WO2010029610A1 - ハイブリッドアルファーグルコシドトランスポーター - Google Patents

ハイブリッドアルファーグルコシドトランスポーター Download PDF

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WO2010029610A1
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seq
polynucleotide
sequence
amino acid
yeast
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PCT/JP2008/066239
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治代 畠中
文彦 大村
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サントリーホールディングス株式会社
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    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
    • C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G2200/00—Special features
    • C12G2200/11—Use of genetically modified microorganisms in the preparation of wine

Definitions

  • the present invention relates to an alpha-glucoside transporter that can accelerate utilization of maltose and maltotriose contained in wort and the like.
  • malt fermented beverages such as beer, happoshu, and whiskey
  • maltose maltose
  • maltotriose main sugars contained in wort mashed malt and the like.
  • the ratio of these malt-derived sugars can be slightly changed by the mashing method, but if you do not add enzyme agents or saccharified starch, it will not change greatly, about 1: 5: 1
  • glucose is a monosaccharide and is first assimilated as the sugar most preferred by yeast.
  • Yeast has a number of genes that are repressed in the transcription process in the presence of glucose. This suppression control is called glucose repression.
  • Agt1p in yeast has a very high degradation rate in the presence of glucose, and thus it is considered that one problem is that it cannot function efficiently in culture at a high glucose concentration.
  • the present invention is capable of efficiently assimilating maltose and maltotriose to yeast even in the presence of high glucose in the medium if the degradation of the post-translational alpha-glucoside transporter Agt1p by glucose can be controlled. Therefore, an object is to produce an alpha-glucoside transporter Agt1p that is not easily inactivated or decomposed by glucose.
  • the present inventors have made a hybrid gene of AGT1, which is known to be susceptible to inactivation / degradation by glucose, and MAL21, which is less susceptible to inactivation / degradation by glucose obtained from nature. From the above, succeeded in producing a hybrid transporter that is less susceptible to inactivation / degradation by glucose, and that can incorporate maltotriose in the same manner as AGT1 for substrate specificity. completed.
  • the present invention relates to a gene encoding a glucose-induced inactivation / degradation resistance transporter, a transporter protein encoded by the gene, a transformed yeast in which the expression of the gene is regulated, and the expression of the gene is regulated.
  • the present invention relates to a method for producing alcoholic beverages by using yeast.
  • the present invention provides the following polynucleotide, a vector containing the polynucleotide, a transformed yeast introduced with the vector, a method for producing alcoholic beverages using the transformed yeast, and the like.
  • a 12-transmembrane domain code comprising a polynucleotide encoding a transporter protein having glucose-induced inactivation / degradation resistance and comprising the polynucleotide according to any one of the following (a) to (d):
  • a polynucleotide comprising a region and recombining a 5 ′ sequence and / or a 3 ′ sequence with a heterologous polynucleotide: (a) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 from 307 to 1659 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 from nucleotide 283 to 1641;
  • polynucleotide (2) The polynucleotide according to (1), wherein the heterologous polynucleotide sequence is a 5 ′ sequence and / or a 3 ′ sequence of the 12-transmembrane domain of SEQ ID NO: 1: The recombination position is within the predicted TMD1 coding region of the 12th transmembrane domain, and the recombination position with the 3 ′ sequence is 3 ′ from the predicted TMD12 coding region start position of the 12th transmembrane domain from the predicted TMD12 coding region end position.
  • the polynucleotide according to (1) which is in a region of 96 bases or less on the side and in a region having an identity of 80% or more in the corresponding amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4.
  • the recombination position with the 5 ′ side sequence is within the region from the 175th base of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5 to the 12th transmembrane domain predicted TMD1 coding region end position, and the 12th transmembrane
  • the polynucleotide according to (1), wherein the recombination position between the domain and the 3 ′ side sequence is within a region of 180 bases or less from the predicted TMD12 coding region start position to the 3 ′ side of the predicted TMD12 coding region end position.
  • the polynucleotide according to any one of (1) to (4) which comprises a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, 15, or 17.
  • the polynucleotide according to any one of (1) to (4) which comprises a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 16, or 18.
  • the polynucleotide according to any one of (1) to (6) which is DNA.
  • (10) A transformed yeast into which the vector according to (9) has been introduced.
  • (11) The yeast for brewing according to (10), wherein the ability to assimilate oligosaccharides is improved by introducing the vector according to (9).
  • (12) The yeast for brewing according to (11), wherein the ability to assimilate oligosaccharides is improved by increasing the expression level of the protein according to (8).
  • (13) A method for producing an alcoholic beverage using the yeast according to any one of (10) to (12).
  • (14) The method for producing an alcoholic beverage according to (13), wherein the alcoholic beverage to be brewed is a malt beverage.
  • (15) The method for producing an alcoholic beverage according to (13), wherein the alcoholic beverage to be brewed is wine.
  • the fermentation rate of koji containing oligosaccharides such as maltose and maltotriose can be increased.
  • the modified hybrid transporter gene can be introduced into any brewing yeast or laboratory yeast. In particular, it is more effective when a fermentation stock solution containing a lot of monosaccharides such as glucose and fructose contains oligosaccharides that can be incorporated by a modified transporter such as maltose, maltotriose, tulanose, and trehalose.
  • FIG. 5 is an alignment diagram of amino acid sequences of Mal21p and Agt1p.
  • FIG. 3 is an alignment diagram of amino acid sequences of Mal21p and Mtt1p. It is a figure which shows the difference in substrate specificity of Agt1p and Mal21p. It is a figure which shows the decomposition
  • the present inventors have succeeded in actually increasing the growth rate in a maltose medium by highly expressing a hybrid transporter that is not easily inactivated or decomposed by glucose produced in the present invention. In beer brewing, the rate of maltose utilization was increased.
  • the present invention has been completed based on these ideas and research results.
  • ⁇ -glucoside transporter used in the present specification is a protein related to membrane transport of ⁇ -glucoside.
  • ⁇ -glucoside transporter include maltose transporter, maltotriose transporter and the like. Is included.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding a transporter protein having glucose-induced inactivation / degradation resistance, wherein (a) the nucleotide sequence or sequence from 307 to 1659 of SEQ ID NO: 3 A polynucleotide comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence from 283 to 1641 at number 5; and (b) the amino acid sequence from 103 to 553 at SEQ ID NO: 4, or the amino acid sequence from 95 to 547 at SEQ ID NO: 6.
  • a polynucleotide comprising a 12-transmembrane domain coding region consisting of a polynucleotide encoding, and a 5 ′ and / or 3 ′ sequence recombined with a heterologous polynucleotide is provided.
  • the polynucleotide may be DNA or RNA.
  • the 12-transmembrane domain means a range from TMD1 to TMD12 which are 12 transmembrane domains, including individual transmembrane domains TMD1, TMD2,..., TMD12 and sequences intervening in each. Each number attached to TMD such as TMD1 and TMD12 indicates a transmembrane domain number counted from the N-terminal side of the amino acid sequence.
  • the 12-transmembrane domain coding region refers to a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence ranging from TMD1 to 12, and the TMD1 coding region refers to a nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence of TMD1.
  • the present invention relates to the sequence of the N-terminal side and / or C-terminal side of an alpha-glucoside transporter protein having a 12-transmembrane domain and the N-terminal side and / or C-terminal of another transporter protein having a 12-transmembrane domain.
  • the present invention relates to a transporter protein recombined with a sequence on the side or a polynucleotide encoding the same. Therefore, in the present specification, the “heterologous polynucleotide” refers to a polynucleotide encoding a transporter protein different from the transporter protein before recombination.
  • the alignment of the nucleotide sequence and / or amino acid sequence can be confirmed between the polynucleotide to be recombined and the heterologous polynucleotide, and the corresponding regions can be recombined. .
  • the 5 ′ side sequence and / or the 3 ′ side sequence refers to a sequence adjacent to a specific gene or DNA sequence, that is, a sequence present on the 5 ′ side and / or 3 ′ side.
  • the 5'-side sequence of the 12th transmembrane domain coding region includes a sequence for initiating translation of a region encoding a protein having the 12th transmembrane domain in the central portion, and the 12th transmembrane domain coding region
  • the 3′-side sequence contains a sequence for terminating the translation of a region encoding a protein having a 12-transmembrane domain in the center.
  • the 5 ′ side sequence and the 3 ′ side sequence refer to a 5 ′ side sequence or a 3 ′ side sequence sandwiching the 12-transmembrane domain.
  • the recombination position on the 5 ′ side may be, for example, in a region in TMD1, or may be upstream on the 5 ′ side from the TMD1 start position.
  • a preferred polynucleotide of the present invention is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of 307 to 1659 of SEQ ID NO: 3, or the nucleotide sequence of 283 to 1641 of SEQ ID NO: 5, or the amino acids of 103 to 553 of SEQ ID NO: 4.
  • the 12th transmembrane domain coding region of SEQ ID NO: 1 is used as the 5 'and / or 3' side sequence of the 12th transmembrane domain coding region consisting of the sequence or the polynucleotide encoding the 95th to 547th amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • Examples include a polynucleotide encoding a transporter protein having resistance to glucose-induced inactivation / degradation, which is recombined with a 5 ′ side and / or 3 ′ side sequence of a domain coding region.
  • the polynucleotide targeted by the present invention is not limited to a polynucleotide encoding a protein having the above sequence, and includes other polynucleotides encoding a protein functionally equivalent to this protein.
  • the functionally equivalent protein include 1 to 10 (preferably 1) in the amino acid sequence from 103 to 553 in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence from 95 to 547 in SEQ ID NO: 6. ⁇ 9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1) amino acids are deleted or substituted,
  • Examples include transporter proteins that contain an inserted and / or added amino acid sequence and have glucose-induced inactivation / degradation resistance.
  • Such a protein examples include, for example, 1 to 10, 1 to 9, and 1 to 8 in the amino acid sequence at positions 103 to 553 in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence at positions 95 to 547 in SEQ ID NO: 6. 1 to 7, 1 to 6 (1 to several), 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 1 amino acid residue deleted, substituted, inserted And / or a transporter protein comprising an added amino acid sequence and having glucose-induced inactivation / degradation resistance.
  • the larger the homology value the better.
  • glucose-induced inactivation / degradation resistance can be evaluated, for example, as follows.
  • the strain expressing each transporter protein is maltose or other minimal medium containing 0-2 mM 2-deoxyglucose (Yeast Nitrogen Base w / o amino acids 6.7 g / L, maltose 20 g / L, etc.) (However, auxotrophic transformants contain their nutrients.)
  • fully synthetic medium SCM
  • maltose containing 0-2 mM 2-deoxyglucose Yeast Nitrogen Base w / o amino acids 6.7 g / L, maltose 20 g / L, adenine sulfate 20 mg / ml, uracil 20 mg / ml, L-tryptophan 20 mg / ml, L-histidine hydrochloride 20 mg / ml, L-argin
  • this strain is inoculated into YPD (yeast extract 10 g / L, polypeptone 20 g / L, glucose 20 g / L) and shake-cultured at 30 ° C. overnight.
  • 60 OD660unit cells measured and incubated at 30 ° C in advance (Yeast Nitrogen Base w / o amino acids and ammonia 1.6 g / L, glucose 20 g / L, cycloheximide 25 ⁇ g / L) Suspend in 30 ml and incubate at 30 ° C. Sample the cell suspension for 5 ml at the appropriate time (0, 10, 20, 30 and 40 minutes or 0, 30, 60, 90 and 120 minutes), centrifuge immediately, discard the supernatant, and dry the cells with ethanol dry ice. to freeze. The transporter protein is detected from the frozen cells according to a conventional method, the intensity of the protein band is measured, and the half-life is obtained from the decrease rate.
  • a transporter protein preferable in the present invention has, for example, a half-life of 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, or 8 times or more as compared with Agt1p.
