BRPI0920882B1 - “processo para preparação de dl-metionil-dl- metionina e isolamento da mistura de diastereômeros de dd/ll/dl/ld- metionilmetionina e uso dos mesmos” - Google Patents

Description

(54) Título: PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DE DL-METIONIL-DL-METIONINA E ISOLAMENTO DA MISTURA DE DIASTEREÔMEROS DE DD/LL/DL/LD- METIONILMETIONINA E USO DOS MESMOS (51) Int.CI.: C07C 319/20; C07C 319/28; C07D 241/08 (30) Prioridade Unionista: 17/10/2008 DE 10 2008 042 932.5 (73) Titular(es): EVONIK DEGUSSA GMBH (72) Inventor(es): CHRISTOPH KOBLER; THOMAS HÀUSSNER; CHRISTOPH WECKBECKER

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DE DL-METIONIL-DL-METIONINA E ISOLAMENTO DA MISTURA DE DIASTEREÔMEROS DE DD/LL/DL/LD- METIONILMETIONINA E USO DOS MESMOS.

Introdução

A presente invenção refere-se às novas sínteses químicas de metionilmetionina, o dipeptídeo de metionina, e o uso específico das mesmas como aditivo alimentício sozinho ou misturado com metionina para nutrição de peixes e crustáceos.

Técnica Anterior

Aminoácidos essenciais (EAA) tais como metionina, lisina ou treonina são constituintes muito importantes como aditivos alimentícios em nutrição animal e desempenham uma parte significante na criação comercial de animais produtivos tais como, por exemplo, galinhas, porcos e ruminantes.

Suplementação de fontes de proteína natural tais como, por exemplo, sojas, milho e trigo com EAAs torna possível por um lado os animais desenvolverem-se mais rápido, ou a produção de leite ser maior em vacas leiteiras de alta produção, porém por outro lado para a utilização da alimentação ser mais eficaz. Isto representa uma vantagem comercial muito grande. Os mercados para aditivos alimentícios são de grande importância industrial e comercial. Além disso, eles são mercados de alto desenvolvimento, atribuível não apenas à importância crescente de países tais como, por exemplo, China e Índia.

L-Metionina (ácido (S)-2-amino-4-metiltiobutírico) representa o primeiro aminoácido limitante para muitas espécies tais como galinhas, pa25 tos, perus e também para muitas espécies de peixe e marisco e, portanto, desempenha um papel muito significante em nutrição animal e como aditivo alimentício (Rosenberg e outro, J. Agr. Food Chem. 1957, 5, 694-700 e Lovell, T. R., J. Anim. Sci. 1991, 69, 4193-4200). Entretanto, na síntese química clássica, metionina resulta como racemato, uma mistura de 50:50 de D- e

L-metionina. Esta DL-metionina racêmica pode, entretanto, ser empregada diretamente como aditivo alimentício por que existe em algumas espécies sob condições in vivo um mecanismo de transformação que converte o

Petição 870180008475, de 31/01/2018, pág. 13/58

2/45 enantiômero D não natural de metionina no enantiômero L natural. Isto vincula primeiramente a D-metionina sendo desaminada com o auxílio de uma D-oxidase não específica para α-cetometionina, e subsequentemente ser também transformada com uma L-transaminase em L-metionina (Baker, D.

H. in Amino acids in farm animal nutrition, D'Mello, J.P.F. (ed.), Wallingford (UK), CAB International, 1994, 37-61). A quantidade disponível de L-metionina no corpo é desse modo aumentada e pode em seguida ser disponível para o animal durante o crescimento. A transformação enzimática de D- em L-metionina foi detectada em galinhas, porcos, e vacas, porém especialmen10 te também em peixes carnívoros e onívoros e também em camarões e pitus. Desse modo, por exemplo, Sveier e outro, (Aquacult. Nutr. 2001, 7 (3), 169181) e Kim e outro, (Aquaculture 1992, 101 (1-2), 95-103) foram capazes de mostrar que a transformação de D- em L-metionina é possível em salmão do Atlântico carnívoro e truta arco-íris. Robinson e outro, (J. Nutr. 1978, 108 (12), 1932-1936) e Schwarz a outro, (Aquaculture 1998, 161, 121-129) foram capazes de mostrar o mesmo para espécies de peixe onívoro tais como, por exemplo, bagre e carpa. Além disso, Forster e Dominy (J. World Aquacult. Soc. 2006, 37 (4), 474-480) foram capazes de mostrar em experimentos de alimentação em camarões onívoros da espécie Litopenaeus vannamei que a

DL-metionina tem a mesma atividade como L-metionina.

A produção mundial em 2007 de DL-metionina cristalina e racêmica, análogo de hidróxi de metionina líquida (MHA, ácido rac-2-hidróxi-4(metiltio)butanóico (HMB)) e MHA de cálcio sólido foi maior do que 700 0001, que foi empregada de forma bem- sucedida diretamente como aditivo alimentício para animais monogástricos tais como, por exemplo, aves domésticas e porcos. Devido ao rápido desenvolvimento comercial de criação de peixe e crustáceo em aquaculturas altamente industrializadas uma opção de suplementação de metionina ideal, econômica e eficiente tornouse crescentemente importante precisamente nesta área nos últimos anos (Food e Agriculture Organization of the United Nation (FAO) Fisheries Department State of World Aquaculture 2006, 2006, Rome, International Food

Policy Research Institute (IFPRI) Fish 2020: Supply and Demand in Chan3/45 ging Markets, 2003, Washington, D.C.). Entretanto, ao contrário de galinhas e porcos, vários problemas ocorrem no uso de metionina, MHA ou Ca-MHA como aditivo alimentício para certas variedades de peixe e crustáceo. Desse modo, Rumsey e Ketola (J. Fish. Res. Bd. Can. 1975, 32, 422-426) reportam que o uso de refeição de soja em conjunção com aminoácidos individuais cristalinos suplementados não induziu a qualquer aumento no desenvolvimento de truta arco-íris. Murai e outro, (Bull. Japan. Soc. Sci. Fish. 1984, 50, (11), 1957) foram capazes de mostrar que alimentação diária de dietas de peixe com taxas elevadas de aminoácidos cristalinos suplementados em carpa induziu a não mais do que 40% dos aminoácidos livres sendo excretados por meio das guelras e rins. Por causa da rápida absorção de aminoácidos suplementados logo após a ingestão de alimento, existe um aumento muito rápido na concentração de aminoácido no plasma sanguíneo do peixe (rápida resposta). Entretanto, neste momento, os outros aminoácidos das fontes de proteína natural tal como, por exemplo, refeição de soja não estão ainda presentes no plasma, possivelmente induzindo à assincronia da biodisponibilidade atual de todos os aminoácidos importantes. Como um resultado da mesma, parte dos aminoácidos altamente concentrados é rapidamente excretada ou rapidamente metabolizada no corpo, e é usada, por exemplo, como fonte de energia pura. Como um resultado, existe apenas um leve ou nenhum aumento no desenvolvimento de, sob o uso de aminoácidos cristalinos como aditivos alimentícios (Aoe e outro, Bull. Jap. Carpa Soc. Sci. Fish. 1970, 36, 407-413). A suplementação de aminoácidos cristalinos pode induzir a outros problemas em crustáceos. O comportamento alimentar lento de certos crustáceos tal como, por exemplo, camarões da espécie Litopenaeus Vannamei resulta, devido ao longo tempo de residência do alimento sob água, nos aminoácidos solúveis em água suplementados que são dissolvidos (lixiviação), induzindo à eutroficação da água e não a um aumento no desenvolvimento dos animais (Alam e outro, Aquaculture 2005, 248, 13-16).

O eficiente suprimento de peixes e crustáceos mantidos em aquaculturas desse modo requer, para certas espécies e aplicações, uma forma de produto de metionina específica, tal como, por exemplo, uma meti4/45 onina apropriadamente química ou fisicamente protegida. O objetivo disto é por um lado que o produto permaneça suficientemente estável no ambiente aquoso durante a alimentação e não é dissolvido fora do alimento. Por outro lado que o produto de metionina eventualmente tomado pelo animal pode ser utilizado idealmente e com eficiência elevada no corpo animal.

Muitos esforços foram feitos no passado para desenvolver aditivos alimentícios adequados, particularmente com base na metionina, para peixes e crustáceos. Desse modo, por exemplo, WO8906497 descreve o uso de di- e tripeptídeos como aditivo alimentício para peixes e crustáceos. A invenção deste é promover o crescimento dos animais. Entretanto, os di- e tripeptídeos preferivelmente empregados neste caso foram de aminoácidos não essenciais e, portanto, não limitantes tais como, por exemplo, glicina, alanina e serina. Os únicos dipeptídeos contendo metionina descritos são DL-alanil-DL-metionina e DL-metionil-DL-glicina. Entretanto, isto significa que eficazmente apenas 50% de substância ativa (mol/mol) estão presentes no dipeptídeo, e isto deve ser categorizado como muito desvantajoso a partir do aspecto econômico. WO02088667 descreve a síntese enantiosseletiva e uso de oligômeros de MHA e aminoácidos tal como, por exemplo, metionina como aditivos alimentícios, entre outros, também para peixes e crustáceos. É referido ser possível obter crescimento mais rápido desse modo. Os oligômeros descritos são agrupados por uma reação catalisada por enzima e exibem uma distribuição muito ampla dos comprimentos de cadeia dos oligômeros individuais. Isto torna o processo não seletivo, caro e elaborado no procedimento e purificação. Dabrowski e outro, descrevem em US20030099689 o uso de peptídeos sintéticos como aditivos alimentícios para promoção do crescimento de animais aquáticos. Neste caso, a proporção dos peptídeos na formulação de alimento completo pode ser de 6 a 50% em peso. Os peptídeos sintéticos preferivelmente consistem em aminoácidos essenciais e limitantes. Entretanto, a síntese de tais oligo- e polipeptídeos sintetizados é muito elaborada, dispendioso e difícil de converter para escala industrial. Além disso, a eficácia de polipeptídeos de um único aminoácido é disputada, por que estes são frequentemente convertidos apenas muito lentamente ou de modo algum

5/45 sob condições fisiológicas nos aminoácidos livres. Desse modo, por exemplo, Baker e outro, (J. Nutr. 1982, 112, 1130-1132) descrevem a falta de valor biologico de poli-L-metionina em galinhas por causa da insolubilidade em água, visto que a absorção pelo corpo é impossível.

Além do uso de novos derivados de metionina químicos tais como, por exemplo, peptídeos e oligômeros contendo metionina, existe também a investigação de várias possibilidades de proteção física tais como, por exemplo, revestimentos e a incorporação de um aminoácido em uma matriz protetora. Desse modo, por exemplo, Alam e outro, (Aquacult. Nutr. 2004, 10, 309-316 e Aquaculture 2005, 248, 13-19) foram capazes de mostrar que a metionina revestida e lisina têm, ao contrário da não revestida, uma influência muito positiva sobre o crescimento de camarões kuruma jovens. Embora o uso de um revestimento específico fosse capaz de suprimir a lixiviação de metionina e lisina fora da pélete de alimentação, existem algumas sérias desvantagens. A preparação ou o revestimento de metionina geralmente representa um processo tecnicamente complicado e elaborado e é, portanto, dispendioso. Além disso, o revestimento da superfície da metionina após o revestimento é facilmente lesionado por estresse mecânico e abrasão processo de alimentação, possivelmente induzindo a uma diminuição ou perda total da proteção física. Um fator adicional é que o teor de metionina é reduzido, e desse modo frequentemente torna-se não econômico, por um revestimento ou uso de uma substância matriz.

