WO2010005243A2 - 패각류 유래의 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법 - Google Patents

패각류 유래의 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법 Download PDF

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이철원
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주식회사 서진바이오텍
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/618—Molluscs, e.g. fresh-water molluscs, oysters, clams, squids, octopus, cuttlefish, snails or slugs

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a water-soluble conchiolin-containing extract derived from shellfish, and more particularly, to recover the insoluble precipitate by centrifuging the shellfish powder with acetic acid and then citrate the precipitate. It relates to a method for producing a water-soluble conchiolin containing extract comprising the step of dissolving in dialysis buffer.
  • the present invention is derived as part of the fisheries specific research and development project of the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries Food Ministry [Task Management No .: F10502608A 220000110, Task name: Herbal materialization and practical technology development of functional aquatic products using nanoenzyme technology].
  • shells in Chinese medicine prescription include shells of 13 kinds (abalone, eardrum, mussel, mother-of-pearl, glass clam, oyster, clam shell, large king clam, lily, clam, dong clam, scallop and clam). It is used. These shells are used for the detoxification, treatment of the stomach, intestines, liver, lungs, conjunctiva and skin thickening, and are mostly used in a dry state.
  • oyster shells have the effect of treating pulmonary tuberculosis, lymphatic tuberculosis, subcutaneous hypertrophy.
  • the clam shell has the effect of cleansing detoxification and moisturizing the skin and treating window (dermatitis).
  • the shell shell has the effect of treating stomach, duodenal ulcers and stomach pain, etc.
  • the shell of the zucchini has the effect of treating stomach, duodenal ulcers and burns.
  • Conchiolin which is a kind of light protein obtained from shells of shellfish, has an excellent effect on skin moisturizing and the like, and is used in cosmetics or external skin preparations. At this time, since conchiolin is an insoluble protein, dissolution is required in order to be used in cosmetics and the like.
  • the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art, an object of the present invention, containing a water-soluble conchioline that can be safely applied to the human body from shellfish through a simple manufacturing process using a weak acid, acetic acid and citrate buffer solution It is to provide a method for obtaining the extract in high yield.
  • the present invention is water-containing conchiolin containing the step of recovering the insoluble precipitate by demineralizing the shellfish powder with acetic acid and then centrifuging and dissolving the precipitate in citrate buffer It provides a method for preparing an extract.
  • the present invention also provides a method for preparing a water-soluble conchiolin-containing extract, wherein the step of recovering the precipitate further comprises the step of removing excess acetic acid remaining in the precipitate and then drying.
  • the present invention is the production of one or more water-soluble conchiolin-containing extract of the shellfish selected from the group consisting of oysters, mussels, clams, clams, clams, pearl mussels, donjuk, abalone, taste clams, modified clams, pearl clams and key clams.
  • the shellfish selected from the group consisting of oysters, mussels, clams, clams, clams, pearl mussels, donjuk, abalone, taste clams, modified clams, pearl clams and key clams.
  • the present invention provides a method for producing a water-soluble conchiolin-containing extract, characterized in that the acetic acid concentration is in the range of 3M to 10M, used in a volume of 5 to 15 times the weight of shellfish powder.
  • the present invention provides a method for producing a water-soluble conchiolin containing extract, characterized in that the deliming is carried out at 20 °C to 30 °C for 5 hours to 24 hours.
  • the present invention also provides a method for producing a water-soluble conchiolin-containing extract, characterized in that the centrifugation is carried out for 5 to 30 minutes in the 2,000 to 20,000 rpm range.
  • the present invention provides a method for producing a water-soluble conchiolin-containing extract, characterized in that the drying is carried out at 50 °C to 100 °C for 8 hours to 24 hours.
  • the present invention also provides a method for producing a water-soluble conchiolin-containing extract, characterized in that the concentration of the citrate buffer is in the range of 0.01M to 1M.
  • the present invention provides a method for producing a water-soluble conchiolin containing extract, characterized in that the pH of the citrate buffer is in the range of 5.5 to 6.5.
  • the present invention provides a method for producing a water-soluble conchiolin containing extract, characterized in that the dialysis is carried out for 15 hours to 72 hours.
  • a water-soluble conchiolin-containing extract that can be safely applied to the human body from shellfish through a simple manufacturing process can be obtained in high yield, the water-soluble conchiolin-containing extract has excellent anti-inflammatory activity,
  • the present invention is very useful in the pharmaceutical and cosmetic industries because it exhibits antioxidant activity and tyrosinase inhibitory activity and can be used as a raw material for anti-inflammatory agents, antioxidants and skin whitening agents.
