WO2011147881A2 - Cyclische dipeptide als futtermitteladditive - Google Patents

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WO2011147881A2
WO2011147881A2 PCT/EP2011/058577 EP2011058577W WO2011147881A2 WO 2011147881 A2 WO2011147881 A2 WO 2011147881A2 EP 2011058577 W EP2011058577 W EP 2011058577W WO 2011147881 A2 WO2011147881 A2 WO 2011147881A2
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met
cyclo
diketopiperazine
methionine
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Christoph Kobler
Thomas HÄUSSNER
Christoph Weckbecker
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Evonik Degussa Gmbh
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D241/00—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings
    • C07D241/02—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D241/06—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings having one or two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D241/08—Heterocyclic compounds containing 1,4-diazine or hydrogenated 1,4-diazine rings not condensed with other rings having one or two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with oxygen atoms directly attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/105—Aliphatic or alicyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
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    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/10—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for ruminants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system

Definitions

  • the present invention relates to feed additives comprising chemically protected dipeptides in the form of dic-topiperazines (cyclo-dipeptides, dehydrodipeptides) of essential, limiting amino acids, such as e.g. Methionine, lysine, threonine, tryptophan, cysteine and cystine, and their synthesis and use in feedingstuffs for the nutrition of ruminants and especially of fish and shellfish in aquaculture.
  • dic-topiperazines cyclo-dipeptides, dehydrodipeptides
  • essential, limiting amino acids such as e.g. Methionine, lysine, threonine, tryptophan, cysteine and cystine
  • EAA essential amino acids methionine, lysine, threonine, tryptophan, histidine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, arginine, cysteine and cystine are very important ingredients in feed and play in economic union ⁇ breeding of farm animals such as chickens , Pigs, ruminants and aquacultures play a significant role. Above all, an optimal distribution and adequate
  • L-methionine ((5) -2-amino-4-methylthiobutyric acid) represents the first limiting amino acid of all EAAs for many animal species and therefore plays one of the most important roles in animal nutrition and as a feed additive (Rosenberg et al., J. Agr. Food Chem. 1957, 5, 694-700).
  • methionine is obtained as a racemate, a 50: 50 mixture of D- and L-methionine, at.
  • this racemic DL-methionine can be used directly as a feed additive because in some species under in vivo conditions there is a conversion mechanism that converts the unnatural D enantiomer of methionine to the natural L enantiomer.
  • the D-methionine is first deaminated with a non-specific D-oxidase to keto-methionine and then further converted with a L-transaminase to L-methionine (Baker, DH in "Amino acids in farm animal nutrition", D'Mello , JPF (ed.), Wallingford (UK), CAB International, 1994, 37-61), which increases the amount of L-methionine available in the organism, which can then be made available to the animal for growth D- to L-methionine has been found in chickens, pigs and cows, but especially in fish, shrimp and prawns, for example Sveier et al. (Aquacult Nutr 2001, 7 (3), 169-181).
  • liquid methionine-hydroxy analogue MHA, rac-2-hydroxy-4- (methylthio) butanoic acid (HMB)
  • solid calcium MHA was produced worldwide and successfully used in mono- Gastric animals such as poultry and pigs used directly as a feed additive.
  • the L-enantiomers can be used as feed ⁇ additive of lysine, threonine and tryptophan, in each case only because the respective D-enantiomers of these three essential and limiting amino acids can not be converted by the organism under physiological conditions to the corresponding L-enantiomer can.
  • L-lysine the first-limiting amino acid in pigs for example, was over one million tonnes in 2007.
  • L-threonine and L-tryptophan the world market in 2007 was over 100,000 t or a few thousand t.
  • a rumen-stable protected form In order for the ruminant to have access to methionine with high efficiency, a rumen-stable protected form must be used. There are several ways to give DL-methionine or rac-MHA these properties. One possibility is to achieve a high rumen stability by applying a suitable protective layer or distribution of the methionine in a protective matrix . This allows methionine to pass the rumen with virtually no loss. In the course of the protective layer is then z. B. in Lab ⁇ stomach removed by acid hydrolysis and the liberated methionine can then be absorbed in the small intestine of ruminants.
  • Mepron ® from Evonik Degussa and smart amines TM from Adisseo.
  • the preparation or coating of methionine is usually a technically complicated and expensive process and is therefore expensive.
  • the superficial Be ⁇ coating of the finished pellets can easily be caused by mechanical stress and abrasion during feed processing damaged, which may lead to reduction or until complete loss of protection. Therefore, it is not possible to process the protected methionine in a RESIZE ⁇ ßeres mixed feed pellet, as this, in turn, the protective layer would break due to the mechanical stress. This limits the use of such pro ⁇ -products.
  • Another way to increase the Pan ⁇ senstabilmaschine is the chemical derivatization of Methio ⁇ nin or MHA.
  • the functional groups of the molecule are derivatized with suitable protective groups. This can be done, for example, by esterification of the carboxylic acid function with alcohols. This can reduce degradation in the rumen by microorganisms.
  • a commercially available ⁇ royal product with chemical protection for example, Me ⁇ tasmart TM, the racemic ⁇ so-propyl ester of MHA (HMBi).
  • WO00 / 28835 published a biowareness of at least 50% for HMBi in ruminants.
  • the disadvantage of che ⁇ mix derivatization of methionine or MHA is often in the poorer bioavailability and formallyswei ⁇ se low drug content.
  • the Pro ⁇ domestic product remains sufficiently stable during feeding in the aqueous environment and not,ge from the feed is ⁇ dissolves.
  • the amino acid product finally absorbed by the animal can be utilized opti ⁇ mally and with high efficiency in the animal organism.
  • WO 8906497 describes the use of di- and tripeptides as a feed additive for fish and shellfish. This should promote the growth of the animals.
  • di- and tripeptides of nonessential and also nonlimiting amino acids such as, for example, glycine, alanine and serine, which are more than sufficiently present in many vegetable protein sources.
  • methionine-containing dipeptides only DL-alanyl-DL-methionine and DL-methionyl-DL-glycine were described.
  • the oligomers described are built up by an enzyme-catalyzed reaction and have a very broad distribution of the chain length of the individual oligomers. This makes the process unselective, expensive and expensive to carry out and purify.
  • Dabrowski et al. describes in the US20030099689 Ver ⁇ application of synthetic peptides, as feed additives for promoting the growth of aquatic animals.
  • the peptides may account for 6-50% by weight of the total feed formulation.
  • the synthetic peptides are preferably EAAs.
  • the enantioselective synthesis of such synthetic oligopeptides and polypeptides is very complicated, expensive and difficult to realize on an industrial scale.
  • Diketopiperazines can be synthesized in several different ways .
  • Jainta et al. discloses the microwave-based synthesis of cyclic dipeptides by condensation of amino acids.
  • Zheng-Zheng et al. Angew Chem .. Int Ed., 2008, 47, 1758-1761
  • FAEL ⁇ len solvents or catalysts are used, which have a cost-effective production of the cyclic dipeptides impossible.
  • Naraoka et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans.
  • Cyclic dipeptides can also be obtained from ordinary dipeptides by dehydration. This was demonstrated, for example, by Kopple et al. (J. Org. Chem., 1968, 33, 862-864) and Tullberg et al. (Tetrahedron, 2006, 62, 7484-7491). In both cases, however, combustible or toxic organic solvents must be used. Snyder et al.
  • the production or coating of amino acids usually represents a technically complicated and expensive process and is therefore expensive.
  • the superficial coating of the ready-coated amino acid can easily be damaged by mechanical stress and abrasion during feed processing, which can lead to a reduction or even complete loss of physical protection.
  • the content of the amino acid is reduced by a coating or use of a matrix substance and thus often becomes uneconomical.
  • Methionine, L-lysine, L-threonine or L-tryptophan for ruminants such as dairy cows, but also for many omni-, herbi- and carnivorous fish and shellfish species that live in salt or fresh water provide.
  • EAA essential amino acid
  • the chemically protected product form of two identical or different EAAs should be rumen-stable and thus suitable for all ruminants.
  • the product form For use as a feed additive for fish and shellfish, the product form should have a low solubility behavior from the total feed pellet or extrudate in the water (leaking).
  • the feed additive should be more soluble in the digestive system of fish and shellfish than in the surrounding salt or fresh water.
  • a further object was to find a replacement for crystalline ne EAAs as feed or a feed additive having a very high biological value, the good Handhab ⁇ bility and shelf life and stability should have under the übli ⁇ chen conditions of the mixed feed processing, in particular the pelletization and extrusion , In this way, ruminants, fish and crustaceans should, in addition to the known crystalline, coated or matrix protected EAAs, be provided with further efficient sources of essential amino acids which, if possible, do not or only to a limited extent have the disadvantages of the known products.
  • the present invention provides a feed or egg ⁇ nen feed additive for animal nutrition based on a six-membered heterocyclic ring system (2,5-piperazinedione, diketopiperazine [DKP], cyclo-dipeptide, De hydrodipeptid) provided in the amino acid residues of essential and limiting amino acids such as DL-methionine, L- Lysine, L-threonine and L-tryptophan are covalently bound to the 3, 6-positions of the diketopiperazine and which can be used as a feed additive for the nutrition of ruminants such as dairy cows, but especially of fish and shellfish in aquaculture.
  • a six-membered heterocyclic ring system (2,5-piperazinedione, diketopiperazine [DKP], cyclo-dipeptide, De hydrodipeptid) provided in the amino acid residues of essential and limiting amino acids such as DL-methionine, L- Lysine,
  • a feed additive comprising at least one diketopiperazine (cyclic diproptide) having the following general formula IV or a salt thereof:
  • R and / or R ' are in the L configuration.
  • the diketopiperazine contained in the feed additive as cyclo-D-EAA-D-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-L-EAA or micro mixtures thereof, in particular as diastereomeric mixture Cyc- lo-DL-EAA-DL-EAA is present, wherein an amino acid EAA from ⁇ selected from the group methionine, lysine, threonine, tryptophan, histidine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine , Arginine, cysteine and cystine.
  • R 1 and R 2 each have a
  • the diketopiperazine contained in the feed additive as a mixture of diastereomers
  • DD / LL / meso-cyclo-Met-Met (ie as a mixture of DD / LL-cyclo-Met-Met and meso-cyclo-Met-Met), where Met denotes methionine.
  • the invention further provides a feed mixture containing the feed additive described above.
  • the feed mixture are additionally contained in a mixture: one or more of the following substances: DL-methionine, L-EAA, DL-EAA, the diastereomer mixtures DD / LL / DL / LD-methionyl EAA increment. DD / LL / DL / LD EAA methionine, DD / LL methionyl EAA,
  • the feed additive containing diketopiperazines (cyclic dipeptides) and their salts is suitable as an additive in feed mixtures for ruminants, but in particular also for fish and shellfish from aquaculture. Especially be ⁇ vorzugt is the use as an additive in feed mixtures for ruminants.
  • the feed mixture contains 0.01 to 5.0 wt .-%, preferably 0.05 to 0.5 wt .-% diketopiperazine, alone or in admixture with one or more free amino acids (EAA), in a mixture one or more natural or unnatural dipeptides (EAA-EAA) or in mi containing amino acids (EAA) and dipeptides (EAA-EAA).
  • EAA free amino acids
  • EAA-EAA natural or unnatural dipeptides
  • EAA-EAA mi containing amino acids
  • EAA-EAA dipeptides
  • the compound shows good pelleting and extrusion stability in feed production.
  • the diketopiperazines are stable in mixtures with conventional ones
  • Components and feed such as e.g. Cereals (eg maize, wheat, triticale, barley, millet, etc.), vegetable or animal protein carriers (eg soybeans and oilseed rape and their processed products, legumes (eg peas, peas, lupins, etc.), fishmeal, etc.). ) and in combination with supplemented essential amino acids, proteins, peptides, carbohydrates, vitamins, minerals, fats and oils.
  • Cereals eg maize, wheat, triticale, barley, millet, etc.
  • vegetable or animal protein carriers eg soybeans and oilseed rape and their processed products, legumes (eg peas, peas, lupins, etc.), fishmeal, etc.).
  • legumes eg peas, peas, lupins, etc.
  • fishmeal e.g., fishmeal, etc.
  • diketopiperazine is particularly suitable as a feed additive for fish and shellfish kept in aquaculture, since the solubility of diketopiperazine is generally very low (see Fig. 2), but dissolves better in the digestive tract of fish or crustaceans than in the non-native one Water (see Fig. 1).
  • the feed mixture contains proteins and carbohydrates, preferably based on fish, soya or maize flour, and may be supplemented with essential amino acids, proteins, peptides, vitamins, minerals, carbohydrates, fats and oils.
  • cyclo EAA EAA in the Futterstoffmi ⁇ alone as cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D -EAA-D-EAA or as a mixture with one another, in particular as diastereomeric mixture cyclo-DL-EAA-DL-EAA is present, preferably in each case to ⁇ additionally in a mixture with L-EAA, D-EAA or DL-EAA such as methionine , Lysine, threonine or tryptophan, each alone or mixed together, preferably with an amino acid content of 0.01 to 90 wt .-%, preferably from
  • cyclo-EAA-EAA alone as cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA D-EAA or as a mixture with one another, in particular as a diastereomeric mixture cyclo-DL-EAA-DL-EAA, is present, preferably in each case additionally in admixture with dipeptides of the general formula EAA-EAA, alone as L-EAA-L-EAA, D- EAA-L-EAA, L-EAA-D-EAA and D-EAA-D-EAA or in mixtures with one another, in particular as diastereomer mixture DL-EAA-DL-EAA, is preferably additionally in each case mixed with L-EAA, D-EAA or DL-EAA such as methionine, lysine, threonine or tryptophan, each
  • the diketopiperazine cyclo-EAA-EAA alone is described as cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-D -EAA or as a mixture with one another, in particular as a mixture of diastereomers cyclo-DL-EAA-DL-EAA, or in the case of charged EAA radicals such as in the case of lysine, histidine or arginine its alkali and alkaline earth salts such as the sparingly soluble calcium or zinc salts, alone or in admixture with each additionally in admixture with dipeptides of the general formula EAA-EAA, alone as L-EAA-L-EAA, D-EAA-L-EAA, L-EAA-D-EAA and D-EAA-D-EAA or in mixtures with one another, in particular as a
  • the animals are fresh and salt water fish held in aquaculture and -krustentiere selected from the group consisting of carp, trout, salmon, catfish, perch, flatfish, sturgeon, tuna, Aa ⁇ le, bream, cod, shrimp, krill and prawns, all be ⁇ Sonder for Silver- (Hypophthalmichthys molitrix), grass (Ctenopharyngodon idella), dandruff (Cyprinus carpio) and Bigheadkarpfen (Aristichthys nobilis), crucian carp (Carassius carassius), Catla (Catla Catla) Roho Labeo ( Labeo rohita), Pacific and Atlantic salmon (Salmon salar and Oncorhynchus kisutch), rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), American catfish (Ictalurus punctatus), African catfish ⁇ Ciarias gariepinus), Pan
  • the main object of the present invention is the use of diketopiperazines (cyclo-dipeptides) alone as cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D- EAA-D-EAA or as a mixture with one another, in particular as diastereomeric mixture cyclo-DL-EAA-DL-EAA, as a growth promoter for ruminants, but also for omni, carni- and herbivorous fish and crustaceans in Aquakultu ⁇ ren.
