WO2008018472A1 - Nouvel anticorps monoclonal et son utilisation - Google Patents

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WO2008018472A1
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pac1
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human
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Masahiro Shirakawa
Hiroshi Inooka
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Kyoto University
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Definitions

  • the present invention relates to a plurality of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type I receptors (hereinafter abbreviated as "PAC1") having different antigenic determinants.
  • PAC1 pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type I receptors
  • PAC1 is a receptor for pituitary adenylate cyclase activating polyp tide (hereinafter abbreviated as “PACAP”), a 7-transmembrane type G A protein-coupled receptor (GPCR).
  • PACAP pituitary adenylate cyclase activating polyp tide
  • GPCR 7-transmembrane type G A protein-coupled receptor
  • membrane proteins represented by GPCR are targets for drug discovery, it is important to elucidate their structures and functions. Crystallization of the protein is required for the three-dimensional structure analysis of the protein, but the membrane protein can contribute to the formation of crystals because the hydrophobic region is covered with a surfactant that solubilizes it. Protein surface is limited and it is very difficult to obtain good quality crystals. As for PAC1, good crystals that enable three-dimensional structure analysis have not yet been obtained.
  • the hydrophilic portion can generate an intermolecular interaction sufficient for crystal lattice formation. Attempts have been made to increase the size.
  • a monoclonal antibody that recognizes the hydrophilic portion of the target membrane protein and recognizes the structure (native structure) in which the membrane protein can exhibit its original physiological function is indispensable.
  • Membrane protein As a means of obtaining an antibody capable of recognizing its native structure, a method of immunizing an animal using cells expressing the membrane protein or its membrane fraction as an antigen as it is has been performed. Because of the low expression level on the cell membrane surface, the possibility of obtaining the desired antibody is extremely low. As for PAC1, none of the antibodies reported so far (Non-Patent Documents 1 to 3) have a denatured non-physiological structure and cannot be recognized.
  • PAC1 is a PACAP receptor that is widely distributed from the central nervous system to the peripheral nerves and exerts various physiological functions
  • an antibody that can recognize the native structure of PAC1 is As a substance that binds to PAC1 and modulates the physiological activity of PACAP, it can itself be a drug candidate. Because of its high specificity and long blood half-life, it has excellent side-effects and low drug side effects and long-lasting medicinal properties!
  • PAC1 is a cell surface receptor, it is desirable that therapeutic anti-PAC1 antibodies recognize the extracellular region of PAC1, but all known anti-PAC1 antibodies recognize the cytoplasmic C-terminal region. To understand.
  • an anti-PAC1 monoclonal antibody that can recognize the extracellular region of PAC1 having a native structure is strongly desired.
  • Non-patent literature l Rong_Ming Lyu et al., “The 'Journal' of 'Biological' Chemistry (J. Biol. Chemj j, (USA), Vol. 275, p.36134-36142, 2000)
  • Non-Patent Document 2 Solveig Schulz et al., “Clinical Cancer Res.” (USA), Vol. 10, p.8235-8242, 2004
  • Non-Patent Document 3 ST Anderson et al., “Journal 'of' Neuroendocrinolj, (US), Vol. 17, p.298-305, 2 005
  • Non-Patent Document 4 Tetsuya Ohtaki et al., “The Journal of 'Biological Chemistry (J. Biol. Chemj, (USA), Vol. 273, p.15464-15473, 1998”
  • the present invention provides a novel anti-PAC1 antibody capable of recognizing human PAC1 having a native structure, and a preventive-therapeutic or diagnostic agent for a disease associated with abnormal PAC1 activity by using the antibody. It is intended to provide a method for screening a substance that regulates the expression of PAC1.
  • the present invention provides:
  • a PAC 1 activity modulator comprising the antibody according to [1] above;
  • a PAC 1 activity inhibitor comprising the antibody according to [4] above;
  • a PAC 1 detection agent comprising the antibody according to [1] above;
  • a screening method for a substance that regulates PAC1 expression comprising using the antibody according to [1] above and a PAC1-expressing cell;
  • the novel anti-PAC1 antibody of the present invention can recognize the extracellular region of PAC1 having a native structure, it can bind to PAC1 and regulate its activity in vivo.
  • Diseases associated with abnormal PAC1 activity such as depression, psychobehavioral dysfunction, sexual dysfunction, circadian rhythmic photosynchrony, etc. It is useful as a diagnostic agent for secretion disorders.
  • FIG. 1 shows the apparent binding affinity between a Si9 cell sample and PACAP before and after solubilization of a membrane fraction using an SM1200 / CHS mixed micelle system.
  • FIG. 2 is a diagram showing a scatchyard analysis of membrane fraction (A) and membrane fraction solubilized solution (B).
  • FIG. 3 is a view showing the binding affinity of a membrane fraction lysate for PACAP.
  • FIG. 4 is a diagram showing the binding affinity for PACAP of each eluted fraction obtained by affinity adsorption.
  • FIG. 3 is a diagram showing an apparent binding affinity (B).
  • FIG. 6 Main fraction (A) and affini obtained by hydroxyapatite chromatography. It is a figure showing the Scatchyard analysis for the tea chromatography elution fraction (B)!
  • FIG. 7 shows the binding affinity of the mouse anti-human PAC1 monoclonal IgG antibody (A) obtained in Example 2 and its Fab fragment (B) to the antigen PAC1 receptor.
  • FIG. 8 shows inhibition of binding of PACAP to PAC1 by the mouse anti-human PAC1 monoclonal IgG antibody (A) obtained in Example 2 and its Fab fragment (B).
  • FIG. 9-2 shows inhibition of GTP- ⁇ S binding to PAC1 by the mouse anti-human PAC1 monoclonal IgG antibody obtained in Example 2 (D, ⁇ ).
  • FIG. 10-1 shows the results of competitive ELASA (direct adsorption method) using two different mouse anti-human PAC1 monoclonal IgG antibodies obtained in Example 2 (AF).
  • FIG. 10-2 shows the results of competitive ELASA (direct adsorption method) using two different mouse anti-human PAC1 monoclonal IgG antibodies obtained in Example 2 (G to U).
  • FIG. 10-3 shows the results of competitive ELASA (direct adsorption method) using two different mouse anti-human PAC1 monoclonal IgG antibodies obtained in Example 2 (M to R).
  • FIG. 10-4 is a diagram showing the results of competitive ELASA (direct adsorption method) using two separate mouse anti-human PAC1 monoclonal IgG antibodies obtained in Example 2 (S to V).
  • the present invention provides a novel anti-PAC1 antibody (hereinafter also referred to as “the antibody of the present invention”) capable of recognizing PAC1 having a native structure.
  • “native structure jt” means a structure in a state where PAC1 can exert its original physiological function, that is, any structure which can be taken in a state naturally existing in a cell membrane of a living body. Since it is a GPCR, it is in an activated state (ie, a state in which PACAP or another PAC1 agonist is bound) and in an inactivated state (a state in which a ligand is bound! /, NA! /, Or an antagonist is bound). However, the structure in any state corresponds to the “native structure” in the present invention.
  • the antibody of the present invention may have any part of PAC1 as an antigenic determinant as long as it can recognize PAC1 having a native structure, but the purified PAC1 / surfactant complex Is preferably used as an immunogen, so preferably one of the hydrophilic regions of PAC1 (i.e., N-terminal region, extracellular first to third loop region, cytoplasmic first to third loop region, C-terminal region) is selected. More preferably, it recognizes one of the extracellular regions (that is, the N-terminal region and the extracellular first to third loop regions). Since the antibody of the present invention that recognizes an extracellular region can bind to PAC1 expressed on the surface of an intact cell, it is particularly advantageous for use as an antibody drug.
  • the purified PAC1 / surfactant complex Is preferably used as an immunogen, so preferably one of the hydrophilic regions of PAC1 (i.e., N-terminal region, extracellular first to third loop region, cytoplasmic first to third loop region,
  • the isotype of the antibody of the present invention is not particularly limited, but preferably IgG, IgM or IgA, particularly preferably IgG.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it has at least a complementarity determining region (CDR) for specifically recognizing and binding to a target antigen.
  • CDR complementarity determining region
  • It may be a conjugate molecule prepared by genetic engineering such as Diapody, or a derivative thereof modified with a molecule having a protein stabilizing action such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • An antibody against PAC1 can be produced according to a known method for producing an antibody or antiserum.
  • Antigens used to prepare the antibodies of the present invention include PAC1 or a partial peptide thereof, or a peptide having one or more of the same antigenic determinants, or a (synthetic) peptide having two or more types. You can also use these things.
  • PAC1 or a partial peptide thereof is prepared, for example, by (a) a known method from a warm-blooded animal tissue or cell such as a human, monkey, rat, mouse, or chicken, or a method analogous thereto, (b) a peptide ' ⁇ Chemically synthesized by a known peptide synthesis method using a synthesizer, etc. (c) Culture of transformants containing DNA encoding PACl or its partial peptide, or (d) PAC1 or its partial peptide It is produced by biochemical synthesis using a cell-free transcription / translation system in the form of a coding nucleic acid.
  • the PAC1 protein used in the present invention is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • PAC1 is, for example, a mammalian cell (eg, human, mouse, rat, rabbit, hidge, pig, ushi, horse, cat, inu, monkey, chimpanzee, etc.) [eg, hepatocyte, spleen cell, nerve Cells, glial cells, ⁇ / 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langeron cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, fat Cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone Cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells or cancer cells, etc.], or any tissue or
  • It may also be a protein synthesized chemically or biochemically with a cell-free translation system! /, Or produced from a transformant into which a nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence is introduced. It may be a recombinant protein.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Examples thereof include amino acid sequences having a homology of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more.
  • “homology” refers to an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm is used to align sequences for optimal alignment). The ratio of the same amino acid residue and similar amino acid residues to all overlapping amino acid residues in one or both of which can be considered).
  • Similar amino acids means amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, lie, Val), polar amino acids (Gln, Asn). ), Basic Classified into the same groups such as amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) Amino acids are mentioned. It is expected that such substitution with similar amino acids does not change the protein phenotype (ie, is a conservative amino acid substitution). Specific examples of conservative amino acid substitutions are well known in the art and have been described in various literature (see, for example, Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)).
  • NCBI BLAST National and enter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • Other algorithms for determining amino acid sequence homology include, for example, Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 ersion 2.0) (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))], Needleman et al., J. Mol.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is not less than about 60%, preferably not less than about 70%, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence has about 80% or more, particularly preferably about 90% or more identity.
  • Examples of a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Substantially the same as the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A protein having quality activity is preferred.
  • Substantially the same activity includes, for example, ligand (ie, PACAP) binding activity and signal transduction activity (eg, adenylate cyclase stimulating activity (increased cAMP production), conjugated trimeric G protein GTP derivative binding activity, phospholipase C stimulating activity (intracellular Ca concentration increase), and the like.
  • ligand ie, PACAP
  • signal transduction activity eg, adenylate cyclase stimulating activity (increased cAMP production), conjugated trimeric G protein GTP derivative binding activity, phospholipase C stimulating activity (intracellular Ca concentration increase), and the like.
  • “Substantially the same quality” indicates that their activities are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) the same. Therefore, it is preferable that the activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (for example, about 0.5 to about 2 times)! /, Force S, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular
  • the PAC1 used in the present invention includes, for example, (1) most of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 (preferably about 1 to 100, preferably Amino acid sequence IJ from which about 1 to 50, more preferably about 1 to 10, particularly preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acids have been deleted, (2) SEQ ID NO: 2 or more in the amino acid sequence represented by 2 (preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 50, more preferably about 1 to 10, particularly preferably 1 to several.
  • Amino acid sequence IJ with (2, 3, 4 or 5) amino acids added (3) SEQ ID NO: 2 or more (preferably about 1-50) Preferably, about 1 to 10, more preferably 1 to several (2, 3, 4 or 5) amino acid sequences IJ, (4) SEQ ID NO: 2 or more of the amino acid sequences represented by 2 (preferably about 1-50, preferably about 1-10, more preferably 1-number (2, 3, 4, or 5)
  • SEQ ID NO: 2 or more of the amino acid sequences represented by 2 preferably about 1-50, preferably about 1-10, more preferably 1-number (2, 3, 4, or 5)
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited as long as the activity of the protein is maintained.
  • PAC1 used in the present invention is preferably a human PAC1 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (GenBank accession number: NP_001109), or an ortholog thereof in other mammals [for example, Mouse and rat orthologs registered in GenBank as accession numbers NP_03 1433 and NP_598195 respectively. G) about 87.5% and about 87.3% identity to PAC1).
  • PA C1 used in the present invention including a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, has a C-terminal carboxyl group (—COOH), carboxylate (—COO—), amide (—CO NH) or ester (-COOR)! /
  • R in the ester is, for example, C alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropylene, n-butyl; for example, cyclopentyl, cyclohexyl, etc.
  • C cycloalkyl group for example, C aryl group such as phenyl, ⁇ _naphthyl;
  • ⁇ _Naphthyl C C aralkyl group such as an alkyl group; bivalyloxymethyl group
  • the carboxyl group may be amidated or esterified! /, which is also included in the protein of the present invention. It is.
  • ester in this case, for example, the C-terminal ester described above is used.
  • the amino group of the amino acid residue at the terminus is a protecting group (for example, C acyl group such as C alkanol such as formyl group, acetyl group, etc.).
  • Protected can be generated by cleavage in vivo ⁇ Glutamine residue at the terminal is pyroglutamine oxidized, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (eg -OH, -SH, amino group) , Imidazole groups, indole groups, guanidino groups, etc.) are protected with appropriate protecting groups (eg C acyl groups such as C alkanoyl groups such as formyl and acetyl groups).
  • glycoprotein to which a sugar chain is bound for example, in the case of human PAC1, the Asn residue represented by amino acid numbers 28, 40, 97, 280 and 355 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, for example (Including GPCR database (based on GTP database (http://br.expasy.org/uniprot/PACR_HUMAN))] and other complex proteins.
  • the partial peptide of PAC1 is a peptide having the partial amino acid sequence of PAC1 described above. As long as it has substantially the same activity as PAC 1, any of them may be used.
  • “substantially the same quality of activity” has the same meaning as described above. In addition, “substantially the same quality of activity” can be measured in the same manner as in PAC 1.
  • a region involved in binding to the ligand PACAP for example, in the case of human PAC 1, SEQ ID NO: 2 In the extracellular region (GPCR database (http: // br. Expasy. Org / uniprot / PACR_HUMAN) indicated by amino acid numbers 1-135, 186-207, 272-289 and 352-365 in the amino acid sequence represented by And other regions involved in signal transduction through interaction with PACAP [for example, it binds to the ⁇ subunit (G a) of the trimeric G protein and promotes its GDP-GTP exchange reaction.
  • GPCR database http: // br. Expasy. Org / uniprot / PACR_HUMAN
  • a region having a partial amino acid sequence including a region having a region is used.
  • the size of the partial peptide of PAC 1 is not particularly limited, but includes, for example, a partial amino acid sequence consisting of 10 or more, preferably 30 or more, more preferably 100 or more, more preferably 200 or more amino acid residues. Things.
  • the partial amino acid sequence may be a single continuous partial amino acid sequence, or may be a concatenation of a plurality of discontinuous partial amino acid sequences! /.
  • the partial peptide of PAC 1 may have any one of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO—), an amide (—CONH), or an ester (—COOR) at the C-terminus.
  • R in the ester include those described above for PAC 1.
  • those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of PAC 1. In this case, for example, the same ester as the C-terminal ester is used.
  • the amino acid residue of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group
  • the glutamine residue of the N-terminal is pyroglutamine oxidized
  • the substituents on the side chains of amino acids in the molecule are protected with an appropriate protecting group, or glycopeptides bound to sugar chains! /, Complex peptides such as so-called glycopeptides.
  • PAC 1 or a partial peptide thereof used in the present invention may be in the form of a salt.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • base eg, alkali metal
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid).
  • PAC1 can be produced from the aforementioned mammalian cells or tissues by a known protein purification method. Specifically, after homogenizing mammalian tissues or cells and removing cell debris by low-speed centrifugation, the supernatant is centrifuged at a high speed to precipitate the cell membrane-containing fraction (if necessary, such as by density gradient centrifugation). PAC1 or a salt thereof can be prepared by purifying the cell membrane fraction) and subjecting the fraction to chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and affinity matrix. As described later, in a preferred embodiment of the present invention, PAC1 is purified as a PAC1 / surfactant complex from the cell membrane-containing fraction using an appropriate surfactant.
  • PAC1 or a partial peptide thereof (hereinafter, in the description of chemical synthesis, unless otherwise specified, these are simply referred to as “PAC1”) may be produced according to known peptide synthesis methods. it can.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by removing the protecting group.
  • condensation and the removal of the protecting group are carried out according to a method known per se, for example, the method described in the following (1) to (5).
  • PAC 1 thus obtained can be purified and isolated by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • PAC 1 obtained by the above method is a free form
  • the free form can be converted to an appropriate salt by a known method or a method according thereto, and conversely, PAC 1 is converted into a salt.
  • the salt can be converted to a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be used for the synthesis of PAC 1.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl.
  • amino acid having an amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the desired PAC 1 sequence according to various condensation methods known per se.
  • proteins, etc. are excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the desired PAC 1 or its amide.
  • the ability to use various activation reagents that can be used for protein synthesis examples include DCC, N, N, -diisopropyl carpositimide, N-ethyl-N,-(3-dimethylaminoprolyl) carpositimide.
  • a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is activated in advance as a symmetric anhydride, HOBt ester or HOOBt ester. Once done, it can be added to the resin.
  • a racemization inhibitor for example, HOBt, HOOBt
  • Solvents used for the activation of protected amino acids and condensation with resins are used in protein condensation reactions. It may be appropriately selected from known solvents that can be used. For example, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, acid amides such as N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and blackform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitryl, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof, etc.
  • solvents such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, acid amides such as N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and blackform
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for protein bond forming reaction, and is usually selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C.
  • Activated amino acid derivatives are usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protection group, the removal of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1-Z, Br-Z, and adamantyl.
  • Oxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, forminole, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc, etc. are used.
  • the carboxyl group is, for example, alkyl esterified (for example, straight chain such as methyl, ethyl, propinole, butinole, tertiary butinole, cyclopentinole, cyclohexinole, cycloheptinole, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified for example, straight chain such as methyl, ethyl, propinole, butinole, tertiary butinole, cyclopentinole, cyclohexinole, cycloheptinole, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Branched or cyclic alkyl ester esterification branched or cyclic alkyl ester esterification
  • aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester ester, 4-methoxybenzeno ester ester, 4-chlorobenzene ester ester, benzhydrino ester Protection
  • phenacyl esterification benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected by, for example, esterification or etherification.
  • Examples of the group suitable for esterification include a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycananol group.
  • Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a t_butyl group.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, CI-Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like.
  • protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylolenesulfonyl, DNP, benzyloxymethylol, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfone.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfone.
  • Acid treatment with acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture of these, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. Can also be used.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C.
  • the activated carboxyl group of the raw material includes, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 -Esterol with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like.
  • active ester alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 -Esterol with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt) and the like.
  • activated amino group of the raw material include a corresponding amino acid phosphate. Is used.
  • the PAC 1 ester can be obtained, for example, by condensing the ⁇ -carboxyl group of the carboxy-terminal amino acid with the desired alcohol to form an amino acid ester, and then, in the same manner as the PAC 1 amide.
  • a partial peptide of PAC 1 can also be produced by cleaving the full-length protein of PAC 1 with an appropriate peptidase.
  • PAC 1 used as an immunogen in the present invention or a partial peptide thereof has a native structure (in the case of a partial peptide, it exhibits a function equivalent to the original physiological function of PAC 1. It is preferably prepared as a complex with a vegous surfactant capable of retaining the structure in a state where it can be maintained. Therefore, ⁇ AC 1 or a partial peptide thereof chemically synthesized as described above is preferably mixed with an appropriate surfactant prior to immunization to an animal so that its hydrophobic region is interfaced. Prepared in a complex covered with activator micelles.
  • PAC 1 can also be produced by culturing a transformant containing a nucleic acid encoding it and separating and purifying PAC 1 from the resulting culture.
  • the nucleic acid encoding PAC 1 or a partial peptide thereof may be DNA, RNA, or a DNA / RNA chimera.
  • DNA is used.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. If double stranded, double stranded DNA, double stranded RNA or D NA: RNA hybrids may also be used. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • DNA encoding PAC1 or a partial peptide thereof includes genomic DNA, mammals (eg, human, ushi, monkey, horse, pig, hidge, goat, nu, cat, guinea pig, rat, mouse, usagi).
  • mammals eg, human, ushi, monkey, horse, pig, hidge, goat, nu, cat, guinea pig, rat, mouse, usagi.
  • Smooth muscle cells fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, Monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chond
  • genomic DNA and cDNA encoding PAC1 or its partial peptide use the genomic DNA fraction and total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell-tissue as cocoons, respectively. Amplification can also be carried out directly by “PCR method” and reverse transcriptase-PCR (hereinafter abbreviated as “RT_PCR method”). Alternatively, genomic DNA and cDNA encoding PAC1 or its partial peptides can be obtained by inserting genomic DNA prepared from the cells and tissues described above and total RNA or mRNA fragments into an appropriate vector. Libraries and cDNA libraries can be cloned from scratch by colony or plaque hybridization method or PCR method, respectively. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • DNA encoding PAC1 examples include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or high under stringent conditions with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Examples thereof include DNA that encodes a protein that contains a base sequence to be blizzarded and has substantially the same quality of activity as PAC1 (eg, ligand binding activity, signal transduction activity, etc.).
  • DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 70% or more, with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. More preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more is used.
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search ⁇ ool
  • the above-mentioned homology calculation algorithm for amino acid sequences is also preferably exemplified.
  • Hybridization may be performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, Molecular Cloning Second Edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be carried out according to the method described in the above. In addition, when using a commercially available library, hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization can be performed preferably according to stringent conditions.
  • Highly stringent conditions include, for example, a hybridization reaction at 45 ° C in 6 X SSC (sodium chloride / sodium cirate), followed by one at 65 ° C in 0.2 X SSC / 0.1% SDS. Cleaning more than once.
  • X SSC sodium chloride / sodium cirate
  • the salt concentration of the hybridization solution the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, By appropriately changing the washing temperature and the like, the desired stringency can be easily adjusted.
  • DNA encoding the [0044] PAC1 is preferably SEQ ID NO: DNA containing the base sequence encoding the human PAC1 protein represented by the nucleotide sequence represented by 1 (GenB an k ⁇ click Session ID: N M_001118) Or other orthologs in other mammals (eg GenBank These are mouse and rat orthologs registered as the accession numbers NM_007407 and NM_133511, respectively.
  • DNA encoding a partial peptide of PAC1 includes a base sequence encoding a peptide having the same or substantially the same amino acid sequence as part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and Any one may be used as long as it encodes a peptide having an equivalent physiological activity.
  • DNA encoding the partial peptide of PAC1 for example, (1) a partial base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (2) a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 DNA encoding a peptide having a base sequence that is hybridized under stringent conditions and having substantially the same activity as PAC1 (eg, ligand binding activity, signal transduction activity, etc.) Used.
  • DNA encoding PAC1 or a partial peptide thereof is amplified by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of a base sequence encoding PAC1 or a partial peptide thereof, or an appropriate expression vector.
  • the DNA incorporated into can be cloned by hybridization with a DNA fragment encoding a part or all of the PAC1 protein or a labeled synthetic DNA.
  • Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning, Second Edition (described above). When a commercially available library is used, the hybridization can be performed according to the method described in the instruction manual attached to the library.
  • the DNA base sequence can be determined using known kits such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc. Conversion can be carried out according to a method known per se such as duplex method or unkel method or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA can be used as it is depending on the purpose, or if necessary, after digestion with a restriction enzyme, or after adding a linker.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation start codons and translation stop codons are It can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • An expression vector containing DNA encoding PAC1 or a partial peptide thereof is, for example, P
  • plasmids derived from E. coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, pUBllO, pTP5, pC194
  • yeast eg, pSH19, pSH15
  • insects Cell expression plasmids eg pFast-Bac
  • animal cell expression plasmids eg pAl-ll, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo
  • Bacteriophages such as lambda phage
  • Insects such as baculovirus Virus vectors (eg, BmNPV, AcNPV); retrovirus,
  • any promoter that is appropriate for the host used for gene expression can be used!
  • SRa promoter SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter motor, MoMuLV (moroni murine leukemia virus) LTR, HSV- The TK (simple herpesvirus thymidine kinase) promoter is used.
  • CMV promoter, SRa promoter and the like are preferable.
  • trp promoter When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ promoter, lpp promoter, T7 promoter and the like are preferable.
  • the host is a Bacillus
  • SP01 promoter, SP02 promoter, penP plug motor, etc. are preferred.
  • the host is yeast, the PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • polyhedrin promoter When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter, etc. are preferred.
  • the expression vector may be, as desired, an enzyme, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter abbreviated as SV40 ori).
  • Selectable markers include, for example, dihydrofolate reductase gene (hereinafter abbreviated as dhfr, methotrexate (MTX) resistance), ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as am), neomycin resistance Gene (hereinafter sometimes abbreviated as nee /, G418 resistance) and the like.
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster cells are used and the dhfr gene is used as a selection tool, the target gene is selected using a medium not containing thymidine.
  • a base sequence that encodes a signal sequence that matches the host (signal codon) to the 5 'end of the DNA encoding PAC1 or its partial peptide, or replace it with a native signal codon) May be.
  • the host is Escherichia, PhoA 'signal sequence, OmpA' signal sequence, etc.
  • PAC1 or a partial peptide thereof can be produced by transforming the host with an expression vector containing DNA encoding PAC1 or a partial peptide thereof and culturing the resulting transformant.
  • Escherichia for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia coli 12-DHl Escherichia coli JM103, Escherichia coli JA221, Escherichia coli HB101, Escherichia coli C600, and the like.
  • Bacillus bacteria examples include Bacillus subtilis MI114, Notils subtilis 207-21, and the like.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae A H22, AH22R—, NA87-11A, DKD-5D, 20B_12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris ) M71 etc. are used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, a larvae-derived cell line derived from night steal (Spodoptera frugiperda cell; Si
  • the virus is BmNPV
  • insect-derived cell lines (Bombyx mori N cells; BmN cells) are used as insect cells.
  • the Si ⁇ field include Si9 cells (ATCC CRL1711), Si21 cells, and the like.
  • insects examples include silkworm larvae.
  • animal cells include COS_7, Vero, CHO, CHO (dhfr-), CHO_Kl, L, AtT-20, GH3, F HEK293, MH3T3, Balb3T3, FM3A, L929, SP2 / 0, P3U1, Cells such as B16 and P388 are used.
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host.
  • Escherichia can be transformed according to the method described in, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982).
  • Bacillus can be transformed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • Yeast can be transformed according to the method described in, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 75, 1929 (1978). Cells and insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, Vol. 6, 47-55 (1988).
  • Animal cells can be transformed according to the method described in, for example, Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experimental Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). Touch with S.
  • Culture of the transformant can be performed according to a known method depending on the type of the host.
  • a liquid medium is preferable as a medium used for the culture.
  • the medium is transformed It is preferable to contain a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for body growth.
  • the carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • the nitrogen source for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal.
  • inorganic substances such as potato extract or inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added to the medium.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to about 8.
  • M9 medium containing glucose, casamino acid is preferred. If necessary, a drug such as 3 ⁇ -indolylacrylic acid may be added to the medium in order to make the promoter work efficiently.
  • Culturing of the transformant whose host is the genus Escherichia is usually performed at about 15 to about 43 ° C. for about 3 to about 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • the transformant whose host is Bacillus is usually cultured at about 30 to about 40 ° C. for about 6 to about 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • Examples of a medium for culturing a transformant whose host is yeast include a Burkholder minimum medium and an SD medium containing 0.5% casamino acid.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to about 8.
  • the culture is usually performed at about 20 ° C to about 35 ° C for about 24 to about 72 hours. Aeration and agitation may be performed as necessary.
  • a medium for culturing a transformant whose host is an insect cell or an insect for example, a medium appropriately added with an additive such as 10% sushi serum inactivated in Grace's Insect Medium is used.
  • the pH of the medium is preferably about 6.2 to about 6.4.
  • the culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to about 5 days. You may perform ventilation
  • a medium for culturing a transformant whose host is an animal cell for example, a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to about 20% fetal urine serum, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI 1640 Medium, 199 medium, etc. are used.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to about 8.
  • the culture is usually performed at about 30 ° C. to about 40 ° C. for about 15 to about 60 hours. Vent and agitate as necessary! /.
  • the force S can be used to produce PAC1 or a partial peptide thereof inside or outside the transformant.
  • PAC1 or a partial peptide thereof can be separated and purified according to a method known per se.
  • microbial cells or cells collected from the culture by a known method are suspended in an appropriate buffer, homogenizer method, ultrasound, lysozyme and / or freeze-thaw. After disrupting the cells or cells, etc., precipitate and remove the cell debris by low-speed centrifugation, and precipitate the cell membrane-containing fraction by high-speed centrifugation of the supernatant (purify the cell membrane fraction by density gradient centrifugation if necessary) Method) is used.
  • Isolation and purification of PAC1 or a partial peptide thereof contained in the membrane fraction thus obtained can be performed according to a method known per se.
