CN101541951A - 内含来自es细胞的造血前体细胞的结构物及使用该结构物的血细胞的制备方法 - Google Patents

内含来自es细胞的造血前体细胞的结构物及使用该结构物的血细胞的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101541951A
CN101541951A CNA2007800386946A CN200780038694A CN101541951A CN 101541951 A CN101541951 A CN 101541951A CN A2007800386946 A CNA2007800386946 A CN A2007800386946A CN 200780038694 A CN200780038694 A CN 200780038694A CN 101541951 A CN101541951 A CN 101541951A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
thrombocyte
reticulated structure
hemocyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007800386946A
Other languages
English (en)
Inventor
中内启光
江藤浩之
高山直也
锦井秀和
津久井弘子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Publication of CN101541951A publication Critical patent/CN101541951A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的在于提供内含造血前体细胞的网状结构物和该网状结构物的制备方法，以及由该网状结构物有效地制备成熟巨核细胞、血小板等血细胞的方法。本发明提供一种将ES细胞播种于饲养层细胞上，在适于造血前体细胞分化诱导的条件下培养而得到的、内含造血前体细胞的网状结构物。此外，提供将该网状结构物中内含的造血前体细胞在适于血细胞分化诱导的条件下进一步培养，从而产生各种血细胞的方法。

Description

内含来自ES细胞的造血前体细胞的结构物及使用该结构物的血细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及内含由ES细胞制备的造血前体细胞的网状结构物(Endothelial Sac；embryonic stem-sac；ES-sac)。进而，本发明涉及使用该网状结构物的血细胞的制备方法。
背景技术
对于以白血病为代表的血液相关疾病的治疗，使必要量的血细胞稳定地扩增、供给，对于治疗是非常重要的，因此迄今为止由许多研究者尝试了造血干细胞或造血前体细胞的有效扩增的研究。在血细胞中，巨核细胞是使血小板前体细胞(proplatelet)进一步产生血小板的细胞，在治疗的应用中占有重要的位置。在血细胞中，血小板是血液凝固(止血)所必需的细胞，因此在白血病、骨髓移殖、抗癌治疗等中血小板的需求极高。迄今为止，一直采用由捐献者献血而获取的方法来供给血小板。然而，利用捐献者的方法由于长期的捐献者不足、无法冷冻所获取的血小板等，而难以实现稳定的血小板供给。另一方面，尝试了给予TPO的方法、由脐带血或骨髓细胞分化为巨核细胞的方法等，但是TPO的给予由于在给予后产生对TPO的抗体而使其无效，因而无法实用化。进而，采用由脐带血或骨髓细胞分化巨核细胞的方法也只能够得到极少数成为巨核细胞来源的造血干细胞，因此仍不是适于提供稳定的血小板的方法。
近年来，盛行在活体外使由活体只能少量得到的造血干细胞或造血前体细胞扩增的研究。例如，报道有由小鼠ES细胞建立能够自我复制、还能够分化成淋巴细胞的造血干细胞株的方法(专利文献1)；在活体外将灵长类动物的ES细胞分化诱导后，将得到的细胞移殖到羊子宫内的胚胎，由出生的羊胎儿获取灵长类的ES细胞的方法(专利文献2)；或者使维持造血干细胞未分化性的CD34阳性/CD38阴性细胞在活体外简便且稳定地扩增的方法(专利文献3)等。
为了稳定地供给血小板，使造血干细胞或造血前体细胞有效地分化成巨核细胞和血小板的方法是必需的。因此，盛行由源于各种动物的ES细胞诱导出巨核细胞、进而诱导出血小板的研究。Eto等人明确了通过将小鼠ES细胞与OP9基质细胞一起共培养从而分化诱导成巨核细胞(非专利文献1)；Fujimoto等人报道了采用与Eto等人同样的方法成功诱导出血小板(非专利文献2)。此外，还有由猴子的ES细胞成功分化诱导出巨核细胞的报道(非专利文献3)；有由人的ES细胞成功分化诱导出巨核细胞的报道(非专利文献4)。但是，无论哪种方法都没有确认血小板的释放。此外，为了稳定地获取除血小板、巨核细胞以外的血细胞在治疗上所必需的量，必须有效获取造血干细胞或造血前体细胞，但是该方法尚未能说确立。
专利文献1：特开2006-141356号公报
专利文献2：特开2004-380601号公报
专利文献3：特开2006-61106号公报
非专利文献1：Eto等，Proc.Acad.Sci.USA 2002；99：12819-12824.