Além disso, o uso novo inventivo de DL-metionil-DL-metionina como aditivo alimentício com características de baixa lixiviação com péletes de alimentação e extrudados, e um suprimento ideal de metionina para o corpo através de divagem de liberação lenta de metionilmetionina, foi também possível desenvolver novos processos para a preparação de metionilmetionina que têm muitas vantagens sobre as variantes de preparação descritas na literatura. A maioria das sínteses de dipeptídeo descritas na literatura usam grupos de proteção dispendiosos tais como, por exemplo, grupos de proteção Boc- (ferc-butoxicarbonil) ou Z-(benziloxicarbonil), que devem ser ligados ao apropriado amidoácido antes da síntese de dipeptídeo real, e

6/45 subsequentemente eliminados novamente. Além disso, a ativação dos aminoácidos a serem acoplados é geralmente necessária. Desse modo, metionilmetionina pode ser preparada acoplando-se N-Boc-metionina com o metil éster de metionina usando diciclo-hexilcarbodiimida (DCC). As maiores desvantagens deste processo de preparação são o uso de grupos de proteção dispendiosos, uma síntese muito elaborada e reagentes de acoplamento dispendiosos que não podem ser reciclados, tal como, por exemplo, DCC. Outra alternativa para a síntese industrial de metionilmetionina é descrita em DE2261926. 3,6-Bis[2-metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (metioninadicetopiperazina, DKP) é formada no primeiro estágio aquecendo o isopropil éster de metionina e é em seguida hidrolisada em metionilmetionina. Produções meramente satisfatórias de 62 a 65% foram possíveis pela estapa de hidrólise neste caso. Além disso, o uso de isopropil éster de metionina como material de partida é também dispendioso e, portanto, não econômico.

Objetivo da invenção

Um objetivo geral foi fornecer um gênero alimentício ou um aditivo alimentício para nutrição animal com base em um novo substituto de metionina que pode ser empregado sozinho ou como mistura com metionina especialmente no setor de criação industrial de peixe e crustáceo em aquaculturas. Foi pretendido ao mesmo tempo desenvolver síntese química simples e econômico deste novo substituto de metionina.

Levando em consideração as desvantagens da técnica anterior, foi o objetivo em particular fornecer um produto de metionina quimicamente protegido para várias espécies de peixes e crustáceos onívoros, herbívoros e carnívoros que vivem em água salgada ou fresca. Pretendia-se em particular que este produto mostrasse características de baixa solubilidade (lixiviação) da pélete ou extrudado de alimentação completa em água e possuísse um mecanismo de liberação lenta, isto é, uma liberação lenta e contínua da metionina livre sob condições fisiolígicas. Além disso, pretendia-se também que o novo produto de metionina pudesse ser empregado vantajosamente como mistura com DL-metionina.

Um outro objetivo foi encontrar um substituto de metionina como

7/45 gênero alimentício ou um aditivo alimentício que tem valor biológico muito elevado e que foi pretendido ser fácil de manipular e armazenar e ter boa estabilidade sob condições usuais de processamento de alimentação composta, especialmente peletização e extrusão.

Pretendia-se desta maneira suprir os peixes e crustáceos com uma outra fonte de metionina eficaz, além de DL-metionina cristalina, cuja fonte exibe, se possível, as desvantagens dos produtos conhecidos apenas para uma extensão reduzida ou de modo algum.

Pretendia-se também desenvolver uma nova rotina de síntese flexível para metionilmetionina (DL-metionil-DL-metionina) em que os subprodutos e precursores típicos do processo de produção de DL-metionina industrial podem ser usados como material de partida. Pretendia-se adicionalmente desenvolver um processo adequado os pares de diastereômeros DD/LL- e DL/LD-metionilmetionina, de modo que um uso ideal e eficaz de apenas um par de diastereômeros (DL/LL-I ou DL/LD-I) seja possível para aplicações específicas.

Descrição da Invenção

O objetivo é obtido pelo uso de DL-metionil-DL-metionina e sais da mesma como aditivo alimentício em misturas alimentícias para animais mantidos em aquaculturas.

De uma maneira preferida, a mistura alimentícia compreende de 0,01 a 5% em peso, e preferivelmente compreende de 0,05 a 0,5% em peso de DL-metionil-DL-metionina.

O uso de DL-metionil-DL-metionina tem demonstrado ser particularmente vantajoso neste contexto por que o composto mostra excelentes características de lixiviação por causa da baixa solubilidade da mistura de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina e do par de diastereômeros DL/LD-metionilmetionina (0,4 g/l).

O composto também mostra boa estabilidade de peletização e extrusão durante a produção de alimento. DL-Metionil-DL-metionina é estável em misturas com componentes convencionais e gêneros alimentícios tais como, por exemplo, cereais (por exemplo, milho, trigo, triticale, cevada, pa8/45 inço, entre outras coisas), fontes de proteína vegetal ou animal (por exemplo, óleo de semente de colza e sojas e os produtos do processamento dos mesmos, legumes (por exemplo, ervilhas, feijões, tremoços, etc.), refeição de peixe, entre outras coisas) e em combinação com aminoácidos essenciais suplementados, proteínas, peptídeos, carbo- hidratos, vitaminas, minerais, gorduras e óleos.

É também vantajoso que, um mol de água é salvo por mol de metionilmetionina em comparação com DL-metionina devido ao alto teor de substância ativa de metionilmetionina por kg de substância.

Em um uso preferido, a mistura alimentícia compreende proteínas e carbo- hidratos, preferivelmente com base na refeição de peixe, refeição de soja ou refeição de milho, e pode ser suplementada com aminoácidos essenciais, proteínas, peptídeos, vitaminas, minerais, carbo- hidratos, gorduras e óleos.

É particularmente preferido a DL-metionil-DL-metionina estar presente em uma mistura alimentícia unicamente como mistura de DD/LL/LD/DL, como mistura de DL/LD ou DD/LL, preferivelmente em cada caso adicionalmente misturada com DL-metionina, preferivelmente com um teor de DL-metionina de 0,01 a 20% em peso, particularmente preferivelmente de 1 a 10% em peso.

Em um uso particularmente preferido, DL-metionil-DL-metionina está presente como um par de DL/LD-metionilmetionina de enantiômeros.

Em um uso preferido, os animais mantidos em aquaculturas são peixes e crustáceos de água salgada e fresca selecionados do grupo que consiste em carpa, truta, salmão, bagre, perca, linguado, esturjão, atum, enguias, brema, bacalhau, camarões, kríll e pitus, muito preferivelmente para carpa prateada (Hypophthalmichthys molitríx), carpa capim (Ctenopharyngodon idella), carpa comum (Cyprínus carpio) e carpa cabeçuda (Aristichthys nobilis), carassius (Carassius carassius), catla (Catla Catla), Roho labeo (Labeo rohita), salmão do Pacífico e Atlântico (Salmon salare Oncorhynchus kisutch), truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), bagre americano (Ictalurus punctatus), bagre africano (Ciarias gariepinus), pangasius (Pangasius bo9/45 courti e Pangasius hypothalamus), Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), milkfish (Chanos), cobia (Rachycentron canadum), camarão pata-branca (Litopenaeus vannamei), camarão tigre preto (Penaeus monodori) e pitu de rio gigante (Macrobrachium rosenbergii).

De acordo com a invenção, DL-metionil-DL-metionina (I) (metionilmetionina ou Met-Met abreviado) ou seus sais de metal de álcali e metal alcalinoterroso tal como, por exemplo, o sal de cálcio ou zinco levemente solúvel é usada como adição em misturas alimentícias como mistura de diastereômero de DD/LL/DL/LD, DD/LL ou DL/LD, sozinha ou misturada com

DL-metionina, preferivelmente para peixes e crustáceos:

Quatro diferentes estereoisômeros (diastereômeros) existem do dipeptídeo DL-metionil-DL-metionina (I), DD-, LL, DL- e LD-I, do qual apenas L-metionil-L-metionina (LL-I) é natural, todos os outros três dipeptídeos L-metionil-D-metionina (LD-I), D-metionil-L-metionina (DL-I) e D-metionil-Dmetionina (DD-I) sendo não naturais (vide esquema 1).

Esquema 1

(DL-I) (LD-I)

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Neste contexto, DD-I e LL-I são relacionados um ao outro como imagens e imagens refletidas, isto é, eles são enantiômeros e desse modo têm as mesmas propriedades físicas. O mesmo aplica-se ao par de DL-I e LD-I.

Os dois pares de DD/LL-I e DL/LD-I são ao contrário diastereômeros um do outro, isto é, eles têm diferentes dados físicos. Desse modo, por exemplo, o par de DD/LL-I de diastereômeros tem uma solubilidade de 21,0 g/l em água em temperatura ambiente, onde como a solubilidade do par de DL/LD-I de é de 0,4 g/l.

Além disso, o desenvolvimento de novos métodos sintéticos para metionilmetionina, a presente invenção refere-se ao uso de DL-metionilDL-metionina como gêneros alimentícios como mistura de diastereômero de DD/LL/DL/LD, DD/LL ou DL/LD como promotor de crescimento para peixes e crustáceos onívoros, carnívoros e herbívoros em aquaculturas. Foi, desse modo, possível mostrar inventivamente que DL-metionil-DL-metionina (I) pode ser clivada sob condições fisiológicas enzimaticamente por peixes e crustáceos à D- e L-metionina livre (esquema 2) (vide também exemplos 22 a 24). Para este propósito, as enzimas digeridas correspondentes foram isoladas de carpa (onívora), truta (carnívora) e camarão pata-branca (onívoro) e reagidas com DL-metionil-DL-metionina em experimentos in vitro otimizados sob condições fisiologicamente comparáveis. A característica particular de acordo com a invenção da divagem de DL-metionil-DL-metionina (I) é que todos os quatro possíveis diastereômeros, tanto o LL-I natural, quanto os três diastereômeros não naturais DD-, DL- e LD-I podem ser clivados sob condições fisiológicas. Isto se aplica tanto ao uso da mistura completa de todos os diastereômeros (DD/LL/DL/LD-I), quanto em cada caso para os dois pares de diastereômeros DD/LL-I e DL/LD-I (veja figura 1).

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Esquema 2

Enzimas digeridas

NH.

cqH

D-Metionina

Transamidação nh₂

L-Metionina

Entretanto, a divagem dos diastereômeros individuais de metionilmetionina ocorre em diferentes taxas. Isto é ilustrado pela representação diagramática da divagem enzimática dos diastereômeros individuais de me5 tionilmetionina com enzimas digeridas de peixes e crustáceos na figura 2. Entretanto, a divagem retardada significa que a liberação de D- e L-metionina é igualmente retadada também (vide figura 3). Isto tem a grande vantagem que pode não existir nenhuma absorção de resposta rápida de D- ou L-metionina livre no trato digestivo e desse modo nenhum pico de concen10 tração de metionina livre no plasma sanguíneo, tampouco.

A vantagem de usar metionilmetionina como aditivo alimentício e fonte de metionina é desse modo que a D- ou L-metionina pode ser liberada no corpo durante o período de digestão completo e desse modo prossegue sincronicamente com a iberação de outros aminoácidos derivados de fontes de proteína natural (mecanismo de liberação lenta) (vide figura 3). Este efeito especial resulta na disponibilidade simultânea de todos os aminoácidos essenciais e importantes em uma relação ideal no plasma sanguíneo sendo assegurada, como é absolutamente necessário para um crescimento ideal

12/45 do corpo.

Na divagem enzimática do dipeptídeo DL-metionil-DL-metionina (I), a D-metionina não natural é também liberada na adição à L-metionina natural (vide esquema 2). O iniciador pode ser enzimaticamente transaminada tanto por peixes quanto crustáceos carnívoros, onívoros e herbívoros de água salgada e fresca para fornecer L-metionina natural. Foi possível mostrar isto para o exemplo de carpa no exemplo 25. Foi possível com o auxílio de um coquetel de enzima de enzimas digestivas e de fígado de carpa para transformar D- em L-metionina sob condições fisiologicamente correspondentes (vide figura 4). Um suprimento ideal de L-metionina natural ao corpo é desse modo assegurado no uso de DL-metionil-DL-metionina (I).

