WO2008034587A1 - Bestimmung von wasserstoffperoxidkonzentrationen - Google Patents

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WO2008034587A1
WO2008034587A1 PCT/EP2007/008121 EP2007008121W WO2008034587A1 WO 2008034587 A1 WO2008034587 A1 WO 2008034587A1 EP 2007008121 W EP2007008121 W EP 2007008121W WO 2008034587 A1 WO2008034587 A1 WO 2008034587A1
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measuring
potential
hydrogen peroxide
concentration
electrodes
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PCT/EP2007/008121
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Inventor
Alexander Adlassnig
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Schultheiss, Klaus, Werner
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G01N27/3273—Devices therefor, e.g. test element readers, circuitry

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for determining hydrogen peroxide concentrations in liquids, in particular an improved determination of hydrogen peroxide concentrations in blood, sweat, urine or milk.
  • the determination of substances, especially in the presence of other, partly interfering substances, is important for many applications, especially in medical diagnostics.
  • the determination of glucose in the blood is of crucial importance for diabetes therapy.
  • the therapy is particularly promising if the blood sugar is controlled by the patient himself at regular intervals.
  • the patient pricks himself with a lancing device to get a drop of blood, which he applies to a disposable biosensor.
  • This is contained in a measuring device that carries out the measurement and the evaluation.
  • the display shows the blood glucose value after 10 to 30 seconds, which is used by the patient for ongoing control and / or precise insulin dosing.
  • optical methods reflection or absorption spectroscopy is used to detect the amount of chromophore formed in the reaction with glucose in the blood.
  • the intensity of the color change is proportional to the blood sugar content.
  • Electrochemical methods use amperometric or coulometric methods to determine the blood sugar content.
  • the possible use and, above all, the efficiency of electrochemical methods is limited by the large number of interfering substances (urea, amino acids, ascorbic acid, medicines, etc.) in the blood, since these can also be converted at the electrodes and thus deliver incorrectly elevated values.
  • the hematocrit is the proportion of red blood cells in the whole blood (in% by volume).
  • the normal hematocrit is between 40 and 45% by volume. In case of illness or in accidents with high blood loss, the Hk can be between about 22 and 65% by volume.
  • Electrochemical disposable sensors usually consist of a substrate on which contacts, lines and electrodes are formed from a conductive material.
  • the reaction zone and the contacts to the meter are defined by applying a non-conductive layer.
  • the reaction zone is formed by the electrodes.
  • two electrodes are found, one serving as a measuring electrode.
  • the other represents the reference and counterelectrode.
  • the actual detection reaction takes place at the measuring electrode.
  • an enzyme layer or membrane is applied on or in front of it.
  • the enzyme is used to specifically react with the glucose in the blood.
  • the measuring electrode now measures the concentration of one or more reaction products of the enzyme reaction. As long as the activity of the enzyme is higher than the substrate concentration, the concentration of the reaction products is directly proportional to the substrate concentration. The measuring electrode thus directly determines the glucose concentration in the blood.
  • the determination of glucose can be based on either (1) the consumption of oxygen (O r electrodes); (2) the hydrogen peroxide formed (H 2 O 2 - electrodes) or (3) the increase in the pH (pH electrodes) take place.
  • Glucose sensors based on pH changes have the disadvantage that their measurement behavior is determined by the buffer capacity of the sample.
  • the measured value over a more or less large area is directly proportional to the glucose concentration.
  • the measuring range is determined by the permeability of the membrane for glucose and oxygen. High permeability of the membrane provides high sensitivity, while low permeability reduces the sensitivity but extends the measurement range. At high glucose concentrations, the measuring range can be limited by insufficient enzyme activity. However, this circumstance can be contained by using excess enzyme. Care must be taken to ensure that self-inhibition occurs, especially in the case of glucoses oxidase at high enzyme levels.
  • the measuring range is limited by the transport speed of oxygen to the enzyme to a maximum of 200 mg / dl.
  • blood sugar levels between 200 and 500 mg / dl are the order of the day.
  • oxygen-independent glucose sensors have been developed.
  • mediators M Other molecules than oxygen take over the transport of the electrons from the redox center of the enzyme to the electrode surface. These molecules are called mediators M. The mechanism works according to the following scheme: Glucose + GOD 0x (( ⁇ -glucolactone + GOD red (II)
  • Such sensors are to some extent oxygen independent and work even in anaerobic environments.
  • mediators examples include benzo and naphthoquinones (EP 0 190 740), substituted flavins, phenazines, phenothiazines, indophenols, substituted 1,4-benzoquinones and indamines (EP 0 330 517), N-oxides, nitroso compounds, hydroxylamines and oxines (EP 0 354 441), soluble hexacyanoferrate / iron compounds (EP 0 496 730) or phenazinimium / phenoxazinium salts (US Pat. No. 3,791,988).
  • glucose sensors with mediators have disadvantages. So all mediators are poisonous.
  • the natural reaction of glucose oxidase with oxygen from the medium can not be prevented, since the affinity of the redox center to O 2 is about 100 times higher than eg to Fe (III) CN 6 . This is especially noticeable at low glucose concentration and leads to low readings because the H 2 O 2 formed by the reaction with oxygen is not detected.
  • In the production of such sensors must like It must be ensured that the mediator remains in the oxidized state until the measurement. Each partial reduction leads to an increased background current, since M red molecules are already present, which of course are also implemented. It is known (EP 0 741 186) that especially at high temperatures and high humidity mediators tend to reduce rapidly. This naturally reduces the durability and thus the possibility of using the sensors as disposable sensors.
  • the working electrodes and the counter electrodes are generally made of platinum, gold, carbon or the like.
  • the reference electrode is an Ag-AgCl electrode, a calomel electrode or the same material as the working electrode.
  • WO 81/03546 discloses a method for measuring the glucose concentration, in which a potential profile (lower limit: -1.0 to -0.6 V, upper limit: 0.7 to 1.1 V) with Holding times at certain points (especially where glucose is converted) and at reversal points. In certain areas, the charge is determined. Breakpoint and hold times are chosen so that the charge is proportional to the glucose concentration, independent of interfering substances, mainly urea and amino acids.
  • the areas in which integration takes place are characterized by the fact that glucose always only makes a positive contribution to the total charge, while the interfering substances provide both positive and negative contributions, which are thus averaged out during integration.
  • this method fails at high concentrations of interfering substances and at the same time low concentrations of glucose.
  • a method for determining glucose in the blood which works with H 2 O 2 electrodes without mediators, is relatively insensitive to hematocrit and temperature at which the H 2 O 2 - detection can be carried out in a lower potential range, desirable he becomes insensitive to Störspezies.
