WO2008041370A1

WO2008041370A1 - Structure renfermant des cellules progénitrices hématopoïétiques issues de cellules es et procédé de préparation de cellules sanguines faisant appel à ladite structure

Info

Publication number: WO2008041370A1
Application number: PCT/JP2007/001081
Authority: WO
Inventors: Hiromitsu Nakauchi; Koji Eto; Naoya Takayama; Hidekazu Nishiki-I; Hiroko Tsukui
Original assignee: The University Of Tokyo
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2007-10-04
Publication date: 2008-04-10
Also published as: JP5283120B2; US20100197016A1; US8058064B2; CN101541951A; GB0906137D0; GB2455472B; GB2455472A; JPWO2008041370A1

Description

明細書

E S細胞からの造血前駆細胞を内包する構造物、及び該構造物を用いた血球細胞の調製方法。

技術分野

[0001] 本発明は、 ES細胞から調製された造血前駆細胞を内包するネット様構造物 ( n d o t h e l ι a I S a c ； em b r y o n i c s t em— s a c ； ES- s a c) に関する。さらに、本発明は該ネット様構造物を用いた血球細胞の調製方法に関する。

背景技術

[0002] 白血病に代表される血液関連疾患の治療に対し、治療に必要な量の血球細胞を安定に増幅し、供給することは極めて重要なことであることから、これまでに多くの研究者によって、造血幹細胞又は造血前駆細胞の効率的な増幅が試みられてきた。血球細胞の中でも、巨核球は血小板前駆細胞（p r o p I a t e I e t ) さらには血小板を産生せしめる細胞であり、治療的な応用において重要な位置を占めている。血球細胞のなかでも血小板は血液凝固（止血）において必須の細胞であるため、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおいて、血小板の需要は極めて高い。これまでに、血小板は、ドナ一からの献血により採取する方法により供給されてきた。しかし、ドナーによる方法は、慢性的なドナー不足、採取した血小板を凍結することができないことなどにより、安定的な血小板の供給を達成することが困難である。一方、 T P Oを投与する方法、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球を分化させる方法などが試みられたが、 T POの投与は、投与後 T POに対する無力化抗体が産生されることで実用化には至っていない。さらに、臍帯血又は骨髄細胞からの巨核球分化による方法も、巨核球のソースとなる造血幹細胞を極めて少数しか得ることができないことから、やはり安定した血小板の提供に適した方法ではない。

[0003] 近年、生体からは僅かしか得られない造血幹細胞又は造血前駆細胞を生体外において増幅させる試みが盛んに行われている。例えば、マウス ES細胞から、自己複製可能で、リンパ球へも分化可能な造血幹細胞株を樹立する方法（特許文献 1 ) 、霊長類動物の ES細胞を生体外で分化誘導した後、得られた細胞をヒッジの子宮内の胎仔に移植し出生したヒッジ胎仔から霊長類の ES細胞を取得する方法（特許文献 2) 、或いは、造血幹細胞の未分化性を維持した C D 34陽性/ C D 38陰性細胞を生体外で簡便かつ安定的に増幅させる方法（特許文献 3) などが報告されている。

[0004] 血小板の安定的な供給には、造血幹細胞又は造血前駆細胞を効率的に巨核球及び血小板へ分化させる方法が必要である。そのため、種々の動物由来の E S細胞から巨核球、さらには血小板を誘導させる試みも盛んに行われている。 E t oらは、マウス ES細胞を OP 9ストロ一マ細胞と共培養することで巨核球へ分化誘導することを明らかにしており（非特許文献 1 ) 、 F u j i mo t oらは、 E t oらと同様の方法を用いて血小板の誘導を確認したとの報告を行っている（非特許文献 2) 。また、サルの ES細胞から巨核球の分化誘導に成功したとの報告（非特許文献 3) 、ヒトの ES細胞から巨核球の分化誘導に成功したとの報告（非特許文献 4) もあるが、いずれも、血小板の放出を確認していない。また、血小板や巨核球以外の血球細胞の治療上必要な量を安定的に取得するためには、造血幹細胞又は造血前駆細胞を効率的に取得する必要があるが、その方法も、未だ、確立されているとは言い難い。

[0005] 特許文献 1 ：特開 2006 _ 1 41 356号公報

特許文献 2：特開 2004 _ 380601号公報

特許文献 3：特開 2006 _ 61 1 06号公報

非特許文献 1 : E t oら， P r o c. A c a d. S c に USA 2002 ; 99 : 1 281 9- 1 2824.