  • the amino acid sequence from 103 to 553 in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence from 95 to 547 in SEQ ID NO: 6 is a portion predicted as a 12-fold transmembrane domain of Agt1p or Mtt1p in yeast.
  • the transmembrane domains of these proteins are either Toppred2 (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html), the Topology prediction program of Swiss University Theoretical Chemistry Protein Prediction Servers, or the Transmembrane regions detection program of EMBnet. TMPRED: Transmembrane regions detection (EMBnet http://www.ch.embnet.org/index.html) can be used for prediction (access date: August 29, 2008).
  • the predicted transmembrane domain of Mal61p is described in Cheng, Q., and Michels, CA (1989) Genetics 123 (3), 477-484.
  • Toppred2 http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html
  • Topology prediction program of Sweden University Theoretical Chemistry Protein Prediction Servers is used for the following predictions TMD1-12. did.
  • FIGS. 3 and 4 show the alignment of the amino acid sequences of Mal21p and Agt1p and the alignment of the amino acid sequences of Mal21p and Mtt1p, respectively. Each figure shows information such as identical amino acids (light gray) and homologous amino acids (dark gray), non-homologous amino acids, gaps (-) and the like.
  • the recombination position of the 3′-side 12-transmembrane domain coding region and the 5′-side sequence is within the predicted TMD1 coding region, and the 12-times transmembrane domain coding region and the 3′-side sequence are combined.
  • the replacement position is within the region within 96 bases from the predicted TMD12 coding region start position to the predicted TMD12 coding region end position, and the identity in the corresponding amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 is 80% or more
  • a polynucleotide encoding a transporter protein having resistance to glucose-induced inactivation / degradation is provided.
  • amino acids in the 95th to 115th amino acids in Mal21p (SEQ ID NO: 2) and amino acids in the 103rd to 123rd regions in Agt1p (SEQ ID NO: 4) are shown as predicted positions. .
  • the predicted TMD1 position in FIG. 3 indicates the predicted position of Agt1p.
  • the base sequence encoding each of the 283 to 345th regions in MAL21 (SEQ ID NO: 1), AGT1 (SEQ ID NO: 3) 307 to 369th area.
  • each predicted TMD12 coding region is the 1576th to 1638th region in MAL21 (SEQ ID NO: 1), AGT1 (SEQ ID NO: 3). It is the 1597th to 1659th region.
  • the “region within 96 bases from the predicted TMD12 coding region start position to the predicted TMD12 coding region end position” refers to a region within the 1576th to 1734th positions in MAL21 (SEQ ID NO: 1), AGT1 (SEQ ID NO: 3) refers to the region within the 1597th to 1755th region.
  • the “region within 96 bases from the predicted TMD12 coding region termination position” is preferably a region within 96 bases, more preferably within 81 bases, and even more preferably within 72 bases from the predicted TMD12 coding region termination position.
  • An example of the corresponding sequence position is shown in Table 1 below. However, depending on the aforementioned prediction program, these numbers can vary by several.
  • the present invention provides a recombination position of the 12th transmembrane domain coding region and the 5 ′ side sequence within the region from the 175th base of SEQ ID NO: 1 to the predicted TMD1 coding region termination position of the 12th transmembrane domain.
  • glucose-induced inactivation / degradation where the recombination position of the 12th transmembrane domain and the 3 'sequence is within the region from the predicted TMD12 coding region start position to the 180th base from the predicted TMD12 coding region end position
  • a polynucleotide encoding a transporter protein having resistance is provided.
  • the 95th to 115th amino acids are shown as predicted positions in Mal21p (SEQ ID NO: 2) and Mtt1p (SEQ ID NO: 6) (ie, there is no gap). Therefore, the base sequence corresponding to the “predicted TMD1 coding region” is the 283th to 345th region in MAL21 (SEQ ID NO: 1) and MTT1 (SEQ ID NO: 5). Therefore, the “region from the 175th base of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5 to the predicted TMD1 coding region end position” refers to the 175th to 345th positions of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5. Since the region from the 175th base to the predicted TMD1 coding region end position is identical in both amino acid sequences within this range, any position within this range can be selected as the recombination position (see FIG. 4). See
  • amino acids in the 526 to 546th region in Mal21p (SEQ ID NO: 2) and amino acids in the 527 to 547th region in Mtt1p (SEQ ID NO: 6) are indicated as predicted positions.
  • a region within 180 bases from the predicted TMD12 coding region start position to the predicted TMD12 coding region end position refers to the 1576th to 1818th region in MAL21 (SEQ ID NO: 1), MTT1 (SEQ ID NO: 5). ) Is the 1579-1821st area.
  • the present invention relates to a polynucleotide containing a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, 15 or 17 or a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 16 or 18.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, 15 or 17 or a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 16 or 18.
  • the present invention hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide described in (1) to (4) above or the polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, 15 or 17.
  • polynucleotides that contain a polynucleotide that encodes a transporter protein that is soy and that has glucose-induced inactiv
  • Preferred polynucleotides in the present invention are polynucleotides including the polynucleotides defined in the above (1) to (4), the polynucleotides encoding the proteins consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 14, 16 or 18, or SEQ ID NOs: : A polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of 13, 15, or 17, more preferably a polynucleotide specified by SEQ ID NO: 13, 15 or 17.
  • polynucleotide (DNA) that hybridizes under stringent conditions means, for example, DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, or SEQ ID NO: 2 or 4 DNA obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like using all or part of DNA encoding an amino acid sequence as a probe.
  • a hybridization method for example, methods described in Molecular® Cloning® 3rd Ed., Current Protocols® in Molecular Molecular Biology, John Wiley®, and Sons® 1987-1997 can be used.
  • stringent conditions may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C.
  • the “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having higher homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.
  • Alkphos Direct Labeling Reagents manufactured by Amersham Pharmacia
  • Hybridized DNA can be detected.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 is about 90%. 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, Examples include DNA having 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more.
  • Protein of the present invention also provides a protein encoded by any of the polynucleotides described in (1) to (6) above.
  • the preferred protein of the present invention has 1 to 10 (preferably 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 1) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 16 or 18. (5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1) amino acid sequence deleted, substituted, inserted and / or added, and resistant to glucose-induced inactivation / degradation It is a transporter protein.
  • Such a protein comprises an amino acid sequence in which the number of amino acid residues as described above is deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 16 or 18, and glucose induction.
  • Transporter proteins having resistance to sex inactivation / degradation Further, as such a protein, a transporter protein having the amino acid sequence having the homology as described above with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, 16 or 18, and having glucose-induced inactivation / degradation resistance Can be mentioned. Such proteins are described in “Molecular Cloning 3rd Edition”, “Current Protocols in Molecular Biology”, “Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”, “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”,“ Gene, 34, 315 (1985) ”,“ Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ”,“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82, 488 (1985) ”and the like.
  • 1 to 10 (preferably 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, in the amino acid sequence of the protein of the polynucleotide of the present invention, (1 to 3, 1 to 2 or 1) amino acid residues are deleted, substituted, inserted and / or added are any and 1 to 10, 1 to 9, 1 to 3 in the same sequence. 1 to 10, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 or 1 position in the amino acid sequence 9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1 amino acid residue deletion, substitution, It means that there is an insertion and / or addition, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously.
  • amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • Group C asparagine, glutamine;
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • the protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). It can also be chemically synthesized using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthesel Vega, Perceptive, Shimadzu, etc. .
  • the present invention provides a vector comprising the polynucleotide described above.
  • the vector of the present invention is preferably a polynucleotide (DNA) according to any one of (1) to (4) above, or a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13, 15 or 17, or SEQ ID NO: It contains a polynucleotide encoding a protein consisting of 14, 16 or 18 amino acid sequences.
  • the vector of the present invention usually contains (x) a promoter that can be transcribed in yeast cells; (y) the polynucleotide (DNA) according to any one of the above, bound to the promoter in a sense direction or an antisense direction. And (z) with respect to transcription termination and polyadenylation of RNA molecules, configured to include an expression cassette that contains as a component a signal that functions in yeast.
  • these polynucleotides are expressed with respect to the promoter so as to promote the expression of the polynucleotide (DNA) described in any one of (a) to (i) above. It is preferably introduced in the sense direction.
  • YEp type vector As the vector used for introduction into yeast, any of a multicopy type (YEp type), a single copy type (YCp type), and a chromosome integration type (YIp type) can be used.
  • YEp type vector is YEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983)
  • YCp type vector is YCp50 (M. D. Rose et al. , ⁇ gene, 60, 237, 1987)
  • YIp5 K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad.cadSci. USP, 76, 1035, 1979
  • YIp5 K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad.cadSci. USP, 76, 1035, 1979
  • pUP3GLP chromosomally integrated pUP3GLP (Omura, F. et al., FEMS Microbiol. Lett., 194, 207, 2001) (Fig. 14), pJHIXSB and pYCGPY (Kodama, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 3455, 2001) (Fig. 13), pJHXSB (Fig. 12), and other single-copy replicating plasmids can also be used.
  • any combination may be used as long as it functions in brewing yeast and is not affected by the concentration of components such as sugar and amino acids in mash.
  • a promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene (TDH3), a promoter of 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK1), and the like can be used.
  • TDH3 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene
  • PGK1 3-phosphoglycerate kinase gene
  • these genes have already been cloned and described in detail in, for example, M. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) and can be easily obtained by known methods.
  • it is effective to change the promoter to be used to have a suitable transcription activity depending on the sugar composition and sugar concentration of the fermentation mash or a combination of a plurality of transporters.
  • G418r geneticin resistance gene
  • CUP1 copper resistance gene
  • CUP1 copper resistance gene
  • fas2m, PDR4 cerulenin resistance gene
  • the vector constructed as described above is introduced into the host yeast.
  • the host yeast include any yeast that can be used for brewing, for example, brewery yeast for beer, wine, sake and the like.
  • yeasts of the genus Saccharomyces include yeasts of the genus Saccharomyces.
  • beer yeasts such as Saccharomyces pastorianus W34 / 70, Saccharomyces carlsbergensis NCYC453, NCYC453, Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954, etc. can be used.
  • whiskey yeasts such as Saccharomyces cerevisiae NCYC90
  • wine yeasts such as association wines Nos. 1, 3, and 4
  • sake yeasts such as association yeasts sake sakes Nos. 7 and 9
  • the present invention is not limited to this.
  • beer yeast for example, Saccharomyces Pastorianus is preferably used.
  • the chromosomal DNA used for the preparation of each transporter gene described in the present specification is not limited to strains such as Saccharomyces cerevisiae ATCC20598, ATCC96955, and any yeast as long as it belongs to Saccharomyces cerevisiae having each gene. It may be prepared from the yeast.
  • yeast transformation method a publicly known method can be used. For example, electroporation method “Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”, spheroplast method “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)”, lithium acetate method “J.Bacteriology, 153, p163 (1983) ”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual etc.
  • electroporation method “Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”
  • spheroplast method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)
  • lithium acetate method J.Bacteriology, 153, p163 (1983)
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978) Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A
  • a transformed strain can be selected on an agar medium not containing uracil by incorporating a gene that complements the host's auxotrophy, such as URA3, into an expression plasmid.
  • an agar medium containing cycloheximide (eg, 0.3 ⁇ g / ml) or geneticin (eg, 300 ⁇ g / ml) by incorporating a drug resistance gene such as a drug resistance gene for cycloheximide, YAP1, or a geneticin resistance gene, G418R into the expression plasmid Can be selected.
  • the host yeast is a standard yeast nutrient medium (for example, YEPD medium “Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117 (1979)”, etc.) so that the value of OD600nm is 1-6.
  • YEPD medium Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117 (1979)”, etc.
  • alkali ion metal ions preferably lithium ions
  • the cells are allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes, and then left at about 30 ° C. for about 60 minutes together with the DNA to be introduced (about 1 to 20 ⁇ g).
