CN101583721B - 过氧化氢浓度的测定 - Google Patents

Abstract

对于电流分析测定液体样品中的过氧化氢浓度，将多种不同的电势步骤施加给电极。在此方法中，至少一种电势适用于测量液体样品中过氧化氢的浓度，和至少一种额外的电势适合测量液体样品中测量过氧化氢浓度期间作为干扰物的物质的浓度。

Description

过氧化氢浓度的测定

发明背景

发明领域

本发明涉及测定液体中过氧化氢浓度的方法和设备，具体涉及对血液、汗液、尿液或牛奶中的过氧化氢进行的改进的测定。

物质，尤其是在其它物质(其中一些物质是干扰物)的存在下的测定在许多应用领域尤其是医学诊断领域中是很重要的。例如，测定血液中的葡萄糖对于糖尿病的治疗而言极其重要。当患者自己定期核查血糖时，其治疗尤其有望成功。为此，患者用针(lancing decive)刺其指头，得到一滴血，然后将该滴血用到一次性生物传感器中。该生物传感器处于实施测量和分析的测量设备之中。10-30秒钟后，显示器显示血糖读数，该患者将该读数用于正在进行的监控和/或服用准确的胰岛素剂量。这要求有精确的血糖测量。偶然的错误测量可导致急性并发症，如昏迷。反复的错误测量导致永久性的非生理高血糖水平，这将导致失明、切除、肾衰竭和心肌梗塞。

现有技术

已知有多种方法测定血糖水平。这些方法通常可分为两类：光学法和电化学方法。在光学法中，采用反射光谱法或吸收光谱法检测血液中与葡萄糖发生反应所形成的生色团的量。颜色改变的强度与血糖含量成正比。

电化学法使用电流分析技术或库仑技术测定血糖含量。应用可能性以及尤其是电化学法的性能受到血液中多种干扰物(尿素、氨基酸、抗坏血酸、药物等)的限制，因为这些物质也可在电极处被转化，从而产生错误的升高读数。其它变量例如血细胞比容也会产生相同的问题，例如，这些变量也会在不同测量中有不同的测量结果。血细胞比容(HCT)是全血中红细胞的百分比(体积％)。正常的血细胞比容在40体积％到45体积％之间。在疾病或高失血量的事故受害者的情况中，HCT可能在大约22体积％到65体积％之间。它影响血糖含量的测量的程度在例如美国专利5,234,516、5,288,636、5,353,351和5,385,846中有描述。

血液或其它体液中化学和生理学组成的不确定性所导致的结果是，使用常规方法实施的电化学葡萄糖测量所获得的测量结果与实际的葡萄糖水平有高达20％的偏差。

一次性电化学传感器通常包括基底，位于基底上的接触点、线以及由导电性材料制成的电极。反应区和与测量设备的接触点通过使用不导电的层来限定。反应区由电极形成。通常存在两个电极，其中之一用作测量电极。另一个电极作为参比电极和对电极。实际检测反应在测量电极上发生。为此，酶层或酶膜施用于此电极或其前面。酶用于与血液中的葡萄糖发生特异性反应。测量电极现在测量酶反应中一种或多种反应产物的浓度。只要酶的活性高于底物的浓度，反应产物的浓度与底物浓度直接成正比。通过这种方法，测量电极直接测定血液中的葡萄糖浓度。

文献中描述了大量的用于测量血液或其它液体中的葡萄糖的酶传感器。几乎所有的葡萄糖传感器的作用基于下述反应式：

葡萄糖可通过以下方式测定：(1)通过氧的消耗(O₂电极)，(2)通过所形成的过氧化氢(H₂O₂电极)，或(3)通过pH的提高(pH电极)。基于pH变化的葡萄糖传感器存在测量行为由样品的缓冲能力确定的缺点。

对于O₂电极和H₂O₂电极，测量值在或多或少都比较大的范围内与葡萄糖浓度直接成正比。测量范围由膜对葡萄糖和氧的渗透性确定。膜的高渗透性产生高敏感性，而低渗透性降低敏感性但扩大了测量范围。葡萄糖浓度高时，测量范围会受到不足的酶活性的限制。但是，可通过施用过量的酶来控制这种情况。重要的是，要紧记用大量的酶可实现自动抑制，尤其是在施用葡萄糖氧化酶的情况下。

没有膜时，由于氧向酶的运输速率的限制，测量范围最大限于大约200mg/dl。但在糖尿病治疗中，200-500mg/dl的血糖水平是很普遍的。为了达到此值而不牺牲厚膜的敏感性，已开发了不依赖氧的葡萄糖传感器。在这些传感器中，非氧分子将电子从酶氧化还原中心转运到电极表面。这些分子已知称为介体M。该机制如下所示：