  • diketopiperazines cyclo-dipeptides
  • DD / LL / mesocyclo-Met-Met as a mixture of diastereomers from a 50:50 mixture of DD / LL-cyclo-Met-Met and meso-cyclo-Met-Met under physiological conditions can be cleaved enzymatically by fish such as carp and trout to free D- or L-methionine (see Fig. 3).
  • mixed cyclic dipeptides such as, for example, cyclo-D-Met-L-Leu, cycloD-Met-L-Phe or cyclo-D-Met-L-Lys under physiological conditions enzymatically of digestive enzymes from mirror carp could be cleaved in in vitro cleavage experiments (see Fig. 5-8).
  • This also does not na ⁇ ral cyclic dipeptides are with D-amino acids (D-EAA) as a feed additive (see diagram 2).
  • the peculiarity of the cleavage of DD / LL / meso-cyclo-Met-Met according to the invention lies in the fact that, in addition to the diastereomer cyclo-L-Met-L-Met which naturally occurs in food, the diastereomers cyclo-D-Met L-Met and cyclo-D-Met-D-Met can be cleaved under physiological conditions (see FIGS. 3 and 4).
  • isolated enzyme cocktail of digestive systems of fish are active only a short time, so that the cleavage rate decreases over several hours Reakti ⁇ onszeit drastically and finally comes to a halt, although the cyclic dipeptide tid has not yet been fully implemented. It can be assumed that under in vivo conditions in living fish, the enzyme activity is significantly higher, remains stable through constant renewal of the enzymes and ultimately also leads to the complete utilization of the feed additive.
  • the diastereomeric mixture DD / LL / meso-cyclo-Met-Met or the diastereomer DD / LL-cyclo-Met-Met can be cleaved by digestive enzymes of the rainbow trout and the mirror carcass.
  • the enzymatic cleavages in the examples listed have not been quantitative since the enzymes in the in vitro digestion experiments under the chosen conditions
  • the carbon atoms with R 1 and / or R 2 are in the L configuration.
  • the diketopiperazine is cyclo-D-EAA-D-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-L-EAA or mixtures thereof, especially as diastereomer mixture cyclo-DL-EAA-DL-EAA, wherein EAA is an amino acid selected from the group consisting of methionine, lysine, threonine, tryptophan, histidine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, arginine, cysteine and cystine.
  • R 1 and R 2 each have a
  • Methionyl residue (R - (CH 2) 2 S CH 3), and wherein the diketopiperazine is in the DD, LL, DL or LD configuration or mixtures thereof; with the proviso that when R 1 and R 2 is - (CH 2) 2 S CH3 which Diketopipe ⁇ Razin is present with the LL-configuration only in a mixture with other configurations.
  • the diketopiperazine is in a mixture as DD / LL / meso-cyclo-Met-Met, vorzugswei ⁇ se in a 50:50 mixture of DD / LL-cyclo-Met-Met and me-so-cyclo- Met-Met, before.
  • the present invention also provides a use of the diketopiperazines as a feed additive for ruminants, fresh or saltwater fish and crustaceans.
  • the object is further achieved by a method for the preparation of a diketopiperazine having the following general ⁇ my formula IV or a salt thereof:
  • R and R are independently defined as follows:
  • R l / 2 2- (methylthio) ethyl) - (methionine)
  • R l / 2 (1R) -1-hydroxyethyl- (threonine)
  • R l / 2 4-aminobutyl- (lysine)
  • R l / 2 benzyl- (phenylalanine)
  • R 1/2 -CH 2 -SS-CH 2 -CH (NH 2 ) COOR ' (cystine) optionally R may be R;
  • R defines linear or branched aliphatic radicals or aromatic radicals and different R ' can occur in different amino acid ester molecules ;
  • the amino acid ester of the general formula III is obtained by esterification of an amino acid having the general formula IR 1/2 -CH (NH 2 ) -COOH or cystine with a compound having the general formula II R'-OH.
  • the esterification is carried out in the presence of a strong acid, preferably in the presence of HCl or H 2 SO 4 .
  • the radical R ' is a C 1 -C -alkyl radical, more preferably a C 1 -C 6 -alkyl radical, particularly preferably a C 1 -C 4 -alkyl radical, where the alkyl radical is in each case linear or may be branched.
  • the radical R ' is selected from the group of methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, benzyl.
  • the radical R ' is a C 2 -C 8 alkenyl group, more preferably a C 2 -C 6 alkenyl group more preferably a C 2 ⁇ C 4 alkenyl, wherein the alkenyl radical is in each case linear or branched, optionally can be.
  • the amino acid ester is concentrated before the conversion of the amino acid ester to the diketopiperazine.
  • the reaction of the amino acid ester to diketopiperazine takes place according to the invention in substance without the use of solvents.
  • no solvents in particular kei ⁇ ne organic, polar or aqueous solvents, and more preferably no bases are present, except the following substances: the resulting in the reaction diketopiperazine itself and the compound with the general formula R'-OH, which is removed by distillation during the reaction.
  • the reaction of the Aminoklarees ⁇ ters occurs approximately catalysts to the diketopiperazine without using Transamidie-.
  • the reaction of the amino acid ester to diketopiperazine is carried out in pure form, preferably with a purity of> 50 wt .-%, preferably> 90% wt .-%, particularly preferably of> 95 wt .-% and most preferably of > 98% by weight.
  • the implementation of the Aminoklareesters to the diketopiperazine at a tempera ture ⁇ 30-220 ° C is preferably carried out at a temperature of 50 to 170 ° C and particularly preferably at a temperature of 70 to 140 ° C.
  • the reaction of the Aminoklareesters to the diketopiperazine preferably by distillative separation of the compound having the general formula R'-OH (eg, an alkanol) performed beispielswei ⁇ se under autogenous pressure, normal pressure or reduced pressure, preferably at a pressure of 0, 01 to 20 bar, more preferably at a pressure of 0.05 to 1.5 bar, most preferably at atmospheric pressure.
  • the amino acid ester which is not completely reacted in the reaction can be recovered and returned to the process.
  • the esterification of the amino acid to the amino acid ester is not completely reacted and / or recovered in the reaction of the amino acid ester to diketopiperazine compound having the general formula R'-OH and recycled to the process.
  • the amino acid ester in the DL, L or D configuration from the group methionine, lysine, threonine, tryptophan, histidine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, arginine, cysteine, cystine in pure substance without use is heated by solvents.
  • R'-OH eg an alkanol
  • unreacted amino acid ester can be fully recycled and recycled to the process (see Scheme 3 and 4).
  • the ester is preferably first obtained from the free amino acid suspended in a compound R'-OH (eg an alkanol) with the aid of water splitting by addition of a strong acid such as, for example, HCl or H2SO4.
  • a strong acid such as, for example, HCl or H2SO4.
  • the resulting oil ie the diketopiperazine in pure substance
  • the alcohol separated by distillation and the cyclic dipeptide (Diketopiperazin the For ⁇ mel IV) highly selectively crystallized from the reaction mixture.
  • the product with egg ⁇ nem solvent is unreacted Aminoklareester recovered and can be recycled to the process.
  • two or more different amino acid esters in the DL, L or D configuration from the group methionine, lysine, threonine, tryptophan, histidine , Valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, arginine, cysteine, cystine in any mixtures with each other.
  • process of the present invention may be carried out in batch processes known in the art or in continuous processes.
  • Figure 1 shows the solubility of cyclo-DL-Met-DL-Met in bile / water mixtures (taken from bile carps bile).
  • Figure 2 shows the solubility of cyclo-DL-Met-DL-Met as a function of the pH of the solution.
  • Figure 3 shows the cleavage of DD / LL / meso-cyclo-Met-Met with rainbow trout enzymes.
  • Figure 4 shows the cleavage of DD / LL-cyclo-Met-Met with enzymes from mirror carp.
  • Figure 5 shows the cleavage of cyclo-L-His-L-His with enzymes from mirror carp.
  • Figure 6 shows the cleavage of cyclo-D-Met-L-Leu with enzymes from mirror carp.
  • Figure 7 shows the cleavage of cyclo-D-Met-L-Phe with enzymes from rainbow trout.
  • Figure 8 shows the cleavage of cyclo-D-Met-L-Lys with rainbow trout enzymes.
  • Figure 9 shows the cleavage of cyclo-D-Met-L-Thr with enzymes from Whiteleg Shrimp.
  • the filtrate is concentrated on a rotary evaporator, taken up in 750 ml of ethyl acetate, washed twice with 50 ml of 10% strength K 2 CO 3 solution each time. About MgSC ⁇ dried and concentrated on a rotary evaporator.
  • Butanol / acetic acid / water 4: 1: 1 (v / v / v) separately. An isolated fraction from this was exemplarily characterized.
  • Example 8 Synthesis of cyclic cyclo-Met-Lys dipeptides from DL-methionine methyl ester (DL-Met-OMe) and L-lysine methyl ester (L-Lys-OMe) and isolation of a diastereomer 3- (S) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (4-aminobutyl) -2,5-piperazinedione hydrochloride (cyclo-L-Met-L-Lys x HCl)
  • Butanol / acetic acid / water 4: 1: 1 (v / v / v) separately. An isolated fraction from this was exemplarily characterized.
  • the isolation of the digestive enzymes was carried out in accordance with the method of EID and MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111-119).
  • EID and MATTY Aquaculture 1989, 79, 111-119.
  • the intestine of six einjumbleri ⁇ gen mirror carp ⁇ Cyprinus carpio morpha noblis) wasged with water, cut longitudinally and scraped off, respectively, the intestinal mucosa. This was crushed together with crushed ice with a blender.
  • the resul ⁇ animal suspension was with an ultrasonic probe behan ⁇ punched to still catch up intact cells.
  • the suspension was centrifuged at 4 ° C for 30 Minu ⁇ th long, decanted the homogenate and sterilized with a trace of thimerosal. 6 ⁇ mirror carp 49 ml enzyme solution of the intestinal mucosa were collected. The solution was stored dark at 4 ° C. b) conducting in vitro digestive studies
  • DD / LL-cyclo-Met-Met was added in TRIS / HCl buffer solution ⁇ be taken and with the enzyme solution.
  • a blank value without enzyme solution was used in each case (see Table 1). From time to time a sample was taken and detected ent ⁇ their composition with the aid of a calibrated HPLC and quantified. The conversion was determined as the quotient of the content of methionine or methionylmethionine (Met-Met) and of the content of DD / LL-cyclo-Met-Met (see FIG. 4). In the blank, virtually no conversion of DD / LL-cyclo-Met-Met to the dipeptide DD / LL-Met-Met or DL-methionine took place.
  • Reaction abbr. 1.0 ml of reaction solution was dissolved in 5.0 ml of a 1: 1 (v / v) mixture of 10% H 3 PO 4 .
  • Example 11 b Taken up solution and acetonitrile, stirred for 20 min and filtered through a 20ym syringe filter.
  • the experiment from Example 11 b) was carried out analogously with the cyclic dipeptides cyclo-L-His-L-His and cyclo-D-Met-L-Leu (see FIGS. 5 and 6).
  • Example 11 The in vitro investigations were carried out analogously to Example 11. The conversion was determined as the quotient of the content of methionine or methionylmethionine (Met-Met) and of the content of cyclo-Met-Met (see FIG. 3). In the blank, virtually no conversion of ⁇ / / meso-cyclo-Met-Met to the dipeptide DD / LL / meso-Met-Met or DL-methionine took place. Table 2: Cleavage of DD / LL / meso-cyclo-Met-Met
  • Bile fluid 1.0 mL 0, 0 ml
  • Reaction abbr. 1.0 ml of reaction solution was dissolved in 5.0 ml of a 1: 1 (v / v) mixture of 10% H 3 PO 4 .
  • Example 12 b The experiment of Example 12 b) was carried out analogously with the cyclic dipeptides cyclo-D-Met-L-Phe and cyclo-D-Met-L-Lys (see Figure 7 and 8).
  • the isolation of the digestive enzymes was carried out in accordance with the method of Ezquerra and Garcia-Carreno (J. Food Biochem., 1999, 23, 59-74). For this, the hepato- pancreas from 2.1 kilograms (57 animals) of Whiteleg shrimps (Li topenaeus vannamei) and crushed with crushed ice with a blender. The further work-up was carried out analogously to Example 11. From 57 Whiteleg shrimps, 74 ml of enzyme solution of the intestinal mucosa were obtained. The solution was stored dark at 4 ° C. b) conducting in vitro digestive studies
  • Example 11 The in vitro investigations were carried out analogously to Example 11. The conversion was determined as the quotient of the content of methionine or D-Met-L-Thr and the content of cyclo-D-Met-L-Thr (see FIG. 9). In the Blindpro ⁇ be no conversion of cyclo-D-Met-L-Thr to the dipeptide D-Met-L-Thr or to the free amino acids took place virtually.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Futtermitteladditive enthaltend mindestens ein Diketopiperazin mit der folgenden allgemeinen Formel (IV) oder ein Salz davon, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander einen Aminosäurerest R darstellen (vorzugsweise in der L-Konfiguration) ausgewählt aus der Gruppe Methionin (R = - (CH2) 2SCH3), Lysin (R = -(CH2)4NH2), Threonin (R = -CH (OH) (CH3)), Tryptophan (R = -indolyl), Histidin (R = -imidazoyl), Valin (R = -CH(CH3)2), Leucin (R = -CH2CH ( (CH3) 2), Isoleucin (R = -CH (CH3) CH2CH3), Phenylalanin (R = -CH2Ph), Arginin (R = - (CH2) 3NHC (=NH) CH2), Cystein (R = -CH2SH), wobei gegebenenfalls R1 gleich R2 sein kann; oder enthaltend mindestens eine Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel (V) oder ein Salz davon, wobei R1 und R2 wie oben definiert sind; sowie das Diketopiperazin selbst und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Description

Cyclische Dipeptide als Futtermitteladditive
Einleitung
Die vorliegende Erfindung betrifft Futtermitteladditive enthaltend chemisch geschützte Dipeptide in Form von Dike- topiperazinen (cyclo-Dipeptiden, Dehydrodipeptiden) von essentiellen, limitierenden Aminosäuren wie z.B. Methionin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Cystein und Cystin, sowie deren Synthese und Verwendung in Futtermitteln für die Ernäh- rung von Wiederkäuern und besonders von Fischen und Krustentieren in Aquakulturen.