  • Such methods include methods that utilize solubility, such as salting-out solvent precipitation; dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method using a charge difference such as ion exchange chromatography, a method using a specific affinity such as affinity chromatography, and a hydrophobic difference such as reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • the method of using; the method of using the difference in isoelectric point such as isoelectric focusing method; These methods can be combined as appropriate.
  • the free form can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and the protein or peptide can be converted into a salt.
  • PAC1 produced by the transformant or its partial peptide may be optionally modified or partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme examples include trypsin, chymotrypsin, anolegininorenopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • PAC1 is appropriately selected from the membrane fraction. It is purified as a PAC1 / surfactant complex using the appropriate surfactant.
  • PAC1 or a partial peptide thereof is a cell-free protein comprising a rabbit reticulocyte lysate, a wheat germ lysate, an Escherichia coli lysate, etc., with the RNA corresponding to the DNA encoding PAC1 or a partial peptide thereof as a saddle type
  • a cell-free transcription / translation system that further contains RNA polymerase can be used to synthesize DNA encoding PAC1 or a partial peptide thereof as a saddle type.
  • the cell-free protein transcription / translation system can be a commercially available one, or a method known per se, specifically, Escherichia coli extract can be obtained from Pratt JM et al., “Transcription and Translation”, edited by Hames BD and Higgins SJ, It can also be prepared according to the method described in IRL Press, Oxford 179-209 (1984).
  • Examples of commercially available cell lysates include E. coli S30 extract system (Promega) and RTS 500 Rapid Translation Sy stem (Roche) derived from E. coli, and Rabbit Reticulocyt derived from rabbit reticulocytes.
  • e Lysate System manufactured by Promega
  • PROTEIOS TM manufactured by TOYOBO
  • TOYOBO wheat germ lysate
  • Methods for preparing wheat germ lysates are described in, for example, Johnston FB et al., Nature, 179, 160-161 (1957) or Erickson ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ et al., Meth. Enzymol., 96, 38-50 (1996). The method can be used.
  • PAC1 or a partial peptide used as an immunogen in the present invention has a native structure (in the case of a partial peptide, it can exhibit a function equivalent to the original physiological function of PAC1. It is preferably prepared as a complex with a veg surfactant capable of maintaining the structure in the state). Therefore, it is synthesized in a cell-free system as described above. PAC1 or a partial peptide thereof is preferably prepared into a complex in which its hydrophobic region is covered with surfactant micelles by mixing with an appropriate surfactant prior to immunization to animals.
  • a partial peptide of PAC1 can be directly immunized if it has immunogenicity, but has a low molecular weight (for example, molecular weight) having only one or several antigenic determinants in the molecule.
  • antigens of about 3,000 or less
  • these antigens are usually immunogenic low-hapten molecules, and therefore can be immunized as a complex bound or adsorbed to an appropriate carrier (carrier).
  • carrier A natural or synthetic polymer can be used as the carrier. Examples of natural polymers include serum albumin of mammals such as rabbits, rabbits, and humans, and thyroglobulins of mammals such as rabbits and rabbits, such as chicken ovoalbumin, such as rabbits, rabbits, humans, and hedges.
  • Mammalian hemoglobin, keyhole limpet hemocyanin (KLH), etc. are used.
  • the synthetic polymer include various latexes such as polymers or copolymers such as polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polybules, and polypropylenes.
  • the mixing ratio of the carrier and the hapten is such that any antibody can be bound at any ratio as long as an antibody against the antigen bound or adsorbed to the carrier is efficiently produced!
  • the above natural or synthetic polymer carrier which is usually used for the production of antibodies against haptens, is bound or adsorbed at a ratio of 0.1 to 100 with respect to hapten 1 by weight. be able to.
  • Various condensing agents can be used for force pulling of the hapten and the carrier.
  • diazonium compounds such as bis-diazotized benzidine that crosslinks tyrosine, histidine, and tributophane, dialdehyde compounds such as dartal aldevito that crosslinks amino groups, diisocyanate compounds such as toluene-2,4-diisocyanate, thiol groups
  • dimaleimide compounds such as N, N, -0-phenylene dimaleimide, a maleimide active ester compound that crosslinks an amino group and a thiol group, and a carpositimide compound that crosslinks an amino group and a carboxyl group are advantageously used.
  • an active ester reagent having a dithiopyridyl group on one amino group for example, N_ (2-pyridyldithio) propionate N-succinimidyl (SPDP), etc.
  • SPDP N-pyridyldithio
  • a warm-blooded animal or insect cell expressing PAC1 itself or a cell membrane-containing fraction thereof can be directly used as an antigen.
  • warm-blooded animal or insect cells use of cells that produce PAC1 endogenously, cells transformed with DNA encoding PAC1, etc. It is more preferable to use transformed cells in which exogenous PAC1 is forcibly expressed in large quantities.
  • the membrane fraction can be fused with ribosomes using various known methods and used as proteoribosomes. For example, after mixing the membrane fraction and ribosome at an appropriate ratio, freeze and thaw repeatedly, and after placing an aqueous solution containing the membrane fraction on the prepared film, the membrane protein is added by the hydration method.
  • a method of transferring to a lipid bilayer can be used for this purpose.
  • the freeze-thaw method is preferable.
  • the obtained proteoribosome can be sized by an ultrasonic treatment method, a homogenizer method, a filtration method (Etastruder method) or the like.
  • These cells or membrane fractions can be injected into an immunized animal while suspended in a medium (eg, RPMI1640) or a buffer (eg, Hanks' Balanced Salt Solution).
  • a medium eg, RPMI1640
  • a buffer eg, Hanks' Balanced Salt Solution
  • any method that can promote antibody production may be used, preferably intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, or subcutaneous injection.
  • PAC1 or a partial peptide thereof used as an immunogen is provided as a complex with an appropriate surfactant.
  • PAC is a partial peptide (hereinafter abbreviated as “PAC1” in the description of complex preparation with surfactants! /). Solubilization with a surfactant is required for separation and purification. To solubilize membrane proteins without denaturation, a series of nonionic or zwitterionic surfactants called mild detergents are used. In order to efficiently obtain an antibody capable of recognizing PAC1 having a native structure, it is necessary to use a PAC1 / surfactant complex with excellent antigen-presenting ability as an immunogen. A big influence.
  • the present inventors have selected from among various surfactants having different sizes, a sucrose monoalkylate having an alkyl chain having 8 to 12 carbon atoms, preferably ⁇ _D -fructoviranosyl- ⁇ -darcopyranosi Domo Nododecanoate (SM1200) force, or alkyl-13-D-manoletoside with 8 to 12 carbon atoms, preferably dodecyl- / 3-D-maltoside (DDM), etc., PAC1 / surfactant complex with excellent antigen presenting ability Found that the body can be provided.
  • a sucrose monoalkylate having an alkyl chain having 8 to 12 carbon atoms
  • SM1200 ⁇ _D -fructoviranosyl- ⁇ -darcopyranosi Domo Nododecanoate
  • DDM dodecyl- / 3-D-maltoside
  • the antigen presenting ability of the PAC1 / surfactant complex can be further improved.
  • the mixing ratio of the surfactant and the amphiphile is not particularly limited. However, when a mixed micelle of SM1200 and CHS is used, for example, the mixing ratio is preferably 10: 1 to 10: 3.
  • the concentration of the surfactant used as the solubilizer is usually in the range of about 0.5 to about 5% (w / w).
  • PAC1 it is preferable to use a cell membrane-containing fraction of a warm-blooded animal or insect cell (preferably a transformed cell in which exogenous PAC1 is forcibly expressed) expressing PAC1! /
  • the above surfactant including mixed micelles with amphiphile
  • the protein concentration is about 1 to about 5 mg / mL, and about 0 to about 0 to about 20 ° C. Incubate for 5 to about 24 hours to solubilize membrane proteins.
  • the above reaction solution is brought into contact with a water-insoluble carrier (for example, glass beads, resin, gel, etc.) on which PACAP is solid-phased, and the PAC1 / surfactant activity is utilized using the PACAP-PAC1 affinity.
  • a water-insoluble carrier for example, glass beads, resin, gel, etc.
  • the PAC1 / surfactant activity is utilized using the PACAP-PAC1 affinity.
  • This can be achieved by trapping the agent complex on a carrier.
  • a tag sequence eg, His-tag, GST-tag, Myc-tag, MBP-tag, etc.
  • Appropriate peptidase recognition site is added to the PAC1 and tag junction.
  • the immunogen prepared as described above is itself administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible by an administration method such as intraperitoneal injection, intravenous injection, subcutaneous injection, or intradermal injection. It is administered alone or with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually once every 1 to 6 weeks, 2 to 10 times in total. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, rats, musters, hedges, goats, donkeys, and chickens. To avoid problems with anti-Ig antibody production, Although mammals of the same species as the subject are preferably used, mice and rats are generally preferably used for the production of monoclonal antibodies.
  • human immunization to humans is ethically difficult, when the antibody of the present invention is to be administered to humans, (i) a human antibody-producing animal produced according to the method described later ( Example: Mouse) is immunized to obtain human antibody, (ii) Chimeric antibody, humanized antibody or fully human antibody is prepared according to the method described later, or (iii) In vitro immunization method and virus cell immortalization, It is preferable to obtain a human antibody by combining human-human (or mouse) hyperpridoma production technology, phage display method and the like.
  • Animal cells used for in vitro immunization include lymphocytes isolated from the peripheral blood, spleen, lymph nodes, etc. of humans and warm-blooded animals (preferably mice and rats), preferably B lymphocytes, etc. Is mentioned.
  • lymphocytes isolated from the peripheral blood, spleen, lymph nodes, etc. of humans and warm-blooded animals (preferably mice and rats), preferably B lymphocytes, etc. Is mentioned.
  • mouse and rat cells extract animal spleen from about 4 to 12 weeks of age ⁇ Isolate spleen cells and use appropriate medium (eg Dulbecco's modified Eagle medium (D MEM), RPMI1640 medium, Ham F12 medium, etc. ), And then suspended in a medium supplemented with fetal urine serum (FCS; about 5 to 20%) containing the antigen and cultured for about 4 to 10 days using a CO incubator.
  • the antigen concentration for example 0.05 to 5 8 including but not limited to. It is preferable to prepare thymocyte
  • antibody titers In the production of monoclonal antibodies, some individuals have been found to have increased antibody titers from warm-blooded animals (eg, mice, rats) or animal cells (eg: humans, mice, rats) immunized with the antigen. Alternatively, select a cell population, collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization, or culture for 4 to 10 days after in vitro immunization, collect the cells, and isolate antibody-producing cells.
  • Antibody-producing hyperpridoma can be prepared by fusing with myeloma cells. The antibody titer in serum can be measured, for example, by reacting a labeled antigen with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • Myeloma cells are not particularly limited as long as they can produce hybridomas that secrete a large amount of antibody, but cells that do not produce or secrete antibodies are preferred, and cell fusion efficiency is high. Those are more preferred.
  • a HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • mouse myeloma cells are NS_1, P3U1, SP2 / 0, AP_1, etc.
  • rat myeloma cells are R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, etc.
  • Human myeloma cells are SKO-007, GM 1500- 6TG_2, LICR-LON-HMy2, UC729-6 and the like.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG), Sendai virus, and the like, preferably PEG.
  • the molecular weight of PEG is not particularly limited, but PEG1000 to PEG6000 having low toxicity and relatively low viscosity are preferable.
  • the PEG concentration include about 10 to 80%, preferably about 30 to 50%.
  • Serum-free medium eg RPMI 16 40
  • complete medium containing about 5-20% serum various buffer solutions such as phosphate buffered saline (PBS), Tris buffer, etc. Can do.
  • DMSO eg, about 10 to 20%
  • the pH of the fusion solution is, for example, about 4 to 10, preferably about 6 to 8.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells is usually about 1: 1 to 20: 1, usually 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C.
  • cell fusion can be carried out efficiently by incubating for 1 to 10 minutes.
  • Antibody-producing cell lines can also be obtained by infecting antibody-producing cells with a virus capable of transforming lymphocytes to immortalize the cells.
  • viruses include Epstein Barr (EB) virus.
  • EB Epstein Barr
  • Recombinant EBs that retain the ability to immortalize B lymphocytes but lack the ability to replicate viral particles (for example, the transition from a latent infection state to a lytic infection state) It is also preferable to use a deficiency in the switch gene).
  • B lymphocytes can be easily transformed by using the culture supernatant.
  • serum and a medium supplemented with penicillin / streptomycin (P / S) eg, RPMI1640
  • a serum-free medium supplemented with cell growth factors the culture supernatant is separated by filtration or centrifugation,
  • Antibody-producing B lymphocytes are suspended at an appropriate concentration (eg, about 10 7 cells / mL), and incubated at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, usually for about 0.5 hours to 2 hours. By doing so, an antibody producing sputum cell line can be obtained.
  • Hedge erythrocytes bound with a soluble antigen can be mixed with antibody-producing rabbit lymphocytes, and a lymphocyte specific for the target antigen can be selected by separating rosettes using a density gradient such as Percoll.
  • antigen-specific sputum lymphocytes are capped and no longer present IgG on the surface, so when mixed with anti-IgG antibody-bound Hudge erythrocytes, antigen-specific B lymphocytes Only the ball forms a rosette. Therefore, antigen-specific B lymphocytes can be selected by collecting a rosette non-forming layer from this mixture using a density gradient such as Percoll.
  • Human antibody-secreting cells that have acquired infinite proliferation ability by transformation can be back-fused with mouse or human myeloma cells in order to stably maintain the antibody-secreting ability.
  • myeloma cells the same ones as described above can be used.
  • Hypridoma screening and breeding is usually performed by adding HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine), and adding 5-20% FCS animal cell culture medium (eg RPMI1640) or cell growth factor. Performed in serum-free medium.
  • the concentrations of hypoxanthine, aminopterin, and thymidine are, for example, about 0.1 mM, about 0.4 ⁇ M, and about 0.016 mM, respectively. Is mentioned.
  • Tubine resistance can be used to select human-mouse hyperpridoma. Since human cell lines sensitive to Uwabain is higher than the mouse cell line, can be eliminated unfused human cells by adding to the culture medium at 10_ 7 ⁇ 10- 3 M about.
  • a feeder cell or a certain type of cell culture supernatant for selection of the hyperidoma.
  • radiation is applied to a cell line that can produce a large amount of a growth factor useful for the appearance of a hyperidoma, which is a heterogeneous cell type with a limited survival period so that it can die by helping the appearance of the hyperidoma.
  • a growth factor useful for the appearance of a hyperidoma
  • those with reduced proliferation ability are used.
  • mouse feeder cells include spleen cells, macrophages, blood, thymic cells and the like
  • human feeder cells include peripheral blood mononuclear cells and the like.
  • the cell culture supernatant include primary culture supernatants of various cells described above and culture supernatants of various cell lines.
  • Hypridoma can also be selected by separating the cells that bind to the antigen using a fluorescence activated cell sorter (FACS) after the antigen is fluorescently labeled and reacted with the fused cells.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • Power S can be. In this case, since it is possible to directly select a hyperidoma that produces an antibody against the target antigen, it is possible to greatly reduce the labor of crawling.
  • Various methods can be used to clone a hybridoma producing a monoclonal antibody against a target antigen.
  • aminopterin inhibits many cell functions, it is preferably removed from the medium as soon as possible. In mice and rats, most myeloma cells die within 10-14 days, so aminopterin can be removed after 2 weeks of fusion. However, human hyperpridoma is usually maintained in a medium supplemented with aminopterin for about 4 to 6 weeks after fusion. It is desirable to remove hypoxanthine and thymidine at least 1 week after aminopterin removal. That is, in the case of mouse cells, for example, 7 to 10 days after the fusion, complete or medium containing hypoxanthine and thymidine (HT) (eg, 10% FCS-added PRPMI1640) is added or replaced. Visible clones appear about 8-14 days after fusion. When the clone has a diameter of about Slmm, the amount of antibody in the culture supernatant can be measured.
  • HT hypoxanthine and thymidine
  • Measurement of the amount of antibody includes, for example, a target antigen or a derivative thereof! /, A partial peptide thereof (including a partial amino acid sequence used as an antigenic determinant) directly or with a carrier
  • a target antigen or a derivative thereof directly or with a carrier
  • radioactive material eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C
  • enzyme eg, ⁇ -galactosidase, 13 dalcosidase
  • fluorescent substances eg fluorescamine, fluorescene isothiocyanate
  • luminescent substances eg luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin
  • a target that is bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin (IgG) antibody (eg, an antibody against IgG derived from the same species as the animal from IgG derived from
  • the limiting dilution method is usually used. Cloning using soft agar and cloning using FACS (described above) are also possible. Cloning by the limiting dilution method can be performed by the following procedure, for example, but is not limited thereto.
  • a positive well is selected by measuring the amount of antibody as described above. Select an appropriate feeder cell and add it to the 96 well plate.
  • Cells are aspirated from antibody-positive wells, suspended in complete medium (eg, 10% FCS and P / S supplemented caroten RMPI1640) to a density of 30 cells / mL, and added to a well plate containing feeder cells.
  • complete medium eg, 10% FCS and P / S supplemented caroten RMPI1640
  • Add lmL (3 cells / well) dilute the remaining cell suspension to 10 cells / mL and sprinkle into another well (1 cell / well), and add the remaining cell suspension to 3 cells / well. Dilute to mL and seed into another well (0.3 cells / well). Incubate for 2 to 3 weeks until a visible clone appears. Measure antibody level.
  • Hypridoma can be cultured in vitro or in vivo.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained as described above can be used while maintaining the cell density at about 10 5 to 10 6 cells / mL, There is a way to gradually scale up from the well plate while gradually decreasing the degree.
  • mice that have been induced plasmacytoma by injecting mineral oil into the abdominal cavity (nobridoma parent strain and histocompatibility mice), 5 to 10 days Later, a method of injecting about 10 6 to 10 7 cells of hyperidoma intraperitoneally and collecting ascites under anesthesia 2 to 5 weeks later can be mentioned.
  • MOPC induced plasmacytoma
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, such as immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE, QEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification by collecting active antibody such as protein A or protein G and dissociating the binding to obtain the antibody Can be done according to law etc.].
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE, QEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification by collecting active antibody such as protein A or protein G and dissociating the binding to obtain the antibody Can be done according to law etc.
  • active antibody such as
  • the antibody of the present invention since the antibody of the present invention is used as a pharmaceutical for human administration, the antibody of the present invention has a reduced risk of showing antigenicity when administered to a human.
  • An antibody specifically, a fully human antibody, a humanized antibody, a mouse-human chimeric antibody, etc., particularly preferably a fully human antibody.
  • Humanized antibodies and chimeric antibodies can be produced by genetic engineering according to the methods described below.
  • a fully human antibody can be produced from the above-described human (or mouse) hyperidoma. In order to provide a large amount of antibody stably and at low cost, human antibody production described later is required. Desirable to produce using animal (eg mouse) or phage display methods.
  • chimeric antibody refers to the variable region (V and V) of the light and light chains.
  • sequence is derived from one mammalian species, and the constant region (C and C) sequences are from other mammalian species
  • variable region Means an antibody derived from The sequence of the variable region is preferably a constant region sequence that is preferably derived from an animal species that is capable of easily producing a hybridoma such as a mouse. It is preferably derived from a mammalian species to be administered.
  • Examples of the method for producing a chimeric antibody include the method described in US Pat. No. 6,331,415 or a method obtained by partially modifying it. Specifically, first, mRNA or total RNA is prepared from a monoclonal antibody-producing hybridoma (for example, mouse-mouse hybridoma) obtained as described above according to a conventional method, and cDNA is synthesized. Using the cDNA as a saddle type, appropriate primers (for example, each of V and V as sense primers)
  • Oligo DNA containing nucleotide sequence encoding N-terminal sequence, oligo DNA hybridizing with nucleotide sequence encoding C and C N-terminal sequence as antisense primer eg
  • chimeric L chain DNA in an appropriate expression vector (for example, a vector containing a promoter (eg, CMV promoter, SV40 promoter, etc.) having transcription activity in CHO cells, COS cells, mouse myeloma cells, etc.) Enter.
  • DNAs encoding both strands may be inserted into separate vectors or tandemly inserted into one vector.
  • Host cells are transformed with the resulting chimeric H chain and chimeric L chain expression vectors. Examples of host cells include animal cells such as mouse myeloma cells as described above, Chinese hamster ovary (CHO) cells, monkey-derived COS-7 cells, Vero cells, and rat-derived GHS cells.
  • any method applicable to animal cells may be used, and preferred examples include the electopore position method.
  • the culture supernatant is recovered and purified by the same method as described above to isolate the chimeric monoclonal antibody.
  • germline cells of animals that have established transgenic technologies such as ushi, goats, and chickens as host cells, and have accumulated large-scale breeding knowhow as livestock (poultry)
  • a transgene animal By producing a transgene animal, a chimeric monoclonal antibody can be obtained easily and in large quantities from the milk or egg of the animal obtained.
  • transgenic technologies such as corn, rice, wheat, soybean, and octopus have been established and are grown in large quantities as major crops.
  • the plant cells are used as host cells, and transgenic plants are produced using microinjection and electorporation to protoplasts, the particle gun method for intact cells, and the Ti vector method.
  • Monoclonal antibodies can also be obtained.
  • Fab can be obtained by digesting the obtained chimeric monoclonal antibody with papain, and F (ab ') can be obtained by digesting with pepsin.
  • DNA encoding mouse V and V should be linked to an appropriate linker.
  • HL peptides eg 1 to 40 amino acids, preferably 3 to 30 amino acids, more preferably 5 to 20 amino acids (eg: [Ser- (Gly) m] n or [(Gly) m-Ser] n (m Is an integer from 0 to 10, n is an integer from 1 to 5), etc.).
  • DNA encoding such genetically modified (conjugated) antibody molecules can be expressed in microorganisms such as Escherichia coli and yeast under the control of appropriate promoters. Can be produced.
  • V and V FRs When introduced into E. coli, a dimer called Fv is formed by monocistronic gene expression. Also, using molecular modeling, the appropriate amino acids in V and V FRs are
  • dsFv dimer When substituted with s, a dimer called dsFv is formed by an intermolecular disulfide bond between both chains.
  • humanized antibody means that the sequence of all regions other than the complementarity determining region (CDR) existing in the variable region (that is, the constant region and the framework region (FR) in the variable region) is human. It means an antibody that is derived from and whose only CDR sequences are derived from other mammalian species. As other mammalian species, for example, an animal species that can easily produce a hyperidoma such as a mouse is preferred!
  • Examples of methods for producing humanized antibodies include those described in US Pat. Nos. 5,225,539, 5,585,089, 5,693,761 and 5,693,762, or partially modified methods thereof. Law. Specifically, in the same manner as in the case of the above chimeric antibody, DNAs encoding V and V derived from mammal species other than humans (eg, mice) are isolated, and then used in a conventional manner.
  • Nucleotide sequences encoding the L and H chains of human antibodies having a FR sequence similar to the determined FR sequence were designed by replacing the CDR coding region with the base sequence encoding the determined heterologous CDR, and the base sequence was divided into fragments of about 20 to 40 bases. And the salt A sequence complementary to the sequence is divided into fragments of about 20 to 40 bases so as to alternately overlap with the above fragments, and each fragment is synthesized using a DNA synthesizer, and these are hybridized and synthesized according to a conventional method.
  • Examples of such a method include the sequential CDR transplantation method described in JP-A-5-227970. DN, which codes V and V, thus obtained
  • A is a DNA encoding human C and C in the same manner as in the case of the above chimeric antibody.
  • a cell or a transgenic animal or plant producing a humanized antibody can be obtained.
  • Humanized antibodies can also be modified to scFv, scFv_Fc, minibody, dsFv, Fv, etc. using genetic engineering techniques in the same way as chimeric antibodies.
  • Microorganisms such as Escherichia coli and yeast can be obtained using appropriate promoters. But it can be produced.
  • Humanized antibody production technology can also be applied to the production of monoclonal antibodies that can be preferably administered to other animal species!
  • livestock such as ushi, pig, hidge, goat and chicken
  • pet animals such as cats and cats.
  • mice with Hg H chain and L chain minigenes introduced using normal transgeneic (Tg) technology, and endogenous mouse Ig genes inactivated with normal KO technology.
  • Human monoclonal antibodies were prepared using human antibody-producing mice (see Immunol. Today, 17: 391-397, 1996) obtained by crossing the two. Some of these human monoclonal antibodies are already in the clinical stage, and to date no production of anti-Hg human antibodies (HAHA) in subjects has been reported.
  • HAHA anti-Hg human antibodies
  • VDJ exon which is a combination of about 80 V fragments, about 30 D fragments, and 6 J fragments, encodes the antigen binding site.
  • the total length H chain of about 1.5 Mb (14 chromosome), K L chain about 2 Mb (2 chromosome), lambda L chain about 1 Mb (22 chromosome by ). It is desirable to introduce the full length of each Ig gene in order to reproduce the same variety of antibody reverberation as in humans in other animal species.
  • DNA that can be inserted into DNA is usually several kb to several hundred kb, and it has been difficult to introduce the full length by conventional transgenic animal production techniques in which cloned DNA is injected into fertilized eggs.
  • Example: Colcemide to prepare microcells in which one to several chromosomes or fragments thereof are encapsulated in the nuclear membrane, and introduce the chromosomes into mouse ES cells by the micronucleus fusion method.
  • Hybrid ES cells that retain chromosomes containing human Ig genes or fragments thereof are selected using a drug-containing medium, and microinjected into mouse embryos in the same manner as in normal KO mouse production.
  • Germline chimeras are selected from the resulting chimeric mice using the coat color as an indicator, etc., and the TC mouse strain (TC (hCF14)) that transmits the human chromosome 14 fragment and the human chromosome 2 fragment are transmitted.
  • a TC mouse strain (TC (hCF2)) is established.
  • mice KO (IgH) and KO (Ig ⁇ )) in which the endogenous heavy chain gene and ⁇ light chain gene were KOed by a conventional method, and by repeating the crossing of these four strains, four types of gene modifications were made.
  • Establish all mouse strains double TC / KO) with force S.
  • An antigen-specific human monoclonal antibody-producing hyperidoma can be produced by applying the same method as that for producing a normal mouse monoclonal antibody to the double TC / KO mouse produced as described above. Can do. However, since hC F2 containing the KL chain gene is unstable in mouse cells, the efficiency of obtaining high-pridoma is lower than that of normal mice.
  • the Hu-Mab Mouse contains about 50% of the ⁇ L chain gene, but it shows the diversity of the ⁇ chain equivalent to that of the full length because the variable region cluster has a doubled structure.
  • the H chain gene is about 10% more powerful, and since it does not contain the H chain diversity, it is poorly responsive to antigens) and inserted into the mouse chromosome by the YAC vector (Ig ⁇ -YAC) Therefore, it is stably maintained in mouse cells.
  • normal mice can be produced by cross-breeding TC (hCF14) and Hu-Mab Mouse to create a mouse (trade name: KM mouse) that stably retains hCF14 and Ig ⁇ -YAC. As a result, it is possible to obtain a high-pridoma acquisition efficiency and an antibody antigen affinity.
  • human antibody-producing animals into which a chain gene is further introduced can be produced.
  • Such animals are Can be obtained by introducing human chromosome 22 or a fragment thereof carrying the ⁇ L chain gene in the same manner as described above, or, for example, a human artificial chromosome containing an H chain locus and a chain locus It can also be obtained by constructing (HAC) and introducing it into mouse cells (Nat. Biotechnol., 18: 1086-1090, 2000).
  • phage display Another approach to making fully human antibodies is to use phage display.
  • PCR mutations may be introduced in addition to CDRs, so there are few reports of clinical HAHA production at the clinical stage.
  • the risk of infection with a heterologous virus derived from the host animal It has the advantage that the specificity of the point and antibody is infinite (antibodies against prohibited clones and sugar chains can be easily produced).
  • Examples of methods for preparing a phage display human antibody library include, but are not limited to, the following.
  • the phage to be used is not particularly limited, but filamentous phage (Ff pacteriophage) is usually preferably used.
  • filamentous phage Ff pacteriophage
  • methods for displaying foreign proteins on the phage surface include a method of expressing and displaying on the coat protein as a fusion protein with any of the coat proteins g3p and g6p to g9p. This is a method of fusing to the N-terminal side of g8p.
  • phage display vectors 1) a foreign protein is fused to the coat protein gene of the fuzzy genome and all coat proteins displayed on the phage surface are presented as fusion proteins with the foreign protein.
  • Escherichia coli having a phagemid beta has a helper phage having a wild type coat protein gene to produce phage particles that simultaneously express the fusion protein and the wild type coat protein.
  • the type 2) or 3) is used to prepare the antibody library.
  • Specific examples of the vector include those described in Holt et al. (Curr. Opin. Biotechnol., 11: 445-449, 2000). See, for example, CESKj.
  • helper phage examples include M13-K07, VCSM13 and the like.
  • the 3 'end of the antibody gene and the 5' end of the coat protein gene are linked to a sequence containing a codon that encodes cysteine, respectively.
  • a codon that encodes cysteine Such as those designed to display antibodies on the coat protein on the phage surface via SS binding between the introduced cysteine residues (Morphosys CysDisplay TM technology), etc. It is.
  • human antibody libraries include naive / non-immunized libraries, synthetic libraries, and immune libraries.
  • a naive / non-immunized library is one of the V and
  • V genes were obtained by RT-PCR, and they were randomly displayed as described above.