葡萄糖+GOD_ox→δ-葡萄糖酸内酯+GOD_red   (II)

GOD_red+2M_ox→GOD_ox+2M_red+2H⁺

M_red→M_ox+e^–(在电极上)

这些传感器在一定程度上不依赖氧，且甚至可在无氧环境中使用。

但是，在使用电化学葡萄糖测定法测量复杂介质如血液或尿液时出现了问题，即这些介质中所含的各种其它物质会影响测量电流。在以大约+0.6V(NHE)进行的直接H₂O₂检测的情况中，大量的易于被氧化的化合物也同时被转化，产生假的升高读数。为此，常用的介体具有低的氧化还原电势，这可降低干扰物对测量结果的影响。合适的介体的例子包括苯醌和萘醌(EP0 190 740)，取代的黄素、吩嗪、吩噻嗪、靛酚、取代的1,4-苯醌和吲达胺(EP0 330 517)，N-氧化物、亚硝基化合物、羟胺和喔星(EP0 354 441)，可溶性氰铁酸盐/三价铁化合物(EP0 496 730)和吩嗪(phenazinium)盐/吩嗪(phenoxazinium)盐(US3,791,988)。

但具有介体的葡萄糖传感器具有很多缺点。例如，所有的介体都是有毒的。葡萄糖氧化酶与介质中的氧气的反应不可避免，因为氧化还原中心与O₂的亲合力大约大于其与例如Fe(III)CN₆的亲合力的100倍。尤其是在低葡萄糖浓度时，在很大程度上会发生这种情况，并产生非常低的测量值，因为检测不到与氧气反应所形成的H₂O₂。此外，当制造这种传感器时，需要确保介体维持为氧化状态直至测量的时候。每次还原，甚至仅仅是部分还原，都会导致背景电流增加，因为M_red分子已存在，该分子当然也被转化。已知(EP0 741 186)介体往往会快速还原，尤其是在高温和高湿度下。自然地，这缩短了使用寿命，并因此降低了将所述传感器用作一次性传感器的应用可能性。

可使用两电极系统或三电极系统。在这两种系统中，工作电极和对电极通常由铂、金、碳等制造。参比电极是Ag-AgCl电极、甘汞电极或由与工作电极的材料相同的材料制得。

公开号为WO81/03546的国际专利申请公开了一种测量葡萄糖浓度的方法，其中使用了一电势曲线(下限：-1.0到-0.6V；上限：+0.7到+1.1V)，其在某些点(尤其是葡萄糖转化时的点)和在某些转换点(reversal point)具有保压时间(dwell time)。在特定区域测量电荷。选择保压点和保压时间，以使电荷与葡萄糖浓度成正比，而与干扰物(主要是尿素和氨基酸)无关。其中进行结合的区域的特征是，葡萄糖总是仅仅为总电荷提供正贡献，而相反的是，干扰物同时提供正和负贡献，该正贡献和负贡献因而使该结合达到平均。

但是，当干扰物的浓度高而同时葡萄糖浓度低时，该方法失效。

总之，需要能用H₂O₂电极实施、不需要介体、对血细胞比容和温度相对不敏感的测量血液中的葡萄糖的方法，其中H₂O₂检测可在较低的电势范围下发生，使得其对干扰物更不敏感。同时，传感器应是可存储的，这样它们可用作一次性传感器。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提高电流分析测定液体样品(尤其是血液。汗液、尿液或牛奶)中过氧化氢浓度的准确性，尤其是进一步减少或完全排除干扰物对测量结果的影响。

通过权利要求1所限定的方法以及权利要求22和23所限定的设备实现此目的。此外，从属权利要求中限定了本发明的改进实施方式。

本发明的一个实施方式是一种在电极的帮助下电流分析测定液体样品(尤其是血液、血清、血浆、尿液、间质液、汗液或牛奶)的过氧化氢浓度的方法，在测量周期中给该电极施加了不同的电势E。该方法包括在适合于测量液体样品中的过氧化氢浓度的电势E_M下实施的测量，和在适合于测量液体样品中在测量过氧化氢浓度时作为干扰物的物质的浓度的至少一个电势E_K下实施的测量，所述作为干扰物的物质尤其是尿素、氨基酸、抗坏血酸和某些药物。

在一个或多个适合测量液体样品中干扰物的浓度的电势E_Kn下测定的额外测量结果可用于评估这种/这些干扰物对在适合测量该液体样品中过氧化氢浓度的电势下所测得的测量结果的影响。这使得葡萄糖测量结果对液体样品中所含有的未知浓度的一种或多种干扰物的影响不敏感。