  • Example 1 is a graph comparing the protein concentration, the sugar concentration and the ratio of Example 1 and Comparative Examples 1 to 8.
  • Figure 2 is a graph showing the concentration of the protein of the supernatant prepared from conchiolin powder extracted from shells.
  • Figure 3 is a graph showing the concentration of sugar in the supernatant prepared from conchiolin powder extracted from shells.
  • Figure 4 is a graph showing the COX-2 inhibition rate (inhibition rate) caused by conchiolin prepared using citrate buffer solution and urea.
  • Figure 5 is a graph showing the inhibition rate of Example 1, Comparative Example 2, ascorbic acid, caffeine.
  • One aspect of the present invention relates to a method for preparing an extract containing water-soluble conchiolin from shellfish.
  • the manufacturing method includes the step of recovering the insoluble precipitate by demineralizing the shellfish powder with acetic acid and then centrifuging and dissolving the precipitate in citrate buffer and dialysis. .
  • the method for producing a water-soluble conchiolin-containing extract of the present invention uses a deliming step using acetic acid and a dialysis step using a citrate buffer solution, the method can be safely applied to the human body, and the process is simple. Yield is also high.
  • the water-soluble conchiolin-containing extract obtained therefrom has excellent anti-inflammatory activity, antioxidant activity, tyrosinase inhibitory activity, and the like, and thus is very useful as a raw material for anti-inflammatory agents, antioxidants, skin whitening agents and the like.
  • shellfish powder is demineralized with acetic acid and then centrifuged to recover insoluble precipitate.
  • the shellfish it is preferable to use at least one selected from the group consisting of oysters, mussels, clams, clams, birds clams, pearl mussels, donjuk, abalone, flavor clams, modified clams, pearl clams and key clams, among them oysters Most preferably used.
  • the shell is prescribed in Chinese medicine, such as a tympanic membrane, mother-of-pearl, clam shell (lily) shells, lilies, scallop shells can be used without particular limitation.
  • the concentration of acetic acid is preferably in the range of 3M to 10M, more preferably in the range of 5M to 8M.
  • the acetic acid is preferably used in an amount of 5 times to 15 times the volume (ml) of the shellfish powder weight (g), more preferably in an amount of 8 times to 12 times the volume (ml). Therefore, in the case of the deliming process, it is preferably carried out for 5 hours to 24 hours at 20 ° C to 30 ° C, preferably for 6 hours to 12 hours at room temperature.
  • the centrifugation is preferably performed for 5 minutes to 30 minutes in the range of 2,000 rpm to 20,000 rpm, and more preferably for 10 minutes to 20 minutes in the range of 8,000 rpm to 15,000 rpm.
  • impurities can be removed and an insoluble primary precipitate sufficiently containing the desired conchiolin can be efficiently obtained.
  • the step of recovering the precipitate may further include a step of removing excess acetic acid remaining in the precipitate and drying after excess acetic acid remains in the precipitate.
  • the excess acetic acid can be removed from the precipitate by a conventional method, for example, can be removed using distilled water.
  • the drying process may be carried out according to a conventional method well known in the art, preferably, it may be performed for 8 to 24 hours in a dry oven (50 °C to 100 °C). More preferably, it may be dried in an oven at 60 ° C. to 80 ° C. for 10 hours to 15 hours, but is not particularly limited thereto, and a person skilled in the art may determine drying conditions depending on the type of shellfish powder used, the concentration of acetic acid, and the like. You can decide accordingly.
  • the precipitate obtained in the first step is dissolved in citrate buffer and dialyzed to obtain an extract containing water-soluble conchiolin.
  • the concentration of the citrate buffer solution is preferably in the range of 0.01M to 1M, more preferably in the range of 0.05M to 0.2M.
  • the pH of the citrate buffer solution is preferably in the range of 5.5 to 6.5, more preferably in the range of 5.75 to 6.25.
  • the content of the citrate buffer solution is not particularly limited, and may be appropriately selected and determined by those skilled in the art according to the content of the precipitate and the concentration of urea.
  • the dialysis process is preferably performed for 15 hours to 72 hours, and more preferably for 24 hours to 72 hours according to a conventional method.
  • dialysis is performed in the above condition range, unnecessary impurities are removed more cleanly, and only an extract containing sufficient water-soluble conchiolin safe to human body can be obtained in high yield.
  • the water-soluble conchiolin-containing extract of the present invention obtained by the above method has excellent anti-inflammatory activity, antioxidant activity and tyrosinase inhibitory activity.
