. Como resultado, existe sólo un ligero o ningún incremento en el crecimiento de, después del uso de aminoácidos cristalinos como aditivos para piensos (Aoe et al., Bull . Jap. Carp Soc . Sci . Fish. 1970, 36, 407-413). La suplementación de aminoácidos cristalinos puede llevar a problemas adicionales en crustáceos. El lento comportamiento alimenticio de ciertos crustáceos tales como, por ejemplo, camarones de la especie Litopenaeus Vannamei se traduce, debido al largo tiempo de residencia del pienso bajo el agua, en que los aminoácidos complementados e hidrosolubles sean disueltos (lixiviados) , llevando a la eutroficación del agua y no a un incremento en el crecimiento de los animales (Alam et al., Aquaculture 2005, 248, 13-16) .

Suplementar eficientemente peces y crustáceos mantenidos en acuicultivos requiere entonces, para ciertas especies y aplicaciones, una forma de producto de metionina específica, tal como, por ejemplo, una metionina -protegida química o físicamente en forma adecuada. El propósito de esto es por un lado que el producto permanezca suficientemente estable en el ambiente acuoso durante la alimentación y no se disuelva del pienso. Por otro lado, que el producto metionina eventualmente absorbido por el animal pueda ser utilizado óptimamente y con alta eficiencia en el cuerpo del animal .

Se han hecho muchos esfuerzos en el pasado por desarrollar aditivos para piensos adecuados, particularmente con base en metionina, para peces y crustáceos. Así, por ejemplo, W08906497 describe el uso de di- y tripéptidos como aditivo para piensos para peces y crustáceos. La intención de esto es promover el crecimiento de los animales. Sin embargo, los di- y tripéptidos empleados de preferencia en este caso provenían de aminoácidos no esenciales y por lo tanto tampoco no limitativos tales como, por ejemplo, glicina, alanina y serina. Los únicos dipéptidos que contienen metionina descritos son DL-alanil-DL-metionina y DL-metionil -DL-glicina . Sin embargo, esto significa que efectivamente sólo 50% de la sustancia activa (mol/mol) está presente en el dipéptido, y esto debe clasificarse como muy inadecuado desde el punto de vista de economía. O2088667 describe la síntesis enantioselectiva y uso de oligómeros de MHA y aminoácidos tales como, por ejemplo, metionina como aditivos para alimentos, entre otros también para peces y crustáceos. Se dice que es posible lograr un crecimiento más rápido de esta manera. Los oligómeros descritos son ensamblados por una reacción catalizada con enzimas y exhiben una distribución muy amplia de las longitudes de cadena de los oligómeros individuales. Esto hace al proceso no selectivo, costoso y elaborado en el procedimiento y purificación. Dabro ski et al. describe en US20030099689 el uso de péptidos sintéticos como aditivos para piensos para promover el crecimiento de animales acuáticos. En este caso, la proporción de los péptidos en la formulación de pienso completa puede ser de 6-50% en peso. Los péptidos sintéticos consisten de preferencia en aminoácidos esenciales y limitantes. Sin embargo, la síntesis de estos oligo- y polipéptidos sintetizados es muy elaborada, costosa y difícil de convertir a escala industrial. Además, la efectividad de los polipéptidos de un solo aminoácido es cuestionada, toda vez que éstos se convierten comúnmente sólo de manera muy lenta o en absoluto bajo condiciones fisiológicas en aminoácidos libres. Asi, por ejemplo, Baker et al. (J. Nutr. 1982, 112, 1130-1132) describe la falta de valor biológico de poli-L-metionina en pollos debido a la insolubilidad absoluta en agua, toda vez que la absorción por el cuerpo es imposible .

Aparte del uso de novedosos derivados químicos de metionina tales como, por ejemplo, péptidos y oligómeros que contienen metionina, también ha habido investigación de varias posibilidades de protección .física tales como, por ejemplo, recubrimientos y la incorporación de un aminoácido en una matriz protectora. De esta manera, por ejemplo, Alam et al. (Aquacult. Nutr. 2004, 10, 309-316 y Aquaculture 2005, 248, 13-19) fueron capaces de demostrar que metionina y lisina recubiertas tienen, en contraste con no recubiertas, una influencia muy positiva en el crecimiento de camarones kuruma jóvenes. Aunque el uso de un recubrimiento específico fue capaz de suprimir el lixiviado de metionina y lisina fuera del gránulo de pienso, existen serias desventajas. La preparación o el recubrimiento de metionina normalmente representa un proceso técnicamente complicado y elaborado y es por lo tanto costoso. Además, el recubrimiento superficial de la metionina después del recubrimiento es fácilmente dañado por el estrés mecánico y la abrasión durante el procesamiento del pienso, llevando posiblemente a una disminución o pérdida completa de la protección física. Un factor adicional es que el contenido de metionina se reduce, y de esta manera comúnmente se vuelve no económico, por un recubrimiento o uso de una sustancia de matriz.

A pesar del novedoso uso inventivo de DL-metionil-DL-metionina como aditivo para piensos con bajas características de lixiviado a partir de los gránulos y extruidos de pienso, y de un suministro óptimo de metionina al cuerpo a través de un corte de liberación lenta de metionilmetionina, también ha sido posible desarrollar procesos nuevos para preparar metionilmetionina que tienen muchas ventajas sobre las variantes de preparación descritas en la literatura. La mayoría de las síntesis de dipéptidos descritas en la literatura usan grupos protectores costosos tales como, por ejemplo, grupos protectores Boc-(ter-butoxicarbonilo) o Z- (benciloxicarbonilo) , los cuales tienen que ser unidos al aminoácido adecuado antes de la síntesis del dipéptido real, y posteriormente eliminados de nuevo. Además, la activación de los aminoácidos con los que se acoplarán es normalmente necesaria. Así, metionilmetionina puede prepararse al acoplar N-Boc-metionina con el éster metílico de metionina usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) . Las grandes desventajas de este proceso de preparación son el uso de grupos protectores costosos, una síntesis muy elaborada y reactivos de acoplamiento costosos que no pueden ser reciclados, tales como, por ejemplo, DCC. Otra alternativa para la síntesis industrial de metionilmetionina se describe en DE2261926. 3 , 6-Bis [2-metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (metioninadiceto-piperazina, DKP) se forma en la primera etapa al calentar el éster isopropílico de metionina y luego se hidroliza en metionilmetionina. Rendimientos simplemente satisfactorios de 62-65% fueron posibles para la etapa de hidrólisis en este caso. Además, el uso de éster isopropílico de metionina como material de partida también es muy costoso y por lo tanto no económico.

Breve descripción de la invención Un objetivo general era proporcionar un producto alimenticio o un aditivo para piensos para la nutrición de animales con base en un nuevo sustituto de metionina que pudiera emplearse solo o como mezcla con metionina especialmente en el sector de crianza industrial de peces y crustáceos en acuicultivos . Se intentaba al mismo tiempo desarrollar una síntesis química simple y económica de éste novedoso sustituto de metionina.

En vista de las desventajas de la técnica anterior, era el objetivo en particular proporcionar un producto de metionina químicamente protegido para varias especies de peces y crustáceos omnívoros, herbívoros y carnívoros que viven en agua salda o dulce. Se intentaba en particular que este producto mostrara características de baja solubilidad (lixiviado) del granulo o extruido de peso completo en agua y poseyera un mecanismo de liberación lenta, es' decir, una liberación lenta y continua de metionina libre bajo condiciones fisiológicas. Además, se intentaba también que el novedoso producto de metionina se empleara adecuadamente como mezcla con DL-metionina .

Un objetivo más era encontrar un sustituto de metionina como alimento o un aditivo para piensos que tuviera un valor biológico muy alto y que estuviera diseñado para ser fácil de manejar y almacenar y tuviera adecuada estabilidad bajo las condiciones usuales del procesamiento de piensos en compuesto, especialmente "granulación y extrusión.

Se intentaba de esta manera proporcionar a los peces y crustáceos una fuente de metionina más eficiente, aparte de DL-metionina cristalina, la cual exhibiera si era posible las desventajas de los productos conocidos sólo en un grado reducido o en absoluto.

Se intentaba además desarrollar una novedosa y flexible ruta de síntesis para metioninmetionina (DL-metionil -DL-metionina) en la cual los precursores típicos y subproductos del proceso de producción de DL-metionina industrial pudieran usarse como material de partida. También se intentaba desarrollar un proceso adecuado para separar los pares de diastereómeros DD/LL- y DL/LD-metionilmetionina , de tal manera que un uso óptimo y eficiente sólo de un par de diastereómeros (DL/LL-I o DL/LD-I) fuera posible para aplicaciones específicas.

El objetivo se logra mediante el uso de DL-metionil -DL-metionina y sales de la misma como aditivo para piensos en mezclas de piensos para animales mantenidos en acuicultivos .

De una manera preferida, la mezcla para pienso comprende de 0.01 a 5% en peso, y de preferencia comprende de 0.05 a 0.5% en peso de DL-metionil-DL-metionina .

El uso de DL-metionil-DL-metionina probó ser particularmente adecuado en este aspecto debido a que el compuesto muestra excelentes características de lixiviado gracias a la baja solubilidad de la mezcla de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina y del par de diastereómeros DL/LD-metionilmetionina (0.4 g/1) .

El compuesto muestra además adecuada estabilidad en granulación y extrusión durante la producción del pienso. DL-metionil -DL-metionina es estable en mezclas con componentes y productos alimenticios convencionales tales como, por ejemplo, cereales (por ejemplo, maíz, trigo, tritical, cebada, mijo, entre otros), fuentes proteicas vegetales o animales (por ejemplo, soya y semilla de colza y los productos del procesamiento de los mismos, legumbres (por ejemplo, chícharos, frijoles, lupinos, etc.), harina de pescado, entre otros) y en combinación con aminoácidos, proteínas, péptidos, carbohidratos, vitaminas, minerales, grasas y aceites esenciales suplementados .

Es además adecuado que, un mol de agua se ahorra por mol de metionilmetionina en comparación con DL-metionina gracias al alto contenido de sustancias activas de metionilmetionina por kg de sustancia.

En un uso preferido, la mezcla para pienso comprende proteínas y carbohidratos, de preferencia a base de harina de pescado, harina de soya o harina de maíz, y se puede complementar con aminoácidos, proteínas, péptidos, vitaminas, minerales, carbohidratos, grasas y aceites esenciales .

Se prefiere particularmente que la DL-metionil-DL-metionina esté presente en la mezcla para piensos únicamente como mezcla DD/LL/LD/DL, como mezcla DL/LD o DD/LL, de preferencia en cada caso mezclada además con DL-metionina, de preferencia con un contenido de DL-metionina de 0.01 a 20% en peso, de manera particularmente preferible de 1 a 10% en peso .

En un uso que se prefiere particularmente, DL-metionil -DL-metionina está presente como un par DL/LD-metionilmetionina de enantiómeros.