非专利文献2：Fujimoto等，Blood 2003；102：4044-4051.
非专利文献3：Hiroyama等，Exp.Hematol.2006；34：760-769.
非专利文献4：Gaur等，J Thromb Haemost.2005；4：436-442.
发明内容
本发明人等鉴于上述情况对造血前体细胞的有效获取方法以及巨核细胞和血小板的获取方法进行了悉心研究，结果成功制备了造血前体细胞被浓缩而存在的网状结构物，进而，首次由人ES细胞成功制备了血小板，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及内含造血前体细胞的网状结构物以及该网状结构物的制备方法。
进而，本发明涉及由该网状结构物有效地制备成熟巨核细胞、血小板等血细胞的方法。
在以往技术中，难以较高浓度地得到造血前体细胞，其结果是，血细胞的得到量也少。特别是难以由ES细胞诱导出血小板在治疗上可利用的量，对于人而言，连诱导都无法进行。发明人为了解决这些问题，着眼于在分化诱导ES细胞过程中得到的网状结构物，由该网状结构物进行了血细胞的诱导。
即，本发明涉及以下的(1)～(10)。
(1)本发明的第1方式是“一种内含造血前体细胞的网状结构物，其特征在于，是将ES细胞播种于饲养层细胞(feeder cell)上，在适于造血前体细胞分化诱导的条件下培养而得到的”。
(2)本发明的第2方式是“如上述(1)所述的网状结构物，其特征在于，所述适于造血前体细胞分化诱导的条件是在VEGF存在下培养14天～16天”。
(3)本发明的第3方式是“如上述(1)或(2)所述的网状结构物，其特征在于，所述ES细胞源于人”。
(4)本发明的第4方式是“如上述(1)～(3)中任一项所述的网状结构物，其特征在于，所述饲养层细胞是10T1/2细胞或OP9细胞”。
(5)本发明的第5方式是“一种产生血细胞的方法，其特征在于，将造血前体细胞与形成上述(1)～(4)中任一项所述网状结构物的隔壁的细胞分离，将得到的造血前体细胞播种于饲养层细胞上，在适于血细胞分化诱导的条件下培养，从而产生血细胞”。
(6)本发明的第6方式是“如上述(5)所述的方法，其特征在于，所述血细胞是巨核细胞和血小板”。
(7)本发明的第7方式是“如上述(6)所述的方法，其特征在于，所述适于血细胞分化诱导的条件是在TPO存在下培养7天～9天”。
(8)本发明的第8方式是“如上述(6)所述的方法，其特征在于，所述适于血细胞分化诱导的条件是在TPO、SCF和肝素存在下培养7～9天”。
(9)本发明的第9方式是“采用上述(6)～(8)中任一项所述的方法产生的巨核细胞和血小板”。
(10)本发明的第10方式是“一种血液制剂，其特征在于，以采用上述(6)～(8)中任一项所述的方法产生的血小板为有效成分”。
本发明的网状结构物中，由于造血前体细胞较高浓度地被浓缩而存在，因此能够有效地分化诱导成各种血细胞(例如，包括嗜中性细胞、巨噬细胞、红细胞、巨核细胞)。
此外，采用本发明的产生血细胞的方法时，能够在活体外有效地获取所需血细胞。特别是对于人的血小板，能够较大量且有效地进行以往无法实现的活体外的血小板的生产。
进而，采用本发明的产生血小板的方法时，可以实现以血小板为有效成分的血液制剂的稳定供给。
附图说明
图1：是表示网状结构物的获取方法的示意图。
图2：是表示网状结构物的获取方法、以及由网状结构物制备巨核细胞/血小板的方法的顺序的示意图。
图3：表示由未分化ES细胞产生网状结构物的过程的图，以及网状结构物的利用相位差显微镜得到的观察图像。
图4：是网状结构物的利用相位差显微镜得到的观察图像。D4和D7表示培养第4天、第7天。此外，Endothelial Sac(embryonic stem-sac；ES-sac)是指网状结构物。
图5：表示利用VEGF的网状结构物的诱导效果。No cytokine：没有添加VEGF、IGF-II、BMP-4等细胞因子的对照组。
图6：用抗人Flk-1(VEGF-R)抗体将网状结构物(培养第14天)进行荧光免疫染色的结果。
图7：表示将网状结构(培养第14天)用抗人Flk-1(VEGF-R)抗体、抗CD31抗体、抗UEA-I凝集素(Lectin)抗体进行荧光染色的结果。HE：苏木精-伊红染色。网状结构表达内皮细胞的标记物，其内部由以凝集素阳性细胞的隔壁所致的多个小胞构成。此外，小胞内存在血球样的细胞。
图8：表示网状结构物内部的血液前体细胞的表面抗原(培养第14天)。是使用抗人Flk-1(VEGF-R)抗体、抗人CD31抗体、抗人CD34抗体、抗人CD41抗体、抗人血管内皮钙粘附蛋白(VE-cadherin)抗体、抗人CXCR4(基质细胞衍生因子-1受体)抗体来研究网状结构物内部的血液前体细胞的表面抗原的结果。
图9：表示使用网状结构物内部的血液前体细胞，制作血液细胞分化用集落(colony)并培养后第7天的多种集落图像。集落图像是采集集落后将细胞成分进行瑞氏吉姆萨(wright-giemsa)染色的结果。观察向包括混合集落的多种血液细胞的分化。
