WO2008009758A1 - Compuestos con actividad inhibidora de las interacciones ubc13-uev, composiciones farmacéuticas y aplicaciones terapéuticas - Google Patents

Compuestos con actividad inhibidora de las interacciones ubc13-uev, composiciones farmacéuticas y aplicaciones terapéuticas Download PDF

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Timothy Thomson Okatsu
Johanna Scheper Sigmund
Ángel MESSEGUER PEYPOCH
Ángel RAMÍREZ ORTIZ
Gloria SANCLIMENS PÉREZ DE ROZAS
Isabel Masip Masip
Alejandra MOURE FERNÁNDEZ
Domingo GONZÁLEZ RUIZ
Antonio MORREALE DE LEÓN
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Definitions

  • This invention is within the field of medical chemistry, and more specifically relates to the development of therapeutic compounds with inhibitory activity of UBC13-UEV interactions, and to the development or use of pharmaceutical compositions directed to antitumor therapy or directed to treatment and / or prophylaxis of diseases associated with metabolic pathways in which the UBC13 enzyme is involved, metabolic pathways in which the transcriptional factor NF- ⁇ B intervenes, or routes in which PCNA or RAD6 are involved.
  • ubiquitilation consists in the formation of isopeptide bonds between a plant of a substrate protein and the carboxy-terminal glycine of the ubiquitin peptide [I].
  • the ubiquitin molecule (Ub) is a 16 amino acid polypeptide, abundant in the cellular cytosol and nucleus.
  • a molecule of Ub forms a thioester bond with an enzyme El (activation enzyme of Ub) which, in a reaction that requires ATP, activates a molecule of Ub, so that it remains in a state that facilitates the formation of a bond thioester with the catalytic cistern of a second class of enzymes, called E2 or ubiquitin conjugation enzyme.
  • El activation enzyme of Ub
  • E2 ubiquitin conjugation enzyme
  • An E2 enzyme can transfer an Ub molecule to a substrate protein, with the formation of an isopeptide bond between the carboxyterminal glycine of the Ub and a substrate protein plant.
  • the modification of a substrate protein by covalently adding a unit of ubiquitin is called monoubiquitilation.
  • the same E2 enzyme can catalyze the transfer of one Ub molecule to another Ub molecule previously bound to a substrate protein, with the formation of isopeptide bonds between ubiquitins. This reaction can be repeated numerous times, resulting in the formation of polyubiquitin chains, this process being known as polyubiquitilation.
  • a molecule of ubiquitin has seven Usinas, any of which can be used for formation of isopeptide bonds between ubiquitins.
  • PCNA cerevisiae orthologous protein of UEVl and UEV2
  • the PCNA protein is modified by sumoylation (covalent binding of a SUMO molecule) at the beginning of the S phase, which gives it stability, allowing its activity in DNA replication during that phase of the cell cycle [7, 9].
  • PCNA is modified by polyubiquitilation canonical by the conjugation enzyme Radóp associated with ubiquitin ligase Radl ⁇ p.
  • UBC13-UEV1 catalyzed polyubiquitilation activity is essential for heterodimerization of the TRAF2 and TRAF6 adapter protein that follows TNF ⁇ binding with its receptor [18-20], or heterodimerization of TRAF6 induced IL-I [21].
  • This heterodimerization stimulates the ubiquitin ligase activity of TRAF2 or TRAF6, which recruited UBC13-UEV1 for autopolyubiquitilation by K63 type chains.
  • K63 polyubiquitin chains are recognized by the TAB2 or TAB3 proteins, which form a complex with the TAKl kinase protein, activating it [22], which in turn phosphorylates and activates another kinase, IKK ⁇ , which initiates a signaling cascade that leads to phosphorylation and degradation of IKB, the cytoplasmic inhibitor of NFKB, which can thus translocate to the nucleus and exert its action as a transcriptional regulator [18-22].
  • the UBC13-UEV1 (or UBC13-UEV2) heterodimer is an essential regulator of two important processes such as cytokine-mediated inflammation (TNF ⁇ ) and, at least in yeast, the post-explanatory repair in response to genotoxic damage.
  • TNF ⁇ cytokine-mediated inflammation
  • yeast the post-explanatory repair in response to genotoxic damage.
  • K63-type polyubiquitilation mediated by UBC13-UEV1 (or UBC13-UEV2) such as motility [23], ligand-dependent endocytosis [24], or antigenic activation of T cells [25]. Therefore, there are many biological processes that may be mediated by this post-translational modification, and whose study represents a new field of research that has barely begun.
  • the structure of the heterodimer formed by UBC 13 and the UEV proteins [26,27] shows an interaction interface in which the most striking feature is the participation, in UBCl 3, of 2 very delimited hydrophobic bags on which Hydrophobic residues of the UEV protein (Mms2p, UEVl or UEV2) also fit, especially Phenylalanine in position 8, Proline in position 5 and Isoleucine in position 36. These interactions are stabilized by electrostatic interactions involving polar residues located at one and another side of hydrophobic interactions. This configuration is unique among ubiquitin conjugation enzymes, and therefore highly specific for the interaction between UBC 13 and any of the UEV proteins (Mms2 ⁇ , UEVl and UEV2) [26-28].
