JPH06245750A - ビールの製造法 - Google Patents
ビールの製造法Info
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- JPH06245750A JPH06245750A JP5038589A JP3858993A JPH06245750A JP H06245750 A JPH06245750 A JP H06245750A JP 5038589 A JP5038589 A JP 5038589A JP 3858993 A JP3858993 A JP 3858993A JP H06245750 A JPH06245750 A JP H06245750A
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- JP
- Japan
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- maltose
- concentration
- yeast
- wort
- gene
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 高濃度麦汁を発酵させてビールを醸造する方
法を提供する。 【構成】 グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子のプロモーターおよび該プロモーターの制御下
にあるマルトースパーミアーゼの構造遺伝子を含有する
酵母を用いて高濃度麦汁を発酵させ、高濃度ビールを得
ることを特徴とするビールの製造方法。 【効果】 従来の原麦汁のエキス濃度の約２倍のエキス
を含有する高濃度麦汁を発酵させてビールを製造するこ
とができる。
法を提供する。 【構成】 グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子のプロモーターおよび該プロモーターの制御下
にあるマルトースパーミアーゼの構造遺伝子を含有する
酵母を用いて高濃度麦汁を発酵させ、高濃度ビールを得
ることを特徴とするビールの製造方法。 【効果】 従来の原麦汁のエキス濃度の約２倍のエキス
を含有する高濃度麦汁を発酵させてビールを製造するこ
とができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビールの高濃度醸造法
に関する。さらに具体的には、マルトース高発酵性酵母
を育種し、それを用いて糖度の高い麦汁を発酵させて得
る高濃度ビールの製造法に関する。なお本発明において
「高濃度ビール」とは、高濃度麦汁を発酵させることに
より得られたビールのことである。また「高濃度麦汁」
とは、麦汁のエキス分を各々のビールの製造法において
通常よりも上げた麦汁のことである。
に関する。さらに具体的には、マルトース高発酵性酵母
を育種し、それを用いて糖度の高い麦汁を発酵させて得
る高濃度ビールの製造法に関する。なお本発明において
「高濃度ビール」とは、高濃度麦汁を発酵させることに
より得られたビールのことである。また「高濃度麦汁」
とは、麦汁のエキス分を各々のビールの製造法において
通常よりも上げた麦汁のことである。
【０００２】
【従来の技術】従来ビールの製造においては、エキス濃
度１１％前後の原麦汁を発酵させてアルコール濃度４．
５〜５％前後のビールを得ている。ビールの生産性向上
のために、世界中のビール会社で高濃度醸造法が採用さ
れている。高濃度醸造法（highgravity brewing) と
は、製造しようとするビールよりも高い原麦汁濃度のビ
ールを与える麦汁を醗酵させた後、これを水で希釈して
所定原麦汁濃度のビールとする方法である（The BREWER
S DIGEST、第５１巻、第３４頁（１９７６年））。な
お、原麦汁のエキス濃度とは比重計で測定した原麦汁の
比重を同じ比重を有する糖の濃度（重量／重量％）とし
て表わしたものである。
度１１％前後の原麦汁を発酵させてアルコール濃度４．
５〜５％前後のビールを得ている。ビールの生産性向上
のために、世界中のビール会社で高濃度醸造法が採用さ
れている。高濃度醸造法（highgravity brewing) と
は、製造しようとするビールよりも高い原麦汁濃度のビ
ールを与える麦汁を醗酵させた後、これを水で希釈して
所定原麦汁濃度のビールとする方法である（The BREWER
S DIGEST、第５１巻、第３４頁（１９７６年））。な
お、原麦汁のエキス濃度とは比重計で測定した原麦汁の
比重を同じ比重を有する糖の濃度（重量／重量％）とし
て表わしたものである。
【０００３】その具体的方策としては、（１）通常発酵
温度よりも高い温度を採用する、（２）麦汁への通気量
を増加させる、（３）酵母の添加量を増加させる、およ
びそれらの組み合わせである。通常のビールを製造する
場合には、これらの方法では原麦汁エキス濃度１５％程
度の高濃度醸造が限界であると言われている。
温度よりも高い温度を採用する、（２）麦汁への通気量
を増加させる、（３）酵母の添加量を増加させる、およ
びそれらの組み合わせである。通常のビールを製造する
場合には、これらの方法では原麦汁エキス濃度１５％程
度の高濃度醸造が限界であると言われている。
【０００４】原麦汁エキス濃度１５％以上の高濃度醸造
を行なった場合に生じる問題点として、まず一番に上げ
られるのは、発酵中期から後期にかけての発酵速度の著
しい低下である。麦汁中に含まれる糖質は、主にマルト
ース、マルトトリオース、グルコース、フラクトース、
シュークロースである。酵母は、グルコース、フラクト
ース、シュークロースを先に資化し、その後にマルトー
ス、マルトトリオースを資化する。従って、発酵中期か
ら発酵後期にかけては、もろみ中の資化性糖はマルトー
ス、マルトトリオースしか存在していない。しかもその
存在比は、３：１と圧倒的にマルトースが多い。
を行なった場合に生じる問題点として、まず一番に上げ
られるのは、発酵中期から後期にかけての発酵速度の著
しい低下である。麦汁中に含まれる糖質は、主にマルト
ース、マルトトリオース、グルコース、フラクトース、
シュークロースである。酵母は、グルコース、フラクト
ース、シュークロースを先に資化し、その後にマルトー
ス、マルトトリオースを資化する。従って、発酵中期か
ら発酵後期にかけては、もろみ中の資化性糖はマルトー
ス、マルトトリオースしか存在していない。しかもその
存在比は、３：１と圧倒的にマルトースが多い。
【０００５】マルトースは、酵母のマルトースパーミア
ーゼによって、細胞内に取り込まれた後、マルターゼに
よって２個のグルコースに加水分解され、エムブデン−
マイヤーホッフ（Embden-Meyerhof)の経路を介して二酸
化炭素とエタノールに転化する。この２つの酵素は、転
写レベルで、マルトースによって誘導され、グルコース
によって抑制される。
ーゼによって、細胞内に取り込まれた後、マルターゼに
よって２個のグルコースに加水分解され、エムブデン−
マイヤーホッフ（Embden-Meyerhof)の経路を介して二酸
化炭素とエタノールに転化する。この２つの酵素は、転
写レベルで、マルトースによって誘導され、グルコース
によって抑制される。
【０００６】麦汁中にはグルコースが、資化性糖の約１
７％含まれるため、酵母のマルトース代謝系遺伝子は、
発酵初期の段階でグルコースによる抑制を受け、マルト
ースの資化が、大幅に遅れることになる。この現象は、
高濃度醸造の際には、さらに顕著となり、マルトース発
酵が遅れるばかりでなく、発酵終了時に、残糖として多
量のマルトースが、資化されないまま残ってしまう。こ
のような問題点によって、高濃度醸造、例えば通常の２
倍の濃度の麦汁を醗酵させることは、従来の技術では不
完全であった。
７％含まれるため、酵母のマルトース代謝系遺伝子は、
発酵初期の段階でグルコースによる抑制を受け、マルト
ースの資化が、大幅に遅れることになる。この現象は、
高濃度醸造の際には、さらに顕著となり、マルトース発
酵が遅れるばかりでなく、発酵終了時に、残糖として多
量のマルトースが、資化されないまま残ってしまう。こ
のような問題点によって、高濃度醸造、例えば通常の２
倍の濃度の麦汁を醗酵させることは、従来の技術では不
完全であった。
【０００７】特開平１−１５３０８２には、パン酵母に
よるドゥ発酵を改善するために、グルコースによる抑制
を受けないアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモ
ーターとマルターゼ遺伝子及びマルトースパーミアーゼ
遺伝子とを含むプラスミドを導入したパン酵母を使用す
ることが開示されている。しかしながら、これをビール
の高濃度醸造に利用するための具体的な記載はない。
よるドゥ発酵を改善するために、グルコースによる抑制
を受けないアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモ
ーターとマルターゼ遺伝子及びマルトースパーミアーゼ
遺伝子とを含むプラスミドを導入したパン酵母を使用す
ることが開示されている。しかしながら、これをビール
の高濃度醸造に利用するための具体的な記載はない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、酵母のマル
トース代謝系遺伝子を改良することにより、マルトース
発酵を促進し、高濃度醸造を実現することを目的とする
ものである。
トース代謝系遺伝子を改良することにより、マルトース
発酵を促進し、高濃度醸造を実現することを目的とする
ものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
め、本発明は、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のプロモーターおよび該プ
ロモーターの制御下にあるマルトースパーミアーゼの構
造遺伝子を含有する酵母を用いて高濃度麦汁を発酵さ
せ、高濃度ビールを得ることを特徴とするビールの製造
法を提供する。
め、本発明は、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のプロモーターおよび該プ
ロモーターの制御下にあるマルトースパーミアーゼの構
造遺伝子を含有する酵母を用いて高濃度麦汁を発酵さ
せ、高濃度ビールを得ることを特徴とするビールの製造
法を提供する。
【００１０】
【作用】本発明においては、グルコースによる抑制を受
けないＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターおよび該プロモ
ーターの制御下にあるマルトースパーミアーゼの構造遺
伝子が導入されたビール酵母を使用するので、グルコー
スの存在下でもマルトースの資化が抑制されず、この結
果グルコースの消失を待たずにマルトースが資化発酵さ
れるため発酵速度が上昇し、高濃度麦汁によるビール醸
造が可能となる。
けないＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターおよび該プロモ
ーターの制御下にあるマルトースパーミアーゼの構造遺
伝子が導入されたビール酵母を使用するので、グルコー
スの存在下でもマルトースの資化が抑制されず、この結
果グルコースの消失を待たずにマルトースが資化発酵さ
れるため発酵速度が上昇し、高濃度麦汁によるビール醸
造が可能となる。
【００１１】
【具体的な説明】サッカロミセス・セレビシエー(Sacch
aromyces cerevisiae) では、マルトース代謝系遺伝子
としてＭＡＬ１，ＭＡＬ２，ＭＡＬ３，ＭＡＬ４，ＭＡ
Ｌ６の５つの重複遺伝子が知られており、そのうちいず
れか一つでも活性なアレル（遺伝子座）であれば、マル
トース発酵性となる。それぞれの遺伝子座には、マルト
ースパーミアーゼ、マルターゼ、そして、これら構造遺
伝子の発現に必要な正の制御因子の３つの遺伝子がコー
ドされている。
aromyces cerevisiae) では、マルトース代謝系遺伝子
としてＭＡＬ１，ＭＡＬ２，ＭＡＬ３，ＭＡＬ４，ＭＡ
Ｌ６の５つの重複遺伝子が知られており、そのうちいず
れか一つでも活性なアレル（遺伝子座）であれば、マル
トース発酵性となる。それぞれの遺伝子座には、マルト
ースパーミアーゼ、マルターゼ、そして、これら構造遺
伝子の発現に必要な正の制御因子の３つの遺伝子がコー
ドされている。
【００１２】先に述べたように、このマルトースパーミ
アーゼおよびマルターゼは、転写レベルで、マルトース
によって誘導され、グルコースによって抑制される。従
って、発酵初期の段階で、麦汁中のグルコースによっ
て、これらの酵素が抑制されることにより、マルトース
の資化が、大幅に遅れることになる。
アーゼおよびマルターゼは、転写レベルで、マルトース
によって誘導され、グルコースによって抑制される。従
って、発酵初期の段階で、麦汁中のグルコースによっ
て、これらの酵素が抑制されることにより、マルトース
の資化が、大幅に遅れることになる。
【００１３】本発明者らは、ＭＡＬ６座のマルトースパ
ーミアーゼ（ＭＡＬ６Ｔ）、マルターゼ（ＭＡＬ６
Ｓ）、および正の制御因子（ＭＡＬ６Ｒ）をクローニン
グし、それらの遺伝子のプロモーターをＧＡＰＤＨ（グ
リセルアルデヒド ３リン酸 デヒドロゲナーゼ）遺伝
子のプロモーターに置き換えることにより、グルコース
存在下でも、発現抑制を受けないような機構にして、各
々、もしくは組み合わせて、酵母細胞内に多コピーエピ
ゾーム、例えばプラスミドの形で導入するか、もしくは
染色体導入型プラスミドで染色体の組換えを行ない、マ
ルトース高発酵性酵母を育種し、初めて実際にビール酵
母を用いたビールの製造に適用できることを確認した。
本発明者らは、ビール酵母において、上記のマルトース
高発酵性酵母を育種し、実際のビール醸造の条件下で高
濃度醸造を行なった。
ーミアーゼ（ＭＡＬ６Ｔ）、マルターゼ（ＭＡＬ６
Ｓ）、および正の制御因子（ＭＡＬ６Ｒ）をクローニン
グし、それらの遺伝子のプロモーターをＧＡＰＤＨ（グ
リセルアルデヒド ３リン酸 デヒドロゲナーゼ）遺伝
子のプロモーターに置き換えることにより、グルコース
存在下でも、発現抑制を受けないような機構にして、各
々、もしくは組み合わせて、酵母細胞内に多コピーエピ
ゾーム、例えばプラスミドの形で導入するか、もしくは
染色体導入型プラスミドで染色体の組換えを行ない、マ
ルトース高発酵性酵母を育種し、初めて実際にビール酵
母を用いたビールの製造に適用できることを確認した。
本発明者らは、ビール酵母において、上記のマルトース
高発酵性酵母を育種し、実際のビール醸造の条件下で高
濃度醸造を行なった。
【００１４】先に挙げた特開平０１−１５３０８２で
は、マルトースの資化速度はマルターゼ（ＭＡＬ６Ｓ）
とマルトースパーミアーゼ遺伝子（ＭＡＬ６Ｔ）の両方
のプロモーターを置き換えて高発現化した株の方が、マ
ルトースパーミアーゼ遺伝子（ＭＡＬ６Ｔ）のみのプロ
モーターを置き換えた株よりも速かったが、本発明にお
いては、ビール醸造の条件下でのマルトース資化速度
は、マルトースパーミアーゼ遺伝子（ＭＡＬ６Ｔ）のみ
のプロモーターを置き換えた株のほうが、マルターゼ
（ＭＡＬ６Ｓ）とマルトースパーミアーゼ遺伝子（ＭＡ
Ｌ６Ｔ）の両方のプロモーターを置き換えた株よりも速
かった。
は、マルトースの資化速度はマルターゼ（ＭＡＬ６Ｓ）
とマルトースパーミアーゼ遺伝子（ＭＡＬ６Ｔ）の両方
のプロモーターを置き換えて高発現化した株の方が、マ
ルトースパーミアーゼ遺伝子（ＭＡＬ６Ｔ）のみのプロ
モーターを置き換えた株よりも速かったが、本発明にお
いては、ビール醸造の条件下でのマルトース資化速度
は、マルトースパーミアーゼ遺伝子（ＭＡＬ６Ｔ）のみ
のプロモーターを置き換えた株のほうが、マルターゼ
（ＭＡＬ６Ｓ）とマルトースパーミアーゼ遺伝子（ＭＡ
Ｌ６Ｔ）の両方のプロモーターを置き換えた株よりも速
かった。
【００１５】このことから、実際のビール醸造の条件下
では、マルトース発酵はマルターゼ活性よりも、マルト
ースの取り込み活性に依存していることが明らかになっ
た。さらに、本発明におけるマルトースパーミアーゼ遺
伝子（ＭＡＬ６Ｔ）のみを高発現化した株は、通常の２
倍の濃度の麦汁においても、マルトースを速やかに資化
し、外観醗酵度（原麦汁エキスに対する醗酵により消失
したエキスの％）６５％に達する時間は、親株に比べ約
３０％の短縮が認められた。麦汁の濃度を上げるため
に、グルコースシロップを添加して発酵を行うことも可
能である。
では、マルトース発酵はマルターゼ活性よりも、マルト
ースの取り込み活性に依存していることが明らかになっ
た。さらに、本発明におけるマルトースパーミアーゼ遺
伝子（ＭＡＬ６Ｔ）のみを高発現化した株は、通常の２
倍の濃度の麦汁においても、マルトースを速やかに資化
し、外観醗酵度（原麦汁エキスに対する醗酵により消失
したエキスの％）６５％に達する時間は、親株に比べ約
３０％の短縮が認められた。麦汁の濃度を上げるため
に、グルコースシロップを添加して発酵を行うことも可
能である。
【００１６】本発明によれば、一般に、従来法における
エキス濃度より高いエキス濃度の原麦汁を使用してビー
ルを醸造することができる。具体的には、本発明によれ
ばエキス濃度２０％以上の原麦汁を使用してビール醸造
を行うことができる。さらに好ましくは、本発明によれ
ばエキス濃度２４％以上の原麦汁を使用してビール醸造
を行うことができる。
エキス濃度より高いエキス濃度の原麦汁を使用してビー
ルを醸造することができる。具体的には、本発明によれ
ばエキス濃度２０％以上の原麦汁を使用してビール醸造
を行うことができる。さらに好ましくは、本発明によれ
ばエキス濃度２４％以上の原麦汁を使用してビール醸造
を行うことができる。
【００１７】
【実施例】以下の実験データは、本発明の例証のために
示される。これらの方法は、他のビール醸造用酵母、例
