WO2010031888A1 - Método para la detección simultanea de histoplasma capsulatum y paracoccidioides brasiliensis - Google Patents
Método para la detección simultanea de histoplasma capsulatum y paracoccidioides brasiliensis Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a method of simultaneous detection of Histoplasma capsulatum and Paracoccidioides brasiliensis DNA by means of the real-time quantitative multiplex PCR technique, based on specific probes labeled with two different fluorophores.
- This technique is applicable in both biological samples and microbiological cultures and environmental samples.
- another aspect of the invention is that a kit has been developed that allows the detection of the two microorganisms simultaneously.
- Histoplasma capsulatum and Paracoccidioides brasiliensis are the causes of the diseases known as histoplasmosis and paracoccidioidomycosis.
- These diseases are primary mycoses of frequent occurrence in certain geographical areas especially in tropical and subtropical areas of temperate and humid climate. In these endemic areas, the appearance of AIDS has aggravated the problem of primary mycoses until it becomes one of the most frequent pathologies.
- the prevalence of these diseases is increasing in Spain due to infections imported in travelers or emigrants from endemic areas, especially the population from Latin America. According to the National Statistics Institute (www.ine.es), 35% of the emigrant population residing in Spain comes from endemic areas and, in addition, one million Vietnamese Vietnamese Congressrds travel to these countries every year.
- histoplasmosis is one of the infections more frequent opportunists in patients with AIDS. Therefore, histoplasmosis should be included in the differential diagnosis of South American patients with AIDS, with signs of systemic infection and involvement of the mononuclear-phagocytic system. In the case of the histoplasmosis of the traveler or the tourist, the disease manifests itself as a respiratory infection that can vary in terms of its symptoms, from a catarrhal picture to a serious infection that endangers the life of the patient.
- paracoccidioidomycosis With respect to paracoccidioidomycosis, it is the most frequent systemic mycosis in Tropical America and, although in Europe it is rare, several cases have been described in recent years associated with population from endemic regions. Generally these patients present the chronic form of the disease that can be unifocal affecting the lung or multifocal represented by a series of cutaneous or mucous lesions and with lung involvement. It is also frequent that several years have elapsed since the disease is acquired until the symptoms develop. Paracoccidioidomycosis should also be included in the differential diagnosis in patients from Latin America with a respiratory infection, whether or not skin lesions appear.
- the method described in the present invention provides a tool that solves some of the problems presented by other methods, since the time taken by conventional diagnostic methods is significantly reduced (it is reduced from 1-2 weeks to 1-2 days ) and serves to simultaneously detect both Histoplasma capsulatum and Paracoccidioides brasiliensis microorganisms. Likewise, the rapidity in the detection will allow the start of the treatment of histoplasmosis and / or the paracoccidioidomycosis to be advanced, improving the prognosis of the patients and will allow monitoring the response to the treatment.
- Molecular beacons are probes that have a fork or loop shape, incorporating an emitting fluorophore and a quencher, which inhibits the emission of fluorescence while the probe does not hybridize.
- a rigid double helix is formed, so that the probe loses its hairpin shape, separating the emitter from the quencher, which originates the detectable fluorescence.
- the molecular beacons consist of 10-30 base pairs, allow the detection of changes of a single base and are probes specially indicated for use in multiplex PCR assays since they can be labeled with different fluorophores and have thermodynamic properties that favor a high specificity .
- the method described in the present invention has a series of advantages over conventional techniques: 1. Reliability and simplicity to identify Histoplasma and
- the PCR techniques have a specificity of 100%, since they do not amplify DNA from other fungal species.
- the PCR technique applied to biological samples can be performed in facilities with conventional biosafety levels (level 2).
- a first aspect of the present invention is a method for the simultaneous detection of Histoplasma capsulatum and Paracoccidioides brasiliensis comprising:
- step (a) obtains a sample and isolate its DNA
- step (a) amplifying a fragment of the ITS region of the ribosomal DNA of Histoplasma capsulatum and / or Paracoccidioides brasiliensis contained in the DNA isolated in step (a)
- step (b) determines the deviation of step (b) with respect to controls.
- controls may be positive controls and / or negative controls
- step (c) analyze the deviation of step (c) and attribute it to the presence of said microorganisms.
- the isolation of the DNA sample is carried out by known methods that allow obtaining the total DNA of the sample.
- the sample contains Histoplasma capsulatum and / or Paracoccidioides brasiliensis, its DNA will be extracted and fragments of interest from the region STIs will be amplified as a result of the high specificity of the method.
- ITS Internal Transcribed Spacer
- negative control refers to the sample from people not infected with Histoplasma capsulatum and / or with Paracoccidioides brasiliensis, as well as internal controls without DNA that are used in PCR reactions to rule out contamination in the manipulation of samples.
- positive control refers to samples that contain DNA from the microorganisms mentioned in complete safety.
- a preferred embodiment of the method described above is that in which, in order to carry out the amplification, the DNA concentration is at least 10 fg / ⁇ l since this is an amount that represents the detection limit of Histoplasma DNA fragments capsulatum and Paracoccidioides brasiliensis.
- the sample can be chosen from a biological sample, a microbiological culture or an environmental sample.
- biological sample refers to an isolated sample of materials of biological origin that can be both of human origin as animal or vegetable
- the main application of this method is directed to samples of human origin but the method of the present invention can be applied to detect these microorganisms causing histoplasmosis and paracoccidioidomycosis in other living beings that can behave as vehicles of transmission of the microorganisms mentioned.
- the biological sample can be selected from the list comprising respiratory sample, bone marrow aspirates, cerebrospinal fluid, tissue biopsy, urine or blood fluid. It is understood by blood fluid; blood, serum or plasma.
- microbiological culture refers to any type of microorganism culture carried out in both liquid, solid and medium growth media that allow the growth of microorganisms.
- environment sample refers to any other type of sample from any medium capable of containing Histoplasma capsulatum and Paracoccidioides brasiliensis. That is, the latter type of samples refers to samples that may come from soil, water, air or any other inorganic matter.
- the biological sample is related to the respiratory system.
- a “sample related to the respiratory system” means a sample of biological origin from any tissue of the respiratory system or fluid secreted in said tissues. Therefore, samples related to the respiratory system are bronchial secretion, bronchoalveolar lavage, sputum or oropharyngeal exudate, without excluding any other type of sample that is framed in the definition of this paragraph.
- the amplification of the ITS2 region of the ribosomal DNA of Histoplasma capsulatum is performed by means of primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and the amplification of the ITS1 region of the ribosomal DNA of Paracoccidioides brasiliensis is performed by means of primers SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
- the amplification is performed by means of real-time multiplex PCR characterized in that specific probes labeled with two different fluorophores are used.
- the specific probes consist of a linear and single-stranded DNA sequence, partially complementary to any part of the sequence of the amplified fragment corresponding to the STIs of Histoplasma capsulatum and Paracoccidioides brasiliensis.
- PCR Polymerase Chain Reaction
- the amount of copies obtained after the amplification of the fragments is proportional to the initial amount thereof, that is, to the amount of microorganisms present in the samples (more specifically, to the amount of DNA extracted and the quality thereof).