  • the water-soluble conchiolin-containing extract obtained by the production method of the present invention exhibits anti-inflammatory activity by inhibiting the activity of cyclooxygenase (COX) enzymes involved in the inflammatory transfer reaction in vivo, and hydrogen-free It exhibits antioxidant activity by having DPPH radical scavenging activity which has a radical, and linolenic acid autooxidation inhibitory activity.
  • COX cyclooxygenase
  • water-soluble conchiolin-containing extract effectively inhibits the activity of tyrosinase, which is one of the main causes of pigmentation, and can be used as a raw material for skin whitening agents as well as anti-inflammatory agents and antioxidants.
  • Test Example 1 Result of Quantitative Analysis
  • Example 1 Comparative Example 1 to Comparative Example 8 extracted from the protein concentration, the sugar concentration and the ratio of the comparative analysis are shown in Table 2 and FIG.
  • Comparative Example 1 the protein concentration was measured in order of Comparative Example 2, Example 1, Comparative Example 5, Comparative Example 3.
  • the extraction ratio of protein and sugar was low as 8.83: 1. That is, since protein extraction was maximized while minimizing sugar extraction, it can be seen that the citrate buffer solution is particularly effective for dialysis.
  • citrate buffer solution and urea were dissolved in the conchiolin powders extracted from the six shellfish shown in Table 3, respectively, and beads were added thereto, followed by reaction under the same conditions at 37 ° C. for 2 hours, and the protein of the supernatant.
  • concentration of and the concentration of sugars are shown in Table 3 and FIGS. 2 and 3.
  • citrate buffer solution to extract active protein from shellfish.
  • the process of inflammation involves a series of reactions induced by numerous stimuli such as infectious agents, ischemia, antigen-antibody reactions, fever or other physical injuries, and erythema Clinical symptoms include edema, tenderness, and pain.
  • Arachidonic acid is produced by cyclooxygenase (COX) to produce various prostaglandins and thromboxanes that are involved in platelet aggregation.
  • COX cyclooxygenase
  • the cyclooxygenase enzyme is composed of COX-1 enzyme, which plays an important role in maintaining homeostasis of normal tissues, and COX-2 enzyme, an inducible enzyme that temporarily increases in inflammatory processes.
  • COX-1 (type 1: constitutive form) enzymes are components of tissues and are known to be interspersed in tissues including the gastrointestinal tract.
  • the enzyme regulates the amount of local prostaglandins involved in the maintenance of vascular flow, cell division, mucus and bicarbonate production in each tissue.
  • Inhibition of activity by NSAIDs Non Steroidal Analgesic Inflammation Drugs
  • the COX-1 enzyme is an enzyme that coagulates the blood to prevent the spread of inflammatory factors, makes it difficult for blood to flow, and creates a substance that constricts blood vessels (Thromboxane A2). It is an enzyme that produces.
  • COX-2 type 2: induced form enzymes
  • COX-2 is found primarily in the brain and kidneys, and are also found in some inflammatory cells, particularly at the site of inflammation.
  • COX-2 is an enzyme that produces prostaglandin E2, an inflammation-causing substance, and also promotes the production of prostacyclin (Prostaglandin I2), a substance that prevents blood clots and dilates blood vessels. to be.
  • the extract prepared using the citrate buffer solution is likely to be an extract containing high purity conchiolin having anti-inflammatory effect by removing a substantial portion of the sugar that was a problem during the purification process.
  • ROS cytotoxicity
  • ROS reactive oxygen species
  • the antioxidant capacity of the extracts of Example 1 and Comparative Example 2 was measured by measuring the DPPH radical scavenging activity. At this time, ascorbic acid and caffeic acid were used as controls.
  • the antioxidant activity was tested by measuring the absorbance according to the degree of color development with the scavenging ability of the free radical DPPH.
  • the method of Blois (1958) was modified. First, 0.6 ml of ethanol was added to 0.6 ml of the sample. Then, 0.025 ml of 1 mM DPPH dissolved in methanol was added and reacted for 30 minutes. The absorbed solution was measured at 550 nm using a UV-vis spectrometer. Inhibition rate was calculated by the following formula and are shown in Table 5 and FIG.
  • Blank untreated DPPH
  • A distilled water
  • B sample (each extract obtained in Example 1)
  • Example 1 the free radical scavenging activity of Example 1 and Comparative Example 2 was confirmed that the activity is similar within the error range.
  • ascorbic acid and caffeic acid used as a positive control showed excellent activity of more than 80% as a purified substance that is currently used as an antioxidant.