Os experimentos de peletização e extrusão com várias misturas de DL-metionil-DL-metionina (I) e fontes de carbo- hidrato e proteína natural tal como, por exemplo, refeição de peixes, milho e soja, e misturadas com outros aminoácidos essenciais, proteínas, peptídeos, vitaminas, minerais, gorduras e óleos, mostram que DL-metionil-DL-metionina (I) é absolutamente adequada durante e após o processo de produção e nenhuma degradação ou decomposição qualquer que seja ocorre (vide exemplo 26).

A fim de investigar as características de lixiviação dos diastereômeros de metionilmetionina (I) de péletes de alimentação composta sob água, o tempo de dependência da dissolução de metionilmetionina foi medido (vide exemplo 26). Para comparação, as características de lixiviação de DL-metionina, MHA e MHA de cálcio (MHA-Ca) foram investigadas sob condições idênticas. Emergiu disto que tanto a mistura completa de todos os diastereômeros (DD/LL/DL/LD-I) quanto os pares de diastereômeros DD/LL-I e DL/LD-I mostram distintamente menos lixiviação do que DL-metionina, MHA e MHA de cálcio (MHA-Ca) (vide figura 5). Muito menos metionilmetionina é desse modo dissolvido fora das péletes de alimentação ao longo do tempo do que com todos os outros derivados de metionina. Particularmente taxas de baixa lixiviação são mostradas pelo par de DL/LD-I de diastereômeros, um máximo de apenas 5% do que foi dissolvido fora dos péletes de alimentação mesmo após um tempo de re13/48 sidência de 200 minutos (vide figura 5).

O objetivo é também obtido por um processo para a preparação de DL-metionil-DL-metionina (I) com a fórmula

reagindo um derivado de ureia da fórmula geral II

em que os radicais R¹ e R² nos derivados de ureia lla, llb, llc, lld, lie, llf e llg são definidos como segue: em que lla: R¹ = COOH, R² = NHCONH₂ llb: R¹ = CONH2, R² = NHCONH2 llc: R¹ = CONH2, R² = NH2 lld: R¹-R² = -CONHCONHlle: R¹ = CN, R² = OH llf: R¹ = CN, R² = NH₂ llg: R¹ = =0, R² = H para fornecer DL-metionil-DL-metionina (I).

Em uma modalidade do processo da invenção é, entretanto, preferido metionina-hidantoína (lld) ser usada como material de partida ou ser formada como produto intermediário. Neste proceso, DL-metionil-DL-metionina é sintetizada diretamente de metionina-hidantoína e inclui método G, H, e J mostrado no esquema 3.

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Esquema 3

Método A para lla e llb

Método B para llc

Método C para lie e llf

Método D para llg

Método E

Método F

(XI)

Método G para lla, llb e lld

Método H para llc, lie e llf

Método J para llg

Método K

DD/LL-Ϊ DL/LD-X

É preferido neste contexto para uma solução compreendendo metioninaidantoína e água ser reagida com metionina sob condições básicas. É também preferido para o pH da solução compreendendo o derivado de ureia ser ajustado para 8 a 14, preferivelmente para 10 a 13.

De uma maneira preferida, a reação ocorre em uma temperatura de 50 a 200°C, preferivelmente em uma temperatura de 80 a 170°C e particularmente preferivelmente em uma temperatura de 130 a 160°C.

É também preferido que a reação seja realizada sob pressão, preferivelmente sob uma pressão de 0,3 a 2 MPa(3 a 20 bars), particular10 mente preferivelmente sob uma pressão de 0,6 a 1,5 MPa( 6 a 15 bars).

Em um outro processo preferido, uma solução compreendendo metionina-hidantoína e água foi anteriormente formada a partir de um ou

15/45 mais compostos Ila, llb, llc, lld, lie, llf e llg.

Em um outro processo preferido, metionina-hidantoína é obtida reagindo o composto lie ou llf com uma base contendo nitrogênio, mistura de NH4HCO3, (NH₄)₂CO₃, NH₄OH/CO₂ ou sais de carbamato.

A reação do composto lie é preferivelmente realizada em uma temperatura de 0°C a 150°C, preferivelmente 0°C a 100°C e particularmente preferivelmente de 10°C a 70°C.

Em um outro processo preferido, a metionina-hidantoína é obtida reagindo o composto llf com CO₂. É preferido neste contexto que a reação ocorra na presença de uma base, preferivelmente selecionada do grupo compreendendo KHCO₃, K₂CO₃, aminas terciárias ou sais das mesmas, bases de metal de álcali e metal alcalinoterroso.

Em um outro processo preferido, metionina-hidantoína é obtida reagindo o composto llg com uma fonte de íon de cianeto e a base selecio15 nada do grupo compreendendo bases contendo nitrogênio, sais de amônio na presença de CO₂, mistura de NH₄HCO₃, (NH₄)₂CO₃, NH₄OH/CO₂ e sais de carbamato. A reação neste caso ocorre em uma temperatura de preferivelmente -20°C a 150°C, preferivelmente -10°C a 100°C e particularmente preferivelmente de 0°C a 70°C.

Uma modalidade alternativa do processo da invenção compreende as seguintes etapas:

a) reação do derivado de ureia de fórmulas Ila, llb, llc, lld, lie, llf e llg para fornecer uma dicetopiperazina da fórmula

b) reação da dicetopiperazina para fornecer DL-metionil-DLmetionina. Este processo inclui método A, B, C e D mostrado no esquema 3.

Neste proceso, dicetopiperazina (III) é formada como intermediário.

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É preferido neste contexto que a reação dos derivados de ureia para fornecer a dicetopiperazina seja realizada em uma temperatura de 50°C a 200°C, preferivelmente de 100°C a 180°C e particularmente preferivelmente de 140°Ca 170°C.

Em um processo preferido, a reação do derivado de ureia para fornecer a dicetopiperazina ocorre sob pressão, preferivelmente sob uma pressão de 0,3 a 2MPa (3 a 20 bars), particularmente preferivelmente sob uma pressão de (6 a15 bars).

A reação do derivado de ureia para fornecer a dicetopiperazina preferivelmente ocorre na presença de uma base. A base neste contexto é preferivelmente selecionada do grupo de bases contendo nitrogênio, mistura de NH4HCO3, (NH₄)₂CO₃, KHCO_3i K₂CO₃, NH4OH/CO2, sais de carbamato, bases de metal de álcali e metal alcalinoterroso.

Em um outro processo preferido, a reação do derivado de ureia para fornecer a dicetopiperazina ocorre por reação com metionina. Uma relação de derivado de ureia para metionina de 1:100 a 1:0,5 é preferida neste contexto.

Em um outro processo preferido, a reação da dicetopiperazina para fornecer DL-metionil-DL-metionina ocorre por hidrólise acídica. A hidrólise acídica é neste caso realizada na presença de um ácido que é preferivelmente selecionado do grupo de ácidos minerais, HCI, H₂CO₃, CO₂/H₂O, H2SO4, ácidos fosfóricos, ácidos carboxílicos e ácidos hidróxi carboxílicos .

Em outra modalidade do processo da invenção, a reação da dicetopiperazina para fornecer DL-metionil-DL-metionina ocorre por hidrólise básica. Neste caso, a hidrólise básica é preferivelmente realizada em um pH de 7 a 14, particularmente preferivelmente em um pH de 9 a 12, muito particularmente preferivelmente em um pH de 10 a 11, a fim de obter DL-metionil-DL-metionina. É, entretanto, possível que as condições básicas sejam ajustadas usando uma substância que é preferivelmente selecionada do grupo de bases contendo nitrogênio, mistura de NH₄HCO₃, (NH₄)₂CO₃, NH4OH/CO2, sais de carbamato, KHCO₃, K₂CO₃, carbonatos, bases de metal de álcali e metal alcalinoterroso.

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A hidrólise acídica ou básica é preferivelmente realizada em temperaturas de 50°C a 200°C, preferivelmente de 80°C a 180°C e particularmente preferivelmente de 90°C a 160°C.

Em uma outra modalidade, a reação da dicetopiperazina para fornecer DL-metionil-DL-metionina é realizada introduzindo CO₂ em uma solução básica, preferivelmente em uma solução de hidróxido de amônio básico, hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio.

Em um processo preferido, a dicetopiperazina é isolada antes da hidrólise. É preferido neste contexto que a dicetopiperazina seja isolada por cristalização de uma solução de reação, preferivelmente em uma temperatura de -30 a 120°C, particularmente preferivelmente em uma temperatura de 10a70°C.

Para isolar a mistura de diastereômeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina de soluções de reação básicas, eles são acidificados e a metionilmetionina é obtida por cristalização ou precipitação. É preferido neste contexto que o pH seja de 5 a 9, particularmente preferido que o pH seja 5 a 7, e muito particularmente preferido que o pH seja de cerca de 5,6. É possível neste contexto usar ácidos preferivelmente do grupo de ácidos minerais, HCl, H₂CO₃, CO2/H2O, H2SO4, ácidos fosfóricos, ácidos carboxilicos e ácidos hidróxi carboxilicos para a acidificação.

Para isolar a mistura de diastereômeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina de soluções de reação acídicas, bases são adicionadas para neutralizar, e a metionilmetionina é obtida por cristalização ou precipitação. É preferido neste contexto que o pH seja de 5 a 9, particularmente preferido que o pH seja de 5 a 7, e muito particularmente preferido que o pH seja de cerca de 5,6. As bases usadas neste caso para a neutralização são preferivelmente do grupo de NH4HCO3, (NH₄)₂CO3, bases contendo nitrogênio, NH₄OH, sais de carbamato, KHCO₃, K₂CO₃, carbonatos, bases de metal de álcali e metal alcalinoterroso.

A invenção também fornece um processo para fracionamento da mistura de diastereômeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina por cristalização fracional, desse modo obtendo os dois pares de enantiômeros DD/LL18/45 metionilmetionina e DL/LD-metionilmetionina.

Em uma modalidade preferida do processo de cristalização fracional por acidificação, o procedimento é como segue:

a) acidificação da suspensão contendo DD/LL/DL/LD-metionilmetionina até uma supensão clara ser obtidas, e adição em etapas de uma base à solução acídica até um precipitado separar-se, resulta em DL/LDmetionilmetionina como precipitado,

b) DD/LL-metionilmetionina é obtida do licor mãe obtida em etapa a).

É particularmente preferido neste contexto que a acidificação na etapa a) ocorra com um ácido e que um pH de 0,1 a 1,0, preferivelmente um pH de cerca de 0,6, seja estabelecido, e que a solução clara resultante subsequentemente seja ajustada com uma base para um pH de 5 a 6, preferivelmente para um pH de cerca de 5,6. É possível usar como ácido neste contexto ácidos minerais, preferivelmente ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico ou ácido carbônico, ou dióxido de carbono, e/ou ácidos carboxílicos, especialmente os C1-C4 ácidos carboxílicos, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico ou ácido isobutírico. Ácido carbônico ou dióxido de carbono é particularmente preferivelmente usado. É possível neste caso que o ácido carbônico ou dióxido de carbono seja introduzido na mistura reacional sob pressão atmosférica ou pressão superatmosférica.

As condições básicas são ajustadas na etapa a) preferivelmente usando uma base selecionada do grupo de NH4HCO3, (NH₄)₂CO3, bases contendo nitrogênio, NH₄OH, sais de carbamato, KHCO₃, K₂CO₃, carbonatas, bases de metal de álcali e bases de metal alcalinoterroso.