  • the present invention is related to a new family of compounds of formula (I) that exhibit inhibitory activity of UBC13-UEV interactions or inhibitory activity of the enzymatic activity of UBCl 3, so they are useful in antitumor therapy or in the treatment and / or prophylaxis of pathologies or diseases associated with metabolic pathways in which the UBC 13 enzyme is involved or metabolic pathways involved the transcriptional factor NF- ⁇ B.
  • the expression "pathologies or diseases associated to metabolic pathways in which the UBC 13 enzyme is involved or to metabolic pathways in which the transcriptional factor NF- ⁇ B intervenes" includes those diseases in which UCB 13 or NF- ⁇ B do not have a direct causal role in the disease / pathology but in some way involved in the development of said disease / pathology, which is why the compounds of formula (I) of the present invention are useful in antitumor therapy or in the treatment and / or prophylaxis of pathologies or diseases associated with metabolic pathways in which the UBC 13 enzyme is involved or metabolic pathways in which the transcriptional factor NF- ⁇ B intervenes.
  • a first aspect of the present invention relates to compounds of formula (I), as well as their salts, solvates, prodrugs and stereoisomers thereof (compounds of the invention) as described below.
  • a second aspect of the invention relates to a process for the synthesis of said compounds of formula (I), their salts, solvates, prodrugs and stereoisomers.
  • a further aspect of the invention relates to compounds of formula (I), their salts, solvates, prodrugs and stereoisomers for medical use.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the compounds of formula (I), their pharmaceutically acceptable salts, solvates, prodrugs or steroisomers thereof for the preparation of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of pathologies or diseases associated with metabolic pathways in which the enzyme UBCl 3 intervenes.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the compounds of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, prodrug or stereoisomer thereof for the preparation of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of associated diseases or diseases. to metabolic pathways in which the transcriptional factor NF- ⁇ B intervenes.
  • the invention relates to the use of compounds of formula • (I), their salts, solvates, prodrugs or stereoisomers thereof acceptable thereof, or mixtures thereof, for the preparation of a medicament directed to antitumor therapy, wherein said medicament is an antagonist of, or inhibits, the pathway of tolerance to genotoxic damage mediated by PCNA and RAD6 producing chemo- or radiosensitizing effects.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the compounds of formula (I) in the preparation of a medicament for increasing the sensitivity of a mammal to treatment with an antitumor agent.
  • compositions comprising a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, solvate or stereoisomer thereof, in therapeutically effective amount, together with a carrier, adjuvant or vehicle. pharmaceutically acceptable.
  • FIGURES Figure 1 Scheme of the steps and methodologies followed in the present invention for the development of inhibitors of the interaction between UBC 13 and UEVl.
  • Figure 2. Results of the scrutiny of the 52 mixtures of peptoids in terms of their ability to inhibit the interaction between UBC13 and UEVl, determined by double hybrid assays in yeasts. Positive cells for UBCl 3- UEVl interaction were incubated with 5 ⁇ M of each peptoid mixture. The interaction activities were normalized with respect to cells without peptoids, and with respect to ⁇ -galactosidase activities of the positive interaction control (large T-p53) in the presence of the same mixtures of peptoids. The bars filled in black correspond to the mixtures with the highest inhibitory activity of the interaction.
  • the illustration corresponds to a Connolly representation of the surface of UBC 13 normally used to interact with UEVl, together with a bar-shaped representation of compound Ib with the optimal fit by CDOCK on the surface of UBCl 3.
  • This representation is illustrated by two different magnifications, in order to better appreciate the fit of compound Ib on the surface hydrophobic bag of UBC13 normally used to interact with UEV proteins (Mms2p, UEVl and UEV2).
  • Figure 5 Inhibition by compounds Ia (Varubin) and Ib of the interaction between UBC13 and UEVl proteins.
  • A Double hybrid test in yeasts. Positive cells for UBC13-UEV1 interaction were incubated with 100 ⁇ M of compound Ia or Ib.
  • FIG. 6 Inhibition of the catalytic activity of UBC13-UEV1, in in vitro polyubiquitilation assays.
  • A Accumulation over time of free polyubiquitins in control reactions, or in the presence of 100 ⁇ M of compound Ia. The ubiquitin used in these reactions is wild (with the 7 lysines available to form isopeptide bonds).
  • the monoubiquitiladas (Ub) and diubiquitiladas (Ub 2 ) forms are present at time 0 and their abundance does not vary significantly throughout the entire kinetics.
  • Triubiquitiladas (Ub 3 ) and tetraubiquitiladas (Ub 4 ) forms accumulate with third order kinetics, as shown in (B).
  • FIG. 7 Sensitization by compounds Ia and Ib to ultraviolet radiation and treatment with methyl methane sulfonate in ⁇ radó mutants of S. cerevisiae. Dose-response curves. Strains of S. cerevisiae lacking RAD6 were subjected to different doses of ultraviolet radiation (upper graph) or to different exposure times to 0.03% MMS (lower graph), without (YPD) or with 100 ⁇ M of compound Ia or compound Ib. Survival was determined in relation to cells not treated.
  • Figure 8 Sensitization by compounds Ia and Ib to ultraviolet radiation and treatment with methyl methane sulphonate in ⁇ rev3 mutants of S. cerevisiae. Dose-response curves.