- PCR is called multiplex when more than one pair of primers are used to simultaneously amplify several DNA fragments in a single amplification reaction.
- both the design of the primers and the probes must be specific enough to avoid cross reactions that lead to nonspecific amplifications that could invalidate the method.
- a combination of primers and probes that are very effective in amplifying the fragments is used.
- a primer or "primer” is a short oligonucleotide that can be synthesized in vitro for use in various molecular techniques. They are designed as complementary sequences of a region of target DNA to be detected. To obtain a fragment, two primers are necessary, one of them will be attached to the template strand (direct primer) and the other to the complementary strand (reverse primer), in a position that allows obtaining, through successive amplifications with a DNA polymerase enzyme heat resistant, a fragment that can be detected and / or quantified.
- the variables to be taken into account in the design of the primers are fundamentally: Oligonucleotide size, melting temperature (Tm), specificity with the DNA of the ITS regions of Histoplasma capsulatum ribosomal DNAs and Paracoccidioides brasiliensis that are intended to be amplified, sequences complementary, content in G / C and fragments of pyrimidines (T, C) or purines (A, G), 3 'terminal sequence and 5' terminal sequence and central regions.
- nucleotides triphosphate dNTPs that is, dATP, dTTP, dCTP and dGTP, thermo-resistant DNA polymerase, magnesium chloride in a given concentration, as well as buffers that maintain adequate physical-chemical conditions for the synthesis of DNA is necessary. the operation of all the components and thus the amplification is achieved.
- the quantitative PCR technique or also known as real-time PCR allows the amplification of the fragments of interest to be quantified in real time.
- the method described in this invention uses two probes labeled with a different fluorophore that specifically binds to the amplified DNA fragments, so that each of the probes hybridizes with the corresponding DNA fragment, present in the amplified sequences of the STIs.
- Each of the probes is labeled with a different fluorophore, in this way the amplification of each fragment is detected and quantified simultaneously by fluorescence emission.
- thermocycler To detect the fluorescence from each of the amplifications, all of them subject to the same amplification conditions, the thermocycler has a detector that measures the fluorescence in real time over the duration of the amplification cycles. In order to know the concentration of DNA that is obtained as a product, it is necessary to use patterns of known concentration that allow monitoring the operation of the technique.
- a more preferred embodiment of the method is that in which the probes used are: to.
- SEQ ID NO: 3 the first seven nucleotides are complementary to the last seven for the amplified fragment of Histoplasma capsulatum and labeled at the 5 ' end with a fluorophore and at the 3 ' end with a quencher and b.
- SEQ ID NO: 6 the first six nucleotides are complementary to the last six for the amplified fragment of Paracoccidioides brasiliensis and is labeled at the 5 ' end with a fluorophore other than that used in section (a) and at the 3 ' end With a quencher
- the probes used in this embodiment are of the molecular type beacon. These probes form a fork due to the presence of 6-7 nucleotides complementary to each other at both ends of the sequence, whose secondary structure maintains the next fluorophore and quencher, so that any photon emitted by the reporter is absorbed by the quencher.
- the rest of the sequence, formed by 19 nucleotides, located between the complementary ends, is in turn complementary to a part of the sequence of the amplified fragments.
- quencher refers to a deactivator or quencher of the fluorescence, that is, a molecule capable of absorbing the photons emitted by the fluorophore and dissipating the energy in the form of heat, so that fluorescence emission does not occur.
- the fluorophore of section (a) is FAM (5 or 6-carboxyfluorescein)
- the fluorophore of section (b) is HEX (5 1 -hexachloro-fluorescein phosphoramidite)
- the quencher is BHQ1.
- Another aspect of the present invention is the method described in the preceding paragraphs as a tool for monitoring the response to a treatment of histoplasmosis and / or paracoccidioidomycosis where serial samples are taken from patients who have received a treatment. The analysis of the ascent or descent of the quantification of the fungal DNA will allow to assess whether the response to the treatment is negative or positive, respectively.
- the monitoring procedure comprises a series of steps that begin by taking serial samples.
- Serial sampling is understood as the extraction of any type of biological samples, including those mentioned in this invention.
- the sampling is carried out at different times since the treatment is administered, so that the quantification of the amplification of the fragments of the STIs of the respective microorganisms in each of the samples from the same patient, will indicate the efficacy of the same .
- a decrease in the deviation of the amplification values with respect to a control the latter represented, for example, by amplification values in the same individual, prior to the treatment, would suppose that the treatment is having an effect in the sense of decreasing the level of microorganisms that cause histoplasmosis and paracoccidioidomycosis diseases. This example would not be limited solely to the use of this type of control.
- kits comprising pairs of primers capable of amplifying, simultaneously and in a single reaction, by means of the PCR technique, a fragment of the ITS region of the ribosomal DNA of Histoplasma capsulatum and / or Paracoccidioides brasiliensis
- the kit may include reagents for the amplification of a fragment of the ITS region of the ribosomal DNA of Histoplasma capsulatum and Paracoccidioides brasiliensis.
- the reagents included in this kit may be other primers specific to the ITS nucleotide region, specific probes labeled with two different fluorophores as well as with a quencher, as described herein.
- the kit can also include positive and negative controls.
- Positive and negative controls are understood as components of the kit that allow checking the efficacy of the reagents supplied therein.
- the nature of the controls depends on the nature of the reagents, therefore, a positive control can be, for example, a genetic construct that includes the sequences of the fragments of the STIs under study in the present invention, which can be amplified by the primer pairs described above and, the negative control may be a construct that lacks the STI fragments present in the positive control.
- Other positive and negative controls can be included in this kit to evaluate its operation.
- the kit comprises primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 to amplify a fragment of the ITS2 region of Histoplasma capsulatum ribosomal DNA and primers SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 for amplify a fragment of the ITS1 region of the ribosomal DNA of Paracoccidioides brasiliensis, by PCR.
- the amplification is carried out by means of real-time multiplex PCR and probes labeled with two different fluorophores are used.
- the sequences of the probes are SEQ ID NO: 3 for the amplified fragment of Histoplasma capsulatum and SEQ ID NO: 6 for the amplified fragment of Paracoccidioides brasiliensis. The probes are marked at the 5 ' end with a different fluorophore in each case and at the 3 ' end with the BHQ1 quencher
- the kit is used to:
- FIG 1. Shows the ITS2 region of Histoplasma capsulatum ribosomal DNA. In the figure the internal position of the ITS2 of Histoplasma capsulatum is observed. Primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 amplify a fragment located in ITS2, between the sequences encoding ribosomal RNA 5.8S and 28S.
- FIG 2. Shows the region of ITS1 of the ribosomal DNA of
- Initiators and probes of the Molecular Beacon type were designed specifically for H. capsulatum and P. brasiliensis directed to ribosomal DNA, specifically to the ITS2 region (Internal Transcriber Spacer 2) in the case of H. capsulatum and to the ITSl region in the case of P. brasMensis.