  • Polyethylene glycol preferably about 4,000 daltons of polyethylene glycol, is added to a final concentration of about 20% to 50%. After standing at about 30 ° C. for about 30 minutes, the cells are heated at about 42 ° C. for about 5 minutes. Preferably, the cell suspension is washed with a standard yeast nutrient medium, placed in a predetermined amount of fresh standard yeast nutrient medium, and allowed to stand at about 30 ° C. for about 60 minutes. Thereafter, the transformant is obtained by planting on a standard agar medium containing an antibiotic or the like used as a selection marker.
  • the method for producing the liquor of the present invention and the liquor obtained by the production method The above-described vector of the present invention is introduced into a yeast suitable for brewing the liquor to be produced, and by using the yeast, an alcoholic beverage characterized by the amino acid composition is obtained.
  • a yeast suitable for brewing the liquor to be produced and by using the yeast, an alcoholic beverage characterized by the amino acid composition is obtained.
  • a known method can be used except that the brewer's yeast obtained in the present invention is used instead of the parent strain. Therefore, the raw materials, production equipment, production management, etc. may be exactly the same as in the conventional method, and there is no increase in cost for producing alcoholic beverages with a reduced fermentation period. That is, according to the present invention, the existing facility can be used and manufactured without increasing the cost.
  • Yeast Evaluation Method An expression vector containing the polynucleotide prepared in the present invention is constructed, introduced into yeast based on a conventional method, and first cultured in a maltose maltotriose medium containing 2-deoxyglucose. Then, using the growth level as an index, a yeast containing a transporter protein that is not easily inactivated by glucose is selected. Next, the yeast is cultured in an oligosaccharide medium (for example, maltose maltotriose medium). During the culture, the glucose-induced inactivation / degradation resistance of the transporter contained in the yeast, the oligosaccharide utilization ability of the yeast, the growth rate, the fermentation rate in wort, etc. Aptitude can be evaluated. Glucose-induced inactivation / degradation resistance, oligosaccharide utilization ability, growth rate, fermentation rate in wort, and the like can be evaluated by the methods used in the examples described later.
  • Test method Test items and test methods used in this example are shown below. Unless otherwise noted, the test methods in this example were based on this.
  • AGT1 gene ⁇ Acquisition of MAL21, AGT1 gene>
  • the AGT1 gene of yeast Saccharomyces cerevisiae has already been cloned and its nucleotide sequence has been reported.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of AGT1 described herein was obtained from the Saccharomyces Genome Database (registration number: YGR289C).
  • the AGT1 gene was obtained by amplification and isolation by PCR using chromosomal DNA prepared from the yeast Saccharomyces cerevisiae having the AGT1 gene as a PCR template based on the nucleotide sequence information.
  • MAL21 is known to be encoded by chromosome III, but its DNA sequence has not been known.
  • MAL21 was also expected to have a fairly high identity.
  • primers (5'AGAGCTCAGCATATAAAGAGACA 3 '(SEQ ID NO: 19) and 5'TGGATCCGTATCTACCTACTGG 3' (SEQ ID NO: 20) from the MAL61 DNA sequence obtained from GenBank (registration number: X17391) and MAL21.
  • MAL21 could be obtained by PCR using a yeast chromosomal DNA having a gene but no other ⁇ -glucoside transporter gene as a template (the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence is SEQ ID NO: AGT1 was obtained using primers (5'TGAGCTCACATAGAAGAACATCAAA 3 '(SEQ ID NO: 21) and 5'ATGGATCCATATGAAAAATATCATT 3' (SEQ ID NO: 22)), specifically AGT1 was Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC204508 (Rose, MD, Winston, F. and Hieter, P.
  • MAL21 is Saccharomyces Obtained by PCR from Visier ATCC 20598.
  • the obtained DNA fragment was inserted into the vector, pCR (registered trademark) 2.1-TOPO, using the Invitrogen TOPO TA cloning kit, and the inserted gene sequence was confirmed by DNA sequencing. .
  • AGT1 it confirmed that it was the same as the base sequence of the registration number: YGR289C registered in the data bank.
  • 10 or more clones were sequenced independently to determine the base sequence (SEQ ID NO: 1).
  • the primer used has an XbaI or SacI site upstream of the start codon and a BamHI site downstream of the stop codon so that it can be incorporated into an expression vector.
  • Amplification of the target gene by PCR using chromosomal DNA and subsequent isolation can be performed by methods well known to those skilled in the art including preparation of PCR primers.
  • the base sequence of MAL21 is shown in FIG. 1, and the amino acid sequence is shown in FIG.
  • pJHXSB (Fig. 12)
  • pYCGPY (Fig. 13)
  • pUP3GLP (Fig. 14)
  • ⁇ Yeast strain> (1) to (3) are used for obtaining a transporter gene, strains (4) and (5) are used for transporter expression and comparison between strains, and (6) is used for confirming the fermentation rate.
  • S. cerevisiae S288C ATCC204508) (MATalpha SUC2 mal mel gal2 CUP1)
  • S. cerevisiae ATCC96955 MATa MAL61 MAL62 MAL63 mal64 mal11 MAL12 mal13 ura3-52 leu2-3 leu2-112 trp1 his
  • S. cerevisiae ATCC20598 MATa suc MAL2 MEL1 his4 leu2
  • S. cerevisiae ATCC20598 MATa suc MAL2 MEL1 his4 leu2
  • the restriction enzyme recognition site was introduced by PCR using a primer having a restriction enzyme recognition site sequence.
  • the DNA sequences of the primers are as shown in Table 3. Specifically, PCR was performed with the combination of primers shown in Table 4 using plasmid pCR (registered trademark) 2.1-TOPO into which AGT1 or MAL21 gene had been inserted as a template. , AGT1-SaK 5 DNA fragments of AGT1-SK, AGT1-SB and AGT1-KB, for MAL21 gene, 5 DNA fragments of MAL21-SaS, MAL21-SaK, MAL21-SK, MAL21-SB and MAL21-KB Got.
  • each fragment was inserted into plasmid pCR (registered trademark) 2.1-TOPO and sequenced, and it was confirmed that there was no base substituted from the original gene other than the introduced restriction enzyme site.
  • plasmid pCR registered trademark
  • Each DNA fragment was excised from the plasmid using restriction enzymes, SacI, SalI, KpnI, BamHI, etc., and used for the construction of the following hybrid transporter gene.
  • hybrid transporter gene Six types of hybrid transporter genes, AAM, AMA, AMM, MAA, MAM, and MMA shown in FIG. 7 were constructed. Each hybrid transporter was obtained by incorporating the respective fragments obtained in the above section into the SacI-BamHI site of the expression vector pYCGPY in the combination shown in FIG. Specifically, pYCGPY was cleaved with SacI and BamHI, dephosphorylated with Bacterial alkali phosphatase, and the linearized vector and the above DNA fragment were ligated and transformed into E. coli DH5 ⁇ .
  • the notation relating to mutants such as MMA, MAA and MAM used in the present invention is a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence whose first letter is derived from the N-terminal domain (5 ′ side) of the 12-transmembrane domain.
  • the second letter encodes an amino acid sequence that encodes an amino acid sequence derived from the 12th transmembrane region
  • the third letter encodes an amino acid sequence derived from the C-terminal domain (3 ′ side) of the 12th transmembrane domain
  • the letter M is derived from MAL21, and the letter A is derived from AGT1. That is, wild type AGT1 can be expressed as AAA, and a hybrid mutant in which the N-terminal side of the 12-transmembrane domain of AGT1 is substituted with the corresponding domain of MAL21 can be expressed as MAA.
  • Yeast was transformed with a plasmid capable of expressing a natural type or hybrid transporter gene obtained by the above method.
  • a transformed strain (a strain having no alpha-glucoside transporter gene as a host) was selected for pYCGPY in YPD medium containing 300 ⁇ g / ml of G418 according to the marker of the plasmid used.
  • pJHXSB when a ura-strain such as HH1001 is used as a host, a synthetic medium not containing uracil, for example, a minimal medium (Yeast Nitrogen Base w / o amino acids 6.7 g / L, glucose 20 g / L) I chose it.
  • the expression of the introduced transporter gene in the transformant of the natural transporter or the constructed hybrid transporter is 0.5% maltose or maltotriose.
  • the cell suspension After collecting this and suspending it again in 1 ml of sterilized water, the cell suspension is directly streaked into a test medium containing maltose or maltotriose as the sole carbon source to confirm growth. It was confirmed to have an uptake activity of maltose or maltotriose.
  • 2-Deoxyglucose resistance of transporter protein ⁇ Evaluation of 2-deoxyglucose resistance of transporter protein>
  • 2-Deoxyglucose (2-DOG) is a sugar analog that cannot be a carbon source because it is not metabolized more than 2-DOG-6 phosphate, but is glucose repressed to the same level as glucose or inactivated by glucose It is known to cause. Therefore, the strain that grows on this plate is likely to have an alpha-glucoside transporter that is less susceptible to inactivation by glucose.
  • a minimal medium such as maltose containing 0-2 mM 2-deoxyglucose (Yeast Nitrogen Base w / o amino acids 6.7 g / L, maltose 20 g / L, but nutrition (Required transformants include their nutrients) or maltose complete synthetic medium (SCM) containing 0-2 mM 2-deoxyglucose (Yeast Nitrogen Base w / o amino acids 6.7 g / L , Maltose 20 g / L, adenine sulfate 20 mg / ml, uracil 20 mg / ml, L-tryptophan 20 mg / ml, L-histidine hydrochloride 20 mg / ml, L-arginine hydrochloride 20 mg / ml, L- Methionine 20 mg / ml, L-tyrosine 30 mg / ml, L-leucine 30 mg / m m
  • the intracellular accumulation amount of the transporter protein can be examined, for example, by Western blotting.
  • a test strain is recovered from a 10 ml culture solution in a logarithmic growth phase, and lysis buffer (8 M urea, 5% (w / v) SDS, 40 mM Tris-HCl (pH 6.8), 0.1 mM EDTA, (1% ⁇ -mercaptoethanol) is disrupted by stirring with glass beads to obtain a cell extract.
  • a sample of 60 ⁇ g of total protein is developed by SDS-gel electrophoresis, transferred to a nitrocellulose membrane, and then subjected to western blotting using a rabbit polyclonal anti-Mal61p antibody.
  • Rabbit polyclonal anti-Mal61p antibody was obtained as follows. DNA encoding the N-terminal region (Met1-Leu181) of Mal61p was ligated downstream of the GST tag of the pET Expression vector (Novagen), transformed into E. coli BL21 (DE3), and the cell lysate of the transformant was transformed into GST. It was prepared by applying to a bind resin column and eluting the protein bound to the column.
  • a positive band corresponding to the molecular weight of the 68 kDa ⁇ -glucoside transporter was detected only in the yeast strain crush solution in which the ⁇ -glucoside transporter gene was expressed.
  • the hybrid transporter only the transporter, MMAp, MAMp and MAAp whose N-terminal part is Mal21p type can be detected with this antibody.
  • the amount of Agt1p accumulated in the cell is determined by constructing a gene encoding a fusion protein in which two hematoagglutinin tags are connected in tandem at the C-terminal part of Agt1p, and obtaining a strain that expresses it by the above method. Using.
  • a mouse monoclonal anti-hematoagglutinin antibody (Covance, Research, Products, Inc.) was used.
  • Example 1 Degradation rate PCR of Mal21p and Agt1p in the presence of glucose
  • the MAL21 gene and AGT1 gene obtained by PCR were inserted into the expression vector pYCGPY and transformed into yeast ⁇ 152. Transformed into minimal medium (MM) containing 0.5% maltose or maltotriose as the sole carbon source and containing 20mg / L uracil, 20mg / L histidine, 30mg / L leucine, 300 ⁇ g / ml geneticin Strains were streaked (Figure 5).