非特許文献 2： F u j i mo t oら， B l o o d 2003 ; 1 02 : 404 4-4051.

非特許文献 3： H i r o y amaら， E x p. H ema t o に 2006 ; 34 ： 760-769.

非特許文献 4： G a u rら， J T h r omb H a emo s t . 2005 ; 4 ： 436-442.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明者らは、上記事情に鑑み造血前駆細胞の効率的な取得方法並びに巨核球及び血小板の取得方法について鋭意研究を行つた結果、造血前駆細胞が濃縮されて存在するネット様構造物の調製に成功し、さらには、ヒト ES細胞からの血小板の調製に初めて成功し、本発明を完成させるに至った。

よって、本発明は造血前駆細胞を内包するネット様構造物及び該ネット様構造物の調製方法に関する。

さらに、本発明は該ネット様構造物から成熟巨核細胞、血小板などの血球細胞を効率的に調製する方法に関する。

課題を解決するための手段

[0007] 従来技術では、造血前駆細胞を比較的高濃度で得ることは困難であり、その結果、血球細胞の得られる量も少なかった。特に、血小板の治療上利用可能な量を ES細胞から誘導することは難しく、ヒトにおいては、誘導すら行うことができなかった。発明者らはこれらの問題を解決するために、 ES細胞を分化誘導する過程で得られるネット様構造物に着目し、該ネット様構造物から血球細胞の誘導を行った。

すなわち、本発明は、以下の（1 ) 〜（1 0) に関する。

(1 ) 本発明の第 1の態様は、「ES細胞をフィーダ一細胞上に播き、造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物」である。

(2) 本発明の第 2の態様は、「前記造血前駆細胞の分化誘導に適した条件が、 VEG F存在下、 1 4日間〜 1 6日間培養することである上記（1 ) に記載のネット様構造物」である。

(3) 本発明の第 3の態様は、「前記 ES細胞がヒト由来であることを特徴とする上記（1 ) 又は（2) に記載のネット様構造物」である。

(4) 本発明の第 4の態様は、「前記フィーダ一細胞が 1 0 T 1 /2細胞、又は OP 9細胞であることを特徴とする上記（1 ) 乃至（3) のいずれかに記載のネット様構造物」である。

(5) 本発明の第 5の態様は、「上記（1 ) 乃至（4) のいずれかに記載のネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダ一細胞上に播き、血球細胞の分化誘導に適した条件で培養し、血球細胞を産生する方法」である。

(6) 本発明の第 6の態様は、「前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする上記（5) に記載の方法」である。

(7) 本発明の第 7の態様は、「前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、 T PO存在下、 7日間〜 9日間培養することである上記（6) に記載の方法」である。

(8) 本発明の第 8の態様は、「前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、 T PO、 S C F及び H e p a r i n存在下、 7〜9日間培養することである上記（6) に記載の方法」である。

(9) 本発明の第 9の態様は、「上記（6) 乃至（8) のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び血小板」である。

(1 0) 本発明の第 1 0の態様は、「上記（6) 乃至（8) のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤」である。発明の効果

[0008] 本発明に係るネット様構造物中には、造血前駆細胞が比較的高濃度に濃縮されて存在しているため、各種血球細胞（例えば、好中球、マクロファージ、赤血球、巨核球を含む）への分化誘導を効率的に行うことができる。

[0009] また、発明に係る血球細胞を産生する方法を用いると、生体外において所望の血球を効率的に取得することができる。特に、ヒトの血小板については、これまでに実現することができなかつた生体外における血小板の産生を、比較的大量かつ効率的に行うことができる。 [0010] さらに、本発明に係る血小板を産生する方法を用いると、血小板を有効成分とする血液製剤の安定的な供給を実現することができる。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]ネット様構造物の取得方法を模式的に示した図である。

[図 2]ネット様構造物の取得方法、及びネット様構造物から巨核球/血小板を調製する方法の手順を模式的に示した図である。

[図 3]未分化 ES細胞からネット様構造物を産生する過程を示した図、及び、ネット様構造物の位相差顕微鏡による観察像を示す。

[図 4]ネット様構造物の位相差顕微鏡による観察像である。 D 4及び D 7は培養 4日目、 7日目であることを示す。また、 E n d o t h e l i a l S a c (em b r y o n ι c s t em— s a c ； ts_ s a c)とは、ィ、ッ卜様構造物のことである。