- the sequences of the ITS regions (Internal Transcriber Spacers) of the ribosomal DNA of 20 strains of H. capsulatum and of a strain of P. brasiliensis available in the Mycology Service were analyzed as well as 14 clinical strains of P. brasiliensis from the Evandro Chagas Clinical Research Institute.
- the design of the initiators and the probes was carried out with the help of the Beacon Desing 5.0 probe design program (Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA) -
- the direct initiator was SEQ ID NO: 1 and the reverse was SEQ ID NO: 2.
- the Beacon Molecular probe defined by the sequence SEQ ID NO: 3, it was marked at the 5 'end with the FAM fluorophore and at the 3' end with the quencher or BHQ1 quencher.
- the direct initiator was SEQ ID NO: 4 and the reverse was SEQ ID NO: 5.
- the probe, defined by the sequence SEQ ID NO: 6 was labeled at the 5 'end with the fluorophore HEX and at the 3 'end with the BHQ1 quencher.
- Table 1 shows the excitation and emission spectra of the two fluorochromes used for the probing of the probes.
- each PCR assay was determined separately and a study was also carried out to know the specificity of the sequences chosen for the primers and the probes.
- twelve strains belonging to fungal species that cause infections similar to histoplasmosis and paracoccidioidomycosis and fungal species that frequently cause infections were used. These species were Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis (it was included in the case of the real-time PCR for the detection of H. capsulatum), Histoplasma capsulatum (it was included in the case of the real-time PCR of the detection of P.
- Blastomyces dermatitidis Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum, Scedosporium prolificans, Scedosporium apiospermum and Candida albicans.
- human and mouse genomic DNA Promega, Madrid, Spain were included in the experiments.
- the multiplex PCR was optimized in real time so that there was no decrease in sensitivity with respect to the
- the real-time PCR reactions contained a final volume of 20 ⁇ L, with 4.5 mM of CbMg, 0.5 ⁇ M of each initiator and 0.2 ⁇ M of the SEQ ID NO: 3 probe and 0.6 ⁇ M of SEQ probe ID NO: 6, in addition, 2 ⁇ l of DNA was added to the PCR mixture.
- a preincubation was carried out at 95 0 C followed by 50 cycles of denaturation (25s at 95 0 C), banding (3Os at 53 0 C), and extension (5s at 72 0 C) .
- the protocol included a cycle to know the melting temperature of the double DNA chain of the amplified product (melting curve). This cycle was carried out in the temperature range of 30 to 8O 0 C. This cycle is always carried out in real-time (or quantitative) PCR, since it helps to identify the amplified product, since the melting temperature is specific for each sequence.
- PCR reactions were performed in the LC480 ⁇ Roche Applied Science, Madrid, Spain) and negative controls were included in each experiment.
- the regression lines were made between the logarithms of the DNA concentrations and the cycle of the PCR reaction in which the fluorescence began to be detected ⁇ crossing point, Ct). Fluorescence was measured in the corresponding channels in each case. Reproducibility was obtained by calculating the coefficients of variation of the Ci for each of the DNA concentrations used.
- the regression lines constructed between the known concentrations of DNA and the Ci had a coefficient of determination (r 2 ) of 0.99 (P ⁇ 0.01). The reproducibility of the trial was very high, the average of the coefficients of variation being around 3% for H. capsulatum and in the case of P. brasiliensis, it was around 4%.
- the sensitivity was also high, with the detection limit between 10 fg and 1 fg per ⁇ L of the sample analyzed, although in the case of the detection of P. brasiliensis at the lowest concentrations (1fg per ⁇ L) the reproducibility is lost, the limit being reproducible of 10 fg per ⁇ L.
- DNA extraction from biological samples was performed by usual procedures and also using the QiampDNA Mini Kit (Qiagen, Izasa, Madrid, Spain). 2 ⁇ l of the DNA extracted from each sample was used for each real-time PCR reaction. The only exception was the serum samples in which it was verified that the use of 4 ⁇ l improved the sensitivity of the assay.
- the PCR technique was positive in 14 of the 18 patients with histoplasmosis and in the two patients with paracoccidioidomycosis, which represents a total of 80% of all patients.
- 21 sera were analyzed (from some patients serial samples of serum were received), 11 samples related to the respiratory system, 3 bone marrow aspirates, 3 plasma samples, 2 blood samples, two biopsies and a urine sample .
- the PCR technique showed 91% sensitivity in samples related to the respiratory system, since it detected DNA of this species in 10 of the 11 samples analyzed (bronchoalveolar lavages, bronchial secretions, sputum and oropharyngeal exudate).
- the technique was positive in two of the three bone marrow samples (66%) and in two of the three plasma samples (66%) and in 100% of the biopsies. It was negative for the urine sample and for the three blood samples, probably due to the inhibition of the PCR by the components of said samples. Regarding the sera, it was positive in 9 of the 21 sera (42.8%). Positive results were never obtained in the sera of patients with paracoccidioidomycosis but it is an expected result since the amount of DNA in these samples is very small. In total, the technique was positive in 25 of the analyzed samples (57%).
- the table summarizes the results of the analyzed samples, together with the serological determinations and the culture results, in the samples that were received.
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Abstract
La presente invención se refiere a un método de detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis mediante la técnica de PCR multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes. Esta técnica es aplicable tanto en muestras biológicas como en cultivos microbiológicos y muestras ambientales. Además, otro aspecto de Ia invención es un kit que permite detectar los dos microorganismos de forma simultánea.
Description
MÉTODO PARA LA DETECCIÓN SIMULTANEA DE HISTOPLASMA CAPSULATUM Y PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS
La presente invención se refiere a un método de detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis mediante Ia técnica de PCR multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes. Esta técnica es aplicable tanto en muestras biológicas como en cultivos microbiológicos y muestras ambientales. Además, otro aspecto de Ia invención es que se ha desarrollado un kit que permite detectar los dos microorganismos de forma simultánea.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los microorganismos Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis son los causantes de las enfermedades conocidas como histoplasmosis y paracoccidioidomicosis. Estas enfermedades son micosis primarias de aparición frecuente en determinadas zonas geográficas especialmente en áreas tropicales y subtropicales de clima templado y húmedo. En estas zonas endémicas, Ia aparición del SIDA ha agravado el problema de las micosis primarias hasta convertirlo en una de las patologías más frecuentes. La prevalencia de estas enfermedades está aumentando en España debido a infecciones importadas en viajeros o emigrantes procedentes de zonas endémicas, especialmente de Ia población procedente de Latinoamérica. Según el Instituto Nacional de Estadística (www.ine.es ), un 35% de Ia población emigrante que reside en España procede de zonas endémicas y, además, un millón de españoles viaja cada año a estos países.
En zonas endémicas, Ia histoplasmosis es una de las infecciones
oportunistas más frecuentes en pacientes con SIDA. Por tanto, Ia histoplasmosis debe ser incluida en el diagnóstico diferencial de pacientes sudamericanos con SIDA, con signos de infección sistémica y afectación del sistema mononuclear-fagocítico. En el caso de Ia histoplasmosis del viajero o del turista, Ia enfermedad se manifiesta como una infección respiratoria que puede variar en cuanto a su sintomatología, desde un cuadro catarral a una infección grave que pone en peligro Ia vida del enfermo.