Em uma outra modalidade preferida do processo de fracional cristalizaçãio por basificação, o procedimento é como segue:

a) basificação da suspensão contendo DD/LL/DL/LD-metionilmetionina até uma supensão clara ser obtida, e adição em etapas de um ácido à solução básica até um precipitado separar-se, resulta em DL/LD-metionilmetionina como precipitado.

b) DD/LL-metionilmetionina é subsequentemente obtidas do licor

19/45 mãe obtidas em etapa a).

É particularmente preferido neste contexto que a basificação na etapa a) ocorra com uma base e que um pH de 7,5 a 14, preferivelmente um pH de cerca de 9 a 13, seja ajustado, e que a solução clara resultante subsequentemente seja ajustada com um ácido para um pH de 5 a 6, preferivelmente para um pH de cerca de 5,6. Bases preferivelmente usadas neste caso são bases do grupo NH4HCO3, (NH₄)₂CO₃, bases contendo nitrogênio, NH₄OH, sais de carbamato, KHCO₃, K₂CO₃, carbonatos, bases de metal de álcali e metal alcalinoterroso.

As condições acídicas na etapa a) são preferivelmente ajustadas usando um ácido do grupo de ácidos minerais, preferivelmente ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ou ácido carbônico ou dióxido de carbono, e/ou do grupo de ácidos carboxílicos, em particular os C1-C4 ácidos carboxílicos, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico e ácido isobutírico. Ácido carbônico ou dióxido de carbono é particularmente preferivelmente usado.

Em uma modalidade preferida do processo de cristalização fracional, ocorre em uma temperatura de 0°C a 100°C, preferivelmente 5°C a 60°C e particularmente preferivelmente de 10°C a 40°C.

A DD/LL-metionilmetionina resultante pode, entretanto, ser racemizada e introduzida no processo de separação descrito acima, desse modo separando os dois pares de enantiômeros DD/LL-metionilmetionina e DL/LD-metionilmetionina um do outro.

Todos os processos da presente invenção que foram mencionados são preferivelmente realizados em um meio aquoso.

O processo da presente invenção pode, além disso, ser realizado em um processo de batelada conhecido pelo versado na técnica ou em processos contínuos.

Figuras

Figura 1 mostra uma representação diagramática da divagem enzimática das misturas de diastereômero de metionilmetionina DD/LL-I,

DL/LD-I e DD/LL/DL/LD-I.

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Figura 2 mostra uma representação diagramática da divagem enzimática dos quatro diastereômeros de metionilmetionina DD-I, LL-I, DL-I e LD-I com diferentes taxas de divagem.

Figura 3 mostra uma representação diagramática da liberação enzimática de metionina (D- e L-Met juntos) dos quatro diastereômeros de metionilmetionina DD-I, LL-I, DL-I e LD-I.

Figura 4 mostra a biotransformação de D-metionina em L-metionina com um coquetel de enzima de carpa comum.

Figura 5 mostra as características de lixiviação de misturas de diastereômero de metionilmetionina DD/LL-I, DL/LD-I e LL/DD/LD/DL-1 em comparação com metionina, MHA e MHA-Ca.

Figura 6 mostra a digestão in vitro de quatro diferentes diastereômeros de metionilmetionina LL-I, LD-I, DL-I e DD-I com enzimas digeridas da carpa comum.

Figura 7 mostra a digestão in vitro de várias misturas de diastereômero de metionilmetionina LL/DD-I, DL/LD-I e LL/DD/LD/DL-I com enzimas digeridas da carpa comum.

Figura 8 mostra a digestão in vitro de quatro diferentes diastereômeros de metionilmetionina LL-I, LD-I, DL-I e DD-I com enzimas digeridas da truta arco-íris.

Figura 9 mostra a digestão in vitro das misturas de diastereômero de metionilmetionina LL/DD-I, DL/LD-I e LL/DD/LD/DL-I com enzimas digeridas da truta arco-íris.

Figura 10 mostra a digestão in vitro de quatro diferentes diastereômeros de metionilmetionina LL-I, LD-I, DL-I e DD-I com enzimas digeridas dos camarões de pata-branca.

Figura 11 mostra a digestão in vitro de várias misturas de diastereômero de metionilmetionina LL/DD-I, DL/LD-I e LL/DD/LD/DL-I com enzimas digeridas dos camarões de pata-branca.

Exemplos

A) Visão geral das etapas individuais e método do processo da invenção

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O processo da invenção para a preparação de DL-metionil-DLmetionina (I) e a separação nos pares de DD/LL-I e DL/LD-I de diastereômeros são descritos em detalhes abaixo.

O processo da invenção para a preparação de DL-metionil-DL5 metionina (I) inicia a partir de um composto da fórmula geral II

onde Ila: R¹ = COOH, R² = NHCONH₂ llb: R¹ = CONH2, R² = NHCONH2 llc: R¹ = CONH₂, R² = NH2 lld: R¹-R² = -CONHCONHlle: R¹ = CN, R² = OH llf: R¹ = CN, R² = NH2 llg: R¹ = =0, R² = H.

Este composto é transformado por vários métodos sintéticos (A, B, C, D, E, F, G, H e J) em DL-metionil-DL-metionina (I) (vide esquema 3). Nos métodos A, B, C, e D aqui, a dicetopiperazina correspondente (III) é produzida como intermediário. Nos métodos sintéticos G, H e J, metionina hidantoína é produzida como intermediário e é transformada diretamente em DL-metionil-DL-metionina (I). É subsequentemente possível por cristalização fracional pelo método K separar os dois pares de diastereômeros DD/LL-I e DL/LD-I (vide esquema 3).

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Esquema 3

Método A para lia e llb

Método B para llc

Método C para lie e llf

Método D

Método E

Método F

(II)

Método G para lia, llb e lld

Método H para llc, lie e llf

Método J para llg

DD/L.L/DL/LD- {1}

Método K

DO/LL-I DL/LD-X

B) Exemplos de síntese:

Exemplo 1:

Síntese de 3,6-bisí2-(metiltio)etin-2,5-piperazinadiona (III) (metioninadiceto5 piperazina, DKP) de N-carbomoilmetionina (lia) pelo método A

17,5 g (90,0 mmols, pureza: 99%) de N-carbomoilmetionina (lia) foram dissolvidos em 150 ml de água e agitados em uma autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética a 160°C durante 6 horas. A pressão sobe durante isto. De vez em quando, gás é descarregado até uma pressão de 0,7MPa (7 bar) ser alcançada. Após a conclusão da reação, a autoclivagem foi resfriada em um banho de gelo. A suspensão resultante foi em seguida filtrada, e o sólido filtrado foi lavado diversas vezes com água e seco em um forno de secagem a 50°C em vácuo. A produção isolada foi de 8,1 g (30,9 mmols) (69%) de bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III), cristais branco-amarelado, pureza > 98% (HPLC), ponto de fusão 234 a 236°C.

23/45 ¹H-RMN de 3,6-bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III) (500 MHz, De-DMSO): δ = 1,85-2,05 (m, 4H, 2 x SCH₂CH₂); 2,049 (s, 6H, 2 x SCH₃); 2,46-2,60 (m, 4H, 2 x SCH₂); 3,92-3,99 (m, 2H, 2 x CH); 8,213 (s, 2H, 2x NH) ¹³C-RMN de 3,6-bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III) (125,8 MHz, De-DMSO): δ = 14,35 (CH₃); 14,38 (CH₃); 28,50 (CH₂S); 28,68 (CH₂S); 31,92 (CH₂CH₂S); 32,33 (CH₂CH₂S); 52,92 (CH); 52,96 (CH); 167,69 (C=O); 167,71 (C=O)

Análise elementar para CioH₁₈N₂0₂S₂ (M = 262,39 g/mol):

Calculada: C 45,77; H 6,91; N 10,68; S 24,44

Encontrada: C 45,94; H 6,96; N 10,64; S 24,38

Exemplo 2:

Síntese de S.S-bis^-fmetiltiojetill^.S-piperazinadiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 2-[(aminocarbonil)amino1-4-(metiltio)butanoamida (N-carbomoilmetioninamida) (Ilb) pelo método A

17,4 g (90,0 mmols, pureza: 98,5%) de 2-[(aminocarbonil)amino]-4-(metiltio)butanoamida (lib) foram dissolvidos em 150 ml de água e agitados em uma autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética a 160°C durante 7 horas. A pressão sobe durante isto. De vez em quando, gás é descarregado até uma pressão de 0,7 MPa(7 bars) ser alcançada. Após a conclusão da reação, a autoclivagem foi resfriada em um banho de gelo. A suspensão resultante foi em seguida filtrada, e o sólido filtrado foi lavado diversas vezes com água e seco em um forno de secagem a 50°C em vácuo. A produção isolada foi de 9,2 g (35,1 mmol) (78%) de bis[2(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III), cristais branco-amarelado, pureza > 98% (HPLC).

O ponto de fusão e os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 1.

Exemplo 3:

Síntese de 3,6-bis[2-(metiltio)etin-2,5-piperazinadiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 5-í2-(metiltio)etin-2₁4-imidazolidinadiona (lld) (metionina-hidantoína) pelo método A e reuso subsequente do licor mãe (reação em

24/45 cascata)

Primeira batelada:

Uma suspensão de 13,4 g (0,09 mol) de metionina, 17,2 g (0,09 mol, pureza: 91%) de metionina-hidantoína (lld) e 150 g de água foram introduzidos na autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética e agitados a 160°C durante 6 horas, durante as quais a pressão aumentou para 15 bars. De vez em quando, a autoclivagem foi descomprimida até a pressão estabelecer-se em uma constante de 10 bars. A autoclivagem foi em seguida resfriada em um banho de gelo, e a suspensão resultante foi filtrada e o sólido foi lavado com 75 ml de água. Finalmente, o sólido foi seco em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante a noite. Bis[2-(metiltio)etil]2,5-piperazinadiona (lll) foi isolado como cristais branco-amarelado.

Subsequente batelada:

A água de lavagem e o licor mãe da batelada precedente foram combinados e concentrados para 90 ml em um evaporador giratório a 50°C. 17,2 g (0,09 mol, pureza: 91%) de metionina-hidantoína (lld) foram absorvidos com licor mãe concentrado e preparado até 150 g de solução com água. A solução resultante foi introduzida na autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética e agitada a 160°C durante 6 horas, durante as quais a pressão aumentou para 1,5 MPa (15 bars). De vez em quando, a autoclivagem foi descomprimida até a pressão permanecer constante a (10 bars). Outra preparação ocorreu em analogia à primeira batelada.

Exemplo 4:

Síntese de 3,6-bisf2-(metiltio)etil1-2₁5-piperazinadiona (lll) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 2-amino-4-(metiltio)butanoamida (metioninamida) (llc) pelo método B

16,6 g (0,09 mol) de cloridrato de 2-amino-4-(metiltio) butanoamida (llc) e 8,7 g (0,09 mol) de (NH4)₂CO₃ foram dissolvidos em 150 g de água e agitados em uma autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética a 160°C durante 6 horas. A autoclivagem foi em seguida resfriada em um banho de gelo. A suspensão resultante foi em seguida filtrada, e o sólido filtrado foi lavado diversas vezes com água e seco em um forno de

25/45 secagem a 50°C em vácuo. A produção isolada foi de 6,5 g (24,8 mmols) (55%) de bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III), cristais brancoamarelado, pureza > 98% (HPLC).

O ponto de fusão e os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 1.