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Abstract

본 발명은 아세트산을 이용한 탈석회 공정 등을 통하여 패각류로부터 수용성 콘키올린을 함유하는 추출물을 고수율로 간단하게 수득할 수 있는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 따라 수득되는 추출물은 인체에 안전하게 적용할 수 있고, 우수한 항염증활성, 항산화활성 및 티로시나제(tyrosinase) 저해활성을 가지므로, 항염증제, 항산화제 및 피부미백제 등의 원료로서 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

패각류 유래의 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법
본 발명은 패각류 유래의 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 패각류 분말을 아세트산으로 탈석회시킨 후 원심분리하여 불용해된 침전물을 회수하는 단계 및 상기 침전물을 시트레이트 버퍼액에 녹여 투석하는 단계를 포함하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 농림수산식품부의 수산특정연구개발사업의 일환으로 도출된 것이다[과제관리번호: F10502608A 220000110, 과제명: 나노효소기술을 이용한 기능성 수산물의 한방소재화 및 실용화 기술개발].
한약처방 중 패각에 관한 처방으로는 13가지 종류(전복, 고막, 담치, 진주모, 유리조개, 굴, 가막(재첩) 조개, 대왕 조개, 백합, 바지락, 동죽, 칼조개, 맛조개)의 패각이 이용되고 있다. 이 패각들은 청열해독과, 위, 장, 간, 폐, 결막 및 피부 농창의 치료 등에 사용되고 있고, 대부분 건조된 상태로 이용되고 있다.
현재 한의학에서 이용되고 있는 대표적인 패각의 종류 및 약성을 보면, 굴 패각은 폐결핵에 의한 패열, 임파선 결핵, 붕루대하 등을 치료하는 효과가 있다. 바지락 패각은 청열해독과 피부를 윤택하게 하고, 창(피부염) 등을 치료하는 효과가 있다. 또한 피조개 패각은 위, 십이지장궤양 및 위통 등을 치료하는 효과가 있고, 동죽 패각은 위, 십이지장 궤양 및 화상 등을 치료하는 효과가 있다.
이러한 조개류의 패각으로부터 얻어지는 경단백질의 일종인 콘키올린(conchiolin)은, 피부 보습 등에 우수한 효과를 나타내어 화장품 또는 피부외용제 등에 사용되고 있다. 이 때, 콘키올린은 불용성 단백질이기 때문에, 화장품 등에 이용되기 위해서는 용해가 필요하다.
종래 콘키올린을 제조 또는 가수분해하는 방법으로는, 패각분말에 HCl, EDTA, NaOH 용액 등 강산이나 약알칼리 수용액을 첨가하여 탈석회시키는 방법이 있었다. 그러나 상기 방법들은 수득율 및 인체 적용율이 낮고 제조공정이 복잡하여 상업화 하기에 적절하지 않은 문제점이 있었다.
본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은, 약산인 아세트산 및 시트레이트 버퍼액을 이용하는 간단한 제조공정을 통하여 패각류로부터 인체에 안전하게 적용할 수 있는 수용성 콘키올린 함유 추출물을 고수율로 수득하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 패각류 분말을 아세트산으로 탈석회시킨 후 원심분리하여 불용해된 침전물을 회수하는 단계 및 상기 침전물을 시트레이트 버퍼에 녹여 투석하는 단계를 포함하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 침전물을 회수하는 단계는, 상기 침전물에 남아있는 여분의 아세트산을 제거한 후 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 패각류가 굴, 홍합, 바지락, 피조개, 새조개, 진주담치, 동죽, 전복, 맛조개, 개조개, 진주조개 및 키조개로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아세트산이 농도가 3M 내지 10M 범위이고, 패각류 분말 무게의 5배 내지 15배의 부피로 사용되는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 탈석회가 20℃ 내지 30℃에서 5시간 내지 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 원심분리가 2,000 내지 20,000rpm범위에서 5분 내지 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 건조가 50℃ 내지 100℃에서 8시간 내지 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 시트레이트 버퍼의 농도가 0.01M 내지 1M 범위인 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 시트레이트 버퍼의 pH가 5.5 내지 6.5범위인 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 투석이 15시간 내지 72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 간단한 제조공정을 통하여 패각류로부터 인체에 안전하게 적용할 수 있는 수용성 콘키올린 함유 추출물을 고수율로 수득할 수 있고, 상기의 수용성 콘키올린 함유 추출물은 우수한 항염증 활성, 항산화 활성 및 티로시나제 저해 활성을 나타내어 항염증제, 항산화제, 피부 미백제의 원료로서 사용될 수 있으므로, 본 발명은 의약 및 화장품 산업상 매우 유용하다.
도 1은 실시예1, 비교예1 내지 비교예8의 단백질 농도, 당 농도 및 비율을 비교분석한 그래프이다.