  • the sensors should be storable so that they can be used as disposable sensors.
  • An object of the present invention is therefore to improve the accuracy of the amperometric determination of hydrogen peroxide concentrations in a liquid sample, in particular in blood, sweat, urine or milk, and in particular to further reduce or completely eliminate the influence of Störsubsubstanzen on the result of the determination ,
  • One embodiment of the invention is a method for the amperometric determination of the in a liquid sample, in particular blood, Se plasma, urine, interstitial fluid, sweat or milk concentration of hydrogen peroxide by means of electrodes to which different potentials E are applied during a measuring cycle.
  • the method comprises the measurement at a potential E M suitable for measuring the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample and the measurement at at least one potential E K suitable for measuring the concentration of a substance in the liquid sample used in the measurement of the Hydrogen peroxide concentration acts as a disruptive substance, in particular urea, amino acids, ascorbic acid and certain drugs.
  • the result / results of the additional measurement (s) at one or more potential (s) E 101 is suitable for measuring the concentration of an interfering substance in the liquid sample are / may be / may be used to study the influence of an interfering substance (s ) to the result of the measurement at the potential suitable for measuring the hydrogen peroxide concentration in the liquid sample. This makes the result of the glucose determination insensitive to the influence of one or more interfering substances contained in the fluid sample in an unknown concentration.
  • a potential is applied at which the current flowing between the electrodes varies essentially linearly, but at most exponentially with the hydrogen peroxide concentration or with the interfering substance concentration.
  • the results of the measurements are at the potentials suitable for measuring the concentration of interfering substances, each multiplied by a previously empirically determined weighting factor a. deducted.
  • the total current at the typical hydrogen peroxide potential is corrected by means of the measuring currents at various typical interfering substance potentials multiplied by a weighting factor, and thus results in a more simple and accurate value.
  • the measurements are repeated at the different potentials, typically until a certain convergence criterion is reached.
  • a certain convergence criterion is reached.
  • an activation potential is applied prior to application of the first measurement potential, which is typically between -200 and +700 mV, preferably at 0V.
  • the measuring potential can be shifted far into the cathodic.
  • a maximum of 10 different potentials are applied, and typically 4, which are in the ranges of -1200 to -800 mV, -600 to 0 mV, -200 to +700 mV, and +200 to +1400 mV.
  • the measuring potentials that are applied for determining the concentrations of the interfering substances are generally more cathodic than the measuring potential E M , so that little substrate is consumed.
  • the hydrogen peroxide is the end product of an enzyme reaction.
  • at least one oxo reductase is preferably used, for example glucose oxidase in the case of glucose determination.
  • substrates can be determined by other suitable enzymes, such as lactate oxidase, cholesterol oxidase, alkohydehydrogenase, xanthine oxidase, amino acid oxidase, ascorbic acid oxidase, acyl-CoA oxidase, uricase, glutamate dehydrogenase, fructose dehydrogenase or the like.
  • suitable enzymes such as lactate oxidase, cholesterol oxidase, alkohydehydrogenase, xanthine oxidase, amino acid oxidase, ascorbic acid oxidase, acyl-CoA oxidase, uricase, glutamate dehydrogenase, fructose dehydrogenase or the like.
  • gold electrodes are used as electrodes.
  • measuring devices by means of which the method described above can be carried out.
  • These measuring devices may have the measuring electrodes integrated, e.g. on a measuring chip, or the measuring electrodes are mounted on an external measuring strip, which is electrically connected to the measuring device.
  • the electrochemical potential drops in the liquid sample are preferably compensated via a control circuit.
  • the potential of the measuring electrode is kept at a constant value by a control circuit during the entire measurement.
  • Fig. 1 shows a typical course of a potential applied to the measuring electrodes
  • Fig. 2 shows a typical course of the measuring current in response to the potential curve shown in Fig. 1;
  • Fig. 3 shows the schematic structure of a test strip suitable for carrying out the measurement
  • Fig. 6 shows a control circuit for impressing the potential levels according to the invention.
  • At least one potential is chosen so that it is suitable for measuring the hydrogen peroxide concentration.
  • this is a potential at which the measurement current is linear or maximally exponential to the hydrogen peroxide concentration, i. varies linearly or exponentially with a change in hydrogen peroxide concentration.
  • At least one potential is selected such that it is suitable for measuring the concentration of a substance which acts as a disruptive substance in the above measurement of the hydrogen peroxide concentration, that is, influences, in particular amplifies, the current flowing between the electrodes in the hydrogen peroxide measurement.
  • Such an additional measuring potential thus permits the estimation of the concentration of a particular interfering substance and is in particular a potential at which the measuring current is not linear to the hydrogen peroxide concentration but to the concentration of the interfering substance.
  • the estimation (s) of the interfering substance (s) can then be used as a correction factor for the preliminary estimation of the hydrogen peroxide concentration by estimating the current that the interfering substance (s) measure at the hydrogen peroxide potential measure, and the reading is corrected accordingly. If the measured value is, for example, the strength of the measuring current flowing at the potential for hydrogen peroxide measurement, then the estimated value of the contribution of the interfering substances determined by the above method to this measured value can be subtracted from this measured value.
  • the actually measurable concentration is then determined according to the method described above for the interfering substances kl, kl,... Kn with a typical potential EK for the measurement of the interfering substance concentration.
  • This typical potential is, for example, a potential at which the measuring current is linear with the concentration of the interfering substance.
  • E M typical for the measurement of the hydrogen peroxide concentration
  • the preliminary value of the hydrogen peroxide concentration is determined, whereby the current value I M is obtained as the measured value.
  • the constants a ,, a 2 , ..., a are weighting factors that have to be determined empirically in preliminary experiments in the laboratory. They are necessary because hu h h ⁇ • h n , as noted above, at the potentials E k2 , ..., E kn are measured, the E k of E M being different, typically smaller.
  • the relationship is no longer linear because the substances influence one another. The relationship varies depending on the concentration of interfering substances and the amount of other components that are still present. In total, ⁇ takes several factors.
  • the above working formula is programmed into the meter.
  • factors can be included in the calculation of the blood sugar concentration and can also supplement the above working formula.
  • factors include, in particular, an estimation of the proportion of the measuring current caused by those interfering substances whose concentration is not measured separately by the above method.
  • physical and physiological properties such as the temperature of the sample can influence the measurement currents.
  • the measuring strip consists of three electrodes (14): measuring, counter and reference electrodes.
  • the substrate 10 consists of a thermoplastic plastic film (eg PVC from Ineos, Germany).