图10：表示将由网状结构物内部的每1×104个血液前体细胞产生的各种血液细胞集落数进行定量化的结果。
图11：表示由KhES细胞(KhES-3细胞)诱导的巨核细胞利用FACS的解析结果。
图12：表示由KhES细胞(KhES-3细胞)诱导的培养第24天的巨核细胞利用流式细胞仪的解析结果。
图13：是将由KhES-3细胞诱导的培养第24天的巨核细胞进行细胞离心后，进行瑞氏吉姆萨(wright-giemsa)染色的观察图像。倍率×40。
图14：表示由KhES-3细胞诱导的巨核细胞和血小板前体的显微镜观察图像。i、ii：由KhES-3细胞诱导的巨核细胞的血小板前体形态的相位差显微镜观察图像，iii、iv、v：使用抗人CD41a(GPIIb，整联蛋白αIIb(integrin αIIb))抗体进行染色的血小板前体的荧光显微镜观察图像。
图15：表示将由KhES-3细胞诱导的血小板用FACS解析的结果。A：作为对照由人末梢血回收的血小板的解析结果；B：源于KhES细胞的血小板的解析结果。
图16：表示将由KhES-3细胞诱导的血小板用FACS流式细胞仪解析的结果。A-a：作为对照由人末梢血回收的血小板的解析结果；BA-b：源于KhES细胞的血小板的解析结果。CD42a(GPIX)、CD42b(GPIbα)都是成熟巨核细胞以及血小板的特异性表达分子。B：利用电子显微镜得到的人末梢血血小板以及源于KhES细胞的血小板的照片。
图17：表示源于KhES-3细胞的血小板的纤维蛋白原结合测定的结果。A是回收培养第24天的上清液，将除去细胞成分并浓缩得到的血小板用血小板活化剂(凝血酶)刺激，将FITC标识的纤维蛋白原结合度用流式细胞仪进行解析的结果。B表示Alexa Fluor 488标识纤维蛋白原以凝血酶量依存性地与CD41阳性颗粒结合的结果。无激动剂(noagonist)：没有Alexa Fluor 488标识纤维蛋白原的结果。
图18：表示源于KhES-3细胞的血小板的纤维蛋白原结合测定的结果。A：是回收培养第24天的上清液，将除去细胞成分并浓缩得到的血小板用血小板活化剂(ADP)刺激，将FITC标识的PAC-1抗体纤维蛋白原结合度用流式细胞仪进行解析的结果。PAC-1(BD Invitrogen公司)是仅与活化的血小板膜上的人CD41a/CD62(GPIIbIIIa，整联蛋白αIIbβ3)结合的抗体。B：表示FITC标识的PAC-1以抗体ADP量依存性地与CD41阳性颗粒结合的结果。no agonist：无ADP的结果。
图19：表示采用荧光显微镜观察源于KhES-3细胞的血小板与源于末梢血的血小板同样、通过PMA刺激而显示细胞骨架变化的样子的结果。B和E表示利用抗F-肌动蛋白抗体的染色图像，C和F表示利用抗CD41a抗体的染色图像。A和D分别是将B与C、E与F重叠而成的观察图像。
图20：表示采用荧光显微镜观察源于KhES-3细胞的血小板与源于末梢血的血小板同样、通过ADP和凝血酶(thrombin)刺激而显示细胞骨架变化的样子的结果。为了比较，在上部显示人末梢血小板的图像。表示利用抗F-肌动蛋白抗体和CD41a抗体的染色图像。
具体实施方式
本发明的实施方式之一是将ES细胞播种于饲养层细胞上、在适于造血系细胞分化诱导的条件下培养而得到的、内含造血前体细胞的网状结构物。由于该网状结构物中造血前体细胞被浓缩而存在，因此能够在活体外有效地分化诱导各种血细胞。此处所谓“ES细胞”，是胚胎性干细胞，是具有多分化功能和自我复制功能的未分化细胞。作为“ES细胞”的来源，可以是任何动物，但是最优选源于人的细胞。此外，作为源于人的ES细胞，可以很好地使用例如KhES细胞株等。此外，作为“饲养层细胞”，只要是有助于ES细胞分化诱导的细胞就可以使用，可以使用例如小鼠胚胎纤维芽细胞、优选10T1/2细胞株、OP9细胞等。使用“饲养层细胞”时，可以预先照射放射线等来抑制细胞的增殖。
作为ES细胞的培养条件，可以选择适用于制备网状结构物的条件。该培养条件根据使用的ES细胞的不同而不同，例如使用作为人ES细胞的KhES细胞株时，作为培养基，使用添加了FBS并使最终浓度为15％的IMDM，此外还可以使用添加有其他适当补充物等而成的培养基。进而，使用KhES细胞株时，为了有效地形成网状结构物，可以添加VEGF和IGF-II各0～100ng/ml、0～300ng/ml左右，更优选添加各20ng/ml、200ng/ml左右。或者，也可以不添加IGF-11。此外，作为培养的环境，根据使用的ES细胞的不同而不同，但是为KhES细胞株时，例如可以采用5％CO2、36～38℃、优选37℃的条件。直至形成网状结构物的培养期间根据ES细胞的不同而不同，但是为KhES细胞株时，播种到饲养层细胞上后，大约14～16天后可以确认其存在。