Stand der Technik
Die essentiellen Aminosäuren (EAA) Methionin, Lysin, Threo- nin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein und Cystin sind sehr wichtige Bestandteile in Futtermitteln und spielen bei der wirtschaft¬ lichen Aufzucht von Nutztieren wie z.B. Hühnern, Schweinen, Wiederkäuern und Aquakulturen eine bedeutende Rolle. Dabei ist vor allem eine optimale Verteilung und ausreichende
Versorgung mit EAAs entscheiden. Da Futter aus natürlichen Eiweißquellen wie z.B. Soja, Mais und Weizen meist in bestimmten EAAs defizitär ist, ermöglicht die gezielte
Supplementierung mit synthetischen EAAs wie beispielsweise DL-Methionin, L-Lysin, L-Threonin oder L-Tryptophan zum einen ein schnelleres Wachstum der Tiere bzw. eine höhere Milchproduktion bei Hochleistungsmilchkühen, zum anderen aber auch die effizientere Verwertung des gesamten Futters. Dies stellt einen sehr großen wirtschaftlichen Vorteil dar. Die Märkte für Futtermitteladditive sind von großer indus¬ trieller und wirtschaftlicher Bedeutung. Zudem sind sie starke Wachstumsmärkte, was nicht zuletzt auf die steigende Bedeutung von Ländern wie beispielsweise China und Indien zurückzuführen ist.
L-Methionin ( (5) -2-Amino-4-methylthiobuttersäure) stellt für viele Tierarten die erste limitierende Aminosäure aller EAAs dar und spielt daher in der Tierernährung und als Futtermitteladditiv eine der bedeutendsten Rollen (Rosenberg et al., J. Agr. Food Chem. 1957, 5, 694-700). Bei der klas¬ sischen chemischen Synthese fällt Methionin jedoch als Ra- cemat, eine 50 : 50-Mischung aus D- und L-Methionin, an. Die- ses racemische DL-Methionin kann jedoch direkt als Futtermitteladditiv eingesetzt werden, da bei einigen Tierarten unter in vivo-Bedingungen ein Umwandlungsmechanismus besteht, der das unnatürliche D-Enantiomer von Methionin in das natürliche L-Enantiomer überführt. Dabei wird das D- Methionin zuerst mit Hilfe einer unspezifischen D-Oxidase zu -Keto-Methionin desaminiert und anschließend mit einer L-Transaminase zu L-Methionin weiter umgewandelt (Baker, D.H. in „Amino acids in farm animal nutrition", D'Mello, J.P.F. (ed.), Wallingford (UK) , CAB International, 1994, 37-61) . Dadurch wird die verfügbare Menge an L-Methionin im Organismus erhöht, die dann dem Tier zum Wachstum zur Verfügung stehen kann. Die enzymatische Umwandlung von D- zu L-Methionin wurde bei Hühnern, Schweinen und Kühen, insbesondere aber auch bei Fischen, Shrimps und Prawns festge- stellt. So konnte beispielsweise Sveier et al . (Aquacult. Nutr. 2001, 7 (3), 169-181) und Kim et al . (Aquaculture 1992, 101 (1-2), 95-103) zeigen, dass die Umwandlung von D- in L-Methionin bei carnivoren atlantischen Lachsen und Regenbogenforellen möglich ist. Gleiches konnte von Robinson et al. (J. Nutr. 1978, 108 (12), 1932-1936) und Schwarz et al . (Aquaculture 1998, 161, 121-129) für omnivore Fischar¬ ten wie zum Beispiel Catfish und Karpfen zeigen. Darüber hinaus konnten Forster und Dominy (J. World Aquacult. Soc. 2006, 37 (4), 474-480) in Fütterungsversuchen von Omnivoren Shrimps der Art Litopenaeus vannamei zeigen, dass DL- Methionin die gleiche Wirksamkeit wie L-Methionin besitzt. 2007 wurden weltweit über 700.000 t kristallines DL- Methionin bzw. racemisches, flüssiges Methionin-Hydroxy- Analog (MHA, rac-2-Hydroxy-4- (methylthio) butansäure (HMB) ) und festes Calcium-MHA produziert und erfolgreich bei mono- gastrischen Tieren wie z.B. Geflügel und Schweinen direkt als Futtermitteladditiv eingesetzt.
Im Gegensatz zu Methionin können von Lysin, Threonin und Tryptophan nur jeweils die L-Enantiomere als Futtermittel¬ additive verwendet werden, da die jeweiligen D-Enantiomere dieser drei essentiellen und limitierenden Aminosäuren vom Organismus unter physiologischen Bedingungen nicht zu den entsprechenden L-Enantiomeren umgewandelt werden können. So lag allein der Weltmarkt für L-Lysin, die erstlimitierende Aminosäure beispielsweise bei Schweinen, für das Jahr 2007 bei über einer Million Tonnen. Für die beiden anderen limitierenden essentiellen Aminosäuren L-Threonin und L- Tryptophan lag der Weltmarkt 2007 bei über 100.000 t bzw. einigen 1000 t.
Bei monogastrischen Tieren wie z.B. Geflügel und Schweinen wird üblicherweise DL-Methionin, MHA, aber auch L-Lysin, L- Threonin und L-Tryptophan direkt als Futtermitteladditiv verwendet. Im Gegensatz dazu ist die Supplementierung des Futters mit EAAs wie Methionin, Lysin, Threonin oder auch MHA bei Wiederkäuern nicht effektiv, da die Hauptmenge im Pansen der Wiederkäuer durch Mikroben abgebaut wird. Aufgrund dieses Abbaus gelangt daher nur ein Bruchteil der supplementierten EAAs in den Dünndarm des Tiers, wo im Allgemeinen die Absorption ins Blut erfolgt. Unter den EAAs spielt vor allem Methionin bei Wiederkäuern eine entschei- dende Rolle, da nur bei optimaler Versorgung eine hohe
Milchproduktion gewährleistet ist. Damit dem Wiederkäuer Methionin mit hoher Effizienz zur Verfügung stehen kann, muss eine pansenstabile geschützte Form eingesetzt werden. Dabei gibt es mehrere Möglichkeiten DL-Methionin bzw. rac- MHA diese Eigenschaften zu verleihen. Eine Möglichkeit be- steht darin, durch Anbringung einer geeigneten Schutzschicht bzw. Verteilung des Methionins in einer Schutzmat¬ rix eine hohe Pansenstabiliät zu erreichen. Dadurch kann Methionin den Pansen praktisch ohne Verlust passieren. Im weiteren Verlauf wird die Schutzschicht dann z. B. im Lab¬ magen durch saure Hydrolyse entfernt und das freiwerdende Methionin kann dann im Dünndarm vom Wiederkäuer absorbiert werden. Kommerziell erhältliche Produkte sind z.B. Mepron® der Firma Evonik Degussa und Smartamine™ der Firma Adisseo. Die Herstellung bzw. die Beschichtung von Methionin stellt meist ein technisch kompliziertes und aufwendiges Verfahren dar und ist daher teuer. Zudem kann die oberflächliche Be¬ schichtung der fertigen Pellets leicht durch mechanische Belastung und Abrieb während der Futterverarbeitung beschä- digt werden, was zur Verminderung bzw. bis zum vollständigen Verlust des Schutzes führen kann. Deshalb ist es auch nicht möglich, die geschützten Methioninpellets in ein grö¬ ßeres Mischfutterpellet zu verarbeiten, da dadurch wiederum die schützende Schicht durch die mechanische Beanspruchung aufbrechen würde. Dies schränkt die Verwendung solcher Pro¬ dukte ein. Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Pan¬ senstabilität ist die chemische Derivatisierung von Methio¬ nin bzw. MHA. Dabei werden die funktionellen Gruppen des Moleküls mit geeigneten Schutzgruppen derivatisiert . Dies kann z.B. durch Veresterung der Carbonsäurefunktion mit Alkoholen erfolgen. Dadurch kann der Abbau im Pansen durch Mikroorganismen verringert werden. Ein kommerziell erhält¬ liches Produkt mit chemischem Schutz ist beispielsweise Me¬ tasmart™, der racemische ίso-Propylester von MHA (HMBi) . In WO00/28835 wurde eine Biowertigkeit von mindestens 50% für HMBi bei Wiederkäuern veröffentlicht. Der Nachteil der che¬ mischen Derivatisierung von Methionin bzw. MHA besteht oft in der schlechteren Bioverfügbarkeit und dem vergleichswei¬ se niedrigen Wirkstoffgehalt . Neben der Problematik des Abbaus im Pansen von supplemen- tiertem EAAs wie Methionin, Lysin oder Threonin bei Wieder- käuern kann es aber auch bei Fischen und Krustentieren zu unterschiedlichen Problemen bei der Supplementierung von EAAs zum Futter geben. Durch die rasante wirtschaftliche Entwicklung der Fisch- und Krustentierzucht in hoch indust- rialisierten Aquakulturen gewinnt eine optimale, wirt¬ schaftliche und effiziente Supplementierungsmöglichkeit von essentiellen und limitierenden Aminosäuren gerade in diesem Bereich in den letzten Jahren eine immer bedeutendere Rolle (Food and Agriculture Organization of the United Nation (FAO) Fisheries Department „State of World Aquaculture
2006", 2006, Rome . International Food Policy Research In¬ stitute (IFPRI) „Fish 2020: Supply and Demand in Changing Markets", 2003, Washington, D.C.) . Dabei kann es im Gegen¬ satz zu Hühnern und Schweinen bei der Verwendung von kri- stallinen EAAs als Futtermitteladditiv jedoch bei bestimmten Fisch- und Krustentiersorten zu unterschiedlichen Problemen kommen. So berichten Rumsey und Ketola (J. Fish. Res. Bd. Can. 1975, 32, 422-426), dass die Verwendung von Soja¬ mehl in Verbindung mit einzeln supplementierten, kristalli- nen Aminosäuren zu keiner Wachstumssteigung bei Regenbogenforellen führte. Murai et al . (Bull. Japan. Soc. Sei. Fish. 1984, 50 (11), 1957) konnte zeigen, dass die tägliche Füt¬ terung von Fischdiäten mit hohen Raten an supplementierten, kristallinen Aminosäuren bei Karpfen dazu führten, dass ü- ber 40% der freien Aminosäuren über die Kiemen und Nieren ausgeschieden werden. Aufgrund der schnellen Resorption von supplementierten Aminosäuren kurz nach der Futteraufnahme, kommt es zu einem sehr schnellen Anstieg der Aminosäurenkonzentration im Blutplasma des Fisches (Fast-Response) . Zu dieser Zeit befinden sich aber die anderen Aminosäuren aus den natürlichen Proteinquellen wie z.B. Sojamehl noch nicht im Plasma, was zur Asynchronität der gleichzeitigen Verfüg¬ barkeit aller wichtigen Aminosäuren führen kann. Ein Teil der hochkonzentrierten Aminosäuren wird in Folge dessen schnell ausgeschieden bzw. im Organismus schnell metaboli- siert und z.B. als reine Energiequelle genutzt. Dadurch kommt es beim Karpfen nur zu einer geringen bzw. keiner Wachstumssteigerung bei der Verwendung von kristallinen A- minosäuren als Futtermitteladditive (Aoe et al . , Bull. Jap. Soc. Sei. Fish. 1970, 36, 407-413). Bei Krustentieren kann die Supplementierung von kristallinen EAAs noch zu weiteren Problemen führen. Durch das langsame Fressverhalten von bestimmten Krustentieren wie z.B. Shrimps der Art Litopenaeus Vannamei kommt es, aufgrund der langen Verweilzeit des Fut¬ ters unter Wasser, zum Herauslösen der supplementierten, wasserlöslichen EAAs (Leaching) , was zur Eutrophierung des Gewässers und nicht zu einer Wachstumssteigerung der Tiere führt (Alam et al . , Aquaculture 2005, 248, 13-16) . Die ef¬ fektive Versorgung von Fischen und Krustentieren, die in Aquakulturen gehalten werden, erfordert somit für bestimmte Arten und Anwendungen eine spezielle Produktform der EAAs wie z.B. eine entsprechend chemisch oder physikalisch geschützte Form. Dabei ist das Ziel zum einen, dass das Pro¬ dukt während der Fütterung in der wässrigen Umgebung hinreichend stabil bleibt und nicht aus dem Futter herausge¬ löst wird. Zum anderen, dass das schließlich vom Tier auf- genommene Aminosäureprodukt im tierischen Organismus opti¬ mal und mit hoher Effizienz verwertet werden kann.
In der Vergangenheit wurden viele Anstrengungen unternommen, um geeignete Futtermitteladditive, im Besonderen auf der Basis der essentiellen Aminosäuren Methionin- und Ly- sin, für Fische und Krustentiere zu entwickeln. So wird beispielsweise in WO8906497 die Verwendung von Di- und Tri- peptiden als Futtermitteladditiv für Fisch- und Krustentieren beschrieben. Dadurch soll das das Wachstum der Tiere gefördert werden. Dabei kamen aber bevorzugt Di- und Tri- peptide aus nicht essentiellen und auch nicht limitierenden Aminosäuren wie z.B. Glycin, Alanin und Serin zum Einsatz, die in vielen pflanzlichen Proteinquellen mehr als ausreichend vorhanden sind. Als methioninhaltige Dipeptide wurde nur DL-Alanyl-DL-Methionin und DL-Methionyl-DL-Glycin be- schrieben. Dadurch sind im Dipeptid aber nur effektiv 50% Wirkstoff (mol/mol) enthalten, was unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten als sehr nachteilig einzustufen ist. In WO02088667 wird die enantioselektive Synthese und Anwendung von Oligomeren aus MHA und Aminosäuren wie z.B. Methionin als Futtermitteladditive, unter anderem auch für Fische und Krustentiere, beschrieben. Dadurch soll ein schnelleres
Wachstum erzielt werden können. Die beschriebenen Oligomere werden durch eine enzymkatalysierte Reaktion aufgebaut und weisen eine sehr breite Verteilung der Kettenlänge der einzelnen Oligomere auf. Dadurch wird das Verfahren unselek- tiv, teuer und aufwendig in der Durchführung und Aufreinigung. Dabrowski et al . beschreibt in US20030099689 die Ver¬ wendung von synthetischen Peptiden als Futtermitteladditive zur Wachstumsförderung für aquatische Tiere. Dabei können die Peptide einen Gewichtsanteil von 6-50% der gesamten Futterformulierung ausmachen. Die synthetischen Peptide bestehen bevorzugt aus EAAs . Die enantioselektive Synthese solcher synthetischer Oligo- und Polypeptide ist jedoch sehr aufwendig, teuer und großtechnisch schwer umsetzbar. Zudem ist die Wirksamkeit von Polypeptiden einer einzelnen Aminosäure umstritten, da diese oft nur sehr langsam oder gar nicht unter physiologischen Bedingungen zu freien Aminosäuren umgesetzt werden. So beschreibt beispielsweise Ba¬ ker et al. (J. Nutr. 1982, 112, 1130-1132), dass Poly-L- Methionin aufgrund der absoluten Unlöslichkeit in Wasser keine Biowertigkeit bei Hühnern aufweist, da eine Resorpti¬ on vom Organismus nicht möglich ist.