  • Electrodes 11 eg Duplo Bond ® from Lohmann, Germany
  • a hydrophilic-coated cover film 12 such as Hostaphan ® RN HSTE by Mitsubishi Polyester film, Germany
  • the glucose oxidase is screen-printed on the electrode surface (eg HEMA GX from Aurum Technology, Austria).
  • the potential ranges are for the typical case for example:
  • E A is an activation potential.
  • Gold electrodes are known to undergo oxidation of H 2 O 2 at two different potentials (M. Gerlache et al., Electrochimica Acta, Vol. 43, No. 23, pages 3467 to 3473, 1998).
  • the height above all of the first peak depends very much on the nature of the electrode and the composition of the medium.
  • the formation of the first peak is accelerated by adsorbed OH ions on the gold surface.
  • the first peak forms only weakly or not at all.
  • this first peak is particularly suitable for the detection of H 2 O 2 , since the half-wave potentials of F 2 O 2 oxidation and of oxide formation are separated from one another. This allows more sensitive measuring, such as with platinum electrodes, in which the oxide formation is always mitge messenger in the H 2 O 2 detection.
  • the blood glucose concentration G can then be derived directly from IM, since it is proportional to the hydrogen peroxide concentration, which in turn is proportional to Iw (in this case referred to as hz). G results with the intercept d and the slope k (both from the calibration) to:
  • the potential suitable for measuring the hydrogen peroxide concentration is between +200 and +1400 mV. In the potential range between +770 and +1030 mV, the confidence interval (without correction term) is 95%.
  • FIG. 1 shows an example of a curve of the voltage applied between the measuring electrodes with four potential steps P t to P 4 .
  • the largest anodic potential - P 2 in Fig. 1 - is typically the potential suitable for measuring hydrogen peroxide concentration.
  • the potential P 1 corresponds to the activation potential E A for the reduction of the measuring potential £ w to ⁇ 0.6 V (NHE). Accordingly P 3 and P 4 represent potential levels that are suitable for measuring two different disturbances.
  • the four time periods t ⁇ measured to t 4 measured identify the periods during which measurements can be performed: f measured is the time period during which can be performed on the hydrogen peroxide concentration measurements (or multiple pulsed measurements) in relation; t 3 mess and t 4 mess are the time periods during which the measurements in relation to the interfering substances can be carried out.
  • t ' mess only plays a role in iterative measurement in the first cycle. Here it serves to check whether the test strip is in order. In subsequent cycles, no measurement is made at Pi.
  • the measuring periods are at the end of the period in which a potential level is applied.
  • FIG. 2 clearly shows how the current between the measuring electrodes does not become stable until the end of each period in which a potential is applied. These ends correspond to the four measurement periods / mess to t meas-
  • the measurement potentials and the corresponding measurements are preferably, as already mentioned above, not only run once but repeated. If so If certain blood glucose value G is no longer changed, this final value is shown on the display.
  • the circuit for impressing the potential levels according to the invention is shown in FIG.
  • the potential of the measuring electrode is kept at a constant value via the contact 27 through the operational amplifier (OP) 21 (pin 5, 6, 7).
  • OP operational amplifier
  • DAC digital-to-analogue converter
  • up to ten potential levels of different height and length are generated and impressed on the controller 22 (pins 8, 9, 10) as a setpoint.
  • the controller 22 compensates for electrochemical potential drops in the blood during the measurement (IR compensation).
  • the potential between the measuring electrode and the reference electrode (connected to the measuring device via contact 25) therefore follows the nominal value.
  • the current of the electrodes flows through the measuring resistor R, vi ess (27) and generates there a voltage drop.
  • the controller 23 (pin 1, 2, 3) brings as a voltage follower the potential VSINK of the measuring electrode to the analog-to-digital converter (ADC, not shown), the controller 21 (pin 5, 6, 7), the voltage after the measuring resistor 24th (U ADC ).
  • ADC analog-to-digital converter
  • U ADC the voltage after the measuring resistor 24th

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Abstract

Zur amperometrischen Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration in einer Flüssigkeitsprobe werden an die Elektroden unterschiedliche elektrische Potentialstufen angelegt. Dabei ist mindestens ein Potential zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration in der Flüssigkeitsprobe geeignet, und mindestens ein weiteres Potential zur Messung der Konzentration einer Substanz in der Flüssigkeitsprobe geeignet, die bei der Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration als Störsubstanz wirkt.

Description

Bestimmung von Wasserstoffperoxidkonzentrationen
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung behandelt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Wasserstoffperoxidkonzentrationen in Flüssigkeiten, insbesondere eine verbesserte Bestimmung von Wasserstoffperoxidkonzentrationen in Blut, Schweiß, Urin oder Milch.
Die Bestimmung von Substanzen, speziell in Gegenwart von anderen, z.T. störenden Substanzen, ist für viele Einsatzgebiete wichtig, insbesondere in der medizinischen Diagnostik. So ist z.B. die Bestimmung von Glukose im Blut von entscheidender Bedeutung für die Diabetes-Therapie. Besonders erfolgversprechend verläuft die Therapie, wenn der Blutzucker vom Patien- ten selber in regelmäßigen Abständen kontrolliert wird. Der Patient sticht sich dazu mit einer Stechhilfe, um einen Tropfen Blut zu bekommen, den er auf einen Wegwerfbiosensor aufträgt. Dieser steckt in einem Messgerät, das die Messung und die Auswertung vornimmt. Am Display erscheint nach 10 bis 30 Sekunden der Blutzuckerwert, der vom Patienten zur laufenden Kon- trolle und/oder genauen Insulindosierung verwendet wird. Dies erfordert eine genaue Messung des Blutzuckers. Gelegentliche Fehlmessungen können zu akuten Komplikationen wie Koma führen. Dauernde Fehlmessungen bedingen einen laufend unphysiologisch hohen Blutzuckerspiegel, was zu Blindheit, Amputationen, Nierenversagen und Herzinfarkt führt.
Stand der Technik
Es sind eine Vielzahl von Methoden zur Blutzuckerbestimmung bekannt. Diese fallen in der Regel in zwei Kategorien: optische Methoden und elektrochemische Methoden. Bei optischen Methoden wird Reflexions- oder Absorptionsspektroskopie eingesetzt, um die bei der Reaktion mit Glukose im Blut gebildete Menge an Chromophor nachzuweisen. Die Intensität des Farbumschlages ist dabei proportional zum Blutzuckergehalt.
