WO2009119331A1 - サイトケラチン7のmRNAの検出用プライマを含む試薬 - Google Patents
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
Definitions
- the present invention aims to provide a primer and primer set that can detect CK7 mRNA in a shorter time than conventional techniques.
- the present invention provides primers for detecting CK7 mRNA.
- This primer contains a first sequence at its 5 'side and a second sequence at its 3' side.
- the first sequence is 10-30 nucleotides in length and is capable of hybridizing to a complementary strand to the first region which is the region contained in the sequence of SEQ ID NO: 1.
- the second sequence is 10-30 nucleotides in length and is hybridizable to a second region located 3 'of the first region in the sequence of SEQ ID NO: 1.
- FIG. 5 is a schematic view showing a nucleic acid region to which a CK7 mRNA detection primer and a primer hybridize.
- the conditions are not particularly limited as long as the conditions are satisfied.
- Stringency during hybridization is known to be a function of temperature, salt concentration, length of primer, GC content of primer and concentration of chaotropic agent in hybridization buffer.
- stringent conditions for example, conditions described in Sambrook, J. et al., 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Part 2), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, etc. can be used.
- “50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate, pH 7.6, 5 ⁇ Denhart's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / ml nucleic acid In the solution containing, it can illustrate hybridization temperature 42 ° C, but it is not limited to this.
- the first sequence may be directly linked to the second sequence, or may be linked via an intervening sequence.
- the intervening sequence is preferably a sequence of low homology with CK7 mRNA or its cDNA. For example, 5'-tttt-3 'can be mentioned.
- the length of the intervening sequence is preferably 1 to 50 nucleotides, more preferably 1 to 40 nucleotides.
- the primer set may include a loop primer.
- loop primer F which is a polynucleotide capable of hybridizing to a region L located between region F2 and F1 included in the mRNA sequence of CK7, and regions R1 and R2 included in the cDNA sequence of CK7
- loop primer R which is a polynucleotide capable of hybridizing to the region M located between them.
- Exon junctions 1 to 8 Since the sequence of SEQ ID NO: 1 consists of 9 exons, there are the following 8 exon junctions (exon junctions 1 to 8). Exon junctions 1 and 2 at exons 1 and 452 and 452 junctions Exon junctions 2 and 3 on exons 2 663 and 664 junctions exons 3 and 4 on exon junctions 3: 724 and 725 Position junction portion Exon junction 4 of exons 4 and 5: junction portion of positions 820 and 821 exon junction 5 of exons 5 and 6: junction portion of positions 985 and 986 exon junction of exons 6 and 7 Junctions at positions 1111 and 1112 Exon junctions 7: 1332 and 1333 at exons 7 and 8 Junctions 8: 1367 and 1368 at exons 8 and 9
- the primer capable of hybridizing to the region containing the above-mentioned exon junction hybridizes to the mRNA, but the possibility of hybridizing to the CK7 gene in the genome is extremely low.
- By using such a primer it is possible to prevent nonspecific amplification of the CK7 gene at the time of mRNA detection by the RT-LAMP reaction.
- exon junctions 3, 5, and 6 from the viewpoints of the homology with the mRNA of other cytokeratins (for example, cytokeratin 6 and cytokeratin 8 etc.), detection rate, reproducibility of detection, etc. It is preferable to use a primer that hybridizes to a region containing any of and 8.
- primers that hybridize to a region containing any of exon junctions 1, 2, 4 and 7 are also homologous to the mRNA of other cytokeratins (cytokeratin 5, cytokeratin 6, cytokeratin 8, etc.) , Detection speed, reproducibility of detection, etc.
- the primer of the present embodiment and a specific region of CK7 mRNA to which the primer hybridizes need not be completely complementary, but may have such a degree that they can be hybridized (this means Described in U.S. Patent No. 4800159). That is, in the case of a polynucleotide having a primer function, the primer has one or more mutations such as substitution, deletion, insertion, addition, etc. introduced into the sequence having complete complementarity with the specific region. It may be a cloned polynucleotide. The mutation of this nucleotide is preferably within 4 or less.
- the polynucleotide into which this mutation has been introduced preferably has 80% or more homology, more preferably 90% or more homology, and most preferably 95% homology to the polynucleotide before mutation introduction. It has the above homology.
- the primer of the present invention can be designed based on each of the above areas.
- the following is an example of each primer.
- the description in parentheses following the indication of the sequence indicates whether each primer is identical to or complementary to any region of CK7 mRNA sequence (SEQ ID NO: 1).
- (F3 primer) SEQ ID NO: 105: 5'- TTGCCGAGGCTGAGGA-3 '(same sequence as the region of 1134 to 1149)
- the detection using RT-LAMP method is performed through an amplification step and a detection step.
- a sample containing CK7 mRNA collected from a living body is mixed with the primer set, reverse transcriptase, dNTPs and strand displacement DNA polymerase. These mixed solutions are heated to a certain temperature (for example, 65 ° C.) to carry out RT reaction and LAMP reaction to amplify CK7 cDNA.
Abstract
本発明は、その5'側に第一配列を、3'側に第二配列を含み、該第一配列は、10~30ヌクレオチドの長さを有し、配列番号1の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、該第二配列は、10~30ヌクレオチドの長さを有し、配列番号1の配列において前記第一領域よりも3'側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能である、CK7のmRNA検出用プライマに関する。
Description
本発明は、試料中のサイトケラチン7(以下、「CK7」とする)のmRNAを検出するために用いられるプライマ及びプライマセット、並びにそれらを含む試薬に関する。
CK7は、上皮細胞に見られる中間径フィラメント構成タンパク質であるサイトケラチン類の一種であり、最近では肺がんや食道がん等のリンパ節転移を検出するための分子マーカーとして有用であることが報告されている。例えば、非特許文献1によると、生体から採取したリンパ節から測定試料を調製し、該測定試料中のCK7のmRNAを核酸増幅(RT-PCR)法によって検出し、非小細胞性肺がんのリンパ節転移を高い特異性で判定できることが開示されている。
Pulteら, CANCER 2005, vol.104, No.7, 1453~61.
Pulteら, CANCER 2005, vol.104, No.7, 1453~61.
上記の通り、CK7のmRNAは、がん検出のための分子マーカーとして有用である。そして、従来の技術においては、CK7のmRNAの検出に、RT-PCR法を用いている。該RT-PCR法は、非常に高感度で、例えばがん細胞のリンパ節への微小転移をも検出できる核酸増幅法であるが、その検出には非常に時間(2~4時間程度)がかかっていた。
それゆえ、本発明は、従来の技術よりも短時間でCK7のmRNAを検出することができるプライマおよびプライマセットを提供することを目的とする。
本発明は、CK7のmRNAを検出するためのプライマを提供する。このプライマは、その5’側に第一配列を、その3’側に第二配列を含む。該第一配列は、10~30ヌクレオチドの長さであり、配列番号1の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能である。該第二配列は、10~30ヌクレオチドの長さであり、配列番号1の配列において、前記第一領域よりも3’側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能である。