  • FIG. 9 Inhibition by compounds Ia and Ib of TNF ⁇ induction of NF- ⁇ B transactivation. Dose-response curve. HeLa cells transfected with an NF- ⁇ B transcriptional activity indicator plasmid (luciferase activation), and pre-incubated or not with different concentrations of compound Ia or compound Ib, were treated with 10 ng / mL of TNF ⁇ for 2 h, quantifying the activation of NF- ⁇ B. The luciferase activity units have normalized in relation to the activity induced by TNF ⁇ in the absence of compounds Ia or Ib. Figure 10.
  • NF- ⁇ B transcriptional activity indicator plasmid luciferase activation
  • FIG. 12 Images (transformed from pseudocolor to grayscale) corresponding to a representative mouse (closest to the average) of each treatment group (control, doxorubicin alone, Varubin alone, or combined treatment), with sequential follow-up. 52 days of brightness, captured on a Hamamatsu Photonics instrument (see text for the description of the instrument and the specific model used).
  • the tumors are located in the 2 thighs of each animal. Within each tumor, the areas of greatest clarity correlate with those of greatest
  • the UBCl 3 enzyme is a promising therapeutic target for the design of new therapeutic compounds. Consequently, a procedure was designed to identify small molecules capable of competitively interfering with the interaction between UBC 13 and UEVl, the starting hypothesis being that the inhibition of this interaction would inhibit the ability of UBC 13 to form K63 type polyubiquitin chains .
  • the methodologies applied for this pharmacological development prioritize, on the one hand, the bioavailability of the inhibitory compounds (that is, their input capacity and intracellular localization), on the other hand the specificity of interference with the UBC 13 -UEVl interaction, and finally , the spatial and charge adjustment of these small molecules to the surface that UBC 13 uses to interact with UEVl.
  • the procedure carried out in the present invention combines sequentially:
  • R 1 , R 2 and R 3 respectively represent the chemical diversity used in the construction of the library [35].
  • the inventors of the invention have identified a new family of compounds with the general formula I capable of inhibiting the interaction between UBC13 proteins and UEV proteins (Mms2p, UEVl and UEV2, see Example 4) ,. capable of competitively inhibiting the K63 type polyubiquitilation activity of this enzyme and producing biological effects at pharmacologically effective concentrations.
  • These compounds competitively prevent the correct interaction between UBC 13 proteins and UEVl protein, thus preventing their enzymatic activity to form polyubiquitin chains in the modality known as "polyubiquitilation. of type K63 ", this being the mechanism by which these compounds exert their activity (Example 5), thus modulating in turn all those biochemical routes and biological processes modulated by this type K63 polyubiquitilation.
  • the biological activities of the drugs object of the present invention reflect the biochemical pathways that are normally regulated by variant polyubiquitilation mediated by UBC13-UEV1, UBC13-UEV2 and Ubcl3p-Mms2p.
  • polyubiquitilation mediated by this heterodimeric enzyme regulates, on the one hand, the repair of DNA by the route known as "error-free", dependent on RAD6 (Example 6), and, on the other, the activation of the NF transcriptional factor. - ⁇ B induced by cytokines and other stimuli.
  • these drugs sensitize both Saccharomyces cerevisiae yeast cells and mammalian cells (HeLa and PC-3, derived from cervical and prostate carcinoma, respectively) to the cytotoxic action of physical or chemical agents such as ultraviolet light, methyl methanesulfonate or doxorubicin (Example 8).
  • Another of the biological consequences of the activity of these drugs is the inhibition of the activation of the NF- ⁇ B transcriptional factor by cytokines such as TNF ⁇ at pharmacologically effective concentrations (Example 7) and enhance the cytotoxic effects of conventional antineoplastic agents. Due to these activities, the drugs object of the present invention have at least two kinds of medical applications:
  • UBC13-UEV1 UBC13-UEV2
  • UBC13-UEV2 UBC13-UEV2
  • these new drugs constitute tools for the investigation of the activity of UBC13-UEV1 (UBC13-UEV2) and other activities that regulate various forms of ubiquitilation and polyubiquitilation.
  • these compounds represent, in addition, a new class of drugs, since there are no precedents of pharmacological inhibitors of this UBCl 3 enzyme, which constitutes a new therapeutic target, and represent an original and novel pharmacological approach with antineoplastic applications, anti-inflammatory, and in multiple other pathological processes associated with metabolic pathways in which the UBC 13 enzyme and the non-canon K63 type polyubiquitilation are involved.
  • a first aspect of the invention relates to a compound of formula (I):
  • R 6 is a radical selected from: H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted cycloalkylalkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted aryl alkyl, heterocyclyl substituted or unsubstituted, substituted or unsubstituted heterocyclylalkyl;
  • - A is a radical selected from substituted or unsubstituted aryl and substituted or unsubstituted heterocyclyl;
  • R 7 and R 8 are independently selected from H, methyl, ethyl, propyl and isopropyl,
  • - o is a number selected from 0, 1, 2, 3 and 4
  • - n is a number selected from O and I
  • - Ri and R2 are independently selected from H, methyl, ethyl, propyl and isopropyl;
  • R 3 is a radical selected from: H, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted cycloalkylalkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted arylalkyl substituted, substituted or unsubstituted heterocyclyl, substituted and unsubstituted heterocyclyl alkyl;
  • R 4 and R 5 are independently selected from H, methyl, ethyl, propyl and isopropyl;
  • - q is a number selected from O and I; and salts, solvates, prodrugs or stereoisomers thereof.