[図 5] V EG Fによるネット様構造物の誘導効果を示す。 N o c y t o k i n e ; V EG F、 I G F— I I , B M P _ 4などのサイト力インを添加しなぃコントロールのことである。

[図 6]抗ヒト F I k- 1 (V EG F— R) 抗体でネット様構造物（培養 1 4日目）を蛍光免疫染色した結果である。

[図 7]ネット様構造（培養 1 4日目）を、抗ヒト F I k- 1 (V EG F— R) 抗体、抗 C D 3 1抗体、抗 U E A_ I レクチン（ L e c t i n ) 抗体で蛍光染色した結果を示す。 H E ：へマトキシリン—ェォジン染色。ネット様構造は、内皮細胞のマ _カ_を発現しており、その内部はレクチン陽性細胞の隔壁による多数の小胞より構成されている。また、小胞内には血球様の細胞が存在する。

[図 8]ネット様構造物内部の血液前駆細胞の表面抗原を示す（培養 1 4日目）。抗ヒト F I k_ 1 (V EG F— R) 抗体、抗ヒト CD 3 1抗体、抗ヒト C D v3 キ几体、ナ九ヒ卜し D 4 1 ί几体、キ几ヒ卜 v a s c u l a r e n d o t h e l I a I c a d h e r i n (V E— c a d h e r i n) キ几体、キ几ヒト CXCR4 ( s t r oma— d e r i v e d f a c t o r— 1 受容体) 抗体を用いてネット様構造物内部の血液前駆細胞表面抗原を調べた結果である。

[図 9]ネット様構造物内部の血液前駆細胞を使用し、血液細胞分化用コロニー作成培養後 7日目の多種コロニー像を示す。コロニー像は、コロニーを採取後に細胞成分をギムザ（w r i g h t - g i ems a) 染色した結果である。ミックスコロニーを含む多種の血液細胞への分化が観察された。

[図 10]ネット様構造物内部の血液前駆細胞 1 X 1 0⁴個あたりから産生された各種血液細胞コロニー数を定量化した結果を示す。

[図 11]Kh ES細胞（Kh ES_3細胞）から誘導された巨核球の FACS による解析結果を示す。

[図 12]Kh ES細胞（Kh ES_3細胞）から誘導された培養 24日目の巨核球のフローサイトメーターによる解析結果を示す。

[図 13]Kh ES_ 3細胞から誘導された培養 24日目の巨核球をサイトスピン後、ギムザ（w r i g h t - g i e m s a) 染色を行った観察像である。倍率 X 40。

[図 14] Kh ES _ 3細胞から誘導された巨核球及び血小板前駆体の顕微鏡による観察像を示す。 i , i i ； K h ES_3細胞から誘導された巨核球の血小板前駆体形態の位相差顕微鏡観察像、 i i i , i v, v ;抗ヒト CD41 a (G P I l b, i n t e g r i n ひ l i b) 抗体を用いて染色したプロプレイトレッ卜の蛍光顕微鏡による観察像。

[図 15] K h ES_ 3細胞から誘導された血小板を、 F ACSを用いて解析した結果を示す。 A ；コントロールとしてヒト末梢血から回収血小板の解析結果、 B ； K h ES細胞由来の血小板の解析結果。

[図 16] K h ES_ 3細胞から誘導された血小板を、 F ACSフローサイトメ —タ一を用いて解析した結果を示す。 A_a ；コントロールとしてヒト末梢血から回収した血小板の解析結果、 BA_b ； K h ES細胞由来の血小板の解析結果。 CD42 a (GP I X) , C D 42 b (GP I bひ）はともに成熟巨核球、及び血小板の特異的発現分子である。 B ；電子顕微鏡によるヒト末梢血血小板、および K h E S細胞由来の血小板写真。

[図 17] K h ES_ 3細胞由来の血小板のフイブリノ一ゲン結合アツセィの結果を示す。 Aは、培養 24日目の上清を回収し、細胞成分を除き、濃縮した血小板を、血小板活性化剤（トロンビン）により刺激し、 F I TC標識したフイブリノ一ゲンの結合度をフ口一サイトメータ一で解析した結果である。 Bは、トロンビンの量依存的に A I e X a F l u o r 488標識フイブリノ一ゲンが CD 41陽性パーティクルに結合した結果を示す。 n o a g