本発明によると、従来の技術よりも短時間で、CK7のmRNAを検出することができるプライマおよびプライマセットを提供することができる。
本明細書において、「検出する」とは、本発明の標的物質であるCK7のmRNAが試料中に存在するか否かを判定することだけでなく、試料中のCK7のmRNAを定量することも含む。
「プライマ」とは、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法(米国特許第6410278号公報および米国特許第6974670号公報参照)などの核酸増幅技術において、増幅対象である核酸の特定の領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる増幅反応の起点となることのできる機能(以下、「プライマ機能」とする)を有するポリヌクレオチドである。検出対象である核酸は、CK7のmRNAであるため、これを、逆転写反応を含む核酸増幅反応(例えば、RT-LAMP法など)により検出することができる。
「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で、ポリヌクレオチドの塩基の相補性に基づいて、あるポリヌクレオチドの一部または全部の配列が、別のポリヌクレオチドの一部または全部の配列と、水素結合を介して結合することをいう。
「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う際に、当業者が一般的に用いる条件であって、本実施形態のプライマが、CK7のmRNAまたはそのcDNAにハイブリダイズすることができる条件であれば、特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマの長さ、プライマのGC含量およびハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J.ら, 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2編), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。より具体的には、「50%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl,15mM クエン酸ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム、pH7.6、5×デンハーツ溶液、10%デキストラン硫酸、及び20μg/mlの核酸を含む溶液中、ハイブリダイゼーション温度42℃」を例示することができるが、これに限定されない。
「プライマ」とは、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法(米国特許第6410278号公報および米国特許第6974670号公報参照)などの核酸増幅技術において、増幅対象である核酸の特定の領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる増幅反応の起点となることのできる機能(以下、「プライマ機能」とする)を有するポリヌクレオチドである。検出対象である核酸は、CK7のmRNAであるため、これを、逆転写反応を含む核酸増幅反応(例えば、RT-LAMP法など)により検出することができる。
「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で、ポリヌクレオチドの塩基の相補性に基づいて、あるポリヌクレオチドの一部または全部の配列が、別のポリヌクレオチドの一部または全部の配列と、水素結合を介して結合することをいう。
「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う際に、当業者が一般的に用いる条件であって、本実施形態のプライマが、CK7のmRNAまたはそのcDNAにハイブリダイズすることができる条件であれば、特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマの長さ、プライマのGC含量およびハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J.ら, 1998, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2編), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。より具体的には、「50%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl,15mM クエン酸ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム、pH7.6、5×デンハーツ溶液、10%デキストラン硫酸、及び20μg/mlの核酸を含む溶液中、ハイブリダイゼーション温度42℃」を例示することができるが、これに限定されない。
本実施形態のプライマは、特にRT-LAMP法を利用したCK7のmRNAの検出に好適に用いられる。CK7のmRNAのヌクレオチド配列は、配列番号1に示される。mRNAには、チミンではなくウラシルが含まれるが、配列番号1では便宜上、ウラシルをチミン(t)として表記してある。この配列は、GenBankデータベースにアクセッション番号NM_005556として登録されている。
RT-LAMP法においては、まずは逆転写反応(RT反応)によってmRNAからそのcDNAが合成され、続いて合成されたcDNAがLAMP反応により増幅される。RT-LAMP法を用いてCK7のmRNAを検出する場合、プライマとして、CK7のmRNA配列に含まれる領域R1cに対し相補的な領域R1にハイブリダイズ可能な第一配列をその5’末端側に有し、CK7のmRNA配列において領域R1cよりも下流(3’側)に位置する領域R2cにハイブリダイズ可能な第二配列をその3’末端側に有するポリヌクレオチドを用いることができる。
上記第一配列は、上記第二配列と直接連結されてもよいし、介在配列を介して連結されてもよい。該介在配列としては、CK7のmRNAまたはそのcDNAと相同性の低い配列であることが好ましい。例えば、5'-tttt-3'などを挙げることができる。該介在配列の長さは、好ましくは1~50ヌクレオチド、より好ましくは1~40ヌクレオチドである。
上記プライマは、上記RT-LAMP法で用いられるプライマのうち、リバースインナープライマ(以下、「RIP」とする)として機能することができる。上記RT―LAMP法では、このRIPに加えて、フォワードインナープライマ(以下、「FIP」とする)およびF3プライマを含むプライマセットが用いられる。以下、このFIPおよびF3プライマについて、図1に基づいて説明する。
図1は、各プライマおよび、各プライマがハイブリダイズする核酸領域を示した模式図である。なお、図1中、F1、F2、L、F1、R1c、R2c、およびR3cの各領域は、CK7のmRNA配列に含まれる領域であり、F3c、F2c、F1c、R1、M、R2、およびR3の各領域は、CK7のmRNAの相補鎖であるCK7のcDNA配列に含まれる領域である。また、F1、F2、F3、R1、R2およびR3は、それぞれF1c、F2c、F3c、R1c、R2cおよびR3cと相補的である。これらの領域は、CK7のmRNAの検出効率、検出の再現性等を考慮して選択される。
上記FIPは、領域F1(領域F1cの相補領域)にハイブリダイズ可能な第三配列をその5’側に有し、かつ領域F2cにハイブリダイズ可能な第四配列をその3’側に有するポリヌクレオチドである。該第三配列は、該第四配列と直接連結されてもよいし、上記介在配列を介して連結されてもよい。
上記F3プライマは、CK7のcDNA配列において領域F2cよりも下流(3’側)に位置する領域F3cにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。
上記F3プライマは、CK7のcDNA配列において領域F2cよりも下流(3’側)に位置する領域F3cにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。
さらに、上記プライマセットは、FIP、RIPおよびF3プライマに加えて、R3プライマを含んでもよい。このR3プライマは、CK7のmRNA配列において領域R2cよりも下流(3’側)に位置する領域R3cにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。
さらに、上記プライマセットは、ループプライマを含んでもよい。該ループプライマとして、CK7のmRNA配列に含まれる領域F2とF1との間に位置する領域Lにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであるループプライマF、およびCK7のcDNA配列に含まれる領域R1とR2との間に位置する領域Mにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであるループプライマRがあげられる。これらループプライマの片方または両方を用いることにより、LAMP反応によるcDNAの増幅を、より迅速に行うことが可能となる。
第一配列、第二配列、第三配列、第四配列、F3プライマ、R3プライマ、ループプライマFおよびループプライマRの長さとしては、プライマ機能を有する長さであれば、特に限定されない。核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマの長さは、5ヌクレオチド前後であることから、プライマの長さは、好ましくは5~100ヌクレオチドである。また、該プライマの長さは、プライマのヌクレオチド配列とプライマがハイブリダイズする領域との間の特異性を考慮すると、10ヌクレオチド以上が好ましく、また、プライマのハイブリダイゼーション温度を考慮すると、30ヌクレオチド以下であることがより好ましい。すなわち、FIPおよびRIPの長さは、好ましくは10~200ヌクレオチド、より好ましくは20~60ヌクレオチドである。
上記プライマのうち、少なくとも一つが、CK7のmRNA配列に含まれるエキソンジャンクションを含む領域に、ハイブリダイズすることが好ましい。CK7遺伝子は9個のエキソンからなり、エキソンとエキソンとの間にはイントロンが介在している。細胞内でCK7遺伝子からそのmRNAが合成される際は、スプライシングによってイントロンが除去されて、エキソン同士が直接連結される。このエキソンとエキソンとが連結されたつなぎ目の部分を、エキソンジャンクションという。例えば、ゲノム中ではエキソン1とエキソン2とは、イントロンによって隔離されているが、mRNA合成においてイントロンは除去されるため、該mRNAではエキソン1の3’末端とエキソン2の5’末端とは隣接している。配列番号1の配列は9個のエキソンからなるため、以下の8個のエキソンジャンクション(エキソンジャンクション1~8)がある。
エキソン1と2とのエキソンジャンクション1:451位と452位の結合部分
エキソン2と3とのエキソンジャンクション2:663位と664位の結合部分
エキソン3と4とのエキソンジャンクション3:724位と725位の結合部分
エキソン4と5とのエキソンジャンクション4:820位と821位の結合部分
エキソン5と6とのエキソンジャンクション5:985位と986位の結合部分
エキソン6と7とのエキソンジャンクション6:1111位と1112位の結合部分
エキソン7と8とのエキソンジャンクション7:1332位と1333位の結合部分
エキソン8と9とのエキソンジャンクション8:1367位と1368位の結合部分
エキソン1と2とのエキソンジャンクション1:451位と452位の結合部分
エキソン2と3とのエキソンジャンクション2:663位と664位の結合部分
エキソン3と4とのエキソンジャンクション3:724位と725位の結合部分
エキソン4と5とのエキソンジャンクション4:820位と821位の結合部分
エキソン5と6とのエキソンジャンクション5:985位と986位の結合部分
エキソン6と7とのエキソンジャンクション6:1111位と1112位の結合部分
エキソン7と8とのエキソンジャンクション7:1332位と1333位の結合部分
エキソン8と9とのエキソンジャンクション8:1367位と1368位の結合部分
上記エキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズ可能なプライマは、mRNAにハイブリダイズするが、ゲノム中のCK7遺伝子にハイブリダイズする可能性は極めて低い。このようなプライマを用いることによって、上記RT-LAMP反応によるmRNA検出の際に、非特異的にCK7遺伝子が増幅されることを防止することが可能となる。
また、RT-LAMP反応の反応機序(米国特許第6410278号公報および米国特許第6974670号公報参照)によると、RIPの第二配列が、試料中のCK7のmRNAと最初にハイブリダイズする。従って、上記プライマのうち、RIPの第二配列が、CK7のmRNA配列中のエキソンジャンクションを含む領域にハイブリダイズすることが好ましい(すなわち、領域R2cがエキソンジャンクションを含むことが好ましい)。これにより、反応の初期の段階で非特異的にCK7遺伝子が増幅されることを避けることができる。
他のサイトケラチン類(例えば、サイトケラチン6やサイトケラチン8など)のmRNAとの相同性、検出速度、検出の再現性等の観点から、上記のエキソンジャンクションのうち、エキソンジャンクション3,5,6および8の何れかを含む領域にハイブリダイズするプライマを用いることが好ましい。また、エキソンジャンクション1,2,4,および7の何れかを含む領域にハイブリダイズするプライマも、他のサイトケラチン類(サイトケラチン5、サイトケラチン6、サイトケラチン8等)のmRNAとの相同性、検出速度、検出の再現性等を考慮して作成し得る。
本実施形態のプライマと、該プライマがハイブリダイズするCK7mRNAの特定の領域とは、完全に相補的である必要はなく、ハイブリダイズできる程度の相補性を有していればよい(このことは、米国特許第4800159号公報に記載される)。すなわち、プライマ機能を有するポリヌクレオチドであれば、上記プライマは、上記特定の領域と完全な相補性を有する配列に、置換、欠失、挿入、付加などのような変異が1個または複数個導入されたポリヌクレオチドであってもよい。このヌクレオチドの変異は、好ましくは4個以内である。この変異が導入されたポリヌクレオチドは、変異導入前のポリヌクレオチドに対して、好ましくは80%以上の相同性を有し、より好ましくは90%以上の相同性を有し、最も好ましくは95%以上の相同性を有する。