En un uso preferido, los animales mantenidos en acuicultivos son peces y crustáceos de agua dulce y salada seleccionados del grupo que consiste en carpa, trucha, salmón, bagre, perca, platija, esturión, atún, anguilas, brema, bacalao, camarones, krill y langostinos, muy preferiblemente para carpa plateada (Hypophthalmichthys molitrix) , carpa china (Ctenopharyngodon idella) , carpa común {Cyprinus carpió) y carpa cabezona (Aristichthys nobilis) , carasio (Carassius carassius) , catla {Catla Catla) , rojo labeo (Lajbeo rohita) , salmón del pacífico y atlántico (Salmón salar y Oncorhynchus kisutch) , trucha arcoíris {Oncorhynchus mykiss) , bagre americano (Ictalurus punctatus) , bagre africano (Ciarías garepinus) , pangasio (Pangasius bocourti y Pangasius hypothalamus) , tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) , sabalote (chanos Chanos) , cobia {Rachycentrón canadum) , camarón patiblanco (Litopenaeus vannamei) , camarón tigre negro {Penaeus monodon) y langostino de río gigante (Macrobrachium rosenbergii) .

De acuerdo con la invención, DL-metionil-DL-metionina (I) (metionilmetionina o Met-Met para abreviar) o sus sales de metal alcalino o metal alcalinotérreo tales como, por ejemplo, la sal calcio o zinc individualmente soluble se usa como adición en mezclas para piensos como una mezcla de diastereómeros DD/LL/DL/LD, DD/LL o DL/LD, sola o mezclada con DL-metionina, de preferencia para peces y crustáceos : (I) Existen cuatro estereoisómeros (diastereómeros) diferentes del dipéptido DL-metionil-DL-metionina (I), DD-, LL, DL- y LD-I, de los cuales sólo L-metionil-L-metionina (LL-I) es natural, todos los demás tres dipéptidos L-metionil-D-metionina (LD-I) , D-metionil-L-metionina (DL-I) y D-metionil-D-metionina (DD-I) son no naturales (véase esquema de reacción 1) .

(DL-I) (LD-I) Esquema de reacción 1 A este respecto, DD-I y LL-I están relacionados unos con otros como una imagen y como una imagen idéntica, es decir, son enantiómeros y de esta manera tienen las mismas propiedades físicas. Lo mismo aplica al par DL-I y LD-I.

Los dos pares DD/LL-I y DL/LD-I son en contraste diastereómeros uno del otro, es decir, tienen datos físicos diferentes. Así, por ejemplo, el par DD/LL-I de diastereómeros tiene una solubilidad de 21.0 g/1 en agua a temperatura ambiente en agua, mientras que la solubilidad del par DL/LD-I de diastereómeros es 0.4 g/1.

Aparte del desarrollo de métodos sintéticos novedosos para met ioni lmet ionina , la presente invención se refiere al uso del DL-metionil -DL-metionina como producto alimenticio como una mezcla de diast ereómeros DD/LL/DL/LD, DD/LL o DL/LD para promover el crecimiento de peces y crustáceos omnívoros, carnívoros y herbívoros en acuicul t ivos . Haciendo entonces posible mostrar de manera inventiva que DL-met ioni 1 -DL -met ionina (I) puede ser cortada bajo condiciones fisiológicas enz imát icamente por peces y crustáceos a D- y L-metionina libre (esquema de reacción 2) (véanse también ejemplos 22 a 24) . Para este propósito, las enzimas digestivas correspondientes han sido aisladas de carpa (omnívoro), trucha (carnívoro) y camarón patiblanco (omnívoro) y hechas reaccionar con DL-metionil -DL-metionina en experimentos ín vitro optimizados bajo condiciones fisiológicamente comparables. La particular característica de acuerdo con la invención del corte de DL-metionil -DL-met ionina (I) es que todos los cuatro diastereómeros posibles, tanto el LL-I natural, como los tres diastereómeros no naturales DD-, DL- y LD-I pueden ser cortados bajo condiciones fisiológicas. Esto aplica tanto al uso de la mezcla completa de todos los diastereómeros (DD/LL/DL/LD-!) , como en cada caso a los dos pares de diastereómeros DD/LL-I y DL/LD-I (véase figura 1) .

D-Metionina Trans- aminación H2 S ^ C02H L-Metionina Esquema de reacción 2 Sin embargo, el corte de los diastereómeros individuales de metionilmetionina tiene lugar a diferentes velocidades. Esto se ilustra por la representación diagramática del corte enzimático de los diastereómeros individuales de metionilmetionina con enzimas digestivas de peces y crustáceos en la figura 2. Sin embargo, el corte retrasado significa que la liberación de D- y L-metionina es igualmente retrasado también (véase figura 3) . Esto tiene la gran ventaja de que no puede haber una absorción de rápida respuesta de D- o L-metionina libre en el tracto digestivo y de esta manera ningún máximo de concentración de metionina libre en el plasma sanguíneo tampoco.

La ventaja de usar metionilmetionina como aditivo para piensos y fuente de metionina es entonces que D- o L-metionina puede ser liberada en el cuerpo durante el periodo de digestión completo y de esta manera procede de manera sincronizada con la liberación de otros aminoácidos derivados de fuentes proteicas naturales (mecanismo de liberación lenta) (véase figura 3). Este efecto especial se traduce en que la disponibilidad simultánea de todos los aminoácidos importantes y esenciales en una proporción ideal en el plasma sanguíneo sea asegurada, y es absolutamente necesario para un crecimiento óptimo del cuerpo.

En el corte enzimático del dipéptido DL-metionil-DL-metionina (I, la D-metionina no natural es también liberada además de la L-metionina natural (véase esquema de reacción 2) . La primera puede ser transaminada enzimáticamente tanto por peces y crustáceos de agua salada y dulce carnívoros, omnívoros y herbívoros para dar L-metionina natural. Fue posible mostrar esto para el ejemplo de la carpa en el ejemplo 25. Fue posible con la ayuda de un coctel enzimático de enzimas digestivas y hepáticas de carpa transformar D- en L-metionina bajo condiciones fisiológicamente correspondientes (véase figura 4) . Un suministro óptimo de L-metionina natural al cuerpo se asegura entonces después del uso de DL-metionil -DL-metionina (I).

Los experimentos de granulación y extrusión con varias mezclas de DL-metionil -DL-metionina (I) y fuentes de proteínas y carbohidratos naturales tales como, por ejemplo, harina de pescado, maíz y soya, y mezcladas con otros aminoácidos, proteínas, péptidos, vitaminas, minerales, grasas y aceites esenciales, muestran que DL-metionil-DL-metionina (I) es absolutamente estable durante y después del proceso de producción y no ocurre degradación o descomposición en absoluto (véase ejemplo 26) .

Para poder investigar las características de lixiviado de los diastereómeros de metionilmetionina (I) a partir de gránulos de pienso en compuesto bajo el agua, la dependencia de tiempo de la disolución de metionilmetionina fue medida (véase ejemplo 26) . Por comparación, las características de lixiviado de DL-metionina, MH y calcio-MHA (MHA-Ca) fueron investigadas bajo condiciones idénticas. Surgió a partir de esto que tanto la mezcla completa de todos los diastereómeros (DD/LL/DL/LD- I ) como los pares de diastereómeros DD/LL-I y DL/LD-I muestran lixiviado distintamente inferior que DL-metionina, MHA y calcio-MHA (MHA-Ca) (véase figura 5) . Mucho menos metionilmetionina se disuelve entonces fuera de los gránulos para pienso con el tiempo que con todos los demás derivados de metionina. índices de lixiviado particularmente bajos se muestran por el par DL/LD-I de diastereómeros, un máximo de sólo 5% de los cuales se disolvió de los gránulos de pienso incluso después del tiempo de residencia de 200 minutos (véase figura 5) .

El objetivo e logra además mediante un proceso para preparar DL-metionil-DL-metionina (I) con la fórmula (i) al hacer reaccionar un derivado de urea de la fórmula II (II) en donde los radicales R1 y R2 en los derivados de urea lia, Ilb, lie, lid, lie, Ilf e Ilg se definen como sigue: en donde Ha: R1 = COOH, R2 = NHC0NH2 Ilb: R1 = C0NH2, R2 = NHCONH2 lie: R1 = CONH2, R2 = NH2 lid: Rx-R2 = -CONHCONH- Ile: R1 = CN, R2 = OH Ilf: R1 = CN, R2 = NH2 Ilg: R1 = =0, R2 = H para dar DL-metionil-DL-metionina (I) .

En una modalidad el proceso de la invención se prefiere además que se use metioninahidantoína (lid) como material de partida o que se forme como producto intermedio. En este proceso, DL-metionil-DL-metionina es sintetizada directamente de metioninahidantoína e incluye los métodos H y J mostrados en el esquema de reacción 3.

Método A para Me, He y llf DD/LL-I DL/LD-I Esquema de reacción 3 Se prefiere a este respecto que una solución que comprenda metioninhidantoina y agua se haga reaccionar con metionina bajo condiciones básicas. Se prefiere además que el pH de la solución que comprende el derivado de urea se ajuste de 8 a 14, de preferencia de 10 a 13.

En una modalidad preferida, la reacción tiene lugar a una temperatura de 50 a 200°C, de preferencia a una temperatura de 80 a 170 °C y de manera muy preferible a una temperatura de 130 a 160°C.

Se prefiere además que la reacción se lleve a cabo bajo presión, de preferencia bajo una presión de 3 a 20 bares, de manera particularmente preferible de 6 a 15 bares.

En un proceso preferido más, una solución que comprende metioninahidantoíha y agua ha sido previamente formada a partir de uno o más de los compuestos lia, Ilb, lie, lid, He, Ilf y Ilg.

En un proceso preferido más, metioninahidantoína se obtiene al hacer reaccionar el compuesto lie o Ilf con una base que contiene nitrógeno, NH4HCO3, (NH4)2C03, NH4OH/C02 mezcla o sales carbamato.

La reacción del compuesto lie se lleva a cabo de preferencia a una temperatura de 0°C a 150°C( de preferencia 0°C a 100°C y de manera particularmente preferible de 10°C a 70°C.

En un proceso preferido más, la metioninahidantoína se obtiene al hacer reaccionar el compuesto Ilf con C02. Se prefiere a este respecto que la reacción tenga lugar en presencia de una base, seleccionada de preferencia del grupo que comprende KHC03, K2C03, aminas terciarias o sales de las mismas, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

En un proceso preferido más, metioninhahidantoína se obtiene al hacer reaccionar el compuesto Ilg con una fuente iónica de cianuro y una base seleccionada del grupo que comprende bases que contienen nitrógeno, sales amonio en presencia de una mezcla de C02, NH4HC03, (NH4)2C03, NH4OH/C02 y sales carbamato. La reacción en este caso tiene lugar a una temperatura de preferencia de -20°C a 150°C, preferiblemente -10°C a 100°C y de manera particularmente preferible de 0°C a 70°C.