0 n i s t ； A I e x a F l u o r 488標識フイブリノ一ゲン無しの結果。

[図 18] K h ES_ 3細胞由来の血小板のフイブリノ一ゲン結合アツセィの結果を示す。 A ；培養 24日目の上清を回収し、細胞成分を除き、濃縮した血小板を、血小板活性化剤（ADP) により刺激し、 F I TC標識した PAC - 1抗体フイブリノ一ゲンの結合度をフローサイトメ一ターで解析した結果である。 PAC— 1 (BD I n V i t r o g e n社）は、活性化した血小板膜上のヒト CD41 a/CD62 (GP I I b I I I a, i n t e g r i n ひ I I b S 3) にのみ結合する抗体である。 B ； A DPの量依存的に F

1 T C標識した P A C— 1抗体が、 C D 41陽性パーティクルに結合した結果を示す。 n o a g o n i s t ; ADPなしの結果。

[図 19] K h ES— 3細胞由来の血小板が、末梢血由来の血小板と同様に、 P M A刺激によって細胞の骨格変化を示した様子を蛍光顕微鏡により観察した結果を示す。 B及び Eは、抗 F—ァクチン抗体による染色像を、 C及び Fは、抗 CD41 a抗体による染色像を示す。 A及び Dは、各々、 Bと C、巳と Fを重ね合わせた観察像である。

[図 20] K h ES— 3細胞由来の血小板が、末梢血由来の血小板と同様に、 A D P及びトロンビン（ t h r omb i n) 刺激によって細胞の骨格変化を示した様子を蛍光顕微鏡により観察した結果を示す。比較のため、ヒト末梢血小板での像を上に呈示した。抗 F—ァクチン抗体及び抗 CD41 a抗体による染色像を示す。発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明の実施形態の 1つは、 ES細胞をフィーダ一細胞上に播き、造血系細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物である。該ネット様構造物には、造血前駆細胞が濃縮されて存在しているため、各種血球細胞を生体外において効率的に分化誘導することができる。ここで「ES細胞」とは、胚性幹細胞のことであり、多分化能と自己複製能を備えた未分化細胞のことである。「ES細胞」のソースとしては如何なる動物であってもよいが、ヒト由来の細胞が最も好ましい。また、ヒト由来の ES細胞としては、例えば、 K h ES細胞株などが好適に使用可能である。また、「フィーダ一細胞」としては、 ES細胞の分化誘導に寄与するものであれば使用可能であるが、例えば、マウス胚繊維芽細胞、好ましくは、 1 0 T 1 /2細胞株、 O P 9細胞などを用いることができる。「フィーダ一細胞」を用いる際には、放射線を照射するなどして、細胞の増殖を抑止しておくのがよい。

[0013] ES細胞の培養条件としては、ネット様構造物を調製するために適した条件を選択することができる。この培養条件は、用いる ES細胞によって異なるが、例えば、ヒト ES細胞である Kh ES細胞株を用いる場合、培地としては、最終濃度 1 5%の FBSを添加した I MDMを用い、その他適宜サブリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、 Kh ES細胞株を用いる場合、ネット様構造物を効率的に形成させるために、 VEG F及び I G F- I Iを、各々、 0〜 1 00 n g/m I、 0〜300 n g/m I程度、より好ましくは、 20 n g/m I、 200 n g/m I程度加えるのがよい。あるいは、 I G F— 1 1は加えなくてもよい。また、培養の環境としては、用いる ES細胞によって異なるが、 Kh ES細胞株の場合、例えば、 5%

C0₂、 36〜38°C、好ましくは 37°Cの条件を用いることができる。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、 ES細胞によって異なるが、 Kh ES細胞株の場合、フィーダ一細胞上に播いてから、 1 4〜1 6日後くらいにその存在を確認することができる。 [0014] 形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、中胚葉細胞のマ ―力一の一つである F l k 1 、 f e t a l l i v e r k i n a s e 1 ) 、 CD31、 CD34、又は U EA— I レクチン（U l e x e u r o p a e u s. a g g l u t i n i n- 1 ) 陽性細胞によって隔壁が構成されている。このネット様構造物の内部には、造血前駆細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する造血前駆細胞を各種血球細胞の分化誘導に用いる場合には、隔壁構成している細胞などから分離する必要がある。この分離は、物理的な手段により行うのが望ましい。例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナ一など）に通すことにより、隔壁細胞と造血前駆細胞を分離することができる。