Diketopiperazine lassen sich auf mehrere verschiedene Wei¬ sen synthetisieren. So beschrieben beispielsweise Jainta et al. (Eur. J. Org. Chem. 2008, 5418-5424) die mikrowellenas- sistierte Synthese von cyclischen Dipeptiden durch Kondensation von Aminosäuren. Zheng-Zheng et al . (Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 1758-1761) beschrieben hingegen die Synthese mit Hilfe biomimetrischer Katalyse. In beiden Fäl¬ len werden Lösungsmittel bzw. Katalysatoren eingesetzt, die eine kostengünstige Herstellung der cyclischen Dipeptide unmöglich machen. Naraoka et al . (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1986, 1557- 1560) setzten Aminosäureester um, wobei die Reaktionsge¬ schwindigkeit bei den gewählten Reaktionsbedingungen sehr langsam und auch nach mehreren Tagen kein Vollumsatz zu verzeichnen war. Cyclische Dipeptide lassen sich auch aus gewöhnlichen Dipeptiden durch Wasserabspaltung gewinnen. Dies zeigten beispielsweise Kopple et al . (J. Org. Chem., 1968, 33, 862-864) und Tullberg et al . (Tetrahedron, 2006, 62, 7484-7491) . In beiden Fällen müssen jedoch brennbare oder giftige organische Lösungsmittel eingesetzt werden. Snyder et al . konnten cyclische Dipeptide gewinnen, indem sie bereits bestehende Diketopiperazinderivate wie z.B. chlorierte Diketopiperazine (Journal of the American Chemi¬ cal Society, 1944, 66, 1002-1004) oder vinylierte Diketopi- perazinderivate (Journal of the American Chemical Society, 1944, 66, 511-512) umfunktionalisierten . Weiterhin gelang Snyder et al . Die Synthese von cyclischen Dipeptiden aus Aminolactonen (Journal of the American Chemical Society, 1942, 64, 2082-2084) . In allen genannten Fällen sind im Vorfeld aufwändig zu synthetisierende Edukte notwendig. Ein gängiges Verfahren zur Synthese gemischter cyclischer Dipeptide ist außerdem die Anwendung der Schutzgruppentechnik, wie z.B. von DesMarteau et al . (Tetrahedron Letters, 2006, 47, 561-564) oder Egusa et al . (Bull Chem. Soc. Jpn . , 1986, 59, 2195-2201) angewandt wurde. Schutzgruppenchemie bedarf jedoch immer zusätzlicher Reaktionsschritte - einerseits um die Amino- oder die Carboxylatgruppe der zu kop¬ pelnden Aminosäuren zu schützen und andererseits nach der Kopplung die Schutzgruppen wieder zu entfernen. Eine Ver- einfachung stellt hierbei die Festphasensynthese dar. So konnten beispielsweise Lloyd-Williams et al . (Pept. 1990, Proc. Eur. Pept. Symp. 21st, 1991, 146-148), Compo ET AL . (Tetrahedron, 2009, 65, 5343-5349) oder Wang et al . (Tetra¬ hedron Letters, 2002, 43, 865-867) cyclische Dipeptide mit Hilfe der Festphasenchemie herstellen. Die Verwendung der Festphasensynthese ist zur Herstellung von cyclischen Di- Peptiden im Kilogramm-Maßstab nicht geeignet, da die Harze unverhältnismäßig teuer sind.
Neben dem Einsatz neuer chemischer Derivate von EAAs wie z.B. methioninhaltige Peptide und Oligomere wurden auch verschiedene physikalische Schutzmöglichkeiten wie z.B Coa- tings bzw. die Einbettung einer EAA in einer Schutzmatrix untersucht. So konnten beispielsweise Alam et al . (Aqua- cult. Nutr. 2004, 10, 309-316 und Aquaculture 2005, 248, 13-19) zeigen, dass gecoatetes Methionin und Lysin im Ge- gensatz zu nicht gecoatetem einen sehr positiven Einfluss auf das Wachstum von jungen Kuruma Shrimps besitzt. Obwohl die Verwendung eines speziellen Coatings das Leaching von Methionin und Lysin aus dem Futterpellet unterdrücken konnte, gibt es einige gravierende Nachteile. Die Herstellung bzw. die Beschichtung von Aminosäuren stellt meist ein technisch kompliziertes und aufwendiges Verfahren dar und ist daher teuer. Zudem kann die oberflächliche Beschichtung der fertig gecoateten Aminosäure leicht durch mechanische Belastung und Abrieb während der Futterverarbeitung beschä- digt werden, was zur Verminderung bzw. bis zum vollständigen Verlust des physikalischen Schutzes führen kann. Hinzukommt, dass durch ein Coating oder Verwendung einer Matrixsubstanz der Gehalt der Aminosäure verringert und damit oft unwirtschaftlich wird.
Aufgabe der Erfindung
Vor dem Hintergrund der Nachteile des Standes der Technik war es vor allem die Aufgabe, ein chemisch geschütztes Pro¬ dukt aus der kovalent gebundenen Kombination aus zwei es- sentiellen und limitierenden Aminosäuren wie z.B. DL-
Methionin, L-Lysin, L-Threonin oder L-Tryptophan für Wiederkäuer wie z.B. Milchkühe, aber auch für viele omni-, herbi- und karnivore Fisch- und Krustentierarten, die in Salz- oder Süßwasser leben, bereitzustellen. Insbesondere sollte dieses chemisch geschützte Produkt einen „Slow Re¬ leases-Mechanismus, also eine langsame und kontinuierliche Freisetzung von freiem Methionin und EAA (EAA=essentielle Aminosäure) unter physiologischen Bedingungen besitzen. Zu- dem sollte die chemisch geschützte Produktform aus zwei gleichen oder verschiedenen EAAs pansenstabil sein und damit für alle Wiederkäuer geeignet sein. Für die Anwendung als Futtermitteladditiv für Fische und Krustentiere sollte die Produktform ein geringes Löslichkeitsverhalten aus dem Gesamtfutterpellet bzw. -extrudat im Wasser aufweisen (Lea- ching) . Darüber hinaus sollte das Futtermitteladditiv im Verdauungssystem des Fische und Krustentiere besser löslich sein als im umgebenden Salz- oder Süßwasser.
Eine weitere Aufgabe war es, ein Ersatzstoff für kristalli- ne EAAs als Futtermittel bzw. einen Futtermittelzusatzstoff mit sehr hoher Biowertigkeit aufzufinden, der gute Handhab¬ barkeit und Lagerfähigkeit sowie Stabilität unter den übli¬ chen Bedingungen der Mischfutterverarbeitung, insbesondere der Pelletierung und Extrusion aufweisen sollte. Auf diese Weise sollten Wiederkäuern, Fischen und Krustentieren neben den bekannten kristallinen, gecoateten oder Matrix geschützten EAAs, weitere effiziente Quellen essentieller Aminosäuren zur Verfügung gestellt werden, welche möglichst die Nachteile der bekannten Produkte nicht oder nur in verringertem Umfang aufweisen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Futtermittel bzw. ei¬ nen Futtermittelzusatzstoff für die Tierernährung auf Basis eines sechsgliedrigen heterocyclischen Ringsystems (2,5- Piperazindion, Diketopiperazin [DKP] , cyclo-Dipeptid, De- hydrodipeptid) bereit, bei dem Aminosäurereste essentieller und limitierender Aminosäuren wie z.B. DL-Methionin, L- Lysin, L-Threonin und L-Tryptophan kovalent an den 3, 6- Positionen des Diketopiperazins gebunden sind und welcher als Futtermitteladditiv für die Ernährung von Wiederkäuern wie z.B. Milchkühe, insbesondere aber auch von Fischen und Krustentieren in Aquakulturen verwendet werden kann.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Futtermitteladditiv enthaltend mindestens ein Diketopiperazin (cyclisches Dipep- tid) mit der folgenden allgemeinen Formel IV oder ein Salz davon :
Figure imgf000013_0001
wobei R und R unabhängig voneinander einen Aminosäurerest R darstellen (vorzugsweise in der L-Konfiguration) ausgewählt aus der Gruppe Methionin (R = - (CH2) 2SCH3) , Lysin (R = -(CH2)4NH2), Threonin (R = -CH (OH) (CH3) ) , Tryptophan (R = - indolyl), Histidin (R = -imidazoyl) , Valin (R = -CH(CH3)2), Leucin (R = -CH2CH ( (CH3) 2) , Isoleucin (R = -CH (CH3) CH2CH3) , Phenylalanin (R = -CH2Ph) , Arginin (R = - (CH2) 3NHC (=NH) CH2) , Cystein (R = -CH2SH) , wobei gegebenenfalls R1 gleich R2 sein kann; oder enthaltend mindestens eine Verbindung mit der folge den allgemeinen Formel V oder ein Salz davon, wobei R1 ui R2 wie oben definiert sind
Figure imgf000014_0001
In einer bevorzugten Ausführungsform liegen R und/oder R' in der L-Konfiguration vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Futtermitteladdi- tivs ist R1 oder R2 ein Methionyl-Rest (R = -(CH2)2SCH3) in der DD-, LL, LD- oder DL-Konfiguration .
Weiterhin ist bevorzugt, dass das im Futtermitteladditiv enthaltene Diketopiperazin als cyclo-D-EAA-D-EAA, cyclo-L- EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-L-EAA oder Mi- schungen davon, insbesondere als Diastereomerengemisch cyc- lo-DL-EAA-DL-EAA, vorliegt, wobei EAA eine Aminosäure aus¬ gewählt aus der Gruppe Metionin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein und Cystin bezeichnet. Zudem ist weiter bevorzugt, dass R1 und R2 jeweils einen
Methionyl-Rest (R = -(CH2)2SCH3) darstellen, und wobei das Diketopiperazin in der DD-, LL-, DL- oder LD-Konfiguration oder in Mischungen davon vorliegt; dabei ist bevorzugt, (d.h. wenn R1 und R2 gleich -(CH2)2SCH3 sind), dass das Di- ketopiperazin mit der LL-Konfiguration nur in Mischung mit anderen Konfigurationen vorliegt.
Besonders bevorzugt ist, dass das im Futtermitteladditiv enthaltene Diketopiperazin als Diastereomerengemisch
DD/LL/meso-cyclo-Met-Met vorliegt (d.h. als Mischung von DD/LL-cyclo-Met-Met und meso-cyclo-Met-Met ) , wobei Met Methionin bezeichnet.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Futtermittelmischung enthaltend das oben beschriebene Futtermitteladdi- ti .
In einer bevorzugten Ausfühungsform der Futtermittelmischung sind zusätzlich in Mischung enthalten: eine oder mehrere der folgenden Substanzen: DL-Methionin, L-EAA, DL- EAA, die Diastereomerengemische DD/LL/DL/LD-Methionyl- EAAbzw . DD/LL/DL/LD-EAA-Methionin, DD/LL-Methionyl-EAA,
DD/LL-EAA-Methionin, D-Methionyl-L-EAA, L-Methionyl-L-EAA, D-Methionyl-D-EAA, L-Methionyl-D-EAA, D-EAA-L-Methionin, L- EAA-L-Methionin, D-EAA-D-Methionin, L-EAA-D-Methionin, bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit DL-Methionin, vorzugsweise mit einem DL-Methioninanteil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevorzugt von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevor¬ zugt von 1 bis 30 Gew. -%, bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit einer L-EAA wie beispielsweise L-Lysin, vorzugsweise mit einem L-EAA Anteil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevorzugt von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt von 1 bis 30 Gew.-%.
Das Futtermitteladditiv enthaltend Diketopiperazine (cycli- sche Dipeptide) und deren Salze ist geeignet als Additiv in Futtermischungen für Wiederkäuer, insbesondere aber auch für Fische und Krustentiere aus Aquakulturen. Besonders be¬ vorzugt ist die Verwendung als Additiv in Futtermischungen für Wiederkäuer.
In bevorzugter Weise enthält die Futtermittelmischung 0,01 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt 0,05 bis 0,5 Gew.-% Diketopipera- zin, allein oder in Mischung mit einer oder mehrere freien Aminosäuren (EAA) , in Mischung eines oder mehrerer natürlicher oder unnatürlicher Dipeptide (EAA-EAA) oder in Mi- schung enthaltend Aminosäuren (EAA) und Dipeptide (EAA- EAA) .
Die Verwendung von 3, 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2, 5- piperazindion (cyclo-Met-Met, Methionin-diketopiperazin) hat sich hierbei als besonders vorteilhaft erwiesen, weil dieses Diketopiperazin ein besonders gutes Leaching- Verhalten aufgrund der niedrigen Löslichkeit aufweist.
Weiterhin zeigt die Verbindung eine gute Pelletier- und Extrusionsstabilität bei der Futtermittelherstellung. Die Diketopiperazine sind stabil in Mischungen mit üblichen
Komponenten und Futtermitteln wie z.B. Getreide (z.B. Mais, Weizen, Tritikale, Gerste, Hirse, u.a.), pflanzliche oder tierische Eiweißträger (z.B. Sojabohnen und Raps und deren Weiterverarbeitungsprodukte, Leguminosen (z.B. Erbsen, Boh- nen, Lupinen, etc.), Fischmehl, u . a . ) und in Kombination mit supplementierten essentiellen Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Vitaminen, Mineralien, Fetten und Ölen.
Weiterhin ist von Vorteil, dass durch den besonders hohen Wirkstoffanteil von Diketopiperazinen pro kg Substanz, im Vergleich zu zwei Mol Aminosäuren pro Mol Diketopiperazin zwei Mole Wasser eingespart werden.