  • the invention also provides salts of the compounds of the invention.
  • the pharmaceutically acceptable salts of the compounds provided herein can be acid addition salts, base addition salts or metal salts, and can be synthesized from parental compounds containing a basic or acidic moiety by conventional chemical procedures
  • such salts are prepared, for example, by reacting the free acid or base forms of these compounds with a stoichiometric amount of the appropriate base or acid in water or in an organic solvent or in a mixture of the two.
  • non-aqueous media such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile are preferred.
  • acid addition salts include addition salts of mineral acids such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, iodohydrate, sulfate, nitrate, phosphate, organic acid addition salts such as, for example, acetate, maleate, fumarate. , citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate and /> - toluenesulfonate.
  • mineral acids such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, iodohydrate, sulfate, nitrate, phosphate
  • organic acid addition salts such as, for example, acetate, maleate, fumarate. , citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate and /> - toluenesulfonate.
  • alkali addition salts include inorganic salts such as, for example, ammonium salts and organic alkaline salts such as, for example, ethylenediamine, ethanolamine, N 5 N-dialkylene ethanolamine, triethanolamine, glutamine and basic amino acid salts.
  • metal salts include, for example, sodium, potassium, calcium, magnesium, aluminum and lithium salts.
  • pharmaceutically acceptable refers to molecular entities and compositions that are physiologically tolerable and normally do not produce a similar allergic or adverse reaction, such as gastric discomfort, dizziness and the like, when administered to a human.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means approved by a federal or state government regulatory agency or listed in the US pharmacopoeia. or other pharmacopoeia generally recognized for use in animals, and more particularly in humans.
  • solvate includes both pharmaceutically acceptable solvates, that is, solvates of the compound of formula (I) that can be used in the manufacture of a medicament, as pharmaceutically acceptable solvates, which may be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable solvates or salts.
  • pharmaceutically acceptable solvate is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • Solvates can be obtained by conventional solvation methods well known to those skilled in the art. Examples of solvates include hydrates and alcoholates, preferably C 1 -C 6 alcoholates, for example, methanolate.
  • prodrug includes any compound derived from a compound of formula (I), for example, esters, including carboxylic acid esters, amino acid esters, phosphate esters, metal salt sulphonate esters, etc., carbamates, amides, etc., which, when administered to an individual, is capable of providing, directly or indirectly, said compound of formula (I) in said individual.
  • said derivative is a compound that increases the bioavailability of the compound of formula (I) when administered to an individual or that enhances the release of the compound of formula (I) in a biological compartment.
  • the nature of said derivative is not critical as long as it can be administered to an individual and provides the compound of formula (I) in a biological compartment of an individual.
  • the preparation of said prodrug can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the present invention encompasses all possible isomers of the compounds described herein.
  • the compounds of the invention may include Z and E isomers.
  • Optical isomers or enantiomers are also included, depending on the presence of chiral centers.
  • the individual isomers, enantiomers or diastereoisomers and mixtures thereof fall into of the scope of the present invention.
  • the individual enantiomers or diastereoisomers, as well as mixtures thereof, can be separated by conventional techniques.
  • a stereoisomer is understood, for the skilled person, as compounds formed from the same atoms linked by the same sequence of bonds, but with different three-dimensional structures that are not interchangeable.
  • the compounds of formula (I), their isomers, salts, prodrugs or solvates will preferably be found in a pharmaceutically acceptable or substantially pure form, that is, having a pharmaceutically acceptable level of purity excluding normal pharmaceutical additives such as diluents and carriers, and not including material considered toxic at normal dosage levels.
  • the purity levels for the active ingredient are preferably greater than 50%, more preferably greater than 70%, more preferably greater than 90%. In a preferred embodiment, they are greater than 95% of the compound of formula (I), or of its salts, solvates or prodrugs.
  • the compounds of the invention also include compounds that differ only in the presence of one or more isotopically enriched atoms.
  • the compounds described in the present invention, their pharmaceutically acceptable salts, prodrugs and / or solvates as well as the pharmaceutical compositions containing them can be used together with other additional drugs to provide a combination therapy.
  • Said additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, they may be provided in the form of a separate composition for simultaneous or non-simultaneous administration to the pharmaceutical composition comprising a compound of formula (I), or a prodrug, solvate, derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the following terms have the indicated meaning:
  • Alkyl refers to a straight or branched chain hydrocarbon radical consisting of carbon and hydrogen atoms, which does not contain unsaturations, with one to six, preferably one to four carbon atoms and which is attached to the rest of the molecule by a single bond, for example, methyl, ethyl, «-propyl, ⁇ -propyl, n-butyl, ⁇ -butyl, n-pentyl , etc.
  • Alkenyl refers to a straight or branched chain hydrocarbon radical consisting of carbon and hydrogen atoms, which contains at least one unsaturation, with two to six, preferably two to four carbon atoms and which is attached to the rest of the molecule For a simple link.
  • Cycloalkyl refers to a saturated carbocyclic ring having between three and six carbon atoms. Suitable cycloalkyl groups include, but are not limited to cycloalkyl groups such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl.