  • a synthetic library selects a specific antibody gene that is functional in human B cells, and uses a random amino acid sequence IJ of an appropriate length for a portion of an antigen-binding region such as CDR3 of a V gene fragment. Substituted with the encoding DNA and made into a library. Since a library can be constructed from a combination of V and V genes that produce functional scFv and Fab from the beginning
  • An immunized library is a lymphocyte collected from a human having an increased blood antibody titer against a target antigen, such as a patient with cancer, an autoimmune disease, an infectious disease, or a person who has been vaccinated, or MRNA is prepared from human lymphocytes and the like artificially immunized with the target antigen by the in vitro immunization method in the same manner as in the naive / non-immune library, and the V and V genes are amplified by the RT-PCR method. It is a library. Purpose from the beginning
  • the target antibody can be obtained even from a relatively small size library.
  • the process of selecting antibodies against a target antigen by the phage display method is called panning. Specifically, for example, a carrier on which an antigen is immobilized is contacted with a phage library, and after washing away unbound phage, the bound phage is eluted with a carrier force, and the phage is propagated by infecting E. coli.
  • the phages displaying antigen-specific antibodies are concentrated by repeating a series of operations 3 to 5 times.
  • a carrier for immobilizing an antigen various carriers used in usual antigen-antibody reaction and affinity chromatography are used.
  • Body for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or microplates, tubes, membranes, columns, beads, etc. made of glass or metal, and surface plasmon resonance ( SPR) sensor chip.
  • insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose
  • synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon
  • microplates tubes, membranes, columns, beads, etc. made of glass or metal
  • SPR surface plasmon resonance
  • biotin mono (Strebto) avidin system is preferably used.
  • the endogenous ligand that is the target antigen is a small molecule such as a peptide
  • special care must be taken so that the moiety used as the antigenic determinant is not covered by binding to the carrier.
  • blocking solution such as BSA solution (1-2 times), PBS containing surfactant such as Tween (3-5 times), etc. can be used sequentially.
  • citrate buffer pH 5
  • a force that normally uses an acid eg 0.1M hydrochloric acid
  • a specific protease for example, a gene sequence encoding a trypsin cleavage site at the junction between an antibody gene and a coat protein gene
  • wild-type coat protein is displayed on the surface of the eluting phage, so that even when all coat proteins are expressed as fusion proteins, it is possible to infect and propagate E. coli.
  • phages presenting antigen-specific antibodies are concentrated by panning, these are infected with Escherichia coli and then seeded on a plate for cloning. Collect the phages again, and confirm the antigen-binding activity by measuring using antibody titer (eg ELISA, RIA, FIA, etc.) or FACS! /, Using SPR.
  • antibody titer eg ELISA, RIA, FIA, etc.
  • Isolation / purification of antibodies from phage clones displaying selected antigen-specific antibodies can be achieved, for example, by using a vector in which an amber stop codon is introduced at the junction of an antibody gene and a coat protein gene as a phage display vector. If used, the phage Is infected with E. coli that does not have an amber mutation (eg, HB215 vermilion), soluble antibody molecules are produced and secreted into the periplasm or medium, so the cell fraction is lysed with lysozyme and the extracellular fraction is recovered, It can be performed using the same purification technique as described above.
  • IMAC can be easily purified using an anti-c_myc antibody column.
  • the antibody molecule is separated from the phage surface when the protease is allowed to act, so the target antibody is purified by carrying out the same purification procedure. be able to.
  • a fully human antibody production technique using a human antibody-producing animal and a phage display human antibody library can be applied to the production of monoclonal antibodies of other animal species.
  • it is widely propagated as domestic animals (poultry) such as rabbits, pigs, hidges, goats and chickens! /, And pet animals such as animals and cats.
  • domestic animals prute animals
  • pigs hidges, goats and chickens!
  • pet animals such as animals and cats.
  • the use of immune libraries is more effective because there are few ethical problems with respect to artificial immunity of the target antigen.
  • the antibody of the present invention obtained by any of the above methods may or may not inhibit the binding of PAC1 to PACAP.
  • Whether or not the antibody of the present invention inhibits the binding of PAC1 to PACAP can be determined by, for example, using a carrier on which PAC1 is immobilized (which may be the PAC1-expressing cell itself or its cell membrane fraction). Incubate in contact with a solution containing labeled PACAP in the presence and absence of antibody, remove the liquid phase, measure the amount of label bound on the solid phase, and compare under both conditions This can be verified.
  • the antibody inhibits the binding of PAC 1 to PACAP, and if the amount of label does not change, the antibody inhibits the binding of PAC1 to PACAP. It can be determined not to.
  • the inhibition of binding between PAC 1 and PACAP can be confirmed. The presence or absence can be detected.
  • PACAP labeled with the membrane fraction or purified receptor is allowed to act in the presence of the antibody, and the inhibitory effect of the antibody on the binding of PAC1 to PACAP is evaluated by the amount of label adsorbed together with the receptor on the glass filter.
  • mouse anti-human PAC1 monoclonal antibodies # 135E, # 130D, 122B and the like shown in Examples below inhibit the binding of PAC 1 to PACAP, while # 2C and the like do not inhibit the binding.
  • the antibody of the present invention that inhibits the binding of PAC 1 to PACAP is a neutralizing antibody that inhibits the signal transduction activity of PAC 1 because it blocks the signal transduction of PACAP-PAC 1. Whether or not the antibody of the present invention inhibits PAC 1 signaling activity can be measured more directly by comparing the effector activity-regulating action of PAC 1 in the presence and absence of the antibody. it can.
  • cAMP produced by adding PACAP and ATP to cells containing PAC 1 and adenylate cyclase (AC) or its membrane fraction
  • the amount is measured by competitive immunoassay with cAMP labeled with a radioactive substance (eg 12 3 ⁇ 4, enzyme (eg alkaline phosphatase, baroxidase), fluorescent substance (eg FITC, rhodamine), etc. using an anti-cAMP antibody.
  • a radioactive substance eg 12 3 ⁇ 4
  • enzyme eg alkaline phosphatase, baroxidase
  • fluorescent substance eg FITC, rhodamine
  • PIP phosphatidylinositol-4,5-diphosphate
  • PLC phospholipase C
  • Method of measuring the amount of inositol phosphate (IP3) produced by addition, 2) Method of measuring intracellular Ca 2+ content including PAC 1 and PLC in the cell membrane, 3) Up-regulated by Ca 2+ Use a method that measures the expression level of the gene in transformed cells into which a ribota gene under the control of the TPA (12-0-tetradecanolphorbol-13-acetate) response element (TRE) has been introduced. Power S can be.
  • the amount of intracellular Ca 2+ is determined by spectroscopic measurement using a fluorescent probe (ibra-2, indo_l, fluor_3, calcium-green I, etc.), equolin, a calcium-sensitive photoprotein, and the like. Can be measured.
  • An apparatus suitable for spectroscopic measurement using a fluorescent probe is the FLIPR (Molecular Devices) system.
  • FLIPR Molecular Devices
  • mouse anti-human PAC1 monoclonal antibody # 130D shown in Examples below, the fully antibody (IgG) PACL order of IC power S10- 7 M in molecular 'G proteins GTP-gamma S binding action existing peptide It is a potent neutralizing antibody that strongly inhibits the sex antagonist PACAP (6_38) NH.
  • PC1-SM-130D The hybridoma producing this antibody (PC1-SM-130D) was founded on August 4, 2006 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (IPOD T 305-8566 Tsukuba Sakai Higashi 1- 1-1 Received at the center 6)! /, (Accession number: FERM BP-10655).
  • the antibody of the present invention obtained as described above binds to PAC1 competitively with PACAP and exhibits the same agonistic activity as PACAP, or binds to any extracellular region of PAC1.
  • the structure of PAC1 may be changed to make it permanently activated.
  • Such antibodies can also be screened by the same method as described above.
  • the antibody of the present invention may or may not inhibit the binding of other anti-PAC1 monoclonal antibodies to PAC1. Whether or not the antibody of the present invention inhibits the binding of other anti-PAC1 monoclonal antibodies to PAC1 can be determined, for example, in the method exemplified above for the inhibition of binding between PAC1 and PACAP. It can be assayed by using an anti-PAC1 monoclonal antibody.
  • mouse anti-human PAC1 monoclonal antibody # 2C shown in Examples below does not inhibit the binding of PAC1 to PACAP as described above, but promotes the binding of PAC1 such as # 34C and # 66A. Therefore, these antibodies are thought to be able to neutralize PAC1 activity more potently when used in combination with # 2C than when used alone.
  • the antibody of the present invention can recognize not only PAC1 having a native structure but also denatured PAC1. Therefore, the antibody of the present invention can be effectively used for detecting denatured PAC1 protein such as Western plot analysis.
  • the present invention provides a PAC1 activity modulator, a prophylactic treatment for a disease associated with PAC1 abnormality, and a diagnostic agent for a disease associated with an abnormal PAC1 activity, characterized by using the antibody of the present invention. provide.
  • PAC1 activity refers to cells mediated by PAC1 induced by binding of PACAP. Intracellular signal transduction activity, and regulating PAC1 activity means reducing or increasing the signal transduction activity! /.
  • PACAP has been suggested to act as a neurotransmitter and neuromodulator, as a neurotrophic factor, and to regulate neurogenesis. Therefore, the antibody of the present invention that enhances the physiological action of its receptor, PAC1, can be used as a prophylactic / therapeutic agent for improving brain edema and dementia symptoms in the center.
  • analysis of PACAP gene-deficient mice showed changes in responsiveness to various stimuli, and decreased anxiety levels and increased curiosity.
  • the antibodies of the invention are associated with diseases associated with increased physiological activity of PA C1 in the center, such as depression It can be used as a preventive or therapeutic agent.
  • PACAP has an insulin secretion effect and a pregnancy maintenance effect in females in the periphery, it has been clarified from the analysis of transgenic mice and deficient mice, so it enhances the physiological activity of its receptor, PAC1
  • the antibody of the present invention can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with decreased physiological activity of PAC1 in the periphery, such as diabetes and pregnancy failure.
  • the antibody of the present invention can be used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent after mixing with a pharmacologically acceptable carrier as necessary to obtain a pharmaceutical composition.
  • the pharmacologically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used, and excipients, solvents (dispersing agents), solubilizing agents, suspending agents, It is formulated as a stabilizer, isotonic agent, buffer, pH adjuster, soothing agent, and the like. If necessary, formulation additives such as preservatives and antioxidants can also be used.
  • excipient examples include lactose, sucrose, D-mannitol, D-sonorebitol, denpun, pregelatinized starch, dextrin, crystalline cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethylcellulose sodium , Gum arabic, pullulan, light anhydrous key
  • examples include acids, synthetic aluminum silicates, magnesium aluminate metasilicates, and the like.
  • Preferable examples of the solvent include water for injection, physiological saline, Ringer's solution, alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, sesame oil, corn oil, olive oil, cottonseed oil and the like.
  • solubilizers include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, citrate.
  • solubilizers include sodium, sodium salicylate, and sodium acetate.
  • the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; Hydrophilic polymers such as polybulol alcohol, polyvinylol pyrrolidone, canolepoxymethylenoresenorelose sodium, methinoresenorelose, hydroxymethinoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, hydroxypropinoresenorelose; polysorbates, Examples include polyoxyethylene hydrogenated castor oil
  • Preferable examples of the stabilizer include human serum albumin (HSA), sodium pyrosulfite, oral gallit, sodium metabisulfite and the like.
  • HSA human serum albumin
  • sodium pyrosulfite sodium pyrosulfite
  • oral gallit sodium metabisulfite and the like.
  • Preferable examples of the tonicity agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, glucose and the like.
  • buffers such as phosphates, acetates, carbonates, and kenates.
  • pH regulator examples include acids or bases such as hydrochloric acid and sodium hydroxide.
  • Preferable examples of the soothing agent include benzyl alcohol.
  • Preferable examples of the preservative include paraoxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • antioxidants include sulfite and ascorbate.
  • dosage form of the pharmaceutical composition include injections (eg, subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, intraarterial injections, etc.), infusions such as drops. Type preparations.
  • the pharmaceutical composition can be produced by a conventional method in the field of pharmaceutical technology, such as the method described in the Japanese Pharmacopoeia. The specific manufacturing method of the preparation is described in detail below.
  • the antibody content in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, dosage, etc., and is, for example, about 0.1 to 100% by weight.
  • an injection comprises an antibody as a dispersant (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycolole, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.), preservative (eg, methylparaben, propylparaben).
  • a dispersant eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycolole, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.
  • preservative eg, methylparaben, propylparaben
  • Benzyl alcohol black mouth butanol, phenol, etc.
  • isotonic agents eg, sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, glucose, etc.
  • other aqueous solvents eg, distilled water, physiological saline) , Ringer's solution, etc.
  • oil-based solvents eg olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil and other vegetable oils, propylene glycol, etc.
  • additives such as a solubilizer (eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin), a soothing agent (eg, benzyl alcohol, etc.) may be used as desired.
  • a solubilizer eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin
  • a soothing agent eg, benzyl alcohol, etc.
  • the injection solution is subjected to sterilization such as filtration sterilization using a membrane filter or the like as necessary, and is usually filled in an appropriate container such as an ampoule.
  • the injection may be used by dissolving (dispersing) the above solution into a powder by vacuum drying or the like.
  • the vacuum drying method include a freeze drying method and a method using a speed back concentrator (SAVANT).
  • SAVANT speed back concentrator
  • lyophilization it is preferable to use a sample cooled to ⁇ 10 ° C. or lower, lyophilize in a flask in the laboratory, industrially using a tray, or in a vial.
  • a speed-back concentrator it is performed at a temperature of about 0 to 30 ° C. and a vacuum of about 20 mmHg or less, preferably about 10 mmHg or less.
  • the powder formulation obtained by vacuum drying is a long-term stable formulation that can be dissolved in water for injection, physiological saline, Ringer's solution, etc. It can be made into an injection by dispersing in leave oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, propylene glycol, etc.
  • the antibody of the present invention may be used in combination with other drugs.
  • other agents having the prophylactic / therapeutic activity of the disease such as imibramin, clomipramine, amitriptyline, maprotiline , Funolevoxamine, Noroxetine, Funore-aged xetine, Minorenaciplan, and other antidepressants, and anxiolytics such as chlordiazepoxide, diazepam, oxazepam, bromazepam, lorazepam, alprazolam, clothiazebam, etizolam, etc.
  • cerebral edema drugs such as glycerol, fructose, mannitol, steroids, dementia symptom improving drugs such as donepezil, amantadine, thioprid, insulin, tonolebutamide, glycloviramide, glibenclamide, methonoremine, epalrestat, voglibose, acarbose, troglitazone
  • anti-diabetic drugs such as clemiphene citrate, sexobit, pituitary gonadotropin (HMG), placental gonadotropin (HCG), and the like can be used in combination.
  • the antibody of the present invention is used in combination with the above-mentioned other drug, for example, (1) according to a known pharmaceutical production method, a single agent together with an excipient that can be appropriately pharmaceutically acceptable if desired (2) Each of them is used as a formulation using a pharmaceutically acceptable excipient, etc., if desired, or used in combination (with a time difference), or (3) A set (kits etc.) that is formulated with excipients as appropriate according to the method may be used.
  • the number of administrations of each preparation may be different as long as the object of the present invention is achieved.
  • the content of the active ingredient in such a preparation may be within the range of the effective amount of each active ingredient or within the range acceptable for pharmacological and pharmacological purposes. Specifically, it is usually about 0.01 to about 100% by weight.
  • the antibody of the present invention acts as a preventive / therapeutic agent itself by linking the antibody of the present invention and the above-mentioned other drug via an appropriate linker as necessary to form an immunoconjugate.
  • Target the target cell ie, PAC1-expressing cell
  • PAC1-expressing cell Also has the effect of ting.
  • the dose of the antibody of the present invention is usually about 0.01 to about 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to about 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to about 5 mg / kg body weight for 3 weeks. It is convenient to administer by intravenous injection, preferably intravenous infusion, at intervals of about once to twice a week, preferably about once every two weeks to once a week. In the case of intravenous infusion, a single administration is performed, for example, for about 30 to about 180 minutes, preferably about 60 to about 120 minutes. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the minimum recommended clinical dose of each drug is used as a reference, the subject to be administered, the age and weight of the subject, the symptoms, the administration time, the administration method, the agent It can be appropriately selected depending on the type and combination of drugs.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize PAC1, it can be used for detection / quantification of PAC1 in a test solution, particularly detection / quantification by sandwich immunoassay. That is, the present invention includes, for example, (i) measuring the ratio of labeled protein bound to the antibody by competitively reacting the antibody of the present invention with a test solution and labeled protein. PAC1 quantification method in the test solution, (ii) the test solution, the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and the labeled antibody of the present invention reacted simultaneously or continuously, and then insolubilized carrier Provided is a method for quantifying PAC1 in a test solution, characterized by measuring the activity of the above labeling agent.
  • the insolubilized antibody and the labeled antibody have an antigen recognition site that does not interfere with the binding of PAC1 to each other (for example, one antibody recognizes the N-terminal portion of PAC1, The other antibody recognizes the extracellular loop, etc.).
  • the antibody of the present invention can recognize PAC1 having a native structure, in situ detection by tissue staining or the like can also be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or any fragment such as F (ab ′), Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • Measurement methods using antibodies against PAC1 should be particularly limited. A standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen, detecting the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in the solution to be measured by chemical or physical means. Any measurement method may be used as long as the measurement method is more calculated. For example, nephrometry, competition method, immunometric method, and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, and luminescent substances.
  • radioisotope e.g., [12 3 ⁇ 4, [m I ], [3 H], [14 C] and the like.
  • enzymes those having stable and high specific activity are preferable, for example, / 3_galactosidase, / 3-Darcosidase, alkaline phosphatase, baroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescene isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a bio-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen to a labeling agent.
  • insolubilization of an antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or enzyme or the like may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized antibody of the present invention (primary reaction), the labeled antibody of the present invention is reacted (secondary reaction), and then the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is detected.
  • primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times.
  • the labeling agent and insolubilization method can be based on those described above.
  • the antibodies of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction are preferably antibodies that have different strengths and binding sites for PAC1. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the N-terminal part of PAC1, the antibody used in the primary reaction is preferably the N-terminal part. Other than these, for example, an antibody that recognizes the extracellular loop portion is used.
  • the antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competitive method, an immunometric method, or nephrometry.
  • a competitive method the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated (B / F separation), measure the amount of labeled B or F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • a B / F separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the above antibody and the force using a solid-phased antibody as the first antibody
  • the first antibody is soluble and the second antibody is a solid-phase method using a solid-phase antibody.
  • an antigen in a test solution and a solid phased antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test solution is separated from the antigen in the test solution.
  • solid phase antigen is added and unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured.
  • Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
  • a PAC1 measurement system may be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For the details of these general technical means, you can refer to reviews, books, etc. [For example, Hiroshi Irie “Radio Im No Atsusei” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “ Continued radio Oimno Atsey (Kodansha, published in 1979), edited by Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (Medical Shoin, published in 1978), Eiji Ishikawa et al.
  • PAC1 can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can also be used to specifically detect PAC1 present in a subject such as a body fluid or tissue. It can also be used for the production of antibody strength rams used to purify PAC1, detection of PAC1 in each fraction during purification, and analysis of PAC1 behavior in test cells.
  • a test animal eg, human, horse, dog, cat, sanore, ushi, pig, hidge, goat, magpie, mouse, rat, nomstar, Diseases associated with abnormal (increased or decreased) PAC1 activity in monoremot, chickens, etc., such as epilepsy, anxiety, psychobehavioral dysfunction, sexual dysfunction, circadian rhythm photophobia, brain edema, dementia symptoms Diagnosis of insulin secretion disorders such as diabetes and hyperinsulinemia, pregnancy failure, etc. becomes possible. More specifically, the present invention provides a method for diagnosing a disease associated with abnormal PAC1 activity by measuring the expression level of PAC1 in a biological sample using the antibody of the present invention.
  • the biological sample used in the method of the present invention may be any biological sample as long as it is derived from a test animal, such as a body fluid (eg, blood, plasma, serum, lymph, cerebrospinal fluid, Synovial fluid, semen, urine, sweat, tears, etc.), various cell / tissue fragments, etc., but body fluids are preferred in that they are less invasive to the test animal, but considering that PAC1 is a membrane protein A cell-containing sample is desirable. Therefore, cells or a tissue piece (biopsy sample), blood, blood cells, etc. at a site where a disease is suspected are preferable.
  • a body fluid eg, blood, plasma, serum, lymph, cerebrospinal fluid, Synovial fluid, semen, urine, sweat, tears, etc.
  • body fluids are preferred in that they are less invasive to the test animal, but considering that PAC1 is a membrane protein A cell-containing sample is desirable. Therefore, cells or a tissue piece (biopsy sample), blood, blood cells, etc. at
  • Quantification of PAC1 in a biological sample can be performed by any of the methods described above. If the PAC1 level is significantly increased compared to the normal value as a result of the measurement, the test animal is likely to have a disease associated with increased PAC 1 activity or will be affected in the future. Can be diagnosed as likely. Conversely, if the amount of PAC1 is significantly reduced compared to normal values, the test animal is likely to have a disease associated with decreased PAC1 activity! /, Or is there! /, Is likely to be affected in the future!
  • the antibody of the present invention can be used for quantification of PAC1, it is useful as a reagent for screening for substances that regulate the expression of PAC1.
  • the present invention provides a screening method for a substance that regulates the expression of PAC1, characterized by using the antibody of the present invention and a PAC1-expressing cell, and a substance obtained by the screening method.
  • the present invention provides, for example, (i) a non-human mammal (1) blood, (2) a specific organ, (3) organ force, and a cell membrane fraction after destroying an isolated tissue or cell. And ii) quantifying PAC1 contained in the cell membrane fraction to screen a substance that regulates PAC1 expression, (ii) after destroying a transformant that expresses PAC1 or its partial peptide, etc.
  • a method of screening for substances that regulate PAC1 expression by isolating cell membrane fractions and quantifying PAC1 contained in cell membrane fractions (iii) nonhuman mammals (1) blood, (2) specific After organizing tissue or cells isolated from organs and (3) organs, PAC1 on the cell membrane was quantified by quantifying the degree of staining of PAC1 on the cell surface by using immunostaining.
  • PAC1 contained in the cell membrane fraction is quantified as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, hidges, pigs, mice, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, obese mice, diabetic mice, high blood pressure
  • Rats, arteriosclerosis rabbits, depression rats, etc. for example, anti-obesity drugs, anti-diabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, antidepressant drugs
  • physical stress for example, water stress
  • the obtained cells are suspended in an appropriate buffer (eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, etc.), and a surfactant (eg, Triton ⁇ -100 TM, Tween) is suspended. 20 TM or the like), and the cell membrane fraction is obtained using techniques such as centrifugation, filtration, and column fractionation.
  • an appropriate buffer eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, etc.
  • a surfactant eg, Triton ⁇ -100 TM, Tween
  • the cell membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after cell disruption.
  • Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, disrupting with a Waring blender polytron (manufactured by Kinematica), disrupting with ultrasonic waves, or pressing with a French press while pressing the cells from a thin nozzle. Examples include crushing by jetting.
  • a fractionation method using centrifugal force such as a fraction centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell disruption solution can be obtained by centrifuging the cell disruption solution at low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes) and further centrifuging the supernatant at high speed (15000 rpm to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours.
  • the precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in membrane components such as PAC1 and cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • PAC1 contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western plot analysis, or the like.
  • the force and sandwich immunoassay method can be performed in the same manner as described above, and the Western plot can be performed by means known per se.
  • a transformant expressing PACl or a partial peptide thereof can be produced according to the method described above, and PAC1 contained in the cell membrane fraction can be quantified.
  • a certain period of time before drug or physical stress is applied to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes before! /, 24 hours before, preferably 30 minutes before! /, 12 hours before, more preferably 1 hour to 6 hours) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), Or after administering a test substance at the same time as a drug or physical stress, after a certain period of time has elapsed (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), By quantifying the amount of PAC1 in the cell membrane,
  • test substance is mixed in the medium and cultured for a fixed time (after 1 to 7 days, preferably after 1 to 3 days, more preferably after 2 days). 3 days later) can be done by quantifying the amount of PAC1 in the cell membrane.
  • PAC1 contained in the cell membrane fraction is confirmed as follows.
  • non-human mammals eg, mouse, rat, rabbit, hidge, pig, ushi, cat, inu, monkey, etc., more specifically, obese mouse, diabetic mouse, high blood pressure, etc.
  • Rats, arteriosclerosis rabbits, depression rats, etc. for example, anti-obesity drugs, anti-diabetic drugs, antihypertensive drugs, vasoactive drugs, antidepressant drugs
  • physical stress for example, water stress
  • the obtained cells are made into tissue sections according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention.
  • immunostaining is performed using the antibody of the present invention.
  • the substance obtained by using the above screening method is a compound having an action of regulating the expression of PAC1 (changing the amount of PAC1 in the cell membrane).
  • PAC1 By increasing the expression of 1 (increasing the amount of PAC1 in the cell membrane), cell stimulating activity via PACAP-PAC interaction (eg, promoting GTP-GDP exchange reaction in conjugation, promoting intracellular cAMP production, inositol Substances that enhance phosphoric acid production, intracellular Ca 2+ uptake, insulin secretion, etc.
  • the substance examples include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These substances may be novel substances or known substances.
  • the substance that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of PAC1.
  • the substance that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic pharmaceutical for reducing the physiological activity of PAC1.
  • a substance that regulates the expression of PAC1 can be used as the above-mentioned medicine after mixing with a pharmacologically acceptable carrier as necessary to obtain a pharmaceutical composition.
  • the pharmacologically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used, and excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations; liquid preparations It is formulated as a solvent, solubilizer, suspending agent, isotonic agent, buffering agent, soothing agent, etc. If necessary, formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used.
  • excipients include lactose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol, denpun, pregelatinized starch, dextrin, crystalline cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethylcellulose sodium, gum arabic , Pullulan, light anhydrous caustic acid, synthetic aluminum silicate, magnesium metasilicate aluminate, and the like.
  • lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, tar, colloidal silica and the like.
  • binder examples include pregelatinized starch, sucrose, gelatin, gum arabic, methyl senorelose, canolepoxymethylenoresenorelose, canolepoxymethinoresenorelose sodium, Crystalline sanolose, sucrose, D-mannitol, trenorose, dextrin, punorelan, hydroxypropenoresenorelose, hydroxypropenoremethinoresenorelose, polyvinylino pyrrolidone and the like.
  • disintegrant examples include lactose, sucrose, starch, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethylstarch sodium, light anhydrous key acid, and low-substituted hydroxypropylcellulose.
  • the solvent include water for injection, physiological saline, Ringer's solution, alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, sesame oil, corn oil, olive oil, cottonseed oil and the like.
  • solubilizing agents include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, salicylic acid.
  • solubilizing agents include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, salicylic acid.
  • examples include sodium and sodium acetate.
  • suspending agent examples include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; Hydrophilic polymers such as polyvinolepyrrolidone, canolepoxymethinoresenololose sodium, methinoresenorelose, hydroxymethinoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, hydroxypropenoresenorelose; polysorbates, polyoxyethylene Preferred examples of isotonic agents that include hydrogenated castor oil include sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sonolebitol, and glucose.
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride,
  • buffering agent examples include buffer solutions such as phosphate, acetate, carbonate, citrate and the like.
  • the soothing agent include benzyl alcohol.
  • Preferable examples of the preservative include noroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • Preferable examples of the antioxidant include sulfite and ascorbate.
  • Suitable examples of colorants include water-soluble food tar dyes (eg, food red Nos. 2 and 3, food yellow Nos. 4 and 5, food blue Nos. 1 and 2, food-insoluble lake dyes ( Examples include aluminum salts of the aforementioned water-soluble edible tar pigments, natural pigments (eg, / 3-carotene, chlorophyll, bengara, etc.).
  • sweetening agent examples include saccharin sodium, dipotassium glycyrrhizinate, aspartame, stevia and the like.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include oral preparations such as tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, suspensions; and injections ( Eg, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection), external preparation (eg, nasal administration, transdermal formulation, ointment, etc.), suppository (eg, rectal seat) And parenteral preparations such as sustained-release preparations (eg, sustained-release microcapsules).
  • the pharmaceutical composition can be produced by a method commonly used in the field of pharmaceutical technology, such as the method described in the Japanese Pharmacopoeia. The specific manufacturing method of the preparation is described in detail below.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, the dose of the active ingredient, etc., for example, about 0.1 to 100% by weight.
  • oral preparations contain active ingredients, excipients (eg, lactose, sucrose, starch, D-mannitol), disintegrants (eg, carboxymethylcellulose calcium), binders (eg, pregelatinized starch, Arabic Add rubber, canolepoxymethylenoresenorelose, hydroxypropinoresenorose, polypyrrole pyrrolidone, etc.) or lubricant (eg talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 6000, etc.) Then, if necessary, it is produced by coating with a coating base by a method known per se for the purpose of taste masking, enteric property or durability.
  • excipients eg, lactose, sucrose, starch, D-mannitol
  • disintegrants eg, carboxymethylcellulose calcium
  • binders eg, pregelatinized starch, Arabic Add rubber, canolepoxymethylenoresenorelose, hydroxypropinoresenorose, polypyrrole
  • Examples of the coating base include sugar coating base, water-soluble film coating base, enteric film coating base, sustained-release film coating base and the like.