Darüber hinaus ist das Diketopiperazin als Feed Additiv für in Aquakulturen gehaltene Fische und Krustentiere besonders geeignet, da die Löslichkeit des Diketopiperazins allgemein sehr gering ist (siehe Abb. 2), sich jedoch im Verdauungstrakt der Fische bzw. Krustentiere besser löst als im unge- benden Wasser (siehe Abb. 1) .
In einer bevorzugten Verwendung enthält die Futtermittelmi- schung Proteine und Kohlenhydrate, vorzugsweise auf Basis von Fisch-, Soja- oder Maismehl, und können mit essentiellen Aminosäuren, Proteinen, Peptiden, Vitaminen, Mineralien, Kohlenhydraten, Fetten und Ölen supplementiert sein. Insbesondere ist bevorzugt, dass in der Futtermittelmi¬ schung cyclo-EAA-EAA allein als cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D- EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-D-EAA oder als Mischung untereinander, insbesondere als Diastereomerenge- misch cyclo-DL-EAA-DL-EAA, vorliegt, bevorzugt jeweils zu¬ sätzlich in Mischung mit L-EAA, D-EAA oder DL-EAA wie beispielsweise Methionin, Lysin, Threonin oder Tryptophan, jeweils allein oder in Mischung untereinander, vorzugsweise mit einem Aminosäureanteil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevor- zugt von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt von 1 bis 30 Gew.-%.
Weiterhin ist bevorzugt, dass in der Futtermittelmischung cyclo-EAA-EAA allein als cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L- EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-D-EAA oder als Mischung untereinander, insbesondere als Diastereomerengemisch cyclo-DL-EAA-DL-EAA, vorliegt, bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit Dipeptiden der allgemeinen Formel EAA-EAA, allein als L-EAA-L-EAA, D-EAA-L-EAA, L-EAA-D-EAA und D-EAA-D- EAA oder in Mischungen untereinander, insbesondere als Di- astereomerengemisch DL-EAA-DL-EAA, vorliegt bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit L-EAA, D-EAA oder DL-EAA wie beispielsweise Methionin, Lysin, Threonin oder Tryptophan, jeweils allein oder in Mischung untereinander, vorzugsweise mit einem Aminosäureanteil und/oder Dipeptidan- teil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevorzugt von 0,1 bis 50 Gew.- %, besonders bevorzugt von 1 bis 30 Gew.-%.
Gemäß der Erfindung wird das Diketopiperazin cyclo-EAA-EAA allein als cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L- EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-D-EAA oder als Mischung untereinan- der, insbesondere als Diastereomerengemisch cyclo-DL-EAA- DL-EAA, oder im Falle von geladenen EAA-Resten wie z.B. im Falle von Lysin, Histidin oder Arginin dessen Alkali- und Erdalkalisalze wie z.B. die schwerlöslichen Calcium- oder Zinksalze, alleine oder in Mischung mit jeweils zusätzlich in Mischung mit Dipeptiden der allgemeinen Formel EAA-EAA, allein als L-EAA-L-EAA, D-EAA-L-EAA, L-EAA-D-EAA und D-EAA- D-EAA oder in Mischungen untereinander, insbesondere als Diastereomerengemisch DL-EAA-DL-EAA, vorliegt bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit L-EAA, D-EAA oder DL-EAA vorzugsweise für Wiederkäuer und besonders bevorzugt für Fische und Krustentiere, verwendet (siehe Schema 1) :
Figure imgf000018_0001
cyclo-L-EAA-D-EAA cyclo-D-EAA-D-EAA
Schema 1
Dabei stehen die Reste R und R der EAAs für:
R = 2- (methylthio) ethyl) - (Methionin
R = 1-Methylethyl- (Valin)
R = 2-Methylpropyl- (Leucin)
R = (15) -1-Methylpropyl- ( Isoleucin
R = (1R) -1-Hydroxyethyl- (Threonin)
R = 4-Aminobutyl- (Lysin)
R = 3- [ (Aminoiminomethyl ) -amino ] propyl- (Arginin9 R Benzyl- ( Phenylalanin)
R (lfi-Imidazol-4-yl) methyl- (Histidin)
R (lH-Indol-3-yl) methyl- (Tryptophan)
R Mercaptomethyl- (Cystein) Im Falle des Cystins liegt eine Verbindung der Formel (cyc- lo-EAA-Cystin) -S-S- (cyclo-Cys-EAA) vor.
In einer bevorzugten Verwendung sind die in Aquakulturen gehaltene Tiere Süß- und Salzwasserfische und -krustentiere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Karpfen, Forellen, Lachse, Welse, Barsche, Plattfische, Störe, Thunfische, Aa¬ le, Brassen, Dorsche, Shrimps, Krill und Prawns, ganz be¬ sonders für Silver- (Hypophthalmichthys molitrix) , Gras- (Ctenopharyngodon idella) , Schuppen- (Cyprinus carpio) und Bigheadkarpfen (Aristichthys nobilis) , Karausche (Carassius carassius) , Catla (Catla Catla) , Roho Labeo (Labeo rohita) , pazifischer und atlantischer Lachs (Salmon salar und On- corhynchus kisutch) , Regenbogenforelle (Oncorhynchus my- kiss) , amerikanischer Wels (Ictalurus punctatus) , afrikani- scher Wels {Ciarias gariepinus) , Pangasius (Pangasius bo- courti und Pangasius hypothalamus) , Niltilapie (Oreochromis niloticus) , Milchfisch (Chanos chanos) , Cobia (Rachycentron canadum) , Whiteleg Shrimp (Litopenaeus vannamei) , Black Ti¬ ger Shrimp (Penaeus monodon) und Giant River Prawn (Mac- robrachium rosenbergii) .
Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Diketopiperazinen (cyclo-Dipeptiden) allein als cyclo-L-EAA-L-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-D-EAA oder als Mischung untereinander, insbe- sondere als Diastereomerengemisch cyclo-DL-EAA-DL-EAA, als Wachstumspromotor für Wiederkäuer, aber auch für omni-, carni- und herbivore Fische und Krustentiere in Aquakultu¬ ren. Zudem kann durch die Verwendung von cyclo-DL-EAA-DL- EAA als Futtermitteladditiv die Milchproduktion bei Hoch- leistungsmilchkühen gesteigert werden. So konnte erfinderisch gezeigt werden, dass DD/LL/meso- cyclo-Met-Met als Diastereomerengemisch aus einer 50:50- Mischung von DD/LL-cyclo-Met-Met und meso-cyclo-Met-Met un¬ ter physiologischen Bedingungen enzymatisch von Fischen wie z.B. Karpfen und Forellen zu freiem D- bzw. L-Methionin gespalten werden kann (siehe Abb. 3) .
Weiterhin konnte erfinderisch gezeigt werden, dass gemischte cyclische Dipeptide wie z.B. cyclo-D-Met-L-Leu, cyclo D- Met-L-Phe oder cyclo-D-Met-L-Lys unter physiologischen Be- dingungen enzymatisch von Verdauungsenzymen aus Spiegelkarpfen in in vitro Spaltungsversuchen gespalten werden konnte (siehe Abb. 5-8) . Damit eignen sich auch nicht na¬ türliche cyclische Dipeptide mit D-Aminosäuren (D-EAA) als Futtermitteladditive (siehe Schema 2) . Dazu wurden die entsprechenden Verdauungsenzyme aus Omnivo¬ ren Karpfen und karnivoren Forellen isoliert und in optimierten in vitro Versuchen unter physiologisch vergleichbaren Bedingungen mit DD/LL/meso-cyclo-Met-Met als Diastereo¬ merengemisch aus einer 50 : 50-Mischung von DD/LL-cyclo-Met- Met und meso-cyclo-Met-Met umgesetzt. Die erfindungsgemäße Besonderheit der Spaltung von DD/LL/meso-cyclo-Met-Met liegt darin, dass neben dem in der Nahrung auf natürliche Art und Weise auftretenden Diastereomer cyclo-L-Met-L-Met auch die Diastereomere cyclo-D-Met-L-Met und cyclo-D-Met-D- Met unter physiologischen Bedingungen gespalten werden können (siehe Abb. 3 und 4) . Unter in vitro Bedingungen sind isolierte Enzymcocktails aus Verdauungssystemen von Fischen nur kurze Zeit aktiv, sodass über die mehrstündige Reakti¬ onszeit die Spaltungsgeschwindigkeit drastisch abnimmt und schließlich zum Erliegen kommt, obwohl das cyclische Dipep- tid noch nicht vollständig umgesetzt wurde. Es ist davon auszugehen, dass unter in vivo Bedingungen im lebenden Fisch die Enzymaktivität deutlich höher ist, durch ständige Erneuerung der Enzyme stabil bleibt und letzendlich auch zur vollständigen Verwertung des Futtermitteladditives führt .
Figure imgf000022_0001
cyclo-D-Met-L-
Verdauungs- ι H 0
enzyme 1
Figure imgf000022_0002
D-Met-L-EAA -EAA- D-Met
VerdauungsH?0
enzyme
Figure imgf000022_0003
-Met -L-EAA L-EAA-L-Met
VerdauungsH20
enzyme
Figure imgf000022_0004
cyclo-L-Met -L-EAA
Schema 2 Die Diketopiperazine wurden mit Verdauungsenzymen aus car- nivoren Regenbogenforellen und Omnivoren Spiegelkarpfen in- vitro verdaut. Dazu wurden die Enzyme aus den Verdauungs¬ trakten der Fische und Shrimps separiert. Die Diketopipera- zine würden anschließend mit den erhaltenen Enzymlösungen versetzt. Für eine bessere Vergleichbarkeit der Verdaulich¬ keiten von Dipeptiden verschiedener Spezies wurden gleiche Bedingungen für die in vitro Verdauungsuntersuchungen gewählt (37°C, pH 9) . Wie aus den Abbildungen 3 und 4 hervorgeht, kann das Di- astereomerengemisch DD/LL/meso-cyclo-Met-Met bzw. das Di- astereomere DD/LL-cyclo-Met-Met von Verdauungsenzymen der Regenbogenforelle und des Spiegelkarpfens gespalten werden. Die enzymatischen Spaltungen in den aufgeführten Beispielen sind nicht quantitativ verlaufen, da die Enzyme in den in vitro-Verdauversuchen unter den gewählten Bedingungen
(37°C, pH 9) nur kurze Zeit stabil sind und die Enzymakti¬ vität bereits nach kurzer Zeit drastisch abnimmt. Es ist davon auszugehen, dass die Reaktion unter in vivo Bedingun- gen deutlich schneller und effizienter abläuft.
Aus den erhaltenen Ergebnissen geht hervor, dass sowohl natürliche cyclische Dipeptide (z.B. cyclo-L-Met-L-Met) , als auch unnatürliche cyclische Dipeptid (z.B. cyclo-D-Met-D- Met und cyclo-D-Met-L-Met ) von Verdauungsenzymen carnivorer und omnivorer Fischarten in vitro gespalten werden können. Durch Zugabe von natürlichen und unnatürlichen cyclo-Met- Met Diketopiperazinen zum Futter können also defiziente essentielle Aminosäuren (hier: DL-Met) gezielt zudosiert wer¬ den . Die Aufgabe wird zudem gelöst durch ein Diketopiperazin o- der ein Salz davon, mit der folgenden allgemeinen Formel IV:
Figure imgf000024_0001
IV wobei R und R unabhängig voneinander einen Aminosäurerest darstellen ausgewählt aus der Gruppe Methionin (R1 2 = - (CH2)2SCH3), Lysin (R1/2 = -(CH2)4NH2), Threonin (R1/2 = - CH (OH) (CH3) ) , Tryptophan (R1/2 = -indolyl) , Histidin (R1/2 = -imidazoyl), Valin (R1/2 = -CH(CH3)2), Leucin (R1/2 = - CH2CH ( (CH3) 2) , Isoleucin (R1/2 = -CH (CH3) CH2CH3) , Phenylalanin (R1/2 = -CH2Ph) , Arginin (R1/2 = - (CH2) 3NHC (=NH) CH2) , Cystein (R1 2 = -CH2SH) , wobei gegebenenfalls R1 gleich R2 sein kann; mit der Voraussetzung dass wenn R1 und R2 gleich -(CH2)2SCH3 sind, dann das Diketopiperazin nicht ausschließlich als cyclo-L-Met-L-Met vorliegt; oder eine Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel V oder ein Salz davon, wobei R1 und R2 wie oben definiert sind
Figure imgf000024_0002
In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die C-Atome mit R1 und/oder R2 in der L-Konfiguration vor.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R oder R2 ein Methionyl-Rest (R = -(CH2)2SCH3) in der DD-, LL, LD- oder DL-Konfiguration an den zugehörigen C-Atomen. In bevorzugter Weise liegt das Diketopiperazin als cyclo-D- EAA-D-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L- EAA-L-EAA oder Mischungen davon, insbesondere als Diastere- omerengemisch cyclo-DL-EAA-DL-EAA, vor, wobei EAA eine Ami- nosäure ausgewählt aus der Gruppe Methionin, Lysin, Threo- nin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein und Cystin bezeichnet.
Weiterhin ist bevorzugt, dass R1 und R2 jeweils einen
Methionyl-Rest (R = - ( CH2 ) 2 S CH3 ) darstellt, und wobei das Diketopiperazin in der DD-, LL-, DL- oder LD-Konfiguration oder in Mischungen davon vorliegt; mit der Voraussetzung, dass wenn R1 und R2 gleich - ( CH2 ) 2 S CH3 sind, das Diketopipe¬ razin mit der LL-Konfiguration nur in Mischung mit anderen Konfigurationen vorliegt. In einer weiteren Ausführungsform liegt das Diketopiperazin in einer Mischung als DD/LL/meso-cyclo-Met-Met , vorzugswei¬ se in einer 50 : 50-Mischung aus DD/LL-cyclo-Met-Met und me- so-cyclo-Met-Met , vor.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verwendung der Diketopiperazine bereit als Futtermitteladditiv für Wiederkäuer, Süß- oder Salzwasserfische und Krustentiere.
Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Diketopiperazins mit der folgenden allge¬ meinen Formel IV oder ein Salz davon:
Figure imgf000025_0001
IV oder eine Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel oder ein Salz davon,
Figure imgf000026_0001
aus einem oder mehreren Aminosäureestern der folgenden all- gemeinen Formel III:
Figure imgf000026_0002
wobei R und R unabhängig voneinander wie folgt definiert sind :
Formel IV und V:
Rl/2 = 2- (methylthio) ethyl) - (Methionin)
Rl/2 = 1-Methylethyl- (Valin)
Rl/2 = 2-Methylpropyl- (Leucin)
Rl/2 = (15) -1-Methylpropyl- ( Isoleucin)
Rl/2 = ( 1R) -1-Hydroxyethyl- (Threonin)
Rl/2 = 4-Aminobutyl- (Lysin)
Rl/2 = 3- [ (Aminoiminomethyl ) -amino ] propyl- (Arginin)
Rl/2 = Benzyl- ( Phenylalanin)
Rl/2 = (lfi-Imidazol-4-yl) methyl- (Histidin)
Rl/2 = (lH-Indol-3-yl) methyl- (Tryptophan)
Rl/2 = Mercaptomethyl- (Cystein)
Formel III:
R1/2 = -CH2-S-S-CH2-CH (NH2) COOR' (Cystin) wobei gegebenenfalls R gleich R sein kann;
und wobei R lineare oder verzweigte aliphatische Reste o- der aromatische Reste definiert und verschiedene R' in ver¬ schiedenen Aminosäureestermolekülen vorkommen können;
wobei die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopipera- zin in Substanz erfolgt.
In einem bevorzugten Verfahren wird der Aminosäureester der allgemeinen Formel III durch Veresterung einer Aminosäure mit der allgemeinen Formel I R1/2-CH (NH2) -COOH oder Cystin mit einer Verbindung mit der allgemeinen Formel II R'-OH, gewonnen .
Weiterhin ist bevorzugt, dass die Veresterung in Anwesenheit einer starken Säure durchgeführt wird, vorzugsweise in Anwesenheit von HCl oder H2SO4. In einem bevorzugten Verfahren ist der Rest R' ein Ci-Cs- Alkylrest, weiter bevorzugt ein Ci-C6-Alkylrest besonders bevorzugt ein Ci-C4-Alkylrest , wobei der Alkylrest jeweils linear ist oder ggf. verzweigt sein kann.
In einem bevorzugten Verfahren ist der Rest R' ausgewählt aus der Gruppe Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n- Butyl, iso-Butyl, sek.-Butyl, Benzyl-.
In einem anderen bevorzugten Verfahren ist der Rest R' ein C2-C8-Alkenylrest , weiter bevorzugt ein C2-C6-Alkenylrest besonders bevorzugt ein C2 ~C4-Alkenylrest , wobei der Alke- nylrest jeweils linear ist oder ggf. verzweigt sein kann.
In einem bevorzugten Verfahren wird vor der Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin der Aminosäurester aufkonzentriert . Wie oben erwähnt erfolgt die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin erfindungsgemäß in Substanz und zwar ohne Verwendung von Lösungsmitteln. Dies bedeutet, dass gemäß der Erfindung bei der Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin, keine Lösungsmittel, insbesondere kei¬ ne organischen, polaren oder wässrigen Lösungsmittel, und insbesondere vorzugsweise keine Basen vorhanden sind, außer den folgenden Substanzen: das bei der Umsetzung entstehende Diketopiperazin selbst und die Verbindung mit der allgemei- nen Formel R'-OH, welche während der Umsetzung destillativ entfernt wird.
Besonders bevorzugt erfolgt die Umsetzung des Aminosäurees¬ ters zum Diketopiperazin ohne Verwendung von Transamidie- rungskatalysatoren . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin in Reinsubstanz, vorzugsweise mit einer Reinheit von > 50 Gew.-%, bevorzugt > 90% Gew.-%, besonders bevorzugt von > 95 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von > 98 Gew.-%. In einem weiteren bevorzugten Verfahren wird die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin bei einer Tempera¬ tur von 30 bis 220°C, bevorzugt bei einer Temperatur von 50 bis 170°C und besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 70 bis 140°C durchgeführt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin bevorzugt durch destillatives Abtrennen der Verbindung mit der allgemeinen Formel R'-OH (z.B. ein Alkanol) durchgeführt, beispielswei¬ se unter Eigendruck, Normaldruck oder vermindertem Druck, bevorzugt bei einem Druck von 0,01 bis 20 bar, besonders bevorzugt bei einem Druck von 0,05 bis 1,5 bar, ganz besonders bevorzugt bei Atmosphärendruck. Vorzugsweise wird das Diketopiperazin bei der genannten Destillation durch Kristallisation erhalten.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren kann der bei der Reaktion nicht vollständig umgesetzte Aminosäureester rück- gewonnen und erneut dem Prozess zugeführt werden.
Auch kann in einem wiederum weiteren bevorzugten Verfahren die bei der Veresterung der Aminosäure zum Aminosäureester nicht vollständig umgesetzte und/oder die bei der Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin wieder erhaltene Verbindung mit der allgemeinen Formel R'-OH rückgewonnen und erneut dem Prozess zugeführt werden.
Insbesondere ist dabei bevorzugt, dass der Aminosäureester in der DL, L- oder D-Konfiguration aus der Gruppe Methio- nin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein, Cystin in Reinsubstanz ohne Verwendung von Lösungsmitteln erwärmt wird. Sowohl die hierbei abgespaltene Verbindung R'-OH (z.B. ein Alkanol) , als auch nicht umgesetzter Aminosäureester können vollständig recycliert und dem Prozess erneut zugeführt werden (siehe Schema 3 und 4) . Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Ester vorzugsweise zunächst aus der in einer Verbindung R'-OH (z.B. ein Alkanol) suspendierten freien Aminosäure unter Wasserapspaltung durch Zugabe einer starken Säure wie z.B. HCl oder H2 S O4 gewonnen. Nach Freisetzung des Aminosäureesters, z.B. aus dessem Hydrochlorid, durch eine Base wie z.B. NH3 oder K2CO3 und Aufkonzentration wird das resultierende Öl (d.h. das Diketopiperazin in Reinsubstanz) erwärmt, wobei der Alkohol destillativ abge- trennt und das cyclische Dipeptid (Diketopiperazin der For¬ mel IV) hochselektiv aus der Reaktionsmischung auskristallisiert. Nach Filtration und Waschen des Produktes mit ei¬ nem Lösungsmittel wird nicht umgesetzter Aminosäureester zurückgewonnen und kann dem Prozess wieder zugeführt werden .
Figure imgf000030_0001
Schema 3
Es ist hierbei zu beachten, dass Schema 3 vereinfacht dar¬ gestellt ist, denn das Reaktionsschema lässt unberücksich¬ tigt, dass verschiedene Aminosäure-Moleküle eingesetzt er¬ den können bzw. verschiedene Aminosäureester verwendet werden können, bezogen auf den Aminosäurerest aber auch möglicherweise bezüglich R' .
EAA
Veresterung
recycli e rter
Alkohol
DKP-Synthese
recyclierter
EAA-Ester
Filtration
DKP ( cyclo-Dipeptid)
Schema 4
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können zur Synthese von gemischten Diketopipera- zinen der allgemeinen Formel cyclo-EAA-EAA zwei oder mehr verschiedene Aminosäureester in der DL, L- oder D- Konfiguration aus der Gruppe Methionin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein, Cystin in beliebigen Mischungen untereinander umgesetzt werden.
Weiterhin kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung in dem Fachmann bekannten Batch-Verfahren oder in kontinuierlichen Verfahren ausgeführt werden.
Abbildungen Die Abbildung 1 zeigt die Löslichkeit von cyclo-DL-Met-DL- Met in Gallenflüssigkeit/Wasser-Mischungen (Gallenflüssigkeit aus Spielgelkarpfen entnommen) .
Die Abbildung 2 zeigt Löslichkeit von cyclo-DL-Met-DL-Met in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung.
Die Abbildung 3 zeigt die Spaltung von DD/LL/meso-cyclo- Met-Met mit Enzymen aus der Regenbogenforelle.
Die Abbildung 4 zeigt die Spaltung von DD/LL-cyclo-Met-Met mit Enzymen aus Spiegelkarpfen. Die Abbildung 5 zeigt die Spaltung von cyclo-L-His-L-His mit Enzymen aus Spiegelkarpfen.
Die Abbildung 6 zeigt die Spaltung von cyclo-D-Met-L-Leu mit Enzymen aus Spiegelkarpfen.
Die Abbildung 7 zeigt die Spaltung von cyclo-D-Met-L-Phe mit Enzymen aus Regenbogenforelle.
Die Abbildung 8 zeigt die Spaltung von cyclo-D-Met-L-Lys mit Enzymen aus Regenbogenforelle.
Die Abbildung 9 zeigt die Spaltung von cyclo-D-Met-L-Thr mit Enzymen aus Whiteleg Shrimp.
Beispiele Beispiel 1 :
Synthese von DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe)
200 g (1,34 Mol) DL-Methionin wurden in 1 L Methanol sus- pendiert. In diese Suspension wird solange HCl-Gas einge¬ leitet, bis der Feststoff gelöst war und dann noch 1 Stunde mit dem Einleiten fortgefahren. Die Temperatur stieg dabei bis auf 60°C an. Anschließend wurden ca. 200 mL Methanol aus der Reaktionslösung bei 30°C am Rotationsverdampfer abdestilliert, hierbei wird der Hauptteil des überschüssigen HCL-Gases entfernt. In die verbleibende Lösung wird an¬ schließend bei 10-20°C so lange H3 ~Gas eingeleitet, bis die Reaktionslösung deutlich alkalisch reagiert. Das ausgefallene NH4C1 wur abgesaugt und mit Methanol nachgewaschen. Das Filtrat wird am Rotationsverdamper eingeengt, in 750 mL Ethylacetat aufgenommen, 2 mal mit je 50 mL 10%iger K2CO3- Lösung gewaschen. Über MgSC^ getrocknet und am Rotations- Verdampfer eingeengt.
Auswaage: 203 g (93% d. Th.) leicht gelbliches klares Öl Das 1R und 13C-NMR stimmte mit den Literaturwerten überein.
Beispiel 2 :
Synthese von DL-Methionin-iso-propylester (DL-Met-OiPr)
200 g (1,34 Mol) DL-Methionin wurden in 1 L iso-Propanol suspendiert. In diese Suspension wird solange HCl-Gas ein¬ geleitet, bis der Feststoff gelöst war und dann noch 1 Stunde mit dem Einleiten fortgefahren. Die Temperatur stieg dabei bis auf 60°C an. Anschließend wurden ca. 200 mL iso- Propanol aus der Reaktionslösung bei 30°C am Rotationsverdampfer abdestilliert, hierbei wird der Hauptteil des über¬ schüssigen HCL-Gases entfernt. In die verbleibende Lösung wird anschließend bei 10-20°C so lange H3 ~Gas eingeleitet, bis die Reaktionslösung deutlich alkalisch reagiert. Das ausgefallene NH4C1 wur abgesaugt und mit iso-Propanol nach¬ gewaschen. Das Filtrat wird am Rotationsverdamper eingeengt, in 750 mL Ethylacetat aufgenommen, 2 mal mit je 50 mL 10%iger K2C03~Lösung gewaschen. Über MgSC^ getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt.
Auswaage: 233 g (91% d. Th.) leicht gelbliches klares Öl Das 1R und 13C-NMR stimmte mit den Literaturwerten überein. Beispiel 3:
Synthese von 3 , 6-Bis [2- (methylthio) ethyl] -2 , 5-piperazindion (DD/LL/meso-cyclo-Met-Met) aus DL-Methioninmethylester (DL- Met-OMe)
Figure imgf000034_0001
272 g (1,67 Mol) DL-Methioninmethylester wurden unter gutem Rühren auf 130 °C erwärmt und 2 Stunden bei dieser Tempera¬ tur gerührt. Dabei wurden 36 g Methanol abdestilliert und das cyclo-Met-Met kristallisierte aus. Nach dem Abkühlen wurde der Kristallbrei mit 250 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit Methanol gewaschen und im Vaku- umtrockenschrank bei 30 °C getrocknet. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer bei 40 °C eingeengt und dem nachfolgenden Ansatz wieder zugeführt. Auswaage: 149 g (68% d. Th.) weißer Feststoff, Reinheit > 99% (HPLC) , Schmelzpunkt 235-236°C.
1H-NMR von 3 , 6-Bis [ 2 - (methylthio ) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (500 MHz, D6-DMSO) : δ = 1, 85-2, 05 (m, 4H, 2 x SCH2CH2) ;
2, 049 (s, 6H, 2 x SCH3) ; 2, 46-2, 60 (m, 4H, 2 x SCH2) ; 3,92- 3, 99 (m, 2H, 2 x CH) ; 8,213 (s, 2H, 2 x NH)
13C-NMR von 3 , 6-Bis [ 2 - (methylthio ) ethyl ] -2 , 5-piperazindion (125.8 MHz, D6-DMSO) : δ = 14,35 (CH3) ; 14,38 (CH3) ; 28,50 (CH2S); 28, 68 (CH2S) ; 31,92 (CH2CH2S); 32, 33 (CH2CH2S); 52,92 (CH) ; 52,96 (CH) ; 167,69 (C=0) ; 167,71 (C=0) Elementaranalyse für Ci0H18N2O2S2 (M = 262, 39 g/mol) :
Berechnet: C 45,77; H 6,91; N 10,68; S 24,44
Gefunden: C 45,94; H 6,96; N 10,64; S 24,38 Beispiel 4 :
Synthese von 3 , 6-Bis- (S) - (lH-imidazol-4-yl) -2 , 5- piperazindion (cyclo-L-His-L-His) aus L-Histidinmethylester (L-His-OMe)
Figure imgf000035_0001
8,46 g (50 mMol) L-Histidmmethylester (L-His-OMe) wurden unter gutem Rühren auf 80 °C erwärmt und 5 Stunden im Wasserstrahlvakuum bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Ab kühlen wurde der Kristallbrei mit 25 mL Ethylacetat ver¬ setzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit Ethylacetat gewa¬ schen und im Olpumpenvakuum getrocknet.
Figure imgf000035_0002
Auswaage: 7,80 g (57% d. Th.) als weißer Feststoff. Έ-NMR von 3 , 6-Bis- ( S) - ( 1H-imidazol-4 -yl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-L-His-L-His) (500 MHz, D6-DMSO) : δ = 2,94 (dd, 3J = 6,8 Hz, 1J = 15,4 Hz, 2H, 2 x CH'H" ) ; 3,07 (dd, 3J = 3,8 Hz, 1J = 15,4 Hz, 2H, 2 x CH'H"); 4, 30-4, 34 (m, 2H, 2 x CH) ; 7,31 (bs, 2H, 2 x N=CH-N) ; 8,17 (bs, 2H, 2 x NH) ; 8,82 (bs, 2H, 2 x NH-CH=C) ; 13-15 (bs, 2H, 2 x CH-NH-CH)
Beispiel 5:
Synthese der cyclischen cyclo-Met-Leu Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-Leucinmethylester (L-Leu-OMe) und Isolation eines Diastereomers 3- (R) - [2- (methylthio)ethyl] -6- (S) - (2- (methyl) ropyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Leu)
Figure imgf000036_0001
4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3, 63 g (25 mMol) L-Leucinmethylester (L-Leu-OMe) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 120 °C erwärmt und 2 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Ab- kühlen wurde der Feststoffbrei mit 20 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo- Met-Leu wurden an einer Kieselgel-Säule mit n- Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert .
3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (2- (methyl ) propyl ) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Leu) :
Figure imgf000037_0001
Auswaage: 320 mg (59% d. Th.) als weißer Feststoff.
H-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (2- (methyl ) propyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Leu) (500 MHz, D6-DMSO) : δ = 0,87 (d, 3J = 6,6 Hz, 3H, CH (CH3) (CH3) ) ; 0,88 (d, 3J = 6,6 Hz, 3H, CH (CH3) (CH3) ) ; 1, 50-1, 58 (m, 2H, SCHCH2) ; 1, 72 - 1, 84 (m, 1H, CH(CH3)2); 1, 88-2, 02 (m, 2H, (CH3) 2HCH2) ; 2,04 (s, 3H, SCH3) ; 2, 44-2, 58 (m, 2H, SCH2) ; 3,68-3,74 (m, 1H, CH) ; 3,94-4,00 (m, 1H, CH) ; 8.11 (bs, 1H, NH) ; 8.19 (bs, 1H, NH)
13C-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (2- (methyl) propyl) -2, 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Leu)
(125.8 MHz, D6-DMSO) : δ = 14,40; 21,82; 22,77; 23,51;
28,51; 31,28; 41,92; 52,50; 52,90; 167,67; 168,82
Beispiel 6:
Synthese der cyclischen cyclo-Met-Phe Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-
Phenylalaninmethylester (L-Phe-OMe) und Isolation eines Di- astereomers 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (2- phenylmethyl) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Phe)
Figure imgf000038_0001
4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 4,48 g (25 mMol) L-Phenylalaninmethylester (L-Phe-OMe) wur- den unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 120 °C erwärmt und 2,5 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 30 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo-Met-Phe wurden an einer Kieselgel-Säule mit n- Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert .
3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (2-phenylmethyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Phe) :
Figure imgf000038_0002
Auswaage: 360 mg (77% d. Th.) als weißer Feststoff.
H-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (2- phenylmethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Phe) (500 MHz, D6-DMSO) : δ = 1, 76-1, 82 (m, 2H, SCHCH2) ; 1,97 (s, 3H, SCH3) ; 2, 30-2, 46 (m, 2H, SCH2) ; 2,89 (dd, 1H, 3J = 4,8 Hz, 1J = 13,5 Hz, PhCH'H"); 3,05 (t, 3J = 5,0 Hz, 1H, CH) ;
2,89 (dd, 1H, 3J = 4,8 Hz, = 13,5 Hz, PhCH'H"); 4,10- 4,16 (m, 1H, CH) ; 7,14-7,30 (m, 5H, Ph) ; 8.03 (bs, 1H, NH) ; 8.13 (bs, 1H, NH) 13C-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (2- phenylmethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Phe) (125.8 MHz, D6-DMSO) : δ = 14,38; 28,22; 31,56; 38,44; 52,16;
55,43; 126,64; 128,00; 129,97; 135,92; 167,24; 167,33
Beispiel 7:
Synthese der cyclischen cyclo-Met-Thr Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-Threoninmethylester (L-Thr-OMe) und Isolation eines Diastereomers 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (1- (R) -Hydroxyethyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Thr)
Figure imgf000040_0001
4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3,33 g (25 mMol) L-Threoninmethylester (L-Thr-OMe) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 100 °C erwärmt und 3 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 150 mL Methanol ver¬ setzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewa¬ schen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo-Met-Thr wurden an einer Kieselgel-Säule mit n-
Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert .
3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (1- (R) -Hydroxyethyl ) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Thr) :
Figure imgf000040_0002
Auswaage: 250 mg (54% d. Th.) als weißer Feststoff.
H-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio ) ethyl ] -6- (S) - ( 1 - (R) - Hydroxyethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Thr) (500 MHz, D6-DMSO) : δ = 1,09 (d, 3H, 3J = 6,3 Hz, CH(OH)CH3); 1, 86-2, 02 (m, 2H, SCH2CH2) ; 2,04 (s, 3H, SCH3) ; 2,42-2,60
(m, 2H, SCH2) ; 2, 42-2, 46 (m, 1H, CH) ; 4, 00-4, 06 (m, 2H, CH, OCH3) ; 4,98 (d, 3J = 5,3 Hz, 1H, OH); 8.01 (bs, 1H, NH) ; 8.07 (bs, 1H, NH)
13C-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio ) ethyl ] - 6- (5) - (1- (R) - Hydroxyethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Thr) (125.8 MHz, D6-DMSO) : δ = 14,41; 19,88; 28,50; 30,77; 52,06;
60,93; 68,17; 168,61; 168,69
Beispiel 8 : Synthese der cyclischen cyclo-Met-Lys Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-Lysinmethylester (L-Lys-OMe) und Isolation eines Diastereomers 3- (S) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (4-Aminobutyl) -2 , 5-piperazindion Hydrochlorid (cyclo-L-Met-L-Lys x HCl)
Figure imgf000041_0001
4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3,33 g (25 mMol) L-Lysinmethylester Monohydrochlorid (L- Lys-OMe x HCl) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlva¬ kuum auf 130°C erwärmt und 1,5 Stunden bei dieser Tempera- tur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 150 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo-Met-Lys wurden an einer Kieselgel- Säule mit n-Butanol/Ethylacetat/Triethylamin = 70:30:2 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde ex¬ emplarisch in ethanolischer HCl-Lösung gelöst, wieder eingeengt, am Ölpumpenvakuum von Lösungsmittelresten befreit und charakterisiert.
3- (5) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (5) - (4-Aminobutyl) -2,5- piperazindion Hydrochlorid (cyclo-L-Met-L-Lys x HCl) :
Figure imgf000042_0001
Auswaage: 190 mg (40% d. Th.) als weißer Feststoff.
H-NMR von 3- ( S) -[ 2 - (methylthio ) ethyl ]- 6- ( S) -( 4 - Aminobutyl ) -2 , 5-piperazindion Hydrochlorid (cyclo-L-Met-L- Lys x HCl) (500 MHz, D6-DMSO) : δ = 1, 26-1, 44 (m, 2H, CH2) ; 1, 50-1, 60 (m, 2H, CH2) ; 1, 62-1, 74 (m, 2H, CH2) ; 1,82-1,92 (m, 2H, SCHCH2) ; 2,04 (s, 3H, SCH3) ; 2, 50-2, 60 (m, 2H, SCH2) ; 2, 70-2, 78 (m, 2H, NCH2) ; 3, 82-3, 88 (m, 1H, CH) ;
3, 92-3, 96 (m, 1H, CH) ; 8,01 (bs, 3H, NH3 +) ; 8.16 (bs, 1H, NH) ; 8.19 (bs, 1H, NH)
13C-NMR von 3- ( S) -[ 2 - (methylthio ) ethyl ]- 6- ( S) -( 4 - Aminobutyl ) -2 , 5-piperazindion Hydrochlorid (cyclo-L-Met-L- Lys x HCl) (125.8 MHz, D6-DMSO) : δ = 14,38; 21,02; 26,57; 28,77; 31,92; 32,48; 38,41; 52,93; 53,60; 167,66; 167,86 Beispiel 9:
Synthese der cyclischen cyclo-Met-Val Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L-Valinmethylester (L-Val-OMe) und Isolation eines Diastereomers 3- (R) - [2- (methylthio)ethyl] -6- (S) - (1- (methyl) ethyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Val)
Figure imgf000043_0001
4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3,28 g (25 mMol) L-Valinmethylester (L-Val-OMe) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 120 °C erwärmt und 2 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 20 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo- Met-Val wurden an einer Kieselgel-Säule mit n- Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert . 3- (R) - [2- (methylthio) ethyl] -6- (S) - (1- (methyl ) ethyl ) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Val) :
Figure imgf000044_0001
Auswaage: 380 mg (82% d. Th.) als weißer Feststoff. 1H-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio ) ethyl ] - 6- (5) - ( 1 -
(methyl ) ethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Val) (500 MHz, D6-DMSO) : δ = 0,85 (d, 3J = 7,0 Hz, 3H, CH (CH3) (CH3) ) ; 0,93 (d, 3J = 7,0 Hz, 3H, CH (CH3) (CH3) ) ; 1, 88-2, 00 (m, 2H, SCHCH2) ; 2,04 (s, 3H, SCH3) ; 2,10-2,18 (m, 1H, CH(CH3)2); 2, 42-2, 58 (m, 2H, SCH2) ; 3, 58-3, 62 (m, 1H, CH) ; 3,94-4,00 (m, 1H, CH) ; 8.11 (bs, 1H, NH) ; 8.13 (bs, 1H, NH)
13C-NMR von 3- (R) - [2- (methylthio ) ethyl ] - 6- (5) - ( 1 - (methyl ) ethyl ) -2 , 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Val) (125.8 MHz, D6-DMSO) : δ = 14,42; 16,98; 18,32; 28,36; 31,71;
31,94; 52,40; 59,72; 167,53; 167,78
Beispiel 10:
Synthese der cyclischen cyclo-Met-Ile Dipeptide aus DL- Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und L- Isoleucinmethylester (L-Ile-OMe) und Isolation eines Dias- tereomers 3- [2- (methylthio) ethyl] -6- (1- (methyl) propyl) -2,5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Ile)
Figure imgf000045_0001
4,08 g (25 mMol) DL-Methioninmethylester (DL-Met-OMe) und 3, 63 g (25 mMol) L-Isoleucinmethylester (L-Ile-OMe) wurden unter gutem Rühren im Wasserstrahlvakuum auf 120 °C erwärmt und 2 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen wurde der Feststoffbrei mit 20 mL Methanol versetzt, kurz aufgerührt, abgesaugt, mit etwas Methanol gewaschen und an der Ölpumpe getrocknet. Die Diastereomere von cyclo- Met-Ile wurden an einer Kieselgel-Säule mit n-
Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:1 (v/v/v) getrennt. Eine isolierte Fraktion daraus wurde exemplarisch charakterisiert .
3- [2- (methylthio) ethyl] -6- (1- (methyl) propyl) -2, 5- piperazindion (cyclo-D-Met-L-Ile) :
Figure imgf000045_0002
H-NMR von 3- [ 2 - (methylthio ) ethyl ]- 6- ( 1 - (methyl ) propyl ) - 2, 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Ile) (500 MHz, D6-DMSO) : δ = 0,85 (t, 3J = 7,4 Hz, 3H, CH2CH3) ; 0,90 (d, 3J = 7,4 Hz, 3H, CHCH3) ; 1,10-1,50 (m, 2H, SCH2CH2) ; 1, 80-1, 90 (m, 1H, CH) ; 1, 90-2, 00 (m, 2H, CH2) ; 2,04 (s, 3H, SCH3) ; 2,42-2,58 (m, 2H, SCH2) ; 3, 64-3, 68 (m, 1H, CH) ; 3, 94-3, 98 (m, 1H, CH) ; 8.08-8,16 (m, 2H, 2 x NH)
13C-NMR von 3- [ 2- (methylthio) ethyl ]- 6- ( 1- (methyl ) propyl ) - 2, 5-piperazindion (cyclo-D-Met-L-Ile) (125.8 MHz, D6- DMSO+HC1) : δ = 12,02; 14,85; 15,27; 24,61; 28,74; 32,15; 39, 90; 52, 92; 59, 34; 167, 90; 168,10
Beispiel 11:
In vitro Verdauungsversuche von 3,6-Bis[2- (methylthio) ethyl] -2 , 5-piperazindion (DD/LL-cyclo-Met-Met) mit Verdauungsenzymen aus Omnivoren Spiegelkarpfen a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Spiegelkarpfen
(Cyprinus carpio morpha noblis)
Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von EID und MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111- 119) durchgeführt. Dazu wurde der Darm von sechs einjähri¬ gen Spiegelkarpfen {Cyprinus carpio morpha noblis) freige¬ legt, mit Wasser gespült, längs aufgeschnitten und jeweils die Darmschleimhaut abgekratzt. Diese wurde zusammen mit zerstoßenem Eis mit einem Mixgerät zerkleinert. Die resul¬ tierende Suspension wurde mit einem Ultraschallstab behan¬ delt, um noch intakte Zellen aufzuschließen. Zur Abtrennung der Zellbestandteile und Fett wurde die Suspension 30 Minu¬ ten lang bei 4°C zentrifugiert , das Homogenat abdekantiert und mit einer Spur Thimerosal sterilisiert. Aus 6 Spiegel¬ karpfen wurden 49 ml Enzymlösung der Darmschleimhaut gewonnen. Die Lösung wurde bei 4°C dunkel gelagert. b) Durchführung der in vitro Verdauungsuntersuchungen
DD/LL-cyclo-Met-Met wurde in TRIS/HCl-Pufferlösung aufge¬ nommen und mit der Enzymlösung versetzt. Als Vergleich und zur Abschätzung der rein chemischen Spaltungsgeschwindig- keit wurde jeweils ein Blindwert ohne Enzymlösung angesetzt (siehe Tabelle 1) . Von Zeit zu Zeit wurde eine Probe ent¬ nommen und deren Zusammensetzung mit Hilfe eines kalibrierten HPLCs detektiert und quantifiziert. Der Umsatz wurde als Quotient des Gehaltes von Methionin bzw. Methionyl- methionin (Met-Met) und und des Gehaltes von DD/LL-cyclo- Met-Met bestimmt (siehe Abb. 4) . In der Blindprobe fand praktisch keine Umsetzung von DD/LL-cyclo-Met-Met zum Di- peptid DD/LL-Met-Met bzw. DL-Methionin statt.
Tabelle 1: Spaltung von DD/LL-cyclo-Met-Met
Probe Blindwert
Vorlage Substrat 0,15 mmo1 0,15 mmo1
(DD/LL-cyclo- Met-Met)
TRIS/HCl- 90,9 ml 95, 0 ml Pufferlösung,
pH 9, 5
Gallenflüssigkeit 5,00 ml 5,00 ml
Reaktionsstart Enzymlösung 4, 1 ml
( 50%
Karpfenlsg . )
Reaktion 37 °C 37 °C
Reaktionsabbr . 1,0 ml Reaktionslösung wurde in 5,0 ml einer 1:1 (v/v) Mischung aus 10%iger H3PO4-
Lösung und Acetonitril aufgenommen, 20 Min gerührt und über einen 20ym Spritzenfilter filtriert . Der Versuch aus Beispiel 11 b) wurde analog mit den cycli- schen Dipeptiden cyclo-L-His-L-His und cyclo-D-Met-L-Leu durchgeführt (siehe Abbildung 5 und 6) .