  • Cycloalkylalkyl refers to a cycloalkyl group attached to the rest of the molecule by an alkyl group such as cyclopentylethyl.
  • Alkynyl refers to a straight or branched chain hydrocarbon radical consisting of carbon and hydrogen atoms, which contains at least one carbon-carbon triple bond, conjugated or not, with two to six, preferably two to four carbon atoms and which is attached to the rest of the molecule by a single bond, such as -
  • Aryl refers to an aromatic hydrocarbon radical having six carbon atoms as phenyl.
  • Arylalkyl refers to an aryl group attached to the rest of the molecule by an alkyl group such as benzyl and phenethyl.
  • Heterocyclyl refers to a stable 3 to 6 member ring consisting of carbon atoms and between one and four heteroatoms selected from the group consisting of nitrogen, oxygen, and sulfur, preferably a 4 to 6 member ring with one, two , three or four heteroatoms, more preferably a 5 or 6 member ring with one, two, or three heteroatoms.
  • the heterocycle is a monocyclic ring system.
  • the nitrogen, carbon or sulfur atoms in the heterocyclyl radical may be optionally oxidized; the nitrogen atom may be optionally quaternized; and the heterocyclyl radical may be partially or completely saturated or aromatic.
  • heterocycles include, but are not limited to, azepines, benzimidazole, benzothiazole, furan, isothiazole, imidazole, indole, piperidine, piperazine, thiadiazole, tetrahydrofuran.
  • Teterocyclyalkyl refers to a heterocycle group attached to the rest of the molecule by an alkyl group such as pyrimidinylethyl.
  • alkyl, cycloalkyl, cycloalkylalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heterocyclyl and heterocyclylalkyl radicals may optionally be substituted by one, two or three substituents such as halo (fluorine, chlorine or bromine), alkyl , alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, hydroxy, alkoxy, sulfoxy, O-Benzyl, O-Benzoyl, carboxy, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, sulfonyl, sulfonylamino, amino, imino and nitro.
  • substituents such as halo (fluorine, chlorine or bromine)
  • Said carbon atom may be part of an alkyl, alkenyl, cycloalkyl, alkynyl, aryl, aralkyl or heterocyclyl group.
  • R 6 is a radical selected from H, substituted or unsubstituted arylalkyl and substituted or unsubstituted heterocyclylalkyl
  • R 3 is a radical selected from H, arylalkyl substituted or unsubstituted and substituted or unsubstituted heterocyclylalkyl.
  • R 6 is a radical selected from substituted or unsubstituted phenylpropyl, substituted or unsubstituted phenylethyl, substituted or unsubstituted benzyl, substituted or unsubstituted furylpropyl, substituted or unsubstituted furyl ethyl, substituted or unsubstituted furyl methyl , substituted or unsubstituted imidazolupropyl, substituted or unsubstituted imidazolylethyl, substituted or unsubstituted substituted or unsubstituted imidazolylmethyl, substituted or unsubstituted substituted or substituted pyridinyl methyl, substituted or unsubstituted substituted or substituted piperidinylpropyl, substituted or unsubstituted piperidylmethyl or without replacing; and R 3 is a radical selected from substituted or unsubstituted phenylpropyl,
  • R 6 is a radical substituted by one or more radicals selected from fluorine, chlorine, bromine, trifluoromethyl, hydroxy, alkoxy, alkylcarbonyl, alkylamino, sulfonamino, cyano, nitro, nitrite, nitrate, thionitrate and carboxamido.
  • R 3 is a radical substituted by one or more radicals selected from fluorine, chlorine, bromine, trifluoromethyl, hydroxyl, alkoxy, alkylcarbonyl, alkylamino, sulfonamino, cyano, nitro, nitrite, nitrate, thionitrate and carboxamido and you go out
  • R 6 is the p-fluorophenylethyl or 2,4-dichlorophenylethyl radical;
  • substituent A is a substituted or unsubstituted aryl;
  • substituent A is a phenyl substituted by chlorine, fluorine and / or bromine, I is a number selected from 1, 2 and 3;
  • R 7 and R 8 are both H, or is 2, and
  • A is p-fluorophenyl;
  • R 3 is 2-pyrimidinylethyl, 2,4-dichlorophenylethyl or 4-methoxyphenylethyl;
  • n is 1;
  • n is 0;
  • q is 0; q is 1.
  • a preferred embodiment of the invention is the compound of formula (Ia): (N-aminocarbamoylmethyl-N- (2 '- (2 "pyridyl) ethyl) -l, 4-bis [2'- (4 "-fluoro-phenyl) ethyl] -3,7-dioxo- [l, 4] diazepan-5-carboxamide), called Varubin:
  • Another preferred embodiment of the invention is the compound of formula (Ib): (l, 4-bis [2 '- (4 "-fluorophenfl) etü] -2- [N-aminocarbonylmetü-N- (2'- (2 "- pyridyl) ethyl) -carbonylmethyl] piperazine-3,6-dione):
  • the invention in its second aspect, relates to a process for the synthesis of said compounds of formula (I), their salts, solvates, prodrugs and stereoisomers.
  • the compounds of the present invention of formula (I) can be obtained or produced by a chemical synthetic route or obtained from a natural material of different origin.