Una modalidad alternativa del proceso de la invención comprende las siguientes etapas: a) reacción del derivado urea de las fórmulas lia, Ilb, lie, lid, lie, Ilf e Ilg para dar una dicetopiperazina de la fórmula (III) b) reacción de la dicetopiperazina para dar DL-metionil-DL-metionina . Este proceso incluye los métodos A, B, C y D mostrados en el esquema de reacción 3. En este proceso, se forma dicetopiperazina (III) como intermediario.

Se prefiere a este respecto que la reacción de los derivados de urea de la dicetopiperazina que se llevará a cabo a una temperatura de 50°C a 200°C, preferiblemente de 100°C a 180°C y en forma particularmente preferible de 140°C a 170°C.

En un proceso preferido, la reacción del derivado de urea para dar la dicetopiperazina tiene lugar bajo presión, de preferencia bajo una presión de 3 a 20 bares, de manera particularmente preferible bajo una presión de 6 a 15 bares .

La reacción del derivado de urea para dar la dicetopiperazina tiene lugar de preferencia en presencia de una base. La base a este respecto se selecciona preferiblemente de bases que contienen nitrógeno, NHHC03, (NH4)2C03, KHC03, K2C03, mezcla de NH4OH/C02, sales carbamato, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

En un proceso preferido más, la reacción del derivado de urea para dar la dicetopiperazina tiene lugar mediante reacción con metionina. Una relación de derivado de urea a metionina de 1:100 a 1:0.5 se prefiere a este respecto .

En un proceso preferido más, la reacción de la dicetopiperazina para dar DL-metionil-DL-metionina tiene lugar mediante hidrólisis ácida. La hidrólisis ácida es en este caso llevada a cabo en presencia de un ácido que se selecciona de preferencia del grupo de ácidos minerales, HCl, H2C03, C02/H20, H2S04, ácidos fosfóricos, ácidos carboxílieos y ácidos hidroxi carboxílieos .

En otra modalidad del proceso de la invención, la reacción de la dicetopiperazina para dar DL-metionil-DL-metionina tiene lugar mediante hidrólisis básica. En este caso, la hidrólisis básica se lleva a cabo de preferencia a un pH de 7 a 14, de manera particularmente preferible a un pH de 9 a 12, de manera muy particularmente preferible a un pH de 10 a 11, para obtener de esta manera DL-metionil-DL-metionina. Es además posible que las condiciones básicas se ajusten usando una sustancia que se seleccione de preferencia del grupo de bases que contienen nitrógeno, NH4HC03, (NH4)2C03, mezcla de NH4OH/C02, sales carbamato, KHC03, K2C03, carbonatos, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

La hidrólisis ácida o básica se lleva a cabo de preferencia a temperaturas de 50°C a 200°C, preferiblemente de 80°C a 180°C y de manera particularmente preferible de 90°C a 160°C.

En una modalidad más, la reacción de la dicetopiperazina para dar DL-metionil-DL-metionina se lleva a cabo al introducir C02 en una solución básica, de preferencia en una solución básica de hidróxido de amonio, hidróxido de potasio o hidróxido de sodio.

En un proceso preferido, la dicetopiperazina es aislada antes de la hidrólisis. Se prefiere a este respecto que la dicetopiperazina sea aislada mediante cristalización a partir de la solución de reacción, de preferencia a una temperatura de -30 a 120°C, de manera particularmente preferible a una temperatura de 10 a 70°C.

Para aislar la mezcla de diastereómeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina a partir de soluciones . de reacción básicas, se acidifican y la metionilmetionina se obtiene mediante cristalización o precipitación. Se prefiere a este respecto que el pH sea de 5 a 9, de manera particularmente preferida que el pH sea de 5 a 7 , y en forma muy particularmente preferida que el pH sea de alrededor de 5.6. Es posible a este respecto usar ácidos preferiblemente del grupo de ácidos minerales, HCl , H2C03, C02/H20, H2S04, ácidos fosfóricos, ácidos carboxílieos y ácidos hidroxi carboxílieos para la acidificación.

Para aislar la mezcla de diastereómeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina a partir de soluciones de reacción ácidas, se añaden bases para neutralizar, y la metionilmetionina se obtiene mediante cristalización o precipitación. A este respecto se prefiere que el pH sea de 5 a 9, se prefiere particularmente que el pH sea de 5 a 7 y se prefiere de manera muy particular que el pH sea de alrededor de 5.6. Las bases usadas en este caso para la neutralización son de preferencia del grupo de NH4HC03, (NH4) 2C03 , bases que contienen nitrógeno, NH4OH, sales carbamato, KHC03, K2C03, carbonatos, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

La invención proporciona además un proceso para fraccionar la mezcla de diastereómeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina mediante cristalización fraccional, obteniendo así los dos pares de enantiómeros DD/LL-metionilmetionina y DL/LD-metionilmetionina.

En una modalidad preferida del proceso de cristalización fraccional por acidificación, el procedimiento es el siguiente: a) acidificación de la suspensión que contiene DD/LL/DL/LD-met ionilmetionina hasta que se obtenga una solución transparente, y adición gradual de una base a la solución ácida hasta que un precipitado se separe y dé como resultado DL/LD-met ionil -metionina como precipitado. b) DD/LL-met ionilmetionina se obtiene a partir del licor madre obtenido en la etapa a) .

Se prefiere particularmente a este respecto que la acidificación en la etapa a) tenga lugar con un ácido y que se ajuste un pH de 0.1 a 1.0, de preferencia a un pH de alrededor de 0.6, y que la solución transparente resultante sea posteriormente ajustada con una base a un pH de alrededor de 5 a 6, de preferencia un pH de alrededor de 5.6. Es posible usar como ácido a este respecto ácidos minerales, de preferencia ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido carbónico, o dióxido de carbono, y/o ácido carboxílieos , especialmente los ácidos carboxílicos de Ci-C4, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónicio, ácido butírico o ácido isobutírico. Acido carbónico o dióxido de carbono se usa de manera muy particularmente preferida. Es posible en este caso que el ácido carbónico o dióxido de carbono se introduzca en la mezcla de reacción bajo presión atmosférica o bajo presión super-atmosférica .

Las condiciones básicas se ajustan en la etapa a) preferiblemente al usar una base seleccionada del grupo NH4HCO3, ( H4)2C03, bases que contienen nitrógeno, NH4OH, sales carbamato, KHC03, K2C03, carbonatos, bases de metal alcalino y bases de metal alcalinotérreo .

En una modalidad preferida más del proceso de cristalización fraccional por basificación, el procedimiento es como sigue: a) basificación de la suspensión que contiene DD/LL/DL/LD-metionilmetionina hasta que se obtenga una solución transparente, y adición gradual de un ácido a la solución básica hasta que un precipitado se separe y dé como resultado DL/LD-metionilmetiónina como precipitado. b) DD/LL-metionilmetionina se obtiene posteriormente a partir del licor madre obtenido en la etapa a) .

Se prefiere particularmente a este - respecto que la basificación en la etapa a) tenga lugar con una base y que se ajuste un pH de 7.5 a 14, de preferencia un pH de alrededor de 9 a 13, y que la solución transparente resultante se ajuste posteriormente con un ácido a un pH de 5 a 6 , de preferencia a un pH de alrededor de 5.6. Se usan de preferencia bases en este caso y son bases seleccionadas del grupo de NH4HC03, (NH4)2C03, bases que contienen nitrógeno, NH4OH, sales carbamato, KHC03, K2C03, carbonatos, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

Las condiciones ácidas en la etapa a) se ajustan de preferencia usando un ácido del grupo de ácidos minerales, de preferencia ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, o ácido carbónico o dióxido de carbono, y/o del grupo de ácidos carboxílieos , en particular los ácidos carboxílicos de 0?-04 ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y ácido isobutírico. Se usa de manera particularmente preferible ácido carbónico o dióxido de carbono.

En una modalidad preferida del proceso de cristalización fraccional, tiene lugar a una temperatura de 0°C a 100°C, de preferencia 5°C a 60°C y en forma particularmente preferible de 10°C a 40°C.

La DD/LL-metionilmetionina resultante puede además ser racemizada e introducida en el proceso de separación descrito arriba, separando entonces los dos pares de enantiómeros DD/LL-metionilmetionina y DL/LD-metionilmetionina unos de otros.

Todos los procesos de la presente invención que han sido mencionados se llevan a cabo de preferencia en un medio acuoso. Los procesos de la presente invención pueden además llevarse a cabo en el proceso intermitente conocido por el experto en la técnica o en proceso continuos.

Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra una representación diagramática del corte enzimático de las mezclas de diastereómeros de metionilmetionina DD/LL-I, DL/LD-I y DD/LL/DL/LD- I .

La figura 2 muestra una representación diagramática del corte enzimático de los cuatro diastereómeros de metionilmetionina DD-I, LL-I, DL-I y LD-I con diferentes velocidades de corte.

La figura 3 muestra una representación diagramática de la liberación enzimática de metionina (D- y L-Met juntas) a partir de los cuatro diastereómeros de metionilmetionina DD-I, LL-I, DL-I y LD-I.

La figura 4 muestra la biotransformación de D-metionina en L-metionina con un coctel enzimático de carpa común.

La figura 5 muestra las características de lixiviado de mezclas de diastereómeros de metionilmetionina DD/LL-I, DL/LD-I y LL/DD/LD/DL- I en comparación con metionina, MHA y HA-Ca.

La figura 6 muestra la digestión in vitro de cuatro diastereómeros de metionilmetionina diferentes LL/DD-I, DL/LD-I y LL/DD/LD/DL-I con enzimas digestivas de la carpa común.

La figura 7 muestra la digestión in vi ro de varias mezclas de diastereómeros de metionilmetionina LL/DD-I, DL/LD-I y LL/DD/LD/DL- I con enzimas digestivas de la carpa común.

La figura 8 muestra la disgestión in vitro de cuatro diastereómeros de metionilmetionina diferentes LL-I, LD-I, DL-I y DD-I con enzimas digestivas de la trucha arcoíris .

La figura 9 muestra la digestión in vitro de las mezclas de diastereómeros de metionilmetionina LL/DD-I, DL/LD-I y LL/DD/LD/DL-I con enzimas digestivas de la trucha arcoíris.

La figura 10 muestra la digestión in vitro de cuatro diastereómeros de metionilmetionina diferentes LL-I, LD-I, DL-I y DD-I con enzimas digestivas de los camarones patiblanco.

La figura 11 muestra digestión in vitro de varias mezclas de diastereómeros de metionilmetionina LL/DD-I, DL/LD-I y LL/DD/LD/DL- I con enzimas digestivas de los camarones patiblanco.

Descripción detallada de la invención Ej emplos A) Perspectiva general de las etapas individuales y métodos del proceso de la invención.

El proceso de la invención para preparar DL-metionil-DL-metionina (I) y la separación en los pares DD/LL-I y DL/LD-I de diastereómeros se describen en detalle a continuación .

El proceso de la invención para preparar DL-metionil-DL-metionina (I) inicia a partir de un compuesto de la fórmula general II (II) en donde Ha: R1 = COOH, R2 = NHCONH2 Ilb: R2 = CONH2f R2 = NHCONH2 líe: R1 = CONH2, R2 = NH2 lid: Rx-R2 = -CONHCONH- Ile: R1 = CN, R2 = OH Hf: R1 = CN, R2 = NH2 Ilg: R1 = =0, R2 = H.