Beispiel 12:
In vitro Verdauungsversuche von DD/LL/meso-cyclo-Met-Met mit Verdauungsenzymen aus karnivoren Regenbogenforellen a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von EID und MATTY (Aquaculture 1989, 79, 111- 119) durchgeführt. Dazu wurde der Darm von fünf einjährigen Regenbogenforellen {Oncorhynchus mykiss) freigelegt und wie in Beispiel 11 beschrieben aufgearbeitet. Aus 5 Regenbogen- forellen wurden 56 ml Enzymlösung der Darmschleimhaut gewonnen. Die Lösung wurde bei 4°C dunkel gelagert. b) Durchführung der in vitro Verdauungsuntersuchungen
Die in vitro Untersuchungen wurden analog zu Beispiel 11 durchgeführt. Der Umsatz wurde als Quotient des Gehaltes von Methionin bzw. Methionylmethionin (Met-Met) und und des Gehaltes von cyclo-Met-Met bestimmt (siehe Abb. 3) . In der Blindprobe fand praktisch keine Umsetzung von ΌΌ/ /meso- cyclo-Met-Met zum Dipeptid DD/LL/meso-Met-Met bzw. DL- Methionin statt. Tabelle 2: Spaltung von DD/LL/meso-cyclo-Met-Met
Probe Blindwert
Vorlage Substrat 0,10 mmo1 0,10 mmo1
(DD/LL/meso- cyclo-Met-Met)
TRIS/HC1- 5,0 mL 10,3 ml
Pufferlösung,
pH 9, 5
Gallenflüssigkeit 1,0 mL 0, 0 ml
Leberhomogenat 1 , 5 mL 0, 0 ml
Reaktionsstart Enzymlösung 2, 8 ml
( 25% Forel- lelsg . )
Reaktion 37 °C 37 °C
Reaktionsabbr . 1,0 ml Reaktionslösung wurde in 5,0 ml einer 1:1 (v/v) Mischung aus 10%iger H3PO4-
Lösung und Acetonitril aufgenommen, 20 Min gerührt und über einen 20ym Spritzenfilter filtriert .
Der Versuch aus Beispiel 12 b) wurde analog mit den cycli- schen Dipeptiden cyclo-D-Met-L-Phe und cyclo-D-Met-L-Lys durchgeführt (siehe Abbildung 7 und 8) .
Beispiel 13:
In vitro Verdauungsversuche von cyclo-D-Met-L-Thr mit Verdauungsenzymen aus Omnivoren Shrimps a) Isolierung der Verdauungsenzyme aus Whiteleg Shrimps
(Litopenaeus Vannamei)
Die Isolierung der Verdauungsenzyme wurde in Anlehnung an die Methode von Ezquerra und Garcia-Carreno (J. Food Bio- chem. 1999, 23, 59-74) durchgeführt. Dazu wurde das Hepato- pankreas aus 2,1 Kilogramm (57 Tiere) Whiteleg Shrimps (Li- topenaeus Vannamei) entfernt und zusammen mit zerstoßenem Eis mit einem Mixer zerkleinert. Die weitere Aufarbeitung wurde analog Beispiel 11 durchgeführt. Aus 57 Whiteleg Shrimps wurden 74 ml Enzymlösung der Darmschleimhaut gewon- nen. Die Lösung wurde bei 4°C dunkel gelagert. b) Durchführung der in vitro Verdauungsuntersuchungen
Die in vitro Untersuchungen wurden analog zu Beispiel 11 durchgeführt. Der Umsatz wurde als Quotient des Gehaltes von Methionin bzw. D-Met-L-Thr und und des Gehaltes von cyclo-D-Met-L-Thr bestimmt (siehe Abb. 9) . In der Blindpro¬ be fand praktisch keine Umsetzung von cyclo-D-Met-L-Thr zum Dipeptid D-Met-L-Thr bzw. zu den freien Aminosäuren statt.
Tabelle 3: Spaltung von cyclo-D-Met-L-Thr
Probe Blindwert
Vorlage Substrat 0,15 mmo1 0,15 mmo1
(cyclo-D-Met-L- Thr)
TRIS/HC1- 8, 5 ml 14,0 ml Pufferlösung,
pH 9, 5
Reaktionsstart Enzymlösung 6,5 ml
(= 5 Shrimps)
Reaktion 37 °C 37 °C
Reaktionsabbr . 0,2 ml Reaktionslösung wurde in 9,8 ml
10%iger HsPC^-Lösung aufgenommen.

Claims

Patentansprüche
1. Futtermitteladditiv enthaltend mindestens ein Diketo- piperazin mit der folgenden allgemeinen Formel IV oder ein Salz davon:
Figure imgf000051_0001
wobei R und R unabhängig voneinander einen Aminosäurerest R darstellen (vorzugsweise in der L-Konfiguration) ausgewählt aus der Gruppe Methionin (R = - (CH2) 2SCH3) , Lysin (R = -(CH2)4NH2), Threonin (R = -CH (OH) (CH3) ) , Tryptophan (R = - indolyl), Histidin (R = -imidazoyl) , Valin (R = -CH(CH3)2), Leucin (R = -CH2CH ( (CH3) 2) , Isoleucin (R = -CH (CH3) CH2CH3) , Phenylalanin (R = -CH2Ph) , Arginin (R = - (CH2) 3NHC (=NH) CH2) , Cystein (R = -CH2SH) , wobei gegebenenfalls R1 gleich R2 sein kann; oder enthaltend mindestens eine Verbindung mit der folge den allgemeinen Formel V oder ein Salz davon, wobei R1 ui R2 wie oben definiert sind
Figure imgf000051_0002
2. Das Futtermitteladditiv nach Anspruch 1, wobei R oder R2 ein Methionyl-Rest (R = -(CH2)2SCH3) ist, in der DD-, LL, LD- oder DL-Konfiguration .
3. Das Futtermitteladditiv nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Diketopiperazin als cyclo-D-EAA-D-EAA, cyclo-L-EAA-D- EAA, cyclo-D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-L-EAA oder Mischungen davon, insbesondere als Diastereomerengemisch cyclo-DL-EAA- DL-EAA, vorliegt, wobei EAA eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Methionin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Histi- din, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein und Cystin bezeichnet.
4. Das Futtermitteladditiv nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R1 oder R2 jeweils einen Methionyl-Rest (R = -
( CH2 ) 2 S CH3 ) darstellen, und wobei das Diketopiperazin in der DD-, LL-, DL- oder LD-Konfiguration oder in Mischungen davon vorliegt; mit der Voraussetzung, dass wenn R1 und R2 gleich - ( CH2 ) 2 S CH3 sind, das Diketopiperazin mit der LL- Konfiguration nur in Mischung mit anderen Konfigurationen vorliegt .
5. Das Futtermitteladditiv nach Anspruch 4, wobei das Diketopiperazin als Diastereomerengemisch DD/LL/meso-cyclo- Met-Met vorliegt (d.h. als Mischung von DD/LL-cyclo-Met-Met und meso-cyclo-Met-Met ) , wobei Met Methionin bezeichnet.
6. Futtermittelmischung enthaltend ein Futtermitteladdi¬ tiv gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
7. Futtermittelmischung nach Anspruch 6, enthaltend zusätzlich in Mischung eine oder mehrere der folgenden Sub- stanzen: DL-Methionin, L-EAA, DL-EAA, DD/LL/DL/LD-
Methionyl-EAA, DD/LL/DL/LD-EAA-Methionin, DD/LL-Methionyl- EAA, DD/LL-EAA-Methionin, D-Methionyl-L-EAA, L-Methionyl-L- EAA, D-Methionyl-D-EAA, L-Methionyl-D-EAA, D-EAA-L- Methionin, L-EAA-L-Methionin, D-EAA-D-Methionin, L-EAA-D- Methionin, bevorzugt jeweils zusätzlich in Mischung mit DL- Methionin, vorzugsweise mit einem DL-Methioninanteil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevorzugt von 0,1 bis 50 Gew.-%, beson¬ ders bevorzugt von 1 bis 30 Gew.-%, bevorzugt jeweils zu¬ sätzlich in Mischung mit einer L-EAA wie beispielsweise L- Lysin, vorzugsweise mit einem L-EAA Anteil von 0,01 bis 90 Gew.-%, bevorzugt von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevor¬ zugt von 1 bis 30 Gew.-%.
8. Diketopiperazin oder ein Salz davon, mit der folgenden allgemeinen Formel IV:
Figure imgf000053_0001
wobei R und R unabhängig voneinander einen Aminosäurerest darstellen ausgewählt aus der Gruppe Methionin (R1 2 = - (CH2)2SCH3), Lysin (R1/2 = -(CH2)4NH2), Threonin (R1/2 = - CH (OH) (CH3) ) , Tryptophan (R1/2 = -indolyl), Histidin (R1/2 = -imidazoyl), Valin (R1/2 = -CH(CH3)2), Leucin (R1/2 = - CH2CH ( (CH3) 2) , Isoleucin (R1/2 = -CH (CH3) CH2CH3) , Phenylalanin (R1/2 = -CH2Ph) , Arginin (R1/2 = - (CH2) 3NHC (=NH) CH2) , Cystein (R1 2 = -CH2SH) , wobei gegebenenfalls R1 gleich R2 sein kann; mit der Voraussetzung dass wenn R1 und R2 gleich -(CH2)2SCH3 sind, dann das Diketopiperazin nicht ausschließlich als cyclo-L-Met-L-Met vorliegt; oder eine Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel V oder ein Salz davon, wobei R1 und R2 wie oben definiert sind
Figure imgf000054_0001
9. Das Diketopiperazin nach Anspruch 8, wobei das Diketo- piperazin als cyclo-D-EAA-D-EAA, cyclo-L-EAA-D-EAA, cyclo- D-EAA-L-EAA, cyclo-L-EAA-L-EAA oder Mischungen davon, ins- besondere als Diastereomerengemisch cyclo-DL-EAA-DL-EAA, vorliegt, wobei EAA eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Methionin, Lysin, Threonin, Tryptophan, Histidin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Arginin, Cystein und Cystin bezeichnet.
10. Das Diketopiperazin nach Anspruch 8 oder 9, wobei R und R2 jeweils einen Methionyl-Rest (R = -(CH2)2SCH3) dar¬ stellen, und wobei das Diketopiperazin in der DD-, LL-, DL- oder LD-Konfiguration oder in Mischungen davon vorliegt; mit der Voraussetzung, dass das Diketopiperazin mit der LL- Konfiguration nur in Mischung mit anderen Konfigurationen vorliegt .
11. Das Diketopiperazin nach Anspruch 10, wobei das Diketopiperazin in einer Mischung als DD/LL/meso-cyclo-Met-Met , vorzugsweise in einer 50 : 50-Mischung aus DD/LL-cyclo-Met- Met und meso-cyclo-Met-Met , vorliegt.
12. Verwendung der Diketopiperazine gemäß Anspruch 8 als Futtermitteladditiv für Wiederkäuer, Süß- oder Salzwasserfische und Krustentiere.
13. Verfahren zur Herstellung eines Diketopiperazins mit der folgenden allgemeinen Formel IV oder ein Salz davon:
Figure imgf000055_0001
oder eine Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel V oder ein Salz davon,
Figure imgf000055_0002
aus einem oder mehreren Aminosäureestern der folgenden allgemeinen Formel III:
Figure imgf000055_0003
wobei R und R unabhängig voneinander wie folgt definiert sind :
Formel IV und V:
Rl 2 = 2- (methylthio) ethyl) - (Methionin)
Rl 2 = 1-Methylethyl- (Valin)
Rl 2 = 2-Methylpropyl- (Leucin)
Rl 2 = (15) -1-Methylpropyl- ( Isoleucin)
Rl/2 = (1R) -1-Hydroxyethyl- (Threonin)
Rl/2 = 4-Aminobutyl- (Lysin) Rl/2 = 3- [ (Aminoiminomethyl ) -amino ] propyl- (Arginin)
Rl/2 = Benzyl- ( Phenylalanin)
Rl/2 = (lfi-Imidazol-4-yl) methyl- (Histidin)
Rl/2 = (lH-Indol-3-yl) methyl- (Tryptophan)
Rl/2 = Mercaptomethyl- (Cystein)
Formel III:
R1/2 = -CH2-S-S-CH2-CH (NH2) COOR' (Cystin) wobei gegebenenfalls R gleich R sein kann;
und wobei R lineare oder verzweigte aliphatische Reste o- der aromatische Reste definiert und verschiedene R' in ver¬ schiedenen Aminosäureestermolekülen vorkommen können;
wobei die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopipera- zin in Substanz erfolgt.
14. Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Aminosäureester der allgemeinen Formel III durch Veresterung einer Aminosäure mit der allgemeinen Formel I R1 2-CH (NH2) -COOH oder Cystin mit einer Verbindung mit der allgemeinen Formel II R'-OH, gewonnen wird.
15. Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Veresterung in Anwesenheit einer starken Säure durchgeführt wird, vor¬ zugsweise HCl oder H2SO4.
16. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wo¬ bei R' ausgewählt ist aus der Gruppe Methyl-, Ethyl-, n- Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl, iso-Butyl, sek.-Butyl, Ben- zyl- .
17. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin bei einer Temperatur von 30 bis 220°C, bevorzugt bei einer Temperatur von 50 bis 170°C und besonders bevorzugt bei ei¬ ner Temperatur von 70 bis 140°C durchgeführt wird.
18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin durch destillatives Abtrennen der Verbindung mit der allgemeinen Formel II R'-OH durchgeführt wird.
19. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, wo¬ bei die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin ohne Verwendung von Lösungsmitteln, erfolgt, insbesondere ohne organische, polare oder wässrige Lösungsmittel.
20. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, wo- bei die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin ohne Verwendung von Transamidierungskatalysatoren erfolgt.
21. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, wobei die Umsetzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin mit einer Reinheit von > 50 Gew.-%, bevorzugt > 90% Gew.-%, besonders bevorzugt von > 95 Gew.-% und ganz besonders be¬ vorzugt von > 98 Gew.-% erfolgt.
22. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21, wobei der bei der Reaktion nicht vollständig umgesetzte Ami¬ nosäureester rückgewonnen und erneut dem Prozess zugeführt werden kann.
23. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 22, wobei die bei der Veresterung der Aminosäure zum Aminosäure¬ ester nicht vollständig umgesetzte und/oder die bei der Um¬ setzung des Aminosäureesters zum Diketopiperazin wieder er- haltene Verbindung mit der allgemeinen Formel R'-OH rückgewonnen und erneut dem Prozess zugeführt werden kann.
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