도 2는 패각류로부터 추출된 콘키올린 파우더로부터 제조된 상층액의 단백질의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 패각류로부터 추출된 콘키올린 파우더로부터 제조된 상층액의 당의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 시트레이트 버퍼액과 요소를 이용하여 제조된 콘키올린에 의하여 유발되는 COX-2 저해율(inhibition rate)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예1, 비교예2, 아스코르브산, 카페인의 저해율을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양상은 패각류로부터 수용성 콘키올린을 함유하는 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기의 제조방법은, 패각류 분말을 아세트산으로 탈석회시킨 후 원심분리하여 불용해된 침전물을 회수하는 단계 및 상기 침전물을 시트레이트 버퍼액(citrate buffer)에 녹여 투석하는 단계를 포함한다.
본 발명의 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법은, 아세트산을 이용한 탈석회 공정 및 시트레이트 버퍼액을 이용한 투석 공정 등을 이용하기 때문에, 인체에 안전하게 적용할 수 있고, 공정도 간단하며, 상기 추출물의 수득율도 높다. 또한, 그로부터 얻어지는 수용성 콘키올린 함유 추출물은 우수한 항염증 활성, 항산화 활성 및 티로시나제 저해활성 등을 가지므로, 항염증제, 항산화제, 피부 미백제 등의 원료로서 매우 유용하다.
이하, 본 발명의 제조방법을 단계별로 자세하게 설명한다.
제1단계:
먼저, 패각류 분말을 아세트산으로 탈석회시킨 후 원심분리하여 불용해된 침전물을 회수한다.
상기 패각류로는 굴, 홍합, 바지락, 피조개, 새조개, 진주담치, 동죽, 전복, 맛조개, 개조개, 진주조개 및 키조개로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 그 중에서도 굴을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 그러나, 고막, 진주모, 가막(재첩) 조개, 백합, 칼조개 등 한약에서 처방되는 패각이면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.
상기 아세트산의 농도는 3M 내지 10M 범위인 것이 바람직하며, 5M 내지 8M 범위의 것이 보다 바람직하다. 또한 상기 아세트산은 패각류 분말 무게(g)의 5배 내지 15배 부피(㎖)의 양으로 사용하는 것이 바람직하며, 8배 내지 12배 부피(㎖)의 양으로 사용하는 것이 보다 바람직하다. 따라서, 상기 탈석회 공정의 경우는 20℃ 내지 30℃에서 5시간 내지 24시간, 바람직하게는 상온에서 6시간 내지 12시간 동안 수행되는 것이 좋다. 아세트산을 상기 범위의 농도 및 함량으로 사용하고, 탈석회 공정을 상기의 온도 범위 및 시간 범위 내에서 수행함으로써, 콘키올린을 충분히 함유하는 1차 침전물을 수득할 수 있다.
한편 상기 원심분리는 2,000rpm 내지 20,000rpm 범위에서 5분 내지 30분 동안 수행되는 것이 바람직하며, 8,000rpm 내지 15,000rpm 범위에서 10분 내지 20분간 수행되는 것이 보다 바람직하다. 상기 조건 범위로 원심분리를 수행하는 경우, 불순물들이 제거되고 목적하는 콘키올린을 충분히 함유하는 불용성의 1차 침전물을 효율적으로 수득할 수 있다.
여기서, 상기 침전물을 회수하는 단계는 상기 침전물에 여분의 아세트산이 남아있을 경우, 상기 침전물에 남아있는 여분의 아세트산을 제거한 후 건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 때, 상기 여분의 아세트산은 통상의 방법에 의하여 침전물로부터 제거될 수 있으며, 예를 들면, 증류수를 이용하여 제거될 수 있다.
또한 상기 건조 공정도 당업계에서 잘 알려진 통상의 방법에 따라 수행될 수 있는데, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 드라이 오븐(dry oven)에서 8시간 내지 24시간 동안 수행될 수 있다. 보다 바람직하게는 60℃ 내지 80℃의 오븐에서 10시간 내지 15시간 동안 건조시킬 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 패각류 분말의 종류, 아세트산의 농도, 함량 등에 따라 당업자가 건조 조건을 적절히 결정할 수 있다.
제2단계:
상기 제1단계에서 얻어진 침전물을 시트레이트 버퍼액에 녹여 투석함으로써 수용성 콘키올린을 함유하는 추출물을 수득한다.
이때, 상기 시트레이트 버퍼액의 농도가 0.01M 내지 1M 범위인 것이 바람직하고 0.05M 내지 0.2M 범위인 것이 보다 바람직하다. 상기 농도범위 내의 시트레이트 버퍼액을 사용하면, 요소보다 더욱더 고순도이며 안전한 수용성 콘키올린 함유 추출물을 보다 높은 수율로 수득할 수 있다.