  • MM minimal medium
  • AGT1-2HA a gene encoding a fusion protein in which two hematoagglutinin tags were connected in tandem to the C-terminal part of Agt1p, was constructed and inserted into the expression vector pJHXSB. MAL61 and MAL21 were also inserted into pJHXSB. These were transformed into yeast HH1001. Using both transformed strains, the degradation rate in the presence of glucose was examined by Western blotting by the method shown in the test method section. The result is shown in FIG.
  • Agt1-2HAp was found to have a shorter half-life than Mal61p and Mal21p (see FIG. 6, Agt1-2HAp: 14 minutes, Mal61p: 25 minutes, Mal21p: 118 minutes). In addition, Mal21p was found to have a much longer half-life than Mal61p even with the same ⁇ -glucoside transporter (Mal61p: 25 minutes, Mal21p: 118 minutes).
  • Example 2 Construction of hybrid transporter and confirmation of substrate specificity Agt1p and Mal21p belong to the MFS (Major facilitated sugar transporter) family, and have 12 transmembrane domains due to the similarity of their amino acid sequences, and N-terminal. And the C-terminus is thought to be the cytoplasmic domain. The sites involved in substrate specificity and activity of Agt1p and Mal21p are not known. Looking at the alignment of the amino acid sequences of both, the N-terminal and C-terminal regions have low similarity in the portion considered to be a cytoplasmic domain, and the central 12 transmembrane domain portions have high similarity (see FIG. 3).
  • MFS Major facilitated sugar transporter
  • AGT1 and MAL21 genes were obtained by PCR, respectively, with a portion encoding the N-terminal or C-terminal cytoplasmic domain and a portion encoding the central 12-transmembrane domain at both ends having restriction enzyme sites.
  • Table 3 shows the primers used
  • Table 4 shows the relationship between the obtained fragments and the primer pairs used.
  • Several hybrid transporter genes were constructed by combining these. The recombination positions used are represented as crosses in FIG. 3, and the names and schematic diagrams of the hybrids are shown in FIG. The details are as described in the test method.
  • the expression vector pYCGPY inserted with each hybrid transporter gene shown in FIG.
  • MM 7 was transformed into yeast ⁇ 152.
  • Minimal medium (MM) containing 0.5% maltose or maltotriose as the sole carbon source and containing 20mg / L uracil, 20mg / L histidine, 30mg / L leucine, 300 ⁇ g / ml geneticin (MM: Yeast Nitrogen Base w / o amino acids 6.7 g / L, 5 g / L maltose or maltotriose, 20 mg / L histidine, 30 mg / L leucine, 20 mg / L uracil 300 ⁇ g / ml geneticin) (FIG. 8).
  • Example 3 2-deoxyglucose resistance of hybrid transporter
  • the hybrid transporter gene described in Example 2 was excised from pYCGPY with SacI-BamHI and incorporated into the SacI-BamHI site of pJHXSB. Each constructed expression vector was transformed into HH1001.
  • HH1001 is a ura3- sibling of the mal-strain X2180-1A and incorporates TPI1p :: MAL32 (encoding the maltase gene), so that maltase is constitutively expressed.
  • a plate was prepared by adding 0 mM to 2 mM 2-deoxyglucose (2-DOG) to a fully synthetic medium (SCM) containing 2% maltose, and as described in the test method, 2- DOG resistance was examined.
  • 2-DOG is a sugar analog that cannot be a carbon source because it is not metabolized more than 2-DOG-6 phosphate, but is known to cause glucose repression or inactivation by glucose at the same level as glucose. ing. Therefore, the strain that grows on this plate is likely to be an ⁇ -glucoside transporter that is not easily inactivated by glucose. The result is shown in FIG.
  • Hybrid transporters MMAp and MAAp with N-terminal cytoplasmic domain derived from MAL21 grew in 1 mM 2-DOG medium.
  • MAMp also grew in 2 mM 2-DOG medium, and had the same resistance to 2-DOG as native Mal21p, and was found to be less susceptible to degradation by glucose.
  • Example 4 Degradation rate of hybrid transporter in the presence of glucose
  • the hybrid transporters MMAp, MAAp, and MAMp having an N-terminal cytoplasmic domain derived from MAL21 are less susceptible to glucose-induced degradation. Conceivable.
  • the degradation rate of MMAp, MAAp, and MAMp in the presence of glucose was measured by the method shown in the test method (FIG. 10). Both hybrid transporters had a longer half-life than Agt1-2HAp.
  • MAMp has a half-life of 119 minutes and almost the same half-life as Mal21p (118 minutes), improving Agt1p, an alpha-glucoside transporter that is rapidly degraded by glucose, and constructing a transporter that is difficult to degrade. I was able to do it.
  • MAL21 a transporter resistant to glucose-induced degradation by a bottom brewer's yeast with high expression of MAL21, was incorporated into the XbaI (or SacI) -BamHI site of plasmid pUP3GLP.
  • pUP3GLP is shown in FIG.
  • pUP3GLP is a YIp type plasmid, and the transporter gene is expressed by the glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase promoter (TDH3p).
  • Each plasmid was cleaved at the EcoRV site in URA3, transformed into lower beer yeast (Weihenstephan 194), and YPG plate containing 0.3 ⁇ g / ml cycloheximide (yeast extract 10 g / L, polypeptone 20 g / L). , Galactose 20 g / L). It was confirmed by PCR that the target expression cassette was inserted into the URA3 gene on the chromosome of Weihenstephan 194.
  • Weihenstephan 194 (URA3 :: TDH3p :: MAL21) and parent strain Weihenstephan 194 were inoculated into two types of sparkling wort.
  • Happoshu wort is a wort that uses saccharified starch, hops, etc. with a malt use ratio of less than 25% in the raw material excluding water.
  • One of the sparkling worts has an initial extract concentration of 14.0% and contains sugar at a composition ratio of 1.2% glucose, 6.6% maltose, and 2.2% maltotriose.
  • Another glucose-rich sparkling wort has an initial extract concentration of 15.6% and contains sugar at a composition ratio of glucose 4.7%, maltose 5.4%, and maltotriose 1.7%.
  • the wet cell bodies were pitched to each sparkling wort so as to be 7.5 g / L, fermented at 15 ° C., and the maltose concentration of moromi during fermentation was measured.
  • the result is shown in FIG.
  • the maltose utilization rate of the MAL21 high-expressing strain was significantly faster than that of the parent strain Weihenstephan 194.
  • a high initial extract concentration means a high glucose concentration, and the effect of a transporter having resistance to glucose-induced degradation was sufficiently observed. Therefore, in the case of a yeast into which the hybrid transporter MAAp or MAMp has been introduced, for example, from the results of FIG. 10 and FIG. 11, it is expected that assimilation of maltotriose will be sufficiently promoted when a monosaccharide such as glucose is at a high concentration.
  • Agt1p which is an alpha-glucoside transporter
  • ⁇ -glucoside transporters have a shorter half-life in the presence of glucose than other ⁇ -glucoside transporters.
  • Mal21p is unlikely to be degraded by glucose, unlike Mal61p.
  • hybrid transporters AAMp, MAAp, and MAMp whose central 12-transmembrane domain is Agt1p type, all take in maltotriose.
  • the present inventors have found that the hybrid transporters MAAp, MMAp, and MAMp, whose N-terminal cytoplasmic domain is of the Mal21p type, are less degraded in the presence of glucose than Agt1p.
  • the hybrid transporter MAM which has Mal21p N-terminal and C-terminal cytoplasmic domains and only the central twelve transmembrane domain is the Agt1p type, has a long half-life similar to Mal21p and malt. If yeast that expresses the mutant transporter (regardless of laboratory strain or brewer's yeast) is used to take in triose, malt triose in moromi and other sugar resources that the transporter can take up Can be accelerated. This is particularly effective when the concentration of monosaccharides such as glucose is high.

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Abstract

　本発明は、麦汁などに含まれるマルトース・マルトトリオースの資化を早めることのできる、アルファーグルコシドトランスポーターなどに関する。特に本発明は、グルコースによる不活化・分解に関して、AGT1とMAL21とのハイブリッドによって、グルコースによる不活化・分解を受けにくく、かつAGT1と同じくマルトトリオースを取り込むことができるアルファーグルコシドトランスポーターなどに関する。例えば本発明のアルファーグルコシドトランスポーターを発現する酵母を使用することによって、マルトース・マルトトリオースなどのオリゴ糖を含む醪の醗酵速度を早める事ができる。

Description

ハイブリッドアルファーグルコシドトランスポーター
　本発明は、麦汁などに含まれるマルトース・マルトトリオースの資化を早めることのできる、アルファーグルコシドトランスポーターなどに関する。
　ビール、発泡酒、ウィスキーなどの麦芽発酵飲料の製造において、麦芽等をマッシングした麦汁に含まれる主な糖はグルコース・マルトース・マルトトリオースの3種類である。これらの麦芽由来の糖の比率はマッシングの方法で、若干変えることが可能だが、酵素剤の添加や、糖化スターチの添加などを行なわない場合は、大きく変わることはなく、1:5:1ぐらいの比であると言える。このうちグルコースは単糖であり、酵母が最も好む糖として、はじめに資化される。酵母は、グルコース存在下で転写過程において抑制される数々の遺伝子を有している。この抑制制御はグルコースリプレッションと呼ばれる。マルトースやマルトトリオースの酵母への取り込みに必要な数種のトランスポーターはいずれもこの抑制を受ける。また、これらグルコースリプレッションを受ける遺伝子の産物は、さらに翻訳後にもグルコースの存在下で不活化されるものがあることが知られている。マルトーストランスポーターもその類に属し、グルコース存在下では、速やかに分解されることが知られている。マルトース・マルトトリオースの資化の第一段階が、このトランスポーターによる酵母細胞内への取り込みであるため、トランスポーターが分解されると、これらの資化は止まってしまう。これが、トランスポーターの発現が資化の律速段階であると呼ばれる由縁である。
Brondijk, T. H., van der Rest, M. E., Pluim, D., de Vries, Y. de., Stingl, K., Poolman, B., and Konings, W. N. (1998) J Biol Chem 273(25), 15352-15357 Medintz, I., Wang, X., Hradek, T., and Michels, C. A. (2000) Biochemistry 39(15), 4518-4526 Gadura, N., and Michels, C. A. (2006) Curr Genet 50(2), 101-114 4) Han EK, Cotty F, Sottas C, Jiang H, Michels CA.(1995) Mol Microbiol.17(6),1093-107.