[0015] 本発明のさらなる実施形態は、ネット様構造物から分離した造血前駆細胞から各種血球細胞を産生する方法である。得られた造血前駆細胞をフィーダ一細胞上に播き、所望の血球細胞の分化誘導に適した条件で培養を行う。ここで「血球細胞の分化誘導に適した条件」とは、目的の血球細胞の種類に応じて、例えば、 T PO、 I L— 1 ひ、 I L— 3、 I L— 4、 I L— 5、 I L _6、 I L_9、 I L_ 1 1、 EPO、 GM_CS F、 SC F、 G— CS F 、 F I t 3リガンド、 H e p a r i nなどを添加した条件を挙げることができる。巨核球及び血小板を分化誘導する場合には、例えば、 T POの存在下で、又は SC F、 H e p a r i n及び T POの存在下で、 7〜9日間程度培養することができる。培養環境としては、生体外で血球細胞の分化誘導を行うにあたり適した環境であればよいが、例えば、 5% C0₂、 36〜38°C 、好ましくは 37°Cの条件下で培養を実施する。

[0016] 本発明によって生産される血球細胞は、生体外で生産するため、生体内に天然に存在するものを取得する場合に比べて、簡便、かつ、豊富に取得することができる点において、本発明に係る方法は優れた方法である。特に、ヒト血小板については、これまでに、生体外で確認できる程の量が生産されたとの報告はなく、生体外で生産されたヒト血小板としては本発明によるものが初めてである。血小板は、白血病、骨髄移植、抗ガン剤治療の際の血小板減少の予防又は改善に有効であるため、本発明により得られたヒト血小板を製剤の形態で安定的に供給することも可能である。血液製剤を調製するにあたっては、血小板が保存に対して不安定であることなどを考慮して、血小板の安定化に資する他の成分を含有せしめることもできる。血小板を安定化させる条件は、当該技術分野の専門家において周知の方法を選択することが可能である。より具体的には、取得した血小板（ヒト ES細胞由来洗浄血小板）は、例えば、以下の方法により製剤化することができる。

ACD— A F F P f r e s h f r o z e n p l a sma ;献皿で得られた全血液から調整したもの、アルブミン、凝固因子など血液成分以外のものをすベて含む）を 1 ： 1 0の比率で調整し、 1 5_50 G yの放射線照射後に 20_ 24°Cにて振とうしながら保存する。 A CD— A液；クェン酸ナトリウム 22 g/クェン酸 8 g/ブドウ糖 22 gを注射用水で全体を 1 Lとするように調整する。

以上の方法を使用する場合、血小板の濃度としては、例えば、 1 X 1 0⁹血小板 Zm L程度が望ましい。

た、 GM600 1 ( a b r o a d— r a n g e h y d r o x am i c a c i d— b a s e d m e t a l l o p r o t e a s e i n h i b i t o r ) (し a l b i o c h e m社、 L a J o I l a, C A , U SA ) を添加しておくと、冷凍保存および室温保存中に起きる血小板機能分子 G P I b_V_ I Xや G P V Iの切断に伴う不活化を予防できる。本発明者らは、この方法により、マウス ES細胞由来血小板に関し不活性化の予防が可能であることを確認している。なお、ヒト血小板を使用したこの血小板不活性化に関する機序の参考論文として、 B e r gm e i e r . W e t a I . , C i r R e s 95 : 677— 683, 2004及び G a r d i n e r , E E e t a I . , J T h r om b o s i s a n d H a e m o s t a s i s, 5 : 1 530- 1 537, 2007を参照のこと。

実施例 [0017] 以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。

[0018] 本実施例は、ヒト ES細胞から巨核球及び血小板を分化誘導するものである（図 1及び図 2参照）。

1. ネット様構造物の調製

1 - 1. 細胞株

本実施例で用いた K h E S細胞株（Kh ES_ 1 ； P a s s a g e 30- 50, Kh ES-2 ； p a s s a g e 20-40, Kh ES-3 ； p a s s a g e 20-40) は、文部科学省の特定胚及びヒト E S細胞等研究専門委員会での審議及び承諾を経て、京都大学再医科学研究所所長中辻憲夫先生より供与された。また、フィーダ一細胞は、マウス胎児由来細胞、 C3 H 1 0 T 1 /2細胞株をつくば理研 B i o Re s o u r c e c e n t e rより供与を受けて使用し、又は OP 9細胞株を大阪大学医学部、仲野徹教授から供与を受けて使用した。分化実験を行う前日に、 0. 1 % ゼラチンコ一ト化ディッシュに 1 0 T 1 / 2細胞を 6 X 1 0⁵/ 1 0 c m ディッシュの密度となるように播き、分化実験の当日に、 1 0 T 1 /2細胞の増殖を止めるため 50 G yの放射線照射を行い、フィーダ一細胞として用いた。また、 O P 9細胞株をフィーダ一細胞として使用する場合には、分化実験の前日に 5