上記プライマが、目的の核酸であるCK7のmRNAにハイブリダイズした後、ポリメラーゼの作用によって、プライマの3’末端を起点として核酸合成が行われる。このため、プライマの3’末端部分とCK7のmRNAとの相補性が低い場合は、核酸合成反応が進行しにくくなることが考えられる。従って、好ましくはプライマの3’末端の3塩基が、プライマのハイブリダイズする領域と完全に相補的であり、より好ましくはプライマの3’末端の5塩基が完全に相補的である。
F3、F2、F1、R1c、R2c、R3c、LおよびMの各領域は、配列番号1に示されるCK7のmRNAの配列中に設定できる。以下に、これらの領域の例を挙げる。
(F1)
619~636位の領域
631~652位の領域
858~879位の領域
873~892位の領域
878~898位の領域
879~898位の領域
893~913位の領域
909~928位の領域
910~928位の領域
1006~1025位の領域
1007~1025位の領域
1007~1026位の領域
1219~1240位の領域
1275~1295位の領域
1276~1296位の領域
1280~1300位の領域
619~636位の領域
631~652位の領域
858~879位の領域
873~892位の領域
878~898位の領域
879~898位の領域
893~913位の領域
909~928位の領域
910~928位の領域
1006~1025位の領域
1007~1025位の領域
1007~1026位の領域
1219~1240位の領域
1275~1295位の領域
1276~1296位の領域
1280~1300位の領域
(F2)
574~590位の領域
813~834位の領域
813~882位の領域
816~834位の領域
837~856位の領域
840~857位の領域
851~869位の領域
851~871位の領域
861~882位の領域
863~883位の領域
963~982位の領域
964~982位の領域
1165~1182位の領域
1235~1252位の領域
1236~1252位の領域
574~590位の領域
813~834位の領域
813~882位の領域
816~834位の領域
837~856位の領域
840~857位の領域
851~869位の領域
851~871位の領域
861~882位の領域
863~883位の領域
963~982位の領域
964~982位の領域
1165~1182位の領域
1235~1252位の領域
1236~1252位の領域
(F3)
538~556位の領域
542~561位の領域
546~564位の領域
775~794位の領域
796~815位の領域
816~834位の領域
827~843位の領域
828~845位の領域
840~859位の領域
932~950位の領域
1134~1149位の領域
1213~1228位の領域
538~556位の領域
542~561位の領域
546~564位の領域
775~794位の領域
796~815位の領域
816~834位の領域
827~843位の領域
828~845位の領域
840~859位の領域
932~950位の領域
1134~1149位の領域
1213~1228位の領域
(R1c)
680~697位の領域
680~699位の領域
898~917位の領域
916~937位の領域
923~943位の領域
924~945位の領域
941~958位の領域
1051~1072位の領域
1052~1073位の領域
1058~1078位の領域
1268~1286位の領域
1297~1316位の領域
1297~1317位の領域
1303~1320位の領域
680~697位の領域
680~699位の領域
898~917位の領域
916~937位の領域
923~943位の領域
924~945位の領域
941~958位の領域
1051~1072位の領域
1052~1073位の領域
1058~1078位の領域
1268~1286位の領域
1297~1316位の領域
1297~1317位の領域
1303~1320位の領域
(R2c)
721~739位の領域
974~999位の領域
976~995位の領域
978~993位の領域
978~997位の領域
981~1000位の領域
1095~1115位の領域
1100~1117位の領域
1101~1117位の領域
1353~1376位の領域
1353~1379位の領域
1354~1376位の領域
721~739位の領域
974~999位の領域
976~995位の領域
978~993位の領域
978~997位の領域
981~1000位の領域
1095~1115位の領域
1100~1117位の領域
1101~1117位の領域
1353~1376位の領域
1353~1379位の領域
1354~1376位の領域
(R3c)
741~759位の領域
742~760位の領域
1007~1023位の領域
1009~1025位の領域
1011~1028位の領域
1012~1028位の領域
1012~1029位の領域
1012~1030位の領域
1117~1132位の領域
1117~1133位の領域
1118~1133位の領域
1118~1134位の領域
1118~1135位の領域
1131~1147位の領域
1132~1148位の領域
1356~1339位の領域
1383~1400位の領域
1384~1401位の領域
1390~1406位の領域
741~759位の領域
742~760位の領域
1007~1023位の領域
1009~1025位の領域
1011~1028位の領域
1012~1028位の領域
1012~1029位の領域
1012~1030位の領域
1117~1132位の領域
1117~1133位の領域
1118~1133位の領域
1118~1134位の領域
1118~1135位の領域
1131~1147位の領域
1132~1148位の領域
1356~1339位の領域
1383~1400位の領域
1384~1401位の領域
1390~1406位の領域
(L)
983~1002位の領域
983~1003位の領域
984~1002位の領域
984~1003位の領域
984~1004位の領域
985~1004位の領域
986~1004位の領域
986~1005位の領域
987~1005位の領域
987~1006位の領域
1251~1271位の領域
1251~1273位の領域
1251~1274位の領域
1252~1273位の領域
1252~1274位の領域
1253~1274位の領域
1256~1277位の領域
1256~1278位の領域
1257~1278位の領域
1258~1278位の領域
1259~1278位の領域
1259~1279位の領域
1260~1279位の領域
983~1002位の領域
983~1003位の領域
984~1002位の領域
984~1003位の領域
984~1004位の領域
985~1004位の領域
986~1004位の領域
986~1005位の領域
987~1005位の領域
987~1006位の領域
1251~1271位の領域
1251~1273位の領域
1251~1274位の領域
1252~1273位の領域
1252~1274位の領域
1253~1274位の領域
1256~1277位の領域
1256~1278位の領域
1257~1278位の領域
1258~1278位の領域
1259~1278位の領域
1259~1279位の領域
1260~1279位の領域
(M)
1073~1089位の領域
1073~1091位の領域
1073~1093位の領域
1074~1093位の領域
1075~1094位の領域
1076~1093位の領域
1076~1094位の領域
1077~1096位の領域
1078~1097位の領域
1078~1098位の領域
1078~1099位の領域
1081~1100位の領域
1328~1345位の領域
1330~1348位の領域
1330~1349位の領域
1330~1351位の領域
1331~1350位の領域
1331~1351位の領域
1331~1352位の領域
1332~1352位の領域
1073~1089位の領域
1073~1091位の領域
1073~1093位の領域
1074~1093位の領域
1075~1094位の領域
1076~1093位の領域
1076~1094位の領域
1077~1096位の領域
1078~1097位の領域
1078~1098位の領域
1078~1099位の領域
1081~1100位の領域
1328~1345位の領域
1330~1348位の領域
1330~1349位の領域
1330~1351位の領域
1331~1350位の領域
1331~1351位の領域
1331~1352位の領域
1332~1352位の領域
上記の各領域に基づき、本発明のプライマを設計することができる。以下に、各プライマの例を挙げる。なお、配列の表示に続く括弧内の記載は、各プライマがCK7のmRNA配列(配列番号1)の何れの領域と同一であるか、または相補的であるかを示したものである。
(F3プライマ)
配列番号2:5'-GACATCTTTGAGGCCCAGAT-3' (542~561位の領域と同じ配列)
配列番号3:5'-TCTTTGAGGCCCAGATTGC-3' (546~564位の領域と同じ配列)
配列番号4:5'-CCCAGACATCTTTGAGGCC-3' (538~556位の領域と同じ配列)
配列番号5:5'-AGACGGAGTTGACAGAGCT-3' (816~834位の領域と同じ配列)
配列番号6:5'-CAGAGCTGCAGTCCCAGA-3' (828~845位の領域と同じ配列)
配列番号7:5'-CTTCCTCAGGACCCTCAATG-3' (796~815位の領域と同じ配列)
配列番号8:5'-GCGGGGCAAGCAGGAT-3' (1213~1228位の領域と同じ配列)
配列番号9:5'-CCCAGATCTCCGACACATCT-3' (840~859位の領域と同じ配列)
配列番号10:5'-ACAGAGCTGCAGTCCCA-3' (827~843位の領域と同じ配列)
配列番号11:5'-TGCCCTGAATGATGAGATCA-3' (775~794位の領域と同じ配列)
配列番号12:5'-GAGGAGATGGCCAAATGCA-3' (932‐950位の領域と同じ配列)
配列番号13:5'-GCGGGGCAAGCAGGAT-3' (1213~1228位の領域と同じ配列)
配列番号2:5'-GACATCTTTGAGGCCCAGAT-3' (542~561位の領域と同じ配列)
配列番号3:5'-TCTTTGAGGCCCAGATTGC-3' (546~564位の領域と同じ配列)
配列番号4:5'-CCCAGACATCTTTGAGGCC-3' (538~556位の領域と同じ配列)
配列番号5:5'-AGACGGAGTTGACAGAGCT-3' (816~834位の領域と同じ配列)
配列番号6:5'-CAGAGCTGCAGTCCCAGA-3' (828~845位の領域と同じ配列)
配列番号7:5'-CTTCCTCAGGACCCTCAATG-3' (796~815位の領域と同じ配列)
配列番号8:5'-GCGGGGCAAGCAGGAT-3' (1213~1228位の領域と同じ配列)
配列番号9:5'-CCCAGATCTCCGACACATCT-3' (840~859位の領域と同じ配列)
配列番号10:5'-ACAGAGCTGCAGTCCCA-3' (827~843位の領域と同じ配列)
配列番号11:5'-TGCCCTGAATGATGAGATCA-3' (775~794位の領域と同じ配列)
配列番号12:5'-GAGGAGATGGCCAAATGCA-3' (932‐950位の領域と同じ配列)
配列番号13:5'-GCGGGGCAAGCAGGAT-3' (1213~1228位の領域と同じ配列)
(FIP)
配列番号14:5'-TGCATGCTCCGCAGCTCCGGGTCAGCTTGAGGCAC-3'
(619~636位の領域の相補配列と、574~590位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号15:5'-GTCCTCCACCACATCCTGCATGGGGTCAGCTTGAGGCAC-3'
(631~652位の領域の相補配列と、574~590位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号16:5'-CAGGTCCAGGGAGCGACTGTTCCCAGATCTCCGACACAT-3'
(878~898位の領域の相補配列と、840~857位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号17:5'-AGCGATGATGCCGTCCAGGTCGACACATCTGTGGTGCTGT-3'
(893~913位の領域の相補配列と、851~869位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号18:5'-TTGTCCATGGACAGCACCACAGAGACGGAGTTGACAGAGCT-3'
(858~879位の領域の相補配列と、816~834位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号19:5'-GCGATCTCGATGTCCAGGGCCCGGCAGCTGCGTGAGTAC-3'
(1276~1296位の領域の相補配列と、1235~1252位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号20:5'-CAGGTCCAGGGAGCGACTGTAGTCCCAGATCTCCGACACA-3'
(879~898位の領域の相補配列と、837~856位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号21:5'-CTGCGCCTTGACCTCAGCGATGGTGCTGTCCATGGACAACAG-3'
(909~928位の領域の相補配列と、861~882位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号22:5'-CTGCGCCTTGACCTCAGCGGTGCTGTCCATGGACAACAGT-3'
(910~928位の領域の相補配列と、863~883位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号23:5'-CTGCGCCTTGACCTCAGCGAGACACATCTGTGGTGCTGTCC-3'
(909~928位の領域の相補配列と、851~871位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号24:5'-CAGGGAGCGACTGTTGTCCAATGAGACGGAGTTGACAGAGCT-3'