　したがって、例えば酵母におけるAgt1pは、グルコース存在下において分解速度が非常に速いため、高グルコース濃度の培養において効率的に機能できないことが１つの問題と考えられる。
　このような状況において、マルトース・マルトトリオースなどのオリゴ糖を含む醗酵醪の酵母による醗酵速度を早めることのできる、オリゴ糖トランスポーターを作製することが望まれていた。
　特に本発明は、翻訳後のアルファーグルコシドトランスポーターAgt1pのグルコースによる分解を制御することができれば、培地中の高グルコース存在下でも、より効率よくマルトース・マルトトリオースを酵母に資化させる事ができることが期待されるため、グルコースによって不活化または分解されにくいアルファーグルコシドトランスポーターAgt1pを作製することを課題とする。
　本発明者らは、この概念に基づき鋭意努力した結果、グルコースによる不活化/分解を受けやすいことがわかっているAGT1と、自然界から取得したグルコースによる不活化・分解を受けにくいMAL21とのハイブリッド遺伝子を複数作製し、その中から、グルコースによる不活化・分解を受けにくく、さらに基質特異性についてはAGT1と同じくマルトトリオースを取り込むことができるハイブリッドトランスポーターを作製することに成功し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、グルコース誘導性不活化／分解耐性トランスポーターをコードする遺伝子、該遺伝子にコードされるトランスポータータンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
（１）　グルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、以下の(a)～(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチドからなる１２回膜貫通ドメインコード領域を含み、５'側配列及び／又は３'側配列を異種ポリヌクレオチドと組み換えてなるポリヌクレオチド：
　(a)配列番号：３の307～1659番目の塩基配列又は配列番号：５の283～1641番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　(b)配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
　(c)配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列において、1～10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；及び
　(d)配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
（２）　異種ポリヌクレオチド配列が配列番号：１の１２回膜貫通ドメインの５'側配列及び／又は３'側配列である、（１）に記載のポリヌクレオチド
（３）　５'側配列との組換え位置が１２回膜貫通ドメインの予測TMD1コード領域内であり、３'側配列との組換え位置が１２回膜貫通ドメインの予測TMD12コード領域開始位置から予測TMD12コード領域終止位置より３'側に96塩基以内の領域内であって、かつ配列番号：２と配列番号：４との対応するアミノ酸配列において同一性が80％以上の領域内である、（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）　５'側配列との組換え位置が配列番号：１又は配列番号：５の175番目の塩基より１２回膜貫通ドメイン予測TMD1コード領域終止位置までの領域内であり、１２回膜貫通ドメインと３'側配列との組換え位置が予測TMD12コード領域開始位置から予測TMD12コード領域終止位置より３'側に180塩基以内の領域内である、（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）　配列番号：１３、１５又は１７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する（１）～（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）　配列番号：１４、１６又は１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する（１）～（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（７）　ＤＮＡである、（１）～（６）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（８）　（１）～（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（９）　（１）～（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（１０）　（９）に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（１１）　（９）に記載のベクターを導入することによって、オリゴ糖資化能が向上した（１０）に記載の醸造用酵母。
（１２）　（８）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってオリゴ糖資化能が向上した（１１）に記載の醸造用酵母。
（１３）　（１０）～（１２）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１４）　醸造する酒類が麦芽飲料である（１３）に記載の酒類の製造方法。
（１５）　醸造する酒類がワインである（１３）に記載の酒類の製造方法。
（１６）　（１３）～（１５）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
　本発明において改変したハイブリッドトランスポーター遺伝子を発現する酵母を使用することによって、マルトース・マルトトリオースなどのオリゴ糖を含む醪の醗酵速度を早める事ができる。改変したハイブリッドトランスポーター遺伝子は、どのような醸造用酵母、実験室酵母にも導入可能である。特にグルコース・フラクトースなどの単糖を沢山含むような醗酵原液に、マルトース・マルトトリオース・ツラノース・トレハロース等、改変したトランスポーターが取り込むことのできるオリゴ糖を含むような場合はより有効である。
MAL21遺伝子の塩基配列を示す図である。 Mal21pのアミノ酸配列を示す図である。 Mal21pとAgt1pとのアミノ酸配列のアラインメント図である。 Mal21pとMtt1pとのアミノ酸配列のアラインメント図である。 Agt1pとMal21pとの基質特異性の違いを示す図である。 Agt1p、Mal61pおよびMal21p のグルコース存在下での分解速度を示す図である。 AMMp、AAMp、AMAp、MAAp、MMAp、MAMpの配列の模式図である。 AMMp、AAMp、AMAp、MAAp、MMAp、MAMpの各ハイブリッドトランスポーターを有する形質転換酵母の基質特異性を示す図である。 AMMp、AAMp、AMAp、MAAp、MMAp、MAMpの各ハイブリッドトランスポーターを有する形質転換酵母の2-DOG耐性を示す図である。 MMAp、MAAp、MAMpの分解速度の測定を示す図である。 MAL21遺伝子を高発現させた下面ビール酵母株の発泡酒あるいは発泡酒（グルコースリッチ）麦汁におけるマルトース発酵速度を示す図である。 pJHXSBを示す図である。 pYCGPYを示す図である。 pUP3GLPを示す図である。
　本発明者らは、翻訳後のトランスポーターのグルコースによる不活性化または分解を制御することができれば、グルコース存在下でも、より効率よくマルトース及びマルトトリオースを酵母に資化させる事ができるのではないかという着想に基づいて、鋭意努力した結果、自然界から分解されにくいα－グルコシドトランスポーターであるMal21pを発見し、Mal21pが他のトランスポーターに比べ、はるかに分解速度が遅いことを確認した。
　本発明において新たに作製したグルコースによる不活化または分解を受けにくいハイブリッドトランスポーターを高発現することによって、実際にマルトース培地での増殖速度を上げる事に成功した。また、ビール醸造においては、マルトースの資化速度を早める事ができた。本発明はこのような着想と研究の成果によって完成したものである。
　本発明において得られた遺伝子およびそのヌクレオチド配列、ならびにそれらの遺伝子にコードされるトランスポータータンパク質のアミノ酸配列は次のとおりである。
　[配列番号：１]　MAL21ヌクレオチド配列
　[配列番号：２]　Mal21pα－グルコシドトランスポーターアミノ酸配列
　[配列番号：３]　AGT1ヌクレオチド配列
　[配列番号：４]　Agt1pα－グルコシドトランスポーターアミノ酸配列
　[配列番号：５]　MTT1ヌクレオチド配列
　[配列番号：６]　Mtt1pα－グルコシドトランスポーターアミノ酸配列
　[配列番号：７]　AAMヌクレオチド配列
　[配列番号：８]　AAMpアミノ酸配列
　[配列番号：９]　AMAヌクレオチド配列
　[配列番号：１０]　AMApアミノ酸配列
　[配列番号：１１]　AMMヌクレオチド配列
　[配列番号：１２]　AMMpアミノ酸配列
　[配列番号：１３]　MAAヌクレオチド配列
　[配列番号：１４]　MAApアミノ酸配列
　[配列番号：１５]　MAMヌクレオチド配列
　[配列番号：１６]　MAMpアミノ酸配列
　[配列番号：１７]　MMAヌクレオチド配列
　[配列番号：１８]　MMApアミノ酸配列
　本明細書中で使用される「α－グルコシドトランスポーター」とは、α－グルコシドの膜輸送に関するタンパク質であり、このようなα－グルコシドトランスポーターとしては、マルトーストランスポーター、マルトトリオーストランスポーターなどが含まれる。
１．本発明のポリヌクレオチド
　まず、本発明は、グルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、(a)配列番号：３の307～1659番目の塩基配列又は配列番号：５の283～1641番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからなる１２回膜貫通ドメインコード領域を含み、５'側及び／又は３'側の配列を異種ポリヌクレオチドに組み換えてなるポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　１２回膜貫通ドメインとは、１２個の膜貫通ドメインであるTMD1からTMD12までの範囲を意味し、個々の膜貫通ドメインであるTMD1、TMD2、…、TMD12およびそれぞれに介在する配列を含む。TMD1、TMD12等のTMDに付属する各番号は、アミノ酸配列のＮ末端側から数えた膜貫通ドメインの番号を示す。したがって１２回膜貫通ドメインコード領域とは、TMD1から12までの範囲のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指し、TMD1コード領域とは、TMD1のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。
　本発明は、１２回膜貫通ドメインを有するアルファーグルコシドトランスポータータンパク質のＮ末側及び／又はＣ末側の配列を他の１２回膜貫通ドメインを有するトランスポータータンパク質のＮ末側及び／又はＣ末側の配列に組み換えてなるトランスポータータンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本明細書において、「異種ポリヌクレオチド」とは、組換え前のトランスポータータンパク質と異なるトランスポータータンパク質がコードされるポリヌクレオチドのことをいう。異種のポリヌクレオチドと組み換える場合、好ましくは、組み換える対象のポリヌクレオチドと異種ポリヌクレオチドとの間でヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列についてのアラインメントを確認し、対応する領域間を組み換えることができる。
　５'側配列及び／又は３'側配列とは、ある特定の遺伝子又はＤＮＡ配列の隣の配列、すなわち５'側及び／又は３'側に存在する配列を指す。例えば、１２回膜貫通ドメインコード領域の５'側配列は、その１２回膜貫通ドメインを中央部分に持つタンパク質をコードする領域の翻訳を開始するための配列を含み、１２回膜貫通ドメインコード領域の３'側配列は、１２回膜貫通ドメインを中央部分に持つタンパク質をコードする領域の翻訳を終結するための配列を含む。本発明において、５'側配列及び３'側配列とは１２回膜貫通ドメインを挟む５'側配列又は３'側配列を指す。５'側の組換え位置は、例えばTMD1内の領域内であってもよいし、TMD1開始位置より５'側の上流であってもよい。
　本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：３の307～1659番目の塩基配列又は配列番号：５の283～1641番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからなる１２回膜貫通ドメインコード領域の５'側及び／又は３'側配列を、配列番号：１の１２回膜貫通ドメインコード領域の５'側及び／又は３'側配列と組み換えてなる、グルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記配列のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列において、1～10個（好ましくは、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個又は1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含み、かつグルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質が挙げられる。
　このようなタンパク質としては、配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列において、例えば、１～10個、１～9個、１～8個、１～7個、１～6個（1～数個）、１～5個、１～4個、１～3個、１～2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつグルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
　また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列に対して約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつグルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
＜グルコース誘導性不活化／分解耐性の評価＞
　本発明において、グルコース誘導性不活化／分解耐性は、例えば次のようにして評価することができる。最初に、各トランスポータータンパクを発現する株が、0～2 mMの2－デオキシグルコースを含有するマルトース等の最少培地（Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g/L、 マルトースなど 20 g/L、ただし、栄養要求性のある形質転換株については、その栄養素を含む) あるいは、0～2 mMの2－デオキシグルコースを含有するマルトース等の完全合成培地(SCM) （Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g/L、 マルトース20 g/L、アデニン硫酸 20 mg/ml、ウラシル20 mg/ml、L-トリプトファン20 mg/ml、L-ヒスチジン塩酸塩20 mg/ml、L-アルギニン塩酸塩20 mg/ml、L-メチオニン20 mg/ml、L-チロシン30 mg/ml、L-ロイシン30 mg/ml、L-イソロイシン30 mg/ml、L-リジン塩酸塩30 mg/ml、L-フェニルアラニン50 mg/ml、L-グルタミン酸100 mg/ml、L-アスパラギン酸 100 mg/ml、L-バリン150 mg/ml、L-トレオニン200 mg/ml、L-セリン400 mg/ml)で生育することを確認し、グルコース誘導性の不活化/分解シグナルが生じている状態の酵母においても、そのトランスポーターがマルトース取り込み活性を持ち機能している株を選択する。次に、この株をYPD(イーストエキストラクト　10 g/L,ポリペプトン　20 g/L, グルコース 20 g/L)に植菌して、30 ℃にて一晩震盪培養する。培養液を、OD660=1.0になるようにYPM培地(イーストエキストラクト　10 g/L,ポリペプトン　20 g/L, マルトース 5 g/L)に植菌し、30 ℃にて2.5時間、震盪培養し、集菌する。60 OD660unitの細胞を測り取り、あらかじめ30 ℃にてインキュベートしておいた分解速度測定用培地（Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and ammonia 1.6 g/L、 グルコース 20 g/L、シクロヘキシミド 25μg/L）30mlに懸濁し、30 ℃でインキュベートする。 細胞懸濁液は適当な時間（0、10、20、30および40 分あるいは、0、30、60、90および120 分）5mlサンプリングし、速やかに遠心して上澄みを捨て、細胞をエタノールドライアイスで凍結する。凍結した細胞から常法にしたがってトランスポータータンパク質を検出し、タンパクバンドのインテンシティーを測定し、その減少速度から半減期を求める。本発明において好ましいトランスポータータンパク質は、例えば、Agt1pと比較して、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上または８倍以上の半減期を有する。