Elektrochemische Methoden benutzen amperometrische oder coulometri- sehe Verfahren, um den Blutzuckergehalt zu bestimmen. Die Einsatzmöglichkeit und vor allem die Leistungsfähigkeit elektrochemischer Methoden wird durch die Vielzahl an Störsubstanzen (Harnstoff, Aminosäuren, As- corbinsäure, Medikamente usw.) im Blut begrenzt, da diese ebenfalls an den Elektroden umgesetzt werden können und so falsch erhöhte Werte lie- fern. Dasselbe gilt für andere Variablen, wie z. B. der Hämatokrit, der auch von Messung zu Messung unterschiedlich sein kann. Der Hämatokrit (Hk) ist der Anteil der roten Blutkörperchen am Gesamtblut (in Vol%). Der normale Hämatokrit liegt zwischen 40 und 45 Vol%. Im Krankheitsfall oder bei Unfällen mit hohem Blutverlust kann der Hk zwischen etwa 22 und 65 Vol% liegen. Inwieweit dieser die Messung des Blutzuckergehalts beein- flusst ist z.B. in den US-Patenten 5,234,516; 5,288,636; 5,353,351 und 5,385,846 beschrieben. Durch die unbestimmte chemische und physiologische Zusammensetzung des Bluts oder anderer Körperflüssigkeiten weisen die Messergebnisse der elektrochemischen Glukosebestimmung nach den herkömmlichen Verfahren Abweichungen vom tatsächlichen Glukosewert von bis zu 20% auf.
Elektrochemische Wegwerfsensoren bestehen in der Regel aus einem Substrat, auf dem Kontakte, Leitungen und Elektroden aus einem leitenden Ma- terial ausgebildet werden. Die Reaktionszone und die Kontakte zum Messgerät, werden durch Aufbringen einer nichtleitenden Schicht definiert. Die Reaktionszone wird durch die Elektroden gebildet. In der Regel findet man zwei Elektroden, wobei eine als Messelektrode dient. Die andere stellt die Referenz- und Gegenelektrode dar. An der Messelektrode erfolgt die ei- gentliche Nachweisreaktion. Dazu wird auf oder vor diese eine Enzymschicht oder -membran angebracht. Das Enzym wird dazu verwendet, spezifisch mit der im Blut befindlichen Glukose zu reagieren. Die Messelektrode misst nun die Konzentration von einem oder mehreren Reaktionsprodukten der Enzymreaktion. Solange die Aktivität des Enzyms höher ist, als die Substratkonzentration, ist die Konzentration der Reaktionsprodukte direkt proportional zur Substratkonzentration. Die Messelektrode bestimmt so direkt die Glukosekonzentration im Blut.
Es sind eine Vielzahl von Enzymsensoren zur Glukosemessung im Blut oder anderen Flüssigkeiten in der Literatur beschrieben. Fast alle Glukosesensoren funktioniere nach folgendem Reaktionsschema:
O2 + H ,0 + Glukose CMmeo^me(GOO) ) δ - Glukolakton + H2O2 (I) Die Glukosebestimmung kann entweder über (1) den Verbrauch von Sauerstoff (OrElektroden); (2) das gebildete Wasserstoffperoxid (H2O2- Elektroden) oder (3) den Anstieg des pH- Wertes (pH-Elektroden) erfolgen. Glukosesensoren basierend auf pH- Wert Änderungen haben den Nachteil, dass ihr Messverhalten durch die Pufferkapazität der Probe bestimmt wird.
Bei O2- und H2θ2-Elektroden ist der Messwert über einen mehr oder weni- ger großen Bereich direkt proportional zur Glukosekonzentration. Der Messbereich wird durch die Permeabilität der Membran für Glukose und Sauerstoff bestimmt. Hohe Durchlässigkeit der Membran sorgt für hohe Empfindlichkeit, während geringe Durchlässigkeit zwar die Sensitivität verringert, den Messbereich jedoch erweitert. Bei hohen Glukosekonzentratio- nen kann der Messbereich durch zu geringe Enzymaktivität begrenzt werden. Dieser Umstand kann aber durch Einsatz von überschüssigem Enzym eingedämmt werden. Dabei ist darauf zu achten, dass es besonders bei GIu- koseoxidase bei hohen Enzymmengen zu einer Selbstinhibierung kommt.
Ohne Membran ist der Messbereich durch die Transportgeschwindigkeit von Sauerstoff zum Enzym auf etwa maximal 200 mg/dl beschränkt. In der Diabetes-Therapie sind aber Blutzuckerwerte zwischen 200 und 500 mg/dl an der Tagesordnung. Um diesen Wert zu erreichen, ohne jedoch Empfindlichkeit durch dicke Membranen zu verlieren, wurden Sauerstoff- unabhängige Glukosesensoren entwickelt. Dabei übernehmen andere Molekühle als Sauerstoff den Transport der Elektronen vom Redoxzentrum des Enzyms zur Elektrodenoberfläche. Diese Moleküle werden als Mediatoren M bezeichnet. Der Mechanismus läuft nach folgendem Schema ab: Glukose + GOD0x (( δ-Glukolakton + GODred (II)
GODred + 2M0x (( GOD0x + 2Mred + 2H+
Mred (( M0x + e~ (an der Elektrode)
Solche Sensoren sind bis zu einem gewissen Grad sauerstoffunabhängig und funktionieren sogar in anaeroben Umgebungen.
Bei der elektrochemischen Glukosebestimmung in einem komplexen Medium wie Blut oder Urin stellt sich allerdings das Problem, dass zahlreiche weitere in dem Medium enthaltene Substanzen den Messstrom beeinflussen können. Im Falle der direkten H2O2-Detektion bei etwa +0,6 V (NHE) werden auch sehr viele leicht oxidierbare Verbindungen mit umgesetzt, was zu falsch erhöhten Messwerten führt. Aus diesem Grund haben die eingesetzten Mediatoren in der Regel niedrige Redoxpotentiale, was den Einfluss von Störspezies auf das Messergebnis verringert. Beispiele für geeignete Mediatoren sind Benzo- und Naphtoquinone (EP 0 190 740), substituierte Flavine, Phenazine, Phenothiazine, Indophenole, substituierte 1,4- Benzoquinone und Indamine (EP 0 330 517), N-Oxide, Nitrosoverbindungen, Hydroxylamine und Oxine (EP 0 354 441), lösliche Hexa- cyanoferrat/Eisen-Verbindungen (EP 0 496 730) oder Phenazini- um/Phenoxazinium-Salze (US 3,791,988).