えばサッカロミセス・セレビシエーＩＦＯ １９５１，
ＩＦＯ １９５２，ＩＦＯ １９５３，ＩＦＯ １９５
４等に於ても、同様に使用されうる。
示される。これらの方法は、他のビール醸造用酵母、例
えばサッカロミセス・セレビシエーＩＦＯ １９５１，
ＩＦＯ １９５２，ＩＦＯ １９５３，ＩＦＯ １９５
４等に於ても、同様に使用されうる。
【００１８】実施例１．ＭＡＬ６遺伝子のクローニング ＭＡＬ６Ｓ，ＭＡＬ６ＴおよびＭＡＬ６Ｒの各遺伝子は
既にクローニングされており、その塩基配列が報告され
ている（S H Hong and J Marmur, Gene,Vol.41, p75-8
4, 1986, B Yao, P Sollitti and J Marmur, Gene, Vo
l.79, P189-197,1989, P Sollitti and J Marmur Mol G
en Gent Vol.213, P56-62 1988)。それらの情報をもと
に各遺伝子をクローニングした。
既にクローニングされており、その塩基配列が報告され
ている（S H Hong and J Marmur, Gene,Vol.41, p75-8
4, 1986, B Yao, P Sollitti and J Marmur, Gene, Vo
l.79, P189-197,1989, P Sollitti and J Marmur Mol G
en Gent Vol.213, P56-62 1988)。それらの情報をもと
に各遺伝子をクローニングした。
【００１９】研究用酵母ＮＣＹＣ７４−ＣＢ１１(MATa,
adel,MAL6)〔National Collectionof Yeast Cultures
（イギリス）において入手可能である。なお、この酵母
ＮＣＹＣ７４−ＣＢ１１は Saccharomyces cerevisiae
SAM 2034 と命名され、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌条第４１９８号（FERM BP-4198）として寄
託されている。〕より、染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解後、ショ糖密度勾配法により
約１０KbのＤＮＡ断片を分離した。
adel,MAL6)〔National Collectionof Yeast Cultures
（イギリス）において入手可能である。なお、この酵母
ＮＣＹＣ７４−ＣＢ１１は Saccharomyces cerevisiae
SAM 2034 と命名され、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌条第４１９８号（FERM BP-4198）として寄
託されている。〕より、染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解後、ショ糖密度勾配法により
約１０KbのＤＮＡ断片を分離した。
【００２０】大腸菌（E. coli) 用のプラスミドｐＢＲ
３２２（宝酒造社製）をＢａｍＨＩで切断後、アルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて酵素的に脱リ
ン酸し、ＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションを行っ
た。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（宝酒造社製）を形質
転換し、ジーンバンクとした。マルトース代謝系遺伝子
のクローン化は、合成ＤＮＡを用いたコロニーハイブリ
ダイゼーションによって行った。プローブは、Ａ２９１
（ＭＡＬ６Ｓ；５′−CGATGGCTGGGGTGATTTAAAAGGTATC−
３′）（配列番号：１）とＡ３４１（ＭＡＬ６Ｒ；５′
−GGTATTGCGAAACAGTCTTGCG−３′）（配列番号：２）を
合成し、用いた。
３２２（宝酒造社製）をＢａｍＨＩで切断後、アルカリ
フォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて酵素的に脱リ
ン酸し、ＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションを行っ
た。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（宝酒造社製）を形質
転換し、ジーンバンクとした。マルトース代謝系遺伝子
のクローン化は、合成ＤＮＡを用いたコロニーハイブリ
ダイゼーションによって行った。プローブは、Ａ２９１
（ＭＡＬ６Ｓ；５′−CGATGGCTGGGGTGATTTAAAAGGTATC−
３′）（配列番号：１）とＡ３４１（ＭＡＬ６Ｒ；５′
−GGTATTGCGAAACAGTCTTGCG−３′）（配列番号：２）を
合成し、用いた。
【００２１】Ａ２９１とＡ３４１にハイブリダイズする
コロニーから、プラスミドを抽出し、制限酵素解析とサ
ザンハイブリダイゼーションの結果、ＭＡＬ６Ｓを含む
クローンｐＭＡＬ６Ｓ（図１）と、ＭＡＬ６ＴとＭＡＬ
６Ｒを含むクローンｐＭＡＬ６ＴＲ（図３）を選択し
た。さらに、ＭＡＬ６Ｓは、約４．５KbのＨｉｎｄ III
−ＳａｌＩ断片に含まれることから、この断片をｐＵＣ
１９（宝酒造社製）のＨｉｎｄ III−ＳａｌＩ部位にサ
ブクローニングしてｐＭＡＬ６ＳＨＳを作成した。
コロニーから、プラスミドを抽出し、制限酵素解析とサ
ザンハイブリダイゼーションの結果、ＭＡＬ６Ｓを含む
クローンｐＭＡＬ６Ｓ（図１）と、ＭＡＬ６ＴとＭＡＬ
６Ｒを含むクローンｐＭＡＬ６ＴＲ（図３）を選択し
た。さらに、ＭＡＬ６Ｓは、約４．５KbのＨｉｎｄ III
−ＳａｌＩ断片に含まれることから、この断片をｐＵＣ
１９（宝酒造社製）のＨｉｎｄ III−ＳａｌＩ部位にサ
ブクローニングしてｐＭＡＬ６ＳＨＳを作成した。
【００２２】さらにＭＡＬ６Ｓの５′非翻訳部分を除く
ためにｐＭＡＬ６ＳＨＳをＢｇｌIIとＳｍａＩで切断
後、アガロースゲル電気泳動し、最大の断片を分離し
た。さらにｐＭＡＬ６ＳＨＳをＢｇｌIIとＳａｌＩで切
断後、最小断片を分離し、さらにＲｓａＩで切断後、前
出のＢｇｌII−ＳｍａＩ断片をライゲーションし、ｐＵ
Ｃ１９ＭＡＬ６ＳΔＢｇｌ II を得た。
ためにｐＭＡＬ６ＳＨＳをＢｇｌIIとＳｍａＩで切断
後、アガロースゲル電気泳動し、最大の断片を分離し
た。さらにｐＭＡＬ６ＳＨＳをＢｇｌIIとＳａｌＩで切
断後、最小断片を分離し、さらにＲｓａＩで切断後、前
出のＢｇｌII−ＳｍａＩ断片をライゲーションし、ｐＵ
Ｃ１９ＭＡＬ６ＳΔＢｇｌ II を得た。
【００２３】ｐＵＣ１９ＭＡＬ６ＳΔＢｇｌ II をＢｇ
ｌ II およびＨｉｎｄ IIIで切断して得られる約３．２
Kbの断片とｐＭＡＬ６ＳＨＳをＢｇｌIIおよびＸｂａＩ
で切断して得られる約１．２Kbの断片、さらにｐＭＡＬ
６ＳＨＳをＸｂａ I−Ｈｉｎｄ III で切断して得られ
る約２．６Kbの断片の３つを同時にライゲーションし、
ｐＵＣ１９ＭＡＬ６Ｓを得た（図１参照）。
ｌ II およびＨｉｎｄ IIIで切断して得られる約３．２
Kbの断片とｐＭＡＬ６ＳＨＳをＢｇｌIIおよびＸｂａＩ
で切断して得られる約１．２Kbの断片、さらにｐＭＡＬ
６ＳＨＳをＸｂａ I−Ｈｉｎｄ III で切断して得られ
る約２．６Kbの断片の３つを同時にライゲーションし、
ｐＵＣ１９ＭＡＬ６Ｓを得た（図１参照）。
【００２４】実施例２．プラスミドの構成 （１）ｐＹＭＳ２２２Ｇ このプラスミドは、酵母２μｍプラスミドの複製起点を
持つＹＥｐ型のプラスミドであり、酵母中で自己複製が
可能であって、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター（J.P.
Holland, M.J.Holland, J.Biol.Chem.vol.254, p9839-9
845,1976) に連結されたマルターゼをコードする遺伝子
（ＭＡＬ６Ｓ）を有し、形質転換マーカーとしてＴＲＰ
１遺伝子及び薬剤耐性遺伝子であるＧ４１８耐性遺伝子
（A.Oka,H.Sugisaki, and M.Takanami,J.Mol.Biol.vol.
147, p217-226, 1981) を有する。
持つＹＥｐ型のプラスミドであり、酵母中で自己複製が
可能であって、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター（J.P.
Holland, M.J.Holland, J.Biol.Chem.vol.254, p9839-9
845,1976) に連結されたマルターゼをコードする遺伝子
（ＭＡＬ６Ｓ）を有し、形質転換マーカーとしてＴＲＰ
１遺伝子及び薬剤耐性遺伝子であるＧ４１８耐性遺伝子
（A.Oka,H.Sugisaki, and M.Takanami,J.Mol.Biol.vol.