  • sugar coating base sucrose is used, and one or more kinds selected from talc, precipitated calcium carbonate, gelatin, gum arabic, pullulan, carnauba wax and the like may be used in combination.
  • water-soluble film coating bases include, for example, senorelose polymers such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropinoremethinoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, and methinorehydroxychinenoserose; Synthetic polymers such as Cetano lestineolaminoacetate, aminoalkyl metaatarylate copolymer E [Eudragit E (trade name), Rohm Farma), polybulur pyrrolidone; polysaccharides such as pullulan.
  • senorelose polymers such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropinoremethinoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, and methinorehydroxychinenoserose
  • Synthetic polymers such as Cetano lestineolaminoacetate, aminoalkyl metaatarylate copolymer E [Eudragit E (trade name), Rohm Farma), polybulur pyrrolidone
  • polysaccharides such as pullulan
  • enteric film coating bases include cellulose-based polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropinoremethinorescenellose acetate succinate, canolepoxymethylethylcellulose, and cellulose acetate phthalate; methacrylic acid copolymers L [Eudragit L (trade name), Rohm Firma], methacrylic acid copolymer LD [Eudragit L-30D55 (trade name), Rohm Falma], methacrylic acid copolymer S [Eudragit S (trade name), Rohm Farma) Acrylic acid polymers; natural products such as shellac.
  • cellulose-based polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropinoremethinorescenellose acetate succinate, canolepoxymethylethylcellulose, and cellulose acetate phthalate
  • methacrylic acid copolymers L Eudragit L (trade name), Rohm Firma]
  • sustained-release film coating bases include cellulose-based polymers such as ethylcellulose; aminoalkyl metatalarylate copolymer RS [Eudragit RS (trade name), Rohmfarma Co., Ltd.], ethyl acrylate and methyl methacrylate Examples thereof include acrylic polymers such as polymer suspensions [Eudragit NE (trade name), Rohm Farma Co., Ltd.]. Two or more of the coating bases described above may be mixed and used at an appropriate ratio. Further, a light-shielding agent such as titanium oxide or iron sesquioxide may be used for coating.
  • a light-shielding agent such as titanium oxide or iron sesquioxide may be used for coating.
  • the active ingredient is a dispersant (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.), preservatives (eg, methylparaben, propylparaben, benzyl alcohol, black mouth) Butanol, phenol, etc.), isotonic agents (eg, sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, glucose, etc.) and other aqueous solvents (eg, distilled water, physiological saline) Water, Ringer's solution, etc.) or oily solvents (eg olive oil, sesame oil, cottonseed oil, vegetable oils such as corn oil, propylene glycol, etc.), etc.
  • a dispersant eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.
  • preservatives eg, methylparab
  • additives such as solubilizing agents (eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, etc.), soothing agents (eg, benzyl alcohol, etc.) may be used as desired.
  • solubilizing agents eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, etc.
  • soothing agents eg, benzyl alcohol, etc.
  • the injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity.
  • mammals eg, humans, rats, rabbits, hidges, pigs, sushi, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the substance that regulates the expression of PAC1 varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc.
  • oral administration for example, for depressed patients (weight 60 kg), It is usually about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose may vary depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • patients with depression with a body weight of 60 kg
  • about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg is usually administered every day. Even if the administration subject is other than a human, the amount converted per 60 kg of human can be administered.
  • bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature or common abbreviations in the field, examples of which are described below.
  • optical isomers for amino acids L form is shown unless otherwise specified.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • RNA Ribonucleic acid
  • mRNA Messenger ribonucleic acid
  • dATP Deoxyadenosine triphosphate
  • dTTP Deoxythymidine triphosphate
  • dGTP Deoxyguanosine triphosphate
  • dCTP Deoxycytidine triphosphate
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • Trt Trityl
  • HONB ⁇ Hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
  • a membrane fraction was prepared from the Si9 cell culture solution (14 L) expressing human PAC1 by the polytron method as usual. Solubilized with 1.5% sucrose monolaurate (SM1200, Dojindo, S023) and 0.3% cholesteryl hemisuccinate tris salt (CHS, Sigma, C6013) after diluting the protein concentration to 2 mg / mL The solution was solubilized by gentle rotation at 4 ° C.
  • Fig. 1 shows the apparent affinity of PAC1 before and after solubilization
  • Fig. 2 shows the membrane fraction and the scattered yardage analysis after solubilization.
  • Figure 1 is based on the membrane fraction of 2 mg / mL used for solubilization, plotted with the dilution as the horizontal axis! /. Therefore, the total number of receptors before and after solubilization of a certain amount of membrane fraction It reflects the affinity (proportional to the product of the number of receptors and the equilibrium constant (Kd)). A comparison of Scatchyard analyzes showed that 88% of the membrane fraction was solubilized (Figure 2).
  • the affinity carrier was packed into the column, washed with about 900 mL, which is 15 times the volume of the column, and the eluate was separated into tubes at about 5 mL every 5 minutes under acidic conditions.
  • Fig. 4 shows the affinity of the eluted fraction. Fractions 7-16 (approximately 70 mL including the washing solution) were collected and protein quantification was performed using Amide Black. The result was 15 g / mL.
  • Fig. 5A shows the results of the PAC1 receptor solution (AF (initial)) after tea chromatography.
  • SM1200 / CHS solubilized PAC1 receptor Using the PAC1 receptor purified in Example 1 above (hereinafter referred to as “SM1200 / CHS solubilized PAC1 receptor”) as an antigen, the same volume as Freund's complete adjuvant for the first time and the Freund's incomplete adjuvant for the second and subsequent times.
  • Emulsion produced by mixing was immunized 4 times per week with 10 g subcutaneously in BALB / C mice (6 weeks old, female). After test blood collection, mice with increased antibody titers were selected, and final immunization (intravenous administration) with 10 g of antigen was performed, and the spleen was removed 4 days later. The spleen cells were loosened, filtered through sterilized gauze, and suspended in Cat. No.
  • TIL Medial (containing 10% FCS) manufactured by the National Institute for Immunology, to obtain a spleen cell suspension.
  • BALB / C mouse-derived myeloma cells P3 X 63.Ag8.653 (P3X63) were used (ATCC CRL1580).
  • Cell fusion was performed by modifying the original method (Nature, 256: 495, 1957). That is, spleen cells and P3X63 were each washed twice with serum-free TIL Medial, mixed so that the ratio of spleen cells to P3X63 number was 10: 1, and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes to precipitate the cells. I let you.
  • This cell precipitate was suspended in TIL Medial (containing 10% FCS) so that P3X63 was 2 ⁇ 10 6 per mL, and seeded at 0.1 mL per well in a 96-well multi-dish (Coaster). After seeding, the cells were cultured in a CO incubator at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO / 95% air. After 24 hours HAT (hypoxanthine 1 X 10- 4 M, aminopterin 4 X 10- 7 M, thymidine 1.6 X 1 0- 5 M) Cat containing. No. 33251 HAT Medial (10% FCS -containing) (HAT HAT selective culture was started by adding 0.1 mL of medium) per well.
  • the HAT selective culture was continued by discarding 0.1 mL of the old solution 3, 6, and 9 days after the start of the culture, and then adding 0.1 mL of HAT medium. Hypridoma growth was observed 9 to 14 days after cell fusion. When the culture medium turned yellow (about 1 ⁇ 10 6 cells / mL), the supernatant was collected and the antibody titer was measured.
  • Example 3 Affinity of purified mouse anti-human monoclonal PAC1 antibody with antigen Antigen SM1200 / CHS solubilized PAC1 receptor is introduced into MAXISORP at 2-5 ⁇ g / mL at 50 HL / well, and then 300 ⁇ L of block solution containing 25% Block Ace is added. Blocked.
  • Example 2 After washing with PBS three times, the antibody obtained in Example 2 and the Fab solution of each clone prepared by a conventional method were allowed to act at various concentrations at room temperature for 1.5 hours, and then horseradish rust peroxidase (HRPO) ) Labeled goat anti-mouse IgG antibody (American Qualer, A106PU) was allowed to act at 1000-fold dilution at room temperature for 1 hour, and washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween20.
  • HRPO horseradish rust peroxidase
  • HRPO substrate TMB Peroxidase Substrate 2-component Kit, 50-76-00, manufactured by KPL
  • 1N sulfuric acid was dispensed in 50 ⁇ L aliquots to stop the reaction.
  • the absorbance at 450 mm was measured using a plate reader (multi-scan; Lab Systems). The measurement results are shown in FIG. 7, and the affinity data are shown in Table 1.
  • D-PBS Dulbecco's PBS
  • 125 I_PACAP27 2 nM
  • the mixture was subjected to suction filtration using a GF / F glass filter (Whatman) treated with polyethyleneimine, and the radioactivity of 125 I_PACAP27 trapped on the filter was detected with a ⁇ counter.
  • the measurement was performed three times. 100% which was added D-PBS instead of antibody bound, to a final concentration of 10- 7 M and a material obtained by adding co Id PACAP27 as 0% bound, was evaluated in% of Control. The results are shown in Fig. 8 and Table 2.
  • CHO cells that have been introduced and expressed with the PAC 1 receptor gene are disrupted by the Polytron method, and 20 mM Tris-HC1, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl, 150 mM NaCl, 1 ⁇ ⁇ GDP
  • the solution was diluted 150-fold with a buffer containing 1% BSA to make 100 ⁇ l.
  • the mouse anti-PAC1 monoclonal antibody obtained in Example 2 was supplemented with 10 each at various concentrations, and then incubated for 15 minutes at 25 ° C.
  • 5 nM PACAP27 and 10 L added Caro further 10 nM GTP y - a 35 S was added 10 mu L, and incubated at 60 minutes 25 ° C.
  • null Does not affect binding of biotinylated antibody to antigen
  • IgG_34C and IgG_66A inhibited binding to each other.
  • Six types of IgG-2C, IgG-45A, IgG-95C, IgG-122B, IgG-130D, and IgG_135E were found to inhibit each other, and thus the antigen-binding sites overlap each other.
  • the binding site of these antibodies to the antigen is considered to be an exposed region of PAC1.
  • IgG_39C which does not bind to receptors expressed on the cell surface, did not inhibit or promote other antibodies.
  • the anti-PAC1 antibody of the present invention can regulate PAC1 activity, it increases the physiological activity of PAC1. It is extremely useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases related to progression and a diagnostic agent for diseases associated with abnormal PAC1 activity.
  • the antibodies of the present invention are also useful for screening substances that regulate the expression of PAC1.

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Description

明 細 書
新規モノクローナル抗体およびその用途
技術分野
[0001] 本発明は、抗原決定基の異なる複数の、下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリ ヘプテド I型受 体 (Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide typel recepto r (以下、「PAC1」と略記する））に対する新規抗体およびそれらの用途に関する。 背景技術
[0002] PAC1は下垂体アデ二ル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（Pituitary adenylate cycl ase activating polyp印 tide (以下、「PACAP」と略記する））の受容体であり、 7回膜貫 通タイプの G蛋白共役型受容体（GPCR)の 1つである。 PACAPは、 PAC1に結合する ことで、中枢 ·末梢神経系において種々の生理活性を有することが知られている。即 ち、 PACAP— PAC1シグナル経路における障害力 中枢神経系においてはうつ病、 精神行動機能障害、性的機能障害、 日内リズムの光同調障害等に関わっており、末 梢においても糖尿病または高インスリン血症等のインスリン分泌障害等に関わってい るとの知見が得られている。このことから、 PAC1は上記疾患及び障害治療のための 創薬ターゲットとなり得る。
[0003] GPCRに代表される膜蛋白質は創薬の標的となるため、その構造と機能の解明は 重要である。蛋白質の立体構造解析のためには蛋白質の結晶化が必要となるが、膜 蛋白質は、それを可溶化する界面活性剤により疎水性領域が覆われているために、 結晶の生成に寄与し得る蛋白質表面が制限され、良質な結晶を得ることはきわめて 困難である。 PAC1についても、立体構造解析を可能とするような良好な結晶は未だ 得られていない。
[0004] 膜蛋白質の結晶化を容易ならしむべぐその親水性部分が結晶格子形成に十分な 分子間相互作用を生じ得るように、膜蛋白質に特異的な抗体を利用して親水性部分 のサイズを大きくすることが試みられている。但し、この手法を実施するには、 目的の 膜蛋白質の親水性部分を認識し、且つ該膜蛋白質が本来の生理機能を発揮し得る 構造 (ネイティブな構造)を認識し得るモノクローナル抗体が不可欠である。膜蛋白質 のネイティブな構造を認識し得る抗体を取得する手段の 1つとして、該膜蛋白質を発 現する細胞やその膜画分をそのまま抗原として用い、動物を免疫する方法が行われ ているが、 GPCRは細胞膜表面での発現量が少ないために、 目的の抗体が得られる 可能性はきわめて低い。 PAC1についても、これまでに報告されている抗体（非特許 文献 1ないし 3)は、いずれも変性した非生理的な構造を有する PAC1し力、認識し得な い。
[0005] 上述のように、 PAC1は中枢神経系から末梢神経に広く分布し、多様な生理作用を 発揮する PACAPの受容体であることから、 PAC1のネイティブな構造を認識し得る抗 体は、 PAC1に結合して PACAPの生理活性を調節する物質として、それ自体医薬品 の候補となり得る。抗体はその特異性の高さと血中半減期の長さから、副作用が少な く薬効持続性が長レ、とレ、う医薬品としての優れた特性を備えて!/、る。 PAC1は細胞表 面受容体であることから、治療用抗 PAC1抗体は PAC1の細胞外領域を認識するもの であることが望ましいが、公知の抗 PAC1抗体はいずれも細胞質側の C末端領域を認 識するものである。
従って、ネイティブな構造を有する PAC1の細胞外領域を認識し得る抗 PAC1モノク ローナル抗体が強く望まれている。
[0006] 膜蛋白質のネイティブな構造を認識し得る抗体を取得する別の手段として、精製し た膜蛋白質標品を抗原とする方法が考えられる。上述のように、膜蛋白質をネィティ ブな構造を保持したままで精製するためには、界面活性剤による可溶化が必要にな る。 PAC1をジギトニンを用いて可溶化し、精製したことは既に報告されている（非特 許文献 4)。し力もながら、この方法で得られる精製 PAC1は、界面活性剤により疎水 性領域が覆われるために、抗原決定基となり得る部分が非常に制限されてしまい、抗 原としては適さない。即ち、結晶化において直面するのと同様の問題力 PAC1のネ ィティブな構造を認識し得る抗体の取得をも困難にしている。
非特許文献 l : Rong_Ming Lyuら， 「ザ'ジャーナル'ォヴ 'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chemj j , (米国）,第 275巻， p.36134-36142, 2000年
非特許文献 2 : Solveig Schulzら， 「クリニカル'キャンサー 'リサーチ（Clin. Cancer Res. )」， (米国）,第 10巻， p.8235-8242, 2004年 非特許文献 3 : S.T. Andersonら， 「ジャーナル'ォヴ 'ニューロエンドクリノロジー（J. Ne uroendocrinolj j , (米国），第 17巻， p.298-305, 2005年
非特許文献 4： Tetsuya Ohtakiら，「ザ ·ジャーナル ·ォヴ 'バイオロジカル ·ケミストリ一（ J. Biol. Chemj j , (米国）,第 273巻， p.15464-15473, 1998年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、ネイティブな構造を有するヒト PAC1を認識し得る新規抗 PAC1抗体を提 供すること、及び該抗体を用いることにより PAC1活性の異常が関連する疾患の予防- 治療もしくは診断剤を提供すること、並びに PAC1の発現を調節する物質をスクリー二 ングする方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、 PAC1の可溶化に用いる界面活性剤の種類や配合比などを鋭意検 討した結果、抗体作製のための抗原として適した PAC1精製物を得ることに成功した 。さらに、これを用いて、ネイティブな構造を有するヒト PAC1の細胞外領域を認識する 、性質の異なる複数のマウス抗ヒト PAC1モノクローナル抗体を作製することに成功し た。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成 するに至った。
[0009] すなわち、本発明は、
[ 1 ]ネイティブな構造を有する PAC 1を認識し得る抗 PAC 1モノクローナル抗体；
[2] PAC 1の細胞外領域を認識する上記 [ 1 ]記載の抗体；
[3] PAC 1の PACAPとの結合を阻害する上記 [2]記載の抗体；
[4] PAC 1の生理活性を阻害する上記 [3]記載の抗体；
[5]PAC1の PACAPとの結合を阻害しない上記 [2]記載の抗体；
[6]他の抗 PAC1モノクローナル抗体の PAC1との結合を促進する上記 [5]記載の抗 体；
[7]他の抗 PAC1モノクローナル抗体が PAC1の PACAPとの結合を阻害するものであ る、上記 [6]記載の抗体； [8]さらに変性した PAC 1を認識し得る上記 [ 1 ]記載の抗体；
[9]上記 [ 1 ]記載の抗体を含む PAC 1活性調節剤；
[ 10]上記 [4]記載の抗体を含む PAC 1活性阻害剤；
[ 11 ] PAC 1の生理活性の亢進が関連する疾患の予防 ·治療用である、上記 [ 10]記 載の剤；
[ 12]上記 [ 1 ]記載の抗体を含む PAC 1検出剤；
[ 13] PAC 1活性の異常が関連する疾患の診断用である、上記 [ 12]記載の剤；
[14]上記 [1]記載の抗体および PAC1発現細胞を用いることを特徴とする、 PAC1の 発現を調節する物質のスクリーニング法；
などを提供する。
発明の効果
[0010] 本発明の新規抗 PAC1抗体は、ネイティブな構造を有する PAC1の細胞外領域を認 識し得るので、 in vivoで PAC 1に結合し、またその活性を調節することができ、従って 、 PAC1活性の異常が関連する疾患、例えばうつ病、精神行動機能障害、性的機能 障害、 日内リズムの光同調障害等の予防'治療剤として、さらに上記疾患及び糖尿病 、高インスリン血症等のインスリン分泌障害などの診断剤として有用である。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]SM1200/CHS混合ミセル系を用いた膜画分可溶化の前後における、 Si9細胞試 料と PACAPとの見かけの結合親和性を示す図である。
[図 2]膜画分 (A)及び膜画分可溶化液 (B)のスキャッチヤード解析を示す図である。
[図 3]膜画分可溶化液の PACAPに対する結合親和性を示す図である。
[図 4]ァフィ二ティー吸着によって得られた各溶出画分の PACAPに対する結合親和 性を示す図である。
[図 5]ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって得られた各溶出画分の PACAPに 対する結合親和性 (A)、並びにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって得られ た Main画分、 Subl画分及び Sub2画分の PACAPに対する見かけの結合親和性（B)を 示す図である。
[図 6]ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより得られた Main画分 (A)及びァフィ二 ティークロマトグラフィー溶出画分（B)につ!/、てのスキャッチヤード解析を示す図であ
[図 7]実施例 2で得られたマウス抗ヒト PAC1モノクローナル IgG抗体（A)及びその Fab 断片（B)の抗原 PAC1受容体に対する結合親和性を示す図である。
[図 8]実施例 2で得られたマウス抗ヒト PAC1モノクローナル IgG抗体（A)及びその Fab 断片（B)による、 PACAPの PAC1への結合阻害を示す図である。
[図 9-1]実施例 2で得られたマウス抗ヒト PAC1モノクローナル IgG抗体による、 GTP- γ
Sの PAC1への結合活性化阻害を示す図である (A〜C)。
[図 9-2]実施例 2で得られたマウス抗ヒト PAC1モノクローナル IgG抗体による、 GTP- γ Sの PAC1への結合活性化阻害を示す図である（D、 Ε)。
[図 10-1]実施例 2で得られた別個の 2種類のマウス抗ヒト PAC1モノクローナル IgG抗 体を用いた、競合 ELASA (直接吸着法）の結果を示す図である (A〜F)。
[図 10-2]実施例 2で得られた別個の 2種類のマウス抗ヒト PAC1モノクローナル IgG抗 体を用いた、競合 ELASA (直接吸着法）の結果を示す図である（G〜U。
[図 10-3]実施例 2で得られた別個の 2種類のマウス抗ヒト PAC1モノクローナル IgG抗 体を用いた、競合 ELASA (直接吸着法）の結果を示す図である（M〜R)。
[図 10-4]実施例 2で得られた別個の 2種類のマウス抗ヒト PAC1モノクローナル IgG抗 体を用いた、競合 ELASA (直接吸着法）の結果を示す図である（S〜V)。
[0012] 本発明は、ネイティブな構造を有する PAC1を認識し得る新規抗 PAC1抗体（以下、 「本発明の抗体」ともいう）を提供する。ここで「ネイティブな構造 (native structure) j t は、 PAC1が本来の生理機能を発揮し得る状態における構造、即ち、生体の細胞膜 に天然に存在する状態でとり得るいずれかの構造を意味する。 PAC1は GPCRである ので、活性化状態（即ち、 PACAPや他の PAC1ァゴニストが結合した状態）と不活性 化状態（リガンドが結合して!/、な!/、か、アンタゴニストが結合した状態）とで構造が変 化するが、いずれの状態における構造も、本発明における「ネイティブな構造」に該 当する。
[0013] 本発明の抗体は、ネイティブな構造を有する PAC1を認識し得る限り、 PAC1のいず れの部分を抗原決定基とするものであってもよいが、精製 PAC1/界面活性剤複合体 が免疫原として好ましく用いられることから、好ましくは PAC1の親水性領域 (即ち、 N 末端領域、細胞外第 1〜3ループ領域、細胞質第 1〜3ループ領域、 C末端領域)のい ずれかを認識するものであり、より好ましくは、細胞外領域 (即ち、 N末端領域、細胞 外第 1〜3ループ領域）のいずれかを認識するものである。細胞外領域を認識する本 発明の抗体はインタタトな細胞の表面上に発現する PAC1に結合することができるの で、抗体医薬としての用途にぉレ、て特に有利である。
[0014] 本発明の抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくは IgG、 IgMまたは IgA 、特に好ましくは IgGが挙げられる。
[0015] また、本発明の抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領 域 (CDR)を少なくとも有するものであれば特に制限はなぐ完全抗体分子の他、例え ば Fab、 Fab'、 F(ab' )、 Fv、 V等のフラグメント、 scFv、 scFv— Fc、 dsFv、ミニボディー、
2 H
ダイアポディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエ チレングリコール (PEG)等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそ れらの誘導体などであってもよレ、。
[0016] PAC1に対する抗体は、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造する こと力 Sでさる。
[0017] 以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、および該抗体の製造法について説明す (1)抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、 PAC1またはその部分ぺ プチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を 1種あるレ、は 2種以上有する（合成)ぺプ チドなど、 可れのものも使用すること力できる。
[0018] PAC1またはその部分ペプチドは、例えば、（a)ヒト、サル、ラット、マウス、ニヮトリな どの温血動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用い て調製、（b)ペプチド ' ·シンセサイザ一等を使用する公知のペプチド合成方法で化学 的に合成、（c) PAClまたはその部分ペプチドをコードする DNAを含有する形質転換 体を培養、あるいは（d) PAC1またはその部分ペプチドをコードする核酸を铸型として 無細胞転写/翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。 [0019] 本発明に用いられる PAC1蛋白質は、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
PAC1は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ 、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど）の細胞 [例えば、肝細胞、脾細胞、神経 細胞、グリア細胞、瞵 /3細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルノヽンス細胞、表 皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細 胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、 T細胞、 B細胞、ナチュラルキラー細 胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、 骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆 細胞、幹細胞もしくは癌細胞など]、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織も しくは臓器 [例えば、脳、脳の各部位 (例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、 視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、勝臓、腎臓、肝臓、生殖腺、 甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管 (例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺 、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織 (例 、褐色脂肪組織、白色脂肪組織)、骨格筋など]等から単離 ·精製される蛋白質であ つてもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質で あってもよ!/、し、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導 入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
[0020] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列 番号： 2で表されるアミノ酸配列と約 60%以上、好ましくは約 70%以上、さらに好ましく は約 80%以上、特に好ましくは約 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙 げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを 用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、 該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップ の導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対す る同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％)を意味する。「類似アミノ酸」とは 物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸 (Phe、 Trp、 Tyr)、脂肪族アミノ酸 (Ala、 Leu, lie, Val)、極性アミノ酸（Gln、 Asn)、塩基性ァ ミノ酸（Lys、 Arg、 His)、酸性アミノ酸（Glu、 Asp)、水酸基を有するアミノ酸（Ser、 Thr) 、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met)などの同じグループに分類される アミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化を もたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置 換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、 B owieら， Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nationalし enter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、以下の条件（期待値 =10；ギャップを許す；マトリクス =BLOSUM62；フィルタリ ング =OFF)にて計算すること力 Sできる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他の アルゴリズムとしては、例えば、 Karlinら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 ersion 2.0)に組み込まれている（Altschulら， Nucleic Acids Res., 25 : 3389-3402 (19 97)) ]、 Needlemanら， J. Mol. Biol., 48 : 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム [該ァ ルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の GAPプログラムに組み込まれている]、 Myersおよび Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズム は CGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である ALIGNプログラム（versi on 2.0)に組み込まれている]、 Pearsonら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-244 8 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の FA STAプログラムに組み込まれている]等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ 得る。
より好ましくは、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 とは、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と約 60%以上、好ましくは約 70%以上、さら に好ましくは約 80%以上、特に好ましくは約 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 である。
配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質としては、例えば、前記の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァ ミノ酸配列を含み、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同 質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
[0022] 実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド（即ち、 PACAP)結合活性およびシ グナル伝達活性 (例えば、アデ二ル酸シクラーゼ刺激活性 (cAMP産生上昇)、共役 3 量体 G蛋白質への GTP誘導体結合活性、ホスホリパーゼ C刺激活性 (細胞内 Ca濃度 上昇)等）などが挙げられる。 「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的 (例えば、 生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、リガンド結合活性や シグナル伝達活性などの活性は同等（例えば、約 0.5〜約 2倍）であることが好まし!/、 力 S、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 リガンド結合活性やシグナル伝達活性の測定は、 自体公知の方法（例えば、 WO 0 3/055507を参照）に準じて行なうことができる。
[0023] また、本発明で用いられる PAC1には、例えば、（1)配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列のうちほたは 2個以上 (好ましくは、 1〜100個程度、好ましくは 1〜50個程度、さら に好ましくは 1〜10個程度、特に好ましくは 1〜数 (2、 3、 4もしくは 5)個）のアミノ酸が 欠失したアミノ酸配歹 IJ、（2)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列にほたは 2個以上 (好 ましくは、 1〜100個程度、好ましくは 1〜50個程度、さらに好ましくは 1〜10個程度、特 に好ましくは 1〜数（2、 3、 4もしくは 5)個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配歹 IJ、（3)配列 番号： 2で表されるアミノ酸配列にほたは 2個以上 (好ましくは、 1〜50個程度、好まし くは 1〜10個程度、さらに好ましくは 1〜数 (2、 3、 4もしくは 5)個）のアミノ酸が揷入され たアミノ酸配歹 IJ、（4)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列のうちほたは 2個以上 (好まし くは、 1〜50個程度、好ましくは 1〜10個程度、さらに好ましくは 1〜数 (2、 3、 4もしくは 5)個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配歹 IJ、または (5)それらを組み合 わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が揷入、欠失または置換されている場合、その揷入、欠 失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
[0024] 本発明で用いられる PAC1は、好ましくは、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有 するヒト PAC1蛋白質（GenBankァクセッション番号： NP_001109)、あるいは他の哺乳 動物におけるそのオルソログ [例えば、 GenBankにそれぞれァクセッション番号 NP_03 1433および NP_598195として登録されているマウスおよびラットオルソログ（それぞれヒ ト PAC1に対して約 87.5%および約 87.3%の同一性を有する）等]である。
[0025] 本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端 力 末端（ァミノ末端）、右端が C末端 (カルボキシル末端）で記載される。配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明で用いられる PA C1は、 C末端がカルボキシル基（-COOH)、カルボキシレート (-COO— )、アミド（-CO NH )またはエステル（-COOR)の何れであってもよ!/、。
ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n-プロピル、イソプロピ ノレ、 n-ブチルなどの C アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロへキシルなどの
1-6
C シクロアルキル基；例えば、フエニル、 α _ナフチルなどの C ァリール基；例えば
3-8 6-12
、ベンジル、フエネチルなどのフエ二ルー C アルキル基； α —ナフチルメチルなどの
1-2
α _ナフチルー C アルキル基などの C ァラルキル基；ビバロイルォキシメチル基な
1-2 7-14
どが用いられる。
本発明で用いられる PAC1が C末端以外にカルボキシル基ほたはカルボキシレート )を有してレ、る場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されて!/、るものも本 発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のェ ステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられる PAC1には、 Ν末端のアミノ酸残基のァミノ基が保護基（ 例えば、ホルミル基、ァセチル基などの C アルカノィルなどの C ァシル基など）で
1-6 1-6
保護されているもの、生体内で切断されて生成し得る Ν末端のグルタミン残基がピロ グルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば- OH、 -SH、ァ ミノ基、イミダゾール基、インドール基、グァニジノ基など）が適当な保護基 (例えば、 ホルミル基、ァセチル基などの C アルカノィル基などの C ァシル基など）で保護さ
1-6 1-6
れているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質 [例えばヒト PAC1の場合、 例えば配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 28、 40、 97、 280及び 355で 示される Asn残基が可能性のある糖鎖付加部位として挙げられる（GPCR database (h ttp：〃 br.expasy.org/uniprot/PACR_HUMAN)に基づく）]などの複合蛋白質なども含 よれ 。
[0026] PAC1の部分ペプチドは、上記した PAC1の部分アミノ酸配列を有するペプチドであ り、且つ PAC 1と実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここ で「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」 の測定は PAC 1の場合と同様に行なうことができる。
具体的には、 PAC 1の部分ペプチドとして、例えば、配列番号： 2で表されるアミノ酸 配列のうち、リガンドである PACAPとの結合に関わる領域 [例えばヒト PAC 1の場合、 例えば配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1-135、 186-207、 272-289 および 352-365で示される細胞外領域 (GPCR database (http： //br. expasy . org/unipr ot/PACR_HUMAN)に基づく）など]や、 PACAPとの相互作用を介したシグナル伝達 に関わる領域 [例えば、三量体 G蛋白質の αサブユニット（G a )と結合してその GDP -GTP交換反応を促進する活性を有する領域 (例えば、細胞質第 3ループ領域)等] を含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。 PAC 1の部分ペプチドのサイ ズに特に制限はないが、例えば 10個以上、好ましくは 30個以上、より好ましくは 100個 以上、より好ましくは 200個以上のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列を含むもの が挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ酸配列であってもよく 、あるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたものであってもよ!/、。
[0027] また、 PAC 1の部分ペプチドは C末端がカルボキシル基（-COOH)、カルボキシレー ト（- COO— )、アミド（-CONH )またはエステル（-COOR)の何れであってもよい。ここで エステルにおける Rとしては、 PAC 1について前記したと同様のものが挙げられる。 PA C 1の部分ペプチドが C末端以外にカルボキシル基ほたはカルボキシレート）を有し ている場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも PAC 1の部 分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、 C末端のエステルと同 様のものなどが用いられる。
さらに、 PAC 1の部分ペプチドには、上記した PAC 1と同様に、 N末端のアミノ酸残基 のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N末端のグルタミン残基がピログルタミン 酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されてい るもの、あるいは糖鎖が結合した!/、わゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含ま れる。
[0028] 本発明で用いられる PAC 1またはその部分ペプチドは塩の形態であってもよい。例 えば、生理学的に許容される酸 (例：無機酸、有機酸)や塩基 (例：アルカリ金属）など との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩 としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるい は有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石 酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）と の塩などが用いられる。
[0029] PAC1は、前述した哺乳動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法 によって製造すること力 Sできる。具体的には、哺乳動物の組織または細胞をホモジナ ィズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有 画分を沈澱させ (必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製し）、該画 分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティーク口マトダラ フィ一などのクロマトグラフィー等に付すことにより PAC1またはその塩を調製すること 力できる。後述するように、本発明の好ましい態様においては、 PAC1は、上記細胞膜 含有画分から、適当な界面活性剤を用いて PAC1/界面活性剤複合体として精製さ れる。
[0030] PAC1またはその部分ペプチド（以下、これらの化学合成の説明においては、特に ことわらない限り、これらを包括して単に「PAC1」という）は、公知のペプチド合成法に 従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。 P AC1を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護 基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することがで きる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の (1)〜(5)に記載 された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszkyおよび] VLA. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, N ew York (1966年）
(2) Schroederおよび Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
(3)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株）（1975年） (4)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、蛋白質の化学 IV 205 ( 1977年）
(5)矢島治明監修、続医薬品の開発、第 14巻、ペプチド合成、広川書店
[0031] このようにして得られた PAC 1は、公知の精製法により精製単離することができる。こ こで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロ マトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる PAC 1が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法ある いはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に PAC 1が塩と して得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離 体または他の塩に変換することができる。
[0032] PAC 1の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような 樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルァミン 樹脂、アミノメチル樹脂、 4-ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4-メチルベン ズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4-ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル 樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、 4-(2，，4，-ジメトキシフエ二ル-ヒドロキシメチル)フエノキ シ樹脂、 4-(2 '，4 ' -ジメトキシフエニル- Fmocアミノエチル)フエノキシ樹脂などを挙げる こと力 Sでさる。このような樹脂を用い、 アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミ ノ酸を、 目的とする PAC 1の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で 縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に各種保護基を除去 し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的の PAC 1 またはそのアミド体を取得する。
[0033] 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試 薬を用いることができる力 特に、カルポジイミド類がよい。カルポジイミド類としては、 DCC、 N，N，-ジイソプロピルカルポジイミド、 N-ェチル -N， -(3-ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例え ば、 HOBt、 HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸 無水物または HOBtエステルあるいは HOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸 の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
[0034] 保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使 用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、 N，N-ジメチルホルム アミド， N，N-ジメチルァセトアミド， N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルォロエタノールなどのアルコール 類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類，ジォキサン ,テトラヒドロフランなどのエーテル類、ァセトニトリル，プロピオ二トリルなどの二トリル 類、酢酸メチル，酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範 囲から適宜選択され、通常約- 20°C〜50°Cの範囲から適宜選択される。活性化され たアミノ酸誘導体は通常 1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテスト の結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返す ことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られ ないときには、無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセ チル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護 基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
原料のァミノ基の保護基としては、例えば、 Z、 Boc、ターシャリーペンチルォキシカ ノレボニル、イソボルニルォキシカルボニル、 4-メトキシベンジルォキシカルボニル、 C1 -Z、 Br-Z、ァダマンチルォキシカルボニル、トリフルォロアセチル、フタロイル、ホルミ ノレ、 2-ニトロフエニルスルフエニル、ジフエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いら れる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、ェチル、プロピ ノレ、ブチノレ、ターシャリーブチノレ、シクロペンチノレ、シクロへキシノレ、シクロへプチノレ、 シクロオタチル、 2-ァダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステ ノレ化）、ァラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、 4-ニトロべンジルエステ ノレ、 4-メトキシベンジノレエステノレ、 4-クロ口べンジノレエステノレ、 ベンズヒドリノレエステノレ 化）、フエナシルエステル化、ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブ トキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。 セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することが できる。このエステル化に適する基としては、例えば、ァセチル基などの低級アルカノ イノレ基、ベンゾィル基などのァロイル基、ベンジルォキシカルボニル基、エトキシカノレ ボニル基などの炭酸力 誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する 基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロビラニル基、 t_ブチル基などである。 チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、例えば、 Bzl、 CI -Bzl、 2-ニトロべ ンジル、 Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、 Tos、 4-メトキシ -2,3,6-トリメチ ノレベンゼンスルホニル、 DNP、ベンジルォキシメチノレ、 Bum, Boc、 Trt、 Fmocなどが用 いられる。
[0036] 保護基の除去（脱離)方法としては、例えば、 Pd-黒あるいは Pd-炭素などの触媒の 存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸 処理や、ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、ピぺリジン、ピぺラジンなどに よる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸 処理による脱離反応は、一般に約- 20°C〜40°Cの温度で行なわれるが、酸処理にお いては、例えば、ァニソール、フエノール、チオアニソール、メタクレゾール、ノ ラタレ ゾール、ジメチルスルフイド、 1,4-ブタンジチオール、 1,2-エタンジチオールなどのよう なカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として 用いられる 2,4-ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、トリプトファ ンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1,2-エタンジチオール、 1 ，4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウ ム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
[0037] 原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、 アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフエノール、 2,4,5-トリクロロフ ェノール、 2,4-ジニトロフエノール、シァノメチルアルコール、パラニトロフエノール、 H ONB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフタルイミド、 HOBt)とのエステノレ〕など力 S 用いられる。原料のァミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミ ドが用いられる。
[0038] PAC 1のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸の
a -カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長 まで延ばした後、該ペプチド鎖の N末端の α -アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質 (ペプチド）と C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質 (ペプチド）と を製造し、この両蛋白質 (ペプチド)を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合 反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質 (保護ぺ プチド)を精製した後、上記方法によりすベての保護基を除去し、所望の粗蛋白質（ 粗ペプチド）を得ること力 Sできる。この粗蛋白質 (粗ペプチド）は既知の各種精製手段 を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の PAC 1のアミド体を得ること ができる。
PAC 1のエステル体は、例えば、カルボキシ末端アミノ酸の α -カルボキシル基を所 望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、上記 PAC 1のアミド体の場合と 同様にして得ることができる。
[0039] PAC 1の部分ペプチドは、 PAC 1全長蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断すること によっても製造することカできる。
[0040] 後述するように、本発明において免疫原として用いられる PAC 1またはその部分ぺ プチドは、ネイティブな構造（部分ペプチドにあっては、 PAC 1の本来の生理機能と同 質の機能を発揮し得る状態における構造)を保持し得るベぐ界面活性剤との複合体 として調製されることが好ましい。したがって、上記のようにして化学的に合成された Ρ AC 1またはその部分ペプチドは、好ましくは、動物への免疫に先立って、適当な界面 活性剤と混合することにより、その疎水性領域が界面活性剤ミセルで覆われた複合 体に調製される。
[0041] さらに、 PAC 1は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる 培養物から PAC 1を分離精製することによって製造することもできる。 PAC 1またはその 部分ペプチドをコードする核酸は DNAであっても RNAであってもよぐあるいは DNA/ RNAキメラであってもよい。好ましくは DNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であ つても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖 DNA、二本鎖 RNAまたは D NA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であつ ても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
PAC1またはその部分ペプチドをコードする DNAとしては、ゲノム DNA、哺乳動物（ 例えば、ヒト、ゥシ、サル、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウ ス、ゥサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞 [例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グ リア細胞、瞵 /3細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルノヽンス細胞、表皮細胞、 上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪 細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、 T細胞、 B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満 細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、 骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆 細胞、幹細胞もしくはガン細胞など]もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織 [ 例えば、脳、脳の各部位 (例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、 大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、勝臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆 嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管 (例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎 下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織 (例、褐色脂 肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など]由来の cDNA、合成 DNAなどが挙げられる。 P AC1またはその部分ペプチドをコードするゲノム DNAおよび cDNAは、上記した細胞- 組織より調製したゲノム DNA画分および全 RNAもしくは mRNA画分をそれぞれ铸型と して用い、 Polymerase Chain Reaction (以下、「PCR法」と略称する）および Reverse Tr anscriptase-PCR (以下、「RT_PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる 。あるいは、 PAC1またはその部分ペプチドをコードするゲノム DNAおよび cDNAは、 上記した細胞 ·組織より調製したゲノム DNAおよび全 RNAもしくは mRNAの断片を適 当なベクター中に揷入して調製されるゲノム DNAライブラリーおよび cDNAライブラリ 一から、コロニーもしくはプラークハイブリダィゼーシヨン法または PCR法などにより、 それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バタテリ オファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
PAC1をコードする DNAとしては、例えば、配列番号： 1で表される塩基配列を含有 する DNA、または配列番号： 1で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズする塩基配列を含有し、前記した PAC1と実質的に同質の活性 (例：リガン ド結合活性、シグナル伝達活性など）を有する蛋白質をコードする DNAなどが挙げら れる。
配列番号： 1で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズできる D NAとしては、例えば、配列番号： 1で表される塩基配列と約 60%以上、好ましくは約 7 0%以上、さらに好ましくは約 80%以上、特に好ましくは約 90%以上の相同性を有す る塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (N ational Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Ί ool)を 用い、以下の条件（期待値 =10；ギャップを許す；フィルタリング =ON；マッチスコア =1； ミスマッチスコア =-3)にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するため の他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様 に好ましく例示される。
[0043] ハイブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モ レキユラ一-クローニング (Molecular Cloning)第 2版 (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、巿販 のライブラリーを使用する場合、ハイブリダィゼーシヨンは、添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。ハイブリダィゼーシヨンは、好ましくは、ストリンジ ェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、 6 X SSC (sodium chloride/sodium citra te)中 45°Cでのハイブリダィゼーシヨン反応の後、 0.2 X SSC/0.1 % SDS中 65°Cでの 一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダィゼーシヨン溶液の塩濃度 、ハイブリダゼーシヨン反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、 ノ、イブリダィゼーシヨン反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更す ることにより、所望のストリンジエンシーに容易に調節することができる。
[0044] PAC1をコードする DNAは、好ましくは配列番号： 1で表される塩基配列で示されるヒ ト PAC1蛋白質をコードする塩基配列を含有する DNA (GenBankァクセッション番号: N M_001118)、あるいは他の哺乳動物におけるそのオルソログ（例えば、 GenBankにそ れぞれァクセッション番号 NM_007407および NM_133511として登録されているマウス およびラットオルソログ等）である。
[0045] PAC1の部分ペプチドをコードする DNAは、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基 配列を含み、且つ PAC1と同等の生理活性を有するペプチドをコードするものであれ ばいかなるものであってもよい。具体的には、 PAC1の部分ペプチドをコードする DNA としては、例えば、（1)配列番号： 1で表される塩基配列の部分塩基配列または（2) 配列番号： 1で表される塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする塩基配列を有し、且つ前記した PAC1と実質的に同質の活性 (例：リガンド 結合活性、シグナル伝達活性など）を有するペプチドをコードする DNAなどが用いら れる。
[0046] PAC1またはその部分ペプチドをコードする DNAは、該 PAC1またはその部分ぺプ チドをコードする塩基配列の一部分を有する合成 DNAプライマーを用いて PCR法に よって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだ DNAを、 PAC1蛋白質の 一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは合成 DNAを標識したものとハイブ リダィゼーシヨンすることによってクローニングすることができる。ハイブリダィゼーショ ンは、例えば、モレキュラー 'クローニング（Molecular Cloning)第 2版（前述）に記載 の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、 ノ、イブリダィゼーシヨンは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に 従って行なうことができる。
[0047] DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、 Mutan™-super Express Km (宝酒造（ 株））、 Mutan™- K (宝酒造（株））等を用いて、 ODA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 unkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することがで きる。
[0048] クローン化された DNAは、 目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化す る力、、リンカ一を付加した後に、使用すること力 Sできる。該 DNAはその 5'末端側に翻 訳開始コドンとしての ATGを有し、また 3'末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 T GAまたは TAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適 当な合成 DNAアダプターを用いて付加することができる。
[0049] PAC1またはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発現ベクターは、例えば、 P
AC1をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、該 DNA断片を適当な発 現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。 発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、 pBR322, pBR325, pUC12, pU C13)；枯草菌由来のプラスミド（例、 pUBl lO, pTP5, pC194)；酵母由来プラスミド（例 、 pSH19, pSH15)；昆虫細胞発現プラスミド（例： pFast-Bac)；動物細胞発現プラスミド (例： pAl-l l、 pXTl、 pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo)； λファージなどのバクテ リオファージ；バキュロウィルスなどの昆虫ウィルスベクター（例： BmNPV、 AcNPV)；レ トロウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウイルスなどの動物ウィルスベクターなどが 用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター であれば!/、かなるものでもよ!/、。
例えば、宿主が動物細胞である場合、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 LTR プロモーター、 CMV (サイトメガロウィルス）プロモーター、 RSV (ラウス肉腫ウィルス）プ 口モーター、 MoMuLV (モロニ一マウス白血病ウィルス） LTR、 HSV-TK (単純へルぺ スウィルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、 CMVプロモ 一ター、 SR aプロモーターなどが好ましい。
宿主がェシエリヒア属菌である場合、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロモ 一ター、 λ Ρプロモーター、 lppプロモーター、 T7プロモーターなどが好ましい。
L
宿主がバチルス属菌である場合、 SP01プロモーター、 SP02プロモーター、 penPプ 口モーターなどが好ましレ、。 宿主が酵母である場合、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモータ 一、 ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロモーターなどが好 ましい。
[0050] 発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりェンノヽンサ一、スプライシングシグ ナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 SV40複製起点（以下、 SV40 oriと略称す る場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、 例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、 dhfrと略称する場合がある、メソトレキセ ート（MTX)耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、 am と略称する場合がある）、ネ ォマイシン耐性遺伝子（以下、 nee/と略称する場合がある、 G418耐性）等が挙げられ る。特に、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、 dhfr遺伝子を選択マ 一力一として使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択する ことあでさる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナル コドン）を、 PAC1またはその部分ペプチドをコードする DNAの 5 '末端側に付加ほた はネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。例えば、宿主がェシエリヒア属菌で ある場合、 PhoA'シグナル酉己列、 OmpA'シグナル配列など力 宿主がバチルス属菌 である場合、 α -アミラーゼ ·シグナル配歹 IJ、サブチリシン'シグナル配列などが；宿主 が酵母である場合、 MF a ·シグナル配歹 l]、 SUC2 'シグナル配列などが；宿主が動物 細胞である場合、インスリン'シグナル配歹 IJ、 α _インターフェロン 'シグナル配歹 IJ、抗 体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
上記した PAC1またはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発現ベクターで宿 主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、 PAC1またはその部 分ペプチドを製造することができる。
宿主としては、例えば、ェシエリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、例えば、ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) 12 - DHl ,ェ シエリヒア'コリ JM103,ェシエリヒア'コリ JA221 ,ェシエリヒア'コリ HB101 ,ェシエリヒア' コリ C600などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス 'サブチルス（Bacillus subtilis) MI114, ノ チルス'サブチルス 207-21などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス 'セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae) A H22, AH22R— , NA87-11A, DKD- 5D, 20B_12、シゾサッカロマイセス'ボンべ（Schizo saccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036、ピキア'パストリス（Pichia pastoris) M71などが用いられる。
[0052] 昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが AcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細 胞（Spodoptera frugiperda cell ; Si|田胞）、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞、 Tri choplusia niの卵由来の High Five 細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞、 Estigmen a acrea由来の細胞などが用いられる。ウィルスが BmNPVの場合、昆虫細胞としては、 蚕由来株化細胞（Bombyx mori N細胞； BmN細胞）などが用いられる。該 Si^田胞とし ては、例えば、 Si9細胞（ATCC CRL1711)、 Si21細胞などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる。
[0053] 動物細胞としては、例えば、 COS_7、 Vero、 CHO、 CHO(dhfr―)、 CHO_Kl、 L、 AtT- 20、 GH3、 Fレ HEK293、 MH3T3、 Balb3T3、 FM3A、 L929, SP2/0、 P3U1、 B16、 P388 などの細胞が用いられる。
[0054] 形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
ェシエリヒア属菌は、例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69巻, 2110 (1972)や Gen e, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、 Molecular & General Genetics, 168巻， 111 (1979)など に記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182-187 (1991)、 Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 75巻， 1929 (1978)などに記載の方法に従って形質転換することができ 昆虫細胞および昆虫は、例えば、 Bio/Technology, 6巻， 47-55 (1988)などに記載 の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール， 263-267 (1 995) (秀潤社発行）、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って形質転換す ること力 Sでさる。
[0055] 形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することがで きる。
例えば、宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する 場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換 体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、 炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素 源としては、例えば、アンモニゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ'リカー、ペプトン 、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質力 無機 物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなど がそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など を添加してもよい。培地の pHは、好ましくは約 5〜約 8である。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば
、グルコース、カザミノ酸を含む M9培地が好ましい。必要により、プロモーターを効率 よく働かせるために、例えば、 3 β -インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加し てもよい。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約 15〜約 43°Cで、約 3〜 約 24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約 30〜約 40°Cで、約 6〜約 24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホ 一ルダー（Burkholder)最小培地や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地などが挙げら れる。培地の pHは、好ましくは約 5〜約 8である。培養は、通常約 20°C〜約 35°Cで、 約 24〜約 72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例 えば Grace's Insect Mediumに非働化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたも のなどが用いられる。培地の pHは、好ましくは約 6.2〜約 6.4である。培養は、通常約 27°Cで、約 3〜約 5日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約 5〜 約 20%の胎児ゥシ血清を含む最小必須培地（MEM) ,ダルベッコ改変イーグル培地（ DMEM) , RPMI 1640培地， 199培地などが用いられる。培地の pHは、好ましくは約 6 〜約 8である。培養は、通常約 30°C〜約 40°Cで、約 15〜約 60時間行なわれる。必要 に応じて通気や撹拌を行ってもよ!/、。 以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外に PAC1またはその部分ぺプ チド'を製造せしめること力 Sでさる。
[0056] 前記形質転換体を培養して得られる培養物から PAC1またはその部分ペプチドを自 体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、膜画分から PAC1またはその部分ペプチドを抽出する場合、培養物から公 知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、ホモジナイザー法、 超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊し た後、低速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、上清を高速遠心して細胞膜含有画分 を沈澱させる（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製する）などの 方法が用いられる。
このようにして得られた膜画分中に含まれる PAC1またはその部分ペプチドの単離 精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析ゃ 溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法;透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およ び SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方 法;イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；ァフィ二ティーク口 マトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィー などの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用す る方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
[0057] 力、くして得られる蛋白質またはペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、蛋白質ま たはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる 方法により、該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生する PAC1またはその部分ペプチドを、精製前または精製 後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリぺプ チドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、 キモトリプシン、ァノレギニノレエンドぺプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼ などが用いられる。
[0058] 後述するように、本発明の好ましい態様においては、 PAC1は、上記膜画分から、適 当な界面活性剤を用いて PAC1/界面活性剤複合体として精製される。
[0059] さらに、 PAC1またはその部分ペプチドは、上記の PAC1またはその部分ペプチドを コードする DNAに対応する RNAを铸型として、ゥサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚 芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ 合成すること力 Sできる。あるいは、さらに RNAポリメラーゼを含む無細胞転写/翻訳系 を用いて、 PAC1またはその部分ペプチドをコードする DNAを铸型としても合成するこ と力 Sできる。無細胞蛋白質転写/翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ 自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は Pratt J.M.ら， "Transcription and Tra nslation", Hames B.D.および Higgins S.J.編， IRL Press, Oxford 179-209 (1984)に記 載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由 来のものは E.coli S30 extract system (Promega社製)や RTS 500 Rapid Translation Sy stem (Roche社製)等が挙げられ、ゥサギ網状赤血球由来のものは Rabbit Reticulocyt e Lysate System (Promega社製)等、さらにコムギ胚芽由来のものは PROTEIOS™ (T OYOBO社製)等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適で ある。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えば Johnston F.B.ら， Nature, 179， 160-161 (1957)あるいは Erickson Α·Η·ら， Meth. Enzymol., 96， 38-50 (1996)等に記 載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法 (PrattJ.M.ら（1984)前 述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白 質合成システム（Spirin A.S.ら， Science, 242， 1162-1164 (1988))、透析法（木川ら、 第 21回日本分子生物学会、 WID6)、あるいは重層法（PROTEIOS™Wheat germ cell -free protein synthesis core kit取扱説明書： TOYOBO社製）等が挙げられる。さらに は、合成反応系に、铸型の RNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成 物や分解物を必要時に排出する方法（特開 2000-333673)等を用いることができる。
[0060] 後述するように、本発明において免疫原として用いられる PAC1またはその部分ぺ プチドは、ネイティブな構造（部分ペプチドにあっては、 PAC1の本来の生理機能と同 質の機能を発揮し得る状態における構造)を保持し得るベぐ界面活性剤との複合体 として調製されることが好ましい。したがって、上記のようにして無細胞系で合成され た PAC1またはその部分ペプチドは、好ましくは、動物への免疫に先立って、適当な 界面活性剤と混合することにより、その疎水性領域が界面活性剤ミセルで覆われた 複合体に調製される。
[0061] PAC1の部分ペプチドは、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫する こともできるが、分子内に 1ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量 (例えば、 分子量約 3,000以下）の抗原を用いる場合には、これらの抗原は通常免疫原性の低 ぃハプテン分子なので、適当な担体 (キャリアー）に結合または吸着させた複合体とし て免疫すること力できる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができ る。天然高分子としては、例えばゥシ、ゥサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミン や例えばゥシ、ゥサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニヮトリのオボアル ブミン、例えばゥシ、ゥサギ、ヒト、ヒッジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホール リンペットへモシァニン (KLH)などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリア ミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビュル類、ポリプロピレン類などの重合 物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