0 G yの放射線照射を行い、播き直しを行った後に使用した。

[0019] 1 -2. ネット様構造物の調製方法

ヒト ES細胞、 Kh ES細胞は、 0. 05% トリプシン一 EDTA (S

1 gma社）を用いて解離し、 P— 1 000ピペットを用いて小さいコロニ —に砕き、 1 0 T 1 /2細胞上に播いた。ネット様構造物を調製するための培地の組成を表 1に示す。ほ 1]

I MDM (S i gma社） 8 5%

F B S 1 5%

L一グノレタミン ( I n v i t r o g e n社) 2mM

I T S サプリメント（S i gma社）

インスリン 1 0 μ g/m 1 トランスフエリン 5. 5 m g /m 1 亜セレン酸ナトリウム 5 n g / m 1 ァスコルビン酸（S i gma社） 50 μ g /m 1

MTG (S i gm a社） 0. 4 5mM リコンビナントヒト VEGF (R&D s y s t etn s ) 20 n g/m 1 リコンビナントヒト I GF— I I (P e p r o t e c h) 200 n g/m 1 ヒト E S細胞を播いた日から 3、 7、 1 0、 1 3日目に、細胞の播種は行わず、培養液の交換のみを行った。 7、 1 0、 1 4日目に培地中に浮遊している細胞を用いて、巨核球/血小板の誘導を試みたが、いずれの時期においても巨核球がごく少数誘導されたのみで、血小板を確認することができなかつた。

1 - 3. ネット様構造物の確認

未分化 E S細胞に V E G Fを添加したところ、培養 1 4— 1 5日前後に内部に血球様細胞を含んだネット様構造物が多数確認された（図 3及び図 4) 。また、 I G F_ I Iによるネット様構造物産生に対する更なる増強作用は認められず、ヒト E S細胞からの造血促進効果が報告された BM P— 4の添加では V E G Fの効果が阻害された（図 5) 。このネット様構造を回収し、メタノール又はパラホルムアルデヒド固定を行った後、ホールマウントで抗ヒト F I k - 1 (V E G F— R) 抗体により蛍光染色したところ、ネット内部は F I k _ 1陽性の細胞からなる隔壁により、濾胞状構造をとっている事が分かった（図 6) 。さらに、このネット様構造を、抗ヒト F I k - 1 (V E G F- R) 抗体、抗 C D 3 1抗体、抗 U EA— I レクチン抗体で蛍光染色したところ、ネット構造内部の血球は、血管内皮細胞、造血幹細胞、前駆細胞、分化血液細胞に発現する CD 3 1に対する抗体でも染色されることが明らかとなつた（図 7) 。 K h ES_ 1細胞株、 K h ES_2細胞株、 K h E S-3細胞株のいずれからもネット様構造物を確認できた。

[0021] 1 -4. ネット内の血球の特徴

このネット様構造物内部の血液前駆細胞の表面には、抗ヒト F I k_ 1 ( V EG F-R) 抗体、抗ヒト C D 3 1抗体、抗ヒト C D 34抗体、抗ヒト C D 4，キ几体、ナ九ヒト v a s c u l a r e n d o t h e l ι a I c a d h e r i n (V E- c a d h e r i n) 抗体、抗ヒト CXCR4 ( s t r o ma -d e r i v e d f a c t o r - 1 受容体）抗体で染色される未熟な血液細胞に特徴的な細胞表面抗原が発現されていた（図 8) 。なお、これらのマーカ一は、大量培養系で、時間短縮のためフローサイトメ _タ_または磁気細胞分離法を用いて細胞単離，選別する際にマーカーとして利用することができる。

また、ネット内の血球は 1 X 1 0⁴個あたり、すべての骨髄細胞系分化血液細胞（リンパ球以外）を含む（図 9) 、 1 00_200前後のコロニーを形成することが分かった（図 1 0) 。