147, p217-226, 1981) を有する。
【００２５】具体的には、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモー
ターを含む酵母の発現プラスミドｐＹＥ２２ｍのマルチ
クローニングサイトのＥｃｏＲＩ部位にｐＵＣ１９ＭＡ
Ｌ６ＳをＥｃｏＲＩで部分分解して得られるマルターゼ
の構造遺伝子（ＭＡＬ６Ｓ、約２．０Kb）を連結してｐ
ＹＭＳ２２２を作成した。酵母の発現プラスミドｐＹＥ
２２ｍの作成方法は、特開平０４−２２８０７８に詳し
く記載されている。
ターを含む酵母の発現プラスミドｐＹＥ２２ｍのマルチ
クローニングサイトのＥｃｏＲＩ部位にｐＵＣ１９ＭＡ
Ｌ６ＳをＥｃｏＲＩで部分分解して得られるマルターゼ
の構造遺伝子（ＭＡＬ６Ｓ、約２．０Kb）を連結してｐ
ＹＭＳ２２２を作成した。酵母の発現プラスミドｐＹＥ
２２ｍの作成方法は、特開平０４−２２８０７８に詳し
く記載されている。
【００２６】一方、Ｇ４１８耐性の構造遺伝子を含むプ
ラスミドｐＧＲ１は、Agric.Biol.Chem.vol.54, NO.10,
p2689-2696.1990に記載されている方法で取得でき、こ
れをＥｃｏＲＩおよびＰｖｕｌＩで切断して得られるＧ
４１８耐性の構造遺伝子にＳａｌＩリンカーをつけてＥ
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片とし、これを上述のｐＹＥ２２
ｍのＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターとターミネーター
の間に挿入し、ｐＹＧ１を作成した。これをＨｉｎｄ I
IIで部分的に切断して得られる約２．５Kbの断片の両端
にＢａｍＨＩリンカーをつけ、ｐＹＭＳ２２２のＢａｍ
ＨＩ切断部位に挿入してｐＹＭＳ２２２Ｇを作成した
（図２参照）。
ラスミドｐＧＲ１は、Agric.Biol.Chem.vol.54, NO.10,
p2689-2696.1990に記載されている方法で取得でき、こ
れをＥｃｏＲＩおよびＰｖｕｌＩで切断して得られるＧ
４１８耐性の構造遺伝子にＳａｌＩリンカーをつけてＥ
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片とし、これを上述のｐＹＥ２２
ｍのＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターとターミネーター
の間に挿入し、ｐＹＧ１を作成した。これをＨｉｎｄ I
IIで部分的に切断して得られる約２．５Kbの断片の両端
にＢａｍＨＩリンカーをつけ、ｐＹＭＳ２２２のＢａｍ
ＨＩ切断部位に挿入してｐＹＭＳ２２２Ｇを作成した
（図２参照）。
【００２７】（２）ｐＹＭＴ２２１Ｇ このプラスミドは、（１）のプラスミドのＭＡＬ６Ｓの
代わりにマルトースパーミアーゼをコードする遺伝子
（ＭＡＬ６Ｔ）がＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターに連
結されて挿入されたものであり、他の構成は（１）と全
く同じである。具体的には、ｐＭＡＬ６ＴＲをＳｃａＩ
で切断してｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に挿入してｐＵＣ
ＭＡＬＴを作成し、これをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
で切断して得られるマルトースパーミアーゼ構造遺伝子
（ＭＡＬ６Ｔ、約２．０Kb）を酵母の発現プラスミドｐ
ＹＥ２２ｍのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に連結してｐ
ＹＭＴ２２１を作製し、これにｐＹＭＳ２２２Ｇと同様
にＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターに連結されたＧ４１
８耐性遺伝子を連結してｐＹＭＴ２２１Ｇを作製した
（図３参照）。
代わりにマルトースパーミアーゼをコードする遺伝子
（ＭＡＬ６Ｔ）がＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターに連
結されて挿入されたものであり、他の構成は（１）と全
く同じである。具体的には、ｐＭＡＬ６ＴＲをＳｃａＩ
で切断してｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に挿入してｐＵＣ
ＭＡＬＴを作成し、これをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
で切断して得られるマルトースパーミアーゼ構造遺伝子
（ＭＡＬ６Ｔ、約２．０Kb）を酵母の発現プラスミドｐ
ＹＥ２２ｍのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に連結してｐ
ＹＭＴ２２１を作製し、これにｐＹＭＳ２２２Ｇと同様
にＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターに連結されたＧ４１
８耐性遺伝子を連結してｐＹＭＴ２２１Ｇを作製した
（図３参照）。
【００２８】（３）ｐＹＭＳＴ２２２Ｇ このプラスミドは、（１）のプラスミドのＭＡＬ６Ｓの
代わりに各々ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターに連結さ
れた、マルターゼをコードする遺伝子（ＭＡＬ６Ｓ）
と、マルトースパーミアーゼをコードする遺伝子（ＭＡ
Ｌ６Ｔ）を有する。他の構成は（１）と全く同じであ
る。
代わりに各々ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターに連結さ
れた、マルターゼをコードする遺伝子（ＭＡＬ６Ｓ）
と、マルトースパーミアーゼをコードする遺伝子（ＭＡ
Ｌ６Ｔ）を有する。他の構成は（１）と全く同じであ
る。
【００２９】具体的には、ｐＹＭＴ２２１をＨｉｎｄ I
IIで部分分解して得られる約９．８Kbの断片に、ｐＹＭ
Ｓ２２２をＨｉｎｄ III で切断して得られる約３．１
Kbの断片を連結してｐＹＭＳＴ２２２を作製し、これに
ｐＹＭＳ２２２Ｇと同様にＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモー
ターに連結されたＧ４１８耐性遺伝子を連結してｐＹＭ
ＳＴ２２２Ｇを作製した（図４参照）。
IIで部分分解して得られる約９．８Kbの断片に、ｐＹＭ
Ｓ２２２をＨｉｎｄ III で切断して得られる約３．１
Kbの断片を連結してｐＹＭＳＴ２２２を作製し、これに
ｐＹＭＳ２２２Ｇと同様にＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモー
ターに連結されたＧ４１８耐性遺伝子を連結してｐＹＭ
ＳＴ２２２Ｇを作製した（図４参照）。
【００３０】（４）ｐＹＭＲ２２２Ｇ このプラスミドは、（１）のプラスミドのＭＡＬ６Ｓの
代わりにマルターゼとマルトースパーミアーゼの正の制
御因子をコードする遺伝子（ＭＡＬ６Ｒ）がＧＡＰＤＨ
遺伝子のプロモーターに連結されて挿入されたものであ
り、他の構成は（１）と全く同じである。
代わりにマルターゼとマルトースパーミアーゼの正の制
御因子をコードする遺伝子（ＭＡＬ６Ｒ）がＧＡＰＤＨ
遺伝子のプロモーターに連結されて挿入されたものであ
り、他の構成は（１）と全く同じである。
【００３１】具体的には、酵母の発現プラスミドｐＹＥ
２２ｍのマルチクローニングサイトをＳｍａＩで切断
し、さらにＳａｌＩで切断した後、ｐＭＡＬ６ＴＲをＳ
ｍａＩおよびＳａｌＩで切断して得られる正の制御因子
をコードする遺伝子（ＭＡＬ６Ｒ、約２．４Kb）を連結
してｐＹＭＲ２２２を作製し、これにｐＹＭＳ２２２Ｇ
と同様にＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターに連結された
Ｇ４１８耐性遺伝子を連結してｐＹＭＲ２２２Ｇを作製
した（図５参照）。
２２ｍのマルチクローニングサイトをＳｍａＩで切断
し、さらにＳａｌＩで切断した後、ｐＭＡＬ６ＴＲをＳ
ｍａＩおよびＳａｌＩで切断して得られる正の制御因子
をコードする遺伝子（ＭＡＬ６Ｒ、約２．４Kb）を連結
してｐＹＭＲ２２２を作製し、これにｐＹＭＳ２２２Ｇ
と同様にＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターに連結された
Ｇ４１８耐性遺伝子を連結してｐＹＭＲ２２２Ｇを作製
した（図５参照）。
【００３２】実施例３．酵母の形質転換 ビール酵母ＢＨ８４株を酢酸リチウム処理し、プラスミ
ド溶液とポリエチレングリコール４０００を加えて、３
０℃で３０分保持した後、４２℃で５分処理し、ＹＰＤ
液体培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコ
ース２％）を２ml加えて３０℃で６時間振盪培養した
後、遠心して菌体を１０倍濃縮し、Ｇ４１８を３００pp
m 含むＹＰＤ平板培地（ＹＰＤ液体培地＋２％寒天）に
塗布し、３０℃で３〜５日間培養して、増殖してきたコ
ロニーを拾い、形質転換体とする。
ド溶液とポリエチレングリコール４０００を加えて、３
０℃で３０分保持した後、４２℃で５分処理し、ＹＰＤ
液体培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコ
ース２％）を２ml加えて３０℃で６時間振盪培養した
後、遠心して菌体を１０倍濃縮し、Ｇ４１８を３００pp
m 含むＹＰＤ平板培地（ＹＰＤ液体培地＋２％寒天）に
塗布し、３０℃で３〜５日間培養して、増殖してきたコ
ロニーを拾い、形質転換体とする。
【００３３】形質転換された酵母菌株の命名は以下のと
おりである。ｐＹＭＳ２２２Ｇで形質転換されたＢＨ８
４株をＢＨ−Ｓ，ｐＹＭＴ２２１Ｇで形質転換されたＢ
Ｈ８４株をＢＨ−Ｔ，ｐＹＭＳＴ２２２Ｇで形質転換さ
れたＢＨ８４株をＢＨ−ＳＴ，ｐＹＭＲ２２２Ｇで形質
転換されたＢＨ８４株をＢＨ−Ｒと示す。
おりである。ｐＹＭＳ２２２Ｇで形質転換されたＢＨ８
４株をＢＨ−Ｓ，ｐＹＭＴ２２１Ｇで形質転換されたＢ
Ｈ８４株をＢＨ−Ｔ，ｐＹＭＳＴ２２２Ｇで形質転換さ
れたＢＨ８４株をＢＨ−ＳＴ，ｐＹＭＲ２２２Ｇで形質
転換されたＢＨ８４株をＢＨ−Ｒと示す。
【００３４】実施例４ ．形質転換された酵母のマルターゼ活性 マルターゼ活性の測定は、Halvorson (Methods Enzymo