[0062] 該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対す る抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合ある!/、は吸着 させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然 もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン 1に対し 0.1〜100の割合で結 合あるいは吸着させたものを使用することができる。
[0063] また、ハプテンとキャリアーの力プリングには、種々の縮合剤を用いることができる。
例えば、チロシン、ヒスチジン、トリブトファンを架橋するビスジァゾ化べンジジンなど のジァゾニゥム化合物、アミノ基同士を架橋するダルタルアルデビトなどのジアルデヒ ド化合物、トルエン- 2,4-ジイソシァネートなどのジイソシァネート化合物、チオール基 同士を架橋する N，N， -0-フエ二レンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、ァミノ基と チオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、ァミノ基とカルボキシル基とを 架橋するカルポジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同士を架橋 する際にも、一方のァミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試薬 (例えば、 3_(2-ピリジルジチォ)プロピオン酸 N-スクシンィミジル（SPDP)など）を反応させた後 還元することによりチオール基を導入し、他方のァミノ基にマレイミド活性エステル試 薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
[0064] あるいは、 PAC1を発現する温血動物もしくは昆虫細胞自体またはその細胞膜含有 画分を、抗原として直接用いることもできる。温血動物もしくは昆虫細胞としては、内 在的に PAC1を産生する細胞、 PAC1をコードする DNAで形質転換した細胞などを用 いること力 Sできる力 S、内在性 PAC1は発現量が少ないことから、外来性 PAC1を強制的 に大量発現させた形質転換細胞を用いることがより好ましい。膜画分は、種々の公知 の方法を用いてリボソームと融合させ、プロテオリボソームとして用いることもできる。 例えば、膜画分とリボソームを適切な割合で混合した後に、凍結融解を繰り返す方法 、脂質混合液力 作製されたフィルム上に膜画分を含む水溶液を置いた後、水和法 により膜蛋白質を脂質二重層に移行させる方法等が本目的に使用できる。好ましく は、凍結融解法である。得られたプロテオリボソームは、超音波処理法、ホモジナイ ザ一法、濾過法 (エタストルーダー法）等によりサイジングすることができる。これらの 細胞または膜画分は、培地（例： RPMI1640)または緩衝液（例： Hanks' Balanced Salt Solution)に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては 、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良ぐ静脈内注射、腹腔 内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
[0065] 本発明の好ましい実施態様においては、免疫原として用いる PAC1またはその部分 ペプチドは、適当な界面活性剤との複合体として提供される。
PACほたはその部分ペプチド（以下、界面活性剤との複合体調製の説明にお!/、て は、両者を包括して「PAC1」と略記する）を、ネイティブな構造を保持したまま単離-精 製するためには、界面活性剤による可溶化が必要となる。膜蛋白質を変性させずに 可溶化するために、マイルドデタージェントと呼ばれる一連の非イオン性もしくは両ィ オン性界面活性剤が用いられる。ネイティブな構造を有する PAC1を認識し得る抗体 を効率よく得るためには、抗原提示能に優れた PAC1/界面活性剤複合体を免疫原と して用いる必要がある力 これにはミセルのサイズが大きく影響する。本発明者らは、 サイズの異なる種々の界面活性剤の中から、炭素数 8〜； 12のアルキル鎖を有するス クロースモノアルキレート、好ましくは β _D -フルクトビラノシル- α -ダルコピラノシドモ ノドデカノエート（SM1200)力、、あるいは炭素数 8〜12のアルキル- 13 -D-マノレトシド、 好ましくはドデシル- /3 -D-マルトシド (DDM)等を、抗原提示能に優れた PAC1/界面 活性剤複合体を提供し得るものとして見出した。また、例えば、コレステロールへミサ クシネート (CHS)等の両親媒性物質を併用することにより、 PAC1/界面活性剤複合 体の抗原提示能をさらに向上させることができる。界面活性剤と両親媒性物質の配 合比は特に制限はないが、例えば SM1200と CHSとの混合ミセルを用いる場合、 10 : 1〜； 10 : 3の配合比とすることが好ましい。可溶化剤として用いる界面活性剤の濃度 は、通常約 0· 5〜約 5%(w/w)の範囲である。
[0066] PAC1としては、上記 PAC1を発現する温血動物もしくは昆虫細胞（好ましくは、外来 性 PAC1を強制発現させた形質転換細胞）の細胞膜含有画分を用いることが好まし!/、 。これに蛋白質濃度が約 1〜約 5mg/mLの濃度となるように上記界面活性剤（両親媒 性物質との混合ミセルを含む）溶液を添加し、約 4〜約 20°Cで約 0. 5〜約 24時間ィ ンキュペートして膜蛋白質を可溶化させる。 PAC1の精製は、例えば、 PACAPを固相 化した水不溶性担体 (例えば、ガラスビーズ、樹脂、ゲルなど）に上記反応液を接触 させ、 PACAP-PAC1のァフィ二ティーを利用して PAC1/界面活性剤複合体を担体に 捕捉することにより行うこと力できる。あるいは、組換え PAC1を用いる場合は、 N末端 もしくは C末端にタグ配列（例： His-タグ、 GST-タグ、 Myc-タグ、 MBP-タグ等）を連結 しておいてもよい。 PAC1とタグとの連結部に適当なぺプチダーゼ認識部位を付加し ておくことあでさる。
[0067] (2)モノクローナル抗体の作製
(a)モノクローナル抗体産生細胞の作製
上記のようにして調製された免疫原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静 脈注入，皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそ れ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能 を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与して もよい。投与は通常 1〜6週毎に 1回ずつ、計 2〜10回程度行われる。用いられる温血 動物としては、例えば、サル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラット、ノ、ムスター、ヒ ッジ、ャギ、ロバ、ニヮトリが挙げられる。抗 Ig抗体産生の問題を回避するためには投 与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には 一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。
[0068] ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒト を投与対象とする場合には、（i)後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（ 例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、（ii)後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗 体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは (iii)体外免疫法とウィルスによる細胞不 死化、ヒト一ヒト (もしくはマウス)ハイプリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等と を組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では 抗体産生が抑制される抗原に対する抗体を取得できる可能性があることの他、 ng〜 Ii gオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了する ことなど力、ら、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒ ト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。
[0069] 体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましく はマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくは B リンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、 4〜12週齢程度の動物 力 脾臓を摘出 ·脾細胞を分離し、適当な培地 (例：ダルベッコ改変イーグル培地 (D MEM)、 RPMI1640培地、ハム F12培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ゥシ血清（ FCS ; 5〜20%程度）添加培地に浮遊させて 4〜10日間程度 COインキュベーターなど を用いて培養する。抗原濃度としては、例えば 0.05〜5 8が挙げられるがこれに限定 されない。同一系統の動物（1〜2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法 に従って調製し、培地に添加することが好ましレ、。
[0070] ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、 IL-2、 IL-4 、 IL-5、 IL-6等数種のサイト力インおよび必要に応じてアジュバント物質（例：ムラミノレ ジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。
[0071] モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラ ット)もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット)から抗体価の上昇が認められた個体も しくは細胞集団を選択し、最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは 体外免疫後 4〜 10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと 骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイプリドーマを調製することができる 。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に 結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。
[0072] 骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生し得るものであれば特 に制限はないが、 自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましぐまた、細胞融 合効率が高いものがより好ましい。また、ハイプリドーマの選択を容易にするために、 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)感受性の株を用いることが好ましい。 例えばマウス骨髄腫細胞としては NS_1、 P3U1、 SP2/0、 AP_1等が、ラット骨髄腫細胞 としては R210.RCY3、 Y3-Ag 1.2.3等力 ヒト骨髄腫細胞としては SKO- 007、 GM 1500 -6TG_2、 LICR-LON-HMy2, UC729-6等が挙げられる。
[0073] 融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法 [ネイチヤー（Nature )、 256巻、 495頁 (1975年)]に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリ エチレングリコール (PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられる力 好ましくは PEGな どが用いられる。 PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的 低い PEG1000〜PEG6000が好ましい。 PEG濃度としては例えば 10〜80%程度、好まし くは 30〜50%程度が例示される。 PEGの希釈用溶液としては無血清培地 (例： RPMI16 40)、 5〜20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、トリス緩衝 液等の各種緩衝液を用いることができる。所望により DMSO (例： 10〜20%程度）を添 カロすることもできる。融合液の pHとしては、例えば 4〜10程度、好ましくは 6〜8程度が 挙げられる。
[0074] 抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、通常 1 : 1〜20: 1程 度であり、通常 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cで通常 1〜10分間インキュベートするこ とにより効率よく細胞融合を実施できる。
[0075] 抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウィルスに抗体産生細胞 を感染させて該細胞を不死化することによつても得ることができる。そのようなウィルス としては、例えばェプスタイン一バー（EB)ウィルス等が挙げられる。大多数の人は伝 染性単核球症の無症状感染としてこのウィルスに感染した経験があるので免疫を有 しているが、通常の EBウィルスを用いた場合にはウィルス粒子も産生されるので、適 切な精製を行うべきである。ウィルス混入の可能性のない EBシステムとして、 Bリンパ 球を不死化する能力を保持するがウィルス粒子の複製能力を欠損した組換え EBウイ ノレス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスィッチ遺伝子における 欠損など）を用いることもまた好ましレ、。
[0076] マーモセット由来の B95-8細胞は EBウィルスを分泌しているので、その培養上清を 用いれば容易に Bリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血 清及びペニシリン/ストレプトマイシン（P/S)添加培地（例： RPMI1640)もしくは細胞 増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養 上清を分離し、これに抗体産生 Bリンパ球を適当な濃度（例：約 107細胞/ mL)で浮遊 させて、通常 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cで通常 0·5〜2時間程度インキュベートす ることにより抗体産生 Β細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ 球として提供される場合、大部分の人は ΕΒウィルス感染細胞に対して傷害性を示す Τリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えば ヒッジ赤血球等と Εロゼットを形成させることによって Τリンパ球を予め除去しておくこ とが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒッジ赤血球を抗体産生 Βリンパ球と混合 し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異 的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗 原特異的な Βリンパ球はキャップされて表面に IgGを提示しなくなるので、抗 IgG抗体 を結合したヒッジ赤血球と混合すると抗原非特異的な Bリンパ球のみがロゼットを形 成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層 を採取することにより、抗原特異的 Bリンパ球を選別することができる。
[0077] トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体 分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させるこ とができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。
[0078] ハイプリドーマのスクリーニング、育種は通常 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、 チミジン）を添加して、 5〜20% FCSを含む動物細胞用培地（例： RPMI1640)もしくは細 胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび チミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約 0.1mM、約 0.4〃 Mおよび約 0.016mM等 が挙げられる。ヒトーマウスハイプリドーマの選択にはゥヮバイン耐性を用いることがで きる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてゥヮバインに対する感受性が高いので、 10_7 〜10—3M程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
[0079] ハイプリドーマの選択にはフィーダ一細胞やある種の細胞培養上清を用いることが 好ましい。フィーダ一細胞としては、ハイプリドーマの出現を助けて自身は死滅するよ うに生存期間が限られた異系の細胞種、ハイプリドーマの出現に有用な増殖因子を 大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる 。例えば、マウスのフィーダ一細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細 胞等が、ヒトのフィーダ一細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養 上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上 清が挙げられる。
[0080] また、ハイプリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性 化セルソータ（FACS)を用いて抗原と結合する細胞を分離することによつても選択す ること力 Sできる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイプリドーマを直接選 択すること力 Sできるので、クローユングの労力を大いに軽減することが可能である。
[0081] 標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローユングに は種々の方法が使用できる。
[0082] アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去する ことが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は 10〜14日以内に死 滅するので、融合 2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイ プリドーマについては通常融合後 4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持さ れる。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後 1週間以上後に除去するのが 望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合 7〜10日後にヒポキサンチンおよび チミジン（HT)添加完全培地（例： 10% FCS添力 PRPMI1640)の添加または交換を行う。 融合後 8〜14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径力 Slmm程度 になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
[0083] 抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体ある!/、はその部分ペプチド（ 抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着 させた固相（例：マイクロプレート）にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物 質 (例：125I、 131I、 3H、 14C)、酵素（例： β ガラクトシダーゼ、 13 ダルコシダーゼ、ァ ルカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フ ルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノ ール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン)などで標識した抗免疫グロブリン (IgG)抗体（ もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来の IgGに対する抗体が用レ、 られる）またはプロテイン Aを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する 抗体を検出する方法、抗 IgG抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイブリド 一マ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導 体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原 (抗原決定基）に対 する抗体を検出する方法などによって行うことができる。
[0084] クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられる力 軟寒天を用いたクロー ユングや FACSを用いたクローニング（上述)も可能である。限界希釈法によるクロー ユングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。
[0085] 上記のようにして抗体量を測定して陽性ゥエルを選択する。適当なフィーダ一細胞 を選択して 96ゥエルプレートに添加しておく。抗体陽性ゥエルから細胞を吸い出し、 完全培地（例： 10% FCSおよび P/S添カロ RMPI1640)中に 30細胞/ mLの密度となるよう に浮遊させ、フィーダ一細胞を添加したゥエルプレートに O. lmL (3細胞/ゥエル）加え 、残りの細胞懸濁液を 10細胞/ mLに希釈して別のゥエルに同様にまき（1細胞/ゥエル )、さらに残りの細胞懸濁液を 3細胞/ mLに希釈して別のゥエルにまく（0.3細胞/ゥエル )。 目視可能なクローンが出現するまで 2〜3週間程度培養し、抗体量を測定'陽性ゥ エルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローユングが比較的困難な ので、 10細胞/ゥエルのプレートも調製しておく。通常 2回のサブクローユングでモノク ローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる力 S、その安定性を確認するため にさらに数ケ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
[0086] ハイプリドーマは in vitroまたは in vivoで培養すること力 Sできる。
in vitroでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイ プリドーマを、細胞密度を例えば 105〜106細胞/ mL程度に保ちながら、また、 FCS濃 度を徐々に減らしながら、ゥエルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙 げられる。
in vivoでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞 腫 (MOPC)を誘導したマウス（ノ、イブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、 5〜1 0日後に 106〜107細胞程度のハイプリドーマを腹腔内注射し、 2〜5週間後に麻酔下 で腹水を採取する方法が挙げられる。
[0087] (b)モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分 離精製法 [例:塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換 体 (例： DEAE、 QEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相ある いはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など]に従って行うことができる。
以上のようにして、ハイプリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その 体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造する こと力 Sでさる。
[0088] 好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として 使用されることから、本発明の抗体はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低 減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウスーヒトキメラ抗体などで あり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方 法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、上記したヒ ト一ヒト (もしくはマウス)ハイプリドーマより製造することも可能ではある力 大量の抗 体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例：マウス )またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましレ、。
[0089] (i)キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、 Η鎖および L鎖の可変領域 (Vおよび V )の
H L
配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域 (Cおよび C )の配列が他の哺乳動物種
H L
に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイプリ ドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましぐ定常領域の配列は 投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第 6,331,415号に記載される方法あ るいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のように して得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス一マウスハイブリ ドーマ）から、常法に従って mRNAもしくは全 RNAを調製し、 cDNAを合成する。該 cDN Aを鍀型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとして Vおよび Vの各
H L
N末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴ DNA、アンチセンスプライマーとして Cおよび Cの N末端配列をコードする塩基配列とハイブリダィズするオリゴ DNA (例
H L
えば Bio/Technology， 9: 88-89， 1991参照））を用い、常法に従って PCRで Vおよび V
H
をコードする DNAを増幅.精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例：ヒト）のリ し
ンパ球等より調製した RNAから RT-PCRにより Cおよび Cをコードする DNAを増幅，
H L
精製する。常法を用いて Vと C 、 Vと Cをそれぞれ連結し、得られたキメラ H鎖 DNA
H H L L
およびキメラ L鎖 DNAを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、 CHO細胞、 COS細 胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例： CMVプロモーター、 SV40プロモーター等）を含むベクターなど）に揷入する。両鎖をコードする DNAは別 個のベクターに揷入してもよいし、 1個のベクターにタンデムに揷入してもよい。得ら れたキメラ H鎖およびキメラ L鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞 としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスタ 一卵巣（CHO)細胞、サル由来の COS-7細胞、 Vero細胞、ラット由来の GHS細胞など が挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、 好ましくはエレクト口ポレーシヨン法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一 定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラ モノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてゥシ、ャギ、二 ヮトリ等のトランスジエニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハ ゥが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジエニック動 物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラ モノクローナノレ抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タ ノ コなどのトランスジエニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されてレヽ る植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクト口 ポレーシヨン、無傷細胞へのパーティクルガン法や Tiベクター法などを用いてトランス ジエニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体 を得ることも可能である。
[0091] 得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すれば Fabが、ペプシンで分解 すれば F(ab ' )がそれぞれ得られる。
また、マウス Vおよび Vをコードする DNAを適当なリンカ
H L 一、例えば 1〜40アミノ酸、 好ましくは 3〜30アミノ酸、より好ましくは 5〜20アミノ酸からなるペプチド（例： [Ser-(Gly )m]nもしくは [(Gly)m-Ser]n (mは 0〜10の整数、 nは 1〜5の整数）等）をコードする DNA を介して連結することにより scFvとすることができ、さらに C をコードする DNAを適当
H3
なリンカ一を介して連結することにより minibodyモノマーとしたり、 C全長をコードする
H
DNAを適当なリンカ一を介して連結することにより scFv-Fcとすることもできる。このよう な遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードする DNAは、適当なプロモー ターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、 大量に抗体分子を生産することができる。
マウス Vおよび Vをコードする DNAを 1つのプロモーターの下流にタンデムに揷入
H L
して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現により Fvと呼ばれる二量体 を形成する。また、分子モデリングを用いて Vおよび Vの FR中の適当なアミノ酸を Cy
H L
sに置換すると、両鎖の分子間ジスルフイド結合により dsFvと呼ばれる二量体が形成さ れる。
[0092] (ii)ヒト化抗体
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（CDR) 以外のすべての領域（即ち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域（FR) )の配列がヒト由来であり、 CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意 味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイプリドーマを作製す ることができる動物種が好まし!/、。
[0093] ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第 5,225,539号、第 5,585,089号、第 5 ，693,761号および第 5,693,762号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方 法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺 乳動物種 (例：マウス）由来の Vおよび Vをコードする DNAを単離した後、常法により
H L
自動 DNAシークェンサ一（例： Applied Biosystems社製等）を用いてシークェンスを行 い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列デ ータへース [例えは、 abat database (Kabatら，「Sequences of Proteins of Immunologi cal InterestJ , US Department of Health and Human Services, Public Health Service, MH編，第 5版， 1991参照）等]を用いて解析し、両鎖の CDRおよび FRを決定する。 決定された FR配列に類似した FR配列を有するヒト抗体の L鎖および H鎖をコードす る塩基配列 [例：ヒト κ型 L鎖サブグノレープ Iおよびヒト H鎖サブグノレープ IIもしくは III ( Kabatら， 1991 (上述）を参照）]の CDRコード領域を、決定された異種 CDRをコードす る塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を 20〜40塩基程度のフラグメ ントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバ 一ラップするように 20〜40塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントを DNAシ ンセサイザ一を用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダィズおよびライゲート させることにより、ヒト由来の FRと他の哺乳動物種由来の CDRを有する Vおよび Vを
H L
コードする DNAを構築すること力 Sできる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来 CDRをヒト由来 Vおよび Vに移植するには、 PCRによる部位特異的変異誘発を用い
H L
ることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平 5-227970号公報に記載の 逐次 CDR移植法等力《挙げられる。このようにして得られる Vおよび Vをコード、する DN
H L
Aを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来の Cおよび Cをコードする DNA
H L
とそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細 胞あるいはトランスジエニック動植物を得ることができる。
[0094] ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いて scFv、 scFv_Fc、 minibo dy、 dsFv、 Fvなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌 や酵母などの微生物でも生産させることができる。
[0095] ヒト化抗体作製技術は、例えばノヽイブリドーマの作製技術が確立して!/、な!/、他の動 物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる
。例えば、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ニヮトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されてい る動物やィヌゃネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。
[0096] (iii)ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン (Ig)遺伝子をノックアウト（KO)した非ヒト温血動物に機能的 なヒ Hg遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒ ト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイプリドーマ作製技術が確立してい る動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって 完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒ Hgの H鎖および L 鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジエニック（Tg)技術を用いて導入したマウスと、内因 性マウス Ig遺伝子を通常の KO技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られ たヒト抗体産生マウス（Immunol. Today, 17: 391-397， 1996を参照）を用いて、ヒトモノ クローナル抗体が作製された。これらのヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨 床段階にあり、現在までのところ、被験者における抗ヒ Hgヒト抗体 (HAHA)の産生は 報告されていない。
[0097] その後、 Abgenix社 [商品名 : XenoMouse (Nat. Genet., 15: 146-156， 1997;米国特 許第 5,939,598号等を参照）]や Medarex社 [商品名： Hu-Mab Mouse (Nat. Biotechnol .， 14: 845-851, 1996;米国特許第 5,545,806号等を参照）]が酵母人工染色体 (YAC )ベクターを用いてより大きなヒ Hg遺伝子を導入した Tgマウスを作製し、よりレバートリ 一に富んだヒト抗体を産生し得るようになった。し力もながら、ヒ Hg遺伝子は、例えば H鎖の場合、約 80種の V断片、約 30種の D断片および 6種の J断片が様々に組み合 わされた VDJェクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現してい るため、その全長は H鎖が約 1.5Mb (14番染色体）、 K L鎖が約 2Mb (2番染色体）、 λ L鎖が約 1Mb (22番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レバートリ 一を他の動物種で再現するためには、各 Ig遺伝子の全長を導入することが望ましい 1S 従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、 BAC、 YAC等）に揷入可能な D NAは通常数 kb〜数百 kbであり、クローユングした DNAを受精卵に注入する従来のト ランスジヱニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。
[0098] Tomizukaら（Nat. Genet., 16: 133-143， 1997)は、 Ig遺伝子を担持するヒト染色体の 自然断片 (hCF)をマウスに導入して (染色体導入 (TC)マウス）、完全長ヒ Hg遺伝子 を有するマウスを作製した。即ち、まず、 H鎖遺伝子を含む 14番染色体および κ L鎖 遺伝子を含む 2番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有す るヒトーマウスハイブリッド細胞を 48時間程度紡錘糸形成阻害剤（例：コルセミド）で処 理して、 1〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、 微小核融合法によりマウス ES細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒ ト Ig遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッド ES細胞を選択し、 通常の KOマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られる キメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト 14番染 色体断片を伝達する TCマウス系統 (TC(hCF14))およびヒト 2番染色体断片を伝達す る TCマウス系統（TC(hCF2))を樹立する。常法により内因性 H鎖遺伝子および κ L鎖 遺伝子を KOされたマウス（KO(IgH)および KO(Ig κ ))を作製し、これら 4系統の交配を 繰り返すことにより、 4種の遺伝子改変をすベて有するマウス系統（ダブル TC/KO)を 樹立すること力 Sでさる。
[0099] 上記のようにして作製されるダブル TC/KOマウスに、通常のマウスモノクローナル 抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗 体産生ハイプリドーマを作製することができる。しかしな力 、 K L鎖遺伝子を含む hC F2がマウス細胞内で不安定なため、ハイプリドーマ取得効率は通常のマウスの場合 に比べて低!/ヽとレ、う欠点がある。
[0100] 一方、前記 Hu-Mab Mouseは κ L鎖遺伝子の約 50%を含むが、可変領域クラスター が倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等の κ鎖の多様性を示し (他方 、 H鎖遺伝子は約 10%し力、含まないので H鎖の多様性は低ぐ抗原に対する応答性 が不十分である）、且つ YACベクター（Ig κ -YAC)によりマウス染色体中に挿入され ているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、 TC(hCF14)マウ スと Hu-Mab Mouseとを交配して hCF14と Ig κ -YACとを安定に保持するマウス（商品 名： KMマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイプリドーマ取得効率 および抗体の抗原親和性を得ることができる。
[0101] さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、 鎖遺 伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記 と同様の方法で λ L鎖遺伝子を担持するヒト 22番染色体もしくはその断片を導入した 酉己することにより得ることもできるし、あるいは、例えば H鎖遺伝子座と 鎖遺伝子 座とを含むヒト人工染色体 (HAC)を構築してマウス細胞に導入することにより得ること もできる（Nat. Biotechnol., 18: 1086-1090， 2000)。
[0102] (iv)ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう 1つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法 である。この方法は PCRによる変異が CDR以外に導入される場合があり、そのため臨 床段階で少数の HAHA産生の報告例がある力 S、その一方で宿主動物に由来する異 種間ウィルス感染の危険性がな!/、点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや 糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。
[0103] ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のもの が挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ (Ffパクテリオファ ージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来タンパク質を提示する方法としては 、 g3p、 g6p〜g9pのコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質として該コートタン ノ ク質上で発現 '提示させる方法が挙げられる力 よく用いられるのは g3pもしくは g8p の N末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、 1)ファ ージゲノムのコートタンパク質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファー ジ表面上に提示されるコートタンパク質をすベて外来タンパク質との融合タンパク質 として提示させるものの他、 2)融合タンパク質をコードする遺伝子を野生型コートタン ノ ク質遺伝子とは別に挿入して、融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時 に発現させるものや、 3)融合タンパク質をコードする遺伝子を有するファージミドベタ ターを持つ大腸菌に野生型コートタンパク質遺伝子を有するヘルパーファージを感 染させて融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現するファージ粒子 を産生させるものなどが挙げられるが、 1)の場合は大きな外来タンパク質を融合させ ると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには 2)または 3)のタイ プが用いられる。 [0104] 具体的なベクターとしては、 Holtら（Curr. Opin. Biotechnol. , 11 : 445-449， 2000)に 記載されるものが例示される。例えば、 CESKj. Biol. Chem. , 274: 18218-18230， 19 99参照）は、 1つのラタトースプロモーターの制御下に g3pのシグナルペプチドの下流 に κ L鎖定常領域をコードする DNAと g3pシグナルペプチドの下流に CH3をコードす る D氣 His_tag、 c-myc tag,アンバー終止コドン (TAG)を介して g3pコード配列とが 配置された Fab発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に 導入すると g3pコートタンパク質上に Fabを提示する力 アンバー変異を持たな!/、HB2 15 朱などで発現させると可溶性 Fab抗体を産生する。また、 scFv発現型ファージミド ベクターとしては、例えば pHENl O. Mol. Biol. , 222:581-597， 1991)等が用いられる
[0105] 一方、ヘルパーファージとしては、例えば M13-K07、 VCSM13等が挙げられる。
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の 3 '末端とコートタンパ ク質遺伝子の 5 '末端にそれぞれシスティンをコードするコドンを含む配列を連結し、 両遺伝子を同時に別個に（融合タンパク質としてではなく）発現させて、導入されたシ スティン残基同士による S-S結合を介してファージ表面のコートタンパク質上に抗体を 提示し得るようにデザインされたもの（Morphosys社の CysDisplay™技術）等も挙げら れる。
[0106] ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ/非免疫ライブラリー、合成ライブラリ 一、免疫ライブラリ一等が挙げられる。
ナイーブ/非免疫（non-immunized)ライブラリ一は、正常なヒトが保有する Vおよび
H
V遺伝子を RT-PCRにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイべ し
クタ一にクローユングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄 、扁桃腺などのリンパ球由来の mRNA等が铸型として用いられる。疾病履歴などの V 遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススィッチが起こっていない IgM 由来の mRNAのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的 なものとしては、 CAT社のライブラリー（J. Mol. Biol. , 222: 581-597， 1991 ; Nat. Biote chnol. , 14: 309-314， 1996参照）、 MRC社のライブラリー（Annu. Rev. Immunol. , 12: 4 33-455， 1994参照）、 Dyax社のライブラリー（J. Biol. Chem. , 1999 (上述); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14: 7969-7974， 2000参照）等が挙げられる。