Exemplo 5:

Síntese de 3.6-bisr2-(metiltio)etil1-2,5-piperazinadiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 2-hidróxi-4-(metiltio)butanonitrila (ciano-hidrina de 3(metilmercapto)propionaldeído, MMP-CH) (lie) pelo método C

Uma solução de 30,5 g (0.232 mol) de 2-hidróxi-4-(metiltio)butanonitrila (lie) e 360 g de água foi lentamente adicionada gota a gota em temperatura ambiente a uma suspensão de 22,4 g (0,283 mol = 1,22 eq.) de NH4HCO3 em 20 g de água e agitada durante 2 horas. O NH4HCO3 dissolveu-se durante isto. A solução resultante foi subsequentemente agitada a 50°C durante 7 horas e em seguida em temperatura ambiente durante a noite. A mistura reacional foi em seguida transferida em uma autoclave de aço de 500 ml, aquecida para 160°C, e agitada nesta temperatura durante 6 horas. A autoclivagem foi em seguida resfriada em um banho de gelo, a suspensão resultante foi filtrada, e 0 sólido foi lavado com 50 ml de água. Finalmente, o sólido pálido foi secado em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante a noite. A produção isolada foi de 17,8 g (67,8 mmols) (58%) de bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III), cristais branco-amarelado, pureza > 98% (HPLC).

O ponto de fusão e os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 1.

Exemplo 6:

Síntese de 3,6-bis[2-(metiltio)etil1-2.5-piperazinadiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 2-amino-4-(metiltio)butanonitrila (metioninanitrila) (llf) pelo método C

Uma corrente moderada de CO₂ foi passada em uma solução de

26,2 g (0,201 mol) de 2-amino-4-(metiltio)butanonitrila (llf) em 330 g de água durante um período de 3 horas, durante o qual a temperatura aumentou para

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45°C e o pH estabeleceu-se em 8. Agitação foi em seguida continuada em temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, a mistura reacional foi transferida em uma autoclave de aço de 500 ml, aquecida para 160°C e agitada nesta temperatura durante 6 horas. A autoclivagem foi em seguida resfriada em um banho de gelo, a suspensão resultante foi filtrada, e o sólido foi lavado com 50 ml de água e seco em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante a noite. A produção isolada foi de 15,7 g (59,7 mmols) (59%) de bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III), cristais branco-amarelado, pureza > 98% (HPLC).

O ponto de fusão e os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 1.

Exemplo 7:

Síntese de 3,6-bis[2-(metiltio)etil1-2.5-piperazinadiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) de 3-(metiltio)propanaldeído (3-(metilmercapto)propionaldeído, MMP) (llg) pelo método D

66,0 g (0,68 mol) de (NH^COs foram introduzidos em 100 g de água e resfriados para 5°C em um banho de gelo. Em seguida, durante o curso de 25 minutos, 16,6 g (0,61 mol) de ácido hidrociânico recentemente destilado foram adicionados gota a gota, durante o que a temperatura da suspensão foi mantida na faixa de 5 a 10°C. A adição de 860 g de água foi seguido por adição gota a gota, a 10°C, de 60,3 g (0,58 mol) de 3(metiltio)propionaldeído (llg) durante um período de 80 minutos. O pH permaneceu constante na faixa de 8,5 a 9 durante esta. A mistura reacional foi em seguida aquecida para 50°C e agitada nesta temperatura durante 7 horas. Após a conclusão da reação, a mistura reacional foi resfriada para 5°C em um banho de gelo e armazenada em um refrigerador durante a noite. Na manhã seguinte, a mistura foi transferida em uma autoclave de aço de 2 I, aquecida para 160°C e agitada nesta temperatura durante 6 horas. A autoclivagem foi em seguida resfriada em um banho de gelo, a suspensão resultante foi filtrada e lavada com 150 ml de água, e o sólido foi seco em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante a noite. A produção isolada foi de 48,6 g (185,2 mmols) (64%) de bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona

27/45 (III), cristais branco-amarelado, pureza > 98% (HPLC).

O ponto de fusão e os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 1.

Exemplo 8:

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 3,6-bisí2-(metiltio)etin-2,5piperazinadiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) com ácido clorídrico concentrado pelo método E

655,9 g (2,50 mol) de 3,6-bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III) (DKP) foram suspensos em 1661 g de água. Ao mesmo tempo que agitando, 271,0 g de ácido clorídrico concentrado foram muito lentamente adicionados gota a gota e em seguida cuidadosamente aquecidos, com agitação muito vigorosa, até o refluxo. Diversas espumações podem ocorrer durante isto. A mistura reacional foi aquecida até o refluxo durante 5,5 horas, desse modo dissolvendo todo o sólido. Durante o resfriamento subsequente, o DKP não reagido (III) precipitou-se e foi filtrado. Este DKP pode ser empregado novamente durante outras hidrólises em reações posteriores. O filtrado foi em seguida ajustado para o pH 6 em um béquer de vidro em um banho de gelo com amônia aquosa a 32% de intensidade. A DD/LL/DL/LDmetionilmetionina (I) separa-se como uma massa espessa de cristais, e mistura de 50:50 dos dois pares de diastereômeros (DL/LD-Met-Met) (DL/DL-I) e (DD/LL-Met-Met) (DD/LL-I) durante isto. Ela foi finalmente seca em um forno de secagem a 60°C em vácuo. Produção: 601,0 g (2,14 rnols) (85,7%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido levemente amarelado, pureza 98% (HPLC).

¹H-RMN de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) (500 MHz, D₆DMSO+HCI): δ = 1,86-2,16 (m, 4H, 2 x SCH₂CH₂); 2,050 (s, 3H, SCH₃); 2,060 (s, 3H, SCH₃); 2,44-2,64 (m, 4H, 2 x SCH₂); 2,90-4,00 (m, 1H, CH); 4,32-4,42 (m, 1H, CH); 8,45 (bs, 3H, NH₃ ⁺); 8,98-9,08 (m, 1H, 2 x NH) ¹³C-RMN de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) (125,8 MHz, D₆DMSO+HCI): δ = 14,33 (CH₃); 14,38 (CH₃); 27,74; 27,94; 29,51; 30,04;

30,13; 30,89; 30,95; 51,00; 51,29; 51,54 (CH, CH₂); 168,05 (CONH); 168,19 (CONH); 172,55 (COOH); 172,62 (COOH)

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Análise elementar para C10H20N2O3S2 (M = 280.41 g/mol):

Calculada: C 42,83; H 7,19; N 9,99; S 22,87

Encontrada: C 42,61; H 7,19; N 10,06; S 22,72

Exemplo 9:

Síntese industrial de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 3,6-bis[2(metiltio)etin-2,5-piperazinadiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) com ácido clorídrico concentrado pelo método E

500 I de água foram introduzidos em um tanque esmaltado de

500 I com agitador, 32 I de ácido clorídrico concentrado e 78,6 kg de 3,6bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III) (DKP) foram adicionados, e 0 aparato foi firmemente fechado. Ele foi em seguida aquecido a 110°C ao mesmo tempo que agitando durante 2 horas, durante as quais a pressão aumentou para 0,25 MPa (2,5 bar) e o DKP (III) virtualmente completamente dissolvido. Após a reação ser concluída, a mistura foi resfriada para 20°C, e o DKP não reagido foi centrifugado em uma centrífuga. O sólido foi lavado com 10 I de água. O filtrado e água de lavagem foram em seguida coletados em um recipiente de 800 I e subsequentemente introduzidos em um tanque de 500 I com agitador novamente. A adição de 2 kg de carbono ativado foi seguida por agitação a 20°C durante 30 minutos. A suspensão foi em seguida filtrada através de uma prensa de filtro em um outro tanque de 500 I com agitador. Cerca de 28 I de solução de amônia concentrada foram em seguida adicionados para precipitar em pH 6 a DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I). Durante isto existe precipitação preferencial inicial do par racêmico menos solúvel de diastereômeros DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I). Isto foi centrifugado e o líquido mãe foi concentrado juntamente com água de lavagem para um quarto do volume original volume em vácuo de bomba de vapor em uma temperatura interna não excedendo 40°C. Durante isto, o par racêmico mais solúvel de diastereômeros DD/LL-metionilmetionina (DD/LL-I) cristalizados juntos com pequenas quantidades do DL/LD-I levemente solúvel. A conclusão da destilação foi seguida por resfriamento para 20°C e centrifugação. O líquido mãe separado e água de lavagem foram descartados. Ambas as frações foram secas em vácuo a 70°C. No total, foi possível obter 64,2 kg

29/45 (78%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) como mistura de diastereômeros. Pureza > 98% (HPLC).

O ponto de fusão e os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8.

Exemplo 10:

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 3,6-bis[2-(metiltio)etin-2,5piperazinadiona (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) sob condições alcalinas, por exemplo, com ammonia pelo método F

65,6 g (0,25 mol) de 3,6-bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III) (DKP), 70 ml de solução de amônia de intensidade a 25% e 500 ml de água são aquecido a 150°C em uma autoclave durante 2 horas. Após resfriamento, o DKP não reagido (III) (16,0 g = 24,4%) é filtrado com sucção. Isto pode ser empregado novamente em uma batelada subsequente. O filtrado foi concentrado em um evaporador giratório em uma temperatura de água de 80-90°C até os primeiros cristais separarem-se. Após resfriar e deixar repousar durante à noite foi possível isolar após filtragem e secagem em total de 49,3 g (70,3%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) como mistura de 50:50 dos dois pares de diastereômeros DL/DL-I e DD/LL-I como um sólido branco. Pureza 98% (HPLC).

O ponto de fusão e os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8.

Exemplo 11:

Purificação de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I)

500 g de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) foram suspensos em 7800 g de água desionizada (pH 5,3). A 26°C, o pH foi ajustado para 1,0 com 346,6 g de 50% em peso ácido sulfúrico. A metionilmetionina completamente dissolvida. Para clarificação, 18 g de carbono ativado foram adicionados à solução turva amarelada e agitada durante 60 minutos. O carbono ativado foi filtrado, e a solução incolor clara foi ajustada para o pH 5,6 com 228 g de 32% em peso de solução de amônia. A solução foi deixada repousar durante à noite. O sólido branco precipitado foi filtrado com sucção e seco em um forno de secagem a 50°C em vácuo. Produção: 460,5 g (92%) de

30/45

DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco brilhante, pureza > 99% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. Exemplo 12:

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de N-carbomoilmetionina (lla) e DL-metionina com KOH pelo método G

13,4 g (0,09 mol) de DL-metionina, 17,5 g (0,09 mol, pureza: 99%) de N-carbomoilmetionina (lla) e 11,9 g (0,18 mol) de 85% de KOH puro foram dissolvidos em 150 ml de água e agitados a 150°C em uma autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética durante 5 horas, durante as quais a pressão aumentou para 0,6 MPa (6 bar). Após a reação ser concluída, a autoclivagem foi resfriada, e a 3,6-bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona precipitada (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) foi filtrada e lavada com um pouco de água. A água de lavagem e o líquido mãe foram combinados e concentrados para um volume de 130 ml em um evaporador giratório a 40°C. Uma corrente moderada de CO₂ foi em seguida passada em a solução resultante até um pH de 6,4 ser alcançado e um sólido branco precipitar-se. Este foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e seca em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. A produção isolada foi de 11,4 g (40,6 mmol) (45%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 98% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. Exemplo 13:

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 5-f2-(metiltio)etin-2,4imidazolidinediona (lld) (metioninaidantoína) e DL-metionina com KOH pelo método G

13,4 g (0,09 mol) de DL-metionina, 17,2 g (0,09 mol, pureza: 91%) de metioninaidantoína (lld) e 8,9 g (0,135 mol) de 85% de KOH puro foram dissolvidos em 150 ml de água e agitados a 150°C em uma autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética durante 5 horas, durante as quais a pressão aumentou para 0,8MPa (8 bar). Após a reação ser concluída, a autoclivagem foi resfriada, a suspensão resultante foi filtrada e a 3,631/45 bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona precipitada (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) foi lavada diversas vezes com um pouco de água. O líquido mãe e água de lavagem foram combinados, e a solução resultante foi concentrado para um volume de 125 ml em um evaporador giratório a 40°C. O concentrado foi cuidadosamente neutralizado com ácido clorídrico concentrado. Um sólido branco precipitou-se na agitação em temperatura ambiente e em um pH de 5,8 durante à noite. Este sólido foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e seca em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. A produção isolada foi de 17,5 g (62,4 mmols) (69%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 98% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. Exemplo 14:

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 5-f2-(metiltio)etil1-2,4imidazolidinediona (lld) (metioninaidantoína) e DL-metionina com K?CO₃ pelo método G

13,4 g (0,09 mol) de DL-metionina, 17,2 g (0,09 mol, pureza: 91%) de metioninaidantoína (lld) e 12,4 g (0,09 mol) de K₂CO₃ foram dissolvidos em 150 ml de água e agitados a 150°C em uma autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética durante 5 horas, durante as quais a pressão aumentou para 1,2 MPa (12 bar). Após a reação ser concluída, a autoclivagem foi resfriada, e a 3,6-bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona precipitada (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) foi filtrada e lavada com um pouco de água. A água de lavagem e o líquido mãe foram combinados e concentrados para um volume de 135 ml em um evaporador giratório a 40°C. Uma corrente moderada de CO₂ foi em seguida passada em a solução resultante até um pH de 6,8 ser alcançado e um sólido branco precipitar-se. Este foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e secaseca em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. Produção: 14.3 g (60,0 mmols) (57%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 99% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8.