l., vol.7, p559,1966)に従って行なった。即ち、ＹＰ
Ｄ液体培地１０mlに菌体を一白金耳接種し、３０℃で１
７時間培養して、遠心、集菌後、０．０１Ｍのリン酸バ
ッファーで洗浄し、０．７mlの同バッファーに懸濁し、
０．４ｇのグラスビーズを加えて、ビーズビーターで１
分間処理して菌体を破砕する。この菌体破砕液を１００
００×ｇ、１０分遠心して上清を粗酵素液とする。
l., vol.7, p559,1966)に従って行なった。即ち、ＹＰ
Ｄ液体培地１０mlに菌体を一白金耳接種し、３０℃で１
７時間培養して、遠心、集菌後、０．０１Ｍのリン酸バ
ッファーで洗浄し、０．７mlの同バッファーに懸濁し、
０．４ｇのグラスビーズを加えて、ビーズビーターで１
分間処理して菌体を破砕する。この菌体破砕液を１００
００×ｇ、１０分遠心して上清を粗酵素液とする。
【００３５】０．０１Ｍのリン酸バッファー２．８ml
（２０℃）、同バッファーに溶かした０．０１ＭのＰＮ
ＰＧ（ρ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ド）１００μｌ（２０℃）、上記の粗酵素液２０μｌを
キュベット内で混合し、１分間の４００nmの吸光度の上
昇で酵素活性を測定した。グルコースで１７時間培養し
たときの、親株ＢＨ８４株、並びに形質転換体ＢＨ−
Ｓ，ＢＨ−ＳＴおよびＢＨ−Ｒのマルターゼ活性を図６
に示す。ＢＨ−Ｓは親株の約１９倍、ＢＨ−ＳＴは約５
倍、マルターゼ活性が上昇していた。ＢＨ−Ｒは、この
条件下では、マルターゼ活性は親株と変わらなかった。
（２０℃）、同バッファーに溶かした０．０１ＭのＰＮ
ＰＧ（ρ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ド）１００μｌ（２０℃）、上記の粗酵素液２０μｌを
キュベット内で混合し、１分間の４００nmの吸光度の上
昇で酵素活性を測定した。グルコースで１７時間培養し
たときの、親株ＢＨ８４株、並びに形質転換体ＢＨ−
Ｓ，ＢＨ−ＳＴおよびＢＨ−Ｒのマルターゼ活性を図６
に示す。ＢＨ−Ｓは親株の約１９倍、ＢＨ−ＳＴは約５
倍、マルターゼ活性が上昇していた。ＢＨ−Ｒは、この
条件下では、マルターゼ活性は親株と変わらなかった。
【００３６】実施例５．形質転換された酵母のマルトー
スパーミアーゼ活性 マルトースパーミアーゼ活性の測定は、R.Serrano (Eu
r.J.Biochem., vol.80,p97-102,1977)に従って行なっ
た。即ち、２％グルコースを含むYeast Nitrogen Base
(Difco) １０mlで、３０℃で一晩前培養し、その菌液
２．５mlを５０mlの新鮮な培地に移して、３０℃で８時
間培養した。培養後、集菌、洗浄した菌体、ＯＤ６６０
＝１．０、５ml分を１mlの０．１mMマルトース（０．２
μCi／mlの14Ｃマルトースを含む）／ 0.1M Tartarate-
Tris（pH４．３）に懸濁し、２０秒毎に１００μｌずつ
サンプリングして菌体内にとり込まれた放射活性を測定
した。グルコースで８時間培養したときの、親株ＢＨ８
４株、並びに形質転換体ＢＨＴ，ＢＨ−ＳＴおよびＢＨ
−Ｒのマルトースパーミアーゼ活性を図７に示す。ＢＨ
−Ｔは親株の約９０倍、ＢＨ−ＳＴは約２０倍、マルト
ースパーミアーゼ活性が上昇していた。ＢＨ−Ｒは、こ
の条件下では、マルトースパーミアーゼ活性は、親株と
変わらなかった。
スパーミアーゼ活性 マルトースパーミアーゼ活性の測定は、R.Serrano (Eu
r.J.Biochem., vol.80,p97-102,1977)に従って行なっ
た。即ち、２％グルコースを含むYeast Nitrogen Base
(Difco) １０mlで、３０℃で一晩前培養し、その菌液
２．５mlを５０mlの新鮮な培地に移して、３０℃で８時
間培養した。培養後、集菌、洗浄した菌体、ＯＤ６６０
＝１．０、５ml分を１mlの０．１mMマルトース（０．２
μCi／mlの14Ｃマルトースを含む）／ 0.1M Tartarate-
Tris（pH４．３）に懸濁し、２０秒毎に１００μｌずつ
サンプリングして菌体内にとり込まれた放射活性を測定
した。グルコースで８時間培養したときの、親株ＢＨ８
４株、並びに形質転換体ＢＨＴ，ＢＨ−ＳＴおよびＢＨ
−Ｒのマルトースパーミアーゼ活性を図７に示す。ＢＨ
−Ｔは親株の約９０倍、ＢＨ−ＳＴは約２０倍、マルト
ースパーミアーゼ活性が上昇していた。ＢＨ−Ｒは、こ
の条件下では、マルトースパーミアーゼ活性は、親株と
変わらなかった。
【００３７】実施例６．グルコース存在下でのマルター
ゼ（ＭＡＬ６Ｓ）と、マルトースパーミアーゼ（ＭＡＬ
６Ｔ）、のｍＲＮＡの発現量の解析 ２％グルコースを含むYeast Nitrogen Base (Difco) １
０mlで、３０℃、１７時間培養した酵母菌体を、集菌、
洗浄し、０．２mlのＬＥＴＳバッファー（０．１Ｍ Ｌ
ｉＣｌ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．４）、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ）に懸濁
し、０．４ｇのグラスビーズを加えて、ビーズビーター
で２．５分間処理して菌体を破砕する。この菌体破砕液
を１００００×ｇ、１０分遠心して上清を得、３回フェ
ノール処理を行なった後に、エタノールを加え、−２０
℃でＲＮＡを沈殿させる。
ゼ（ＭＡＬ６Ｓ）と、マルトースパーミアーゼ（ＭＡＬ
６Ｔ）、のｍＲＮＡの発現量の解析 ２％グルコースを含むYeast Nitrogen Base (Difco) １
０mlで、３０℃、１７時間培養した酵母菌体を、集菌、
洗浄し、０．２mlのＬＥＴＳバッファー（０．１Ｍ Ｌ
ｉＣｌ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．４）、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ）に懸濁
し、０．４ｇのグラスビーズを加えて、ビーズビーター
で２．５分間処理して菌体を破砕する。この菌体破砕液
を１００００×ｇ、１０分遠心して上清を得、３回フェ
ノール処理を行なった後に、エタノールを加え、−２０
℃でＲＮＡを沈殿させる。
【００３８】遠心後、沈殿を７０％エタノールでリンス
し、乾固させて５５μｌの蒸留水に溶解し、全ＲＮＡ液
とする。これを oligotex dT30（第一化学薬品社製）で
処理し、ｍＲＮＡ液を得た。得られたｍＲＮＡを、常法
どおりホルムアルデヒドゲル電気泳動し、メンブレンに
トランスファーして、ＭＡＬ６Ｓ，ＭＡＬ６Ｔのフラグ
メントをビオチンラベルしたプローブとハイブリダイズ
させて、発現量を比較した。プローブのビオチンラベル
とノザンブロッティングの検出は、ＢＲＬ社のキット
（BioNick Labelling System #8247SA, PhotoGene Nucl
eic Acid Detection System #8192SA)を用いて行なっ
た。結果を表１に示す。
し、乾固させて５５μｌの蒸留水に溶解し、全ＲＮＡ液
とする。これを oligotex dT30（第一化学薬品社製）で
処理し、ｍＲＮＡ液を得た。得られたｍＲＮＡを、常法
どおりホルムアルデヒドゲル電気泳動し、メンブレンに
トランスファーして、ＭＡＬ６Ｓ，ＭＡＬ６Ｔのフラグ
メントをビオチンラベルしたプローブとハイブリダイズ
させて、発現量を比較した。プローブのビオチンラベル
とノザンブロッティングの検出は、ＢＲＬ社のキット
（BioNick Labelling System #8247SA, PhotoGene Nucl
eic Acid Detection System #8192SA)を用いて行なっ
た。結果を表１に示す。
【００３９】 注 （＋）：わずかに発現 ＋＋：強く発現 ＮＴ：試験せず。
【００４０】親株が、グルコース存在下ではマルターゼ
（ＭＡＬ６Ｓ）とマルトースパーミアーゼ（ＭＡＬ６
Ｔ）のｍＲＮＡの発現が低く抑えられているのに対し、
ＢＨＳ，ＢＨ−ＴおよびＢＨ−ＳＴでは、それぞれ導入
した遺伝子が高発現していた。
（ＭＡＬ６Ｓ）とマルトースパーミアーゼ（ＭＡＬ６
Ｔ）のｍＲＮＡの発現が低く抑えられているのに対し、
ＢＨＳ，ＢＨ−ＴおよびＢＨ−ＳＴでは、それぞれ導入
した遺伝子が高発現していた。
【００４１】実施例７．ビール醸造試験 親株ＢＨ８４株、並びに形質転換体ＢＨ−Ｓ，ＢＨ−
Ｔ，ＢＨ−ＳＴおよびＢＨ−Ｒを用いて、高濃度麦汁で
の発酵試験を表２の条件下で行なった。 表２．発酵条件 ─────────────────────────── 原麦汁エキス濃度 ２４％ 麦汁容量 ２Ｌ 麦汁溶存酸素濃度 ９ppm 発酵温度 １５℃一定 酵母投入量 １５ｇ湿酵母菌体／２Ｌ麦汁 ───────────────────────────
Ｔ，ＢＨ−ＳＴおよびＢＨ−Ｒを用いて、高濃度麦汁で
の発酵試験を表２の条件下で行なった。 表２．発酵条件 ─────────────────────────── 原麦汁エキス濃度 ２４％ 麦汁容量 ２Ｌ 麦汁溶存酸素濃度 ９ppm 発酵温度 １５℃一定 酵母投入量 １５ｇ湿酵母菌体／２Ｌ麦汁 ───────────────────────────
【００４２】発酵中の酵母増殖量（ＯＤ６６０）（図
８）、グルコース、マルトースおよびマルトトリオース
の資化経過（図９、図１０、図１１）、マルトース消費
速度（図１２）、並びにエキスの消費経過（図１３）を
調べた。
８）、グルコース、マルトースおよびマルトトリオース
の資化経過（図９、図１０、図１１）、マルトース消費
速度（図１２）、並びにエキスの消費経過（図１３）を
調べた。
【００４３】ＢＨ−ＴおよびＢＨ−ＳＴは、親株に比べ
てマルトースの資化速度が速く、結果的にエキスの消費
速度も速くなっており、発酵度６５％に達する時間は、
親株の２６５時間に比べ、ＢＨ−ＳＴでは２１５時間、
ＢＨ−Ｔでは１８０時間と、著しい発酵時間の短縮が認
められた。特にＢＨ−Ｔ は、高濃度醸造に非常に有効
な酵母であった。この結果から、ビール醸造に於けるマ
ルトース発酵は、マルターゼ活性よりも、マルトースの
取り込み活性に依存しており、マルトースパーミアーゼ
遺伝子（ＭＡＬ６Ｔ）を高発現化することにより、著し
い発酵時間の短縮を可能にすることが出来ることが明か
になった。
てマルトースの資化速度が速く、結果的にエキスの消費
速度も速くなっており、発酵度６５％に達する時間は、