形成的网状结构物形成滤胞状结构，由作为中胚叶细胞的标记之一的Flk1(fetal liver kinase 1)、CD31、CD34或UEA-I凝集素(Ulexeuropaeus.agglutinin-1)阳性细胞构成隔壁。在该网状结构物的内部，造血前体细胞以浓缩的状态存在。将存在于网状结构物内部的造血前体细胞用于各种血细胞的分化诱导时，必须从构成隔壁的细胞等中进行分离。该分离优选采用物理方法进行。例如，通过流通过灭菌后的筛状器具(例如细胞滤器等)，可以将隔壁细胞和造血前体细胞分离。
本发明进一步的实施方式是由从网状结构物分离得到的造血前体细胞产生各种血细胞的方法。将所得的造血前体细胞播种到饲养层细胞上，在适于所需血细胞分化诱导的条件下进行培养。此处所谓“适于血细胞分化诱导的条件”，根据目标血细胞的种类，可以列举例如添加TPO、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3配体、肝素等的条件。分化诱导巨核细胞和血小板时，例如可以在TPO的存在下，或者在SCF、肝素和TPO的存在下，培养7～9天左右。作为培养环境，只要是适于在活体外进行血细胞的分化诱导的环境即可，例如，在5％CO2、36～38℃、优选37℃的条件下进行培养。
根据本发明生产的血细胞，由于在活体外生产，因此与在活体内获取天然存在的血细胞相比，能够简便且大量地获取，在这一点上本发明的方法是优异的方法。特别是对于人血小板，迄今没有在活体外生产能够确认程度的量的报道，作为在活体外生产的人血小板，本发明是首次。
血小板由于对预防或改善白血病、骨髓移殖、抗癌剂治疗时的血小板减少有效，因此也可以将由本发明得到的血小板以制剂方式稳定地供给。制备血液制剂时，考虑到血小板对保存是不稳定的因素等，还可以含有有助于使血小板稳定化的其他成分。使血小板稳定化的条件可以选择在该技术领域的专家所周知的方法。更具体地说，所获取的血小板(源于人ES细胞的洗净后的血小板)例如可以采用以下的方法进行制剂化。
ACD-A溶液：以1∶10的比例配制FFP(fresh frozen plasma；由通过献血得到的全血液制成，含有白蛋白、凝固因子等血液成分以外的所有物质)，照射15-50Gy的放射线后在20-24℃振荡着保存。ACD-A溶液：用注射用水将柠檬酸钠22g/柠檬酸8g/葡萄糖22g整体调整到1L。
使用以上的方法时，作为血小板的浓度，优选例如1×109血小板/mL左右。
此外，预先添加GM6001(a broad-range hydroxamic acid-basedmetalloprotease inhibitor)(Calbiochem公司，La Jolla，CA，USA)时，能够预防伴随着冷冻保存和室温保存中发生的血小板功能分子GPIb-V-IX、GPVI切断的不活化。本发明人等采用该方法确认能够预防与小鼠ES细胞来源血小板相关的不活化。另外，作为使用人血小板的与该血小板不活化相关的机理的参考论文，请参照Bergmeier，W etal.，Cir Res 95：677-683，2004和Gardiner，EE et al.，J Thrombosis andHaemostasis，5：1530-1537，2007。
实施例
以下给出实施例进一步详细说明，但本发明并不受实施例的任何限定。
本实施例由人ES细胞分化诱导巨核细胞和血小板(参照图1和图2)。
1.网状结构物的制备
1-1.细胞株
本实施例中使用的KhES细胞株(KhES-1：Passage 30-50，KhES-2：passage 20-40，KhES-3：Passage 20-40)是经过文部科学省的特定胚胎和人ES细胞等研究专门委员会的审议和同意，由京都大学再生医学研究所  所长  中辻宪夫先生提供的。此外，饲养层细胞使用由筑波理研BioResource center提供的小鼠胎儿来源细胞、C3H10T1/2细胞株，或者使用由大阪大学医学部的仲野彻教授提供的OP9细胞株。在进行分化实验的前一天，在铺有0.1％明胶的培养皿上播种10T1/2细胞使得在培养皿中的密度成为6×105/10cm，在分化实验的当天，为了终止10T1/2细胞的增殖，进行50Gy的放射线照射，然后作为饲养层细胞使用。此外，使用OP9细胞株作为饲养层细胞时，在分化实验的前一天进行50Gy的放射线照射，重新播种后使用。
1-2.网状结构物的制备方法
人ES细胞、KhES细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Sigma公司)解离，然后用P-1000移液管捣碎成小的集落，播种于10T1/2细胞上。将用于制备网状结构物的培养基组成示于表1。
[表1]
Figure A20078003869400121
在播种人ES细胞之日起第3、7、10、13天，不进行细胞的播种，仅进行培养液的更换。在第7、10、14天使用在培养基中浮游的细胞，尝试巨核细胞/血小板的诱导，但在任何时期都只诱导出极少的巨核细胞，无法确认血小板。
1-3.网状结构物的确认