[0107] 合成ライブラリ一は、ヒト B細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、 V遺伝子 断片の、例えば CDR3等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配 歹 IJをコードする DNAで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的な scFv や Fabを産生する Vおよび V遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので
H L
、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、 Morphosy s社の HuCALライブラリー（J. Mol. Biol. , 296: 57-86， 2000参照）、 Biolnvent社のライ ブラリー（Nat. Biotechnol., 18: 852， 2000参照）、 Crucell社のライブラリー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3938， 1995; J. Immunol. Methods, 272: 219-233， 2003参照) 等が挙げられる。
[0108] 免疫（immunized)ライブラリ一は、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者やワクチン 接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリン パ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等か ら、上記ナイーブ/非免疫ライブラリーの場合と同様にして mRNAを調製し、 RT-PCR 法によって Vおよび V遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的
H L
の抗体遺伝子がライブラリ一中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーか らでも目的の抗体を得ることができる。
[0109] ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンユング操作で 取り扱えるファージ数（iou〜io13ファージ）と通常のパンユングでクローンの単離およ び増幅に必要なファージ数（100〜1，000ファージ/クローン）を考慮すれば、 108〜10 11クローン程度が適当であり、約 108クローンのライブラリーで通常 10— 9オーダーの Kd 値を有する抗体をスクリーニングすることができる。
[0110] 標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンユングとい う。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ 、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体力 溶出させ、大腸菌 に感染させて該ファージを増殖させる、とレ、う一連の操作を 3〜5回程度繰り返すこと により抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体とし ては、通常の抗原抗体反応やァフィ二ティークロマトグラフィーで用いられる各種担 体、例えばァガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロ プレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（S PR)のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いても よぐまた、通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化 学結合を用いる方法でもよい。例えばビォチン一（ストレブト）アビジン系等が好ましく 用いられる。標的抗原である内因性リガンドがペプチドなどの小分子である場合には 、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意す る必要がある。非結合ファージの洗浄には、 BSA溶液などのブロッキング液（1-2回）、 Tween等の界面活性剤を含む PBS (3-5回）などを順次用いることができる。クェン酸 緩衝液 (pH5)などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通 常酸 (例： 0.1M塩酸など）が用いられる力 特異的プロテアーゼによる切断 (例えば、 抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする 遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コ 一トタンパク質が提示されるので、コートタンパク質のすべてが融合タンパク質として 発現しても大腸菌への感染 ·増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あ るいは S-S結合の還元（例えば、前記した CysDisplay™では、パンユングの後、適当な 還元剤を用いて抗体とコートタンパク質とを解離させることにより抗原特異的ファージ を回収すること力できる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで 中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収 する。
[0111] パンユングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸 菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、 抗体価測定法（例： ELISA、 RIA、 FIA等）や FACSある!/、は SPRを利用した測定により 抗原結合活性を確認する。
[0112] 選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離'精製は 、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子 の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージ をアンバー変異を持たない大腸菌（例： HB215 朱）に感染させると、可溶性抗体分子 が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで 溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。 His -tagや c-myc tagを導入しておけば、 IMACゃ抗 c_myc抗体カラムなどを用いて容易 に精製すること力できる。また、パンユングの際に特異的プロテアーゼによる切断を 利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分 離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することがで きる。
[0113] ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト 抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用すること ができる。例えば、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ニヮトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖 されて!/、る動物やィヌゃネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動 物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライ ブラリーの利用がより有効である。
[0114] 上記のいずれかの方法によって得られる本発明の抗体は、 PAC1の PACAPとの結 合を阻害するものであっても、阻害しないものであってもよい。本発明の抗体が PAC1 の PACAPとの結合を阻害するか否かは、例えば、 PAC1を固相化した担体（PAC1発 現細胞自体やその細胞膜画分であってもよい）に、本発明の抗体の存在下および非 存在下で、標識した PACAPを含む溶液を接触させてインキュベートした後、液相を除 去し、固相上に結合した標識量を測定して、両条件下で比較することにより検定する ことができる。抗体の存在下で固相に結合する標識量が低下すれば、該抗体は PAC 1の PACAPとの結合を阻害し、標識量に変化がなければ、該抗体は PAC1の PACAP との結合を阻害しないと判定することができる。あるいは、 PACAPをセンサーチップ上 に固定化して、表面プラズモン共鳴により PAC1と PAC1/抗 PAC1抗体複合体の PAC APへの結合を測定'比較することによつても、 PAC 1と PACAPの結合阻害の有無を検 定することができる。また該抗体存在下、膜画分や精製受容体に標識した PACAPを 作用させ、ガラスフィルターに受容体とともに吸着する標識量によって、該抗体の PA C1の PACAPとの結合の阻害性を評価することができる。 例えば、後記実施例に示されるマウス抗ヒト PAC lモノクローナル抗体 #135E、 #130 D、 122B等は、 PAC 1の PACAPとの結合を阻害するのに対し、 #2C等は該結合を阻害 しない。
PAC 1の PACAPとの結合を阻害する本発明の抗体は、 PACAP-PAC 1のシグナル伝 達を遮断するので、 PAC 1のシグナル伝達活性を阻害する中和抗体である。本発明 の抗体が PAC 1のシグナル伝達活性を阻害するか否かは、より直接的には、抗体の 存在下および非存在下における PAC 1のエフェクター活性調節作用を比較すること により測定することができる。例えば、抗体の存在下および非存在下において、例え ば、 1)PAC 1およびアデ二ル酸シクラーゼ (AC)を細胞膜上に含む細胞もしくはその 膜画分に PACAPおよび ATPを添加し、生成する cAMP量を、抗 cAMP抗体を用いて 放射性物質 (例： 12¾、酵素（例：アルカリフォスファターゼ、バーオキシダーゼ）、蛍光 物質（例： FITC、ローダミン）等で標識した cAMPとの競合ィムノアッセィにより測定す る方法、 2)上記細胞もしくはその膜画分に [ α -32Ρ]ΑΤΡを添加し、生成する [32P]cAMP をアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法、 3)cAMP応答エレメント (CRE)の制御下にあるリポーター遺伝子（例:ルシフェラーゼ遺伝子）を導入した形 質転換細胞における該遺伝子の発現量を測定する方法、 4)PAC 1を含む膜画分に [35 S]GTP y S (G aサブユニットの GTPase活性によって加水分解を受けない GTPアナ口 グ)を添加し、膜に結合した放射活性を測定する方法等が挙げられる。あるいは、上 記 1)〜4)に代えて、 la)PAC lおよびホスホリパーゼ C (PLC)を細胞膜に含む細胞もし くはその膜画分にホスファチジルイノシトール- 4,5-二リン酸 (PIP)を添加し、生成する イノシトールリン酸 (IP3)量を測定する方法、 2)PAC 1および PLCを細胞膜に含む細胞 内の Ca2+量を測定する方法、 3)Ca2+によりアップレギュレートされる TPA ( 12-0-テトラ デカノィルホルボール- 13-アセテート）応答エレメント（TRE)の制御下にあるリボータ 一遺伝子を導入した形質転換細胞における該遺伝子の発現量を測定する方法等を 用いること力 Sできる。尚、細胞内 Ca2+量は、蛍光プローブ（ibra-2、 indo_l、 fluor_3、 Ca lcium-Green I等）を用いて分光学的に測定する力、、カルシウム感受性発光蛋白質で あるェクオリン等を用いて測定することができる。蛍光プローブを用いた分光学的測 定に適した装置として、 FLIPR (Molecular Devices社）システムが挙げられる。 例えば、後記実施例に示されるマウス抗ヒト PAC1モノクローナル抗体 #130Dは、完 全抗体（IgG)分子で IC 力 S10— 7Mのオーダーで PACl ' G蛋白質の GTP- γ S結合作用 を既存のペプチド性拮抗剤 PACAP(6_38)NHより強く阻害する、強力な中和抗体で ある。本抗体を産生するハイブリドーマ（PC1-SM-130D)は、 2006年 8月 4日付で、独 立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（IPOD T 305-8566 茨 城県つくば巿東 1-1-1 中央第 6)に受領されて!/、る（受託番号： FERM BP-10655)。
[0116] 一方、上記のようにして得られうる本発明の抗体は、 PACAPと拮抗的に PAC1に結 合して PACAPと同様のァゴニスト活性を示したり、 PAC1の任意の細胞外領域に結合 して PAC1の構造を変化させ、恒常的に活性化された状態にし得るものであってもよ い。そのような抗体も、上記と同様の方法により、スクリーニングすることができる。
[0117] 本発明の抗体はまた、他の抗 PAC1モノクローナル抗体の PAC1との結合を阻害す るものであっても、阻害しないものであってもよい。本発明の抗体が他の抗 PAC1モノ クローナル抗体の PAC1との結合を阻害するか否かは、例えば、上記 PAC1と PACAP の結合阻害の検定について例示された方法において、 PACAPの代わりに当該他の 抗 PAC1モノクローナル抗体を用いることによって検定することができる。
例えば、後記実施例に示されるマウス抗ヒト PAC1モノクローナル抗体 #2Cは、上述 のように自体 PAC1の PACAPとの結合を阻害しないが、 #34C、 #66A等の PAC1との結 合を促進する。従って、これらの抗体は、 #2Cと併用することにより、単独の場合よりも 強力に PAC1活性を中和し得ると考えられる。
[0118] 本発明の抗体は、ネイティブな構造を有する PAC1を認識し得るだけでなぐ変性し た PAC1をも認識すること力 Sできる。従って、本発明の抗体は、ウェスタンプロット分析 のような変性した PAC1蛋白質を検出する場合にも有効に利用することができる。
[0119] 本発明は、本発明の抗体を用いることを特徴とする、 PAC1活性調節剤、 PAC1の異 常が関連する疾患の予防'治療、および PAC1活性の異常が関連する疾患の診断剤 を提供する。
[0120] 上述のように、本発明の抗体は、 PAC1のネイティブな構造を認識してこれに結合し 、 PAC1の活性を調節することができるため、 PAC1活性調節剤として使用することが できる。ここで、 PAC1活性とは、 PACAPの結合により惹起される PAC1を介した細胞 内シグナル伝達活性をいい、 PAC1活性を調節するとは、該シグナル伝達活性を減 少または上昇させることを!/、う。
[0121] PACAPおよび PAC1の各種臓器における生物学的および薬理学的効果について は、例えば、 Pharmacol. Rev., (米国)， 2000年，第 52巻（第 2号)， pp. 269-324等に詳 述されている。例えば、 PACAPは中枢神経系においては、神経伝達物質や神経調 節因子としての作用の他、神経栄養因子としての作用や神経発生の調節機能が示 唆されている。したがって、その受容体である PAC1の生理作用を増強する本発明の 抗体は、中枢における脳浮腫や痴呆症状の改善などの予防 ·治療薬として使用する こと力 Sできる。また PACAP遺伝子欠損マウスの解析から、種々の刺激への反応性の 変化が認められ、不安レベルの低下や好奇心の亢進が認められるので、その受容体 である PAC 1の生理活性を阻害する本発明の抗体 (例えば、後記実施例に示される マウス抗ヒト PAC1モノクローナル抗体 #135E、 #130D、 #122B等）は、中枢における PA C1の生理活性の亢進が関連する疾患、例えば、鬱ゃ不安などの予防'治療剤として 使用すること力でさる。
一方、 PACAPは末梢においては、インシュリン分泌作用や雌における妊娠の維持 作用を有することが遺伝子導入および欠損マウスの解析から明らかになっているの で、その受容体である PAC1の生理活性を増強する本発明の抗体は、末梢における P AC1の生理活性の低下が関連する疾患、例えば、糖尿病や妊娠不全症などの予防' 治療剤として使用することができる。
[0122] 本発明の抗体は、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬 組成物とした後に、上記予防 ·治療剤として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機ある いは無機担体物質が用いられ、賦形剤、溶剤（分散剤）、溶解補助剤、懸濁化剤、安 定化剤、等張化剤、緩衝剤、 pH調節剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に 応じて、保存剤、抗酸化剤などの製剤添加物を用いることもできる。
[0123] 賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、 D-マンニトール、 D-ソノレビトーノレ、デンプ ン、 α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセル口 ース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケィ 酸、合成ケィ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
[0124] 溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロ ピレンダリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、ォリーブ油、綿実 油などが挙げられる。
[0125] 溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 D -マンニトール、トレハロース、安息香酸べンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレ ステロール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、サリチル酸ナト リウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
[0126] 懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウ ム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニゥム、塩化べンゼトニゥム 、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビュルアルコール、ポリビ ニノレピロリドン、カノレポキシメチノレセノレロースナトリウム、メチノレセノレロース、ヒドロキシ メチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロースなどの 親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる
[0127] 安定化剤の好適な例としては、ヒト血清アルブミン (HSA)、ピロ亜硫酸ナトリウム、口 ンガリット、メタ亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられる。
[0128] 等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、 D-マンニトール、 D-ソル ビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
[0129] 緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クェン酸塩などの緩衝液 などが挙げられる。
[0130] pH調節剤の好適な例としては、塩酸、水酸化ナトリウムなどの酸または塩基が挙げ られる。
[0131] 無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
[0132] 保存剤の好適な例としては、パラォキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベ ンジルアルコール、フエネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられ
[0133] 抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、ァスコルビン酸塩などが挙げられる。 [0134] 前記医薬組成物の剤形としては、例えば注射剤（例：皮下注射剤、静脈内注射剤、 筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、動脈内注射剤など）、点滴剤等の注入型製剤が挙 げられる。
[0135] 医薬組成物は、製剤技術分野にお!/、て慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の 方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述 する。医薬組成物中の抗体含量は、剤形、投与量などにより異なるが、例えば約 0.1 ないし 100重量％である。
[0136] 例えば、注射剤は、抗体を分散剤（例：ポリソルベート 80,ポリオキシエチレン硬化ヒ マシ油 60,ポリエチレングリコーノレ，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウ ムなど）、保存剤（例：メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロ口 ブタノール，フエノールなど）、等張化剤（例：塩化ナトリウム，グリセリン， D-マンニトー ノレ， D-ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例:蒸留水，生理的食塩水 , リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例:ォリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油 などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することによ り製造される。この際、所望により溶解補助剤 (例：サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウ ム等）、安定化剤（例：ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例：ベンジルアルコール等） 等の添加物を用いてもよい。注射液は、必要に応じて、例えばメンブレンフィルター 等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行い、通常、アンプル等の適当な容器に充 填される。
[0137] 注射剤は、上記液剤を真空乾燥などによって粉末とし、用時溶解 (分散)して使用 することもできる。真空乾燥法の例としては、凍結乾燥法、スピードバックコンセントレ 一ター（SAVANT社)を用いる方法などが挙げられる。凍結乾燥を行う際には、 -10°C 以下に冷却されたサンプルを用いて、実験室ではフラスコ中で、工業的にはトレイを 用いて、あるいはバイアル中で凍結乾燥させることが好ましい。スピードバックコンセ ントレーターを用いる場合は、 0〜30°C程度で、約 20mmHg以下、好ましくは約 10mm Hg以下の真空度で行われる。乾燥させる液剤中には、リン酸塩などの緩衝剤を添カロ して pHを 3〜 10程度とすることが好ましい。真空乾燥により得られる粉末製剤は長期 間安定な製剤として、用時注射用水、生理食塩水、リンゲル液等に溶解、もしくはォ リーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油、プロピレングリコール等に分散することに より注射剤とすることができる。
[0138] さらに、本発明の抗体は、他の薬剤などと併用してもよい。例えば、 PAC1の生理活 性を阻害する抗体を欝、不安などの予防 ·治療剤として用いる場合には、該疾患の 予防'治療活性を有する他の薬剤、例えば、イミブラミン、クロミプラミン、アミトリプチリ ン、マプロチリン、フノレボキサミン、ノ ロキセチン、フノレ才キセチン、ミノレナシプラン等 の抗欝薬、及び、クロルジァゼポキシド、ジァゼパム、ォキサゼパム、ブロマゼパム、 ロラゼパム、アルプラゾラム、クロチアゼバム、ェチゾラム等の抗不安薬などを併用す ること力 Sできる。また、例えば、 PAC1の生理活性を増強する抗体を、脳浮腫、痴呆症 状、糖尿病、妊娠不全症などの予防'治療剤として用いる場合には、該疾患の予防- 治療活性を有する他の薬剤、例えば、グリセロール、果糖、マンニトール、ステロイド 等の抗脳浮腫薬、ドネぺジル、ァマンタジン、チアプリド等の痴呆症状改善薬、インシ ュリン、トノレブタミド、グリクロビラミド、グリベンクラミド、メトホノレミン、ェパルレスタツト、 ボグリボース、ァカルボース、トログリタゾン等の抗糖尿病薬、及び、クェン酸クロミフェ ン、セキソビット、下垂体性性腺刺激ホルモン (HMG)、胎盤性性腺刺激ホルモン (H CG)等の妊娠不全症治療薬などを併用することができる。
[0139] 本発明の抗体と上記他の薬剤とを併用する場合、例えば（1)公知の製剤学的製造 法に準じ、所望により適宜製剤学的に許容され得る賦形剤等と共に単一剤に製造す る、（2)それぞれを所望により製剤学的に許容され得る賦形剤等を用いて各製剤とし 同時または時差を設けて組み合わせて使用（併用）する、または（3)それぞれを常法 により適宜賦形剤と共にそれぞれ製剤化したものをセット (キット剤等）等としてもよ!/、 。（2)の場合、本発明の目的が達成される限り、各製剤の投与回数は異なっていても よい。このような製剤中の有効成分の含有量は、各々の有効成分の有効量の範囲内 あるいは製剤学的、薬理学的に許容される範囲内であればよい。具体的には通常約 0.01〜約 100重量％である。
あるいは、本発明の抗体と上記他の薬剤とを、必要に応じて適当なリンカ一を介し て連結し、ィムノコンジュゲートとすることにより、本発明の抗体は、 自体予防'治療薬 として作用するだけでなぐ併用薬剤を標的細胞（即ち、 PAC1発現細胞）にターゲッ ティングする効果をも奏する。
[0140] 本発明の抗体を含有する上記製剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与 ルートなどによっても異なる力 S、例えば、うつ病の治療 ·予防のために使用する場合 には、本発明の抗体を 1回量として、通常約 0.01〜約 20mg/kg体重程度、好ましくは 約 0.1〜約 10mg/kg体重程度、さらに好ましくは約 0.1〜約 5mg/kg体重程度を、 3週に 1回程度〜週 2回程度、好ましくは 2週に 1回〜週 1回程度の間隔で、静脈注射、好ま しくは点滴静注により投与するのが好都合である。点滴静注の場合、 1回投与を、例 えば約 30〜約 180分、好ましくは約 60〜約 120分かけて行う。他の非経口投与および 経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重レ、場合に は、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体と他の薬剤とを組み合わせて用いる場合には、個々の薬物の最少推 奨臨床投与量を基準とし、投与対象、投与対象の年齢および体重、症状、投与時間 、投与方法、剤型、薬物の組み合わせなどにより、適宜選択することができる。
[0141] 本発明の抗体は、 PAC1を特異的に認識することができるので、被験液中の PAC1 の検出 ·定量、特にサンドイッチ免疫測定法による検出 ·定量などに使用することがで きる。すなわち、本発明は、例えば、（i)本発明の抗体と、被験液および標識化蛋白 質等とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化蛋白質等の割合を測定するこ とを特徴とする被験液中の PAC1の定量法、（ii)被験液と担体上に不溶化した本発明 の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させた後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被験液中の PAC1の定量 法を提供する。
上記 (ii)においては、不溶化抗体と標識化抗体とが互いに PAC1との結合を妨害し ないような抗原認識部位を有することが好ましい（例えば、一方の抗体が PAC1の N端 部を認識し、他方の抗体が細胞外ループ部を認識する等）。
[0142] 本発明の抗体は、ネイティブな構造を有する PAC1を認識し得るので、組織染色等 による in situ検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用い てもよく、また、抗体分子の F(ab')、 Fab'、あるいは Fab画分などいかなるフラグメント を用いてもよい。 PAC1に対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきもので はなぐ被測定液中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体 抗原複合体の量 を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用い て作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい 。例えば、ネフロメトリー、競合法、ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用 いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好まし い。
[0143] 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、 酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 [12 ¾、 [mI]、 [3H]、 [14C]などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなも のが好ましぐ例えば、 /3 _ガラクトシダーゼ、 /3 -ダルコシダーゼ、アルカリフォスファ ターゼ、バーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質として は、例えば、フルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン などが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチンーァビジ ン系を用いることもできる。
[0144] 抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよぐまた通常、蛋白 質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でも よい。担体としては、例えば、ァガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖 類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用い られる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体に被験液を反応させ（1次反応 )、さらに標識化した本発明の抗体を反応させ（2次反応)た後、不溶化担体上の標 識剤の活性を測定することにより被験液中の PAC 1量を定量すること力 Sできる。 1次反 応と 2次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして 行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる
〇
[0145] また、サンドイッチ法による免疫測定法にお!/、て、固相用抗体ある!/、は標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなぐ測定感度を向上させる等の目 的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよ!/、。
サンドイッチ法による PAC1の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる 本発明の抗体は PAC1との結合に力、かる部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、例えば、 2次反応で用いられる 抗体が、 PAC1の N端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、好ましくは N 端部以外、例えば細胞外ループ部を認識する抗体が用いられる。
[0146] 本発明の抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、ィムノメトリツ ク法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被験液中の抗原 と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原 (F)と抗体と 結合した標識抗原 (B)とを分離し (B/F分離）、 B, Fいずれかの標識量を測定し、 被験液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、 B/ F分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、第 1抗体として固相化抗体を用いる力、、あるいは、第 1抗体は可溶性のもの を用い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法が用いられる。
ィムノメトリック法では、被験液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に 対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被験液中の抗原と過 剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固 相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定 し被験液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不 溶性の沈降物の量を測定する。被験液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか 得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に 用いられる。
[0147] これら個々の免疫学的測定法を PAC1の定量に適用するにあたっては、特別の条 件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法 に当業者の通常の技術的配慮を加えて PAC1の測定系を構築すればよい。これらの 一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例え ば、入江 寛編「ラジオィムノアツセィ」（講談社、昭和 49年発行）、入江 寛編「続ラジ オイムノアツセィ」（講談社、昭和 54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学 書院、昭和 53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 2版）（医学書院、昭和 5 7年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 3版）（医学書院、昭和 62年発行）、「 メソッズ 'イン 'ェンザィモロジ一（Methods in ENZYMOLOGY)」 Vol. 70 (Immunoche mical Techniques (Part A))、 書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B》、 IKI 書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 ]書 Vol. 84 (Immunochemical T echniques (Part D: Selected Immunoassays))^同書 Vol. 92 (Immunochemical Techni ques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))^同書 Vol . 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、 PAC1を高感度に定量すること ができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での PAC1を定量することによって、 PAC1 活性の亢進もしくは低下に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被験体中に存在する PAC1を特異的に 検出するために使用することができる。また、 PAC1を精製するために使用する抗体力 ラムの作製、精製時の各画分中の PAC1の検出、被験細胞内における PAC1の挙動 の分析などに使用することができる。
上記のように、本発明の抗体を用いることにより、被験動物（例えば、ヒト、ゥマ、ィヌ 、ネコ、サノレ、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、マウス、ラット、ノヽムスター、モノレモット 、ニヮトリ等）における PAC1活性の異常（亢進または低下）が関連する疾患、例えば、 欝、不安、精神行動機能障害、性的機能障害、 (日内リズムの光同調障害）、脳浮腫 、痴呆症状、糖尿病や高インスリン血症等のインスリン分泌障害、妊娠不全症などの 診断が可能となる。より具体的には、本発明は、本発明の抗体を用いて、生体試料 中の PAC1発現量を測定することによる、 PAC1活性の異常が関連する疾患の診断方 法を提供する。ここで「診断」とは、発症の有無を判定することだけでなぐ将来発症 する可能性が高いか否かを予測することや、既に発症が判明している被験動物にお ける病態の進行度の評価なども含む意味で用いられる。 [0149] 本発明の方法に用いられる生体試料としては、被験動物由来のものであればいか なるものであってもよく、例えば、体液 (例：血液、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、 関節液、精液、尿、汗、涙など）、種々の細胞 ·組織片等が挙げられるが、被験動物 への侵襲が少ないという点で体液が好ましいが、 PAC1が膜蛋白質であることを考慮 すると、細胞含有試料であることが望ましい。従って、疾患が疑われる部位の細胞も しくは組織片（生検サンプル）、あるいは血液、血球細胞などが好ましい。
[0150] 生体試料中の PAC1の定量は、上記したいずれかの方法により行うことができる。測 定の結果、 PAC1量が正常値に比べて有意に増加している場合に、被験動物は PAC 1活性の亢進に関連する疾患に罹患している可能性が高いか、あるいは将来罹患す る可能性が高いと診断することができる。逆に、 PAC1量が正常値に比べて有意に減 少している場合に、被験動物は PAC1活性の低下に関連する疾患に罹患している可 能性が高!/、か、ある!/、は将来罹患する可能性が高!/、と診断すること力 Sできる。
[0151] 上述のように、本発明の抗体は PAC1の定量に用いることができるので、 PAC1の発 現を調節する物質のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明の抗体および PAC1発現細胞を用いることを特徴とす る、 PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング方法、および当該スクリーニング方 法によって得られる物質を提供する。
[0152] すなわち本発明は、例えば、（i)非ヒト哺乳動物の (1)血液、（2)特定の臓器、（3)臓器 力 単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分 に含まれる PAC1を定量することによる、 PAC1の発現を調節する物質のスクリーニン グ方法、（ii) PAC1またはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる PAC1を定量することによる、 PAC1の発 現を調節する物質のスクリーニング方法、（iii)非ヒト哺乳動物の (1)血液、（2)特定の臓 器、（3)臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いるこ とにより、細胞表層での PAC1の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の PA C1を確認することによる、 PAC1の発現を調節する物質のスクリーニング方法、（iv) PA Cほたはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を 用いることにより、細胞表層での PAC1の染色度合いを定量化することにより、細胞膜 上の PAC 1を確認することによる、 PAC 1の発現を調節する物質のスクリーニング方法 を提供する。
[0153] 細胞膜画分に含まれる PAC1の定量は具体的には以下のようにして行なう。
(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、 ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血 圧ラット、動脈硬化ゥサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤 (例えば、抗肥満薬、抗 糖尿病薬、降圧剤、血管作用薬、抗うつ薬など)あるいは物理的ストレス (例えば、浸 水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液 、あるいは特定の臓器 (例えば、勝臓、脳下垂体など）、組織 (例えば、勝島など）ある いは細胞（例えば、瞵 /3細胞、下垂体腺細胞など）を得る。得られた細胞等を、例え ば、適当な緩衝液 (例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、 HEPES緩衝液など）等 に懸濁し、界面活性剤 (例えば、トリトン Χ-100™、ツイーン 20™など)などを用いて該 細胞等を破壊し、さらに遠心分離や濾過、カラム画分などの手法を用いて細胞膜画 分を得る。
[0154] 細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜 が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモ ジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーゃポリトロン（Kinematica社 製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノ ズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の画分には、画分遠心 分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による画分法が主として用いられる。例 えば、細胞破砕液を低速（500rpm〜3000rpm)で短時間（通常、約 1〜10分）遠心し、 上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm)で通常 30分〜 2時間遠心し、得られる沈澱 を膜画分とする。該膜画分中には、 PAC1と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜 成分が多く含まれる。
[0155] 細胞膜画分に含まれる PAC1は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫 測定法、ウェスタンプロット解析などにより定量することができる。
力、かるサンドイッチ免疫測定法は前述の方法と同様にして行なうことができ、ウェス タンプロットは自体公知の手段により行なうことができる。 [0156] (ii) PAClまたはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従って作 製し、細胞膜画分に含まれる PAC1を定量することができる。
[0157] PAC1の発現を調節する物質のスクリーニングは、
(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスな どを与える一定時間前（30分前な!/、し 24時間前、好ましくは 30分前な!/、し 12時間前、 より好ましくは 1時間前ないし 6時間前)もしくは一定時間後（30分後ないし 3日後、好 ましくは 1時間後ないし 2日後、より好ましくは 1時間後ないし 24時間後）、または薬剤 あるいは物理的ストレスと同時に被験物質を投与し、投与後一定時間経過後（30分 後ないし 3日後、好ましくは 1時間後ないし 2日後、より好ましくは 1時間後ないし 24時 間後）、細胞膜における PAC1の量を定量することにより行なうことができ、
(ii)形質転換体を常法に従い培養する際に被験物質を培地中に混合させ、一定時 間培養後（1日後ないし 7日後、好ましくは 1日後ないし 3日後、より好ましくは 2日後な いし 3日後）、細胞膜における PAC1の量を定量することにより行なうことができる。
[0158] 細胞膜画分に含まれる PAC1の確認は、具体的には以下のようにして行なう。
(iii)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、 ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど、より具体的には、肥満マウス、糖尿病マウス、高血 圧ラット、動脈硬化ゥサギ、うつ病ラットなど）に対して、薬剤 (例えば、抗肥満薬、抗 糖尿病薬、降圧剤、血管作用薬、抗うつ薬など)あるいは物理的ストレス (例えば、浸 水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液 、あるいは特定の臓器 (例えば、勝臓、脳下垂体など）、組織 (例えば、勝島など）ある いは細胞（例えば、瞵 /3細胞、下垂体腺細胞など）を得る。得られた細胞等を、常法 に従って組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での PAC1 の染色度合いを定量化することによって、細胞膜上の PAC1を確認することにより、定 量的または定性的に、細胞膜における PAC1の量を確認することができる。
(iv) PAClまたはその部分ペプチドを発現する形質転換体等を用いて同様の手段を とることにより確言忍することあでさる。
[0159] 上記スクリーニング方法を用いて得られる物質は、 PAC1の発現を調節する（細胞膜 における PAC1の量を変化させる）作用を有する化合物であり、具体的には、（a) PAC 1の発現を増加させる（細胞膜における PAC1の量を増加させる）ことにより、 PACAP— PAC 目互作用を介する細胞刺激活性 (例えば、共役 における GTP-GDP交換反 応促進、細胞内 cAMP産生促進、イノシトールリン酸産生促進、細胞内 Ca2+取り込み 促進、インスリン分泌促進など）を増強させる物質、（b) PAClの発現を減少させる（細 胞膜における PAC1の量を減少させる）ことにより、該細胞刺激活性を減弱させる物質 である。
該物質としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産 物などが挙げられ、これらの物質は新規物質であってもよいし、公知物質であっても よい。
該細胞刺激活性を増強させる物質は、 PAC1の生理活性を増強するための安全で 低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる物質は、 PAC1の生理活性を減少させるための安全 で低毒性な医薬として有用である。
PAC1の発現を調節する物質は、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに 混合して医薬組成物とした後に、上記医薬として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機ある いは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤 ；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤な どとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの 製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、 D-マンニトール、 D-ソルビトール、デンプ ン、 α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセル口 ース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケィ 酸、合成ケィ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。 滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タ ルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、 α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチル セノレロース、カノレポキシメチノレセノレロース、カノレポキシメチノレセノレロースナトリウム、結 晶セノレロース、白糖、 D-マンニトーノレ、トレノヽロース、デキストリン、プノレラン、ヒドロキ シプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ポリビニノレピロリドンなど が挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、 カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメ チルスターチナトリウム、軽質無水ケィ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースな どが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロ ピレンダリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、ォリーブ油、綿実 油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 D -マンニトール、トレハロース、安息香酸べンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレ ステロール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、サリチル酸ナト リウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウ ム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニゥム、塩化べンゼトニゥム 、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビュルアルコール、ポリビ ニノレピロリドン、カノレポキシメチノレセノレロースナトリウム、メチノレセノレロース、ヒドロキシ メチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロースなどの 親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる 等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、 D-マンニトール、 D-ソノレ ビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クェン酸塩などの緩衝液 などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、ノ ラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベ ンジルアルコール、フエネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられ 抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、ァスコルビン酸塩などが挙げられる。 着色剤の好適な例としては、水溶性食用タール色素（例、食用赤色 2号および 3号、 食用黄色 4号および 5号、食用青色 1号および 2号などの食用色素、水不溶性レーキ 色素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など）、天然色素（例、 /3 -カ ロチン、クロロフィル、ベンガラなど）などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、ァス パルテーム、ステビアなどが挙げられる。