親株の２６５時間に比べ、ＢＨ−ＳＴでは２１５時間、
ＢＨ−Ｔでは１８０時間と、著しい発酵時間の短縮が認
められた。特にＢＨ−Ｔ は、高濃度醸造に非常に有効
な酵母であった。この結果から、ビール醸造に於けるマ
ルトース発酵は、マルターゼ活性よりも、マルトースの
取り込み活性に依存しており、マルトースパーミアーゼ
遺伝子（ＭＡＬ６Ｔ）を高発現化することにより、著し
い発酵時間の短縮を可能にすることが出来ることが明か
になった。
【００４４】
配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CGATGGCTGG GGTGATTTAA AAGGTATC 28
【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTATTGCGA AACAGTCTTG CG 22
【図１】図１はｐＵＣ１９ＭＡＬ６Ｓの構成を示す。
【図２】図２はプラスミドｐＹＭＳ２２２Ｇの構成を示
す。矢印は図中の遺伝子の転写方向を示す。記号：Ｇ４
１８r 、ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーターの制御下にＧ４
１８に耐性を与える。ＰＧＡＰ，ＧＡＰＤＨ遺伝子プロ
モーター。ＴＧＡＰ，ＧＡＰＤＨターミネーター。Ａｐ
r 、アンピシリン耐性遺伝子。ＴＲＰ１、トリプトファ
ン要求性（ｔｒｐ１）回復遺伝子。ＩＲ、酵母３μｍＤ
ＮＡ中の逆位の繰り返し配列。
す。矢印は図中の遺伝子の転写方向を示す。記号：Ｇ４
１８r 、ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーターの制御下にＧ４
１８に耐性を与える。ＰＧＡＰ，ＧＡＰＤＨ遺伝子プロ
モーター。ＴＧＡＰ，ＧＡＰＤＨターミネーター。Ａｐ
r 、アンピシリン耐性遺伝子。ＴＲＰ１、トリプトファ
ン要求性（ｔｒｐ１）回復遺伝子。ＩＲ、酵母３μｍＤ
ＮＡ中の逆位の繰り返し配列。
【図３】図３はプラスミドｐＹＭＴ２２１Ｇの構成を示
す。
す。
【図４】図４はプラスミドｐＹＭＳＴ２２２Ｇの構成を
示す。
示す。
【図５】図５はプラスミドｐＹＭＲ２２２Ｇの構成を示
す。
す。
【図６】図６はグルコースで培養したときの、親株と形
質転換体のマルターゼ活性を示す。
質転換体のマルターゼ活性を示す。
【図７】図７はグルコースで培養したときの、親株と形
質転換体のマルトースパーミアーゼ活性を示す。
質転換体のマルトースパーミアーゼ活性を示す。
【図８】図８は発酵中の酵母増殖量（ＯＤ６６０）を示
す。
す。
【図９】図９はグルコースの資化経過を示す。
【図１０】図１０はマルトースの資化経過を示す。
【図１１】図１１はマルトトリオースの資化経過を示
す。
す。
【図１２】図１２はマルトースの消費速度を示す。
【図１３】図１３はエキスの消費経過を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年５月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビールの高濃度醸造法
に関する。さらに具体的には、マルトース高発酵性酵母
を育種し、それを用いて糖度の高い麦汁を発酵させて得
る高濃度ビールの製造法に関する。なお本発明において
「高濃度ビール」とは、高濃度麦汁を発酵させることに
より得られたビールのことである。また「高濃度麦汁」
とは、麦汁のエキス濃度を各々のビールの製造法におい
て通常よりも上げた麦汁のことである。
に関する。さらに具体的には、マルトース高発酵性酵母
を育種し、それを用いて糖度の高い麦汁を発酵させて得
る高濃度ビールの製造法に関する。なお本発明において
「高濃度ビール」とは、高濃度麦汁を発酵させることに
より得られたビールのことである。また「高濃度麦汁」
とは、麦汁のエキス濃度を各々のビールの製造法におい
て通常よりも上げた麦汁のことである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】従来ビールの製造においては、エキス濃
度１１％前後の原麦汁を発酵させてアルコール濃度４．
５〜５％前後のビールを得ている。ビールの生産性向上
のために、多くのビール会社で高濃度醸造法が採用され
ている。高濃度醸造法（high gravity brewing) とは、
製造しようとするビールよりも高い原麦汁濃度のビール
を与える麦汁を醗酵させた後、これを水で希釈して所定
原麦汁濃度のビールとする方法である（The BREWERS DI
GEST、第５１巻、第３４頁（１９７６年））。なお、原
麦汁のエキス濃度とは比重計で測定した原麦汁の比重を
同じ比重を有する糖の濃度（重量／重量％）として表わ
したものである。
度１１％前後の原麦汁を発酵させてアルコール濃度４．
５〜５％前後のビールを得ている。ビールの生産性向上
のために、多くのビール会社で高濃度醸造法が採用され
ている。高濃度醸造法（high gravity brewing) とは、
製造しようとするビールよりも高い原麦汁濃度のビール
を与える麦汁を醗酵させた後、これを水で希釈して所定
原麦汁濃度のビールとする方法である（The BREWERS DI
GEST、第５１巻、第３４頁（１９７６年））。なお、原
麦汁のエキス濃度とは比重計で測定した原麦汁の比重を
同じ比重を有する糖の濃度（重量／重量％）として表わ
したものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】原麦汁エキス濃度１５％以上の高濃度醸造
を行なった場合に生じる問題点として、まず第一に上げ
られるのは、発酵中期から後期にかけての発酵速度の著
しい低下である。麦汁中に含まれる糖質は、主にマルト
ース、マルトトリオース、グルコース、フラクトース、
シュークロースである。酵母は、グルコース、フラクト
ース、シュークロースを先に資化し、その後にマルトー
ス、マルトトリオースを資化する。従って、発酵中期か
ら発酵後期にかけては、もろみ中の資化性糖はマルトー
ス、マルトトリオースしか存在していない。しかもその
存在比は、３：１と圧倒的にマルトースが多い。
を行なった場合に生じる問題点として、まず第一に上げ
られるのは、発酵中期から後期にかけての発酵速度の著
しい低下である。麦汁中に含まれる糖質は、主にマルト
ース、マルトトリオース、グルコース、フラクトース、
シュークロースである。酵母は、グルコース、フラクト
ース、シュークロースを先に資化し、その後にマルトー
ス、マルトトリオースを資化する。従って、発酵中期か
ら発酵後期にかけては、もろみ中の資化性糖はマルトー
ス、マルトトリオースしか存在していない。しかもその
存在比は、３：１と圧倒的にマルトースが多い。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】マルトースは、酵母のマルトースパーミア
ーゼによって、細胞内に取り込まれた後、マルターゼに
よって２分子のグルコースに加水分解され、エムブデン
−マイヤーホッフ（Embden-Meyerhof)の経路を介して二
酸化炭素とエタノールに転化する。この２つの酵素は、
転写レベルで、マルトースによって誘導され、グルコー
スによって抑制されることが知られている。
ーゼによって、細胞内に取り込まれた後、マルターゼに
よって２分子のグルコースに加水分解され、エムブデン
−マイヤーホッフ（Embden-Meyerhof)の経路を介して二
酸化炭素とエタノールに転化する。この２つの酵素は、
転写レベルで、マルトースによって誘導され、グルコー
スによって抑制されることが知られている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】麦汁中にはグルコースが、酵母の資化性糖
の約１０％含まれるため、酵母のマルトース代謝系遺伝
子は、発酵初期の段階でグルコースによる抑制を受け、
マルトースの資化が、大幅に遅れることになる。この現
象は、高濃度醸造の際には、さらに顕著となり、マルト
ース発酵が遅れるばかりでなく、発酵終了時に、残糖と
して多量のマルトースが、資化されないまま残ってしま
う。このような問題点によって、高濃度醸造、例えば通
常の２倍の濃度の麦汁を醗酵させることは、従来の技術
では不完全であった。
の約１０％含まれるため、酵母のマルトース代謝系遺伝
子は、発酵初期の段階でグルコースによる抑制を受け、
マルトースの資化が、大幅に遅れることになる。この現
象は、高濃度醸造の際には、さらに顕著となり、マルト
ース発酵が遅れるばかりでなく、発酵終了時に、残糖と
して多量のマルトースが、資化されないまま残ってしま
う。このような問題点によって、高濃度醸造、例えば通
常の２倍の濃度の麦汁を醗酵させることは、従来の技術
では不完全であった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】
【具体的な説明】酵母サッカロマイセス・セレビシエー
(Saccharomyces cerevisiae) では、マルトース代謝系
遺伝子としてＭＡＬ１，ＭＡＬ２，ＭＡＬ３，ＭＡＬ
４，ＭＡＬ６の５つの重複遺伝子が知られており、その
うちいずれか一つでも活性なアレル（遺伝子座）であれ
ば、マルトース発酵性となる。それぞれの遺伝子座に
は、マルトースパーミアーゼ、マルターゼ、そして、こ
れら構造遺伝子の発現に必要な正の制御因子の３つの遺
伝子がコードされている。
(Saccharomyces cerevisiae) では、マルトース代謝系
遺伝子としてＭＡＬ１，ＭＡＬ２，ＭＡＬ３，ＭＡＬ
４，ＭＡＬ６の５つの重複遺伝子が知られており、その
うちいずれか一つでも活性なアレル（遺伝子座）であれ
ば、マルトース発酵性となる。それぞれの遺伝子座に
は、マルトースパーミアーゼ、マルターゼ、そして、こ
れら構造遺伝子の発現に必要な正の制御因子の３つの遺
伝子がコードされている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】先に述べたように、このマルトースパーミ
アーゼおよびマルターゼは、転写レベルで、マルトース
によって誘導され、グルコースによって抑制される。従
って、発酵初期の段階で、麦汁中のグルコースの存在に
よって、これらの酵素が抑制されることにより、マルト
ースの資化が、大幅に遅れることになる。
アーゼおよびマルターゼは、転写レベルで、マルトース
によって誘導され、グルコースによって抑制される。従
って、発酵初期の段階で、麦汁中のグルコースの存在に