在未分化ES细胞中添加VEGF后，培养大约14-15天确认大量在内部含有血球样细胞的网状结构物(图3和图4)。此外，没有看到IGF-II所致的对产生网状结构物的进一步增强作用，报道有由人ES细胞的促进造血效果的BMP-4的添加，抑制了VEGF的效果(图5)。回收该网状结构，进行甲醇或低聚甲醛固定后，对整个载片用抗人Flk-1(VEGF-R)抗体进行荧光染色，结果明确网内部通过由Flk-1阳性细胞形成的隔壁而形成滤胞状结构(图6)。进而，对该网状结构用抗人Flk-1(VEGF-R)抗体、抗CD31抗体、抗UEA-I凝集素抗体进行荧光染色，结果明确网状结构内部的血细胞也被血管内皮细胞、造血干细胞、前体细胞、分化血液细胞中表达的CD31的抗体染色(图7)。在KhES-1细胞株、KhES-2细胞株、KhES-3细胞株的任一种中都可以确认网状结构物。
1-4.网内血细胞的特征
在该网状结构物内部的血液前体细胞的表面，表达有被抗人Flk-1(VEGF-R)抗体、抗人CD31抗体、抗人CD34抗体、抗人CD41抗体、抗人血管内皮钙粘附蛋白(VE-cadherin)抗体、抗人CXCR4(基质细胞衍生因子-1受体)抗体染色的未成熟血液细胞中的特征性细胞表面抗原(图8)。另外，这些标记可以在大量培养系中，为了缩短时间而采用流式细胞仪或磁性细胞分离法进行细胞单离、筛选时作为标记使用。
此外，还知道网内的血细胞每1×104个形成含有所有的骨髓细胞系分化血液细胞(淋巴细胞以外)的(图9)、大约100-200的集落(图10)。
2.巨核细胞/血小板的诱导
2-1.巨核细胞的诱导
使用P-1000移液管，在相位差显微镜下选出网状结构物，使用70μm细胞滤器，将血细胞和网状结构物分离。重新将血细胞以2～3×104/孔播种到在6孔板上准备的放射线照射后的10T1/2细胞(6×105/6孔板1片)上。将用于诱导巨核细胞/血小板的培养基组成示于表2。
[表2]
Figure A20078003869400131
此外，如果在表2所示的组成中加入50ng/ml的SCF、25U/ml的肝素，则产生的血小板量增加到2倍。
变更成表2所示组成的培养液，进而培养7-8天(在第17天、第19天更换培养液)(累计培养期间为21-22天)时，采用FACS解析，作为巨核细胞/血小板特异性标记的CD41a(整联蛋白αIIb链，GPIIb分子)、CD42a(GPIX分子)，得到了大约50-60％的阳性细胞(图11)。进而，以累计培养期间为22-24天进行实验，则得到大约50-60％的作为巨核细胞/血小板特异性标记的CD41a(整联蛋白αIIb链，GPIIb分子)、CD42a(GPIX分子)和CD42b(GPIbα)阳性细胞(图12)。CD42a(GPIX分子)和CD42b(GPIbα)都是成熟的巨核细胞特异性表达的分子(图12)。在形态学方面，多核、大型细胞与巨核细胞的形态一致(图13)。采用免疫染色，确认了CD41a阳性细胞是被认为与血小板释放相关的血小板前体(Proplatelet)的形态(图14)。此外，根据对网内部血细胞来源的RNA的RT-PCR结果(信使RNA的半定量)，更加确认未分化的CD34+/CD41a-与进行了分化的CD41a+部分的存在，明确了在CD41a阳性部分表达与正常的巨核细胞分化细胞相同的基因。
综上所述，证明网内部的血细胞是高效产生巨核细胞的造血前体细胞。
2-2.血小板的确认
回收培养第22天的培养上清液，分离血细胞并浓缩血小板。作为血小板的对照，回收人末梢血中的血小板并确定了血小板部分的门(gate)(图15左列)。用CD41aPE抗体将培养上清液的血小板染色，在同一部分用门进行解析，结果确认了CD41a阳性颗粒(图15右列)。按日期先后次序回收培养上清，用Beads计数血小板数，结果在培养第7天-第9天血小板产量达到顶峰，在第9天以后逐渐减少。在本实施例中，由1-2×105的KhES细胞产生3-12×104的CD41a阳性颗粒。
同样地，在由培养第24天的培养上清液回收的血小板中，也确认了作为血小板标记的CD41a阳性颗粒(图16A)，在该CD41a阳性颗粒中，以70-80％的效率确认对形成血栓发挥重要功能的GPIba/V/IX复合体的GPIba和GPIX表达。用电子显微镜观察本颗粒，结果确认了与末梢血血小板同样的血小板颗粒和微小管结构等(图16B)。
在培养第24天，在SCF(干细胞因子)50ng/ml、TPO 100ng/ml、肝素25U/ml的条件下，由1×105个的人ES细胞确认得到5×106个血小板。
2-3.血小板功能解析1：纤维蛋白原结合测定
活体内血小板随着活化通过细胞粘连分子GPIIbIIIa(整联蛋白αIIbβ3)与纤维蛋白原的持续结合，引起血小板凝集从而有助于形成血栓。回收培养第21-23天的上清液中的血小板，在血小板活化剂凝血酶的存在下使Alexa Fluor 488-标识化纤维蛋白原反应，结果在凝血酶刺激下由于强凝集而出现在FSC、SSC不同部分凝集的CD41阳性颗粒(图17A)。此外，在没有发生强凝集的部分看到纤维蛋白原-Alexa的结合时，看到纤维蛋白原以凝血酶量依存性地向CD41颗粒结合(图17B)。
根据上述，确认了作为血小板功能之一的GPIIbIIIa(整联蛋白αIIbβ3)对药物刺激的活化和其后的与纤维蛋白原的结合反应。
