DE3411448A1

DE3411448A1 - Verfahren und anordnung zur bestimmung von glucose

Info

Publication number: DE3411448A1
Application number: DE19843411448
Authority: DE
Inventors: Karl Prof. Dr.rer.nat. 8000 München Cammann; Frank Dipl.-Chem. 7907 Langenau Honold
Original assignee: Licentia Patent Verwaltungs GmbH
Current assignee: Licentia Patent Verwaltungs GmbH
Priority date: 1984-03-28
Filing date: 1984-03-28
Publication date: 1985-10-10

Description

Beschreibung
Verfahren und Anordnung zur Bestimmung von Glucose Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Bestimmung von Glucose nach den Oberbegriffen der Patentansprüche 1 und 11.
Derartige Verfahren und Anordnungen sind insbesondere auf dem medizinischen Sektor anwendbar, um bei zuckerkranken Patienten, den sog. Diabetikern, den Blutzuckerspiegel innerhalb des normalen Wertebereichs zu halten. Diese Patienten benötigen in bestimmten Zeitabständen eine bestimmte Menge (Dosis) an Insulin, das gespritzt wird.
Im allgemeinen lernt es der Patient, die Insulininjektion selbst vorzunehmen, z.B. mit Hilfe einer handbetriebenen Spritze. Derzeit handelsüblich sind auch tragbare Insulin- Dosierpumpen, die Insulin subkutan oder intravenös verabreichen und dem Diabetiker die unter Umständen als unangenehm empfundene eigenhändige Injektion abnehmen. Die insulinrate wird vom Arzt eingestellt. Der Patient kann zusätzlich Insulin-Gaben auslösen, z.B. nach Mahlzeiten.
Da die Dosierpumpe nach einem festen Programm arbeitet, kann sie die Insulingaben nicht den tatsächlichen Erfordernissen anpassen. So können z.B. Streß, sportliche Betätigung und/oder Nichteinhalten der Diät Diskrepanzen zwischen Insulinbedarf und Varabreichung zur Folge haben.
Dabei kann eine zu hohe Insulingabe zum hypoglykämischen Schock führen, eine zu niedrige Insulingabe zu hyperglykämischen Zuständen.
Es ist folglich von Vorteil, wenn die Insulingabe dem tatsächlichen Bedarf angepaßt werden kann. Zu diesem Zweck muß der Blutzuckergehalt zeitlich fortlaufend gemessen werden. Besonders ist dafür ein implantierbarer Glucose-Sensor einsetzbar, welcher die Glucosekonzentration im Blut überwacht und die Dosierpumpe derart steuert, daß im Blut immer die optimale Insulinkonzentration vorhanden ist. Für derartige Sensoren sind insbesondere ionensensitive Feldeffekttransistoren (ISFET's) geeignet, da diese räumlich klein aufbaubar sind und außerdem ein niederohmiges elektrisches Ausgangssignal erzeugen, das insbesondere mit Hilfe eines integrierten Schaltkreises und/oder eines Mikroprozessors weiterverarbeitbar ist.
Zur Bestimmung der Glucose-Konzentration in einer wässerigen Lösung wurde vorgeschlagen, die elektrischen Ausgangssignale von zwei pH-sensitiven ISFET's durch eine Diffe- renzschaltung auszuwerten. Dabei dient ein pH-sensitiver ISFET als Bezugselektrode, welche den pH-Wert (Konzentration der H3 0+ -Ionen) der Lösung mißt. Der zweite pH-sensitive ISFET dient als Glucose-sensitive Meßelektrode. Dazu wird der H3 0 -ionenempfindliche Bereich der Meßelektrode mit einer Membran überzogen, welche das Enzym Glucoseoxidase (GOD) enthält.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gattungsgemäßes Verfahren und eine gattungsgemäße Anrodnung anzugeben, die insbesondere bei einer Bestimmung der Glucosekonzentration in sog. Vollblut eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Glucose besitzen und die außerdem eine hohe Lebensdauer haben.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die in den kennzeichnenden Teilen der Patentansprüche 1 und 11 angegebenen Merkmale.
Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen sind den Unteransprüchen entnehmbar.
Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, daß in kostengünstiger Weise ein zuverlässiger sowie wartungsarmer Glucose-Sensor herstellbar ist, der implantierbar ist und der allenfalls in großen Zeitabständen ausgewechselt werden muß, Die Erfindung beruht auf der stromlosen Messung der Konzentration von Gluconsäure, die mit Hilfe des Enzyms Glucoseoxidase (GOD) entsteht gemäß der Formel: Glucose + H20 + 02 Gluconsäure + H202.