[0022] 2. 巨核球/血小板の誘導

2- 1. 巨核球の誘導

P- 1 000 ピぺットを用いて、位相差顕微鏡下でネット様構造物をピックアップし、 10 I m セルストレイナ一を用いて、血球細胞とネット様構造物を分離した。新たに、 6ゥエルプレートに用意した放射線照射済みの 1 0 T 1 /2細胞（6 X 1 0⁵/6ゥヱルプレート 1枚）上に血球細胞を 2〜 3 X 1 0⁴/ゥエルで播いた。巨核球/血小板を誘導するための培地の組成を表 2に示す。ほ 2]

I MDM (S i gma社） 8 5%

F B S 1 5%

L―グノレタミン ( I n v i t r o g e n社) 2mM

I T S サプリメント（S i gma社）

インスリン 1 0 μ g/m 1 トランスフェリン 5. 5 m g/m 1 亜セレン酸ナトリウム 5 n g/m 1 ァスコルビン酸 (S i gma社） 50 μ g/m 1

MTG (S i gma社） 0. 4 5 mM

リコンビナントヒト TPO (キリンビール） 1 00 n g/m 1 また、表 2に示す組成に、 S C F 5 0 n g/ 1 H e p a r i

5 U/m I を加えると、産生する血小板の量は 2倍に増量した。

表 2に組成を示す培養液に変更し、さらに 7 _ 8日間（培養液を 1 7日、 1 9日目に交換）（累積培養期間 2 1 — 2 2日間）培養すると、 F A C Sで巨核球/血小板特異的マーカ一である C D 4 1 a (インテグリンひ I I b鎖、 G P I I b分子）、 C D 4 2 a (G P I X分子）、陽性細胞が 5 0 - 6 0 %前後得られた（図 1 1 ) 。さらに、累積培養期間を 2 2— 2 4日間で実験を行うと、巨核球/血小板特異的マーカ一である C D 4 1 a (インテグリン a I I b鎖、 G P I l b分子）、 C D 4 2 a (G P I X分子）、及び C D 4 2 b (G P I b a) 陽性細胞が 5 0— 6 0%前後得られた（図 1 2 ) 。 C D 4 2 a (G P I X分子）、及び C D 4 2 b (G P I bひ）はともに成熟巨核球特異的発現分子である（図 1 2 ) 。形態学的にも多核、大型の細胞で巨核球の形態と一致した（図 1 3 ) 。免疫染色により、 C D 4 1 a陽性細胞が血小板放出に関わるとされる血小板前駆体（P r o p l a t e l e t ) の形態をとっていることが確認された（図 1 4) 。また、ネット内部の血球由来の R N Aに対する R T— P C Rの結果（メッセンジャー R N Aの半定量）から、より未分化な C D 3 4 +/C D 4 1 a—と分化の進んだ C D 4 1 a +分画の存在が確認され、 C D 4 1 a陽性分画には、正常な巨核球分化細胞と同様の遺伝子発現をしていることが明らかとなった。以上より、ネット内部の血球が巨核球を効率よく産生する造血前駆細胞である事が証明された。

[0024] 2 - 2. 血小板の確認

培養 2 2日目の培養上清を回収し、血球細胞を分離して血小板を濃縮した。血小板のコントロールとしてヒト末梢血中の血小板を回収し、血小板分画のゲートを確定した（図 1 5左列）。培養上清の血小板を C D 4 1 a P E抗体で染色し、同じ分画でゲートをかけて解析したところ、 C D 4 1 a陽性パ一ティクルが確認された（図 1 5右列）。時系列を追って培養上清を回収し . B e a d sを用いて血小板数をカウントしたところ、培養 7日 _ 9日目をピークに血小板が産生され、 9日目以降は徐々に減少した。本実施例では、 1 _ 2 X 1 0⁵の K h E S細胞から 3 _ 1 2 X 1 0⁴の C D 4 1 a陽性パ一ティクルが産生されていた。

同様に、培養 24日目の培養上清から回収した血小板にも、血小板マーカ —である C D 4 1 a陽性のパーティクルが確認され（図 1 6 A) 、この C D 4 1 a陽性パーティクル中には、血栓形成に重要な機能を果たす G P I b a /\1 / I X複合体の G P I b aと G P I Xの発現が 7 0 - 80%の効率で認められた。本パーティクルを電子顕微鏡で観察したところ、末梢血血小板同様、血小板顆粒及び微小管構造等が確認された（図 1 6 B) 。

培養 24日目には、 S C F (S t e m c e l l f a c t o r ) 50 n g/m l、 T P O 1 00 n g / rc\ I H e p a r i n 2 5 U/m I 0) 条件で、 1 x 1 0⁵個のヒト E S細胞から、 5 X 1 0⁶個の血小板が確認された。