进而，回收培养第23-24天的上清液中的血小板，用FITC标识的活性型整联蛋白αIIbβ3结合抗体(商品名：PAC-1)(BD Invitrogen公司)确认了整联蛋白活化(对止血血栓必须的血小板功能之一)，结果从血小板活化活体内药物ADP低浓度到高浓度(0.5-500μM)都看到整联蛋白以浓度依存性地活化(显示出与人血小板同等程度的反应性)(图18A)。此外，FITC标识的活性型整联蛋白αIIbβ3结合抗体(PAC-1)以凝血酶量依存性地与CD41阳性颗粒结合，该结合被作为人特异性抗CD41a/CD62药剂的tirofiban完全抑制(图18B)。
2-4.血小板功能解析2：固相下纤维蛋白原上的散布
这些血小板在将纤维蛋白原固相化的载片上通过PMA刺激(图19)、ADP刺激和凝血酶刺激(图20)，形成作为细胞骨架变化之一的肌动蛋白应力纤维而扩散。血小板活化后产生的肌动蛋白应力纤维对于在生物体内形成稳定并持续的血栓是必需的。
综上所述，与源于末梢血的血小板同样，源于人ES细胞的血小板也诱导出伴有介由整联蛋白的肌动蛋白再聚合的骨架变化。
产业上的可利用性
本发明的网状结构物由于能够在活体外有效地扩增血细胞，因此在医疗等领域获得极其有益的效果。特别是作为用于稳定地供给在活体外无法制备的血小板等的方法的利用价值很高。

Claims (10)

1、一种内含造血前体细胞的网状结构物，其特征在于，是将ES细胞播种于饲养层细胞上，在适于造血前体细胞分化诱导的条件下培养而得到的。
2、如权利要求1所述的网状结构物，其特征在于，所述适于造血前体细胞分化诱导的条件是在VEGF存在下培养14天～16天。
3、如权利要求1或2所述的网状结构物，其特征在于，所述ES细胞源于人。
4、如权利要求1～3中任一项所述的网状结构物，其特征在于，所述饲养层细胞是10T1/2细胞或OP9细胞。
5、一种产生血细胞的方法，其特征在于，将造血前体细胞与形成权利要求1～4中任一项所述的网状结构物的隔壁的细胞分离，将得到的造血前体细胞播种于饲养层细胞上，在适于血细胞分化诱导的条件下培养，从而产生血细胞。
6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述血细胞是巨核细胞和血小板。
7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述适于血细胞分化诱导的条件是在TPO存在下培养7天～9天。
8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述适于血细胞分化诱导的条件是在TPO、SCF和肝素存在下培养7～9天。
9、采用权利要求6～8中任一项所述的方法产生的巨核细胞和血小板。
10、一种血液制剂，其特征在于，以采用权利要求6～8中任一项所述的方法产生的血小板为有效成分。
CNA2007800386946A 2006-10-04 2007-10-04 内含来自es细胞的造血前体细胞的结构物及使用该结构物的血细胞的制备方法 Pending CN101541951A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP272555/2006 2006-10-04
JP2006272555 2006-10-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101541951A true CN101541951A (zh) 2009-09-23

Family

ID=39268236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007800386946A Pending CN101541951A (zh) 2006-10-04 2007-10-04 内含来自es细胞的造血前体细胞的结构物及使用该结构物的血细胞的制备方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8058064B2 (zh)
JP (1) JP5283120B2 (zh)
CN (1) CN101541951A (zh)
GB (1) GB2455472B (zh)
WO (1) WO2008041370A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109172945A (zh) * 2018-10-22 2019-01-11 恰慕医疗科技（上海）有限公司 一种利用分层次皮下注射皮肤去皱和自体细胞再生的方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009119105A1 (ja) * 2008-03-28 2009-10-01 国立大学法人東京大学 ＧＰＩｂα＋ＧＰＶ＋ＧＰＶＩ＋血小板のインビトロ調製法