(873~892位の領域の相補配列と、813~834位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号25:5'-CGTCCCCATGCTTCCCAGCCCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1006~1025位の領域の相補配列と、963~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号26:5'-TCGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1007~1026位の領域の相補配列と、964~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号27:5'-CGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1007~1025位の領域の相補配列と、963~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号28:5'-TCGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1007~1026位の領域の相補配列と、962~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号29:5'-CGATCTCGATGTCCAGGGCCACGGCAGCTGCGTGAGT-3'
(1275~1295位の領域の相補配列と、1235~1250位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号30:5'-CGATCTCGATGTCCAGGGCCAGGCAGCTGCGTGAGTAC-3'
(1275~1295位の領域の相補配列と、1236~1252位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号31:5'-GGTGGCGATCTCGATGTCCAGCGGCAGCTGCGTGAGTAC-3'
(1280~1300位の領域の相補配列と、1235~1252位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号32:5'-GGTGGCGATCTCGATGTCCAGCGGCAGCTGCGTGAGT-3'
(1280~1300位の領域の相補配列と、1235~1250位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号14:5'-TGCATGCTCCGCAGCTCCGGGTCAGCTTGAGGCAC-3'
(619~636位の領域の相補配列と、574~590位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号15:5'-GTCCTCCACCACATCCTGCATGGGGTCAGCTTGAGGCAC-3'
(631~652位の領域の相補配列と、574~590位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号16:5'-CAGGTCCAGGGAGCGACTGTTCCCAGATCTCCGACACAT-3'
(878~898位の領域の相補配列と、840~857位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号17:5'-AGCGATGATGCCGTCCAGGTCGACACATCTGTGGTGCTGT-3'
(893~913位の領域の相補配列と、851~869位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号18:5'-TTGTCCATGGACAGCACCACAGAGACGGAGTTGACAGAGCT-3'
(858~879位の領域の相補配列と、816~834位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号19:5'-GCGATCTCGATGTCCAGGGCCCGGCAGCTGCGTGAGTAC-3'
(1276~1296位の領域の相補配列と、1235~1252位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号20:5'-CAGGTCCAGGGAGCGACTGTAGTCCCAGATCTCCGACACA-3'
(879~898位の領域の相補配列と、837~856位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号21:5'-CTGCGCCTTGACCTCAGCGATGGTGCTGTCCATGGACAACAG-3'
(909~928位の領域の相補配列と、861~882位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号22:5'-CTGCGCCTTGACCTCAGCGGTGCTGTCCATGGACAACAGT-3'
(910~928位の領域の相補配列と、863~883位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号23:5'-CTGCGCCTTGACCTCAGCGAGACACATCTGTGGTGCTGTCC-3'
(909~928位の領域の相補配列と、851~871位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号24:5'-CAGGGAGCGACTGTTGTCCAATGAGACGGAGTTGACAGAGCT-3'
(873~892位の領域の相補配列と、813~834位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号25:5'-CGTCCCCATGCTTCCCAGCCCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1006~1025位の領域の相補配列と、963~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号26:5'-TCGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1007~1026位の領域の相補配列と、964~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号27:5'-CGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1007~1025位の領域の相補配列と、963~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号28:5'-TCGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1007~1026位の領域の相補配列と、962~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号29:5'-CGATCTCGATGTCCAGGGCCACGGCAGCTGCGTGAGT-3'
(1275~1295位の領域の相補配列と、1235~1250位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号30:5'-CGATCTCGATGTCCAGGGCCAGGCAGCTGCGTGAGTAC-3'
(1275~1295位の領域の相補配列と、1236~1252位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号31:5'-GGTGGCGATCTCGATGTCCAGCGGCAGCTGCGTGAGTAC-3'
(1280~1300位の領域の相補配列と、1235~1252位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号32:5'-GGTGGCGATCTCGATGTCCAGCGGCAGCTGCGTGAGT-3'
(1280~1300位の領域の相補配列と、1235~1250位の領域と同じ配列とを連結した配列)
(RIP)
配列番号33:5'-AACCACCGCACAGCTGCTGAGGCAGCATCCACATCCTTC-3'
(680~699位の領域と同じ配列と、721~739位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号34:5'-AACCACCGCACAGCTGCTGGCAGCATCCACATCCTTC-3'
(680~697位の領域と同じ配列と、721~739位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号35:5'-GCGCAGTATGAGGAGATGGCCCTGGAGGGTCTCAAACTTGG-3'
(923~943位の領域と同じ配列と、981~1000位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号36:5'-GCGCAGTATGAGGAGATGGCCAGAGGGTCTCAAACTTGGTCT-3'
(923~943位の領域と同じ配列と、978~997位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号37:5'-GGTCAAGGCGCAGTATGAGGAGGGGTCTCAAACTTGGTCTGG-3'
(916~937位の領域と同じ配列と、976~995位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号38:5'-CACCTACCGCAAGCTGCTGGTCACAGAGATATTCACGGCT-3'
(1297~1316位の領域と同じ配列と、1354~1376位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号39:5'-GCCAAATGCAGCCGGGCTTGGAGGGTCTCAAACTTGGTCTGGTA-3'
(941~958位の領域と同じ配列と、974~999位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号40:5'-GGACGGCATCATCGCTGAGGGTCTCAAACTTGGTCTGGTA-3'
(898~917位の領域と同じ配列と、978~993位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号41:5'-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1095~1115位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号42:5'-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCGGCACGCTGGTTCTTGA-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1101~1117位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号43:5'-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCGGCACGCTGGTTCTTGAT-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1100~1117位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号44:5'-CACCTACCGCAAGCTGCTGGATCATCACAGAGATATTCACGGCTC-3'
(1297~1317位の領域と同じ配列と、1353~1376位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号45:5'-CCGCAAGCTGCTGGAGGGAATTCATCACAGAGATATTCACGGCTC-3'
(1303~1320位の領域と同じ配列と、1353~1379位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号33:5'-AACCACCGCACAGCTGCTGAGGCAGCATCCACATCCTTC-3'
(680~699位の領域と同じ配列と、721~739位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号34:5'-AACCACCGCACAGCTGCTGGCAGCATCCACATCCTTC-3'
(680~697位の領域と同じ配列と、721~739位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号35:5'-GCGCAGTATGAGGAGATGGCCCTGGAGGGTCTCAAACTTGG-3'
(923~943位の領域と同じ配列と、981~1000位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号36:5'-GCGCAGTATGAGGAGATGGCCAGAGGGTCTCAAACTTGGTCT-3'
(923~943位の領域と同じ配列と、978~997位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号37:5'-GGTCAAGGCGCAGTATGAGGAGGGGTCTCAAACTTGGTCTGG-3'
(916~937位の領域と同じ配列と、976~995位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号38:5'-CACCTACCGCAAGCTGCTGGTCACAGAGATATTCACGGCT-3'
(1297~1316位の領域と同じ配列と、1354~1376位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号39:5'-GCCAAATGCAGCCGGGCTTGGAGGGTCTCAAACTTGGTCTGGTA-3'
(941~958位の領域と同じ配列と、974~999位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号40:5'-GGACGGCATCATCGCTGAGGGTCTCAAACTTGGTCTGGTA-3'