Este compuesto se transforma por varios métodos sintéticos (A, B, C, D, E, F, G, H y J) en DL-me ionil -DL-metionina (I) (véase esquema de reacción 3) . En los métodos A, B, C y D ahí, la dicetopiperazina (III) correspondiente se produce como intermediario. En los métodos sintéticos G, H y J, metionina hidantoína se produce como intermediario y se transforma directamente en DL-metioni -DL-metionina (I) . Es posteriormente posible mediante cristalización fraccional por medio del método K separar los dos pares de diastereómeros DD/LL-I y DL/LD-I (véase esquema de reacción 3) .

Método A para lie, lie y llf DD/LL-I DL/LD-I Esquema de reacción 3 B) Ejemplos de síntesis Ejemplo 1 Síntesis de 3 , 6-bis [2 - (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de N- carbamoilmetionina (lia) mediante el método A 17.5 g (90.0 mmoles, pureza: 99%) de N- carbamoilmetionina (lia) se disolvieron en 150 mi de agua y se agitaron en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética a 160°C durante 6 horas. La presión se eleva durante esto. De vez en cuando, gas fue descargado repetidamente hasta que se alcanzara una presión de 7 bares. Luego de concluir la reacción, el autoclave se enfrió en un baño de hielo. La suspensión resultante se filtró después, y el sólido filtrado se lavó varias veces con agua y se secó en un horno de secado a 50°C al vacío. El rendimiento aislado fue de 8.1 g (30.9 mmoles) (69%) de bis [ 2 - (me t i 11 io ) et i 1 ] - 2 , 5 -piperazindiona (III) , cristales blancos amarillentos, pureza >98% (HPLC) , punto de fusión 234-236°C. 1H RMN de 3 , 6 -bis [ 2 - (me t i 11 io ) et i 1 ] - 2 , 5 -piperazindicona (III) (500 MHz , D6-DMS0) : d = 1.85-2.05 (m, 4H, 2 x SCH2CH2) ; 2.049 (s, 6H, 2 x SCH3) ; 2.46-2.60 (m, 4H, 2 x SCH2) ; 3.92-3.99 (m, 2H, 2 x CH) ; 8.213 (s, 2H, 2 X NH) . 13C-RMN de 3 , 6-bis [2- (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (125.8 MHz, D6-DMS0) : d = 14.35 (CH3) ; 14.38 (CH3) ; 28.50 (CH2S) ; 28.68 (CH2S) ; 31.92 (CH2CH2S) ; 32.33 (CH2CH2S) ; 52.92 (CH) ; 52.96 (CH) ; 167.69 (C=0) ; 167.71 (C=0) .

Análisis elemental para Ci0Hi8 2O2S2 ( = 262.39 g/moles ) : Calculado: C 45.77; H 6.91; N 10.68; S 24.44 Encontrado: C 45.94; H 6.96; N 10.64; S 24.38 Ejemplo 2 Síntesis de 3, 6-bis [2- (metiltio) etil] -2, 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 2- [ (aminocarbonil) amino] -4 - (metiltio) butanoamida (N- carbamoilmetioninamida) (Ilb) mediante método A 17.4 g (90.0 inmoles, pureza: 98.5%) de 2-[ (aminocarbonil) -amino] -4- (met i 11 io ) butanoamida (Ilb) se disolvieron en 150 mi de agua y se agitaron en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética a 160°C durante .7 horas. La presión se eleva durante esto. De vez en cuando, se descarga repetidamente gas hasta que se alcanza una presión de 7 bares. Luego de concluir la reacción, el autoclave se enfrió en un baño de hielo. La suspensión resultante se filtró después, y el sólido filtrado se lavó varias veces con agua y se secó en un horno de secado a 50°C al vacío. El rendimiento aislado fue de 9.2 g (35.1 mmoles) (78%) de bis[2- (met i 11 io) et il ] - 2 , 5 -piperaz indiona (III), cristales blancos amarillentos, pureza >98% (HPLC) .

El punto de fusión y los datos de RMN concuerdan con aquellos del ejemplo 1.

Ejemplo 3 Síntesis de 3, 6-bis [2- (metiltio) etil] -2, 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 5- [2- (metiltio) etil] -2 , 4-imidazolidindiona (lid) (metioninahidantoína) mediante el método A y reutilización subsecuente del licor madre (reacción en cascada) Primer lote : Una suspensión de 13.4 g (0.09 moles) de metionina, 17.2 g (0.09 moles, pureza: 91%) de metioninahidantoína (lid) y 150 g de agua se introduce en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética y se agita a 60°C durante 6 horas, tiempo durante el cual la presión se eleva a 15 bares. De vez en cuando se descomprime el autoclave hasta que la presión se establezca a 10 bares constantes. Luego se enfrió el autoclave en un baño de hielo, y la suspensión resultante se filtra y el sólido se lava con 75 mi de agua. Finalmente, el sólido se seca en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. Se aisla bis [2- (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) como cristales blancos amarillentos.

Lotes subsecuentes: El agua de lavado y el licor madre proveniente del lote anterior se combinan y se concentran hasta 90 mi en un evaporador giratorio a 50°C. Se recogen 17.2 g (0.09 moles, pureza: 91%) de metioninahidantoína (lid) con el licor madre concentrado y se completan hasta 150 g de solución con agua.

La solución resultante se introduce en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética y se agita a 160°C durante 6 horas, tiempo durante el cual la presión se eleva a 15 bares . De vez en cuando se descomprime el autoclave hasta que la presión permanezca constante a 10 bares. Tiene lugar tratamiento adicional en analogía al primer lote .

Ejemplo 4 Síntesis de 3 , 6 -bis [2 - (metil tío) etil] -2 , 5 -piperazin-diona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 2 - amino -4 - (metil tio) butanoamida (metioninamida) (lie) mediante método B 16.6 g (0.09 moles) de clorhidrato de 2-amino-4- (metiltio) butanoamida (lie) y 8.7 g (0.09 moles) de (NH4)2C03 fueron disueltos en 150 g de agua y se agitaron en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética a 160°C durante 6 horas. El autoclave se enfrió después en un baño de hielo. La suspensión resultante se filtra después, y el sólido filtrado se lava varias veces con agua y se seca en un horno de secado a 50 °C al vacío. El rendimiento aislado es de 6.5 g (24.8 mmoles) (55%) de bis [2 - (metiltio) etil ] - 2 , 5 -piperazindiona (III), cristales blancos amarillentos, pureza >98% (HPLC) .

El punto de fusión y los datos de RMN concuerdan con aquellos del ejemplo 1 Ejemplo 5 Síntesis de 3 , 6 -bis [2 - (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindina (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de cianohidrina de 2- hidroxi-4- (metiltio) butanonitrilo (3- (metil- mercapto) propionaldehído, MMP-CH) (lie) mediante método C Una solución de 30.5 g (0.232 moles) de 2-hidroxi -4 - (metiltio) butanonitrilo (lie) y 360 g de agua se añade lentamente por goteo a temperatura ambiente a una suspensión de 22.4 g (0.283 moles = 1.22 eq.) de NH4HC03 en 20 g de agua y se agita durante 2 horas. El NH4HC03 es disuelto durante este tiempo. La solución resultante se agita posteriormente a 50°C durante 7 horas y luego a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se transfiere después a un autoclave de acero de 500 mi, se calienta a 160°C y se agita a esta temperatura durante 6 horas . El autoclave se enfrió después en un baño de hielo, la suspensión resultante se filtra, y el sólido se lava con 50 mi de agua. Finalmente, el sólido pálido se seca en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. El rendimiento aislado es de 17.8 g (67.8 mmoles) 58%) de bis [2 - (metiltio) etil] -2 , 5 -piperaz indiona (III) , cristales blancos amarillentos, pureza >98% (HPLC) .

El punto de fusión y los datos de RMN concuerdan con aquellos del ejemplo 1.

Ejemplo 6 Síntesis de 3, 6-bis [2- (metiltio) etil] -2, 5-ipiperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 2-amino-4- (metiltio) butanonitrilo (metioninonitrilo) (Ilf) mediante método C Un flujo moderado de C02 se pasó en una solución de 26.2 g (0.201 moles) de 2-amino-4- (metiltio) butanonitrilo (Ilf) en 330 g de agua durante un periodo de 3 horas, tiempo durante el cual la temperatura as elevó a 45°C y el pH se estableció en 8. Se continuó agitando a temperatura ambiente durante la noche. La mañana siguiente, la mezcla de reacción se transfirió a un autoclave de acero de 500 mi, se calentó a 160°C y se agitó a esta temperatura durante 6 horas. El autoclave se enfrió después en un baño de hielo, la suspensión resultante se filtró y el sólido se lavó con 50 mi de agua y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. El rendimiento aislado fue de 15.7 g (59.7 mmoles) (59%) de bis [2- (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III), cristales blancos amarillentos, pureza >98% (HPLC) .

El punto de fusión y los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 1.

Ej emplo 7 Síntesis de 3 , 6-bis [2 - (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 3- (metiltio) ropanoaldehído (3- (metilmercapto)propionaldehído, MMP) (Ilg) mediante método D 66.0 g (0.68 moles) de (NH4)2C03 se introdujeron en 100 g de agua y se enfriaron a 5°C en un baño de hielo. Después, durante el curso de 25 minutos, 16.6 g (0.61 moles) de ácido cianhídrico recién destilado fueron añadidos por goteo, tiempo durante el cual la temperatura de la suspensión se mantuvo en la escala de 5 a 10 °C. La adición de 860 °g de agua fue seguida por la adición por goteo, a 10°C, de 60.3 g (0.58 moles) de 3 - (metiltio) ropanoaldehído (Ilg) durante un periodo de 80 minutos. El pH permaneció constante en el intervalo de 8.5 a 9 durante este tiempo. La mezcla de reacción se calentó después a 50°C y se agitó a esta temperatura durante 7 horas. Después de concluir la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a 5°C en un baño de hielo y se almacenó en un refrigerador .durante la noche. La mañana siguiente, la mezcla se transfirió a un autoclave de acero de 2 litros, se calentó a 160°C y se agitó a esta temperatura durante 6 horas. El autoclave se enfrió después en un baño de hielo, la suspensión resultante se filtró y se lavó con 150 mi de agua, y el sólido se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. El rendimiento aislado fue de 48.6 g (185.2 mmoles) (64%) de bis [2 - (metiltio) etil ] - 2 , 5 -piperaz indiona (III), cristales blancos amarillentos, pureza >98% (HPLC) .

El punto de fusión y los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 1.