Respecto a Ia paracoccidioidomicosis, es Ia micosis sistémica más frecuente de América Tropical y, aunque en Europa es poco frecuente, se han descrito varios casos en los últimos años asociados a población procedente de regiones endémicas. Generalmente estos pacientes presentan Ia forma crónica de Ia enfermedad que puede ser unifocal afectando al pulmón o multifocal representada por una serie de lesiones cutáneas o mucosas y con afectación del pulmón. Es frecuente, además, que hayan transcurrido varios años desde que se adquiere Ia enfermedad hasta que se desarrollan los síntomas. La paracoccidioidomicosis también debe ser incluida en el diagnóstico diferencial en pacientes procedentes de Latinoamérica con una infección respiratoria, aparezcan o no lesiones cutáneas.
El diagnóstico de ambas micosis es complicado por Io que, hasta Ia fecha, el diagnostico de certeza se ha basado en el cultivo del microorganismo y posterior identificación mediante técnicas microscópicas o de detección de exoantígenos. No obstante, el cultivo puede tardar 1 ó 2 semanas en ser positivo y Ia identificación puede resultar compleja en centros sin experiencia. La visión de estructuras fúngicas puede ayudar a iniciar el tratamiento, pero no confirma el diagnóstico. Las pruebas serológicas también pueden ayudar al diagnóstico, pero tienen una especificidad
limitada en zonas endémicas y una sensibilidad baja en enfermos inmunodeprimidos. Por otra parte, en el caso de Ia histoplasmosis, existe una técnica de detección de antígeno en orina, que tiene una gran fiabilidad, incluso en enfermos inmunodeprimidos. Pero, hasta Ia fecha, esta técnica no se ha comercializado y sólo está disponible en centros de referencia de los EE.UU.
Ante esta situación, el Servicio de Micología del Centro Nacional de Microbiología ha desarrollado el procedimiento descrito en esta invención para detectar simultáneamente ambos patógenos fúngicos ya que Ia clínica es similar en ambos y Ia población susceptible de ser afectada por dichos patógenos es Ia misma.
El método descrito en Ia presente invención provee de una herramienta que soluciona algunos de los problemas presentados por otros métodos, ya que se reduce de manera significativa el tiempo empleado por los métodos diagnósticos convencionales (se reduce de 1-2 semanas a 1-2 días) y sirve para detectar simultáneamente ambos microorganismos Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis. Asimismo, Ia rapidez en Ia detección permitirá adelantar el inicio del tratamiento de Ia histoplasmosis y/o de Ia paracoccidioidomicosis, mejorando el pronóstico de los enfermos y permitirá realizar el seguimiento de Ia respuesta al tratamiento.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
En Ia presente invención se describe un método de detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis mediante Ia técnica de PCR multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas del tipo molecular beacon (faro molecular) marcadas con dos fluoróforos diferentes.
Los molecular beacons son sondas que tienen una forma de horquilla o de bucle, incorporando un fluoróforo emisor y un quencher, que inhibe Ia emisión de fluorescencia mientras que Ia sonda no hibride. Cuando Ia sonda se une al ADN, se forma una doble hélice rígida, por Io que Ia sonda pierde su forma de horquilla, separándose el emisor del quencher, Io que origina Ia fluorescencia detectable. Los moleculars beacons constan de 10- 30 pares de bases, permiten Ia detección de cambios de una sola base y son sondas especialmente indicadas para usar en ensayos de PCR multiplex ya que pueden marcarse con diferentes fluoróforos y poseen unas propiedades termodinámicas que favorecen una alta especificidad.
El método descrito en Ia presente invención presenta una serie de ventajas respecto de las técnicas convencionales: 1. Fiabilidad y sencillez para identificar Histoplasma y
Paracoccidioides en cultivo.
2. En muestras biológicas, Ia técnica muestra una sensibilidad superior a Ia de las pruebas serológicas.
3. En Io que se refiere a muestras relacionadas con el aparato respiratorio, tiene una sensibilidad comparable a Ia de Ia identificación por cultivo.
4. Las técnicas de PCR tienen una especificidad del 100%, ya que no amplifican ADN de otras especies fúngicas.
5. Su utilización en muestras biológicas permite reducir el tiempo de diagnóstico de los 10-14 días en Ia identificación por cultivo, a 24-
48 horas
6. La técnica de PCR aplicada a muestras biológicas puede realizarse en instalaciones con niveles de bioseguridad convencionales (nivel 2).
En cuanto a las características innovadoras, pueden destacarse:
1. La posibilidad de detectar simultáneamente ambos patógenos.
2. Su elevada especificidad, que evita pasos secundarios como Ia secuenciación del producto o Ia visualización de bandas de ADN marcadas. 3. La reducción significativa del tiempo empleado en Ia detección de de ambos patógenos.
En este sentido, un primer aspecto de Ia presente invención es un método para Ia detección simultánea de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis que comprende:
a. obtener una muestra y aislar su ADN, b. amplificar un fragmento de Ia región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis contenido en el ADN aislado en el paso (a), c. determinar Ia desviación del paso (b) con respecto a los controles. Estos controles pueden ser controles positivos y/o controles negativos, d. analizar Ia desviación del paso (c) y atribuir Ia misma a Ia presencia de los citados microorganismos.
Por el término "detección simultánea" se entiende Ia capacidad de este método de detectar a Ia vez Ia presencia de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis en una muestra y con una única reacción de PCR en tiempo real.
El aislamiento de Ia muestra de ADN se realiza mediante métodos conocidos que permiten obtener el ADN total de Ia muestra. De este modo, si Ia muestra contiene Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis, su ADN será extraído y los fragmentos de interés de Ia región
ITS serán amplificados como consecuencia de Ia alta especificidad del método.
Las regiones conocidas como ITS (Internal Transcríbed Spacer) son secuencias de ADN ribosómico no funcional situadas entre secuencias que codifican para las subunidades de ARN ribosómico 18S y 5.8S (ITS1 ) y entre las subunidades 5.8S y 28S (ITS2). Los ITS presentan un alto grado de variación entre especies cercanas filogenéticamente, Io que permite usarlos de manera específica para determinar Ia especie así como variaciones dentro de ésta.
El término "control negativo" hace referencia a Ia muestra procedente de personas no infectadas con Histoplasma capsulatum y/o con Paracoccidioides brasiliensis, así como a los controles internos sin ADN que se utilizan en las reacciones de PCR para descartar contaminaciones en Ia manipulación de las muestras. El término "control positivo" hace referencia a muestras que contienen ADN de los microorganismos citados con total seguridad.
Una realización preferida del método descrito anteriormente es aquella en Ia que, para llevar a cabo Ia amplificación, Ia concentración de ADN es de al menos 10 fg/μl ya que ésta es cantidad que representa el límite de detección de los fragmentos de ADN de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis.
En otra realización preferida del método, Ia muestra puede escogerse de entre una muestra biológica, un cultivo microbiológico o una muestra ambiental.