为了测量液体样品中过氧化氢浓度或干扰物的浓度，优选施加一电势，在该电势时，电极间的电流随过氧化氢浓度或干扰物的浓度呈基本上线性的但至多是指数性的变化。

根据本发明的优选实施方式，为了评估干扰物的影响，从在适合测量过氧化氢浓度的电势下测得的测量结果中减去各自乘以先前根据经验确定的权重因数的在适合于测量干扰物的电势下测得的测量结果。用乘以权重因数的在各典型干扰物电势下测得的电流校正在典型的过氧化氢电势下测得的总电流，从而可以简单的方式获得更精确的数值。

根据另一优选实施方式，重复用不同电势实施的测量，通常直到获得一定的收敛性判别标准。由测量误差或逸出值导致的不准确性可通过这种方法得以弥补。

在一个实施方式中，在施加第一测量电势前通常施加为-200到+700mV、优选为0V的活化电势。结果是，测量电势可快速移到负电势范围(cathodic range)内。

优选施加最多10种不同的电势，通常是4种电势，其范围为-1200到-800mV、-600到0mV、-200到+700mV和+200到+1400mV。为测定干扰物的浓度而施加的测量电势通常要比测量电势E_M更负，这样底物消耗少。

在本发明的典型应用中，例如，在测定液体中的葡萄糖浓度时，过氧化氢是酶反应的终产物。优选地，在酶反应中使用至少一种氧化还原酶，例如在测定葡萄糖时使用葡萄糖氧化酶。可使用其它合适的酶来测量其它底物，例如乳酸氧化酶、胆固醇氧化酶、醇脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、酰基-CoA氧化酶、尿酸酶、谷氨酸脱氢酶、果糖脱氢酶等。

根据本发明的一个优选实施方式，使用金电极作为所述电极。

本发明的其它优选实施方式是可用来实施上述方法的测量设备。这些测量设备可具有集成在例如测量芯片上的测量电极，或在外部测量条上使用测量电极，所述测量条与该测量设备电连通。

在测量设备中，优选通过控制电路补偿液体样品中的电化学电势降。

此外，在测量设备的有利实施方式中，测量电极的电势在整个测量过程中通过控制电路维持为恒定值。

附图简述

结合下文对本发明优选实施方式的详细描述，将能更好理解本发明上述以及额外的目的、方面和优点，下文详细描述结合了以下附图：

图1显示施加给测量电极的电势的典型曲线。

图2显示相应于图1所示的电势曲线的测量电流的典型曲线。

图3显示适合于实施测量的测试条的示意结构。

图4显示一个实例中不同过氧化氢电势E_M时的测量电流I_M的曲线。

图5显示活化电势E_A的大小对图4实例中E_M＝+800mV的测量电流的影响。

图6显示根据本发明施加电势步骤的控制电路。

本发明优选实施方式的详细描述

根据本发明，对传感器的电极施加多个测量电势步骤。

在此方法中，选择至少一种电势，以使其适合于测量过氧化氢浓度。具体而言，它是这样的一种电势：测量的电流与过氧化氢浓度成线性关系或至多呈指数性关系，即，它相对于过氧化氢浓度的变化呈线性变化或至多呈指数性变化。

此外，选择至少一种电势，以使其适合于测量在上述测量过氧化氢浓度的过程中作为干扰物的物质的浓度，即，该物质影响测量过氧化氢过程中电极间的电流(尤其是增加电极间的电流)。因此，这种性质的额外测量电势使得可评价特定干扰物的浓度，且这种电势尤其是这样的一种电势，即在该电势所测量的电流与干扰物的浓度成线性关系，而不是与过氧化氢浓度成线性关系。

然后，可用干扰物的估算值作为过氧化氢浓度初步估算值的校正过滤器，因为估算了由干扰物产生的对在用于测量过氧化氢浓度的电势处实施的测量有影响的电流，所测量的值也相应地被校正。例如，如果测量值是在测量过氧化氢的电势处测得的电流水平，那么可从所述测量值中减去根据上述关于此测量值的方法测定的干扰物的量的估算值。

下文描述如何从测定干扰物浓度的电势E_K1到E_Kn处的测量值估算干扰物对测定过氧化氢浓度的电势E_M处的测量值的贡献，以及如何校正后一测量值，以(最终)确定过氧化氢浓度。

在血糖测量的情况中，采用上述测量干扰物k1、k2、……kn的方法测定测量干扰物浓度的典型电势E_Ki处的实际可测量浓度。该典型电势是例如测量电流与干扰物浓度成线性关系的电势。对于测量值，然后可获得电流值I_k1、I_k2、……I_kn。此外，使用上述方法用测量过氧化氢浓度的典型电势E_M测定过氧化氢浓度的初值，获得电流值I_M作为测量值。