US8546141B2 (en) 2008-04-01 2013-10-01 The University Of Tokyo Method for preparation of platelet from iPS cell
WO2011034073A1 (ja) * 2009-09-15 2011-03-24 国立大学法人東京大学 分化細胞の新規製造法
CN102985531B (zh) 2010-09-10 2019-04-23 国立大学法人东京大学 涉及由多能干细胞向血细胞分化的培养方法
RU2578607C2 (ru) 2010-09-17 2016-03-27 Дзе Юниверсити Оф Токио Композиция для поддержания функции тромбоцитов
US9738906B2 (en) 2011-05-13 2017-08-22 The University Of Tokyo Method for producing polyploidized megakaryocyte and platelets
RU2014117642A (ru) * 2011-10-03 2015-11-10 Ниссан Кемикал Индастриз, Лтд. Способ получения мегакариоцитов и/или тромбоцитов из плюрипотентных стволовых клеток
US20160002599A1 (en) 2013-02-08 2016-01-07 Kyoto University Production methods for megakaryocytes and platelets
US20160168540A1 (en) 2013-06-07 2016-06-16 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Composition for maintaining platelet function
JP2017122049A (ja) * 2014-05-14 2017-07-13 国立大学法人 東京大学 インターロイキン１α（ＩＬ−１α）を含有する巨核球分化誘導及び血小板産生促進剤
EP4365283A1 (en) 2021-06-30 2024-05-08 National University Corporation Chiba University Method for improving proliferative properties of common myeloid progenitor cells (cmp) or myelocytic progenitor cells

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2412379B (en) 2001-12-07 2006-03-29 Geron Corp Hematopoietic cells from human embryonic stem cells
JP2004350601A (ja) 2003-05-29 2004-12-16 Tanabe Seiyaku Co Ltd 霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法
WO2005019441A1 (ja) 2003-08-25 2005-03-03 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. 霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法
JP2005287479A (ja) 2004-03-31 2005-10-20 Kazuhisa Maeda 組織幹細胞採取方法及びそれを利用した装置
CA2577068C (en) * 2004-08-12 2016-05-17 Adlyfe, Inc. Methods for preparing freeze-dried platelets, compositions comprising freeze-dried platelets, and methods of use
JP4706208B2 (ja) 2004-08-27 2011-06-22 株式会社アイル 造血幹細胞の製造方法
MX2007005200A (es) * 2004-11-01 2007-05-11 Wisconsin Alumni Res Found Plaquetas a partir de celulas germinales.
JP2006141356A (ja) 2004-11-24 2006-06-08 Institute Of Physical & Chemical Research Ｅｓ細胞から樹立された造血幹細胞