[0025] 2 - 3. 血小板機能解析 1 ；フイブリノ一ゲン結合アツセィ

生体内血小板は、活性化に伴い細胞接着分子 G P I I b I I I a (インテグリンひ I I b ^ 3)の持続的なフイブリノ一ゲンとの結合により、血小板凝集を起こし血栓形成に寄与する。培養 2 1 _ 2 3日目の上清中の血小板を回収し、 A l e x a F I u o r 48 8—標識化フィブリノ一ゲンを血小板活性化剤トロンビン存在下で反応させたところ、トロンビン刺激では強い凝集により、 FS C、 S S Cの異なった分画に凝集した CD 4 1陽性パ一テイクルが出現した（図 1 7 A) 。また強い凝集の起きていない分画でのフィプリノ一ゲン一A I e xaの結合を見ると、トロンビンの量依存的に、フイブリノ —ゲンの CD 4 1パーティクルへの結合が認められた（図 1 7 B) 。

以上のことから、血小板機能の 1つである薬物刺激に対する G P I I b I I I a (インテグリンひ I I b S 3)の活性化とその後のフイブリノ一ゲンとの結合反応が確認された。

さらに、培養 23— 24日目の上清中の血小板を回収し、 F I T C標識した活性型インテグリンひ I I b ;S 3結合抗体（商品名； PAC— 1 ) (BD I n V i t r o g e n社）で、インテグリン活性化（止血血栓に必須な血小板機能の一つ）を確認したところ、血小板活性化生体内薬物 A D Pの低濃度から高濃度（0. 5— 500 ;UM) まで濃度依存性に、インテグリンの活性化が確認された（ヒト血小板と同程度の反応性を示した）（図 1 8 A) 。また、 F I T C標識した活性型ィンテグリンひ I I b β 3結合抗体（ P A C - 1 ) は、トロンビンの量依存的に CD 4 1陽性パーティクルに結合し、この結合は、ヒト特異的抗 CD 4 1 a/CD 62薬である、チロフィバン（ t i r o f i b a n ) によって完全に阻害された（図 1 8 B) 。

[0026] 2-4. 血小板機能解析 2 ；固相下フイブリノ一ゲン上でのスプレツディング

これらの血小板は、フイブリノ一ゲンを固相化したスライドグラス上で P MA刺激（図 1 9) 、 AD P刺激及びトロンビン刺激（図 20) により、細胞骨格変化の一つであるァクチンストレスファイバ一を形成して広がった。血小板活性化後に起きるァクチンストレスファイバ一は成体内での安定的持続的な血栓形成において必須である。

以上のように、末梢血由来血小板同様に、ヒト ES細胞由来血小板もインテグリンを介するァクチン再重合を伴う骨格変化を誘導した。

産業上の利用可能性

[0027] 本発明のネット様構造物は、生体外において血球細胞を効率的に増幅することができるため、医療等の分野において極めて有益な効果をもたらす。特に、生体外において調製することができない血小板などを安定に供給するための手段としての利用価値が高い。

Claims

請求の範囲

[1] ES細胞をフィーダ一細胞上に播き、造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物。

[2] 前記造血前駆細胞の分化誘導に適した条件が、 VEG F存在下、 1 4日間〜1 6日間培養することである請求項 1に記載のネット様構造物。

[3] 前記 ES細胞がヒト由来であることを特徴とする請求項 1又は 2に記載のネット様構造物。

[4] 前記フィーダ一細胞が 1 0 T 1 /2細胞、又は OP 9細胞であることを特徵とする請求項 1乃至 3のいずれかに記載のネット様構造物。

[5] 請求項 1乃至 4のいずれかに記載のネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダ一細胞上に播き、血球細胞の分化誘導に適した条件で培養し、血球細胞を産生する方法。

[6] 前記血球細胞が巨核球及び血小板であることを特徴とする請求項 5に記載の方法。

[7] 前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、 T PO存在下、 7日間〜 9日間培養することである請求項 6に記載の方法。

[8] 前記血球細胞の分化誘導に適した条件が、 T PO、 SC F及び H e p a r i n存在下、 7〜9日間培養することである請求項 6に記載の方法。

[9] 請求項 6乃至 8のいずれかに記載の方法により産生された巨核球及び血小板。

[10] 請求項 6乃至 8のいずれかに記載の方法により産生された血小板を有効成分とする血液製剤。