Die mit der Entstehung von Glucosesäure einhergehende Zunahme von H3 0+ -Ionen wird durch die pH-sensitive Meßelektrode ausgewertet. Die pH-sensitive Bezugselektrode dient als pH-Sensor. Durch die erwähnte Differenzschaltung wird vermieden, daß mögliche Schwankungen des pH-Wertes der Lösung, z.B. des Vollbluts, eine Schwankung der zu messenden Glucosekonzentration vortäuschen.
Die Umsetzung der Glucose in Gluconsäure erfolgt in einer Membran, die zumindest den ionensensitiven Bereich der Meßelektrode bedeckt. Die-Membran enthält einen Membranträger, z.B. eine 100 um dicke Folie aus Polyvinylchlorid (PVC) oder Polyacrylamid oder einem Polyamid, das derzeit z.B. unter dem Handelsnamen Nylon erhältlich ist, oder aus einem anderen physiologisch verträglichen Polymer. An den Membranträger ist das Enzym Glucoseoxidase entweder kovalent gebunden und/oder durch mechanischen Einschluß eingelagert. Es ist möglich, zusätzlich Hilfsenzyme einzulagern, welche die oben angegebene Nachweisreaktion unterstützen. Beispielsweise entfernt ICatalase das entstehende Wasserstoffperoxid (H202) durch Umsatz zu Wasser und Sauerstoff. Weiterhin ist es vorteilhaft, in der Membran Komplexbildner sowie antibakterielle und/oder fungizide Stoffe einzulagern. Durch diese Stoffe wird eine Vergiftung des Enzyms Glucoseoxidase vermieden. Als Komplexbildner sind Schwermetallgelatbildner geeignet, die eine störende Wirkung vorhandener Schwermetalle, z.B. Fe, Pb, vermeiden. Es ist zweckmäßig, die Membran mit einer Schutzmembran abzudecken. Dadurch wird insbesondere der Zutritt bestimmter Blutinhaltsstoffe zur Membran begrenzt und/oder Ablagerungen störender Stoffe vermieden.
Es ist vorteilhaft, bei der pH-sensitiven Bezugselektrode zumindest deren H3 0+ -ionensensitiven Bereich mit einer Schicht abzudecken, deren physikalisch-chemische Eigenschaften denjenigen des Membranträgers entsprechen, jedoch keine Glucoseoxidase enthält. Dadurch werden für beide Elektroden im wesentlichen gleiche Meßbedlngungen erreicht.
Beispiel 1: Eine normale ph-Elektrode wird mit einem Glucose-Oxidase-Überzug versehen. Dies kann durch Auf trocknen einer Enzymlösung auf das sensitive Glaselement geschehen. Der mechanische Einschluß erfolgt durch Eintauchen der Elektrode in einer PVC/THF (Tetrahydrofuran)-Lösung und Antrocknen eines dünnen PVC-Films.
Beispiel 2: Eine Glaselektrode mit im wesentlichen flachem Boden wird mit einem Nylon-Netz versehen, an welches Glucoseoxidase kovalent gebunden ist.
Dieses Netz wird mit einer Dialysierfolie abgedeckt.
Beispiel 3: Die Membran besteht aus mit Bisacrylamid vernetztem Polyacrylamid, das Glucoseoxidase kovalent gebunden trägt. Diese Membran wird vor einem H+ -ionensensitiven Feldeffekttransistor angebracht. Bezugspunkt ist ein zweiter derartiger Transistor ohne Membran. Gerade diese Transistoren bieten die Möglichkeit der Miniaturisierung, da sowohl Sensor als auch die zugehörige Meß- und Steuerelektronik auf einem Chip untergebracht werden können.
In allen aufgeführten Beispielen wird eine reproduzierbare Kalibrierfunktion zwischen Meßsignale (= pH-Differenz) und Glucose-Konzentration gefunden. Die Ansprechgeschwindigkeit liegt in allen Fällen im Mlnutenbereich, die Enzymlebensdauer liegt bei Wochen.
In den erwähnten Ausführungsbeispielen liegt die Konzentration der Glucoseoxidase in einem Bereich zwischen 0,01 U/mms und 100 U/mm'. Dabei richtet sich die gewählte Konzentration nach der zu erwartenden Glucosekonzentration und/oder nach der gewünschten Einstellgeschwindigkeit.
Dabei bedeutet die Enzymaktivität 1 U, daß ein Mikromol Glucose pro Minute bei dem Säurewert pH7 und der Reaktionstemperatur 250C oxidiert wird.
Bei den Konzentrationangaben der Katalase gilt das vorstehend Beschriebene entsprechend.
Die Erfindung ist nicht auf die Ausführungsbeispiele beschränkt, sondern in sinngemäßer Weise auf weitere anwendbar. Beispielsweise sind als Bezugs- und/oder Meßelektrode alle H30+-selektiven Elektroden geeignet, wie 3 Glaselektroden, Mikro-Glaselektroden, Flüssigmembranelektroden, PVÇ-Membranelektroden, Zirkonoxid-Elektroden und ionenselektive Feldeffekttransistoren. Letztere besitzen den Vorteil der Miniaturisierbarkeit. Darüberhinaus sind sie niederohmig und in eine Halbleiterauswerteschaltung integrierbar.