＜タンパク質の膜貫通ドメインの規定＞
　本発明において、上記(a)に記載される「配列番号：３の307～1659番目の塩基配列又は配列番号：５の283～1641番目の塩基配列」、及び(b)に記載される配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列とは、酵母におけるAgt1p又はMtt1pの１２回膜貫通ドメインとして予想される部分である。これらタンパク質の膜貫通ドメインは、Stockholm university Theoretical Chemistry Protein Prediction Servers のTopology prediction program であるToppred2 (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html)、あるいは、EMBnetのTransmembrane regions detection programであるTMPRED:Transmembrane regions detection (EMBnet http://www.ch.embnet.org/index.html)などで予測する事が可能である（アクセス日：2008年8月29日）。Mal61pの予測膜貫通ドメインについては、Cheng, Q., and Michels, C. A. (1989) Genetics 123(3), 477-484に書かれている。本明細書において、以下の予測TMD1～12のために、Stockholm university Theoretical Chemistry Protein Prediction Servers のTopology prediction program であるToppred2 (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html)を使用した。
　図３および図４にそれぞれ、Mal21pとAgt1pとのアミノ酸配列のアラインメント、およびMal21pとMtt1pとのアミノ酸配列のアラインメント図を示す。それぞれの図には、同一のアミノ酸（薄いグレー）および相同性のあるアミノ酸（濃いグレー）、相同性のないアミノ酸、ギャップ（－）などの情報が示される。
　また、本発明は、３'側１２回膜貫通ドメインコード領域と５'側配列との組換え位置が予測TMD1コード領域内であり、１２回膜貫通ドメインコード領域と３'側配列との組換え位置が予測TMD12コード領域開始位置から予測TMD12コード領域終止位置より96塩基以内の領域内であって、かつ配列番号：２と配列番号：４との対応するアミノ酸配列において同一性が80％以上の領域内である、グルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
　上記の「予測TMD1」について図３を参照すると、Mal21p（配列番号：２）において95～115番目のアミノ酸、Agt1p（配列番号：４）において103～123番目の領域のアミノ酸が予測位置として示される。(図３中の予測TMD1の位置はAgt1pの予測位置を示す。)したがって、それぞれをコードする塩基配列は、MAL21（配列番号：１）において283～345番目の領域、AGT1（配列番号：３）において307～369番目の領域である。同様に、上記の「予測TMD12」について図３を参照すると、Mal21p（配列番号：２）において526～546番目の領域のアミノ酸、Agt1p（配列番号：４）において533～553番目の領域のアミノ酸が予測位置として示される。(図３中の予測TMD12の位置はAgt1pの予測位置を示す。)よって、それぞれの予測TMD12コード領域は、MAL21（配列番号：１）において1576～1638番目の領域、AGT1（配列番号：３）において1597～1659番目の領域である。したがって、「予測TMD12コード領域開始位置から予測TMD12コード領域終止位置より96塩基以内の領域」とは、塩基配列でMAL21（配列番号：１）では1576～1734番目以内の領域、AGT1（配列番号：３）では1597～1755番目以内の領域を指す。上記「予測TMD12コード領域終止位置より96塩基以内の領域」は、好ましくは予測TMD12コード領域終止位置より96塩基以内、より好ましくは81塩基以内、さらに好ましくは72塩基以内の領域である。それぞれ対応する配列位置の一例について、下記の表１に示す。但し、前述の予測プログラムに依存して、これら数値は数個変動し得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　さらに本発明は、１２回膜貫通ドメインコード領域と５'側配列との組換え位置が配列番号：１の175番目の塩基より１２回膜貫通ドメインの予測TMD1コード領域終止位置までの領域内であり、１２回膜貫通ドメインと３'側配列との組換え位置が予測TMD12コード領域開始位置から予測TMD12コード領域終止位置より180番目の塩基までの領域内である、グルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
　上記の「予測TMD1」について図４を参照すると、Mal21p（配列番号：２）およびMtt1p（配列番号：６）において95～115番目のアミノ酸が予測位置として示される（すなわち、ギャップなし）。よって、「予測TMD1コード領域」に対応する塩基配列は、MAL21（配列番号：１）およびMTT1（配列番号：５）において283～345番目の領域である。したがって、「配列番号：１又は配列番号：５の175番目の塩基より予測TMD1コード領域終止位置までの領域」とは、配列番号：１又は配列番号：５の175～345番目を指す。175番目の塩基より予測TMD1コード領域終止位置までの領域は、この範囲内の両アミノ酸配列が完全に一致しているので、この範囲内の何れの位置も組換え位置として選択できる（図４を参照のこと）。
　同様に、「予測TMD12」は、Mal21p（配列番号：２）において526～546番目の領域のアミノ酸、Mtt1p（配列番号：６）において527～547番目の領域のアミノ酸が予測位置として示される。よって、「予測TMD12コード領域開始位置から予測TMD12コード領域終止位置より180塩基以内の領域」とは、塩基配列でMAL21（配列番号：１）において1576～1818番目の領域、MTT1（配列番号：５）では1579～1821番目の領域である。予測TMD12コード領域終止位置より180塩基以内の領域は、この範囲内の両アミノ酸配列が完全に一致しているので、この範囲内の何れの位置も組換え位置として選択できる（図４を参照のこと）。それぞれ対応する配列位置については、下記の表２を参照のこと。但し、前述の予測プログラムに依存して、これら数値は数個変動し得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　さらに本発明は、配列番号：１３、１５又は１７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、あるいは配列番号：１４、１６又は１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含む。さらにまた本発明は、上記(１)～(４)に記載のポリヌクレオチドあるいは配列番号：１３、１５又は１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
　本発明において好ましいポリヌクレオチドは、上記の(１)～(４)に規定されるポリヌクレオチド、配列番号１４、１６又は１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、あるいは配列番号：１３、１５又は１７のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであり、より好ましくは、配列番号：１３、１５又は１７で特定されたポリヌクレオチドである。
　ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、例えば、配列番号：１若しくは３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号：２若しくは４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
　これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２又は４のアミノ酸配列をコードするDNAと約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAを挙げることができる。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（proc. Natl． Acad．Sci． USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝３とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
２．本発明のタンパク質
　本発明は、上記(１)～(６)に記載のポリヌクレオチドのいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：１４、１６又は１８のアミノ酸配列において、1～10個（好ましくは、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個又は1個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：１４、１６又は１８のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：１４、１６又は１８のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつグルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
　本発明のポリヌクレオチドに係るタンパク質のアミノ酸配列において1～10個（好ましくは、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個又は1個）のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個又は1個のアミノ酸配列中の位置において、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個又は1個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；　C群：アスパラギン、グルタミン；　D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；　E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；　F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；　G群：フェニルアラニン、チロシン。
　また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
　次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、好ましくは、上記(１)～(４)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）、又は配列番号：１３、１５又は１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１４、１６又は１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。なお、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)～(i)の何れかに記載のポリヌクレオチド(DNA)の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入するのが好ましい。
　酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。また、染色体組み込み型のpUP3GLP（Omura, F. et al., FEMS Microbiol. Lett., 194, 207, 2001）（図１４）、pJHIXSBや、pYCGPY （Kodama, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 3455, 2001）（図１３）、pJHXSB（図１２）等の単コピー複製型のプラスミドも使用可能である。
　酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の糖やアミノ酸などの成分の濃度に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。発現ベクターにおいて、使用するプロモーターは、醗酵もろみの糖組成や糖濃度であるとか、複数のトランスポーターの組み合わせなどによって、適当な転写活性を持つものに、変えることが有効である。
　形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス　パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母　清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
　本明細書中に記載される各トランスポーター遺伝子の調製に用いる染色体DNAは、サッカロミセス・セレビジエー ATCC20598、ATCC96955などの株に限定するものではなく、各遺伝子を有するサッカロミセス・セレビジエーに属する酵母であれば何れの酵母から調製されたものであってもよい。
　酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
　また、形質転換株は、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、例えばURA3を発現プラスミドに組み込むことにより、ウラシルを含まない寒天培地で選択することができる。あるいは、発現プラスミドに薬剤耐性遺伝子、例えばシクロヘキシミドに対する薬剤耐性遺伝子、YAP1、あるいはジェネティシン耐性遺伝子、G418Rを組込むことにより、シクロヘキシミド（例えば0.3μg／ml）、あるいはジェネティシン（例えば300μg／ml）を含む寒天培地で選択することができる。
　より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1～6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1～2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1～20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％～50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