よって、これらの酵素が抑制されることにより、マルト
ースの資化が、大幅に遅れることになる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】本発明者らは、ＭＡＬ６座のマルトースパ
ーミアーゼ（ＭＡＬ６Ｔ）、マルターゼ（ＭＡＬ６
Ｓ）、および正の制御因子（ＭＡＬ６Ｒ）をクローニン
グし、それらの遺伝子のプロモーターをＧＡＰＤＨ（グ
リセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子の
プロモーターに置き換えることにより、グルコース存在
下でも、発現抑制を受けないような機構にして、各々、
もしくは組み合わせて、酵母細胞内に多コピーエピゾー
ム、例えばプラスミドの形で導入するか、もしくは染色
体導入型プラスミドで染色体の組換えを行ない、マルト
ース高発酵性酵母を育種し、初めて実際にビール酵母を
用いたビールの製造に適用できることを確認した。本発
明者らは、ビール酵母において、上記のマルトース高発
酵性酵母を育種し、実際のビール醸造の条件下で高濃度
醸造を行なった。
ーミアーゼ（ＭＡＬ６Ｔ）、マルターゼ（ＭＡＬ６
Ｓ）、および正の制御因子（ＭＡＬ６Ｒ）をクローニン
グし、それらの遺伝子のプロモーターをＧＡＰＤＨ（グ
リセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子の
プロモーターに置き換えることにより、グルコース存在
下でも、発現抑制を受けないような機構にして、各々、
もしくは組み合わせて、酵母細胞内に多コピーエピゾー
ム、例えばプラスミドの形で導入するか、もしくは染色
体導入型プラスミドで染色体の組換えを行ない、マルト
ース高発酵性酵母を育種し、初めて実際にビール酵母を
用いたビールの製造に適用できることを確認した。本発
明者らは、ビール酵母において、上記のマルトース高発
酵性酵母を育種し、実際のビール醸造の条件下で高濃度
醸造を行なった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】
【実施例】以下の実験データは、本発明の例証のために
示される。これらの方法は、他のビール醸造用酵母、例
えばサッカロミセス・セレビシエーＩＦＯ１９５１，Ｉ
ＦＯ１９５２，ＩＦＯ１９５３，ＩＦＯ１９５４等に於
ても、同様に使用されうる。
示される。これらの方法は、他のビール醸造用酵母、例
えばサッカロミセス・セレビシエーＩＦＯ１９５１，Ｉ
ＦＯ１９５２，ＩＦＯ１９５３，ＩＦＯ１９５４等に於
ても、同様に使用されうる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】研究用酵母ＮＣＹＣ７４−ＣＢ１１(MATa,
adel,MAL6)〔National Collectionof Yeast Cultures
（イギリス）において入手可能である。なお、この酵母
ＮＣＹＣ７４−ＣＢ１１は Saccharomyces cerevisiae
SAM 2034 と命名され、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第４１９８号（FERM BP-4198）として寄
託されている。〕より、染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解後、ショ糖密度勾配法により
約１０KbのＤＮＡ断片を分離した。
adel,MAL6)〔National Collectionof Yeast Cultures
（イギリス）において入手可能である。なお、この酵母
ＮＣＹＣ７４−ＣＢ１１は Saccharomyces cerevisiae
SAM 2034 と命名され、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第４１９８号（FERM BP-4198）として寄
託されている。〕より、染色体ＤＮＡを抽出し、制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解後、ショ糖密度勾配法により
約１０KbのＤＮＡ断片を分離した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】０．０１Ｍのリン酸バッファー（pH７．
０）２．８ml（２０℃）、同バッファーに溶かした０．
０１ＭのＰＮＰＧ（ρ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グル
コピラノシド）１００μｌ（２０℃）、上記の粗酵素液
２０μｌをキュベット内で混合し、１分間の４００nmの
吸光度の上昇で酵素活性を測定した。グルコースで１７
時間培養したときの、親株ＢＨ８４株、並びに形質転換
体ＢＨ−Ｓ，ＢＨ−ＳＴおよびＢＨ−Ｒのマルターゼ活
性を図６に示す。ＢＨ−Ｓは親株の約１９倍、ＢＨ−Ｓ
Ｔは約５倍、マルターゼ活性が上昇していた。ＢＨ−Ｒ
は、この条件下では、マルターゼ活性は親株と変わらな
かった。
０）２．８ml（２０℃）、同バッファーに溶かした０．
０１ＭのＰＮＰＧ（ρ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グル
コピラノシド）１００μｌ（２０℃）、上記の粗酵素液
２０μｌをキュベット内で混合し、１分間の４００nmの
吸光度の上昇で酵素活性を測定した。グルコースで１７
時間培養したときの、親株ＢＨ８４株、並びに形質転換
体ＢＨ−Ｓ，ＢＨ−ＳＴおよびＢＨ−Ｒのマルターゼ活
性を図６に示す。ＢＨ−Ｓは親株の約１９倍、ＢＨ−Ｓ
Ｔは約５倍、マルターゼ活性が上昇していた。ＢＨ−Ｒ
は、この条件下では、マルターゼ活性は親株と変わらな
かった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】実施例６．グルコース存在下でのマルター
ゼ（ＭＡＬ６Ｓ）と、マルトースパーミアーゼ（ＭＡＬ
６Ｔ）、正の制御因子（ＭＡＬ６Ｒ）、のｍＲＮＡの発
現量の解析 ２％グルコースを含むYeast Nitrogen Base (Difco) １
０mlで、３０℃、１７時間培養した酵母菌体を、集菌、
洗浄し、０．２mlのＬＥＴＳバッファー（０．１Ｍ Ｌ
ｉＣｌ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．４）、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ）に懸濁
し、０．４ｇのグラスビーズを加えて、ビーズビーター
で２．５分間処理して菌体を破砕する。この菌体破砕液
を１００００×ｇ、１０分遠心して上清を得、３回フェ
ノール処理を行なった後に、エタノールを加え、−２０
℃でＲＮＡを沈殿させる。
ゼ（ＭＡＬ６Ｓ）と、マルトースパーミアーゼ（ＭＡＬ
６Ｔ）、正の制御因子（ＭＡＬ６Ｒ）、のｍＲＮＡの発
現量の解析 ２％グルコースを含むYeast Nitrogen Base (Difco) １
０mlで、３０℃、１７時間培養した酵母菌体を、集菌、
洗浄し、０．２mlのＬＥＴＳバッファー（０．１Ｍ Ｌ
ｉＣｌ、１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．４）、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ）に懸濁
し、０．４ｇのグラスビーズを加えて、ビーズビーター
で２．５分間処理して菌体を破砕する。この菌体破砕液
を１００００×ｇ、１０分遠心して上清を得、３回フェ
ノール処理を行なった後に、エタノールを加え、−２０
℃でＲＮＡを沈殿させる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】遠心後、沈殿を７０％エタノールでリンス
し、乾固させて５５μｌの蒸留水に溶解し、全ＲＮＡ液
とする。これを oligotex dT30（第一化学薬品社製）で
処理し、ｍＲＮＡ液を得た。得られたｍＲＮＡを、常法
どおりホルムアルデヒドゲル電気泳動し、メンブレンに
トランスファーして、ＭＡＬ６Ｓ，ＭＡＬ６Ｔ，ＭＡＬ
６Ｒのフラグメントをビオチンラベルしたプローブとハ
イブリダイズさせて、発現量を比較した。プローブのビ
オチンラベルとノザンブロッティングの検出は、ＢＲＬ
社のキット（BioNick Labelling System #8247SA, Phot
oGene NucleicAcid Detection System #8192SA)を用い
て行なった。結果を表１に示す。
し、乾固させて５５μｌの蒸留水に溶解し、全ＲＮＡ液
とする。これを oligotex dT30（第一化学薬品社製）で
処理し、ｍＲＮＡ液を得た。得られたｍＲＮＡを、常法
どおりホルムアルデヒドゲル電気泳動し、メンブレンに
トランスファーして、ＭＡＬ６Ｓ，ＭＡＬ６Ｔ，ＭＡＬ
６Ｒのフラグメントをビオチンラベルしたプローブとハ
イブリダイズさせて、発現量を比較した。プローブのビ
オチンラベルとノザンブロッティングの検出は、ＢＲＬ
社のキット（BioNick Labelling System #8247SA, Phot
oGene NucleicAcid Detection System #8192SA)を用い
て行なった。結果を表１に示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】表１ ────────────────────────────── ＭＡＬＳ ＭＡＬＴ ＭＡＬＲ ────────────────────────────── ＢＨ−８４ ＋ ＋ ＋ ＢＨ−Ｓ ＋＋ ＋ ＋ ＢＨ−Ｔ ＋ ＋＋ ＋ ＢＨ−ＳＴ ＋＋ ＋＋ ＋ ＢＨ−Ｒ ＋ ＋ ＋＋ ────────────────────────────── 注 ＋ ：弱く発現 ＋＋：強く発現 ＮＴ：試験せず。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】親株が、グルコース存在下ではマルターゼ
（ＭＡＬ６Ｓ）とマルトースパーミアーゼ（ＭＡＬ６
Ｔ）、正の制御因子（ＭＡＬ６Ｒ）のｍＲＮＡの発現が
低く抑えられているのに対し、ＢＨ−Ｓ，ＢＨ−Ｔ，Ｂ
Ｈ−ＳＴおよびＢＨ−Ｒでは、それぞれ導入した遺伝子
が高発現していた。
（ＭＡＬ６Ｓ）とマルトースパーミアーゼ（ＭＡＬ６
Ｔ）、正の制御因子（ＭＡＬ６Ｒ）のｍＲＮＡの発現が
低く抑えられているのに対し、ＢＨ−Ｓ，ＢＨ−Ｔ，Ｂ
Ｈ−ＳＴおよびＢＨ−Ｒでは、それぞれ導入した遺伝子