(898~917位の領域と同じ配列と、978~993位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号41:5'-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1095~1115位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号42:5'-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCGGCACGCTGGTTCTTGA-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1101~1117位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号43:5'-TTCAGAGATGAACCGGGCCATCGGCACGCTGGTTCTTGAT-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1100~1117位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号44:5'-CACCTACCGCAAGCTGCTGGATCATCACAGAGATATTCACGGCTC-3'
(1297~1317位の領域と同じ配列と、1353~1376位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号45:5'-CCGCAAGCTGCTGGAGGGAATTCATCACAGAGATATTCACGGCTC-3'
(1303~1320位の領域と同じ配列と、1353~1379位の領域の相補配列とを連結した配列)
(R3プライマ)
配列番号46:5'-CAGCTCCACCTTGCTCATG-3' (742~760位の領域の相補配列)
配列番号47:5'-AGCTCCACCTTGCTCATGT-3' (741~759位の領域の相補配列)
配列番号48:5'-AGGTCGTCCCCATGCTTC-3' (1012~1029位の領域の相補配列)
配列番号49:5'-CGTCCCCATGCTTCCCA-3' (1009~1025位の領域の相補配列)
配列番号50:5'-TCCCCATGCTTCCCAGC-3' (1007~1023位の領域の相補配列)
配列番号51:5'-CACCGCCACTGCTACTG-3' (1390~1406位の領域の相補配列)
配列番号52:5'-CGTCCCCATGCTTCCCA-3'(1009~1025位の領域の相補配列)
配列番号53:5'-GGTCGTCCCCATGCTTCC-3' (1011~1028位の領域の相補配列)
配列番号54:5'-GGTCGTCCCCATGCTTC-3' (1012~1028位の領域の相補配列)
配列番号55:5'-GGCGGCCTCCAACTTG-3'(1117~1132位の領域の相補配列)
配列番号56:5'-TGGCGGCCTCCAACTT-3'(1118~1133位の領域の相補配列)
配列番号57:5'-AATGGCGGCCTCCAACTT-3'(1118~1135位の領域の相補配列)
配列番号58:5'-CCACTGCTACTGCCACCA-3'(1384~1401位の領域の相補配列)
配列番号59:5'-ATGGCGGCCTCCAACTT-3'(1118~1134位の領域の相補配列)
配列番号60:5'-CACTGCTACTGCCACCAG-3'(1383~1400位の領域の相補配列)
配列番号46:5'-CAGCTCCACCTTGCTCATG-3' (742~760位の領域の相補配列)
配列番号47:5'-AGCTCCACCTTGCTCATGT-3' (741~759位の領域の相補配列)
配列番号48:5'-AGGTCGTCCCCATGCTTC-3' (1012~1029位の領域の相補配列)
配列番号49:5'-CGTCCCCATGCTTCCCA-3' (1009~1025位の領域の相補配列)
配列番号50:5'-TCCCCATGCTTCCCAGC-3' (1007~1023位の領域の相補配列)
配列番号51:5'-CACCGCCACTGCTACTG-3' (1390~1406位の領域の相補配列)
配列番号52:5'-CGTCCCCATGCTTCCCA-3'(1009~1025位の領域の相補配列)
配列番号53:5'-GGTCGTCCCCATGCTTCC-3' (1011~1028位の領域の相補配列)
配列番号54:5'-GGTCGTCCCCATGCTTC-3' (1012~1028位の領域の相補配列)
配列番号55:5'-GGCGGCCTCCAACTTG-3'(1117~1132位の領域の相補配列)
配列番号56:5'-TGGCGGCCTCCAACTT-3'(1118~1133位の領域の相補配列)
配列番号57:5'-AATGGCGGCCTCCAACTT-3'(1118~1135位の領域の相補配列)
配列番号58:5'-CCACTGCTACTGCCACCA-3'(1384~1401位の領域の相補配列)
配列番号59:5'-ATGGCGGCCTCCAACTT-3'(1118~1134位の領域の相補配列)
配列番号60:5'-CACTGCTACTGCCACCAG-3'(1383~1400位の領域の相補配列)
(ループプライマF)
配列番号61:5'-GGGCCTGGAGGGTCTCAAA-3' (986~1004位の領域の相補配列)
配列番号62:5'-TGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3' (987~1005位の領域の相補配列)
配列番号63:5'-GGGCCTGGAGGGTCTCAAACT-3' (984~1004位の領域の相補配列)
配列番号64:5'-GGGCCTGGAGGGTCTCAAAC-3' (985~1004位の領域の相補配列)
配列番号65:5'-GGCCTGGAGGGTCTCAAACT-3' (984~1003位の領域の相補配列)
配列番号66:5'-GGCCTGGAGGGTCTCAAACTT-3' (983~1003位の領域の相補配列)
配列番号67:5'-CTGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3' (987~1006位の領域の相補配列)
配列番号68:5'-TGGGCCTGGAGGGTCTCAAA-3' (986~1005位の領域の相補配列)
配列番号69:5'-GCCTGGAGGGTCTCAAACT-3' (984~1002位の領域の相補配列)
配列番号70:5'-TGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3' (987~1005位の領域の相補配列)
配列番号71:5'-GCCTGGAGGGTCTCAAACTT-3' (983~1002位の領域の相補配列)
配列番号72:5'-TCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3' (1251~1271位の領域の相補配列)
配列番号73:5'-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTG-3' (1253~1274位の領域の相補配列)
配列番号74:5'-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3' (1251~1274位の領域の相補配列)
配列番号75:5'-CTTCACGCTCATGAGTTCCTGG-3' (1252~1273位の領域の相補配列)
配列番号76:5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAG-3' (1259~1278位の領域の相補配列)
配列番号77:5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAGTTC-3'(1256~1278位の領域の相補配列)
配列番号78:5'-CTTCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3' (1251~1273位の領域の相補配列)
配列番号79:5'-GGCCAGCTTCACGCTCATGA-3' (1260~1279位の領域の相補配列)
配列番号80:5'-CCAGCTTCACGCTCATGAGTTC-3' (1256~1277位の領域の相補配列)
配列番号81:5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAGTT-3' (1257~1278位の領域の相補配列)
配列番号82:5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAGT-3' (1258~1278位の領域の相補配列)
配列番号83:5'-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTGG-3' (1252~1274位の領域の相補配列)
配列番号84:5'-GGCCAGCTTCACGCTCATGAG-3' (1259~1279位の領域の相補配列)
配列番号61:5'-GGGCCTGGAGGGTCTCAAA-3' (986~1004位の領域の相補配列)
配列番号62:5'-TGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3' (987~1005位の領域の相補配列)
配列番号63:5'-GGGCCTGGAGGGTCTCAAACT-3' (984~1004位の領域の相補配列)
配列番号64:5'-GGGCCTGGAGGGTCTCAAAC-3' (985~1004位の領域の相補配列)
配列番号65:5'-GGCCTGGAGGGTCTCAAACT-3' (984~1003位の領域の相補配列)
配列番号66:5'-GGCCTGGAGGGTCTCAAACTT-3' (983~1003位の領域の相補配列)
配列番号67:5'-CTGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3' (987~1006位の領域の相補配列)
配列番号68:5'-TGGGCCTGGAGGGTCTCAAA-3' (986~1005位の領域の相補配列)
配列番号69:5'-GCCTGGAGGGTCTCAAACT-3' (984~1002位の領域の相補配列)
配列番号70:5'-TGGGCCTGGAGGGTCTCAA-3' (987~1005位の領域の相補配列)
配列番号71:5'-GCCTGGAGGGTCTCAAACTT-3' (983~1002位の領域の相補配列)
配列番号72:5'-TCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3' (1251~1271位の領域の相補配列)
配列番号73:5'-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTG-3' (1253~1274位の領域の相補配列)
配列番号74:5'-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3' (1251~1274位の領域の相補配列)
配列番号75:5'-CTTCACGCTCATGAGTTCCTGG-3' (1252~1273位の領域の相補配列)
配列番号76:5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAG-3' (1259~1278位の領域の相補配列)
配列番号77:5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAGTTC-3'(1256~1278位の領域の相補配列)
配列番号78:5'-CTTCACGCTCATGAGTTCCTGGT-3' (1251~1273位の領域の相補配列)
配列番号79:5'-GGCCAGCTTCACGCTCATGA-3' (1260~1279位の領域の相補配列)
配列番号80:5'-CCAGCTTCACGCTCATGAGTTC-3' (1256~1277位の領域の相補配列)
配列番号81:5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAGTT-3' (1257~1278位の領域の相補配列)
配列番号82:5'-GCCAGCTTCACGCTCATGAGT-3' (1258~1278位の領域の相補配列)
配列番号83:5'-GCTTCACGCTCATGAGTTCCTGG-3' (1252~1274位の領域の相補配列)
配列番号84:5'-GGCCAGCTTCACGCTCATGAG-3' (1259~1279位の領域の相補配列)
(ループプライマR)
配列番号85:5'-AGGCTGCAGGCTGAGATCG-3' (1076~1094位の領域と同じ配列)
配列番号86:5'-GAGGCTGCAGGCTGAGATCG-3' (1076~1093位の領域と同じ配列)
配列番号87:5'-AGAGGCTGCAGGCTGAGATC-3' (1074~1093位の領域と同じ配列)
配列番号88:5'-GAGGCTGCAGGCTGAGATCG-3' (1075~1094位の領域と同じ配列)
配列番号89:5'-CAGAGGCTGCAGGCTGA-3' (1073~1089位の領域と同じ配列)
配列番号90:5'-CAGAGGCTGCAGGCTGAGA-3' (1073~1091位の領域と同じ配列)
配列番号91:5'-CAGAGGCTGCAGGCTGAGATC-3' (1073~1093位の領域と同じ配列)
配列番号92:5'-GCTGCAGGCTGAGATCGACAAC-3' (1078~1099位の領域と同じ配列)
配列番号93:5'-GCAGGCTGAGATCGACAACA-3' (1081~1100位の領域と同じ配列)
配列番号94:5'-GCTGCAGGCTGAGATCGACA-3' (1078~1097位の領域と同じ配列)
配列番号95:5'-GCTGCAGGCTGAGATCGACAA-3' (1078~1098位の領域と同じ配列)
配列番号96:5'-GGCTGCAGGCTGAGATCGAC-3' (1077~1096位の領域と同じ配列)
配列番号97:5'-CCGGTTGGCTGGAGATGGAGTG-3' (1330~1351位の領域と同じ配列)
配列番号98:5'-AGCCGGTTGGCTGGAGAT-3' (1328~1345位の領域と同じ配列)
配列番号99:5'-CGGTTGGCTGGAGATGGAGTGG-3' (1331~1352位の領域と同じ配列)
配列番号100:5'-CCGGTTGGCTGGAGATGGAG-3' (1330~1349位の領域と同じ配列)
配列番号101:5'-CGGTTGGCTGGAGATGGAGT-3' (1331~1350位の領域と同じ配列)
配列番号102:5'-CGGTTGGCTGGAGATGGAGTG-3' (1331~1351位の領域と同じ配列)