Exemplo 15:

32/45

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 5-í2-(metiltio)etil1-2,4imidazolidinediona (lld) (metioninaidantoína) e DL-metionina com KHCOg pelo método G

13,4 g (0,09 mol) de DL-metionina, 17.2 g (0,09 mol, pureza: 91%) de metioninaidantoína (lld) e 9.1 g (0,09 mol) de KHCO₃ foram dissolvidos em 150 ml de água e agitados a 150°C em uma autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética durante 5 horas, durante as quais a pressão aumentou para 1,2 MPa (12 bar). Após a reação ser concluída, a autoclivagem foi resfriada, e a 3,6-bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona precipitada (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) foi filtrada e lavada com um pouco de água. A água de lavagem e o líquido mãe foram combinados e concentrados para um volume de 120 ml em um evaporador giratório a 40°C. Uma corrente moderada de CO₂ foi em seguida passada em a solução resultante até um pH de 6.3 ser alcançado e um sólido branco precipitar-se. Este foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e seca em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. Produção: 16,0 g (57,1 mmols) (63%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 99% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. Exemplo 16:

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 2-amino-4-(metiltio) butanoamida (llc) (metioninamida) e DL-metionina com (NH^bCOg pelo método H

8,3 g (0,045 mol) de cloridrato de 2-amino-4-(metiltio) butanoamida (llc), 6,7 g (0,045 mol) de metionina, 4,3 g (0,045 mol) de (NH₄)2CO₃ e 3,0 g (0,045 mol) de 85% de KOH puro foram dissolvidos em 75 g de água e agitados a 160°C em uma autoclave de aço Roth de 200 ml com agitação magnética durante 6 horas. A autoclivagem foi em seguida resfriada em um banho de gelo, a suspensão resultante foi filtrada, e a 3,6-bis[2-(metiltio)etil]2,5-piperazinadiona precipitada (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) foi lavada com um pouco de água. A água de lavagem e o líquido mãe foram combinados e concentrados para um volume de 70 ml em um evaporador

33/45 giratório a 40°C. Uma corrente moderada de CO₂ foi em seguida passada em a solução resultante até um pH de 6,3 ser alcançado e um sólido branco precipitar-se. Este foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e seca em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. Produção: 7,8 g (27,8 mmols) (62%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 98% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. Exemplo 17:

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (!) de 2-hidróxi-4-(metiltio) butanonitrila (lie) (cianoidrina de 3-(metilmercapto)propionaldeído, MMP-CH) e

DL-metionina com NH4HCO3 pelo método H

15,2 g (0,116 mol) de 2-hidróxi-4-(metiltio)butanonitrila (lie) foram lentamente adicionados gota a gota em temperatura ambiente a uma suspensão de 11,1 g (0,141 mol = 1,22 eq.) de NH4HCO3 em 10 g de água e agitada durante 2 horas. O NH4HCO3 dissoveu-se durante isto. Em seguida 180 g de água foram adicionados e a solução resultante foi agitada a 50°C durante 7 horas e em temperatura ambiente durante à noite. Na manhã seguinte, 17,3 g (0,116 mol) de metionina, 7,7 g (0,116 mol) de 85% de KOH puro e mais 180 g de água foram adicionados, e a mistura reacional foi transferida em uma autoclave de aço de 1 I, aquecida para 160°C e agitada nesta temperatura durante 6 horas. A autoclivagem foi em seguida resfriada em um banho de gelo, a suspensão resultante foi filtrada, e a 3,6-bis[2(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona precipitada (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) foi lavada com 100 ml de água. O líquido mãe e água de lavagem foram combinados, e a solução resultante foi concentrada para um volume de 160 ml em um evaporador giratório a 40°C. O concentrado foi cuidadosamente neutralizado com ácido sulfúrico de intensidade a 50%. Um sólido branco precipitou-se na agitação em temperatura ambiente e em um pH de

5,4 durante à noite. Este sólido foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e seca em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. Produção: 15,2 g (54.2 mmols) (47%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 99% (HPLC).

34/45

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. Exemplo 18:

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 2-amino-4-(metiltio) butanonitrila (llf) (metioninanitrila) com CO?_e DL-metionina pelo método H

Uma corrente moderada de CO₂ foi passada em uma solução de 26,2 g (0,201 mol) de 2-amino-4-(metiltio)butanonitrila (llf) em 330 g de água durante um período de 3 horas, durante as quais a temperatura aumentou para 45°C e o pH ajustado em 8. Agitação foi em seguida continuada em temperatura ambiente durante à noite. Na manhã seguinte, a mistura reacional foi misturada com 30,0 g (0,201 mol) de metionina e 13,3 g (0,201 mol) de 85% de KOH puro e transferida em uma autoclave de aço de 1 I, aquecida para 160°C e agitada nesta temperatura durante 6 horas. A autoclivagem foi em seguida resfriada em um banho de gelo, a suspensão resultante foi filtrada, e a 3,6-bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona precipitada (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) foi lavada com um pouco de água. A água de lavagem e o líquido mãe foram combinados e concentrados para um volume de 280 ml em um evaporador giratório a 40°C. Uma corrente moderada de CO₂ foi em seguida passada em a solução resultante até um pH de 6,0 ser alcançado e um sólido branco precipitar-se. Este foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e seco em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. Produção: 32,7 g (116,6 mmols) (58%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 98% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. Exemplo 19:

Síntese de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) de 3-(metiltio)propanaldeído (llq) (MMP) com ácido hidrociânico, amônio carbonato e DL-metionina pelo método J

66,0 g (0,68 mol) de (NH₄)₂CO₃ foram introduzidos em 100 g de água e resfriada para 5°C em um banho de gelo. Em seguida 16,55 g (0,612 mol) de ácido hidrociânico recentemente destilado foram adicionados gota a gota durante o curso de 25 minutos, durante os quais a temperatura da suspensão foi mantida a 5 a 10°C. Após 500 g de água terem sido adi35/45 cionados, 60,3 g (0,58 mol) de 3-(metiltio)propionaldeído (llg) foram adicionados gota a gota a 10°C durante um período de 80 minutos. O pH permaneceu constante na faixa de 8,5 a 9 durante isto. A mistura reacional foi em seguida aquecida para 50°C e agitada nesta temperatura durante 7 horas. Após a reação ser concluída, a mistura reacional foi resfriada para 5°C em um banho de gelo e armazenada em um refrigerator durante à noite. Na manhã seguinte, 86,5 g (0,58 mol) ácido 2-amino-4-(metiltio)butanoico (metionina), 38,3 g (0,58 mol) de 85% de KOH puro (0,58 mol), e mais 530 g de água foram adicionados. A mistura foi transferida em uma autoclave de aço de 2 I, aquecida para 160°C e agitada nesta temperatura durante 6 horas. A autoclivagem foi em seguida resfriada em um banho de gelo, a suspensão resultante foi filtrada, e a 3,6-bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona precipitada (III) (metioninadicetopiperazina, DKP) foi lavada com um pouco de água. A água de lavagem e o líquido mãe foram combinados e concentrados para um volume de 800 ml em um evaporador giratório a 40°C. Uma corrente moderada de CO₂ foi em seguida passada em a solução resultante até um pH de 6,0 ser alcançado e um sólido branco precipitar-se. Este foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e seco em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. Produção: 85,1 g (0,30 mol) (52%) de DD/LL/DL/LDmetionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 98% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. Exemplo 20:

Separação dos dois pares de diastereômeros DD/LL-metionilmetionina (DD/LL-I) e DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) por cristalização fracionai from DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) pelo método K

a) DL/LD-Metionilmetionina (DL/LD-I):

290,4 g de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I) (mistura de 50:50 DD/LL-I e DL/LD-I) foram suspensos em 2614 g de água desionizada e ajustados para o pH 0,6 com 381,7 g de 50% em peso de ácido sulfúrico. A solução incolor clara foi ajustada para o pH 5,6 com 265,9 g de 32% em peso de solução de amônia, e o precipitado branco resultante foi filtrado com sucção (580,9 g de umidade). O sólido foi finalmente seco em um forno de secagem

36/45 em vácuo a 50°C. A produção foi de 126,2 g (86,9%) de DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I), sólido branco, pureza > 98% (HPLC), faixa de fusão 232 a 233°C (decomposição).

¹H-RMN de DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) (500 MHz, De-DMSO+HCI): 1,88-2,12 (m, 4H, 2 x SCH2CH2); 2,031 (s, 3H, CH3); 2,041 (s, 3H, CH3); 2,48-2,56 (m, 4H, 2 x SCH2); 3,87-3,95 (m, 1H, CH); 4,30-4,38 (m, 1H, CH); 8,429 (d, 3H, ³J = 4,4Hz, NH3⁺); 9,034 (d, 1H, ³J= 8,0Hz, NH) ¹³C-RMN de DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) (125,8 MHz, DeDMSO+HCI): 14,57 (CH₃); 14,62 (CH₃); 28,19; 29,75; 30,28; 31,19; 51,25 (CH); 51,79 (CH); 168,29 (CONH); 172,80 (COOH)

Solubilidade (água, 20°C): 0.4 g/l b) DD/LL-Metionilmetionina (DD/LL-I):

O líquido mãe incolor de a) foi concentrado em um evaporador giratório a 35°C sob vácuo de bomba de água. Uma suspensão branca foi obtida. O sólido branco composto de sulfato de amônio, resíduos de DL/LD-I e o composto alvo foram em seguida filtrados com sucção e secos em vácuo a 50°C. Os três sólidos foram separados suspendendo-se a mistura em água desionizada e agitação. O DL/LD-I não dissolvido foi filtrado com sucção, e o líquido mãe foi concentrado para cerca de um quinto em um evaporador giratório a 50°C sob vácuo de bomba de água. Após repouso prolongado, DD/LL-metionilmetionina (DD/LL-I) cristalizou-se como um sólido branco. Ele foi finalmente filtrado com sucção e seco em um forno de secagem a vácuo a 50°C. A produção foi de 78,2 g (53.9%) com base na DD/LLmetionilmetionina (DD/LL-I), sólido branco, > 96% (HPLC), faixa de fusão 226 a 227°C (decomposição).