El término "muestra biológica" hace referencia a una muestra aislada de materiales de origen biológico que pueden ser tanto de origen humano
como animal o vegetal. La principal aplicación de este método va dirigida a muestras de origen humano pero el método de Ia presente invención puede aplicarse para detectar estos microorganismos causantes de histoplasmosis y paracoccidioidomicosis en otros seres vivos que puedan comportarse como vehículos de transmisión de los microorganismos citados. La muestra biológica puede seleccionarse de Ia lista que comprende muestra respiratoria, aspirados de médula ósea, líquido cefalorraquídeo, biopsia tisular, orina o fluido sanguíneo. Se entiende por fluido sanguíneo; sangre, suero o plasma.
La muestra denominada como "cultivo microbiológico" se refiere a cualquier tipo de cultivo de microorganismos realizado en medios de crecimiento tanto líquidos, sólidos como aquellos que permitan el crecimiento de los microorganismos.
El término "muestra ambiental" hace referencia a cualquier otro tipo de muestra procedente de cualquier medio susceptible de poder contener Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis. Es decir, este último tipo de muestras se refieren a muestras que pueden proceder de suelo, agua, aire o cualquier otra materia inorgánica.
En otra realización más preferida, Ia muestra biológica está relacionada con el aparato respiratorio. Una "muestra relacionada con el aparato respiratorio" se entiende una muestra de origen biológico procedente de cualquier tejido del aparato respiratorio o fluido secretado en los citados tejidos. Por tanto, son muestras relacionadas con el aparato respiratorio Ia secreción bronquial, el lavado broncoalveolar, el esputo o el exudado orofaríngeo, sin excluir cualquier otro tipo de muestra que se enmarque en Ia definición de este párrafo.
En otra realización preferida, Ia amplificación de Ia región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum se realiza por medio de los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y Ia amplificación de Ia región ITS1 del ADN ribosómico de Paracoccidioides brasiliensis se realiza por medio de los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
En otra realización preferida, Ia amplificación se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real caracterizada porque se emplean sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes.
Las sondas específicas consisten en una secuencia de ADN lineal y de cadena sencilla, complementario, parcialmente, de cualquier parte de Ia secuencia del fragmento amplificado correspondiente a los ITS de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis.
La técnica de amplificación de ADN conocida como PCR (Polymerase Chain Reaction) se basa en Ia repetición de un ciclo formado por tres etapas:
Desnaturalización del ADN de doble cadena que se consigue con temperaturas altas (940C en Ia mayor parte de los casos), hibridación de los cebadores a Ia zona 3' específica de cada una de las hebras (Ia temperatura es específica para cada par de cebadores) y extensión del cebador por actuación de Ia ADN polimerasa (el tiempo necesario para Ia extensión depende de Ia longitud del fragmento).
La cantidad de copias obtenidas tras Ia amplificación de los fragmentos es proporcional a Ia cantidad inicial de los mismos, es decir, a Ia cantidad de microorganismos presentes en las muestras (más concretamente, a Ia cantidad de ADN extraído y Ia calidad del mismo).
La PCR se denomina multiplex cuando se utilizan más de un par de cebadores para amplificar de forma simultánea varios fragmentos de ADN en una sola reacción de amplificación. Para poder llevar a cabo estas amplificaciones, tanto el diseño de los cebadores como de las sondas debe ser Io suficientemente específico para evitar reacciones cruzadas que den lugar a amplificaciones inespecíficas que pudieran invalidar el método. En esta invención se utiliza una combinación de cebadores y sondas que se muestran muy eficaces en Ia amplificación de los fragmentos.
Un cebador o "primer" es un oligonucleótido corto que se puede sintetizar in vitro para ser utilizado en diversas técnicas moleculares. Se diseñan como secuencias complementarias de una región de ADN diana que se desea detectar. Para obtener un fragmento, son necesarios dos cebadores, uno de ellos se unirá a Ia hebra molde (cebador directo) y el otro a Ia hebra complementaria (cebador reverso), en una posición que permita obtener, mediante sucesivas amplificaciones con una enzima ADN polimerasa termorresistente, un fragmento que pueda ser detectado y/o cuantificado.
Para el diseño de cebadores es necesario hacer una serie de predicciones, como Ia temperatura de fusión (Tm) o Ia posibilidad de formación de horquillas que puedan reducir, por competencia, Ia efectividad de Ia hibridación con Ia secuencia de ADN diana. Las variables a tener en cuenta en el diseño de los cebadores son fundamentalmente: Tamaño del oligonucleótido, temperatura de fusión (Tm), especificidad con el ADN de las regiones ITS de los ADN ribosómicos de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis que se pretenden amplificar, secuencias complementarias, contenido en G/C y fragmentos de
pirimidinas (T, C) o purinas (A, G), secuencia 3' terminal y secuencia 5' terminal y regiones centrales.
Además, para Ia síntesis del ADN es necesaria Ia presencia de nucleótidos trifosfato dNTPs, es decir, dATP, dTTP, dCTP y dGTP, ADN polimerasa termoresistente, cloruro de magnesio en una concentración determinada así como tampones que mantengan las condiciones físico-químicas adecuadas para el funcionamiento de todos los componentes y se consiga con ello Ia amplificación.
La técnica de Ia PCR cuantitativa o también conocida como PCR en tiempo real permite cuantificar en tiempo real Ia amplificación de los fragmentos de interés. El método descrito en esta invención utiliza dos sondas marcadas con un fluoróforo distinto que se une de manera específica a los fragmentos de ADN amplificados, de modo que, cada una de las sondas hibridan con el fragmento de ADN correspondiente, presente en las secuencias amplificadas de los ITS. Cada una de las sondas está marcada con un fluoróforo distinto, de este modo se detecta y cuantifica de forma simultánea, por emisión de fluorescencia, Ia amplificación de cada uno de los fragmentos. Para detectar Ia fluorescencia procedente de cada una de las amplificaciones, sometidas todas ellas a las mismas condiciones de amplificación, el termociclador tiene acoplado un detector que mide Ia fluorescencia en tiempo real a Io largo del tiempo de duración de los ciclos de amplificación. Para poder conocer Ia concentración de ADN que se obtiene como producto, es necesario usar patrones de concentración conocida que permitan realizar un seguimiento del funcionamiento de Ia técnica.
Así pues, una realización más preferida del método es aquella en Ia que las sondas empleadas son:
a. SEQ ID NO: 3 (los siete primeros nucleótidos son complementarios a los siete últimos) para el fragmento amplificado de Histoplasma capsulatum y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo y en el extremo 3' con un quencher y b. SEQ ID NO: 6 (los seis primeros nucleótidos son complementarios a los seis últimos) para el fragmento amplificado de Paracoccidioides brasiliensis y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo distinto del usado en el apartado (a) y en el extremo 3' con un quencher.
Las sondas empleadas en esta realización son del tipo molecular beacon. Estas sondas forman una horquilla debido a Ia presencia de 6-7 nucleótidos complementarios entre sí en ambos extremos de Ia secuencia, cuya estructura secundaria mantiene el fluoróforo y el quencher próximos, de forma que cualquier fotón emitido por el repórter es absorbido por el quencher. El resto de Ia secuencia, formada por 19 nucleótidos, situada entre los extremos complementarios, es complementaria a su vez a una parte de Ia secuencia de los fragmentos amplificados. Cuando Ia sonda híbrida con el ADN amplificado, se abre y esto aleja al fluoróforo del quencher, permitiendo que se emita fluorescencia que puede ser detectada y cuantificada.