[0161] 前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイク 口カプセルを含む）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの経口剤；および 注射剤 (例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤など）、外 用剤 (例、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）、坐剤 (例、直腸坐剤、膣坐剤な ど）、ペレット、点滴剤、徐放性製剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）等の非経口剤 が挙げられる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の 方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述 する。医薬組成物中の有効成分の含量は、剤形、有効成分の投与量などにより異な る力 例えば約 0.1ないし 100重量％である。
例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤（例、乳糖， 白糖，デンプン， D-マンニトー ノレなど）、崩壊剤（例、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）、結合剤（例、 α 化デンプン，アラビアゴム，カノレポキシメチノレセノレロース，ヒドロキシプロピノレセノレロー ス，ポリビュルピロリドンなど）または滑沢剤（例、タルク，ステアリン酸マグネシウム，ポ リエチレングリコール 6000など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味の マスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティング基剤を用いて自体公 知の方法でコーティングすることにより製造される。
[0162] 該コーティング基剤としては、例えば糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、 腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤などが挙げられる 糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン 、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウなどから選ばれる 1種または 2種以上を併用し てもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒ ドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、メチノレヒドロキシェ チノレセノレロースなどのセノレロース系高分子；ポリビニノレアセターノレジェチノレアミノァセ テート、アミノアルキルメタアタリレートコポリマー E〔オイドラギット E (商品名）、ロームフ アルマ社〕、ポリビュルピロリドンなどの合成高分子；プルランなどの多糖類などが挙 げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロー ス フタレート、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース アセテートサクシネート、カノレポ キシメチルェチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース系高分子； メタアクリル酸コポリマー L〔オイドラギット L (商品名）、ロームフアルマ社〕、メタアクリル 酸コポリマー LD〔オイドラギット L-30D55 (商品名）、ロームフアルマ社〕、メタアクリル酸 コポリマー S〔オイドラギット S (商品名）、ロームフアルマ社〕などのアクリル酸系高分子； セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えばェチルセルロースなどのセルロー ス系高分子；アミノアルキルメタアタリレートコポリマー RS〔オイドラギット RS (商品名 )、 ロームフアルマ社〕、アクリル酸ェチル 'メタアクリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラ ギット NE (商品名）、ロームフアルマ社〕などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。 上記したコーティング基剤は、その 2種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい 。また、コーティングの際に、例えば酸化チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を用 いてもよい。
注射剤は、有効成分を分散剤（例、ポリソルベート 80,ポリオキシエチレン硬化ヒマ シ油 60,ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウム など）、保存剤（例、メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロ口 ブタノール，フエノールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム，グリセリン， D-マンニト ール， D-ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例、蒸留水，生理的食塩 水，リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例、ォリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ 油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することに より製造される。この際、所望により溶解補助剤 (例、サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリ ゥム等）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例、ベンジルアルコール等） 等の添加物を用いてもよい。注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
[0164] このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例え ば、ヒト、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して投与するこ と力 Sできる。
[0165] PAC1の発現を調節する物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法 などにより差異はある力 経口投与の場合、例えばうつ病患者（体重 60kgとして）に 対しては、一日にっき通常約 0.1〜100mg、好ましくは約 1.0〜50mg、より好ましくは約 1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その 1回投与量は投与対象、対象 臓器、症状、投与方法などによっても異なる力 例えば注射剤の場合であれば、例え ばうつ病常患者（体重 60kgとして）に対しては、一日にっき通常約 0.01〜30mg程度、 好ましくは約 0.1〜20mg程度、より好ましくは約 0.1〜10mg程度を投与するのが好都 合である。投与対象がヒト以外の場合も、ヒト 60kg当たりに換算した量を投与すること ができる。
[0166] 本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体 があり得る場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリボ核酸
cDNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シトシン
RNA ：リボ核酸 mRNA ：メッセンジャーリボ核酸 dATP ：デォキシアデノシン三リン酸 dTTP ：デォキシチミジン三リン酸 dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸 dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ：ドデシル硫酸ナトリウム
Gly ：グリシン
Ala ：ァラニン
Val ：バリン
Leu ：ロイシン
lie ：ィソロイシン
Ser ：セリン
Thr ：スレ才ニン
Cys ：システィン
Met ：メチォニン
Glu ：グルタミン酸
Asp ：ァスパラギン酸
Lys ：リジン
Arg ：アルギニン
His ：ヒスチジン
Phe ：フエニノレアラニン
Tyr ：チロシン
Trp ：トリブトファン
Pro ：プ πリン
Asn ：ァスパラギン
Gin ：グルタミン pGlu
Me
Et
Bu
Ph
TC 4 (R) カルボキサミド基
[0167] また、本明細書中で繁用される置換基、保護基及び試薬を下記の記号で表記する fos ： p―トノレエンスノレフォニノレ
CHO ：ホノレミノレ
Bzl
CI Bzl : 2, 6 ジクロロべ
Figure imgf000065_0001
ci-z
Br-Z ： 2—ブロモベンジノレ才キシカノレポ二ノレ
Boc ： t ブトキシカノレボニノレ
DNP ：ジニトロフエノーノレ
Trt ：トリチル
Bum ： tーブトキシメチノレ
Fmoc ： N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
HOBt ： 1ーヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt : 3,4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4 ォキソ
1,2,3 べンゾトリアジン
HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルボルネン- 2，3-ジカルボキシイミド
DCC ： N, N'—ジシクロへキシノレカノレボジイミド
[0168] 以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を 限定するものではない。 実施例
[0169] 実施例 1 SM1200/CHS混合ミセル系を用いたヒト PAC1の精製
ヒト PAC1を発現させた Si9細胞培養液（14 L)から、定法どおりポリトロン法にて膜画 分を調製した。蛋白質濃度を 2 mg/mLに希釈した後、 1.5%シユークロースモノラウレ ート（SM1200, Dojindo, S023) 及び 0.3%コレステリルへミサクシネートトリス塩（CHS, Sigma, C6013)を含む可溶化液を用いて、 4°Cで緩やかにローテーションして可溶化 した。可溶化前後の PAC1の見かけの親和性を図 1に、膜画分および可溶化後のス キャッチヤード解析を図 2に示す。図 1は可溶化に用いた膜画分 2 mg/mLを基準に、 希釈を横軸としてプロットして!/、るので、一定量の膜画分を可溶化した前後での受容 体の総親和性 (受容体数と平衡定数 (Kd)の積に比例)を反映したものとなっている。 スキャッチヤード解析の比較から、膜画分の 88%受容体が可溶化されたことがわかつ た（図 2)。
次に、可溶化液を 3倍に希釈した後、 Avidin-Affgel / Biotinyl PACAP38を 30当量 添加して、ァフィ二ティー吸着を行った（図 3)。
その後、ァフィ二ティー担体をカラムに充填し、カラム体積の 15倍量である約 900 m Lで洗浄を行い、酸性条件にて溶出液を 5分毎に約 5 mLずつチューブに分取した。 溶出画分の親和性を図 4に示す。画分 7-16 (洗浄液を含めて約 70 mL)を収集し、ァ ミドブラックを用いて蛋白定量を行ったところ、 15 g/mLであった。
[0170] 引き続き、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる PAC1の精製'濃縮を試みた。
上記ァフィ二ティークロマトグラフィー溶出液 70 mL (蛋白質 1050 μ g)を内径 1 cmの カラムを用いて 900〃 Lのヒドロキシアパタイト担体を充填した。流速は約 6.6 mL/hr (r ange 6)に設定し、カラム体積の 10倍量である約 9 mLで洗浄を行い、溶出液を 4分毎 に約 0.44 mLずつ分取した。溶出画分の親和性を図 5Aに示す。この内、画分 7-11を Main画分として採取し、画分 12-14を Subl画分、画分 6， 15-17を sub2画分として採取 し、それらの見かけの親和性をァフィ二ティークロマトグラフィー後の PAC1受容体溶 液（AF(initial))の結果とともに図 5Bに示す。
Main画分及びァフィ二ティークロマトグラフィー溶出画分につ!/、てスキャッチヤード 解析を行い、各画分の特性を解析した（図 6)。これによりヒト PAC1が精製されたことが 確認された。精製した PAC1受容体試料は Main、 sub画分を併せて約 1 mgであった。
[0171] 実施例 2 マウス抗ヒト PAC1モノクローナル抗体の作製
上記実施例 1で精製された PAC1受容体（以下、「SM1200/CHS可溶化 PAC1受容 体」と称する）を抗原として、初回にフロイント完全アジュバントと、 2回目以降はフロイ ント不完全アジュバントと等容量混合して作製したェマルジヨンを、 BALB/Cマウス（6 週齢，雌）の皮下に 10 gずつ 1週間毎に 4回の免疫を行った。試験採血の後、抗体 価上昇が認められたマウスを選択して、 10 gの抗原による最終免疫（静脈内投与） を行い、 4日後に脾臓を摘出した。脾臓細胞をほぐした後、滅菌ガーゼでろ過し、免 疫生物研究所製 Cat. No. 33612 TIL Medial (10% FCS含有）に浮遊させ、脾臓細胞 浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、 BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞 P3 X 63.Ag8.653 (P3X63)を用いた（ATCC CRL1580)。細胞融合は、原法（Nature, 256 ： 495, 1957)を改変して行った。即ち、脾臓細胞および P3X63をそれぞれ血清を含有 しない TIL Medialで 2度洗浄し、脾臓細胞と P3X63数の比率を 10: 1になるよう混合して 、 1500回転で 5分間遠心を行って細胞を沈澱させた。上清を十分に除去した後、沈 澱を軽くほぐし、 45%-ポリエチレングリコール（PEG) 4000 (免疫生物研究所社製 Cat- No. 33331)を 1.0 mL加え、 37°C温水槽中で 5分間静置して融合を行った。融合後細 胞に毎分 2 mLの割合で、 TIL Medial (10% FCS含有）を添加し、合計 40 mLの TIL Me dial (10% FCS含有）を加えた後 800回転で 5分間遠心して上清を除去した。この細胞 沈殿物を TIL Medial (10% FCS含有）に P3X63が 1 mL当り 2 X 106個になるように浮遊 させ、 96穴マルチディッシュ（Coaster社製）に 1ゥエルあたり 0.1 mLずつ播種した。播 種後、細胞を COインキュベータ一中、 37°C、 5% CO /95%大気の雰囲気下で培養し た。 24時間後 HAT (ヒポキサンチン 1 X 10— 4M、アミノプテリン 4 X 10— 7M、チミジン 1.6 X 1 0— 5M)を含んだ Cat. No. 33251 HAT Medial (10% FCS含有）（HAT培地）を 1ゥエル当 り 0.1 mLずつ添加することにより、 HAT選択培養を開始した。 HAT選択培養は、培養 開始 3、 6、 9日後に旧液を 0.1 mL捨てた後、 0.1 mLの HAT培地を添加することにより 継続した。ハイプリドーマの増殖は、細胞融合後 9〜14日で認められ、培養液が黄変 したとき (約 1 X 106細胞/ mL)上清を採取し、抗体価を測定した。
[0172] 実施例 3 精製マウス抗ヒトモノクローナル PAC1抗体の抗原との親和性 抗原 SM1200/CHS可溶化 PAC1受容体を MAXISORPに 2-5 μ g/mLになるように 50 H L/ゥエルずつ導入してー晚作用させ、その後 25%ブロックエースを含むブロック液 を 300 L入れてブロッキングした。 PBSで 3回洗浄した後、実施例 2で得られた抗体 および常法により作製した各クローンの Fabの溶液を、種々の濃度で室温で 1.5時間 作用させ、その後西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRPO)標識ャギ抗マウス IgG抗体（ American Qualer, A106PU)を 1000倍希釈にて室温で 1時間作用させ、 0.05% Tween2 0を含む PBSで 3回洗浄した。その後、 HRPO基質（TMB Peroxidase Substrate 2-com ponent Kit, 50-76-00， KPL社製）を 50 μ Lずつ分注して発色させ、 1N硫酸を 50 μ Lずつ分注して反応停止後、プレートリーダー（マルチスキャン；ラボシステムズ）を用 いて 450匪の吸光度を測定した。測定結果を図 7に、親和性データを表 1に示す。
[表 1]
Ag_Affinity R2 Bmax Subclass chain
2C 1. 07E-07 0. 9456 0. 5153 Gl K
2C— Fab 1. 48E-07 0. 1093 0. 1215
34C 3. 16E-08 0. 9882 0. 9414 Gl K
34C— Fab 1. 83E-06 0. 8953 1. 2961
39C 1. 59E-08 0. 9917 2. 0118 G2a K
39C— Fab 4. 00E-05 0. 9494 23. 4705
45A 1. 12E-08 0. 984 1. 8567 G2a K
45A_Fab 3. 76E-07 0. 8333 0. 4229
66A 1. 26E-07 0. 9821 1. 5327 Gl K
66A— Fab 1. 29E-06 0. 8679 1. 4089
95C 3. 95E-08 0. 9725 2. 3627 Gl K
95C— Fab 2. 19E-07 0. 9804 2. 0456
122B 7. 02E-08 0. 9539 0. 9774 Gl K
122B— Fab 7. 48E-07 0. 9658 1. 1969
130D 2. 93E-08 0. 9603 0. 7344 Gl K
130D— Fab 2. 75E-07 0. 9091 0. 6949
135E 4. 76E-09 0. 9263 0. 7816 G2a K
135E— Fab 1. 10E-08 0. 6085 0. 2396
[0174] サブクラスの同定
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (ロシュ 'ダイァグノスティックス， 1493027)を用いて、ハイプリドーマ培養上清を D-PDSで 30倍に希釈して 150 /i Lチュ ーブに添加して評価した。同定された各抗体クローンのサブクラスを表 1に示す。
[0175] 実施例 4 マウス抗ヒトモノクローナル PAC 1抗体による受容体のリガンド結合阻害 精製 SM1200/CHS可溶化 PAC 1受容体（0.4 mg/mL)を、 TED-DG buffer (20 mM T ris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Digitonin, 0.5 mM PMSF, 10 μ g/ mL Pepstatin A, 20 μ g/mL Leupeptin, 4 μ g/mL E-64)によって 200,000倍に希釈 し、 100 a Lずつ 5 mLポリエチレンチューブ（Falcon, 352053)に分注した。実施例 2 で得られた抗 PAC1モノクローナル抗体のダルベッコ PBS (D-PBS)溶液を、種々の濃 度で 10 しずつ添加し、 15-30分間 25°Cでインキュベートした後に、 125I_PACAP27 (2 nM)を 5 L添加してさらに 1時間 25°Cでインキュベートした。その後、ポリエチレンィ ミン処理した GF/Fグラスフィルター（Whatman)を用いて吸引ろ過し、フィルター上に 捕捉された125I_PACAP27の放射活性を γカウンタ一により検出した。測定は 3回行つ た。抗体の代わりに D-PBSを添加したものを 100% bound,終濃度 10— 7Mになるように co Id PACAP27を添加したものを 0% boundとして、 % of controlで評価した。結果を図 8及 び表 2に示す。
[表 2]
検出されず
試験せず
Figure imgf000071_0001
実施例 5 マウス抗ヒトモノクローナル PAC 1抗体による受容体活性阻害 GTP- y S結 合活性評価
PAC 1受容体遺伝子を導入し発現させたチャイニーズノヽムスター卵巣（CHO)細胞 をポリトロン法にて破砕し、 20 mM Tris- HC1、 1 mM EDTA、 5 mM MgCl、 150 mM Na Cl、 1 β Μ GDP、 1% BSAを含む緩衝液にて 150倍に希釈し、 100 μしとした。実施例 2 で得られたマウス抗 PAC 1モノクローナル抗体を、種々の濃度でそれぞれ 10 し添カロ した後、 15分、 25°Cにてインキュベートした。続いて 5 nM PACAP27を 10 L添カロし、 さらに 10 nM GTP y -35Sを 10 μ L添加して、 60分 25°Cにてインキュベートした。その後 、水で湿らせた GF/Fグラスフィルター（Whatman)を用いて吸引ろ過し、 50 mM Tris- HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA, 5 mM MgCl、 0.05% CHAPS, 0.1% BSAを含む洗浄用緩 衝液 1.5 mLで 2回洗浄した。フィルター上に捕捉された GTP y -35Sの放射活性を液体 シンチレ一ターにより検出した。測定は 2回行った。抗体の代わりに D-PBSを添カロし たものを 100% bound,終濃度 1.5 X 10— 6Mになるようにアンタゴニスト PACAP6-38を添 加したものを 0% boundとして、 % of controlで評価した。結果を図 9一;!〜 9— 2に示す
〇
この系ではアンタゴニスト PACAP(6_38)NHの阻害が IC 10— 7 M程度となっており、 文献値（Eur. J. Biochem. 207， 239 (1992))で報告された IC 2 nMと比べて 50倍程度 弱く見積もられている。この系での評価では IgG 130Dが IC 10— 7 Mオーダーの阻害、
122B、 135E、 45Aおよび 66Aが 10— 6Mオーダーの阻害となり、このうち 130D、 122B、 13 5Eおよび 45Aはアンタゴニスト PACAP(6_38)NHより GTP- γ S結合阻害度が大きい。 実施例 6 2つのマウス抗ヒトモノクローナル PAC 1抗体による競合 ELISA
精製 SM1200/CHS可溶化 PAC 1受容体を 2 μ g/mLとなるように 10 mMリン酸ナトリ ゥム (pH 8.0), 100 mM NaCl bufferで希釈した溶液を、 96穴 MAXSORP plateに 50 μ L ずつ添加し、一晚固相化した。このプレートをブロッキング液（25% Block Ace及び 0. 1 % NaNを含有する PBS) 320 μ Lにてー晚処理し、ブロッキングを行った。該プレート を PBSにて 2回洗浄後、 PBSに溶解した実施例 2で得られた第一のマウス抗ヒトモノク ローナル PAC 1抗体を PBSにて 4段階以上に希釈し、該希釈液を 40 し添加した（n=2 )。同仁のビォチン化キット（Biotin Labeling Kit - NH )を用いてビォチン化した第二 のマウス抗ヒトモノクローナル PAC 1抗体を、 1 μ g/mL (但し、 2C、 66Aおよび 135Eは それぞれ 5 μ g/mL, 2 μ g/mLおよび 0· 2 μ g/mL)となるように 20 mMリン酸ナトリウム（ pH 7.0), 0.4 M NaCl、 2 mM EDTA, 10% Block Ace、 0.2% BSA、 0.05% CHAPSを含む 緩衝液で希釈し、 10 μ Lずつ添加した（終濃度 0.2 g/mL)。室温で 2時間反応させ た後、 0.05% Tween 20を含む D-PBSで 1回洗浄し、 D-PBSで 2回洗浄した。次に、 Avi din-HRP (Dako, P034)を 20 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0), 0.4 M NaCl, 2 mM EDTA 、 1.0% BSAにて 4000倍希釈して 50 μ Lずつ添加し、室温で 1.5時間、揺動条件で反 応させた。 PBSTにて 3回洗浄の後、 2 component system試薬を 50 L添カロして HRP 反応を実施し、 3-7分の呈色反応の後、 50 11 Lの H SOを添加して反応を停止し、プ
2 4
レートリーダーを用いて 450 nmにて呈色定量した。結果を図 10— ;!〜 10— 4及び表 3に示す。
[0179] [表 3]
Figure imgf000073_0001
++ :ビォチン化抗体の抗原への結合を強く促進する
一： ピオチン化抗体の抗原への結合を阻害する
null： ビォチン化抗体の抗原への結合に影響を与えない
[0180] この測定において、同一の biotin化抗体と無標識抗体との競合を positive controlと して評価し、このときと同程度の dynamic rangeにて、 displaceされるものを互いに阻害 する（一表 3)として評価した。この系を設定したときは、この (一)か、もしくは biotin化 抗体の結合を妨げなレ、(null)の 2種類の結果のみが得られると考えて!/、た。し力もなが ら、逆に無標識抗体の添加により、 biotin化抗体の結合が強く促進されるもの (++)も見 いだされた。特に IgG_2Cと IgG_34Cおよび IgG_2Cと IgG_66Aは共存することで、お互 いの結合を促進し合った。一方、 IgG_34Cと IgG_66Aはお互いに結合を阻害し合った 。 IgG-2C，IgG-45A，IgG-95C，IgG-122B，IgG-130Dおよび IgG_135Eの 6種はお互いに 阻害し、従ってお互いに抗原結合部位が重なりあうことが判明した。これらの抗体の 抗原への結合部位は PAC1の細胞外に露出した領域と考えられる。細胞表面に発現 する受容体に結合しない IgG_39Cはその他の抗体とは阻害や促進を示さな力 た。 産業上の利用可能性
[0181] 本発明の抗 PAC1抗体は、 PAC1活性を調節し得ることから、 PAC1の生理活性の亢 進が関連する疾患の予防'治療剤、および PAC1活性の異常が関連する疾患の診断 剤として極めて有用である。また、本発明の抗体は PAC1の発現を調節する物質のス クリーニングにも有用である。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得るこ とは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載され た以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の 範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、 日本で出願された特願 2006-216282 (出願日：平成 18年 8月 8日）を基 礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また 、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内 容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に 組み込まれるものである。

Claims

請求の範囲
[I] ネイティブな構造を有する PAC1を認識し得る抗 PAC1モノクローナル抗体。
[2] PAC1の細胞外領域を認識する請求項 1記載の抗体。
[3] PAC1の PACAPとの結合を阻害する請求項 2記載の抗体。
[4] PAC1の生理活性を阻害する請求項 3記載の抗体。
[5] PAC1の PACAPとの結合を阻害しな!/、請求項 2記載の抗体。
[6] 他の抗 PAC1モノクローナル抗体の PAC1との結合を促進する請求項 5記載の抗体
[7] 他の抗 PAC1モノクローナル抗体が PAC1の PACAPとの結合を阻害するものである、 請求項 6記載の抗体。
[8] さらに変性した PAC 1を認識し得る請求項 1記載の抗体。
[9] 請求項 1記載の抗体を含む PAC1活性調節剤。
[10] 請求項 4記載の抗体を含む PAC1活性阻害剤。
[I I] PAC1の生理活性の亢進が関連する疾患の予防 ·治療用である、請求項 10記載の 剤。
[12] 請求項 1記載の抗体を含む PAC1検出剤。
[13] PAC1活性の異常が関連する疾患の診断用である、請求項 12記載の剤。
[14] 請求項 1記載の抗体および PAC1発現細胞を用いることを特徴とする、 PAC1の発現 を調節する物質のスクリーニング法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016514458A (ja) * 2013-03-15 2016-05-23 アムジェン インコーポレイテッド ヒトｐａｃ１抗体
JP2017533694A (ja) * 2014-09-15 2017-11-16 アムジェン インコーポレイテッド 二重特異性抗ｃｇｒｐ受容体／ｐａｃ１受容体抗原結合タンパク質及びその使用
WO2021225161A1 (ja) * 2020-05-08 2021-11-11 国立大学法人鹿児島大学 Ｐａｃ１受容体拮抗薬を用いた抗うつ・抗不安薬

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016168757A1 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Use of anti-pacap antibodies and antigen binding fragments thereof for treatment, prevention, or inhibition of photophobia
US10822408B2 (en) 2015-12-15 2020-11-03 Amgen Inc. PACAP antibodies and uses thereof
EP3426686A4 (en) 2016-04-15 2019-11-06 Alder Biopharmaceuticals, Inc. HUMANIZED ANTI-PACAP ANTIBODIES AND USES THEREOF
CN111566126A (zh) * 2018-01-12 2020-08-21 美国安进公司 Pac1抗体及其用途
TW202214851A (zh) * 2020-10-07 2022-04-16 國立中央大學 外泌體核酸萃取方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
JPH05227970A (ja) 1992-02-19 1993-09-07 Chugai Pharmaceut Co Ltd ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5585089A (en) 1988-12-28 1996-12-17 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5939598A (en) 1990-01-12 1999-08-17 Abgenix, Inc. Method of making transgenic mice lacking endogenous heavy chains
JP2000333673A (ja) 1999-05-31 2000-12-05 Wakenyaku Kk 連続無細胞タンパク質合成手段
US6331415B1 (en) 1983-04-08 2001-12-18 Genentech, Inc. Methods of producing immunoglobulins, vectors and transformed host cells for use therein
WO2003055507A1 (fr) 2001-12-27 2003-07-10 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. Medicaments contre l'anorexie ou des affections liees au mode de vie et procede de recherche systematique de ces medicaments
JP2006216282A (ja) 2005-02-01 2006-08-17 Japan Aviation Electronics Industry Ltd コネクタ

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0618291A3 (en) * 1993-02-26 1997-12-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. PACAP receptor protein, method for preparing said protein, and use thereof
US20050129687A1 (en) * 2003-11-03 2005-06-16 University Of Vermont And State Agricultural College Use of inhibitors of PACAP receptor activity for treatment of overactive bladder and pelvic floor pain syndrome

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6331415B1 (en) 1983-04-08 2001-12-18 Genentech, Inc. Methods of producing immunoglobulins, vectors and transformed host cells for use therein
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5585089A (en) 1988-12-28 1996-12-17 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5693761A (en) 1988-12-28 1997-12-02 Protein Design Labs, Inc. Polynucleotides encoding improved humanized immunoglobulins
US5693762A (en) 1988-12-28 1997-12-02 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5939598A (en) 1990-01-12 1999-08-17 Abgenix, Inc. Method of making transgenic mice lacking endogenous heavy chains
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JPH05227970A (ja) 1992-02-19 1993-09-07 Chugai Pharmaceut Co Ltd ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体
JP2000333673A (ja) 1999-05-31 2000-12-05 Wakenyaku Kk 連続無細胞タンパク質合成手段
WO2003055507A1 (fr) 2001-12-27 2003-07-10 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. Medicaments contre l'anorexie ou des affections liees au mode de vie et procede de recherche systematique de ces medicaments
JP2006216282A (ja) 2005-02-01 2006-08-17 Japan Aviation Electronics Industry Ltd コネクタ

Non-Patent Citations (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Immunochemical Techniques", ACADEMIC PRESS, article "Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies"
"Kouso Meneki Sokuteihou", 1978
"Kouso Meneki Sokuteihou", 1982
"Kouso Meneki Sokuteihou", 1987
"Molecular Cloning"
"Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods", IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES, vol. 121
"Rajioimunoassei", 1974
"Seitai Kobunshi Rittai Koho Joho Kaiseki", NEW ENERGY AND INDUSTRIAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT ORGANIZATION KENKYU HYOKA IINKAI, XP003020251, Retrieved from the Internet <URL:http://www.nedo.go.jp/iinkai/hyouka/houkoku/16h/chukan/03.pdf> *
"Seitai Kobunshi Rittai Kozo Joho Kaiseki", NEW ENERGY AND INDUSTRIAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT ORGANIZATION, pages 21 - 22, XP003020250, Retrieved from the Internet <URL:http://www.tech.nedo.go.jp/Index.html> *
"Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol", 1995, SHUJUNSHA, pages: 263 - 267
"Zoku Rajioimunoassei", 1979
ALTSCHUL ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402
ANDERSON S.T. ET AL.: "Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type 1 receptor (PAC1R) in the ewe hypothalamus: distribution and colocalization with tyrosine hydroxylase-immunoreactive neurones", J. NEUROENDOCRINOL., vol. 17, no. 5, 2005, pages 298 - 305, XP003020254 *
ANNU. REV. IMMUNOL., vol. 12, 1994, pages 433 - 455
BIO/TECHNOLOGY, vol. 6, 1988, pages 47 - 55
BIO/TECHNOLOGY, vol. 9, 1991, pages 88 - 89
BOWIE ET AL., SCIENCE, vol. 247, 1990, pages 1306 - 1310
ERICKSON A.H. ET AL., METH. ENZYMOL., vol. 96, 1996, pages 38 - 50
EUR. J. BIOCHEM., vol. 207, 1992, pages 239
GENE, vol. 17, no. 107, 1982
HARUAKI YAJIMA: "Zoku Iyakuhin no Kaihatsu", vol. 14, HIROKAWA SHOTEN
HARUAKI YAJIMA; SHUNPEI SAKAKIBARA, SEIKAGAKU JIKKEN KOZA 1, TANPAKUSHITSU NO KAGAKU IV, 1977, pages 205
HOLT ET AL., CURR. OPIN. BIOTECHNOL., vol. 11, 2000, pages 445 - 449
IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES (PART A), vol. 73
IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES (PART B), vol. 74
IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES (PART C), vol. 84
IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES (PART D: SELECTED IMMUNOASSAYS), vol. 92
IMMUNOL. TODAY, vol. 17, 1996, pages 391 - 397
INOOKA H. ET AL.: "Conformation of a peptide ligand bound to its G-protein coupled receptor", NAT. STRUCT. BIOL., vol. 8, no. 2, 2001, pages 161 - 165, XP001147071 *
J. BIOL. CHEM., 1999
J. BIOL. CHEM., vol. 274, 1999, pages 18218 - 18230
J. IMMUNOL. METHODS, vol. 272, 2003, pages 219 - 233
J. MOL. BIOL., vol. 222, 1991, pages 581 - 597
J. MOL. BIOL., vol. 296, 2000, pages 57 - 86
JOHNSTON F.B. ET AL., NATURE, vol. 179, 1957, pages 160 - 161
KARLIN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873 - 5877
LI M. ET AL.: "Specific antibody recognition of rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide receptors", ENDOCRINE, vol. 7, no. 2, 1997, pages 183 - 190, XP003020255 *
LYU R. ET AL.: "Identification of an essential amino acid motif within the C terminus of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor that is critical for signal transduction but not for receptor internalization", J. BIOL. CHEM., vol. 275, no. 46, 2000, pages 36134 - 36142, XP003020252 *
M. BODANSZKY; M.A. ONDETTI: "Peptide Synthesis", 1966, INTERSCIENCE PUBLISHERS
METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 194, 1991, pages 182 - 187
METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 70
MOLECULAR & GENERAL GENETICS, vol. 168, 1979, pages 111
MYERS; MILLER, CABIOS, vol. 4, 1988, pages 11 - 17
NAT. BIOTECHNOL., vol. 14, 1996, pages 309 - 314
NAT. BIOTECHNOL., vol. 14, 1996, pages 845 - 851
NAT. BIOTECHNOL., vol. 18, 2000, pages 1086 - 1090
NAT. BIOTECHNOL., vol. 18, 2000, pages 852
NAT. GENET., vol. 15, 1997, pages 146 - 156
NEEDLEMAN ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 48, 1970, pages 444 - 453
NEW ENERGY AND INDUSTRIAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT ORGANIZATION, HEISEI 15 NENDO HYOKA HOKOKUSHO CHUKAN HYOKA, XP008101985, Retrieved from the Internet <URL:http://www.nedo.go.jp/iinka/hyouka/houkoku/16h/index.html> *
NEW ENERGY AND INDUSTRIAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT ORGANIZATION, SEIKA HOKOKUSHO SHINKI TOROKU LIST, 2 June 2006 (2006-06-02), XP008101986, Retrieved from the Internet <URL:http://www.nedo.go.jp/database/newlist/new_list20060602.html> *
NOBUO IZUMIYA ET AL.: "Peptide Gosei-no-Kiso", 1975, MARUZEN CO.
PEARSON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 2444 - 2448
PHARMACOL. REV., (USA), vol. 52, no. 2, 2000, pages 269 - 324
PRATT J. M. ET AL.: "Transcription and Translation", 1984, IRL PRESS, pages: 179 - 209
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 14, 2000, pages 7969 - 7974
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 69, 1972, pages 2110
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 75, no. 1929, 1978
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 92, 1995, pages 3938
RONG-MING LYU ET AL., J. BIOL. CHEM., (US), vol. 275, 2000, pages 36134 - 36142
S.T. ANDERSON ET AL., J. NEUROENDOCRINOL., (US), vol. 17, 2005, pages 298 - 305
SAIBO KOGAKU, pages 8
SCHROEDER; LUEBKE: "The Peptide", 1965, ACADEMIC PRESS
SCHULZ S. ET AL.: "Immunocytochemical Identification of VAPC1, VPAC2, and PAC1 Receptors in Normal and Neoplastic Human Tissues with Subtype-Specific Antibodies", CLIN. CANCER RES., vol. 10, no. 24, 2004, pages 8235 - 8242, XP003020253 *
SOLVEIG SCHULZ ET AL., CLIN. CANCER RES., (US), vol. 10, 2004, pages 8235 - 8242
SPIRIN A.S. ET AL., SCIENCE, vol. 242, 1988, pages 1162 - 1164
TETSUYA OHTAKI ET AL., J. BIOL. CHEM., (US), vol. 273, 1998, pages 15464 - 15473
TOMIZUKA ET AL., NAT. GENET., vol. 16, 1997, pages 133 - 143
VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016514458A (ja) * 2013-03-15 2016-05-23 アムジェン インコーポレイテッド ヒトｐａｃ１抗体
JP2018076373A (ja) * 2013-03-15 2018-05-17 アムジェン インコーポレイテッド ヒトｐａｃ１抗体
JP2017533694A (ja) * 2014-09-15 2017-11-16 アムジェン インコーポレイテッド 二重特異性抗ｃｇｒｐ受容体／ｐａｃ１受容体抗原結合タンパク質及びその使用
WO2021225161A1 (ja) * 2020-05-08 2021-11-11 国立大学法人鹿児島大学 Ｐａｃ１受容体拮抗薬を用いた抗うつ・抗不安薬
JP7049637B1 (ja) * 2020-05-08 2022-04-07 国立大学法人 鹿児島大学 Ｐａｃ１受容体拮抗薬を用いた抗うつ・抗不安薬

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