Ej emplo 8 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 3,6-bis[2- (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) con ácido clorhídrico concentrado mediante método E 655.9 g (2.50 moles) de 3 , 6-bis [2 - (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (DKP) se suspendieron en 1661 g de agua. Mientras se agitaba, 271.0 g de ácido clorhídrico concentrado se añadieron por goteo muy lentamente y después se calentaron cuidadosamente, con una agitación muy vigorosa, hasta reflujo. Durante este tiempo puede ocurrir una severa formación de espuma. La mezcla de reacción se calienta a reflujo durante 5.5 horas, disolviendo entonces todo el sólido. Durante el enfriamiento subsecuente, DKP (III) no reaccionado se precipita y es filtrado. Este DKP puede emplearse de nuevo para hidrólisis adicionales en reacciones posteriores. El filtrado se ajusta después a pH 6 en un vaso de precipitados de cristal en un baño de hielo con amoniaco acuoso al 32% de concentración. Se separa una DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) como una masa espesa de cristales, y una mezcla 50:50 de los dos pares de diastereómeros (DL/LD-Met-Met) (DL/DL-I) y (DD/LL-Met-Met) (DD/LL-I) durante este tiempo. Se seca finalmente en un horno de secado a 60°C al vacío. Rendimiento: 601.0 g (2.14 moles) (85.7%) de DD/LL/DL/LD-metionil-metionina (I) , sólido ligeramente amarillento, pureza 98% (HPLC) .

Hí-RMN de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) (500 MHz, D6-DMS0+HC1) : d = 1.86-2.16 (ra, 4H, 2 x SCH2CH2) ; 2.050 (a, 3H, SCH3) ; 2.060 (s, 3H, SCH3) ; 2.44-2.64 (m, 4H, 2 x SCH2) ; 2.90-4.00 (m, 1H, CH) ; 4.32-4.42 (m, 1H, CH) ; 8.45 (bs, 3H, NH3+) ; 8.98-9.08 (m, 1H, 2 x NH) . 13C-RMN de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) (125.8 MHz, D6-DMSO+CH1) : d = 14.33 (CE¾; 14.38 (CH3) ; 27.74; 27.94; 29.51; 30.04; 30.13; 30.89; 30.95; 51.00; 51.29; 51.54 (CH, CH2) ; 168.05 (CONH); 168.19 (CONH); 172.55 (COOH) ; 172.62 (COOH) .

Análisis elemental para CioH20N203S2 (M = 280.41 g/moles) : Calculado: C 42.83; H 7.19; N 9.99; S 22.87 Encontrado: C 42.61; H 7.19; N 10.06; S 22.72 Ejemplo 9 Síntesis industrial de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 3 , 6 -bis [2- (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) con ácido clorhídrico concentrado mediante método E 500 Litros de agua se introducen en un tanque barnizado de 500 litros con agitador, 32 litros de ácido clorhídrico concentrado y 78.6 kg de 3, 6 -bis [2- (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (DKP) fueron añadidos, y el aparato se cerró herméticamente. Después se calentó a 110 °C mientras se agitaba durante 2 horas, tiempo durante el cual la presión se elevó a 2.5 bares y la DKP (III) se disolvió casi completamente. Luego de completar la reacción, la mezcla se enfrió a 20°C y la DKP que no reaccionó fue centrifugada en una centrífuga. El sólido se lavó con 10 litros de agua. El filtrado y el agua de lavado se recogieron después en un recipiente de 300 litros y posteriormente se introdujeron en un tanque de 500 litros con agitador de nuevo. La adición de 2 kg de carbón activado fue seguida por agitación a 20°C durante 30 minutos. La suspensión se filtró después a través de una presa de filtración en un tanque de 500 litros adicional con agitador. Aproximadamente 28 litros de solución de amoniaco concentrado se añadieron después para precipitar a pH 6 la DD/LL/DL/LD-metinilmetionina (I) . Durante este tiempo existe una precipitación preferencial inicial del par racémico menos soluble de diastereómeros DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) . Esto fue centrifugado y el licor madre se concentró junto con el agua de lavado a un cuarto del volumen original en un vacío con bomba de vapor a una temperatura interna que no excediera 40°C. Durante este tiempo, el par racémico más soluble de diastereómeros DD/LL-métionilmetionina (DD/LL-I) se cristalizó junto con pequeñas cantidades del DL/LD-I ligeramente soluble. La conclusión de la destilación fue seguida por enfriamiento a 20°C y centrifugación. El licor madre separado y el agua de lavado fueron descartados . Ambas fracciones fueron secadas al vacío a 70 °C. En total, fue posible obtener 64.2 kg (78%) de DD/LL/DL/LD-metionil-metionina (I) como mezcla de diastereómeros . Pureza > 98% (HPLC) .

El punto de fusión y los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 8.

Ejemplo 10 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 3,6-bis[2- (metiltio) etil] -2, 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) bajo condiciones alcalinas, por ejemplo, con amoniaco mediante el método F 65.6 g (0.25 moles) de 3 , 6 -bis [2 - (metiltio) etil] -2 , 5 -piperazindiona (III) (DKP), 70 mi de solución de amoniaco al 25% de concentración y 500 mi de agua se calientan a 150°C en un autoclave durante 2 horas. Después de enfriar, la DKP no reaccionada (III) (16.0 g = 24.4%) se filtra con succión. Esta se puede emplear nuevamente en un lote subsiguiente. El filtrado se concentra en un evaporador giratorio a una temperatura de agua de 80-90°C hasta que los primeros cristales se separen. Después del enfriamiento y de dejar reposar durante la noche es posible aislar luego de la filtración y secado en total 49.3 g (70.3%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) como una mezcla 50:50 de los dos pares de diastereómeros DL/DL-I y DD/LL-I como un sólido blanco. Pureza 98% (HPLC) .

El punto de fusión y los datos de RMN concuerdan con aquellos del ejemplo 8.

Ejemplo 11 Purificación de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) 500 g de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) se suspendieron en 7,800 g de agua desionizada (pH 5.3). A 26°C, el pH se ajustó a 1.0 con 346.6 g de ácido sulfúrico al 50% en peso. La metionilmetionina se disuelve completamente. Para aclarar, 18 g de carbón activado se añaden a la solución turbia amarillenta y se agitan durante 60 minutos. El carbón activado se filtra y la solución incolora transparente se ajusta a pH 5.6 con 228 g de solución de amoniaco al 32% en peso. La solución se deja reposar durante la noche. El sólido blanco precipitado se filtra con succión y se seca en un horno de secado a 50 °C al vacío. Rendimiento: 460.5 g (92%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) , sólido blanco brillante, pureza >99% (HPLC) .

Los datos de RMN concuerdan con aquellos del ejemplo 8.

Ejemplo 12 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) a partir de N- carbamoilmetionina (lia) y DL-metionina con KOH mediante el - método G 13.4 g (0.09 moles) de DL-metionina, 17.5 g (0.09 moles, pureza: 99%) de N-carbamoilmetionina (lia) y 11.9 g (0.18 moles) de KOH al 85% puro se disolvieron en 150 mi de agua y se agitaron a 150°C en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética durante 5 horas, tiempo durante el cual la presión se elevó a 6 bares. Después de que se completó la reacción, el autoclave se enfrió, y la 3,6-bis [2- (metiltio)etil] -2, 5 -piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina , DKP) precipitada se filtró y se lavó con un poco de agua. El agua de lavado y el licor madre se combinaron y concentraron hasta un volumen de 130 mi en un evaporador giratorio a 40°C. Después se pasó un flujo moderado de C02 en la solución resultante hasta que se alcanzara un pH de 6.4 y se precipitara un sólido blanco. Este se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. El rendimiento aislado fue 11.4 g (40.6 mmoles) (45%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) , sólido blanco, pureza >98% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 8.

Ejemplo 13 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) a partir de 5- [2- (metiltio) etil] -2 , -imidazolindiona (lid) (metioninahidantoína) y DL-metionina con KOH mediante el método G 13.4 g (0.09 moles) de DL-metionina, 17.2 g (0.09 moles, pureza: 91%) de metioninahidantoína (lid) y 8.9 g (0.135 moles) de KOH puro al 85% se disolvieron en 150 mi de agua y se agitaron a 150 °C en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética durante 5 horas, tiempo durante el cual la presión se elevó a 8 bares. Una vez que se completó la reacción, el autoclave se enfrió, la suspensión resultante se filtró y la 3, 6-bis [2- (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) precipitada se lavó varias veces con un poco de agua. El licor madre y agua de lavado se combinaron, y la solución resultante se concentró hasta un volumen de 125 mi en un evaporador giratorio a 40°C. El concentrado se neutralizó cuidadosamente con ácido clorhídrico concentrado. Se precipitó un sólido blanco después de la agitación a temperatura ambiente y a un pH de 5.8 durante la noche. Este sólido se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. El rendimiento aislado fue 17.5 g (62.4 mmoles) (69%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) , sólido blanco, pureza >98% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 8.

Ejemplo 14 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) a partir de 5- [2- (metiltio) etil] -2, 4-imidazolidindiona (lid) (metioninahidantoina) y DL-metionina con K2CO3 mediante el método G 13.4 g (0.09 moles) de DL-metionina, 17.2 g (0.09 moles, pureza: 91%) de metioninahidantoína (lid) y 12.4 g (0.09 moles) de K2C03 se disolvieron en 50 mi de agua y se agitaron a 150 °C en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética durante 5 horas, tiempo durante el cual la presión se elevó a 12 bares. Una vez que se completó la reacción, el autoclave se enfrió, y la 3,6-bis[2-(metiltio)etil] -2, 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) precipitada se filtró y se lavó con un poco de agua. El agua de lavado y el licor madre se combinaron y concentraron hasta un volumen de 135 mi en un evaporador giratorio a 40°C. Después se pasó un flujo moderado de C02 en la solución resultante hasta que se alcanzara un pH de 6.8 y se precipitara un sólido blanco. Este se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. Rendimiento: 14.3 g (60.0 mmoles) (57%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) , sólido blanco, pureza >99% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 8.

Ejemplo 15 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) a partir de 5- [2- (metiltio) etil] -2, 4 -imidazolidindiona (lid) (metioninahidantoína) y DL-metionina con KHCQ3 mediante el método G 13.4 g (0.09 moles) de DL-metionina, 17.2 g (0.09 moles, pureza: 91%) de metioninahidantoína (lid) y 9.1 g (0.09 moles) de KHC03 se disolvieron en 150 mi de agua y se agitaron a 150 °C en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética durante 5 horas, tiempo durante el cual la presión se elevó a 12 bares. Una vez que se completó la reacción, el autoclave se enfrió, y la 3,6-bis[2-(metiltio) etil] -2 , 5 -piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) precipitada se filtró y se lavó con un poco de agua. El agua de lavado y el licor madre se combinaron y concentraron hasta un volumen de 120 mi en un evaporador giratorio a 40°C. Luego se pasó un flujo moderado de CO2 en la solución resultante hasta que se alcanzara un pH de 6.3 y se precipitara un sólido blanco. Este se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. Rendimiento: 16.0 g (57.1 mmoles) (63%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) , sólido blanco, pureza >99% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 8.