¹H-RMN de DD/LL-metionilmetionina (DD/LL-I) (500 MHz, D6-DMSO+HCI): 1,84-2,12 (m, 4H, 2 x SCH2CH2); 2,044 (s, 3H, CH3); 2,046 (s, 3H, CH3); 2,48-2,62 (m, 4H, 2 x SCH2); 3,89-3,97 (m, 1H, CH); 4,33-4,40 (m, 1H, CH); 8,422 (d, 3H, ³J = 4,0Hz, NH3⁺); 9,065 (d, 1H, ³J = 7,5Hz, NH) ¹³C-RMN de DD/LL-metionilmetionina (DD/LL-I) (125,8 MHz, DeDMSO+HCI): 14,56 (CH₃); 14,57 (CH₃); 27,97; 29,73; 30,35; 31,11; 51,22 (CH); 51,50 (CH); 168,41 (CONH); 172,83 (COOH)

37/45

Solubilidade (água, 20°C): 21,0 g/l Exemplo 21:

Racemização dos dois pares de diastereômeros DD/LL-metionilmetionina (DD/LL-I) e DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) sob condições básicas

a) Racemização de DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I)

12,6 g (45,0 mmols) do par de diastereômeros DL/LD-metionilmetionina (DL/LD-I) foram dissolvidos juntamente com 3,1 g (22,5 mmols) de K₂CO₃ em 75 ml de água em um reator de laboratório Roth de 200 ml e aquecidos para 160°C ao mesmo tempo agitando. A pressão aumentou para 0,7 MPa (7 bar) durante isto. Após 6 horas nesta temperatura, a autoclivagem foi resfriada em um banho de gelo. A suspensão resultante foi em seguida filtrada, e o sólido foi filtrado, lavado diversas vezes com água e seca em um forno de secagem em vácuo a 50°C. A produção isolada foi de 6,5 g (24,8 mmols) (55%) de bis[2-(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III), cristais branco amarelado, pureza > 98%, ponto de fusão 234 a 236°C; relação de diastereômero: 52:48 (DD/LL-III : meso- III). A água de lavagem e o líquido mãe foram combinados e concentrados para um volume de 25 ml em um evaporador giratório a 40°C. Uma corrente moderada de CO₂ foi em seguida passada em a solução resultante até o pH alcançar 6,0 e um sólido branco precipitar-se. Este foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e seco em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. A produção isolada foi de 5,7 g (20,3 mmols) (45%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 98% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. a) Racemização de DL/LD-metionilmetionina (DD/LL-I)

12,6 g (45,0 mmols) de DD/LL-metionilmetionina (DD/LL-I) foram dissolvidos juntamente com 4,5 g (45,0 mmols) de KHCO₃ em 75 ml de água em um reator de laboratório Roth de 200 ml e aquecidos para 160°C ao mesmo tempo agitando. A pressão aumentou para 0,7 MPa (7 bar) e, após 6 horas nesta temperatura, a autoclivagem foi resfriada em um banho de gelo. A suspensão resultante foi em seguida filtrada, e o sólido filtrado foi lavado diversas vezes com água e seco em um forno de secagem em vácuo

38/45 a 50°C. A produção isolada foi de 6,0 g (22,9 mmols) (51%) de bis[2(metiltio)etil]-2,5-piperazinadiona (III), cristais branco amarelado, pureza > 98% (HPLC), ponto de fusão 233 a 236°C; relação de diastereômero: 54:46 (DD/LL-III : meso- III). A água de lavagem e o líquido mãe foram combinados e concentrados para um volume de 25 ml em um evaporador giratório a 40°C. Uma corrente moderada de CO₂ foi em seguida passada na solução resultante até o pH alcançar 6,0 e um sólido branco precipitar-se. Este foi filtrado, lavado com um pouco de água fria e seca em um forno de secagem a vácuo a 50°C durante à noite. A produção isolada foi de 5,5 g (19,6 mmols) (44%) de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina (I), sólido branco, pureza > 98% (HPLC).

Os dados de RMN estão de acordo com aqueles de exemplo 8. Exemplo 22:

Experimentos de digestão in vitro em DL-metionil-DL-metionina (I) com enzimas digeridas de carpa onívora

a) Isolamento das enzimas digeridas de carpa comum (Cyprinus carpio morpha noblis)

O método para o isolamento das enzimas digeridas foi com base naquele de EID e MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111-119). Para este propósito, o intestino de cinco carpas comuns de um ano de idade (Cyprinus carpio morpha noblis) foi exposto, enxaguado com água e cortado aberto longitudinamente, e em cada caso a mucosa intestinal foi raspada. Isto foi fragmentado juntamente com gelo esmagado usando um misturador. A suspensão resultante foi tratada com uma sonda ultrassônica a fim de romper as células que estavam ainda intactas. A gordura e constituintes de célula foram separados centrifugando-se a suspensão a 4°C durante 30 minutos, e o homogeneizado foi decantado e esterilizado com um traço de timerosal. 260,7 ml de solução de enzima da mucosa intestinal foram obtidos de 5 carpas comuns, e a solução foi armazenada no escuro a 4°C.

b) Procedimento para as investigações de digestão in vitro

DL-Metionil-DL-metionina (I) e os pares correspondentes de diastereômeros DD/LL-I e DL/LD-I foram absorvidos em solução de tampão de

39/45

TRIS/HCI e misturados com a solução de enzima. Um absoluto foi preparado em cada caso sem a solução de enzima para comparação e para estimar a taxa de divagem puramente química. Uma amostra foi tirada de vez em quando, e a composição da mesma foi detectada e quantificada com o auxí5 lio de uma HPLC calibrada. A conversão foi determinada como o quociente da área quanto à metionina e a área quanto à metionilmetionina (I) (veja figura 6 e 7).

Tabela 1

Amostra Absoluto

Pré-carga	Substrato Met-Met (1) Solução de tampão de TRIS/HCI, pH 9,5	0,143 mmol (40,1 mg) 5,7 ml	0,143 mmol (40,1 mg) 8,3 ml
Início da reação	Solução de enzima (Á solução de carpa a 5%)	2,6 ml
Reação		37°C	37°C

Interrupção da 0,2 ml de solução de reação foi absorvido em 9,8 ml reação de solução de H₃PO₄ de intensidade a 10%.

Exemplo 23:

Experimento de disgestão in vitro em DL-metionil-DL-metionina (I) com enzimas digeridas de truta carnívora

a) Isolamento das enzimas digeridas de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)

O método para o isolamento das enzimas digeridas foi com base 15 naguele de EID e MATTY (Aguaculture 1989, 79, 111-119). Para este propósito, o intestino de seis trutas arco-íris de um ano de idade (Oncorhynchus mykiss) foi exposto e processado como descrito no exemplo 22.

b) Procedimento para as investigações de digestão in vitro

As investigações in vitro foram realizadas em analogia ao exem20 plo 22 (veja figura 8 e 9).

40/45

Tabela 2

	Amostra	Absoluto
Pré-carga	Substrato Met-Met(l) Solução de tampão de TRIS/HCI, pH 9,5	0,143 mmol (40,1 mg) 5,7 ml	0,143 mmol (40,1 mg) 9,8 ml
Início da reação	Solução de enzima (A solução de truta a 10%)	4,2 ml
Reação		37°C	37°C

Interrupção da 0,2 ml de solução de reação foi absorvido em 9,8 ml reação de solução de H₃PO₄ de intensidade a 10%.

Exemplo 24:

Experimentos de digestão in vitro em DL-metionil-DL-metionina (I) com en5 zimas digeridas de camarões onívoro

a) Isolamento das enzimas digeridas de camarões de patabranca (Litopenaeus Vannamei)

O método para o isolamento das enzimas digeridas foi com base naquele de Ezquerra e Garcia-Carreno (J. Food Biochem. 1999, 23, 59-74).

Para este propósito, o hepatopâncreas foi removido de cinco quilogramas de camarões de pata-branca (Litopenaeus Vannamei) e fragmentado juntamente com gelo esmagado usando um misturador. O outro processamento foi realizado em analogia ao exemplo 22.

b) Procedimento para as investigações de digestão in vitro As investigações in vitro foram realizadas em analogia ao exemplo 22 (veja figura 10 e 11).

42/45

to à D-metionina (veja figura 4).
	Tabela 4	Amostra	Absoluto
Pré-carga	Substrato solução de tampão de D-Metionina	0.143 mmol (21.3 mg)	0.143 mmol (21.3 mg)
		11.7 ml	23.4 ml
Início da reação	Coquetel de enzima (A solução de carpa a 5%)	11.7 ml
Reação		37°C	37°C

Interrupção da 0,2 ml de solução de reação foi absorvido em 9,8 ml reação de solução de H₃PO₄ de intensidade a 10%,

Soluções de Tampão:

Tampão de Citrato: pH 5, pH 6 e pH 7

Tampão de fosfato: pH 8

Tampão de TRIS/HCI: pH 9

Coquetel de enzima composto de enzimas intestinais, hepáticas e pancreáticas (Asolução de carpa a 5%):

2.6 ml de solução de enzima de mucosa intestinal

3,5 ml de solução de enzima de fígado

5.6 ml de solução de enzima de pâncreas Exemplo 26:

Características de lixiviação das misturas de diastereômeros de metionilmetionina LL/DD/LD/DL-I, DD/LL-I e DL/LD-I de péletes de alimentação em comparação com DL-metionina, MHA e MHA de cálcio.

Mistura alimentícia:

A matriz alimentícia usada foi uma mistura alimentícia deficiente de metionina de ingredientes convencionais tais como, por exemplo, refeição de soja, óleo de soja, amido de milho, refeição de trigo, refeição de peixe, celulose, aminoácidos essenciais cristalinos e minerais e vitaminas como pré-misturas. Esta mistura foi em seguida suplementada em bateladas em bateladas de 20 kg em cada caso com o derivado de metioninas estabelecí43/45 do na tabela 5, com uma taxa de suplemetação de 0,25% (com base nem equivalentes de enxofre), e foi homogeneizada e em seguida peletizada com tratamento a vapor. Em comparação com metionilmetionina (I), um experimento de peletização foi realizado em cada caso com DL-metionina, MHA (análogo de hidróxi de metionina) e MHA de cálcio. Além disso, um experimento de controle foi realizado por peletização sem a adição de um derivado de metionina (veja tabela 5).

Tabela 5

N°	Derivado de metionina	Pureza (% em peso)	Massa molecular (monômero)	Peso inicial
1	Nenhum aditivo	—	—	0,00 g
2	DL-Metionina	99,0%	149,21	50,61 g
3	MHA	88,0%	150,19	57,14 g
4	MHA de cálcio (MHA-Ca)	93,3%	169,22	60,77 g
5	DD/LL/DL/LD metionilmetionina (1)	99,7%	140,20	47,13 g

Todos os diastereômeros de metionilmetionina (I) permanece10 ram estáveis durante todo o processo de peletização e tratamento a vapor (veja tabela 6).

Tabela 6

^\Am ostra Parâmetrò'\	Mistura de alimentação não suplementada	Mistura de alimentação suplementada com Met-Met (1)	Péletes de alimentação suplementadas com Met-Met (1)
CP	%	18,64	18,88	18,45
DM	%		85,58	86,58
MET	%	0,28	0,47	0,51
CYS	%	0,32	0,32	0,30
MET+CYS	%	0,59	0,79	0,81
LYS	%	1,00	0,99	0,98
THR	%	0,67	0,70	0,67
ARG	%	1,16	1,19	1,17

44/45

^\Am ostra Parâmetrh\	Mistura de alimentação não suplementada	Mistura de alimentação suplementada com Met-Met (1)	Péletes de alimentação suplementadas com Met-Met (1)
ILE	%	0,75	0,79	0,74
LEU	%	1,54	1,60	1,51
VAL	%	0,88	0,90	0,85
HIS	%	0,47	0,51	0,48
PHE	%	0,91	0,92	0,88
GLY	%	0,78	0,81	0,77
SER	%	0,89	0,94	0,90
ALA	%	0,89	0,93	0,89
ASP	%	1,74	1,75	1,70
GLU	%	3,62	3,79	3,58
MET-MET (l)	Ex		0,156	0,153
MET	Ex		0,017	0,022
LYS	Ex		0,092	0,104

(Exemplo: constituintes solúveis).