　その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genitics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
　上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによってアミノ酸の組成に特徴のある酒類を製造することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。
　これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、発酵期間の短縮された酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。
５．酵母の評価方法
　本発明において作製されたポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを構築し、それを定法に基づいて酵母に導入し、最初に、2-デオキシグルコースを含むマルトース・マルトトリオース培地で培養して、その生育レベルを指標に用いてグルコースによる不活化を受けにくいトランスポータータンパク質を含む酵母を選択する。次に、その酵母をオリゴ糖培地（例えば、マルトース・マルトトリオース培地）で培養する。その培養の際、その酵母に含まれるトランスポーターのグルコース誘導性不活化／分解耐性、その酵母のオリゴ糖資化能、増殖速度、麦汁での醗酵速度などを測定することによって、その酵母の適性を評価することができる。グルコース誘導性不活化／分解耐性、オリゴ糖資化能、増殖速度、麦汁での醗酵速度などは、後述の実施例において用いられた方法によって評価することができる。
　以下に、本発明を実施例により、さらに詳しく説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されない点に注意すべきである。
試験方法：
　本実施例で用いた試験項目および試験方法を以下に示す。特に断りのない限り、本実施例における試験方法はこれに準じた。
＜MAL21, AGT1遺伝子の取得＞
　酵母サッカロミセス・セレビジエーのAGT1遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列が報告されている。本明細書中に記載されるAGT1のヌクレオチド配列（配列番号：３）はSaccharomyces Genome Database（登録番号：YGR289C）から入手した。AGT1遺伝子は、その塩基配列情報をもとに、AGT1遺伝子を持つ酵母サッカロミセス・セレビジエーから調製した染色体DNAをPCRの鋳型に使用して、PCRによって増幅、単離することにより取得した。
　また、MAL21については、染色体III番にコードされていることが知られているが、DNA配列は知られていなかった。しかし、染色体II番にコードされるMAL31, 染色体VIII番にコードされるMAL61遺伝子が99 %以上のアイデンティティーを持つことから考えて、MAL21もかなり高いアイデンティティーを持つことが予想された。
　実際に我々はGenBank(登録番号：X17391)から入手したMAL61のDNA配列からプライマー（5’AGAGCTCAGCATATAAAGAGACA 3’ (配列番号：１９)と5’TGGATCCGTATCTACCTACTGG 3’(配列番号：２０）を設計した。そしてMAL21遺伝子を持つが、他のα－グルコシドトランスポーター遺伝子を持たない酵母の染色体DNAを鋳型として、PCRでMAL21を取得することができた（そのヌクレオチド配列は配列番号：１、アミノ酸配列は配列番号：２に示される）。AGT1はプライマー（5’TGAGCTCACATAGAAGAACATCAAA 3’ (配列番号：２１)と5’ATGGATCCATATGAAAAATATCATT 3’ (配列番号：２２)）を用いて取得した。具体的にはAGT1はサッカロミセス・セレビジエー S288C (ATCC204508（Rose, M.D., Winston, F. and Hieter, P. (1990): Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）)、MAL21はサッカロミセス・セレビジエー ATCC20598からPCRによって取得した。取得したDNA断片は、Invitrogen社のTOPO TA cloning kitを用いて、ベクター、pCR(登録商標)2.1-TOPOに挿入した後、DNAシークエンスにより挿入した遺伝子配列を確認した。
　AGT1については、データバンクに登録されている登録番号：YGR289Cの塩基配列と同一であることを確認した。MAL21については、独立に10クローン以上をシークエンスして、塩基配列を確定した(配列番号：１)。
　なお、使用したプライマーには開始コドンの上流にXbaIあるいはSacIサイト、終始コドンの下流にBamHIサイトがあり、発現ベクターに組み込めるようになっている。染色体DNAを用いたPCRによる目的遺伝子の増幅およびその後の単離は、PCRプライマーの調製を含め、当業者に周知な方法で行うことができる。MAL21の塩基配列を図１にアミノ酸配列を図２に示す。
＜発現プラスミド＞
　本発明においては（１）～（３）の３種類の発現ベクターを用いた。
（１）pJHXSB (図１２)
（２）pYCGPY（図１３）
（３）pUP3GLP（図１４）
＜酵母株＞
　本発明においては、トランスポーター遺伝子の取得には、(1)～(3)を、トランスポーターの発現と株間比較には株(4)および(5)を、醗酵速度の確認には(6)を用いた。
　(1) S.cerevisiae S288C (ATCC204508) (MATalpha SUC2 mal mel gal2 CUP1)
　(2) S.cerevisiae ATCC96955(MATa MAL61 MAL62 MAL63 mal64 mal11 MAL12 mal13 ura3-52 leu2-3 leu2-112 trp1 his)
　(3) S.cerevisiae ATCC20598(MATa suc MAL2 MEL1 his4 leu2)
　(4) S.cerevisiae HH1001 (MATa SUC2 mal mel gal2 CUP1 TPI1::TPI1pr-MAL32-G418R ura3)
　(5) S.cerevisiae Δ152 (MATa mal61Δ::TRP1 MAL62 MAL63 mal64 mal11 MAL12 mal13 ura3-52 leu2-3 leu2-112 trp1 his) 
　(6) 下面ビール酵母　Weihenstephan 194 
＜制限酵素認識サイトの導入＞
　制限酵素認識サイトの配列を持つプライマーでPCRを行なうことにより、制限酵素認識サイトの導入を行なった。プライマーのDNA配列は表３にあるとおりである。具体的には、AGT1あるいはMAL21遺伝子が挿入されたプラスミドpCR(登録商標)2.1-TOPOを鋳型として、表４に示したプライマーの組み合わせで、PCRを行うことにより、AGT1遺伝子については、AGT1-SaS, AGT1-SaK AGT1-SK, AGT1-SB及びAGT1-KBの５つのDNA断片、MAL21遺伝子については、MAL21-SaS, MAL21-SaK, MAL21-SK, MAL21-SB及びMAL21-KBの５つのDNA断片を得た。各断片の模式図は、下記の表２および３に示される。得られたDNA断片はプラスミドpCR(登録商標)2.1-TOPOに挿入して、シークエンスを行い、導入した制限酵素サイト以外に元の遺伝子から置換された塩基がないことを確認した。各々のDNA断片はプラスミドより制限酵素、SacI, SalI, KpnI, BamHIなどを用いて切り出し、下記ハイブリッドトランスポーター遺伝子の構築に用いた。
＜ハイブリッドトランスポーター遺伝子の構築＞
　図７に示した６種類のハイブリッドトランスポーター遺伝子、AAM, AMA, AMM, MAA, MAM及びMMAを構築した。各々のハイブリッドトランスポーターは上記項で得られたそれぞれの断片を、図７に示した組み合わせで、発現ベクターpYCGPYのSacI-BamHIサイトに組み込むことにより取得した。詳しくは、pYCGPYをSacIとBamHIで切断し、Bacterial alkali phosphataseで脱リン酸化処理したものを用意して、その直線化ベクターと、上記DNA断片をライゲーション後、E.coli DH5αに形質転換した。アンピシリン耐性となったコロニー数個よりプラスミドを調製し、MAL21あるいはAGT1遺伝子にしか存在しない制限酵素の組み合わせで切断後、アガロースゲル電気泳動を行なうことにより、検出された断片の大きさから、目的のハイブリッドトランスポーター遺伝子がベクターpYCGPYに組み込まれたことを確認した。pYCGPYにおいて、トランスポーター遺伝子はPYK1プロモーターより転写される。また、pYCGPYからSacI-BamHIで各々のハイブリッドトランスポーターを切り出し、発現ベクターpJHXSBのSacI-BamHIサイトに組み込んだ。pJHXSBにおいて、トランスポーター遺伝子はTPI1プロモーターより転写される。
　なお、本発明において使用されるMMA、MAA、MAMなどの変異体に関する表記は、最初の文字が１２回膜貫通ドメインのＮ末側ドメイン（５'側）に由来するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、２番目の文字が１２回膜貫通領域に由来するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、３番目の文字が１２回膜貫通ドメインのＣ末側ドメイン（３'側）に由来するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ連続して含むヌクレオチド配列であることを意味する。文字ＭはMAL21由来であること、文字ＡはAGT1由来であることを意味する。すなわち、野生型AGT1はAAAと表記でき、AGT1の１２回膜貫通ドメインのＮ末側をMAL21の対応するドメインと置換したハイブリッド変異体はMAAと表記できる。
＜酵母の形質転換＞
　前記方法により得られた天然型、あるいはハイブリッドトランスポーター遺伝子を発現することのできるプラスミドで酵母を形質転換した。形質転換株（アルファーグルコシドトランスポーター遺伝子を持たない株を宿主とする）は、使用したプラスミドのマーカーに従って、pYCGPYについては、G418を300 μg/ml含むYPD培地で選択した。また、pJHXSBについては、宿主にHH1001などのura-株を用いた場合、ウラシルを含まない合成培地、例えば、最少培地（Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g/L、グルコース　20 g/L)などで選択した。
＜トランスポータータンパクのマルトースあるいはマルトトリオース取り込み活性の評価＞
　天然型トランスポーター、あるいは、構築したハイブリッドトランスポーターの形質転換株（アルファーグルコシドトランスポーター遺伝子を持たない株を宿主とする）における、導入したトランスポーター遺伝子の発現は、0.5 %のマルトースあるいはマルトトリオースを唯一の炭素源とする最少培地（ただし、栄養要求性のある形質転換株については、その栄養素を含む）での生育の有無により調べることができる。例えば、供試菌株をYPDプレート(イーストエキストラクト　10 g/L,ポリペプトン　20 g/L, グルコース 20 g/L)から一白金耳とって、1 mlの滅菌水で一度洗浄した後、OD660=0.2になるように滅菌水に再懸濁した。これを集菌して、もう一度1 mlの滅菌水に懸濁した後、細胞懸濁液をマルトース又はマルトトリオースを唯一の炭素源とする試験培地に直接ストリークして生育を確認することにより、マルトース又はマルトトリオースの取り込み活性を持つことを確認した。
＜トランスポータータンパクの2-デオキシグルコース耐性の評価＞
　2-デオキシグルコース（2-DOG）は　2-DOG-6リン酸以上に代謝されないため、炭素源にはなり得ない糖アナログであるが、グルコースと同じレベルにグルコースリプレッション、あるいはグルコースによる不活化を起こすことが知られている。従って、このプレートで生育する株は、グルコースによる不活化を受けにくいアルファーグルコシドトランスポーターを持つ可能性が高い。2-DOGに対する耐性を調べるため、0～2 mMの2－デオキシグルコースを含有するマルトース等の最少培地（Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g/L、 マルトースなど 20 g/L、ただし、栄養要求性のある形質転換株については、その栄養素を含む)、あるいは、0～2 mMの2－デオキシグルコースを含有するマルトース完全合成培地(SCM)（Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g/L、 マルトース20 g/L、アデニン硫酸 20 mg/ml、ウラシル20 mg/ml、L-トリプトファン20 mg/ml、L-ヒスチジン塩酸塩 20 mg/ml、L-アルギニン塩酸塩20 mg/ml、L-メチオニン20 mg/ml、L-チロシン30 mg/ml、L-ロイシン30 mg/ml、L-イソロイシン30 mg/ml、L-リジン塩酸塩30 mg/ml、L-フェニルアラニン50 mg/ml、L-グルタミン酸 100 mg/ml、L-アスパラギン酸 100 mg/ml、L-バリン150 mg/ml、L-トレオニン200 mg/ml、L-セリン400 mg/ml)を作製した。各トランスポーター発現株のOD660=0.2の細胞懸濁液の希釈系列を試験培地に各々3μlスポットし、30 ℃にて2～3日培養することによって調べた。
＜トランスポータータンパクの菌体内蓄積量の測定＞
　トランスポータータンパクの菌体内蓄積量は、例えばウエスタンブロッティングにより調べることができる。例えば、供試菌株を10 mlの培養液から対数増殖期で回収し、溶解バッファー（8 M 尿素、5 % (w/v) SDS、40 mM Tris-HCl (pH6.8)、0.1 mM EDTA、1 % β-メルカプトエタノール）中でグラスビーズによる撹拌によって破壊し、細胞抽出液を得る。総タンパク60 μgのサンプルをSDS-ゲル電気泳動で展開し、ニトロセルロース膜に転写した後にウサギポリクローナル抗Mal61p抗体を用いてウエスタンブロッティングを行う。
　ウサギポリクローナル抗Mal61p抗体は以下のようにして取得した。Mal61pのＮ末領域 (Met1-Leu181) をコードするDNAをpET Expression vector(Novagen社)のGST tagの下流につなぎ、大腸菌BL21(DE3)に形質転換し、その形質転換体の細胞破砕液をGST bind resin columnにアプライして、カラムに結合したタンパクを溶出する事によって調製した。詳しくは、Novagen 社のpET Expression System, GST・BindTM Affinity Resins(Novagen社)に添付されたマニュアルのとおりである。調製した融合タンパクは、SDS-PAGEにて純度を確認した後、これを抗原としてウサギを免疫し、ポリクローナル抗体を得た。抗体の有効性については、α－グルコシドトランスポーター遺伝子を発現させた酵母株と、当遺伝子を持たないその宿主株とをYPM培地(イーストエキストラクト　10 g/L,ポリペプトン　20 g/L, マルトース　5.0 g/L)で培養し、その細胞破砕液を、本抗体を用いて上記方法にてウエスターンブロッティングを行なうことにより確認した。本抗体により、α－グルコシドトランスポーター遺伝子を発現させた酵母株破砕液だけに、68 kDaのα－グルコシドトランスポーターの分子量に一致するポジティブバンドを検出した。なお、ハイブリッドトランスポーターについては、N末部がMal21p型であるトランスポーター、MMAp, MAMp及びMAApのみ、本抗体で検出可能である。
　Agt1pの菌体内蓄積量は、Agt1pのC末端部に、ヘマトアグルチニンタグをタンデムに2個つないだ融合タンパクをコードする遺伝子を構築し、上述の方法にてそれを発現する株を取得して用いた。抗体は、マウスモノクローナル抗ヘマトアグルチニン抗体（Covance, Research, Products, Inc.社）を用いた。