Ejemplo 16 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) a partir de 2- amino-4 - (metiltio) butanoamida (lie) (metioninamida) y DL- metionina con (??4)2003 mediante el método H 8.3 g (0.045 moles) de clorhidrato de 2-amino-4- (metiltio) butanoamida (lie), 6.7 g (0.045 moles) de metionina, 4.3 g (0.045 moles) de (NH4)2C03 y 3.0 g (0.045 moles) de KOH puro al 85% se disolvieron en 75 g de agua y se agitaron a 160°C en un autoclave de acero Roth de 200 mi con agitación magnética durante 6 horas. El autoclave se enfrió después en un baño de hielo, la suspensión resultante se filtró y la 3 , 6-bis [2- (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) precipitada se lavó con un poco de agua. El agua de lavado y el licor madre se combinaron y concentraron hasta un volumen de 70 mi en un evaporador giratorio a 40°C. Después se pasó un flujo moderado de C02 en la solución resultante hasta que se alcanzara un pH de 6.3 y se precipitara un sólido blanco. Este se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50 °C durante la noche. Rendimiento: 7.8 g (27.8 mmoles) (62%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido blanco, pureza > 98% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 8.

Ej emplo 17 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) a partir de cianohidrina de 2 -hidroxi-4 - (metiltio) butanonitrilo (lie) (3 - (metil-mercapot) propionaldehído, MMP-CH) y DL-metionina con NH4HCO3 mediante el método H 15.2 g (0.116 moles) de 2-hidroxi-4- (metiltio) butanonitrilo (He) se añadieron lentamente por goteo a temperatura ambiente a una suspensión de 11.1 g (0.141 moles = 1.22 eq.) de NH4HC03 en 10 g de agua y se agitaron durante 2 horas. El NH4HC03 se disolvió durante este tiempo. Después se añadieron 180 g de agua y la solución resultante se agitó a 50 °C durante 7 horas y a temperatura ambiente durante la noche. La mañana siguiente, 17.3 g (0.116 moles) de metionina, 7.7 g (0.116 moles) de KOH puro al 85% y 180 g adicionales de agua fueron añadidos, y la mezcla de reacción se transfirió a un autoclave de acero de 1 litro, se calentó a 160°C y se agitó a esta temperatura durante 6 horas. El autoclave se enfrió después en un baño de hielo, la suspensión resultante se filtró y la 3,6-bis[2-(metiltio) -etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (metioninadiceto-piperazina, DKP) precipitada se lavó con 100 mi de agua. El licor madre y agua de lavado se combinaron, y la solución resultante se concentró hasta un volumen de 160 mi en un evaporador giratorio a 40°C. El concentrado se neutralizó cuidadosamente con ácido sulfúrico a 50% de concentración. Se precipitó un sólido blanco después de agitar a temperatura ambiente y a un pH de 5.4 durante la noche. Este sólido se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50 °C durante la noche. Rendimiento: 15.2 g (54.2 mmoles) (47%) de DD/LL/DL/LD-metinilmetionina (I), sólido blanco, pureza > 99% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 8.

Ejemplo 18 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) a partir de 2-amino-4- (metiltio) butanonitrilo (Ilf) (metionina-nitrilo) con C02 y DL-metionina mediante el método H Un flujo moderado de C02 se pasó en una solución de 26.2 g (0.201 moles) de 2 -amino-4 - (metiltio) butanonitrilo (11F) en 330 g de agua durante un periodo de 3 horas, tiempo durante el cual la temperatura se elevó a 45°C y el pH se quedó en 8. Después se continuó agitando a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, la mezcla de reacción se mezcló con 30.0 g (0.201 moles) de metionina y 13.3 g (0.201 moles) de KOH puro al 85% y se transfirió a un autoclave de acero de 1 litro, se calentó a 160°C y se agitó a esta temperatura durante 6 horas. El autoclave se enfrió después en un baño de hielo, la suspensión resultante se filtró y la 3 , 6-bis [2- (metiltio) etil] -2 , 5-piperazindiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) precipitada se lavó con un poco de agua. El agua de lavado y el licor madre se combinaron y concentraron hasta un volumen de 280 mi en un evaporador giratorio a 40°C. Después se pasó un flujo moderado de C02 en la solución resultante hasta que se alcanzara un pH de 6.0 y se precipitara un sólido blanco. Este se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche.

Rendimiento: 32.7 g (116.6 moles) (58%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) , sólido blanco, pureza >98% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos . del ej emplo 8.

Ejemplo 19 Síntesis de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) a partir de 3- (metiltio) propanaldehído (Ilg) MMP) con ácido hidrociánico, carbonato de amonio y DL-metionina mediante el método J 66.0 g (0.68 moles) de (NH4)2C03 se introdujeron en 100 g de agua y se enfriaron a 5°C en un baño de hielo. Después 16.55 g (0.612 moles) de ácido cianhídrico recién destilado fueron añadidos por goteo durante el curo de 25 minutos, tiempo durante el cual la temperatura de la suspensión se mantuvo a 5 a 10°C. Después de que se habían añadido 500 g de agua, 60.3 g (0.58 moles) de 3- (metiltio) ropionaldehído (Ilg) se añadieron por goteo a 10°C durante un periodo de 80 minutos. El pH permaneció constante en la escala de 8.5 a 9 durante este tiempo. La mezcla de reacción se calentó después a 50°C y se agitó a esta temperatura durante 7 horas. Una vez que se completó la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a 5°C en un baño de hielo y se almacenó en un refrigerador durante la noche. A la mañana siguiente, 86.5 g (0.58 moles) de ácido 2-amino- (metiltio) butanoico (metionina) , 38.3 g (0.58 moles) de KOH puro al 85% (0.58 moles) y 530 g adicionales de agua fueron añadidos. La mezcla se transfirió a un autoclave de acero de 2 litros, se calentó a 160°C y se agitó a esta temperatura durante 6 horas. El autoclave se enfrió después en un baño de hielo, la suspensión resultante se filtró y la 3,6-bis[2-(metiltio) etil] -2 , 5 -piperazin-diona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) precipitada se lavó con un poco de agua. El agua de lavado y el licor madre se combinaron y se concentraron hasta un volumen de 800 mi en un evaporador giratorio a 40 °C. Un flujo moderado de C02 se pasó después en la solución resultante hasta que se alcanzara un pH de 6.0 y se precipitara un sólido blanco. Este se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. Rendimiento: 85.1 g (0.30 moles) (52%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido blanco, pureza >98% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos del ejemplo 8.

Ejemplo 20 Separación de los dos pares de diastereómeros DD/LL-metionilmetionina (DD/LL-I) y DL/LD-metionilmetionina (DL/LD- I) mediante cristalización fraccional a partir de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) mediante el método K a) DL/LD-Metionilmetionina (DL/LD-I) : 290.4 g de DD/LL/DL/LD-metinilmetionina (I) (mezcla 50:50 de DD/LL-I y DL/LD-I) fueron suspendidos en 2,614 g de agua desionizada y ajustados a pH 0.6 con 381.7 g de ácido sulfúrico al 50% en peso. La solución incolora transparente se ajustó a pH 5.6 con 265.9 g de solución de amoniaco al 32% en peso, y el precipitado blanco resultante se filtró con succión (580.9 g húmedo) . El sólido se secó finalmente en un horno de secado al vacío a 50°C. El rendimiento fue de 126.2 g (86.9%) de DL/LD-metionilmet ionina (DL/LD-I), sólido blanco, pureza >98% (HPLC) , intervalo de fusión 232-233°C (descomposición) . 1H-RMN de DL/LD-met ionilmet ionina (DL/LD- I ) (500 MHz, Dg-DMSO+HCl) : 1.88-2.12 (m, 4H, 2 x SCH2CH2); 2.031 (s, 3H, CH3) ; 2.041 (s, 3H, CH3); 2.48-2.56 (m, 4H, 2 x SCH2) ; 3.87-3.95 (m, 1H, CH) ; 4.30-4.38 (m, 1H, CH) ; 8.429 (d, 3H, 3J = 4.4Hz, NH3+) ; 9.034 (d, 1H, 3<J = 8.0Hz , NH) . 13C-R N de DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) (125.8 MHz , D6-DMS0+CH1) : 14.57 (CH3); 14.62 (CH3); 28.19; 29.75; 30.28; 31.19; 51.25 (CH); 51.79 (CH); 168.29 (CONH) ; 172.80 (COOH).

Solubilidad (agua, 20°C) : 0.4 g/1. b) DD/LL-Metionilmet ionina (DD/LL-I) : El licor madre incoloro de a) se concentró en un evaporador giratorio a 35°C bajo un vacío de bomba de agua. Se obtuvo una suspensión blanca. El sólido blanco compuesto de sulfato de amonio, residuos de DL/LD-I y compuesto objetivo fue después filtrado con succión y secado al vacío a 50°C. Los tres sólidos se separaron al suspender la mezcla en agua desionizada y agitar. La DL/LD-I no disuelta se filtró con succión, y el licor madre se concentró hasta aproximadamente un quinto en un evaporador giratorio a 50°C bajo vacío de bomba de agua. Después de reposo prolongado, se cristalizó DD/LL-metionilmet ionina (DD/LL-I) como un sólido blanco. Finalmente se filtró con succión y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C. El rendimiento fue de 78.2 g (53.9%) con base en DD/LL-met ionilmet ionina (DD/LL-I), sólido blanco, >96% (HPLC) , intervalo de fusión 226-227°C (descomposición) . 1H-RMN de DD/LL -met ioni lmet ionina (DD/LL-I) (500 MHz, D6-DMS0+HC1) : 1.84-2.12 (m, 4H, 2 x SCH2CH2); 2.044 (s, 3H, CH3) ; 2.046 (s, 3H, CH3); 2.48-2.62 (m, 4H, 2 x SCH2) ; 3.89-3.97 (m, 1H, CH) ; 4.33-4.40 (m, 1H, CH) ; 8.422 (d, 3H, 3J = 4.0Hz, NH3+); 9.065 (d, 1H, 3J = 7.5Hz , NH) . 13C-RMN de DD/LL-metionilmetionina (DD/LL-I) (125.8 MHz, D6-DMSO+HCl) : 14.56 (CH3); 14.57 (CH3); 27.97; 29.73; 30.35; 31.11; 51.22 (CH); 51.50 (CH); 168.41 (CONH) ; 172.83 (COOH).

Solubilidad (agua, 20°C) : 21.0 g/1.