Neste caso, a determinação de aminoácido foi com base no método EU 98/64/EC. Após extração dos aminoácidos livres e metionilmetionina (I), estes foram subsequentemente determinados com o auxílio de um analisador de aminoácido por derivação de pós-coluna com ninidrina (veja tabela 6).

As características de lixiviação dos diastereômeros de metionilmetionina (I) a partir dos péletes de alimentação foram em seguida investigados sob água. Neste caso, a dissolução de metionilmetionina sob água como uma função de tempo, temperatura, composição de água (água salgada ou fresca) foi determinada. Para este propósito, 20,0 g dos péletes de alimentação foram colocados em uma bolsa de peneira de malha fechada e completamente imersos em 200 g de água em um frasco Erlenmeyer. Todo o frasco Erlenmeyer foi subsequentemente continuamente agitada com um agitador de laboratório em uma temperatura constante de 20°C. Em seguida, em intervalos de tempo definidos, uma amostra de água foi removida em

45/45 cada caso e o teor dos pares individuais de diastereômeros de metionilmetionina na água foi determinado por HPLC (veja tabela 7).

Tabela 7

Tempo	Metionina	MHA	MHA-Ca	LL/DD-I	DL/LD-I	LL/DD/LD/DL-I
0	4,0%	6,0%	8,6%	2,7%	0,6%	1,5%
5	12,0%	12,8%	16,5%	3,7%	0,7%	2,0%
10	16,0%	20,8%	28,2%	6,5%	0,9%	3,2%
15	24,0%	28,8%	39,4%	7,7%	0,6%	3,6%
30	39,9%	50,5%	61,7%	12,1%	0,6%	5,4%
60	59,9%	75,4%	82,4%	20,6%	1,7%	9,5%
120	79,8%	94,1%	94,1%	27,4%	1,7%	12,3%
210	87,8%	99,9%	97,0%	35,9%	3,8%	17,0%

Para comparação, em cada caso os péletes de alimentação suplementados com DL-metionina, MHA ou MHA de cálcio foram investigadas sob as mesmas condições e desse modo suas características de lixiviação sob água determinadas sob as respectivas condições (veja figura 5 e tabela 7).

1/5

Claims (4)

REIVINDICAÇÕES

1/11

Representação diagramática da divagem enzimática das misturas de diastereômero de metionilmetionina DD/LL-I, DL/LD-I e DD/LL/DL/LD-I % tua (|) ΐθ|/\|-)θ|Λΐ ap Joaj.

Tempo de digestão em minutos

1. Uso de DL-metionil-DL-metionina e sais do mesmo, caracterizado pelo fato de que é como aditivo alimentício em misturas alimentícias para animais mantidos em aquiculturas, em que é dada preferência como sal

5 a cátions do grupo de metais de álcali e metais alcalino terrosos, e amônio, Cu²+, Zn²+ e Co²+.

2/11

Representação diagramática da divagem enzimática dos quatro diastereômeros de metionilmetionina DD-I, LL-I, DL-I e LD-I com diferentes taxas de divagem % me (|) ΐθ|Λ|-1θ|ΛΙ ©P Joei

Tempo de digestão em minutos

2/5 (Salmon salar e Oncorhynchus kisutch), truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), bagre americano (Ictalurus punctatus), bagre africano (Ciarias gariepinus), pangasius (Pangasius bocourti e Pangasius hypothalamus), Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), milkfish (Chanos chanos), cobia (Rachycentron canadum), camarão pata-branca (Litopenaeus vannamei), camarão tigre preto (Penaeus monodon) e pitu de rio gigante (Macrobrachium rosenbergii).

7. Processo para preparação de DL-metionil-DL-metionina (I) com a fórmula caracterizado pelo fato de que reage com um derivado de ureia da fórmula geral II em que os radicais R¹ e R² nos derivados de ureia IIa, IIb, llc, lie, e llf são definidos como segue: em que IIa: R¹ = COOH, R² = NHCONH₂

IIb: R¹ = CONH2, R² = NHCONH2 llc: R¹ = CONH2, R² = NH2 lie: R¹ = CN, R² = OH llf: R¹ = CN, R² = NH₂ para fornecer DL-metionil-DL-metionina.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o pH da solução compreendendo o derivado de ureia é ajustado para 8 a 14, preferivelmente para 10 a 13.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a reação ocorre em uma temperatura de 50 a 200Ό, preferivelmente em uma temperatura de 80 a 170Ό e particularmente preferivelmente em uma temperatura de 130 a 160Ό.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7

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2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mistura alimentícia compreende de 0,01 a 5% em peso, preferivelmente 0,05 a 0,5% em peso, de DL-metionil-DL-metionina.

10 3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a mistura alimentícia compreende proteína e carboidratos, preferivelmente com base na refeição de peixe, refeição de soja ou refeição de milho, e pode ser suplementada com aminoácidos essenciais, proteínas, peptídeos, vitaminas, minerais, carboidratos, gorduras e óleos.

15 4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que DL-metionil-DL-metionina está presente sozinha ou como sal como mistura DD/LL/LD/DL, como mistura DL/LD ou DD/LL, preferivelmente em cada caso adicionalmente misturada com DL-metionina, preferivelmente com um teor de DL-metionina de 0,01 a 20%

20 em peso, particularmente preferivelmente de 1 a 10% em peso.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que DL-metionil-DL-metionina está presente como um par DL/LD-metionilmetionina de enantiômeros.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 25 caracterizado pelo fato de que os animais mantidos em aquiculturas são peixes e crustáceos de água salgada e fresca, preferivelmente selecionados a partir do grupo que consiste em carpa, truta, salmão, bagre, perca, linguado, esturjão, atum, enguias, brema, bacalhau, camarões, krill e camarões pitus, muito preferivelmente para carpa prateada (Hypophthalmichthys molitrix),

30 carpa capim (Ctenopharyngodon idella), carpa comum (Cyprinus carpio) e carpa cabeçuda (Aristichthys nobilis), carassius (Carassius carassius), catla (Catla Catla), Roho labeo (Labeo rohita), salmão do Pacífico e Atlântico

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3/11

Representação diagramática da liberação enzimática de metionina (D-e L-Met juntos) dos quatro diastereômeros de metionilmetionina DD-I, LL-I, DL-I e LD-I % iuo ΐθ|Λ|-Ί/α ®P oeóejeqn

Tempo de digestão em minutos

3/5 a 9, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada sob pressão, preferivelmente sob uma pressão de 0,3 a 2 MPa (3 a 20 bar), particularmente preferivelmente sob uma pressão de 0,6 a1,5 MPa (6 a 15 bar).

11. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado 5 pelo fato de compreende as seguintes etapas:

a) reação do derivado de ureia de fórmulas lla, llb, llc, lie, e llf para fornecer uma dicetopiperazina (III) da fórmula O (III)

b) reação da dicetopiperazina (III) para fornecer DL-metionil-DLmetionina (I) e em que a reação do derivado de ureia é preferivelmente reali10 zada a uma temperatura de 50Ό a 200Ό.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a reação do derivado de ureia para fornecer a dicetopiperazina é realizada em uma temperatura de 100Ό a 180°C e preferivelmente de 140Ό a 170Ό.

15 13. Processo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a reação do derivado de ureia para fornecer a dicetopiperazina é realizada sob pressão, preferivelmente sob uma pressão de 0,3 a 2 MPa (3 a 20 bar), particularmente preferivelmente sob uma pressão de 0,6 a 1,5 MPa (6 a 15 bar).

20 14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações

11 a 13, caracterizado pelo fato de que a reação do derivado de ureia para fornecer a dicetopiperazina ocorre na presença de uma base.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a base é selecionada a partir do grupo de bases contendo

25 nitrogênio, NH4HCO3, (NH₄)₂CO₃, KHCO₃, K₂CO₃, mistura de NH₄OH/CO₂, sais de carbamato, bases de metal de álcali e metal alcalino terroso.

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que a reação do derivado de ureia para

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4/5 fornecer a dicetopiperazina ocorre por reação com metionina.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações

11 a 16, caracterizado pelo fato de que a reação da dicetopiperazina para fornecer DL-metionil-DL-metionina ocorre por hidrólise acídica.

5 18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a hidrólise acídica ocorre na presença de um ácido que é selecionado a partir do grupo de ácidos minerais, HCl, H₂CO₃, CO₂/H₂O, H2SO4, ácidos fosfóricos, ácidos carboxílicos e ácidos hidróxi carboxílicos.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações

10 11 a 16, caracterizado pelo fato de que a reação da dicetopiperazina para fornecer DL-metionil-DL-metionina ocorre por hidrólise básica.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a hidrólise básica é realizada em um pH de 7 a 14, particularmente preferivelmente em um pH de 9 a 12, muito particularmente preferi15 velmente em um pH de 10 a 11, a fim de obter DL-metionil-DL-metionina.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que as condições básicas são ajustadas usando uma substância selecionada do grupo de bases contendo nitrogênio, NH4HCO3, (NH4)2CO3, mistura de NH4OH/CO2, sais de carbamato, KHCO3, K2CO3, car20 bonatos, bases de metal de álcali e bases de metal alcalino terroso.

22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada em uma temperatura de 50°C a 200°C, preferivelmente 80°C a 180° C e particularmente preferivelmente de 90°C a 160°C.

25 23. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações

11 a 16, caracterizado pelo fato de que a reação da dicetopiperazina para fornecer DL-metionil-DL-metionina ocorre introduzindo CO2 em uma solução básica, preferivelmente em uma solução básica de hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, ou hidróxido de sódio.

30 24. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações

11 a 23, caracterizado pelo fato de que a dicetopiperazina é isolada antes da hidrólise.

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5/5

25. Processo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a dicetopiperazina é isolada por cristalização a partir da solução de reação, preferivelmente em uma temperatura de -30 a 120°C, muito particularmente preferivelmente em uma temperatura de 10 a 70°C.

5 26. Processo para isolamento da mistura de diastereômeros de

DD/LL/DL/LD-metionilmetionina, caracterizado pelo fato de que é por cristalização a partir de soluções da reação básica que foram obtidas, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 16 e 19 a 25, e em que a solução é ajustada com um ácido para um pH de 5 a 9.

10 27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a solução é ajustada com um ácido para um pH de 5 a 7, preferivelmente para um pH de cerca de 5,6.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a cristalização ocorre na presença de um ácido sele15 cionado a partir do grupo de ácidos minerais, HCl, H₂CO₃, CO₂/H₂O, H₂SO₄, ácido fosfóricos, ácidos carboxílicos, ácidos hidróxi carboxílicos.

29. Processo para isolamento da mistura de diastereômeros de DD/LL/DL/LD-metionilmetionina, caracterizado pelo fato de que é por cristalização a partir de soluções da reação acídica que foram obtidas, como defi20 nido na reivindicação 17 ou 18, em que a solução é ajustada com uma base para um pH de 5 a 9.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a solução é ajustada com uma base para um pH de 5 a 7, preferivelmente para um pH de cerca de 5,6.

25 31. Processo, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que a base é selecionada a partir do grupo de NH₄HCO₃, (NH₄)₂CO₃, bases contendo nitrogênio, NH₄OH, sais de carbamato, KHCO₃, K₂CO₃, carbonatos, bases de metal de álcali e metal alcalino terroso.

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4/11 o

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Biotransformação de D-metionina em L-metionina com

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