然后使用下述工作等式由这些测量值计算电流值I_M’：

I_M’＝I_M－a₁·I_k1－a₂·I_k2－……－a_n·I_kn   (III)

常数a₁、a₂、……a_n是权重因数，它们必须在实验室的预备试验中事先测定。它们是必需的，因为如上所示，I_k1、I_k2、……I_kn在电势E_k1、E_k2、……E_kn处测量，其中E_K不同于E_M，通常小于E_M。此外，在存在多种干扰物的情况下，该关系不再是线性的，因为这些物质会相互影响。该关系依干扰物的浓度以及所存在的额外成分的量而变化。总之，多个因数涉及a_i。

上述工作等式编程入测量设备中。但是，必须注意的是，其它因数对血糖浓度的计算有一些影响，且也可补充上述工作等式。这些因数具体包括具体干扰物带来的测量电流的比例的估算值，所述干扰物的浓度未采用上述方法独立地测量。此外，除了液体样品的化学组成外，物理和生理特性如样品的温度可影响测量电流。

现在将用一个实例描述血液葡萄糖含量的测定。该测定通过样品与葡萄糖氧化酶反应，形成过氧化氢，并通过电流分析测定所形成的过氧化氢的量而实现。

为此，至少使用两种、优选最多10种、通常4种电势施加给图3的测试条的测量电极。测量条由三个电极(14)组成：测量电极、对电极和参比电极。基底10由热塑性膜(例如德国依纽斯公司(Ineos)的PVC)制得。在电极表面上由隔离膜11(例如，德国咯曼公司(Lohmann)的)和带有亲水涂层的覆膜12(例如，德国三菱聚酯膜公司(Mitsubishi Polyester Films)的RN HSTE)形成的毛细管。采用丝网印刷法将葡萄糖氧化酶施加到电极表面上(例如澳大利亚欧路姆技术公司(Aurum Technology)的HEMAGX)。具体例子的示例性电势范围如下：

E_A:-200到+200mV

E_M:+400到+800mV

E_k1:-400到-600mV

E_k2:-800到-1000mV。

E_A是活化电势。理由如下：已知金电极中H₂O₂的氧化在两个不同电势下发生(M.Gerlache等,Electrochimica Acta,第43卷,第23期,第3467-3473页,1998)。第一个峰在开始形成氧化物的区域内(E_p＝+0.49V)，第二个峰(一定程度上更正极的(anodic)峰)完全在氧化物区域内(E_p＝+0.87V)。特别的是，第一峰的高度非常依赖于电极的组成和介质的组成。第一峰的形成通过金表面上吸附的OH离子而得到加速。如果没有OH离子可被吸附(如在高Cl离子浓度和/或介质中存在表面活性物质、干燥或氧化表面的情况下)，第一峰要么根本不形成，要么非常弱。但是，该第一峰尤其适合于检测H₂O₂，因为H₂O₂氧化的半波电位以及氧化物形成的半波电位是相互分离的。这与铂电极相比具有更敏感的测量，例如，铂电极通常在检测H₂O₂的同时测量氧化物形成。

明显的是，在实际测量电势(E_M)之前通过使用低于开始形成氧化物的电势的电势(活化电势E_A)可使得测量电势能快速进入负范围(到+0.1V)。这是因为通过施加活化电势而在电极表面上形成少量的催化量的氧化物的缘故。这产生的结果是，测量电势从至少+0.6V(NHE)降至+0.4V以下。结果，干扰物对测量电流的影响也降低，而且也不绝对需要使用介体。

现在给出此例子中的工作式：

I_M’＝I_M-a₁·I_k1-a₂·I_k2   (IV)

当比较有或者没有修正项的置信区间(CI)时，此方法的有效性是明显的。在通过样品与葡萄糖氧化酶反应，形成过氧化氢而测定血液葡萄糖含量的情况下，采用所描述的方法电流分析技术测定所形成的过氧化氢的量，可获得0.96999的置信区间。当在等式中包括带有根据经验测定的权重因数a₁＝-0.11和a₂＝0.47的修正项时，置信区间升至0.99922。

然后可直接从I_M获得血糖浓度G，因为它与过氧化氢浓度正正比，这又与I_M’(在此例中称为I_BZ)成正比。G由截距d和斜率k(两者都得自校准曲线)获得，具体如下：