  • a synthetic route of the compounds of the invention of formula I based on a solid phase synthesis is described.
  • the solid phase synthesis schemes of two of the compounds of the invention, those of formula (Ia) and (Ib), are included.
  • this type of synthesis illustrated by the two schemes set forth below and by Example 3), to the rest of the compounds encompassed by the formula (I).
  • compositions hereinafter pharmaceutical composition of the invention, comprising at least one compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt, prodrug, solvate or stereoisomer thereof, in therapeutically effective amount. , together with a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant or vehicle for administration to a patient.
  • Another particular embodiment of the invention is the pharmaceutical composition of the invention in which the compound of formula (I) is the following: N-aminocarbamoylmethyl-N- (2 '- (2 "pyridyl) ethyl) -l, 4- bis [2 '- (4 "-fluorophenyl) ethyl] -3,7-dioxo- [1, 4] diazepan-5-carboxamide (Ia) or any of its enantiomeric forms R, S and / or racemic mixtures.
  • the compound of formula (I) is the following: N-aminocarbamoylmethyl-N- (2 '- (2 "pyridyl) ethyl) -l, 4- bis [2 '- (4 "-fluorophenyl) ethyl] -3,7-dioxo- [1, 4] diazepan-5-carboxamide (Ia) or any of its enantiomeric forms R, S and / or racemic mixtures
  • Another particular embodiment of the invention is the pharmaceutical composition of the invention in which the compound of formula (I) is as follows: 1,4- bis [2 '- (4 "-fluorophenfl) ethyl] -2- [N-aminocarbonylmethyl-N- (2' - (2" pyridyl) ethyl) carbonylmethyl] piperazine-3,6-dione (Ib), or any of its enantiomeric forms R, S and / or racemic mixtures.
  • Another particular form of the invention is the pharmaceutical composition of the invention in which the compound (I) is selected from: iV-aminocarbamoylmethyl-iV- (2 '- (2' '-pyridyl) ethyl) -l - [2 '- (2 ", 4' '-dichlorophenyl) ethyl] -4- [2'-
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the agent or compound capable of developing inhibition of the UBCl 3 enzyme, calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among others causes, due to the characteristics of the compounds, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • said therapeutic composition is prepared in the form of a solid form or aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention may be administered by any appropriate route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • administration of the therapeutic composition provided by this invention is performed orally, topically, rectally or parenterally (including subcutaneously, intraperitoneally, intradermally, intramuscularly, intravenously, etc.).
  • parenterally including subcutaneously, intraperitoneally, intradermally, intramuscularly, intravenously, etc.
  • an effective administered amount of a compound used in the invention will depend on the relative efficacy of the compound chosen, the severity of the disorder treated, or the age, weight or mode of administration. However, normally the active compounds will be administered one or more times a day, for example 1, 2, 3, or 4 times a day, with a typical total daily dose in the range of 0.01 to 100 mg / kg / day .
  • the compounds used in the present invention can also be administered with other drugs to provide a combination therapy.
  • the other drugs may be part of the same composition, or they may be supplied as a separate composition for administration at the same time or at a different time.
  • a further aspect of the invention relates to compounds of formula (I), their salts, solvates, prodrugs or stereoisomers, or mixtures thereof, for medical use.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the compounds of formula (I), their salts, solvates, prodrugs and steroisomers, or mixtures thereof, in the treatment and / or prophylaxis of pathologies or diseases associated with alterations of metabolic pathways. in which the UBGl 3 enzyme is involved.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the compounds of formula (I), their pharmaceutically acceptable salts, solvates, prodrugs or steroisomers thereof, or mixtures thereof, for the preparation of a medicament. aimed at the treatment and / or prophylaxis of pathologies or diseases associated with metabolic pathways in which the enzyme UBCl 3 is involved.
  • the pathologies or diseases associated with metabolic pathways in which the UBCl 3 enzyme is involved are inflammatory and autoimmune diseases.
  • the inflammatory and autoimmune diseases or pathologies can be: inflammatory bowel disease, inflammatory joint pathologies, atopic dermatitis and other inflammatory dermatological pathologies, neuritis, encephalitis, encephalomyelitis and inflammatory pathologies that affect the central or peripheral nervous system, myositis, vasculitis, systemic lupus erythematosus, infectious diseases that occur with inflammation, reactions of host rejection against grafting, conjunctivitis and inflammatory oculopathies, otitis or mucositis.
  • the pathologies or diseases associated with metabolic pathways in which the UBC 13 enzyme is involved are cancer or neoplasia, including but not limited to any type of benign or malignant neoplasm of any tissue origin, including but not limited to a, any type of carcinomas including those of prostate, breast, lung, pancreas, colorectal, gastric, esophageal, larynx, thyroid, hepatic, urinary bladder, renal, uterine, and cervix, any type of sarcomas including osteosarcomas, soft tissue and angiosarcomas sarcomas, any type of hematopoietic tumor including leukemia and lymphomas, any type of nervous system tumor including neuroblastomas, glioblastomas and astrocytomas, any dermatological cancer including melanoma, basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the compounds of formula (I), their pharmaceutically acceptable salts, solvates, prodrugs or steroisomers thereof, or mixtures thereof, for the preparation of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of pathologies or diseases associated with metabolic pathways in which the transcriptional factor NF- ⁇ B intervenes.