El término "quencher" hace referencia a un desactivador o apagador de Ia fluorescencia, es decir, una molécula capaz de absorber los fotones emitidos por el fluoróforo y disipar Ia energía en forma de calor, por Io que no se produce emisión de fluorescencia.
En una realización aún más preferida, el fluoróforo del apartado (a) es FAM (5 ó 6-carboxifluoresceina), el fluoróforo del apartado (b) es HEX (51- hexachloro-fluoresceina fosforamidita) y el quencher es BHQ1.
Otro aspecto de Ia presente invención es el método descrito en los párrafos precedentes como herramienta para Ia monitorización de Ia respuesta a un tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis donde se realizan tomas de muestras seriales de pacientes que han recibido un tratamiento. El análisis del ascenso o del descenso de Ia cuantificación del ADN fúngico permitirá evaluar si Ia respuesta al tratamiento es negativa o positiva, respectivamente.
El procedimiento de monitorización comprende una serie de pasos que comienzan por Ia toma de muestras seriales. Se entiende por toma de muestras seriales a Ia extracción de cualquier tipo de muestras biológicas, incluidas las mencionadas en esta invención. La toma de muestras se realiza a diferentes tiempos desde que se administra el tratamiento, de forma que Ia cuantificación de Ia amplificación de los fragmentos de los ITS de los respectivos microorganismos en cada una de las muestras procedentes del mismo paciente, indicarán Ia eficacia del mismo. Así pues, una disminución de Ia desviación de los valores de amplificación respecto de un control, representado éste último, por ejemplo, por valores de amplificación en un mismo individuo, previos al tratamiento, supondría que el tratamiento está surtiendo efecto en el sentido de disminuir el nivel de microorganismos causantes de las enfermedades histoplasmosis y paracoccidioidomicosis. Este ejemplo no se limitaría únicamente al uso de este tipo de control.
Otro aspecto de Ia presente invención es un kit que comprende pares de cebadores capaces de amplificar, de forma simultánea y en una sola reacción, mediante Ia técnica de Ia PCR, un fragmento de Ia región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis.
El kit puede incluir reactivos para Ia amplificación de un fragmento de Ia región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis. Los reactivos incluidos en este kit pueden ser otros cebadores específicos de Ia región nucleotídica ITS, sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes así como con un quencher, tal como se ha descrito en esta memoria.
El kit también puede incluir controles positivos y negativos. Por controles positivos y negativos se entienden componentes del kit que permitan comprobar Ia eficacia de los reactivos suministrados en el mismo. La naturaleza de los controles depende de Ia propia naturaleza de los reactivos, así pues, un control positivo puede ser, por ejemplo, una construcción genética que incluya las secuencias de los fragmentos de los ITS objeto de estudio en Ia presente invención, que pueden ser amplificadas por los pares de cebadores descritos anteriormente y, el control negativo puede ser una construcción que carece de los fragmentos de ITS presentes en el control positivo. Otros controles positivos y negativos pueden ser incluidos este kit para evaluar el funcionamiento del mismo.
En una realización preferida, el kit comprende los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para amplificar un fragmento de Ia región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 para amplificar un fragmento de Ia región ITS1 del ADN ribosómico de Paracoccidioides brasiliensis, mediante PCR.
En otra realización preferida del kit, Ia amplificación se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real y se emplean sondas marcadas con dos fluoróforos diferentes.
En una realización más preferida del kit, las secuencias de las sondas son SEQ ID NO: 3 para el fragmento amplificado de Histoplasma capsulatum y SEQ ID NO: 6 para el fragmento amplificado de Paracoccidioides brasiliensis. Las sondas se marcan en el extremo 5' con un fluoróforo diferente en cada caso y en el extremo 3' con el quencher BHQ1
En diversas realizaciones preferidas, el kit se emplea para:
- el diagnóstico de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis en una muestra biológica, ambiental o en un cultivo microbiológico.
- Ia monitorización de Ia respuesta a un tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG 1. Muestra Ia región del ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum.
En Ia figura se observa Ia posición interna del ITS2 de Histoplasma capsulatum. Los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 amplifican un fragmento situado en el ITS2, entre las secuencias que codifican para el ARN ribosómico 5.8S y 28S.
FIG 2. Muestra Ia región del ITS1 del ADN ribosómico de
Paracoccidioides brasiliensis.
En Ia figura se observa Ia posición interna del ITS1 de Paracoccidioides brasiliensis. Los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 amplifican un fragmento situado en el ITS2, entre las secuencias que codifican para el ARN ribosómico 18S y 5.8S.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Diseño de Ia técnica de PCR en tiempo real.
Se diseñaron iniciadores y sondas del tipo Molecular Beacon específicos para H. capsulatum y P. brasiliensis dirigidos al ADN ribosómico, en concreto a Ia región ITS2 (Internal Transcriber Spacer 2) en el caso de H. capsulatum y a Ia región ITSl en el caso de P. brasMensis. Para el diseño de los iniciadores y de las sondas se analizaron las secuencias de Ia regiones ITS {Internal Transcriber Spacers) del ADN ribosómico de 20 cepas de H. capsulatum y de una cepa de P. brasiliensis disponible en el Servicio de Micología así como 14 cepas clínicas de P. brasiliensis procedentes del Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. El diseño de los iniciadores y de las sondas se realizó con Ia ayuda del programa de diseño de sondas Beacon Desing 5.0 (Premier Biosoft, Palo
Alto, CA, EE.UU.)- En el caso de H. capsulatum, el iniciador directo fue SEQ ID NO: 1 y el reverso fue SEQ ID NO: 2. La sonda Molecular Beacon, definida por Ia secuencia SEQ ID NO: 3, se marcó en el extremo 5' con el fluoróforo FAM y en el extremo 3' con el quencher o apagador BHQ1. En el caso de P. brasiliensis, el iniciador directo fue SEQ ID NO: 4 y el reverso fue SEQ ID NO: 5. La sonda, definida por Ia secuencia SEQ ID NO: 6, se marcó en el extremo 5' con el fluoróforo HEX y en el extremo 3' con el quencher BHQ1.
En Ia Tabla 1 aparecen los espectros de excitación y emisión de los dos fluorocromos empleados para el mareaje de las sondas.
Tabla 1 λ(nm) Fluorocromo
Excitación Emisión
FAM 483 533
HEX 523 568
Una vez diseñados los iniciadores y las sondas, se realizó una búsqueda de tipo BLAST en Ia base de datos GenBank (http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/) para estar seguros de que no presentaban homología con otros microorganismos. Adicionalmente, se comprobó Ia especificidad de las sondas y de los iniciadores diseñados mediante análisis filogenéticos de sus secuencias. Para estos análisis se utilizó Ia base de datos de secuencias del Servicio de Micología, que dispone de 3600 cepas pertenecientes a 300 especies fúngicas y el programa informático Fingerprínting Il informatix, versión 3.0 (BIORAD, Madrid, España).