또한, 상기 시트레이트 버퍼액의 pH가 5.5 내지 6.5범위인 것이 바람직하고 pH가 5.75 내지 6.25 범위인 것이 보다 바람직하다. 상기 pH범위 내의 시트레이트 버퍼액을 사용하면, 더욱더 고순도이며 안전한 수용성 콘키올린 함유 추출물을 보다 높은 수율로 수득할 수 있다.
상기 시트레이트 버퍼액의 함량은 특별한 제한이 없으며, 사용되는 침전물의 함량 및 요소의 농도에 따라 당업자가 적절히 선택하여 결정할 수 있다.
상기 투석 공정은 통상의 방법에 따라 15시간 내지 72시간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 24시간 내지 72시간 동안 수행되는 것이 보다 바람직하다. 상기의 조건 범위로 투석을 수행하게 되면, 불필요한 불순물들은 보다 깨끗이 제거되고, 인체에 안전한 수용성 콘키올린을 충분히 함유하는 추출물만을 고수율로 수득할 수 있다.
상기와 같은 방법에 의해 수득되는 본 발명의 수용성 콘키올린 함유 추출물은, 우수한 항염증 활성, 항산화 활성 및 티로시나제 저해활성을 갖는다. 구체적으로, 본 발명의 제조방법에 의해 수득되는 수용성 콘키올린 함유 추출물은, 생체 내 염증전달 반응에 관여하는 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase; COX) 효소의 활성을 저해함으로써 항염증 활성을 나타내며, 수소 자유 라디칼을 갖는 DPPH 라디칼 소거활성 및 리놀렌산 자동산화 억제활성을 가짐으로써 항산화 활성을 나타낸다. 또한, 상기 수용성 콘키올린 함유 추출물은 색소침착의 주된 원인 중 하나인 티로시나아제의 활성을 효과적으로 억제하는 바, 항염증제, 항산화제뿐만 아니라 피부 미백제의 원료로서도 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 자세히 설명하나, 이는 단지 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예1 및 비교예1 내지 8: 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조
굴의 가공분말 30g과 6.5M 아세트산 300㎖, 즉 1:10(W/V)의 비율로 37℃에서 12시간 동안 탈석회시킨 후, 15분 동안 10℃에서 7,000rpm으로 원심분리하여 1차 침전물을 회수하였다. 상기 1차 침전물에 남아있는 여분의 아세트산을 증류수로 세번 제거한 다음, 20분간 4℃에서 9,000rpm으로 원심분리하고, 동결건조하여 분말상태의 2차 침전물 0.3g을 수득하였다. 상기 2차 침전물을 표 1에 기재된 버퍼액에 녹이고, 이 혼합물에 비드를 넣고 2시간 동안 37℃에서 200rpm으로 교반하면서 단백질을 추출하였다. 추출된 상층액은 투석튜브에서 1차 증류수로 3회 탈염시킨 후 24시간 동안 투석하고, 부유물은 원심분리를 통하여 제거하여 최종적으로 수용성 콘키올린을 함유하는 추출물을 수득하였다.
표 1
Figure PCTKR2009003745-appb-T000001
시험예1: 정량분석결과
(1) 굴로부터 단백질 및 당 추출
굴에서 추출한 실시예1, 비교예1 내지 비교예8의 단백질 농도, 당 농도 및 비율을 비교분석한 것을 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2009003745-appb-T000002
표 2 및 도 1을 참조하면, 비교예2, 실시예1, 비교예5, 비교예3 순으로 단백질 농도가 높게 측정되었다. 하지만, 실시예1은 단백질과 당의 추출비율이 8.83:1로 낮게 추출되었다. 즉, 당 추출을 최소화하면서 단백질 추출이 최대화되었기 때문에, 시트레이트 버퍼액이 투석용으로 특히 효과적인 것을 알 수 있다. 반면에, 단백질과 당의 추출비율이 실시예1 보다 우수한 비교예1, 비교예3, 비교예4, 비교예5, 비교예6이 단백질 농도가 낮아 추출물로 바람직하지 않다.
(2) 패각류별 단백질 및 당 추출
하기 표 3에 기재된 6종의 패각류로부터 추출된 콘키올린 파우더에 각각 시트레이트 버퍼액과 요소를 넣어 녹이고 비드를 첨가한 뒤, 37℃에서 2시간 동안 동일조건으로 반응시키고, 그 상층액의 단백질의 농도와 당의 농도를 하기 표 3과 도 2, 도 3에 나타내었다.