  • the pathologies or diseases are inflammatory or neoplastic processes.
  • the invention relates to the use of the compounds of formula (I), their pharmaceutically acceptable salts, solvates, prodrugs or stereoisomers thereof, or mixtures thereof, for the preparation of a medicament for antitumor therapy, in where said drug is an antagonist of, or inhibits, the pathway of tolerance to genotoxic damage mediated by PCNA and RAD6 producing chemo- or radiosensitizing effects.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the compounds of formula (I) in the preparation of a medicament for increasing the sensitivity of a mammal to treatment with an antitumor agent.
  • antitumor agent is understood to be that chemical, physical or biological compound or agent with antiproliferative, antioncogenic and / or carcinostatic properties that can be used to inhibit the growth, proliferation and / or development of tumors.
  • antitumor agents that can be employed in the present invention are (i) alkylating agents, such as, alkyl sufonates and ethyleneimine derivatives; (ii) antimetabolites, such as antifolates and purine analogs; (iii) natural products, such as antitumor antibiotics and mitotic inhibitors; (iv) hormones and antagonist thereof, such as androgens and corticosteroids; (v) biological agents, such as viral vectors; and (vi) physical agents such as ionizing radiation generated by different types of irradiation source
  • radiotherapeutic agents A list of compounds that can be used as antitumor agents is described in patent application WO2005 / 112973.
  • the antitumor agent is doxorubicin or etoposide.
  • the compound of formula (I) has to be administered to a mammal in an amount such that it is capable of sensitizing said mammal against treatment with an antitumor agent.
  • effective sensitizing amount is defined as that amount of compound of formula (I) which, when administered to an animal, preferably, a mammal, more preferably a human, is sufficient to sensitize the mammal against an agent antitumor or against any other antitumor therapy / treatment.
  • the effective concentration in the tumor tissue of the compounds of formula (I) that is necessary to produce a sensitizing effect against an antitumor agent ranges from nanomolar OO 1 to 100 micromolar, and the dose of said compounds that it is necessary to administer to the subject, by any means, it must be adjusted to reach said intratumoral concentrations.
  • the term "sensitize" a mammal includes: (i) increasing the efficacy of an antitumor agent or an antitumor therapy / treatment in a mammal that has not previously received any antitumor agent or antitumor treatment ("initial sensitization"), and / or (ii) increase the efficacy of an antitumor agent or an antitumor therapy / treatment in a mammal that has already received an antitumor agent or antitumor treatment and against which, it has previously been able to present or not resistance.
  • Antitumor treatments that can be considered in the present invention are, for example, treatment with a platinum compound, such as carboplatin or cisplatin, optionally in combination with gemcitabine or a taxane such as docetaxel or paclitaxel. More examples of antitumor treatments can be found in patent application WO2005 / 112973.
  • Cancers that can be effectively treated by using the compounds of formula (I) in the preparation of a medicament for increasing the sensitivity of a mammal to treatment with an antitumor agent include mammalian cancers, especially cancer or neoplasia, including but not limited to any type of benign or malignant neoplasm of any tissue origin, including, but not limited to, any type of carcinoma including prostate, breast, lung, pancreas, colorectal, gastric, esophageal, larynx, thyroid, Hepatic, urinary bladder, renal, uterine, and cervical, any type of sarcomas including osteosarcomas, soft tissue sarcomas and angiosarcomas, any type of hematopoietic tumor including leukemia and lymphomas, any type of nervous system tumor including neuroblastomas, glioblastomas and astrocytomas, any dermatological cancer including melanoma, basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma.
  • another additional aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises the compounds of formula (I), a pharmaceutically acceptable salt, solvate, prodrugs or stereoisomer thereof, in therapeutically effective amount, together with a carrier, adjuvant or pharmaceutically acceptable vehicle.
  • said pharmaceutical composition additionally comprises, in a therapeutically effective amount, at least one second therapeutic agent which, in another even more particular embodiment of the invention, is a compound of formula (I), a salt, solvate, pro drug or pharmaceutically acceptable stereoisomer thereof.
  • UBC13 and UEVl used in the following examples are from Homo sapiens.
  • the UBC13 protein also called UBE2N (HUGO nomenclature)
  • UBE2N has the following identifiers: NCBI-GI: 4507793, UniProt: P61088 and [EC: 6.3.2.19].
  • the UEVl protein also called UBE2V1 (HUGO nomenclature), has the following identifiers: NCBI-GI: 73765546 and UniProt: Q13404.
  • UBC13 is expressed as a fusion protein with the DNA-binding domain (DBD-UBC13) of Gal4 from plasmid pBD-UBC13
  • UEVl is expressed as a fusion protein with the transcriptional activation domain of Gal4 (AD-UEVl), from plasmid pACT2-UEVl).
  • Both plasmids are co-transfected in the strain of Saccharomyces cerevisiae AH 109, growing on YPD medium plates without Leucine or Tryptophan, selecting only the colonies expressing tRNA synthase for these two amino acids, that is, those containing the two co-transfected plasmids .
  • the AHl 09 strain integrates two artificial loci into its genome: a locus contains recognition sequences for the Gal4 DBD linked to the GALl promoter in front of the histidyl tRNA synthase gene; another locus contains the Gal4 DBD linked to the GAL2 promoter before the ADE2 gene and the third locus contains recognition sequences for the Gal4 DBD bound to the MELl promoter in front of the lacZ gene for the ⁇ -galactosidase enzyme.