が高発現していた。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はｐＵＣ１９ＭＡＬ６Ｓの構成を示す。
【図２】図２はプラスミドｐＹＭＳ２２２Ｇの構成を示
す。矢印は図中の遺伝子の転写方向を示す。記号：Ｇ４
１８r 、ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーターの制御下にＧ４
１８に耐性を与える遺伝子。ＰＧＡＰ，ＧＡＰＤＨ遺伝
子プロモーター。ＴＧＡＰ，ＧＡＰＤＨ遺伝子ターミネ
ーター。Ａｐr 、アンピシリン耐性遺伝子。ＴＲＰ１、
トリプトファン要求性（ｔｒｐ１）回復遺伝子。ＩＲ、
酵母２μｍＤＮＡ中の逆位の繰り返し配列。
す。矢印は図中の遺伝子の転写方向を示す。記号：Ｇ４
１８r 、ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーターの制御下にＧ４
１８に耐性を与える遺伝子。ＰＧＡＰ，ＧＡＰＤＨ遺伝
子プロモーター。ＴＧＡＰ，ＧＡＰＤＨ遺伝子ターミネ
ーター。Ａｐr 、アンピシリン耐性遺伝子。ＴＲＰ１、
トリプトファン要求性（ｔｒｐ１）回復遺伝子。ＩＲ、
酵母２μｍＤＮＡ中の逆位の繰り返し配列。
【図３】図３はプラスミドｐＹＭＴ２２１Ｇの構成を示
す。
す。
【図４】図４はプラスミドｐＹＭＳＴ２２２Ｇの構成を
示す。
示す。
【図５】図５はプラスミドｐＹＭＲ２２２Ｇの構成を示
す。
す。
【図６】図６はグルコースで培養したときの、親株と形
質転換体のマルターゼ活性を示す。
質転換体のマルターゼ活性を示す。
【図７】図７はグルコースで培養したときの、親株と形
質転換体のマルトースパーミアーゼ活性を示す。
質転換体のマルトースパーミアーゼ活性を示す。
【図８】図８は発酵中の酵母増殖量（ＯＤ６６０）を示
す。
す。
【図９】図９はグルコースの資化経過を示す。
【図１０】図１０はマルトースの資化経過を示す。
【図１１】図１１はマルトトリオースの資化経過を示
す。
す。
【図１２】図１２はマルトースの消費速度を示す。
【図１３】図１３はエキスの消費経過を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/53 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 柴野 裕次 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社基礎研究所内 (72)発明者 芦刈 俊彦 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社基礎研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子のプロモーターおよび該プロモーターの制
御下にあるマルトースパーミアーゼの構造遺伝子を含有
する酵母を用いて高濃度麦汁を発酵させ、高濃度ビール
を得ることを特徴とするビールの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03858993A JP3426633B2 (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | ビールの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03858993A JP3426633B2 (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | ビールの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06245750A true JPH06245750A (ja) | 1994-09-06 |
| JP3426633B2 JP3426633B2 (ja) | 2003-07-14 |
Family
ID=12529489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03858993A Expired - Fee Related JP3426633B2 (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | ビールの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3426633B2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996025483A1 (fr) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Suntory Limited | Procede de production de biere |
| US6013288A (en) * | 1995-02-17 | 2000-01-11 | Suntory Limited | Process for manufacturing beer |
| JP2009537173A (ja) * | 2006-05-19 | 2009-10-29 | ハイネケン・サプライ・チェーン・ビー．ブイ． | 酵母発酵飲料の生産のための連続的方法 |
| JP2009537170A (ja) * | 2006-05-19 | 2009-10-29 | ハイネケン・サプライ・チェーン・ビー．ブイ． | 酵母発酵飲料を生産する方法 |
| JP4430132B1 (ja) * | 2008-09-09 | 2010-03-10 | サントリーホールディングス株式会社 | ハイブリッドアルファーグルコシドトランスポーター |
| JP4430133B1 (ja) * | 2008-09-09 | 2010-03-10 | サントリーホールディングス株式会社 | グルコース誘導性不活化／分解耐性トランスポーター遺伝子及びその用途 |
| AU2008297027B2 (en) * | 2008-09-09 | 2011-08-18 | Suntory Holdings Limited | Glucose-induced inactivation/degradation-resistant transporter gene and use thereof |
| JP2013138621A (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-18 | Kirin Brewery Co Ltd | 高濃度仕込によるビールテイスト飲料の製造方法 |
-
1993
- 1993-02-26 JP JP03858993A patent/JP3426633B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996025483A1 (fr) * | 1995-02-17 | 1996-08-22 | Suntory Limited | Procede de production de biere |
| US6013288A (en) * | 1995-02-17 | 2000-01-11 | Suntory Limited | Process for manufacturing beer |
| JP2009537173A (ja) * | 2006-05-19 | 2009-10-29 | ハイネケン・サプライ・チェーン・ビー．ブイ． | 酵母発酵飲料の生産のための連続的方法 |
| JP2009537170A (ja) * | 2006-05-19 | 2009-10-29 | ハイネケン・サプライ・チェーン・ビー．ブイ． | 酵母発酵飲料を生産する方法 |
| KR101426061B1 (ko) * | 2006-05-19 | 2014-08-01 | 하이네켄 서플라이 체인 비.브이. | 효모 발효 음료의 제조 방법 |
| WO2010029612A1 (ja) * | 2008-09-09 | 2010-03-18 | サントリーホールディングス株式会社 | グルコース誘導性不活化／分解耐性トランスポーター遺伝子及びその用途 |
| JP4430133B1 (ja) * | 2008-09-09 | 2010-03-10 | サントリーホールディングス株式会社 | グルコース誘導性不活化／分解耐性トランスポーター遺伝子及びその用途 |
| WO2010029610A1 (ja) * | 2008-09-09 | 2010-03-18 | サントリーホールディングス株式会社 | ハイブリッドアルファーグルコシドトランスポーター |
| AU2008297027B2 (en) * | 2008-09-09 | 2011-08-18 | Suntory Holdings Limited | Glucose-induced inactivation/degradation-resistant transporter gene and use thereof |
| US8048667B2 (en) | 2008-09-09 | 2011-11-01 | Suntory Holdings Limited | Hybrid alpha-glucoside transporter |
| US8053224B2 (en) | 2008-09-09 | 2011-11-08 | Suntory Holdings Limited | Glucose-induced inactivation/degradation-resistant transporter gene and use thereof |
| JP4430132B1 (ja) * | 2008-09-09 | 2010-03-10 | サントリーホールディングス株式会社 | ハイブリッドアルファーグルコシドトランスポーター |
| JP2013138621A (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-18 | Kirin Brewery Co Ltd | 高濃度仕込によるビールテイスト飲料の製造方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3426633B2 (ja) | 2003-07-14 |
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