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109172945A (zh) * 2018-10-22 2019-01-11 恰慕医疗科技（上海）有限公司 一种利用分层次皮下注射皮肤去皱和自体细胞再生的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008041370A1 (fr) 2008-04-10
GB0906137D0 (en) 2009-05-20
GB2455472A (en) 2009-06-17
US20100197016A1 (en) 2010-08-05
JPWO2008041370A1 (ja) 2010-02-04
US8058064B2 (en) 2011-11-15
JP5283120B2 (ja) 2013-09-04
GB2455472B (en) 2011-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101541951A (zh) 内含来自es细胞的造血前体细胞的结构物及使用该结构物的血细胞的制备方法
CN101981181B (zh) 由iPS细胞制备血小板的方法
Sugimoto et al. Platelet production from induced pluripotent stem cells
CA2774193C (en) Novel method for producing differentiated cells
Strassel et al. On the way to in vitro platelet production
WO2005097979A2 (en) Methods and compositions for obtaining hematopoietic stem cells derived from embryonic stem cells and uses thereof
Melero‐Martin et al. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis
WO2009119105A1 (ja) ＧＰＩｂα＋ＧＰＶ＋ＧＰＶＩ＋血小板のインビトロ調製法
CN106119200A (zh) 涉及由多能干细胞向血细胞分化的培养方法
KR20050042046A (ko) 조혈 줄기세포의 증식방법
CN109370988A (zh) 干细胞体外扩增培养体系及其方法
CN110551688B (zh) 一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞且促进造血干/祖细胞体外扩增的组合物及其应用
CN106659560B (zh) 生殖腺来源的侧群干细胞
RU2360965C1 (ru) СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПАЦИЕНТА ex vivo
WO2022143675A1 (zh) 用于扩增并维持HSCs自我更新能力和分化潜能的培养基组合物及其应用
CA2219869A1 (en) Human cd-34 hematopoietic stem cells
AU2008277391A1 (en) Culture for expanding stem cells ex-vivo
WO2005085426A1 (ja) 無フィ−ダ−分化用培地及び霊長類動物胚性幹細胞からの無フィ−ダ−分化方法
Pendaries et al. Methods for genetic modification of megakaryocytes and platelets
DE602004010417T2 (de) Blutprodukte aus mesenchymalen stammzellen
WO2022082224A1 (en) Production of megakaryocytes and platelets in a co-culture system
Audet Quantitative analysis of hematopoietic stem cell response to cytokine stimulation in vitro
Brandt Self-renewal of human bone marrow-derived hematopoietic stem cells in vitro
Broxmeyer et al. Hematopoietic Stem and Progenitor Cells from Cord Blood
YIN-KUAN DIRECTED REPROGRAMMING OF FIBROBLASTS INTO HEMATOPOIETIC PROGENITORS BY NUCLEAR REGULATORS

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20090923