Glukosesensoren mit Mediatoren haben jedoch Nachteile. So sind alle Mediatoren giftig. Die natürliche Reaktion von Glukoseoxidase mit Sauerstoff aus dem Medium lässt sich nicht verhindern, da die Affinität des Redox- zentrums zu O2 etwa 100 Mal höher ist als z.B. zu Fe(III)CN6. Dies tritt besonders bei niedriger Glukosekonzentration verstärkt auf und führt zu zu niedrigen Messwerten, da das durch die Reaktion mit Sauerstoff gebildete H2O2 nicht detektiert wird. Bei der Herstellung solcher Sensoren muss wie terhin dafür gesorgt werden, dass der Mediator bis zur Messung im oxidier- ten Zustand bleibt. Jede auch nur teilweise Reduktion führt zu einem erhöhten Grundstrom, da schon Mred-Moleküle vorhanden sind, die natürlich auch umgesetzt werden. Es ist bekannt (EP 0 741 186), dass besonders bei hohen Temperaturen und hoher Luftfeuchtigkeit Mediatoren zur schnellen Reduktion neigen. Das verringert natürlich die Haltbarkeit und damit die Einsatzmöglichkeit der Sensoren als Wegwerfsensoren.
Man kann Zweielektrodensysteme oder Dreielektrodensysteme verwenden. Bei beiden Systemen bestehen die Arbeitselektroden und die Gegenelektroden im Allgemeinen aus Platin, Gold, Kohlenstoff oder dergleichen. Die Vergleichselektrode ist eine Ag-AgCl-Elektrode, eine Kalomelelektrode oder aus demselben Material wie die Arbeitselektrode.
Die internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 81/03546 offenbart ein Verfahren zur Messung der Glukosekonzentration, bei dem ein Potentialverlauf (unteres Limit: -1,0 bis - 0,6 V; oberes Limit: 0,7 bis 1,1 V) mit Haltezeiten an bestimmten Stellen (besonders dort, wo Glukose umgesetzt wird) und an den Umkehrpunkten angelegt wird. In bestimmten Bereichen wird die Ladung bestimmt. Dabei werden Haltepunkt und Haltezeiten so gewählt, dass die Ladung proportional zur Glukosekonzentration ist, unabhängig von Störsubstanzen, hauptsächlich Harn- stoff und Aminosäuren. Die Bereiche, in denen integriert wird, zeichnen sich dadurch aus, dass Glukose immer nur einen positiven Beitrag zur Gesamtladung liefert, die Störsubstanzen dagegen sowohl positive als auch negative Beiträge, die somit bei der Integration herausgemittelt werden. Dieses Verfahren versagt aber bei hohen Konzentrationen an Störsubstanzen und gleichzeitig geringen Konzentrationen an Glukose.
In Summe wäre ein Methode zur Glukosebestimmung im Blut wünschenswert, die mit H2O2-Elektroden arbeitet, ohne Mediatoren auskommt, relativ unempfindlich gegenüber Hämatokrit und Temperatur ist, bei der die H2O2- Detektion in einem niedrigeren Potentialbereich erfolgen kann, wodurch er unempfindlicher gegenüber Störspezies wird. Gleichzeitig sollten die Sensoren lagerfähig sein, damit sie als Wegwerfsensoren eingesetzt werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Genauigkeit der amperometrischen Bestimmung von Wasserstoffperoxidkonzentrationen in einer Flüssigkeitsprobe, insbesondere in Blut, Schweiß, Urin oder Milch, zu verbessern und insbesondere den Einfluss von Störsubsubstanzen auf das Ergebnis der Bestimmung weiter zu verringern bzw. ganz auszuschließen.
Die Aufgabe wird durch das Verfahren gelöst, das in Anspruch 1 definiert ist, sowie durch die Vorrichtungen, die in den Ansprüchen 22 und 23 definiert sind. Weitere, bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur amperometrischen Bestimmung der in einer Flüssigkeitsprobe, insbesondere Blut, Se rum, Plasma, Urin, interstitielle Flüssigkeit, Schweiß oder Milch vorhandenen Wasserstoffperoxidkonzentration mit Hilfe von Elektroden, an die wäh- rend eines Messzykluses unterschiedliche Potentiale E angelegt werden. Das Verfahren umfasst die Messung bei einem Potential EM, das zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration in der Flüssigkeitsprobe geeignet ist, und die Messung bei mindestens einem Potential EK, das zur Messung der Konzentration einer Substanz in der Flüssigkeitsprobe geeignet ist, die bei der Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration als Störsubstanz wirkt, insbesondere Harnstoff, Aminosäuren, Ascorbinsäure und bestimmte Medikamente.
Das Ergebnis/die Ergebnisse der zusätzlichen Messung(en) bei einem oder mehreren Potential(en) E101, die zur Messung der Konzentration einer Störsubstanz in der Flüssigkeitsprobe geeignet ist/sind, kann/können verwendet werden, um den Einfluss dieser Störsubstanz(en) auf das Ergebnis der Messung bei dem Potential, das zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration in der Flüssigkeitsprobe geeignet ist, abzuschätzen. Dadurch wird das Ergebnis der Glukosebestimmung unempfindlich gegenüber dem Einfluss von einer oder mehreren Störsubstanz(en), die in der Flüssigkeitsprobe in unbekannter Konzentration enthalten ist/sind.
Vorzugsweise wird zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration bzw. der Konzentration einer Störsubstanz in der Flüssigkeitsprobe ein Potential angelegt, bei dem sich der zwischen den Elektroden fließende Strom im Wesentlichen linear, höchstens aber exponentiell mit der Wasserstoffperoxidkonzentration bzw. mit der Störsubstanzkonzentration verändert. Nach einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden zur Abschätzung des Einflusses der Störsubstanzen vom Ergebnis der Messung bei dem zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration geeigneten Potential die Ergebnisse der Messungen bei den zur Messung der Konzentration von Störsubstanzen geeigneten Potentialen, jeweils multipliziert mit einen zuvor empirisch ermittelten Gewichtungsfaktor a, abgezogen. Der Gesamtstrom beim typischen Wasserstoffperoxidpotential wird mit Hilfe der Mess- ströme bei verschiedenen typischen Störsubstanzpotentialen, multipliziert mit einem Gewichtungsfaktor, korrigiert und ergibt so auf einfache Art und Weise einen genaueren Wert.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Messungen bei den verschiedenen Potentialen wiederholt, typischer Weise bis zum Erreichen eines bestimmten Konvergenzkriteriums. Dadurch können Unge- nauigkeiten wegen Messfehlern oder Ausreißern ausgeglichen werden.
In einer Ausführungsform wird vor dem Anlegen des ersten Messpotentials ein Aktivierungspotential angelegt, welches typischer Weise zwischen -200 und +700 mV, vorzugsweise bei 0 V liegt. Dadurch kann das Messpotential weit ins Kathodische verschoben werden.