Claims

Patentansprüche Verfahren zur Bestimmung von Glucose in einer wässerigen Lösung, deren Glucosekonzentration elektrisch ausgewertet wird durch eine Differenzschaltung einer pH-sensi tiven Bezugselektrode und einer pH-sensitiven Meßelektrode, deren ionenempfindlicher Bereich mit einer das Enzym Glucoseoxidase enthaltenden Membran überzogen wird, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Merkmale: - in die Membran werden zusätzlich mindestens ein Hilfsenzym und/oder mindestens eine Substanz eingelagert, welche die Vergiftung des Enzyms Glucoseoxidase vermeiden, - die Konzentration der Glucoseoxidase wird gewählt entsprechend der gewünschten Empfindlichkeit gegenüber Glucose, - die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Membranträgers sowie dessen Abstand zum ionenempfindlicc Bereich der Meßelektrode werden gewählt entsprechend der gewünschten Empfindlichkeit gegenüber Glucose.
2. Verfahren zur Bestimmung von Glucose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Membranträger Polyvinylchlorid und/oder Polyacrylamid und/oder ein Polyamid enthält.
3. Verfahren zur Bestimmung von Glucose nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke des Membranträgers und/oder der Abstand der Membran zum ionensensitiven Bereich kleiner als 200 um gewählt wird.
4. Verfahren zur Bestimmung von Glucose nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Glucoseoxidase in einem Wertebereich von 0,01 U/mm3 bis 100 U/mms gewählt wird.
5. Verfahren zur Bestimmung von Glucose nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Hilfsenzym Katalase gewählt wird.
6. Verfahren zur Bestimmung von Glucose nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Katalase in einem Wertebereich von 0 bis 1000 U/mm3 gewählt wird.
7. Verfahren zur Bestimmung von Glucose nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vergiftung des Enzyms Glucoseoxidase und/oder des Hilfsenzyms vermieden wird durch in die Membran eingelagerte Komplexbildner, die eine Bindung von Schwermetallionen ermöglichen.
8. Verfahren zur Bestimmung von Glucose nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Komplexbildner mindestens ein Schwermetallgelatbildner verwendet wird.
9. Verfahren zur Bestimmung von Glucose nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Einfluß von Enzyminhibitoren herabgesetzt wird durch in die Membran eingelagerte antibakterielle und/oder fungizide Stoffe.
10. Verfahren zur Bestimmung von Glucose nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Komplexbildners gewählt wird in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration und/oder der Konzentration der Schwermetallionen in der Lösung.
11. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung von Glucose in einer wässerigen Lösung, deren Glucosekonzentration elektrisch ausgewertet wird durch eine Differenzschaltung einer pH-sensitiven Bezugselektrode und der pH-sensitiven Meßelektrode, deren ionenempfindlicher Bereich mit einer das Enzym Glucoseoxidase enthaltenden Membran-überzogen wird, dadurch gekennzeichnet, daß am Ausgang der Differenzschaltung ein elektrisches Signal entsteht, das mindestens einer Glucose-Empfindlichkeit von 2 mV/(100 mg du 1) entspricht, insbesondere unter physiologischen Bedingungen des Blutes.
12. Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß insbesondere unter physiologischen Bedingungen des Blutes ein im wesentlichen linearer Meßbereich vorhanden ist, mindestens bis zu einer Konzentration von 3 g Glucose/Liter Lösung.
13. Anordnung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß insbesondere unter physiologischen Bedingungen des Blutes die Membran eine Lebensdauer besitzt, die im Bereich der Raumtemperatur (200C) mindestens einen Monat beträgt.
14. Anordnung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß zum Schutz der pH-sensitiven Bezugselektrode zumindest auf deren ionensensitivem Bereich eine Schicht aufgetragen ist, welche dem Membranträger entspricht.