표 3
Figure PCTKR2009003745-appb-T000003
표 3, 도 2 및 도 3을 참조하면, 바지락, 진주담치 및 새조개의 경우에는, 시트레이트 버퍼액을 이용하여 제조한 추출물이 요소를 이용하여 제조한 추출물보다 단백질의 수득률이 높았다. 하지만, 피조개의 경우, 요소를 이용하여 제조한 추출물이 시트레이트 버퍼액을 이용하여 제조한 추출물보다 단백질의 수득률이 2배 정도 높게 측정되었다. 또한, 동죽의 경우 시트레이트 버퍼액을 이용하여 제조한 추출물과 요소를 이용하여 제조한 추출물이 단백질의 수득률이 동일하였다. 그러나 진주담치를 제외한 5가지 패각이 시트레이트 버퍼액을 이용하여 제조한 추출물이 요소를 이용하여 제조한 추출물의 경우보다 당의 수득률이 최대 13배 높게 측정되었다.
따라서, 패각류로부터 활성 단백질을 추출하기 위해 시트레이트 버퍼액을 이용하는 것이 바람직하다.
시험예 2: 항염증 활성 측정
염증이 일어나는 과정은 감염성 물질(infectious agents), 허헐(ischemia), 항원-항체 반응, 열 또는 다른 신체적인 상처 등과 같은 수많은 자극에 의하여 유도되는 일련의 반응을 수반하며, 염증반응에는 홍반(erythema), 부종(edema), 압통(tenderness), 통증 등의 임상증상이 나타난다.
아라키돈산(arachidonic acid)은 사이클로옥시게나제(COX)에 의해서 생체 내 염증전달 반응에 중요한 역할을 하는 각종 프로스타글란딘(prostaglandin)과 혈소판 응집에 관여하는 트롬복산(thromboxane)을 생성한다. 상기 사이클로옥시게나제 효소는 정상조직의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 COX-1 효소와 염증과정에서 일시적으로 발현이 증가하는 유도성 효소인 COX-2 효소로 구성되어 있다.
COX-1(타입 1: constitutive form) 효소는 조직의 구성요소이며, 위장관계를 포함한 조직에 산재하는 것으로 알려져 있다. 이 효소는 각 조직에서 혈류(vascular flow)의 유지, 세포분화(cell division), 점액(mucus)과 중탄산염(bicarbonate)의 생성 등에 관여하는 국소적인 프로스타글란딘의 양을 조절하는데, 이러한 COX-1 효소의 활성을 NSAIDs (Non Steroidal Analgesic Inflammation Drugs)가 저해함으로써 위 장관과 신장의 부작용 및 항 혈소판 작용(antiplatelet activity)이 나타난다. 다시 말해서 COX-1 효소는 염증인자가 퍼지지 않도록 혈액을 응고시키고, 피가 잘 통하지 않게 하고, 혈관을 수축시키는 물질(Thromboxane A2)을 만들어내는 효소이며, 동시에 위점막이 파괴되지 않도록 점막 보호 물질을 만들어내는 효소이다.
반면에, COX-2(타입 2: induced form) 효소는 뇌와 신장에서 주로 발견되며, 일부 염증성 세포(inflammatory cells)에서도 발견되고, 특히 염증 부위에서 유도되는 것으로 알려져 있다. COX-2 효소는 염증을 유발하는 물질인 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2)를 생성하는 효소이며, 또한 혈전을 예방하고 혈관을 확장하는 물질인 프로스타사이클린(Prostacyclin(Prostaglandin I2))의 생성도 촉진하는 효소이다.
이러한 COX-1 및 COX-2 효소의 저해활성을 측정함으로써 시료의 항염증 활성을 측정할 수 있다. 본 실험에서는, 다음과 같은 실험방법으로 유발되는 염증을 억제하는 단백질(실시예 1에서 수득된 각 수용성 콘키올린 함유 추출물)의 효능을 평가하였다.
사이클로옥시게나제(cyclooxygenase) 저해율 측정 실험방법
하기 표 4에 기재된 6종류의 패각류를 시트레이트 버퍼액과 요소를 이용하여 2시간 추출 후, 투석과정을 거쳐 천연 콘키올린(단백질 농도: 10㎍/㎖)을 추출하였다. 천연 콘키올린에 의하여 유발되는 COX-2 저해율 (inhibition rate, %)을 표 4 및 도 4에 나타내었다.