Vorzugsweise werden maximal 10 unterschiedliche Potentiale angelegt, und typischerweise 4, welche in den Bereichen -1200 bis -800 mV, -600 bis 0 mV, -200 bis +700 mV und +200 bis +1400 mV liegen. Die Messpotentiale, die zur Bestimmung der Konzentrationen der Störsubstanzen angelegt werden, sind in der Regel kathodischer als das Messpotential EM, damit wenig Substrat verbraucht wird. In einem typischen Anwendungsfall der Erfindung, z.B. bei der Bestimmung der Glukosekonzentration in der Flüssigkeit, ist das Wasserstoffpero- xid Endprodukt einer Enzymreaktion. Bei der Enzymreaktion wird vorzugsweise mindestens eine Oxoreduktase verwendet wird, z.B. Glukoseo- xidase im Fall der Glukosebestimmung. Weitere Substrate lassen sich durch andere geeignete Enzyme bestimmen wie z.B. Laktatoxidase, Cholesterolo- xidase, Alkohodehydrogenase, Xanthinoxidase, Aminosäureoxidase, As- corbinsäureoxidase, Acyl-CoA-oxidase, Uricase, Glutamatdehydrogenase, Fruktosedehydrogenase oder ähnliche.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als Elektroden Goldelektroden verwendet.
Weitere bevorzugte Ausfuhrungsformen der Erfindung sind Messvorrichtungen, mit Hilfe derer sich das oben beschriebene Verfahren durchführen lässt. Diese Messvorrichtungen können die Messelektroden integriert haben, z.B. auf einem Messchip, oder die Messelektroden sind auf einem ex- ternen Messstreifen angebracht, der mit dem Messgerät elektrisch verbunden wird.
In den Messvorrichtungen werden die elektrochemischen Potentialabfälle in der Flüssigkeitsprobe vorzugsweise über eine Regelschaltung kompensiert.
Weiterhin wird in einer vorteilhaften Ausfuhrungsform der Messvorrichtungen das Potential der Messelektrode durch eine Regelschaltung während der gesamten Messung auf einen konstanten Wert gehalten. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die obige und andere Aufgaben, Aspekte und Vorteile der Erfindung werden mit der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausfuh- rungsformen der Erfindung besser verstanden werden, in der Bezug auf die Zeichnung genommen wird, in der:
Fig. 1 einen typischen Verlauf eines an die Messelektroden angelegten Potentials zeigt;
Fig. 2 einen typischen Verlauf des Messstroms in Reaktion auf die in Fig. 1 gezeigte Potentialkurve zeigt;
Fig. 3 den schematischen Aufbau eines für die Durchführung der Messung geeigneten Teststreifens zeigt;
Fig. 4 die Kurve des Messstroms /w bei unterschiedlichen Wasserstoffpero- xidpotentialen Ey für ein Beispiel zeigt;
Fig. 5 den Einfluss der Höhe des Aktivierungspotentials EA auf den Messstrom für EM = +800 mV für das Beispiel aus Fig. 4 zeigt; und
Fig. 6 einen Steuerschaltkreis zum Aufprägen der erfindungsgemäßen Potentialstufen zeigt. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung werden mehrere Messpotentialstufen an die Elektroden des Sensors angelegt.
Dabei wird mindestens ein Potential so gewählt, dass es zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration geeignet ist. Dies ist insbesondere ein Potential, bei dem der Messstrom linear oder maximal exponential zur Was- serstoffperoxidkonzentration ist, d.h. sich linear oder maximal exponentiell mit einer Änderung der Wasserstoffperoxidkonzentration verändert.
Zusätzlich wird mindestens ein Potential so gewählt, dass es zur Messung der Konzentration einer Substanz geeignet ist, die bei der obigen Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration als Störsubstanz wirkt, das heißt den zwischen den Elektroden bei der Wasserstoffperoxidmessung fließenden Strom beeinflusst, insbesondere verstärkt. Ein solches zusätzliches Messpo- tential erlaubt also die Abschätzung der Konzentration einer bestimmten Störsubstanz und ist insbesondere ein Potential, bei dem der Messstrom nicht linear zur Wasserstoffperoxidkonzentration, sondern zur Konzentration der Störsubstanz ist.
Die Abschätzung(en) der Störsubstanz(en) kann/können dann als Korrektur- fϊlter bezüglich der vorläufigen Abschätzung der Wasserstoffperoxidkonzentration verwendet werden, indem der Strom abgeschätzt wird, den die Störsubstanz(en) bei der Messung beim Potential zur Wasserstoffperoxid messung beitragen, und der Messwert entsprechend korrigiert wird. Ist der Messwert zum Beispiel die Stärke des beim Potential zur Wasserstoffpero- xidmessung fließenden Messstroms, so kann von diesem Messwert der nach dem obigen Verfahren ermittelte Schätzwert des Beitrags der Störsubstanzen zu diesem Messwert abgezogen werden.
Im Folgenden wird beschrieben, wie aus den Messwerten bei den Potentia- len Eκι bis EKn zur Bestimmung der Störsubstanzkonzentrationen der Beitrag der Störsubstanzen zum Messwert beim Potential EM zur Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration abgeschätzt werden kann und letzterer zur (endgültigen) Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration korrigiert werden kann.
Bei der Blutzuckermessung wird dann nach dem oben beschriebenen Verfahren für die Störsubstanzen kl, kl, ... kn die tatsächlich messbare Konzentration bei einem für die Messung der Störsubstanzkonzentration jeweils typischen Potential EK, bestimmt. Dieses typische Potential ist zum Beispiel ein Potential, bei dem der Messstrom linear zur Konzentration der Störsubstanz ist. Man erhält dann als Messwerte die Stromwerte Iki, Ik2, ..., /*„. Darüber hinaus wird nach dem oben beschriebenen Verfahren bei einem für die Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration typischen Potential EM der vorläufige Wert der Wasserstoffperoxidkonzentration bestimmt, wobei man als Messwert den Stromwert IM erhält.
Aus diesen Messwerten wird dann der Stromwert IM- nach folgender Arbeitsformel berechnet: hv = hι - <*rhi - arh2 - - an hn (HI)
Die Konstanten a,, a2, ..., a„ sind Gewichtungsfaktoren, die bei Vorversu- chen im Labor empirisch bestimmt werden müssen. Sie sind notwendig, da hu hh ■■■• hn, wie oben bemerkt, bei den Potentialen
Figure imgf000016_0001
Ek2, ..., Ekn gemessen werden, wobei die Ek von EM verschieden, typischerweise geringer sind. Darüber hinaus ist bei mehreren Störsubstanzen der Zusammenhang nicht mehr linear, da sich die Substanzen gegenseitig beeinflussen. Der Zusam- menhang variiert je nach Konzentration der Störsubstanzen und der Menge sonst noch vorhandener Komponenten. In Summe gehen in α, mehrere Faktoren ein.