＜トランスポータータンパクの分解速度の測定＞
　各トランスポータータンパクを発現する株をYPDに植菌して、30 ℃にて一晩震盪培養した。培養液を、OD660=1.0になるようにYPM培地に植菌し、30 ℃にて2.5時間、震盪培養し、集菌した。60 OD660unitの細胞を測り取り、あらかじめ30 ℃にてインキュベートしておいた分解速度測定用培地（Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and ammonia 1.7 g/L、 グルコース 20 g/L、シクロヘキシミド 25 mg/L）30mlに懸濁し、30 ℃でインキュベートした。 細胞懸濁液は適当な時間（0、10、20、30及び40分あるいは0、30、60、90及び120 分）5mlサンプリングし、速やかに遠心して上澄みを捨て、細胞をエタノールドライアイスで凍結した。凍結した細胞は、上記の方法にてトランスポータータンパクを検出し、タンパクバンドのインテンシティーを測定し、その減少速度から半減期を求めた。
＜マルトース資化能の評価＞
　トランスポータータンパク質を構成的に発現している酵母によるマルトースの資化について、当該酵母に適した条件下にて酵母を好気培養あるいは醗酵させ、培地中のマルトース量を測定することにより評価した。糖の測定は、当業者に周知の方法、例えばIR検出器を用いた液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
実施例１：Mal21pとAgt1pのグルコース存在下での分解速度
　PCRにより取得した、MAL21遺伝子とAGT1遺伝子を発現ベクターpYCGPYに挿入し、酵母Δ152に形質転換した。0.5 ％のマルトースあるいは、マルトトリオースを唯一の炭素源として含み、20mg/Lのウラシル、20mg/Lのヒスチジン、30mg/Lのロイシン、300μg／mlのジェネティシンを含む最少培地(MM)に形質転換株をストリークした（図５）。MAL21を持つ株はマルトース培地でしか生育できなかったが、AGT1を持つ株はマルトース、マルトトリオースどちらの培地でも生育し、AGT1だけが両糖を取り込むことができることを確認した。次にAgt1pのC末端部にヘマトアグルチニンタグをタンデムに2個つないだ融合タンパクをコードする遺伝子、AGT1-2HAを構築し、発現ベクターpJHXSBに挿入した。MAL61とMAL21もpJHXSBに挿入した。これらを酵母HH1001に形質転換した。両形質転換株を用いて、試験方法の項に示した方法で、グルコース存在下での分解速度をウエスターンブロッティングにて調べた。その結果を図６に示す。Agt1-2HApはMal61pやMal21pに比べ、半減期が短い（図６を参照して、Agt1-2HAp:14分、 Mal61p:25分、Mal21p:118分）事がわかった。また、同じα－グルコシドトランスポーターでもMal21pはMal61pに比べ、はるかに長い半減期を持つことがわかった（Mal61p:25分, Mal21p:118分）。
実施例２：ハイブリッドトランスポーターの構築とその基質特異性の確認
　Agt1pとMal21pはMFS(Major facilitated sugar transporter)の仲間に属し、そのアミノ酸配列の類似性から、12の膜貫通ドメインを持ち、N末端とC末端は細胞質ドメインだと考えられている。Agt1pとMal21pの基質特異性や活性に関わる部位については知られていない。両者のアミノ酸配列のアラインメントを見ると、N末端とC末端は細胞質ドメインと考えられる部分は類似性が低く、中央の12の膜貫通ドメイン部分は類似性が高い（図３を参照のこと）。そこで、我々は中央の12の膜貫通ドメイン部分は取り込み活性を持ち、あるいは基質特異性を左右する部分である可能性があると考えた。AGT1とMAL21遺伝子をそれぞれ、N末あるいはC末の細胞質ドメインをコードする部分と、中央部の12回膜貫通ドメインをコードする部分とを両端に制限酵素サイトを持つ形で、PCRにより取得した。使用したプライマーを表３に、取得した断片と使用したプライマー対との関係を表４に示した。これらを組み合わせることにより数種のハイブリッドトランスポーター遺伝子を構築した。使用した組換え位置を図３中の十字印として表し、各ハイブリッドの名称および模式図を図７に示す。詳しくは試験方法に述べた通りである。図７に示した、各ハイブリッドトランスポーター遺伝子を挿入した発現ベクター、pYCGPYを酵母Δ152に形質転換した。0.5 ％のマルトースあるいは、マルトトリオースを唯一の炭素源とし、20mg/Lのウラシル、20mg/Lのヒスチジン、30mg/Lのロイシン、300μg／mlのジェネティシンを含む最少培地(MM) (MM：Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g/L、5 g/L マルトースあるいはマルトトリオース、20 mg/L ヒスチジン、30 mg/L ロイシン、20 mg/L ウラシル300μg／ml ジェネティシン)に形質転換株をストリークした（図８）。その結果、中央部の12回膜貫通ドメインがAgt1p由来である3つのハイブリッドトランスポーター、AAMp、MAMp、MAApはマルトトリオースを取り込む活性を持つことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 （上記の配列はそれぞれ配列番号：２３～３２に記載される）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例３：ハイブリッドトランスポーターの2-デオキシグルコース耐性
　実施例２に記載したハイブリッドトランスポーター遺伝子をpYCGPYからSacI-BamHIで切り出し、pJHXSBのSacI-BamHIサイトに組み込んだ。構築した各々の発現ベクターをHH1001に形質転換した。HH1001はmal-株であるX2180-1Aのura3-のシブリングであり、TPI1p::MAL32(マルターゼ遺伝子をコードしている)が組み込まれているので、マルターゼが構成的に発現している。2 ％のマルトースを含む完全合成培地(SCM)に2-デオキシグルコース(2-DOG)を0 mM～2 mM加えたプレートを作製し、試験方法に記載したように、各形質転換株の2-DOG 耐性を調べた。2-DOGは2-DOG-6リン酸以上に代謝されないため、炭素源にはなり得ない糖アナログであるが、グルコースと同じレベルにグルコースリプレッション、あるいはグルコースによる不活化を起こすことが知られている。従って、このプレートで生育する株は、グルコースによる不活化を受けにくいα－グルコシドトランスポーターである可能性が高い。その結果を図９に示す。MAL21由来のN末の細胞質ドメインを持つハイブリッドトランスポーター MMAp、MAApは1 mMの2-DOGの培地でも生育した。また、MAMpは2 mMの2-DOGの培地でも生育し、天然型のMal21pと同じ2-DOGに対する耐性を持っており、グルコースによる分解誘導を受けにくいことがわかった。
実施例４：ハイブリッドトランスポーターのグルコース存在下での分解速度
　実施例３で示したとおり、MAL21由来のN末の細胞質ドメインを持つハイブリッドトランスポーター MMAp、MAAp及びMAMpはグルコースによる分解誘導を受けにくいと考えられる。そこでこれを確かめるため、試験方法に示した方法で、グルコース存在下でのMMAp、MAAp及びMAMpの分解速度を測定した（図１０）。いずれのハイブリッドトランスポーターもAgt1-2HApよりも長い半減期を持っていた。特にMAMpは半減期が119分で、Mal21p（118分）とほぼ同じ半減期を持っており、グルコースにより速やかに分解されるアルファーグルコシドトランスポーターであるAgt1pを改良し、分解されにくいトランスポーターを構築することが出来た。
参考例１：MAL21を高発現させた下面ビール酵母による、発泡酒麦汁醗酵試験
　グルコース誘導性分解に対する耐性を持つトランスポーター、MAL21をプラスミドpUP3GLPのXbaI(あるいはSacI)-BamHIサイトに組み込んだ。pUP3GLPを図１４に示す。pUP3GLP はYIp型プラスミドであり、トランスポーター遺伝子はグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（TDH3p）によって発現する。各プラスミドをURA3の中にあるEcoRVサイトで切断後、下面ビール酵母（Weihenstephan 194）に形質転換し、0.3μg/mlのシクロヘキシミドを含むYPGプレート(イーストエキストラクト 10 g/L,ポリペプトン 20 g/L, ガラクトース 20　g/L)に塗布した。目的の発現カセットがWeihenstephan 194の染色体上のURA3遺伝子に挿入されたことはPCRによって確認した。
　Weihenstephan 194 (URA3::TDH3p::MAL21)と親株Weihenstephan 194 を2種類の発泡酒麦汁に植菌した。発泡酒麦汁は水を除く原料中の麦芽の使用比率が25％未満で、糖化スターチ、ホップなどを用いた麦汁である。発泡酒用麦汁のうちの１つは初期エキス濃度が14.0 ％で、グルコース 1.2 %、マルトース 6.6 %、マルトトリオース 2.2 %の組成比で糖が含まれている。もう一つのグルコースリッチ発泡酒麦汁は、初期エキス濃度が15.6 ％で、グルコース 4.7 %、マルトース 5.4 %、マルトトリオース 1.7 %の組成比で糖が含まれている。それぞれ、同じ量の麦汁（終濃度、麦芽比率25 %未満）に対して、糖組成の異なる糖化スターチを加えることにより調製した。各発泡酒麦汁に湿菌体を7.5 g/Lになるようにピッチングし、15 ℃にて醗酵を行い、醗酵中のもろみのマルトース濃度を測定した。その結果を図１１に示す。
　どちらの発泡酒麦汁においても、MAL21高発現株のマルトースの資化速度は、親株のWeihenstephan 194よりも著しく早くなった。特にグルコースリッチ発泡酒麦汁の場合、その効果は顕著であった。初期エキス濃度が高いということは、グルコース濃度が高いことを意味しており、グルコース誘導性分解に対する耐性を持つトランスポーターの効果が十分見られた。したがって、ハイブリッドトランスポーターMAAp又はMAMpを導入した酵母の場合は、例えば図１０および図１１の結果から、例えばグルコースなど単糖が高濃度の場合におけるマルトトリオースの資化促進が十分期待される。
　以上記載のように、アルファーグルコシドトランスポーターである、Agt1pは、他のα－グルコシドトランスポーターに比べて、グルコース存在下での半減期が短いことを発見した。さらに、同じα－グルコシドトランスポーターでも、Mal21pは、Mal61pとは異なり、グルコースによって分解されにくいことを発見した。6種類のハイブリッドトランスポーターを構築した結果、中央の12回膜貫通ドメインがAgt1p型であるハイブリッドトランスポーター、AAMp、MAAp及びMAMpはいずれもマルトトリオースを取り込むことを見出した。また、N末の細胞質ドメインがMal21p型であるハイブリッドトランスポーターMAAp、MMAp及びMAMpはいずれもAgt1pよりもグルコース存在下で分解されにくいことを見出した。これらの中で、Mal21pのN末とC末の細胞質ドメインを持ち、中央の12回膜貫通ドメインだけがAgt1p型であるハイブリッドトランスポーターMAMは、Mal21pと同程度の長い半減期を持ち、かつマルトトリオースを取り込めるため、その変異型トランスポーターを発現する酵母（実験室株、醸造用酵母を問わない）を用いれば、もろみ中のマルトトライオースなど、そのトランスポーターが取り込むことのできる糖の資化を早めることができる。特にグルコースなど単糖の濃度が高い時にはより有効である。

Claims (16)

  1. 　グルコース誘導性不活化／分解耐性を有するトランスポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、以下の(a)～(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチドからなる１２回膜貫通ドメインコード領域を含み、５'側配列及び／又は３'側配列を異種ポリヌクレオチドと組み換えてなるポリヌクレオチド：
    　(a)配列番号：３の307～1659番目の塩基配列又は配列番号：５の283～1641番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　(b)配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
    　(c)配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列において、1～10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；及び
    　(d)配列番号：４の103～553番目のアミノ酸配列又は配列番号：６の95～547番目のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
  2. 　異種ポリヌクレオチド配列が配列番号：１の１２回膜貫通ドメインの５'側配列及び／又は３'側配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 　１２回膜貫通ドメインコード領域と５'側配列との組換え位置が１２回膜貫通ドメインの予測TMD1コード領域内であり、１２回膜貫通ドメインと３'側配列との組換え位置が１２回膜貫通ドメインの予測TMD12コード領域開始位置から予測TMD12コード領域終止位置より３'側に96塩基以内の領域内であって、かつ配列番号：２と配列番号：４との対応するアミノ酸配列において同一性が80％以上の領域内である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 　１２回膜貫通ドメインコード領域と５’側配列との組換え位置が配列番号：１又は配列番号：５の175番目の塩基より予測TMD1コード領域終止位置までの領域内であり、１２回膜貫通ドメインコード領域と３'側配列との組換え位置が予測TMD12コード領域開始位置から予測TMD12コード領域終止位置より３'側に180塩基以内の領域内である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  5. 　配列番号：１３、１５又は１７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１～４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  6. 　配列番号：１４、１６又は１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項１～４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  7. 　ＤＮＡである、請求項１～６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
  9. 　請求項１～７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  10. 　請求項９に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
  11. 　請求項９に記載のベクターを導入することによって、オリゴ糖資化能が向上した請求項１０に記載の醸造用酵母。
  12. 　請求項８に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってオリゴ糖資化能が向上した請求項１１に記載の醸造用酵母。
  13. 　請求項１０～１２のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
  14. 　醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１３に記載の酒類の製造方法。
  15. 　醸造する酒類がワインである請求項１３に記載の酒類の製造方法。
  16. 　請求項１３～１５のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
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