En una primera etapa de puesta a punto de Ia técnica se optimizó por separado Ia detección de ADN de H. capsulatum y P. brasiliensis. Se determinó Ia sensibilidad y reproducibilidad de cada ensayo de PCR por separado y también se realizó un estudio para conocer Ia especificidad de las secuencias elegidas para los iniciadores y las sondas. En este estudio de especificidad se utilizaron doce cepas pertenecientes a especies fúngicas que causan infecciones parecidas a Ia histoplasmosis y paracoccidioidomicosis y especies fúngicas que originan infecciones con frecuencia. Estas especies eran Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis (se incluyó en el caso de Ia PCR en tiempo real de detección de H. capsulatum), Histoplasma capsulatum (se incluyó en el caso de Ia PCRen tiempo real de Ia detección de P. brasiliensis) Blastomyces dermatitidis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Fusarium oxysporum, Scedosporium prolificans, Scedosporium apiospermum y Candida albicans. Además se incluyeron en los experimentos ADN genómico humano y de ratón (Promega, Madrid, Spain).
En una segunda etapa se optimizó Ia PCR multiplex en tiempo real de modo que no se produjera una disminución de sensibilidad respecto a las
PCRs en tiempo real estandarizadas individualmente. Puesto que los fluorocromos estaban separados sólo 30 nm se realizó una compensación de color para evitar solapamiento en Ia detección de fluorescencia. Para realizar Ia compensación de color se hizo una lectura de fluorescencia en ambos canales empleando las sondas en una concentración 0,4 μM. Una vez estandarizadas las condiciones se aplicó dicha compensación de color a cada uno de los experimentos.
En Ia FIG 1 y FIG 2 se representan esquemáticamente las zonas de amplificación elegidas en cada caso.
EJEMPLO 2
Validación in vitro del método de detección.
Se emplearon las 20 cepas de H. capsulatum, las 15 cepas de P. brasiliensis y las 11 de otras especies descritas en el apartado anterior. La extracción de ácidos nucleicos se realizó siguiendo procedimientos habituales. En el caso de los patógenos primarios, Ia extracción se realizó en un laboratorio de bioseguridad para patógenos del grupo 3, cumpliendo las normas establecidas (Real Decreto 664/1997).
Las reacciones de PCR en tiempo real contenían un volumen final de 20 μL, con 4,5mM de CbMg, 0,5 μM de cada iniciador y 0,2 μM de Ia sonda SEQ ID NO: 3 y 0,6 μM de sonda SEQ ID NO: 6, además, se añadieron 2 μl de ADN a Ia mezcla de PCR. Respecto a las condiciones de Ia reacción de PCR, se realizó una preincubación a 950C seguida de 50 ciclos de desnaturalización (25s a 950C), anillamiento (3Os a 530C), y extensión (5s a 720C). Por último, el protocolo incluyó un ciclo para conocer Ia temperatura de fusión de Ia doble cadena de ADN del producto amplificado (curva de melting). Este ciclo se realizó en el intervalo de temperaturas de 30 a 8O0C. Este ciclo se realiza siempre en las PCR en tiempo real (o cuantitativas), pues ayuda a identificar el producto amplificado, ya que Ia temperatura de fusión es específica para cada secuencia.
Las reacciones de PCR se realizaron en el equipo LC480 {Roche Applied Science, Madrid, España) y en cada experimento se incluyeron controles negativos.
El estudio de reproducibilidad de Ia técnica, así como Ia cuantificación del ADN amplificado se realizaron mediante Ia construcción de rectas de regresión con los resultados de cinco repeticiones de diferentes diluciones de ADN (desde 10 ng a 1 fg DNA/μL) de H. capsulatum CNM-CM-2721 (Colección de hongos
filamentosos del Servicio de Micología del Centro Nacional de Microbiología), así como cinco repeticiones de diferentes diluciones de ADN de P. brasiliensis 20960 (Colección de hongos filamentosos del Servicio de Micología del Centro Nacional de Microbiología) (desde 10 ng a 1 fg DNA/μL). Las rectas de regresión se realizaron entre los logaritmos de las concentraciones de ADN y el ciclo de Ia reacción de PCR en el que se empezaba a detectar Ia fluorescencia {crossing point, Ct). La fluorescencia se midió en los canales correspondientes en cada caso. La reproducibilidad se obtuvo mediante el cálculo de los coeficientes de variación de los Ci para cada una de las concentraciones de ADN utilizadas. Las rectas de regresión construidas entre las concentraciones conocidas de ADN y los Ci tenían un coeficiente de determinación (r2) de 0,99 (P<0.01 ). La reproducibilidad del ensayo fue muy elevada siendo Ia media de los coeficientes de variación en torno al 3% para H. capsulatum y en el caso de P. brasiliensis, se situó en torno al 4%.
La sensibilidad fue también elevada, situándose el límite de detección entre 10 f g y 1 fg por μL de muestra analizada, aunque en el caso de Ia detección de P. brasiliensis en las concentraciones más bajas (1fg por μL) se pierde Ia reproducibilidad siendo el límite reproducible de 10 fg por μL.
La especificidad fue del 100%, ya que no se detectó en ninguna de las reacciones realizadas, ADN de las otras 11 especies incluidas en los estudios, ni ADN murino o humano.
EJEMPLO 3.
Validación del método para Ia identificación y confirmación de colonias en cultivo.
Se emplearon las 46 cepas enumeradas en las secciones precedentes. Se utilizaron las mismas técnicas de extracción y de amplificación. La sensibilidad fue del 100% y Ia especificidad del 100%. Todos estos experimentos se realizaron en las instalaciones con medidas de bioseguridad de nivel 3.
EJEMPLO 4
Validación de Ia técnica en muestras biológicas
Una vez que se estandarizó in vitro Ia técnica de PCR multiplex y que se comprobó su utilidad como método de identificación de colonias en cultivo, se procedió a realizar una adaptación de Ia misma, para utilizarla en muestras biológicas.
La extracción de ADN de las muestras biológicas se realizó mediante procedimientos habituales y también empleando el kit QiampDNA Mini Kit (Qiagen, Izasa, Madrid, España). Se emplearon 2 μl del ADN extraído de cada muestra para cada reacción de PCR en tiempo real. La única excepción fueron las muestras de suero en los que se verificó que el empleo de 4 μl mejoraba Ia sensibilidad del ensayo.