Ejemplo 21 Raeemización de los dos pares de días tereómeros DD/LL-metioni lme tionina (DD/LL-I) y DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) bajo condiciones básicas a) Racemización de DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) . 12.6 g (45.0 inmoles) del par de días tereómeros DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) fueron disueltos juntos con 3.1 g (22.5 mmoles) de K2C03 en 75 mi de agua en un reactor de laboratorio Roth de 200 mi y calentados a 160°C mientras se agitaba. La presión se elevó a 7 bares durante esto. Luego de 6 horas a esta temperatura, el autoclave se enfrió en un baño de hielo. La suspensión resultante se filtró después, y el sólido se filtró, se lavó varias veces con agua y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C. El rendimiento aislado fue 6.5 g (24.8 mmoles) 55%) de bi s [ 2 - (met i 11 io ) et i 1 ] - 2 , 5 -piperaz indiona (III), cristales blancos amarillentos, pureza >98%, punto de fusión 234-236°C; relación de diastereómeros : 52:48 (DD/LL-III : meso-III) . El agua de lavado y el licor madre se combinaron y concentraron hasta un volumen de 25 mi en un evaporador giratorio a 40°C. Después se pasó un flujo moderado de C02 en la solución resultante hasta que el H alcanzara 6.0 y se precipitara un sólido blanco. Este se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. El rendimiento aislado fue 5.7 g (20.3 inmoles) (45%) de DD/ LL/DL/ LD -met ioni lmet ionina (I), sólido blanco, pureza >98% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos del ej emplo 8. a) Racemi zac i ón de DL/ LD -met ioni lmet ionina (DD/LL-I) . 12.6 g (45.0 mmoles) de DD/LL-metionilmet ionina (DD/LL-I) se disolvieron junto con 4.5 g (45.0 mmoles) de KHC03 en 75 mi de agua en un reactor de laboratorio Roth de 200 mi y se calentaron a 160°C mientras se agitaba. La presión se elevó a 7 bares y, después de 6 horas a esta temperatura, el autoclave se enfrió en un baño de hielo. La suspensión resultante se filtró después, y el sólido filtrado se lavó varias veces con agua y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C. El rendimiento aislado fue de 6.0 g (22.9 mmoles) 51%) de bis[2- ( met i 11 io ) et i 1 ] - 2 , 5 -p iperaz indiona (III), cristales blancos amarillentos, pureza >98% (HPLC), punto de fusión 233-236°C; relación de diastereómeros : 54.46 (DD/LL-III : meso-III) . El agua de lavado y el licor madre se combinaron y concentraron hasta un volumen de 25 mi en un evaporador giratorio a 40°C. Un flujo moderado de C02 se pasó después en la solución resultante hasta que el pH alcanzara 6.0 y se precipitara un sólido blanco. Este se filtró, se lavó con un poco de agua fría y se secó en un horno de secado al vacío a 50°C durante la noche. El rendimiento aislado fue de 5.5 g (19.6 mmoles) (44%) de DD/ LL/DL/ LD -me t ioni lmet ionina (I) , sólido blanco, pureza >98% (HPLC) .

Los datos de RMN concordaron con aquellos del e j emplo 8.

Ejemplo 22 Experimentos de digestión in vítro en DL -me tioni 1 -DL - metionina (I) con enzimas digestivas de carpa omnívora a) Aislamiento de las enzimas digestivas de carpa común (Cyprinus carpió morpha noblis) .

El método para aislar las enzimas digestivas se basó en aquél de EID y MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111-119) . Para este propósito, el intestino de cinco carpas comunes de un año de edad (Cyprinus carpió morpha noblis) fue expuesto, enjuagado con agua y abierto longitudinalmente, y en cada caso la mucosa intestinal fue retirada raspando. Esto se pulverizó junto con hielo triturado usando un mezclador. La suspensión resultante se trató con una sonda ultrasónica para romper las células que aún estaban intactas. Los constituyentes celulares y grasa fueron separados al centrifugar la suspensión a 4°C durante 30 minutos, y el homogenado se decantó y se esterilizó con una traza de timerosal. 260.7 mi de la solución enzimática de la mucosa intestinal se obtuvieron a partir de 5 carpas comunes, y la solución se almacenó en la oscuridad a 4°C. b) Procedimiento para las investigaciones de digestión in vitro.

DL -Met ioni 1 - DL -met ionina (I) y los pares correspondientes de diastereómeros DD/LL-I y DL/LD-I se recogieron en solución reguladora de pH TRIS/HCl y se mezclaron con la solución de enzimas. Se formó una suspensión en cada caso sin solución de enzima para comparación y para calcular el índice de corte químico simplemente. Se tomó la muestra de vez en cuando, y la composición de la misma se detectó y cuantificó con la ayuda de una HPLC calibrada. La conversión se determinó como el cociente del área para metionina y el área para metionilmetionina (I) (véase figura 6 y 7) .

Tabla 1 Ejemplo 23 Experimento de digestión in vitro en DL-metionil-DL-metionina (I) con enzimas digestivas de trucha carnívora a) Aislamiento de las enzimas digestivas de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykis) .

El método para aislar las enzimas digestivas se basó en aquél de EID y MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111-119) . Para este propósito, el intestino de seis truchas arcoíris de un año de edad (Oncorhynchus mykiss) fue expuesto y procesado como se describió en el ejemplo 22. b) Procedimiento para las investigaciones de digestión in vi tro.

Las investigaciones in vitro se llevaron a cabo de manera análoga al ejemplo 22 (véase figuras 8 y 9) .

Tabla 2 metionina (I) con enzimas digestivas de camarones omnívoros a) Aislamiento de las enzimas digestivas de camarones patiblancos (Litopenaeus Vannamei) .

El método para aislar las enzimas digestivas se basó en aquél de Ezquerra y García-Carreno (J. Food Biochem. 1999, 23, 59-74) . Para este propósito, el hepatopáncreas fue retirado de cinco kilogramos de camarones patiblancos {Litopenaeus Vannamei) y molido junto con hielo triturado usando un mezclador. El procesamiento adicional se llevó a cabo en analogía al ejemplo 22. b) Procedimiento para las investigaciones de digestión in vitro.

Las investigaciones in vitro se llevaron a cabo en analogía al ejemplo 22 (véase figuras 10 y 11) .

Tabla 3 Ejemplo 25 Biotransformación de D- en L-metionina con enzimas del intestino, hígado y páncreas de carpa común a) Aislamiento de las enzimas digestivas de carpa común ( Cyprinus carpió morpha noblis) .

El método para asilar las enzimas digestivas se basó en aquél de EID y MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111-119) . Para este propósito, el intestino de cinco carpas comunes (Cyprinus carpió morpha noblis) de un año de edad fue expuesto y procesado como se describió en el ejemplo 22. Para aislar enzimas hepáticas, los hígados fueron aislados, homogene i z ados y tratados en analogía al procesamiento de las enzimas intestinales en el ejemplo 22. El procedimiento para el aislamiento enzimático del páncreas también fue análogo al mismo. b) Procedimiento para la biotransformación in vitro del D- en L-metionina.

D-Metionina se recogió en solución reguladora de pH, y la solución enzimática fue añadida. Una suspensión sin solución enzimática se formó en cada caso como comparación y para calcular la velocidad de transformación puramente química. Después de 24 horas, se tomó una muestra y la composición se detectó y se cuantificó con la ayuda de HPLC calibrada. La conversión se determinó como el cociente del área para L-metionina y el área para D-metionina (véase figura 4) .

Tabla 4 Soluciones reguladoras de pH: Regulador de pH de citrato: pH 5, pH 6 y pH 7 Regulador de pH de fosfato: pH 8 Regulador de pH TRIS/HCl : pH 9 Coctel enzimático compuesto de enzimas intestinales, hepáticas y pancreáticas {= 5% de solución de carpa) : 2.6 mi de solución enzimática de mucosa intestinal 3.5 mi de solución enzimática del hígado 5.6 mi de solución enzimática de páncreas Ejemplo 26 Característic s de lixiviado de las mezclas de di as tereómero de me tioni Ime t ionina LL/DD/LD/DL - I , DD/LL-I y DL/LD-I a partir de granulos de pienso en comparación con DL-metionina, MHA y calcio MHA Mezcla de pienso: La matriz para pienso usada fue una mezcla para pienso deficiente en metionina de ingredientes convencionales tales como, por ejemplo, harina de soya, aceite de soya, almidón de maíz, harina de trigo, harina de pescado, celulosa, aminoácidos esenciales cristalinos y minerales y vitaminas como premezclas. Esta mezcla se complementó después de manera intermitente en lotes de 20 kg en cada caso con los derivados de metionina indicados en la tabla 5, con una velocidad de suplementac ión de 0.25% (con base en equivalentes de azufre) , y se homogeneizó y luego se granuló con tratamiento de vapor. Como comparación con met ioni Imet ionina (I) , se llevó a cabo un experimento de granulación en cada caso con DL-metionina, MHA (análogo de metionina hidroxi) y MHA de calcio. Además, se llevó a cabo un experimento de control al granular sin la adición de un derivado de metionina (véase tabla 5) .

Tabla 5 Todos los diastereómeros de metionilmetionina permanecieron inestables a lo largo del proceso granulación y tratamiento con vapor (véase tabla 6) .

Tabla 6 (Ex: constituyentes solubles) En este caso, la determinación de los aminoácidos se basó en el método EU 98/64/EC. Después de la extracción de los aminoácidos libres y metionilmet ionina (I), éstos fueron determinados posteriormente con la ayuda de un analizador de aminoácidos mediante derivatización post-columna con ninhidrina (véase tabla 6) .

Las características de lixiviado de los días tereómeros de met ioni lmet ionina (I) de los gránulos de pienso se investigó después bajo el agua. En este caso, la disolución de met ioni lmet i onina bajo el agua como una función de tiempo, temperatura, composición del agua (agua salada o dulce) fue determinada. Para este propósito, 20.0 g de los gránulos de pienso fueron puetos en una bolsa de tamizado de malla cerrada y sumergidos completamente en 200 g de agua en un matraz Erlenmeyer. Todo el matraz Erlenmeyer fue posteriormente agitado continuamente con un agitador de laboratorio a una temperatura constante de 20°C. Después, a intervalos de tiempo definidos, se removió una muestra de agua en cada caso y el contenido de los pares individuales de diastereómeros de met ioni lmet ionina en el agua se determinó mediante HPLC (véase tabla 7) .

Tabla 7 Para comparación, en cada caso los gránulos de pienso complementados con DL-metionina, MHA o calcio MHA fueron investigados bajo las mismas condiciones y de esta manera sus características de lixiviado bajo el agua determinadas bajo las condiciones respectivas (véase figura 5 y tabla 7) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (53)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Uso de DL-metionil-DL-metionina y sales de la misma como aditivo para pienso en mezclas de pienso para animales mantenidos en acuicultivos .

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, como sal de preferencia cationes del grupo de metales alcalinos y metales alcalinotérreos y amonio, Cu2+, Zn2+ y Co2+.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde la mezcla para pienso comprende de 0.01 a 5% en peso, de preferencia 0.05 a 0.5% en peso, de DL-metionil-DL-metionina .

4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la mezcla para pienso comprende proteína y carbohidratos, de preferencia a base de harina de pescado, harina de soya o harina de maíz, y puede complementarse con aminoácidos, proteínas, péptidos, vitaminas, minerales, carbohidratos, grasas y aceites esenciales .

5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde DL-metionil-DL-metionina está presente sola o como sal como una mezcla DD/LL/LD/DL, como mezcla DL/LD o DD/LL, de preferencia en cada caso mezclada además con DL-metionina, de preferencia con un contenido de DL-metionina de 0.01 a 20% en peso, en forma particularmente preferible de 1 a 10% en peso.

6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde DL-metionil -DL-metionina está presente como un par de enantiómeros de DL/LD-metionilmetionina .