配列番号103:5'-GGTTGGCTGGAGATGGAGTGG-3' (1332~1352位の領域と同じ配列)
配列番号104:5'-CCGGTTGGCTGGAGATGGA-3'(1330~1348位の領域と同じ配列)
配列番号85:5'-AGGCTGCAGGCTGAGATCG-3' (1076~1094位の領域と同じ配列)
配列番号86:5'-GAGGCTGCAGGCTGAGATCG-3' (1076~1093位の領域と同じ配列)
配列番号87:5'-AGAGGCTGCAGGCTGAGATC-3' (1074~1093位の領域と同じ配列)
配列番号88:5'-GAGGCTGCAGGCTGAGATCG-3' (1075~1094位の領域と同じ配列)
配列番号89:5'-CAGAGGCTGCAGGCTGA-3' (1073~1089位の領域と同じ配列)
配列番号90:5'-CAGAGGCTGCAGGCTGAGA-3' (1073~1091位の領域と同じ配列)
配列番号91:5'-CAGAGGCTGCAGGCTGAGATC-3' (1073~1093位の領域と同じ配列)
配列番号92:5'-GCTGCAGGCTGAGATCGACAAC-3' (1078~1099位の領域と同じ配列)
配列番号93:5'-GCAGGCTGAGATCGACAACA-3' (1081~1100位の領域と同じ配列)
配列番号94:5'-GCTGCAGGCTGAGATCGACA-3' (1078~1097位の領域と同じ配列)
配列番号95:5'-GCTGCAGGCTGAGATCGACAA-3' (1078~1098位の領域と同じ配列)
配列番号96:5'-GGCTGCAGGCTGAGATCGAC-3' (1077~1096位の領域と同じ配列)
配列番号97:5'-CCGGTTGGCTGGAGATGGAGTG-3' (1330~1351位の領域と同じ配列)
配列番号98:5'-AGCCGGTTGGCTGGAGAT-3' (1328~1345位の領域と同じ配列)
配列番号99:5'-CGGTTGGCTGGAGATGGAGTGG-3' (1331~1352位の領域と同じ配列)
配列番号100:5'-CCGGTTGGCTGGAGATGGAG-3' (1330~1349位の領域と同じ配列)
配列番号101:5'-CGGTTGGCTGGAGATGGAGT-3' (1331~1350位の領域と同じ配列)
配列番号102:5'-CGGTTGGCTGGAGATGGAGTG-3' (1331~1351位の領域と同じ配列)
配列番号103:5'-GGTTGGCTGGAGATGGAGTGG-3' (1332~1352位の領域と同じ配列)
配列番号104:5'-CCGGTTGGCTGGAGATGGA-3'(1330~1348位の領域と同じ配列)
また、上記以外にも、以下に例示するプライマを用いることができる。
(F3プライマ)
配列番号105:5'-TTGCCGAGGCTGAGGA-3' (1134~1149位の領域と同じ配列)
(F3プライマ)
配列番号105:5'-TTGCCGAGGCTGAGGA-3' (1134~1149位の領域と同じ配列)
(FIP)
配列番号106:5'- CGTCCCCATGCTTCCCAGCCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1006~1025位の領域の相補配列と、964~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号107:5'- CGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1007~1025位の領域の相補配列と、964~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号108:5'- CTGCCGTGCCATATCCTGCTTGGCTCAAGGATGCTCGTGC-3'
(1219~1240位の領域の相補配列と、1165~1182位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号106:5'- CGTCCCCATGCTTCCCAGCCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1006~1025位の領域の相補配列と、964~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号107:5'- CGTCCCCATGCTTCCCAGCTGAAGCCTGGTACCAGACC-3'
(1007~1025位の領域の相補配列と、964~982位の領域と同じ配列とを連結した配列)
配列番号108:5'- CTGCCGTGCCATATCCTGCTTGGCTCAAGGATGCTCGTGC-3'
(1219~1240位の領域の相補配列と、1165~1182位の領域と同じ配列とを連結した配列)
(RIP)
配列番号109:5'-CGCAGTATGAGGAGATGGCCAACTGGAGGGTCTCAAACTTGG-3'
(924~945位の領域と同じ配列と、981~1000位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号110:5'- ATGAACCGGGCCATCCAGAGGCTTGGCACGCTGGTTCTTG-3'
(1058~1078位の領域と同じ配列と、1102~1120位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号111:5'- TTCAGAGATGAACCGGGCCATCACTTGGCACGCTGGTTCTTG-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1102~1121位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号112:5'- TCAGAGATGAACCGGGCCATCCACTTGGCACGCTGGTTCTTG-3'
(1052~1073位の領域と同じ配列と、1102~1121位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号113:5'- TTCAGAGATGAACCGGGCCATCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1095~1115位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号114:5'- TCAGAGATGAACCGGGCCATCCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3'
(1052~1073位の領域と同じ配列と、1095~1115位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号115:5'- GTGAAGCTGGCCCTGGACACCAACCGGCTCTCCTC-3'
(1268~1286位の領域と同じ配列と、1322~1337位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号109:5'-CGCAGTATGAGGAGATGGCCAACTGGAGGGTCTCAAACTTGG-3'
(924~945位の領域と同じ配列と、981~1000位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号110:5'- ATGAACCGGGCCATCCAGAGGCTTGGCACGCTGGTTCTTG-3'
(1058~1078位の領域と同じ配列と、1102~1120位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号111:5'- TTCAGAGATGAACCGGGCCATCACTTGGCACGCTGGTTCTTG-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1102~1121位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号112:5'- TCAGAGATGAACCGGGCCATCCACTTGGCACGCTGGTTCTTG-3'
(1052~1073位の領域と同じ配列と、1102~1121位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号113:5'- TTCAGAGATGAACCGGGCCATCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3'
(1051~1072位の領域と同じ配列と、1095~1115位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号114:5'- TCAGAGATGAACCGGGCCATCCCACGCTGGTTCTTGATGTTGT-3'
(1052~1073位の領域と同じ配列と、1095~1115位の領域の相補配列とを連結した配列)
配列番号115:5'- GTGAAGCTGGCCCTGGACACCAACCGGCTCTCCTC-3'
(1268~1286位の領域と同じ配列と、1322~1337位の領域の相補配列とを連結した配列)
(R3プライマ)
配列番号116:5'-GAGGTCGTCCCCATGCTTC-3'(1012~1030位の領域の相補配列)
配列番号117:5'- CTCAGCCTCGGCAATGG-3'(1131~1147位の領域の相補配列)
配列番号118:5'- CCTCAGCCTCGGCAATG-3'(1132~1148位の領域の相補配列)
配列番号119:5'- TGGCGGCCTCCAACTTG-3'(1117~1133位の領域の相補配列)
配列番号120:5'- GCTCCCACTCCATCTCCA-3'(1339~1356位の領域の相補配列)
配列番号116:5'-GAGGTCGTCCCCATGCTTC-3'(1012~1030位の領域の相補配列)
配列番号117:5'- CTCAGCCTCGGCAATGG-3'(1131~1147位の領域の相補配列)
配列番号118:5'- CCTCAGCCTCGGCAATG-3'(1132~1148位の領域の相補配列)
配列番号119:5'- TGGCGGCCTCCAACTTG-3'(1117~1133位の領域の相補配列)
配列番号120:5'- GCTCCCACTCCATCTCCA-3'(1339~1356位の領域の相補配列)
上記のRIPプライマのうち、配列番号33および34のプライマは、上記エキソンジャンクション3を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号35~37,39、40および109のプライマは、上記エキソンジャンクション5を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号41~43および110~114のプライマは、上記エキソンジャンクション6を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号115のプライマは、上記エキソンジャンクション7を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号38,44および45に示されるプライマは、上記エキソンジャンクション8を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号35~37,39、40および109のプライマは、上記エキソンジャンクション5を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号41~43および110~114のプライマは、上記エキソンジャンクション6を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号115のプライマは、上記エキソンジャンクション7を含む領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号38,44および45に示されるプライマは、上記エキソンジャンクション8を含む領域にハイブリダイズ可能である。
上記のプライマは、目的の増幅領域に応じて適宜組み合わされるプライマセットとして用いられる。F3プライマ、FIP、RIPおよびR3プライマの4種類を含むプライマセットの具体例を、表1に示す。なお、表中の各プライマの列に記載された数字は配列番号を示す。
また、F3プライマ、FIP、RIPおよびR3プライマに加えて、ループプライマFおよびループプライマRをさらに含むプライマセットの具体例を下記表2に示す。なお、表中の各プライマの列に記載された数字は配列番号を示す。
RT-LAMP法を用いる場合、試料を、本実施形態のプライマセット、RNA依存性DNAポリメラーゼ(以下、「逆転写酵素」とする)、鎖置換活性を有するDNA依存性DNAポリメラーゼ(以下、「鎖置換型DNAポリメラーゼ」とする)ならびにdNTPs(dATP、dGTP、dTTP、およびdCTPを含む)と混合し、反応させることにより、試料中のCK7のmRNAを検出することができる。
逆転写酵素および鎖置換型DNAポリメラーゼは、どちらも、当該分野において公知のものを用いることができる。また、逆転写酵素および鎖置換型DNAポリメラーゼの代わりに、RNAを鋳型としてDNAを合成する作用および鎖置換を行いながらDNAを鋳型としてDNAを合成する作用を備える、一種類の酵素を用いてもよい。
さらに、好ましくは上記酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤を用いる。
本実施形態のプライマセットは、凍結乾燥した状態または溶液状態で試薬として提供され得る。異なる種類のプライマを同一の容器に収容してもよいし、各種プライマをそれぞれ別の容器に収容してもよい。
RT-LAMP法で用いられる各試薬は、それぞれ別々の容器に収容することができるが、逆転写酵素および鎖置換型DNAポリメラーゼを同一の容器に収容してもよい。また、dNTPs、緩衝剤、および各種プライマのうち少なくとも二種類の物質を同一の容器に収容してもよい。これらの試薬をユーザに提供する際は、上記の試薬の一部または全部を含む試薬キットとして提供してもよい。
CK7のmRNA検出に供される試料としては、生体から採取した組織(リンパ節、リンパ液、血液等)または便などが例示される。
本実施形態のプライマセットは、凍結乾燥した状態または溶液状態で試薬として提供され得る。異なる種類のプライマを同一の容器に収容してもよいし、各種プライマをそれぞれ別の容器に収容してもよい。