Die obige Arbeitsformel wird in das Messgerät einprogrammiert. Es sei aber bemerkt, dass noch weitere Faktoren in die Berechnung der Blutzuckerkonzentration einfließen und auch die obige Arbeitsformel ergänzen können. Zu solchen Faktoren gehört insbesondere eine Abschätzung des Anteils am Messstrom, der durch diejenigen Störsubstanzen verursacht wird, deren Konzentration nicht nach dem obigen Verfahren extra gemes- sen wird. Weiterhin können neben der chemischen Zusammensetzung der Flüssigkeitsprobe physikalische und physiologische Eigenschaften wie die Temperatur der Probe die Messströme beeinflussen.
Anhand eines Beispiels wird jetzt die Bestimmung des Glukosegehalts in Blut beschrieben. Dies geschieht durch Reaktion der Probe mit Glukoseo- xidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid und amperometrisches Bestimmen der Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids. Es werden dazu mindestens zwei, vorzugsweise maximal zehn und typischerweise vier Potentiale an die Messelektrode des Teststreifens aus Fig. 3 angelegt. Der Messstreifen besteht aus drei Elektroden (14): Mess-, Gegen- und Referenzelektrode. Das Substrat 10 besteht aus einer thermoplastischen Kunststofffolie (z.B. PVC von Ineos, Deutschland). Oberhalb der Elektrodenflächen wird durch eine Spacerfolie 11 (z.B. Duplobond® von Lohmann, Deutschland) und einer hydrophil beschichteten Deckfolie 12 (z.B. Hostaphan® RN HSTE von Mitsubishi Polyester Films, Deutschland) eine Kapillare erzeugt. Die Glukoseoxidase wird im Siebdruckverfahren auf die Elektrodenfläche aufgebracht (z.B. HEMA GX von Aurum Technology, Österreich). Die Potentialbereiche sind für den typischen Fall zum Beispiel:
EA: -200 bis +200 mV
EM: +400 bis +800 mV
Ek, : -400 bis -600 mV
Ek2: -800 bis -1000 mV.
EA ist ein Aktivierungspotential. Damit hat es folgende Bewandtnis: Von Goldelektroden ist bekannt, dass die Oxidation von H2O2 bei zwei unterschiedlichen Potentialen stattfindet (M. Gerlache et al., Electrochimica Ac- ta, Vol. 43, No. 23, Seiten 3467 bis 3473, 1998). Der erste Peak liegt im Bereich des Onsets der Oxidbildung (Ep = 0,49 V), der zweite - etwas ano- discher - komplett im Oxid-Bereich (Ep = 0,87 V). Die Höhe vor allem des ersten Peaks hängt sehr von der Beschaffenheit der Elektrode und der Zusammensetzung des Mediums ab. Die Ausbildung des ersten Peaks wird durch adsorbierte OH-Ionen an der Goldoberfläche beschleunigt. Können keine OH-Ionen adsorbiert werden (z.B. bei hoher Cl-Ionen Konzentration und/oder oberflächenaktiver Substanzen im Medium, verschmutzter oder oxidierter Oberfläche), bildet sich der erste Peak nur schwach oder gar nicht aus. Besonders dieser erste Peak bietet sich jedoch gut für den Nachweis von H2O2 an, da das Halbwellenpotential der F^OrOxidation und der O- xidbildung von einander getrennt sind. Das erlaubt empfindlicheres Messen, als z.B. mit Platin-Elektroden, bei denen bei der H2O2-Detektion die Oxidbildung immer mitgemessen wird.
Es hat sich herausgestellt, dass durch Anlegen eines Potentials unterhalb des Onsets der Oxidbildung (Aktivierungspotential EA) vor dem eigentlichen Messpotential (EM) das Messpotential weit ins Kathodische verschoben werden kann (bis auf 0,1 V). Durch das Anlegen des Aktivierungspo- tentials wird nämlich eine kleine katalytische Menge Oxid auf der Elektrodenoberfläche gebildet. Diese führt dazu, dass das Messpotential von mindestens 0,6 V (NHE) auf unter 0,4 V verringert wird. Damit verringert sich auch der Einfluss von Störspezies auf den Messstrom, und der Einsatz von Mediatoren ist nicht mehr unbedingt notwendig.
Die Arbeits formel im Beispiel sieht nun folgendermaßen aus:
Figure imgf000018_0001
Wie wirkungsvoll diese Methode ist, zeigt sich, wenn man das Konfiden- zintervall (den Vertrauensbereich VB) mit und ohne Korrekturterm vergleicht. Im Fall der Bestimmung des Glukosegehalts in Blut, durch Reaktion der Probe mit Glukoseoxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid und amperometrisches Bestimmen der Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids nach der beschriebenen Methode, erhält man einen VB von 0,96999. Erweitert man die Formel um den Korrekturterm mit den empirisch ermittelten Gewichtungsfaktoren α/ = -0,1 1 und a2 = 0,47, erhöht sich der VB auf 0,99922.
Die Blutzuckerkonzentration G kann dann direkt aus IM abgeleitet werden, da sie proportional zur Wasserstoffperoxidkonzentration ist, welche wiederum proportional zu Iw (in diesem Falle als hz bezeichnet) ist. G ergibt sich mit dem Achsenabschnitt d und der Steigung k (beide aus der Kalibrierung) zu:
G_iBZ -d (V) k
Alle Potentiale beziehen sich auf die interne Referenzelektrode. Das Potential, das sich zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration eignet, liegt zwischen +200 und +1400 mV. Im Potentialbereich zwischen +770 und +1030 mV liegt das Konfidenzintervall (ohne Korrekturterm) bei 95%.
Die Fig. 1 zeigt einen beispielhaften Verlauf einer Kurve der zwischen den Messelektroden angelegten Spannung mit vier Potentialstufen Pt bis P4. Das größte anodische Potential - P2 in Fig. 1 - ist typischerweise das Potential, welches sich zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration eignet. Das Potential P1 entspricht dem Aktivierungspotential EA für die Verringerung des Messpotentials £w auf < 0,6 V (NHE). Dementsprechend stellen P3 und P4 Potentialstufen dar, die sich zur Messung von zwei verschiedenen Störgrößen eignen.