7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los animales mantenidos en acuicultivos son peces y crustáceos de agua salada y dulce, seleccionados preferiblemente del grupo que consiste en carpa, trucha, salmón, bagre, perca, platija, esturión, atún, anguilas, brema, bacalao, camarones, krill y langostinos, muy preferiblemente para carpa plateada (Hypophthalmichthys molitrix) , carpa china (Ctenopharyngodon idella) , carpa común (Cyprinus carpió) y carpa cabezona (Aristichthys nobilis) , carasio {Carassius carassius) , catla (Catla Catla) , rojo labeo (Labeo rohita) , salmón del pacífico y atlántico (Salmón salar y Oncorhynchus kisutch) , trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) , bagre americano (Ictalurus punctatus) , bagre africano (Ciarías garepinus) , pangasio (Pangasius bocourti y Pangasius hypothalamus) , tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) , sabalote (chanos Chanos) , cobia (Rachycentron canadum) , camarón patiblanco (Litopenaeus vannamei) , camarón tigre negro (Penaeus monodon) y langostino de río gigante {Macrobrachium rosenbergii) .

8. Un procedimiento para preparar DL-metionil-DL-metionina (I) con la fórmula (I) hacer reaccionar un derivado de urea de la fórmula genera (II) caracterizado porque los radicales R1 y R2 en los derivados de urea lia, Ilb, lie, lid, ie, Ilf e Ilg se definen como sigue : en donde Ha: R1 = COOH, R2 = NHCONH2 Ilb: R1 = C0NH2/ R2 = NHC0NH2 lie: R1 = CONH2/ R2 = NH2 lid: R^R2 = -CONHCONH- Ile: R1 = CN, R2 = OH Ilf: R1 = CN, R2 = NH2 Ilg: R1 = =0, R2 = H para dar DL-metionil-DL-metionina .

9. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque metionina-hidantoína se usa como material de partida o se forma como intermediario .

10. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque una solución que comprende metioninahidantoína y agua se hace reaccionar con metionina bajo condiciones básicas.

11. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque el pH de la solución que comprende el derivado de urea se ajusta de 8 a 14, de preferencia de 10 a 13.

12. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la reacción tiene lugar a una temperatura de 50 a 200°C, preferiblemente a una temperatura de 80 a 170 °C y de manera particularmente preferible a una temperatura de 130 a 160°C.

13. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo bajo presión, preferiblemente bajo una presión de de 3 a 20 bares, particularmente de manera preferible bajo una presión de 6 a 15 bares.

14. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque una solución que comprende metioninahidantoína y agua ha sido previamente formada a partir de uno o más de los compuestos lia, Ilb, lie, lid, He, Ilf e Ilg.

15. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque metioninahidantoína se obtiene al hacer reaccionar el compuesto lie o Ilf con una base que contiene nitrógeno, NH4CO3, (NH4)2C03, mezcla de NH4OH/C02, o sales carbamato.

16. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la reacción del compuesto lie se lleva a cabo a una temperatura de 0°C a 150°C, de preferencia 0°C a 100°C y de manera particularmente preferible de 10°C a 70°C.

17. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque metioninahidantoína se obtiene al hacer reaccionar el compuesto Ilf con C02.

18. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la reacción tiene lugar en presencia de una base, seleccionada de preferencia del grupo que comprende KHC03, K2C03, aminas terciarias o sales de las mismas, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

19. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque metioninahidantoína se obtiene al hacer reaccionar el compuesto Ilg con una fuente de iones de cianuro y una base seleccionada del grupo que comprende bases que contienen nitrógeno, sales amonio en presencia de C02, NH4HC03, (NH4)2C03, mezcla de NH4OH/C02 y sales carbamato.

20. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo a una temperatura de -20°C a 150°C, de preferencia - 10°C a 100°C y en forma particularmente preferible de 0°C a 70°C.

21. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) reacción del derivado de urea de las fórmulas lia, Ilb, lie, lid, lie, Ilf e Ilg para dar una dicetopiperazina (III) de la fórmula (III) b) reacción de la dicetopiperazina (III) para dar DL-metionil-DL-metionina (I) .

22. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la reacción del derivado de urea para dar la dicetopiperazina se lleva a cabo a una temperatura de 50°C a 200°C, de preferencia de 100°C a 180°C y en forma particularmente preferible de 140°C a 170°C.

23. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 21 a 22, caracterizado porque la reacción del derivado de urea para dar la dicetopiperazina se lleva a cabo bajo presión, preferiblemente bajo una presión de 3 a 20 bares, de manera particularmente preferible bajo una presión de 6 a 15 bares.

24. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque la reacción del derivado de urea para dar la dicetopiperazina tiene lugar en presencia de una base.

25. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la base se selecciona del grupo de bases que contienen nitrógeno, NH4HC03, (NH4)2C03, K2C03, mezcla de NH4OH/C02, sales carbamato, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

26. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizado porque la reacción del derivado de urea para dar la dicetopiperazina tiene lugar mediante reacción con metionina.

27. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, caracterizado porque la reacción de la dicetopiperazina para dar DL-metionil -DL-metionina tiene lugar mediante hidrólisis ácida.

28. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la hidrólisis ácida tiene lugar en presencia de un ácido que se selecciona del grupo de ácidos minerales, HC1, H2C03, C02/H20, H2S04, ácidos fosfóricos, ácidos carboxílieos y ácidos hidroxi carboxílieos .

29. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, caracterizado porque la reacción de la dicetopiperazina para dar DL-metionil-DL-metionina tiene lugar mediante hidrólisis básica.

30. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la hidrólisis básica se lleva a cabo a un pH de 7 a 14, de manera particularmente preferible a un pH de 9 a 12, de manera muy particularmente preferible a un pH de 10 a 11, para obtener así DL-metionil-DL-metionina .

31. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 29 ó 30, caracterizado porque las condiciones básicas se ajustan al usar una sustancia seleccionada del grupo de bases que contienen nitrógeno, NH4HC03, (NH4)2C03, mezcla de NH4OH/C02, sales carbamato, KHC03, K2C03, carbonatos, bases de metal alcalino y bases de metal alcalinotérreo .

32. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo a una temperatura de 50°C a 200°C, de preferencia 80°C a 180°C y en forma particularmente preferible de 90°C a 160°C.

33. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, caracterizado porque la reacción de la dicetopiperazina para dar DL-metionil-DL-metionina tiene lugar al introducir CO2 en una solución básica, de preferencia en una solución básica de hidróxido de amonio, hidróxido de potasio o hidróxido de sodio.

34. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 33, caracterizado porque la dicetopiperazina es aislada antes de la hidrólisis.

35. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la dicetopiperazina es aislada mediante cristalización a partir de la solución de reacción, de preferencia a una temperatura de -30 a 120°C, en forma muy particularmente preferible a una temperatura de 10 a 70°C.

36. Un procedimiento caracterizado porque es para aislar la mezcla de diastereómeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina mediante cristalización a partir de soluciones de reacción básicas que han sido obtenidas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20 y 29 a 35.

37. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la solución se ajusta con un ácido a un pH de 5 a 9 , de preferencia a un pH de 5 a -7, preferiblemente a un pH de alrededor de 5.6.

38. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 36 ó 37, caracterizado porque la cristalización tiene lugar en presencia de un ácido seleccionado del grupo de ácidos minerales, HC1, H2CO3, C02/H20, H2S04, ácidos fosfóricos, ácidos carboxílicos , ácidos hidroxi carboxílicos.

39. Un procedimiento para aislar la mezcla de diastereómeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina mediante cristalización a partir de soluciones de reacción ácidas, caracterizado porque se obtiene de conformidad con la reivindicación 27 ó 28.

40. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la solución se ajusta con una base a un pH de 5 a 9, de preferencia un pH de 5 a 7 , muy preferiblemente a µ? pH de alrededor de 5.6.

41. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 39 ó 40, caracterizado porque la base se selecciona del grupo de NH4HC03, (NH )2C03, bases que contienen nitrógeno, NH40H, sales carbamato, KHC03, K2C03, carbonatos, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

42. Un procedimiento para fraccionar la mezcla de diastereómeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina mediante cristalización fraccional, caracterizado porque se obtienen los dos pares de enantiómeros DD/LL-metionilmetionina y DL/LD-metionilraetionina.

43. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque a) la acidificación de la suspensión que contienen DD/LL/DL/LD-metionilmetionina hasta que se obtiene una solución transparente, y la adición gradual de una base a la solución ácida hasta que se separe un precipitado y dé como resultado DL/LD-metionil-metionina como precipitado, y b) se obtiene DD/LL-metionilmetionina del licor madre obtenido en la etapa a) .

44. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la acidificación en la etapa a) tiene lugar con un ácido y a un pH de 0.1 a 1.0, de preferencia un pH de aproximadamente 0.6 es establecido, y la solución transparente resultante se ajusta posteriormente con una base hasta un pH de 5 a 6 , de preferencia hasta un pH de alrededor de 5.6.

45. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 43 ó 44, caracterizado porque ácidos minerales, de preferencia ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido carbónico o dióxido de carbono, de manera particularmente preferible ácido carbónico o dióxido de carbono y/o ácidos carboxílicos son empleados como ácidos.

46. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 43 ó 44, caracterizado porque la base se selecciona del grupo de NH4HC03, (NH4)2C03, bases que contienen nitrógeno, NH4OH, sales carbamato, KHC03, K2C03, carbonatos, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

47. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque a) la basificación de la suspensión que contiene DD/LL/DL/LD-metionilmetionina hasta que se obtenga una solución transparente, y la adición gradual de un ácido a la solución básica hasta que un precipitado se separe y dé como resultado DL/LD-metionilmetionina como precipitado, y b) se obtiene DD/LL-metionilmetionina del licor madre obtenido en la etapa a) .

48. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la basificación en la etapa a) tiene lugar con una base y se ajusta un pH de 7.5 a 14, de preferencia un pH de alrededor de 9 a 13, y la solución transparente resultante se ajusta posteriormente con un ácido a un pH de 5 a 6, de preferencia hasta un pH de aproximadamente 5.6.

49. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 47 ó 48, caracterizado porque la base se selecciona del grupo de NHHC03, (NH4)2C03, bases que contienen nitrógeno, NH40H, sales carbamato, KHC03, K2C03, carbonatos, bases de metal alcalino y metal alcalinotérreo .

50. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 47 ó 48, caracterizado porque ácidos minerales, de preferencia ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido carbónico o dióxido de carbono, de manera particularmente preferible ácido carbónico o dióxido de carbono y/o ácidos carboxílieos son empleados como ácido.

51. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 50, caracterizado porque se lleva a cabo a una temperatura de 0°C a 100°C, de preferencia 5°C a 60°C y de manera particularmente preferible de 10°C a 40°C.

52. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 51, caracterizado porque la DD/LL-metionilmetionina resultante es racemizada, y los dos pares de enantiómeros DD/LL-metionilmetionina y DL/LD-metionilmetionina se separan uno de otro.

53. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 52, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo en un medio acuoso.