RT-LAMP法で用いられる各試薬は、それぞれ別々の容器に収容することができるが、逆転写酵素および鎖置換型DNAポリメラーゼを同一の容器に収容してもよい。また、dNTPs、緩衝剤、および各種プライマのうち少なくとも二種類の物質を同一の容器に収容してもよい。これらの試薬をユーザに提供する際は、上記の試薬の一部または全部を含む試薬キットとして提供してもよい。
CK7のmRNA検出に供される試料としては、生体から採取した組織(リンパ節、リンパ液、血液等)または便などが例示される。
RT-LAMP法を用いた検出は、増幅工程および検出工程を経て行われる。まず、生体から採取したCK7のmRNAを含む試料を、上記プライマセット、逆転写酵素、dNTPsおよび鎖置換型DNAポリメラーゼと混合する。これらの混合液を一定の温度(例えば、65℃)まで加温してRT反応およびLAMP反応を行い、CK7のcDNAを増幅する。
RT反応およびLAMP反応の機序は、以下の通りである。
まず、反応液において、RIPの第二配列が、CK7のmRNA配列に含まれる領域R2cにハイブリダイズする。そして、逆転写酵素によって該RIPの3’末端から、CK7のmRNAを鋳型として、CK7のcDNAが合成される。これにより、CK7のmRNAと、該RIPから伸長したCK7のcDNA(RIP伸長鎖)との二本鎖核酸が合成される。
次に、R3プライマが、CK7のmRNA配列に含まれる領域R3cにハイブリダイズする。そして、鎖置換型DNAポリメラーゼによって該R3プライマの3’末端から、CK7のmRNAを鋳型として、既にCK7のmRNAと結合している上記RIP伸長鎖を剥がしながら(置換しながら)、CK7のcDNAが合成される。
上記RIP伸長鎖は、CK7のmRNA配列と相補的な配列を有するので、該RIP伸長鎖には領域F2cが含まれている。また、該RIP伸長鎖は、上記反応により一本鎖の状態になっており、ここにFIPの第四配列がハイブリダイズする。
そして、鎖置換型DNAポリメラーゼによってFIPの3’末端から、上記RIP伸長鎖を鋳型として、DNA合成を行う。この合成されたDNAは、その5’末端に第三配列(領域F1にハイブリダイズする配列)を有するので、該第三配列は、前記の合成されたDNAの配列に含まれる領域F1にハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。また、前記の合成されたDNAは、その3’末端に第一配列の相補配列(領域R1cにハイブリダイズする配列)を有するので、該第一配列の相補配列は、前記の合成されたDNAの配列に含まれる領域R1cにハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。従って、前記の合成されたDNAは、その5’末端および3’末端の両方にステムループ構造を有するダンベル構造を形成する。
このダンベル構造のDNA(ダンベルDNA)は、その3’末端から、自己の配列を鋳型として、5’末端側のステムループ構造を解きながら、鎖置換型DNAポリメラーゼによって伸長される。この伸長鎖は、その5’末端、3’末端およびこれらの中央に、それぞれ互いに相補的な配列を有するので、該伸長鎖内で3つのステムループ構造が形成される。さらに、該伸長鎖は、その3’末端から、自己の配列を鋳型として、前記ステムループ構造を解きながら、鎖置換型DNAポリメラーゼにより伸長される。この反応が実質的に等温下で繰り返されることにより、分子内に特定の配列を複数有するDNAが合成される(該反応の詳細は、米国特許第6410278号公報および米国特許第6974670号公報を参照されたい)。
まず、反応液において、RIPの第二配列が、CK7のmRNA配列に含まれる領域R2cにハイブリダイズする。そして、逆転写酵素によって該RIPの3’末端から、CK7のmRNAを鋳型として、CK7のcDNAが合成される。これにより、CK7のmRNAと、該RIPから伸長したCK7のcDNA(RIP伸長鎖)との二本鎖核酸が合成される。
次に、R3プライマが、CK7のmRNA配列に含まれる領域R3cにハイブリダイズする。そして、鎖置換型DNAポリメラーゼによって該R3プライマの3’末端から、CK7のmRNAを鋳型として、既にCK7のmRNAと結合している上記RIP伸長鎖を剥がしながら(置換しながら)、CK7のcDNAが合成される。
上記RIP伸長鎖は、CK7のmRNA配列と相補的な配列を有するので、該RIP伸長鎖には領域F2cが含まれている。また、該RIP伸長鎖は、上記反応により一本鎖の状態になっており、ここにFIPの第四配列がハイブリダイズする。
そして、鎖置換型DNAポリメラーゼによってFIPの3’末端から、上記RIP伸長鎖を鋳型として、DNA合成を行う。この合成されたDNAは、その5’末端に第三配列(領域F1にハイブリダイズする配列)を有するので、該第三配列は、前記の合成されたDNAの配列に含まれる領域F1にハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。また、前記の合成されたDNAは、その3’末端に第一配列の相補配列(領域R1cにハイブリダイズする配列)を有するので、該第一配列の相補配列は、前記の合成されたDNAの配列に含まれる領域R1cにハイブリダイズして、ステムループ構造を形成する。従って、前記の合成されたDNAは、その5’末端および3’末端の両方にステムループ構造を有するダンベル構造を形成する。
このダンベル構造のDNA(ダンベルDNA)は、その3’末端から、自己の配列を鋳型として、5’末端側のステムループ構造を解きながら、鎖置換型DNAポリメラーゼによって伸長される。この伸長鎖は、その5’末端、3’末端およびこれらの中央に、それぞれ互いに相補的な配列を有するので、該伸長鎖内で3つのステムループ構造が形成される。さらに、該伸長鎖は、その3’末端から、自己の配列を鋳型として、前記ステムループ構造を解きながら、鎖置換型DNAポリメラーゼにより伸長される。この反応が実質的に等温下で繰り返されることにより、分子内に特定の配列を複数有するDNAが合成される(該反応の詳細は、米国特許第6410278号公報および米国特許第6974670号公報を参照されたい)。
上記のようにして増幅された核酸の大部分は、dsDNA(二本鎖DNA:double strand DNA)であるため、この増幅産物をエチジウムブロマイド、SYBR GREEN I、Pico Greenなどのような蛍光インターカレーターで蛍光染色した後、紫外線を照射することによって蛍光を検出することができる。該蛍光染色は、増幅反応後の反応液に蛍光色素を添加することによって行ってもよい。あるいは、あらかじめ上記反応液に蛍光色素を添加し、蛍光色素の存在下で核酸増幅を行ってもよい。蛍光が検出されるか否かにより、試料中にCK7のmRNAが存在しているか否かを判定することができる。また、反応後の反応液の蛍光強度を測定することによって、増幅産物の定量を行うことができる。また、この定量結果に基づいて、試料に含まれるCK7のmRNAを定量することも可能である。特に、蛍光色素の存在下で核酸増幅を行う場合は、反応液の蛍光強度の増大をリアルタイムに測定し、一定の蛍光強度に達するまでの時間を測定することによって、試料中のCK7のmRNAの量に換算することもできる(リアルタイムRT-PCR法、リアルタイムRT-LAMP法など)。
また、LAMP反応では、副産物として水に不溶なピロリン酸マグネシウムが生成する。ピロリン酸マグネシウムは核酸増幅が進むにつれて増加し、この増加に伴って反応液が白濁する。そこで、反応液の濁りを目視により確認する、あるいは反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を測定する、または反応液を有色のフィルターで濾過し、フィルター上の残渣を確認することにより標的核酸を検出することができる(国際公開WO 第01/83817号)。反応液の吸光度または散乱光強度を測定して濁度測定を行う場合、前記蛍光色素を用いた場合と同様に、濁度変化をリアルタイムでモニターすることによって、閉鎖系でDNAの増幅および濁度の増加を追跡可能である。反応液が白濁するか否かにより、試料中にCK7のmRNAが存在しているか否かを判定することができる。また、増幅産物の濁度を測定することによって、該増幅産物を定量することができる。さらに、該定量結果に基づいて、試料に含まれるCK7のmRNAを定量することも可能である。該濁度の増加をリアルタイムに測定する場合は、一定の濁度に達するまでの時間(以下、「増幅立ち上がり時間」とする)を測定し、この時間を試料中のCK7のmRNA量に換算することも可能である。
(実施例1)
表1に示されるプライマセット1~21を用いるRT-LAMP法により、CK7のmRNAを検出できるか否かを、以下の通り検証した。
表1に示されるプライマセット1~21を用いるRT-LAMP法により、CK7のmRNAを検出できるか否かを、以下の通り検証した。
(1)試料調製
5×1010copy/μLのRNAを、RNaseフリーのYeast RNA溶液(50ng/μLのYeast RNA(Ambion)を含む)にて段階希釈し、5×103copy/μLのRNA(以下、「RNA試料A」とする)を調製した。
5×1010copy/μLのRNAを、RNaseフリーのYeast RNA溶液(50ng/μLのYeast RNA(Ambion)を含む)にて段階希釈し、5×103copy/μLのRNA(以下、「RNA試料A」とする)を調製した。
(2)反応液の調製
F3プライマ、FIP、RIPおよびR3プライマを、下記の通り緩衝液に添加し、プライマーミックスを調製した。
32μM FIP
32μM RIP
2μM F3プライマ
2μM R3プライマ
10mM トリスHCl (pH8.0)
F3プライマ、FIP、RIPおよびR3プライマを、下記の通り緩衝液に添加し、プライマーミックスを調製した。
32μM FIP
32μM RIP
2μM F3プライマ
2μM R3プライマ
10mM トリスHCl (pH8.0)
まず下記の試薬類を混合し、RT-LAMP反応用緩衝液を調製した。
53mM トリスHCl (pH8.8)
1.8× Thermopol buffer (New England Biolabs)
1.43mM dNTPs (Invitrogen)
5.36mM MgSO4 (ナカライテスク)
8.93mM DTT (和光純薬)
2% Tergitol (Sigma)
53mM トリスHCl (pH8.8)
1.8× Thermopol buffer (New England Biolabs)
1.43mM dNTPs (Invitrogen)
5.36mM MgSO4 (ナカライテスク)
8.93mM DTT (和光純薬)
2% Tergitol (Sigma)
次に下記の試薬類を混合し、酵素液を調製した。
10U/μL AMV逆転写酵素 (Promega)
8U/μL BstDNAポリメラーゼ (New England Biolabs)
RNase inhibitor (Promega)
10U/μL AMV逆転写酵素 (Promega)
8U/μL BstDNAポリメラーゼ (New England Biolabs)
RNase inhibitor (Promega)
下記の試薬を混合し、25μLの反応液を調製した。
RT-LAMP反応用緩衝液 14.0μL
酵素液 3.0μL
プライマーミックス 2.5μL
10mM トリスHCl(pH8.0) 3.5μL
RNA試料A 2.0μL
RT-LAMP反応用緩衝液 14.0μL
酵素液 3.0μL
プライマーミックス 2.5μL
10mM トリスHCl(pH8.0) 3.5μL
RNA試料A 2.0μL
また、ネガティブコントロール(NC)として、2.0μLのRNA試料Aの代わりに、Yeast RNA溶液(50ng/μLのYeast RNA(Ambion)を含む)2.0μLを添加した反応液も調製した。
(3)検出および検出結果
21種類のプライマセットの何れかを含む反応液を収容したチューブを、あらかじめ65℃に加温しておいたリアルタイム濁度測定装置LA-200(テラメックス社)にセットし、さらに65℃で反応液をインキュベートした。反応開始から反応液の濁度が0.1に達するまでの時間を測定した。ネガティブコントロールの測定を1回行い、RNA試料Aの測定を3回行った(n=3)。ネガティブコントロールの結果およびRNA試料Aの測定結果の平均値を、表3に示す。
21種類のプライマセットの何れかを含む反応液を収容したチューブを、あらかじめ65℃に加温しておいたリアルタイム濁度測定装置LA-200(テラメックス社)にセットし、さらに65℃で反応液をインキュベートした。反応開始から反応液の濁度が0.1に達するまでの時間を測定した。ネガティブコントロールの測定を1回行い、RNA試料Aの測定を3回行った(n=3)。ネガティブコントロールの結果およびRNA試料Aの測定結果の平均値を、表3に示す。
表中、-(ハイフン)は60分以内に濁度が0.1に達しなかったことを示す。表3に示されるとおり、ネガティブコントロールでは、60分以内に濁りの検出が確認されなかった(非特異的な増幅が起こらなかった)が、RNA試料Aを用いた3回の測定では、いずれも60分以内に核酸増幅が確認された(表中では平均値のみ示す)。以上より、プライマセット1~21の何れを用いても、60分以内にCK7のmRNAを検出できることがわかった。
(実施例2)
表2に示されるプライマセット22~61を用いるRT-LAMP法により、CK7のmRNAを検出できるか否かを、以下の通り検証した。
表2に示されるプライマセット22~61を用いるRT-LAMP法により、CK7のmRNAを検出できるか否かを、以下の通り検証した。
(1)試料調製
5×1010copy/μLのRNAをRNaseフリーのYeast RNA溶液(50ng/μLのYeast RNA(Ambion)を含む)にて段階希釈し、2.5×103copy/μLのRNA(以下、「RNA試料B」とする)を調製した。
5×1010copy/μLのRNAをRNaseフリーのYeast RNA溶液(50ng/μLのYeast RNA(Ambion)を含む)にて段階希釈し、2.5×103copy/μLのRNA(以下、「RNA試料B」とする)を調製した。
(2)反応液の調製
F3プライマ、FIP、RIP、R3プライマ、ループプライマFおよびループプライマRを、下記の通り緩衝液に添加し、プライマーミックスを調製した。
16μM FIP
16μM RIP
1μM F3プライマ
1μM R3プライマ
12μM ループプライマF
12μM ループプライマR
10mM トリスHCl (pH8.0)
F3プライマ、FIP、RIP、R3プライマ、ループプライマFおよびループプライマRを、下記の通り緩衝液に添加し、プライマーミックスを調製した。
16μM FIP
16μM RIP
1μM F3プライマ
1μM R3プライマ
12μM ループプライマF
12μM ループプライマR
10mM トリスHCl (pH8.0)
下記の試薬を混合し、25μLの反応液を調製した。
実施例1で調製したRT-LAMP反応用緩衝液 14.0μL
実施例1で調製した酵素液 3.0μL