표 4
Figure PCTKR2009003745-appb-T000004
표 4 및 도 4를 참조하면, 굴, 바지락, 동죽, 진주담치 및 새조개에서 시트레이트 버퍼액을 이용하여 제조된 추출물이 요소를 이용하여 제조된 추출물보다 COX-2 저해율이 높음을 확인할 수 있다. 반면에, 피조개에서는 요소를 이용하여 제조된 추출물이 시트레이트 버퍼액을 이용하여 제조된 추출물보다 COX-2 저해율이 높았으나, 그 저해율 차이가 크지 않음을 알 수 있다.
따라서, 시트레이트 버퍼액을 이용하여 제조된 추출물은, 정제과정 중 문제가 되었던 당을 상당부분제거함으로써 항염효능을 지닌 고순도 콘키올린을 함유한 추출물일 가능성이 높다.
시험예 3: 항산화 활성 측정
세포독성과 관련된 활성산소 종(ROS)은 노화, 암, 심장질환, 치매와 같은 퇴행성 질환이나 병리학적 질병을 초래하게 되는 것으로 알려져 있다. ROS로 인한 과산화물들과 분해산물들은 반응성이 높아 주변의 생체분자(DNA, 단백질, 다른 세포인자)들의 구조와 기능을 변화시킨다. 생체 내에는 활성산소종(ROS)을 방어하는 기전들이 다양하게 보유되어 있지만, 세포 내의 ROS 농도가 초과했을 때에는 부득이하게 손상이 일어난다. 그래서 외부로부터 항산화 물질의 섭취를 통하여, 간접적으로는 세포 자가 면역 조절능을 증가시킴으로써 조직의 산화적 손상을 저하시키고, 직접적으로는 자유 라디칼 종(free radical species)의 소거를 돕는다.
항산화 실험방법
실시예1 및 비교예2의 추출물(0.5㎎/㎖)의 항산화 능력을 DPPH 라디칼 소거 활성(DPPH radical scavenging activity)을 측정하는 방법으로 측정하였다. 이 때, 대조군으로는 아스코르브산 및 카페인산(caffeic acid)을 사용하였다.
가. DPPH 라디칼 소거 활성
자유 라디칼인 DPPH의 소거능으로, 발색 정도에 따른 흡광도를 측정함으로써 항산화능을 테스트 하였다. 본 실험에서는 Blois(1958)의 방법을 변형시켜 사용하였다. 먼저 시료 0.6㎖에 에탄올 0.6㎖을 넣었다. 그 다음 메탄올에 녹인 1mM의 DPPH 0.025㎖을 넣고 30분간 반응시켰다. 반응시킨 액을 550㎚에서 UV-vis 스펙트로미터를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 저해율을 하기 식으로 계산하여 표 5 및 도 5에 나타내었다.
블랭크: 처리되지 않은 DPPH, A: 증류수, B: 시료(실시예 1에서 수득한 각 추출물)
저해율(%) = [(A-B)/A] X 100%
표 5
Figure PCTKR2009003745-appb-T000005
표 5를 참조하면, 실시예1과 비교예2의 자유 라디칼 소거활성은 오차범위 내에서 활성이 유사함을 확인할 수 있었다. 또한 양성 대조군으로 사용한 아스코르브산과 카페인산은 현재 항산화 물질로 사용되고 있는 정제물질로 80% 이상의 우수한 활성을 나타내었다.
따라서, 실시예1의 콘키올린으로부터 추출된 단백질의 항산화 활성이 양성대조군보다는 다소 미약하나, 비교예2의 콘키올린으로부터 추출된 단백질의 항산화 활성과는 DPPH에 대한 전자공여효과가 유사함을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. 패각류 분말을 아세트산으로 탈석회시킨 후 원심분리하여 불용해된 침전물을 회수하는 단계; 및
    상기 침전물을 시트레이트 버퍼에 녹여 투석하는 단계를 포함하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 침전물을 회수하는 단계는,
    상기 침전물에 남아있는 여분의 아세트산을 제거한 후 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 패각류가 굴, 홍합, 바지락, 피조개, 새조개, 진주담치, 동죽, 전복, 맛조개, 개조개, 진주조개 및 키조개로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 아세트산은 농도가 3M 내지 10M 범위이고, 패각류 분말 무게의 5배 내지 15배의 부피로 사용하는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 탈석회는 20℃ 내지 30℃에서 5시간 내지 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 원심분리는 2,000rpm 내지 20,000rpm 범위에서 5분 내지 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법.
  7. 청구항 2에 있어서,
    상기 건조는 50℃ 내지 100℃에서 8시간 내지 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 시트레이트 버퍼는 농도가 0.01M 내지 1M 범위이며, pH가 5.5 에서 6.5 인것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 투석은 15시간 내지 72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 수용성 콘키올린 함유 추출물의 제조방법.
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