En el caso de muestras parafinadas se realizó un paso previo para desparafinar consistente en lavar con 1 ,2 mi de Xileno seguido de dos lavados con 1 ,2 mi de etanol (96-100%). Para validar Ia técnica de PCR en tiempo real en muestras biológicas, se emplearon 44 muestras procedentes de 20 pacientes, 18 de ellos con histoplasmosis probada y dos pacientes con paracoccidioidomicosis probada. La infección se había confirmado mediante técnicas de diagnóstico convencionales como el cultivo, el examen histológico o Ia serología positiva, más cuadro clínico y
antecedentes epidemiológicos compatibles. Debe destacarse que Ia técnica de PCR se aplicó a las muestras biológicas disponibles, que fueron enviadas desde 20 centros sanitarios diferentes, según sintomatología, disponibilidad y posibilidades de cada caso. La técnica de PCR fue positiva en 14 de los 18 enfermos con histoplasmosis y en los dos enfermos con paracoccidioidomicosis Io que representa en total el 80% de todos los pacientes. Por muestras, se analizaron 21 sueros (de algunos enfermos se recibieron muestras seriadas de suero), 11 muestras relacionadas con el aparato respiratorio, 3 aspirados de médula ósea, 3 muestras de plasma, 2 muestras de sangre, dos biopsias y una muestra de orina. La técnica de PCR mostró un 91 % de sensibilidad en muestras relacionadas con el aparato respiratorio, ya que detectó ADN de esta especie en 10 de las 11 muestras analizadas (lavados broncoalveolares, secreciones bronquiales, esputo y exudado orofaríngeo). En otros tipos de muestras biológicas, Ia técnica fue positiva en dos de las tres muestras de médula ósea (66%) y en dos de las tres muestras de plasma (66%) y en el 100% de las biopsias. Fue negativa para Ia muestra de orina y para las tres muestras de sangre, probablemente debido a Ia inhibición de Ia PCR por los componentes de dichas muestras. Respecto a los sueros, fue positiva en 9 de los 21 sueros (42,8%). Nunca se obtuvieron resultados positivos en los sueros de pacientes con paracoccidioidomicosis pero es un resultado esperable ya que Ia cantidad de ADN en dichas muestras es muy pequeña. En total, Ia técnica fue positiva en 25 de las muestras analizadas (57%).
En Ia tabla se resumen los resultados de las muestras analizadas, junto con las determinaciones serológicas y los resultados del cultivo, en las muestras que se recibieron.
Tabla 2. Resultados de Ia técnicas de PCR en tiempo real en 20 enfermos con histoplasmosis y dos enfermos con paracoccidioidomicosis.
NR: No realizado
La media de las concentraciones de DNA en muestras biológicas fue de
51 ,36 fg /μl en las muestras séricas y de 25,2 x103 fg /μl en el resto de muestras analizadas, Io que puede explicar Ia mejor sensibilidad de Ia
técnica en muestras no serológicas.
Asimismo se realizó un estudio de especificidad. Se analizaron 40 muestras de sueros de pacientes neutropénicos (con disminución de Ia concentración de neutrófilos en sangre), 10 de ellos con PCR positiva para
Aspergillus fumigatus y otros 30 con PCR negativa. Para todos ellos Ia técnica de PCR en tiempo real múltiple específica para H. capsulatum y P. brasiliensis fue negativa. Se analizaron también cinco sueros de pacientes sanos procedentes de zonas endémicas obteniéndose también resultados negativos.
Estos resultados indican que Ia técnica de PCR demostró una sensibilidad notable en todas las muestras analizadas, particularmente en las muestras relacionadas con el aparato respiratorio. Nunca se detectó reacción cruzada entre ambos patógenos, siendo Ia técnica negativa a histoplasma en los casos de paracoccidioidomicosis y a Ia inversa. Además, el resultado de Ia PCR se obtuvo 24-48 horas después de recibir Ia muestra en el Servicio de Micología, Io que muestra que es una técnica de diagnóstico rápido.
Paralelamente, se determinó Ia presencia de anticuerpos para H. capsulatum y P. brasiliensis en las muestras de suero y se realizó el cultivo de las muestras de sangre, muestras relacionadas con el aparato respiratorio, de médula ósea y de orina. Como puede verse en Ia tabla anterior, se cultivaron muestras, resultando positivas un total de 12 (52%). El cultivo fue positivo entre 10 y 14 días después de Ia siembra. También se determinaron los anticuerpos anti Histoplasma y Paracoccidioides mediante una técnica de inmunodifusión (ID Fungal Antibody System, Immuno-Mycologics, Leti Laboratorios, Madrid, España), siendo Ia técnica positiva en nueve sueros de los 21 recibidos (42%). La inmunodifusión fue
invariablemente negativa en Ia mayoría de las muestras procedentes de enfermos VIH+ o con otras inmunodepresiones.
Claims
1. Método para Ia detección simultánea de Histoplasma capsulatum y
Paracoccidioides brasiliensis que comprende:
a. obtener una muestra y aislar su ADN, b. amplificar un fragmento de Ia región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis contenido en el ADN aislado en el paso (a), c. determinar Ia desviación del paso (b) con respecto a los controles y d. analizar Ia desviación del paso (c) y atribuir Ia misma a Ia presencia de los citados microorganismos.
2. Método según Ia reivindicación 1 donde Ia concentración del ADN aislado para llevar a cabo Ia amplificación es de al menos 10 fg/μl.
3. Método según Ia reivindicación 1 donde Ia muestra es:
a. una muestra biológica, b. un cultivo microbiológico o c. una muestra ambiental.
4. Método según Ia reivindicación 3 donde Ia muestra biológica está relacionada con el aparato respiratorio.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde Ia amplificación de Ia región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum se realiza por medio de los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y Ia amplificación de Ia región ITS1 del ADN ribosómico de Paracoccidioides brasiliensis se realiza por medio de los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde Ia amplificación se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real caracterizada porque se emplean sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes.
7. Método según Ia reivindicación 6 donde las sondas son:
a. SEQ ID NO: 3 para el fragmento amplificado de Histoplasma capsulatum y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo y en el extremo 3' con un quenchery b. SEQ ID NO: 6 para el fragmento amplificado de
Paracoccidioides brasiliensis y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo distinto del usado en el apartado (a) y en el extremo 3' con un quencher.
8. Método según Ia reivindicación 7 donde el fluoróforo del apartado (a) es FAM, el fluoróforo del apartado (b) es HEX y el quencher es BHQ1.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para Ia monitorización de Ia respuesta a un tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.
10. Kit para Ia detección simultánea de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis que comprende pares de cebadores que pueden amplificar, mediante Ia técnica de Ia PCR, un fragmento de Ia región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis.
11. Kit según Ia reivindicación 10 que comprende los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para amplificar un fragmento de Ia región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 para amplificar un fragmento de Ia región ITS1 del ADN ribosómico de
Paracoccidioides brasiliensis.
12. Kit según Ia cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 donde Ia amplificación se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real y se emplean sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes.
13. Kit según Ia reivindicación 12 donde las sondas son:
a. SEQ ID NO: 3 para el fragmento amplificado de Histoplasma capsulatum y se marca en el extremo 5'con un fluoróforo y en el extremo 3' con un quenchery b. SEQ ID NO: 6 para el fragmento amplificado de
Paracoccidioides brasiliensis y se marca en el extremo 5'con un fluoróforo distinto del usado en el apartado (a) y en el extremo 3' con un quencher.
14. Kit según Ia reivindicación 13 donde el fluoróforo del apartado (a) es FAM, el fluoróforo del apartado (b) es HEX y el quencher es BHQ1.
15. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para el diagnóstico de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis en una muestra biológica, ambiental o en un cultivo microbiológico.
16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para Ia monitorización de Ia respuesta a un tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.
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