Die vier Zeitspannen tι mess bis t4 mess kennzeichnen die Zeiträume, während denen Messungen durchgeführt werden können: fmess ist die Zeitspanne, während der die Messung (bzw. mehrere gepulste Messungen) im Bezug auf die Wasserstoffperoxidkonzentration durchgeführt werden kann; t3 mess und t4 mess sind die Zeitspannen, während denen jeweils die Messungen im Bezug auf die Störsubstanzen durchgeführt werden können. t'mess spielt bei iterativer Messung nur im ersten Zyklus eine Rolle. Hier dient es zur Überprüfung, ob der Teststreifen in Ordnung ist. In den darauffolgenden Zyklen wird bei Pi keine Messung durchgeführt.
Die Messzeiträume liegen jeweils am Ende des Zeitraums, in dem eine Potentialstufe angelegt wird.
In Fig. 2 ist die der Spannungskurve aus Fig. 1 entsprechende Stromkurve dargestellt. In Fig. 2 ist gut zu erkennen, wie der Strom zwischen den Messelektroden erst gegen Ende eines jeden Zeitraums, in dem ein Potential angelegt wird, stabil wird. Diese Enden entsprechen den vier Messzeitspannen / mess bis t mess-
Für die Bestimmung der Glukosekonzentration werden die Messpotentiale und die entsprechenden Messungen vorzugsweise, wie oben bereits erwähnt, nicht nur ein Mal durchlaufen, sondern wiederholt. Wenn sich der so bestimmte Blutzuckerwert G nicht mehr verändert, wird dieser Endwert am Display angezeigt.
Die Schaltung zur Aufprägung der erfϊndungsgemäßen Potentialstufen ist in Fig. 6 dargestellt. Das Potential der Messelektrode wird über den Kontakt 27 durch den Operationsverstärker (OP) 21 (Pin 5, 6, 7) auf einem konstanten Wert gehalten. Über einen Digital-Analog- Wandler (DAC; nicht darge- stellt) werden bis zu zehn Potentialstufen unterschiedlicher Höhe und Länge erzeugt und dem Regler 22 (Pin 8, 9, 10) als Sollwert aufgeprägt. Der Regler 22 kompensiert elektrochemische Potentialabfälle im Blut während der Messung (IR-Kompensation). Das Potential zwischen der Messelektrode und der Referenzelektrode (mit der Mess Vorrichtung über Kontakt 25 ver- bunden) folgt daher dem Sollwert.
Der Strom der Elektroden fließt durch den Messwiderstand R,viess (27) und erzeugt dort einen Spannungsabfall. Der Regler 23 (Pin 1, 2, 3) bringt als Spannungsfolger das Potential VSINK der Messelektrode an den Analog- Digital- Wandler (ADC; nicht dargestellt), der Regler 21 (Pin 5, 6, 7) die Spannung nach dem Messwiderstand 24 (UADC). Der Strom, der an den E- lektroden durch die Nachweisreaktion erzeugt wird, ergibt sich nach folgender Formel:
j JJ ADC -VSINK (VI)
R •«We«

Claims

ANSPRUCHE
1. Amperometrisches Messverfahren zur Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration in einer Flüssigkeitsprobe mit Hilfe von Elektroden, an die unterschiedliche Potentialstufen angelegt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte um- fasst: - Messung bei einem Potential, das zur Messung der Was- serstoffperoxidkonzentration in der Flüssigkeitsprobe geeignet ist, und
Messung bei mindestens einem Potential, das zur Messung der Konzentration einer Substanz in der Flüssigkeitsprobe geeig- net ist, die bei der Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration als Störsubstanz wirkt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration in der Flüssig- keitsprobe geeigneten Potential sich der zwischen den Elektroden fließende Strom höchstens exponentiell mit der Wasserstoffperoxidkonzentration verändert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration in der Flüssigkeitsprobe geeigneten Potential sich der zwischen den Elektroden fließende Strom im Wesentlichen linear mit der Wasserstoffperoxidkonzentration verändert.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei einem zur Messung der Konzentration einer Störsubstanz geeigneten Potential sich der zwischen den Elektroden fließende Strom höchstens exponentiell mit der Störsubstanzkonzentration verändert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass bei einem zur Messung der Konzentration einer Störsubstanz geeigneten Potential sich der zwischen den Elektroden fließende Strom im Wesentlichen linear mit der Störsubstanzkonzentration verändert.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mit Hilfe des Ergebnisses einer Messung bei ei- nem Potential, das zur Messung der Konzentration einer Störsubstanz geeignet ist, der Einfluss dieser Störsubstanz auf das Ergebnis der Messung bei dem Potential, das zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration in der Flüssigkeitsprobe geeignet ist, abgeschätzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Abschätzung des Einflusses der Störsubstanzen das Ergebnis der Messung bei dem zur Messung der Wasserstoffperoxidkonzentration geeigneten Potential mit den Ergebnissen der Messungen bei den zur Messung der Konzentration von Störsubstanzen geeigneten Potentialen, jeweils multipliziert mit einen zuvor empirisch ermittelten Gewichtungsfaktor, korrigiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Messergebnis eine Stromstärke ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messungen bei den verschiedenen Potentialen mehrfach durchgeführt werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Messpotential ein Aktivierungspotential angelegt wird.
1 1. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Aktivierungspotential zwischen -200 und +700 mV liegt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 1 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aktivierungspotential bei 0 V liegt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass maximal 10 unterschiedliche Potentiale angelegt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass genau vier unterschiedliche Potentiale angelegt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die vier Potentiale in den Bereichen -1200 bis -800 mV, -600 bis 0 mV, - 200 bis +700 mV und +200 bis +1400 mV liegen.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitsprobe Blut, Schweiß, Urin oder Milch ist.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Störsubstanzen Harnstoff, Aminosäuren, As- corbinsäure oder Medikamente sind.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, dass das Wasserstoffperoxid Endprodukt einer Enzymreaktion ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Enzymreaktion mindestens eine Oxoreduktase verwendet wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Oxoreduktase Glukoseoxidas, Laktatoxidase, Cholesteroloxidas, Alkohodehydrogenase, Xanthinoxidase, Amino- säureoxidase, Ascorbinsäureoxidase, Acyl-CoA-oxidase, Uricase, Glutamatdehydrogenase oder Fruktosedehydrogenase ist.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden Goldelektroden sind.
22. Messvorrichtung, die zwei oder mehr Elektroden aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21 eingerichtet ist.
23. Messvorrichtung, die mit einem Messstreifen verbunden werden kann, der zwei oder mehr Elektroden aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21 nach Verbindung mit dem Messstreifen eingerichtet ist.
24. Messvorrichtung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrochemischen Potentialabfälle in der Flüssigkeitsprobe über eine Regelschaltung kompensiert werden.
25. Messvorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Potential der Messelektrode durch eine Regelschaltung während der gesamten Messung auf einen konstanten Wert gehalten wird.
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