プライマーミックス 5μL
10mM トリスHCl(pH8.0) 1.0μL
RNA試料B 2.0μL
実施例1で調製したRT-LAMP反応用緩衝液 14.0μL
実施例1で調製した酵素液 3.0μL
プライマーミックス 5μL
10mM トリスHCl(pH8.0) 1.0μL
RNA試料B 2.0μL
(3)検出および検出結果
40種類のプライマセットの何れかを含む反応液を収容したチューブを、あらかじめ65℃に加温しておいたリアルタイム濁度測定装置LA-200(テラメックス社)にセットし、さらに65℃で反応液をインキュベートした。反応開始から反応液の濁度が0.1に達するまでの時間を測定した。ネガティブコントロールの測定を1回行い、RNA試料Bの測定を3回行った(n=3)。ネガティブコントロールの結果およびRNA試料Bの測定結果の平均値を、表4に示す。
40種類のプライマセットの何れかを含む反応液を収容したチューブを、あらかじめ65℃に加温しておいたリアルタイム濁度測定装置LA-200(テラメックス社)にセットし、さらに65℃で反応液をインキュベートした。反応開始から反応液の濁度が0.1に達するまでの時間を測定した。ネガティブコントロールの測定を1回行い、RNA試料Bの測定を3回行った(n=3)。ネガティブコントロールの結果およびRNA試料Bの測定結果の平均値を、表4に示す。
表中、-(ハイフン)は60分以内に濁度が0.1に達しなかったことを示す。表3に示されるとおり、ネガティブコントロールでは、60分以内に濁りの検出が確認されなかった(非特異的な増幅が起こらなかった)が、RNA試料Bを用いた3回の測定では、いずれも40分以内に核酸増幅が確認された(表中では平均値のみ示す)。以上より、プライマセット22~61の何れを用いても、40分以内にCK7のmRNAを検出できることがわかった。
本出願は、2008年3月28日に出願された日本国特許出願特願2008-088188号に関し、この特許請求の範囲、明細書、図面、表、配列表及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
Claims (20)
- 第一プライマ、第二プライマ、第三プライマおよび第四プライマを含み;
1)前記第一プライマが、5'側に第一配列を、3'側に第二配列を含み、
前記第一配列が、
(a)10~30ヌクレオチドの長さを有し、
(b)配列番号1の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
前記第二配列が、
(c)10~30ヌクレオチドの長さを有し、
(d)配列番号1の配列において前記第一領域よりも3'側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第二領域が、
i.配列番号1の724および725位のヌクレオチド、
ii.配列番号1の985および986位のヌクレオチド、
iii.配列番号1の1111および1112位のヌクレオチド、
iv.配列番号1の1332および1333位のヌクレオチド、または
v.配列番号1の1367および1368位のヌクレオチド
を含み、
2)前記第二プライマが、5’側に第三配列を、3’側に第四配列を含み、
前記第三配列が、
(e)10~30ヌクレオチドの長さを有し、
(f)配列番号1の配列において前記第一領域よりも5’側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第四配列が、
(g)10~30ヌクレオチドの長さを有し、
(h)配列番号1の配列において前記第三領域よりも5’側に位置する第四領域にハイブリダイズ可能であり、
3)前記第三プライマが、配列番号1の配列において前記第四領域よりも5’側に位置する第五領域にハイブリダイズ可能であり、
4)前記第四プライマが、配列番号1の配列において前記第二領域よりも3’側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である、サイトケラチン7のmRNAの検出用プライマを含む試薬。 - 5'側に第一配列を、3'側に第二配列を含み;
前記第一配列が、
(a)10~30ヌクレオチドの長さを有し、
(b)配列番号1の配列に含まれる領域である第一領域に対する相補鎖にハイブリダイズ可能であり、
前記第二配列が、
(c)10~30ヌクレオチドの長さを有し、
(d)配列番号1の配列において前記第一領域よりも3'側に位置する第二領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第二領域が、
i. 配列番号1の724および725位のヌクレオチド、
ii. 配列番号1の985および986位のヌクレオチド、
iii.配列番号1の1111および1112位のヌクレオチド、
iv. 配列番号1の1332および1333位のヌクレオチド、または
v. 配列番号1の1367および1368位のヌクレオチド
を含む、サイトケラチン7のmRNA検出用プライマ。 - 以下の(a)および(b):
(a)配列番号33~45および109~115の何れかに記載のポリヌクレオチド、
(b)前記(a)のポリヌクレオチドにおいて1個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項2に記載のプライマ。 - 配列番号1の721~739位の領域、
配列番号1の974~999位の領域、
配列番号1の976~995位の領域、
配列番号1の978~993位の領域、
配列番号1の978~997位の領域、
配列番号1の981~1000位の領域、
配列番号1の1095~1115位の領域、
配列番号1の1100~1117位の領域、
配列番号1の1101~1117位の領域、
配列番号1の1353~1376位の領域、
配列番号1の1353~1379位の領域、および
配列番号1の1354~1376位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項2または請求項3に記載のプライマ。 - 前記第二配列の3’末端の3ヌクレオチドが、前記第二領域の配列と完全に相補的である、請求項2に記載のプライマ。
- 第一プライマ、第二プライマ、第三プライマおよび第四プライマを含む;
1)前記第一プライマが、請求項2に記載のプライマであり、
2)前記第二プライマが、5’側に第三配列を、3’側に第四配列を含み、
前記第三配列が、
i.10~30ヌクレオチドの長さを有し、
ii.配列番号1の配列において前記第一領域よりも5’側に位置する第三領域にハイブリダイズ可能であり、
前記第四配列が、
iii.10~30ヌクレオチドの長さを有し、
iv.配列番号1の配列において前記第三領域よりも5’側に位置する第四領域にハイブリダイズ可能であり、
3)前記第三プライマが、配列番号1の配列において前記第四領域よりも5’側に位置する第五領域にハイブリダイズ可能であり、
4)前記第四プライマが、配列番号1の配列において前記第二領域よりも3’側に位置する第六領域にハイブリダイズ可能である、サイトケラチン7のmRNA検出用プライマセット。 - 前記第二プライマが、以下の(a)および(b):
(a)配列番号14~32および106~108の何れかに記載のポリヌクレオチド;
(b)前記(a)のポリヌクレオチドにおいて1個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択され、
前記第三プライマが、以下の(c)および(d):
(c)配列番号2~13および105のいずれかに記載のポリヌクレオチド;
(d)前記(c)のポリヌクレオチドにおいて1個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項6に記載のプライマセット。 - 前記第二プライマが、
配列番号1の574~590位の領域、
配列番号1の813~834位の領域、
配列番号1の813~882位の領域、
配列番号1の816~834位の領域、
配列番号1の837~856位の領域、
配列番号1の840~857位の領域、
配列番号1の851~869位の領域、
配列番号1の851~871位の領域、
配列番号1の861~882位の領域、
配列番号1の863~883位の領域、
配列番号1の963~982位の領域、
配列番号1の964~982位の領域、
配列番号1の1165~1182位の領域、
配列番号1の1235~1252位の領域、および
配列番号1の1236~1252位の領域
からなる群より選択される領域の相補領域にハイブリダイズする、請求項6に記載のプライマセット。 - 前記第三プライマが、
配列番号1の538~556位の領域、
配列番号1の542~561位の領域、
配列番号1の546~564位の領域、
配列番号1の775~794位の領域、
配列番号1の796~815位の領域、
配列番号1の816~834位の領域、
配列番号1の827~843位の領域、
配列番号1の828~845位の領域、
配列番号1の840~859位の領域、
配列番号1の932~950位の領域、
配列番号1の1134~1149位の領域、および
配列番号1の1213~1228位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項6に記載のプライマセット。 - 前記第四プライマが、以下の(a)および(b):
(a)配列番号46~60および116~120のいずれかに記載のポリヌクレオチド;
(b)前記(a)のポリヌクレオチドにおいて1個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項6に記載のプライマセット。 - 前記第四プライマが、
配列番号1の741~759位の領域、
配列番号1の742~760位の領域、
配列番号1の1007~1023位の領域、
配列番号1の1009~1025位の領域、
配列番号1の1011~1028位の領域、
配列番号1の1012~1028位の領域、
配列番号1の1012~1029位の領域、
配列番号1の1012~1030位の領域、
配列番号1の1117~1132位の領域、
配列番号1の1117~1133位の領域、
配列番号1の1118~1133位の領域、
配列番号1の1118~1134位の領域、
配列番号1の1118~1135位の領域、
配列番号1の1131~1147位の領域、
配列番号1の1132~1148位の領域、
配列番号1の1356~1339位の領域、
配列番号1の1383~1400位の領域、
配列番号1の1384~1401位の領域、および
配列番号1の1390~1406位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項6に記載のプライマセット。 - 前記配列番号1の配列に含まれる前記第三領域と前記第四領域との間に位置する第七領域にハイブリダイズする第五プライマをさらに含む、請求項6に記載のプライマセット。
- 前記第五プライマが、以下の(a)および(b):
(a)配列番号61~84のいずれかに記載のポリヌクレオチド;
(b)前記(a)のポリヌクレオチドにおいて1個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド。
からなる群より選択される、請求項12に記載のプライマセット。 - 前記第五プライマが、
配列番号1の983~1002位の領域、
配列番号1の983~1003位の領域、
配列番号1の984~1002位の領域、
配列番号1の984~1003位の領域、
配列番号1の984~1004位の領域、
配列番号1の985~1004位の領域、
配列番号1の986~1004位の領域、
配列番号1の986~1005位の領域、
配列番号1の987~1005位の領域、
配列番号1の987~1006位の領域、
配列番号1の1251~1271位の領域、
配列番号1の1251~1273位の領域、
配列番号1の1251~1274位の領域、
配列番号1の1252~1273位の領域、
配列番号1の1252~1274位の領域、
配列番号1の1253~1274位の領域、
配列番号1の1256~1277位の領域、
配列番号1の1256~1278位の領域、
配列番号1の1257~1278位の領域、
配列番号1の1258~1278位の領域、
配列番号1の1259~1278位の領域、
配列番号1の1259~1279位の領域、および
配列番号1の1260~1279位の領域
からなる群より選択される領域にハイブリダイズする、請求項12に記載のプライマセット。 - 前記配列番号1の配列に含まれる前記第一領域と第二領域との間に位置する第八領域の相補領域にハイブリダイズする第六プライマをさらに含む、請求項6に記載のプライマセット。
- 前記第六プライマが、以下の(a)および(b):
(a)配列番号85~104のいずれかに記載のポリヌクレオチド;
(b)前記(a)のポリヌクレオチドにおいて1個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項15に記載のプライマセット。 - 前記第六プライマが、
配列番号1の1073~1089位の領域、
配列番号1の1073~1091位の領域、
配列番号1の1073~1093位の領域、
配列番号1の1074~1093位の領域、
配列番号1の1075~1094位の領域、
配列番号1の1076~1093位の領域、
配列番号1の1076~1094位の領域、
配列番号1の1077~1096位の領域、
配列番号1の1078~1097位の領域、
配列番号1の1078~1098位の領域、
配列番号1の1078~1099位の領域、
配列番号1の1081~1100位の領域、
配列番号1の1328~1345位の領域、
配列番号1の1330~1348位の領域、
配列番号1の1330~1349位の領域、
配列番号1の1330~1351位の領域、
配列番号1の1331~1350位の領域、
配列番号1の1331~1351位の領域、
配列番号1の1331~1352位の領域、および
配列番号1の1332~1352位の領域
からなる群より選択される領域の相補領域にハイブリダイズする、請求項15に記載のプライマセット。 - 配列番号25の配列を含む、サイトケラチン7のmRNA検出用プライマ。
- 請求項6に記載のプライマセットと、RNA依存性DNAポリメラーゼと、DNA依存性DNAポリメラーゼとdNTPsとを含む、サイトケラチン7のmRNA検出用キット。
- 1)生体から採取した試料、請求項6に記載のプライマセットおよびRNA依存性DNAポリメラーゼを反応させて、前記試料中のサイトケラチン7のmRNAからcDNAを合成する工程と、
2)前記プライマセット、DNA依存性DNAポリメラーゼおよび前記工程で合成されたcDNAを反応させて、cDNAを増幅する工程と、
3)増幅されたcDNAを検出することにより、前記試料中のサイトケラチン7のmRNAを検出する工程と
を含む、サイトケラチン7のmRNA検出方法。
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