$G=\frac{I_{\mathrm{BZ}}-d}{k}---\left(V\right)$

所有电势都参照内部参比电极。适合测量过氧化氢浓度的电势在+200到+1400mV之间。在+770到+1030mV的电势范围内，置信区间(无修正项)为95％。

图1显示在测量电极之间施加的4个电势步骤(P₁到P₄)的电压曲线的示例性行为。最大的正电势(图1中的P2)通常是适合于测量过氧化氢浓度的电势。电势P1对应于用于将测量电势EM降至<+0.6V(NHE)的活化电势E_A。因此，P3和P4代表的电势步骤适合于测量两种不同的干扰参数。

4个时间间隔t¹ _mess到t⁴ _mess表征可实施测量的期间：t² _mess是可测量(或多脉冲测量)过氧化氢浓度的时间间隔；t³ _mess和t⁴ _mess是可测量干扰物的时间间隔。在重复测量中，t¹ _mess仅在第一轮起作用。在此，它被用于证实测试条状况是否良好。在接下来的循环中，在P1没有进行测量。

每个测量期间位于施加电势步骤的所述期间的末端。

图2示出了对应于图1电压曲线的电流曲线。图2清楚显示了测量电极间的电流首先在施加电势的各期间的末端变得稳定的方法。这些末端对应于4个测量时间间隔t¹ _mess到t⁴ _mess。

为了测定葡萄糖浓度，测量电势和相应的测量值优选重复运行，而不是仅仅运行一次，如上述已提及的。当所获得的血糖值G不再变化时，最终的值显示在显示器上。

图6显示了施加本发明电势步骤的电路。测量电极的电势由运算放大器(OP)21(针脚5、6和7)通过接触点27而维持为恒定值。通过数字模拟转换器(DAC，未显示)在调节器22(针脚8、9、10)上产生并施加多达10种不同高度和长度的电势步骤作为目标值。调节器22补偿测量过程中血液中电化学电势降(IR补偿)。测量电极和参比电极间的电势(通过接触点25连接的测量设备)因而符合该目标值。

电极电流流过测量电阻R_Mess(27)，在那产生电压降。调节器23(针脚1、2、3)作为电压输出器，将测量电极的电势VSINK输送到模拟数字转换器(ADC，未显示)，调节器21(针脚5、6、7)在测量电阻24(U_ADC)之后输送该电压。采用以下式子通过检测反应来测定电极上的电流：

$I=\frac{U_{\mathrm{ADC}}-\mathrm{VSINK}}{R_{\mathrm{Mess}}}---\left(\mathrm{VI}\right).$

Claims (17)

1.测定液体样品中葡萄糖浓度的非治疗目的方法，其中，将所述液体样品与葡萄糖氧化酶接触，在施加了不同的电势步骤的电极的帮助下通过电流分析测量由此形成的过氧化氢的量，其特征在于，该方法包括以下步骤：

——施加一活化电势，以降低用于测量过氧化氢浓度的电势；

——在适合于测量液体样品中的过氧化氢浓度的电势下进行测量，经施用活化电势，该电势已被降低；

——在至少一种电极间的电流与过氧化氢浓度不成线性关系但适合于测量液体样品中测量过氧化氢浓度期间作为干扰物的物质的浓度的电势下的测量；和

——在适合于测量干扰物浓度的电势下测得的测量结果的帮助下，评估这种干扰物对在适合于测量液体样品中过氧化氢浓度的电势下测得的测量结果的影响。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在适合测量液体样品中的过氧化氢浓度的电势下，电极间的电流与过氧化氢浓度呈指数性变化。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在适合测量液体样品中的过氧化氢浓度的电势下，电极间的电流与过氧化氢浓度呈线性变化。

4.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在适合测量液体样品中干扰物浓度的电势下，电极间的电流与干扰物浓度呈指数性变化。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在适合测量液体样品中干扰物浓度的电势下，电极间的电流与干扰物浓度呈线性变化。

6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，为了评估干扰物的影响，用各自乘以先前根据经验确定的权重因数的在适合于测量干扰物的电势下测得的测量结果来校正在适合测量过氧化氢浓度的电势下测得的测量结果。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述测量结果是电流值。

8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，重复用不同电势实施的测量，直到获得收敛性判别标准为止。

9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述活化电势在-200到+700mV之间。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述活化电势是0V。

11.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，施加最多10种不同的电势。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，施加正好4种不同的电势。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述4种电势的范围为-1200到-800mV、-600到0mV、-200到+700mV和+200到+1400mV。

14.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述液体样品是血液、汗液、尿液或牛奶。

15.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述干扰物质是尿素或药物。

16.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述干扰物质是氨基酸或抗坏血酸。

17.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述电极是金电极。