  • strain AHl 09 of transcriptional factors that contain, on the one hand, a Gal4DBD domain, and, on the other, a transcriptional activation domain, induces the expression of His tRNA synthase, allowing growth in a medium lacking Histidine, and , at the same time, induces the expression of ⁇ -galactosidase, whose enzymatic activity is colorimetrically detectable using suitable substrates.
  • DBD-UBCl 3 and AD-UEVl places on the promoters of these two loci a transcriptional factor capable of activating the binding site-associated promoter for Gal4.
  • the eight-step synthetic procedure began with the release of the Fmoc protecting group from the Rink amide resin (0.7 mEq / g, Rapp Polymere, Tubingen, Germany).
  • an acylation step was carried out with chloroacetic acid and diisopropylcarbodiimide, followed by the corresponding amination of the chloromethylated intermediate with the individual amine or the mixture of amines.
  • the products were cleaved from the resin with a mixture of trifluoroacetic acid / dichloromethane / water, the solvents were evaporated, and the residues were lyophilized and redissolved in 10% dimethyl sulfoxide at a concentration of 5 mg / mL.
  • the preparation of individual peptoids was carried out by independent solid phase synthesis, applying the synthetic sequence described above.
  • the purity and identity of the individual JV-alkylglycins was determined by high performance liquid chromatography, mass spectrometry and 1 H and 13 C NMR.
  • the general structure (II) represented in the specification shows the general chemical structure of the N-alkylglycins (peptoids) that make up the combinatorial library used in this invention.
  • UBCl 3 was subcloned into the vector pBD (Stratagene, La Jolla, California, USA), in a pattern with the DNA binding domain of Gal4, giving rise to plasmid pBD-UBC13.
  • UEVl was subcloned into the vector pACT2 (Clontech), in pattern with the transactivation domain Gal4, generating plasmid pACT2-UEVl.
  • Plasmids pBD-UBC13 and pACT2-UEVl were co-transfected into strain AHl 09 of Saccharomyces cerevisiae.
  • freshly prepared competent yeast cells were mixed with the plasmid DNA together with carrier herring testis DNA, in a solution of lithium polyethylene glycol acetate (40% PEG, 100 mM lithium acetate, Tris 10 mM, EDTA ImM) and incubated for 30 min at 30 0 C with stirring. Then 7% dimethyl sulfoxide was added, and the cells were subjected to thermal shock in a water bath at 42 ° C for 30 seconds, followed immediately by cooling on ice.
  • lithium polyethylene glycol acetate 50% PEG, 100 mM lithium acetate, Tris 10 mM, EDTA ImM
  • the cells were centrifuged at 1000 g and resuspended in TE buffer (10 mM Tris-ClH, pH 7.5 mM, 1 mM EDTA) and seeded in minimal medium plates to allow cell selection with expression of the HIS3, ADE2 and LacZ. After 3 days growth, growth - positive colonies (and therefore, positive for UBC13-UEV1 interaction) were selected, and were grown in 5 mL of minimal medium overnight at 30 0 C with stirring. Then it was changed to new growth medium containing one of the 52 mixtures of peptoids, at a concentration of 0'I mixing mM and incubated overnight at 30 0 C.
  • TE buffer 10 mM Tris-ClH, pH 7.5 mM, 1 mM EDTA
  • the absorbance (optical density or OD) was determined of the cultures at 695 mn, and new cultures were prepared with an initial OD 69 S of 0.2 in YPD medium with the same peptoid mixture at 0'I mM under agitation at 30 0 C, allowing growth for 3-4 h until reaching D.0. 695 of 0.8.
  • the cell buttons were resuspended in buffer Z (Na 2 HPO 4 16 g / L, NaH 2 PO 4 5.50 g / L, KCl 0.75 g / L, MgSO 4 0.246 g / L at pH 7'O) and cycles were ruptured by freeze-thaw in liquid nitrogen (1 minute) - 37 0 C (1 minute). Then 160 uL of substrate ⁇ -galactosidase, O-nitrophenyl - galactopyranoside (ONPG, at 4 mg / mL in Z buffer) and incubated at 30 0 C until formation of visible substrate (yellow) was added.
  • buffer Z Na 2 HPO 4 16 g / L, NaH 2 PO 4 5.50 g / L, KCl 0.75 g / L, MgSO 4 0.246 g / L at pH 7'O
  • the reaction was stopped by adding 0.4 mL of 1 M Na 2 CO 3 , incubating for 30 min, followed by centrifugation. The supernatants were transferred to cuvettes for spectrophotometric reading at 420 nm.
  • 1 unit of ⁇ -galactosidase activity is defined herein as the amount capable of hydrolyzing 1 ⁇ mol of ONPG to O-nitrophenol and D-galactose per minute per cell (Miller, 1972; Miller, 1992).
  • This colorimetric assay provides a semi-quantitative measure of the intensity of the interaction between 2 proteins in the double hybrid procedure in yeasts. Each of the 52 mixtures of peptoids was analyzed by this procedure in triplicate, in three independent experiments.
  • peptoids that inhibit the UBC13-UEV1 interaction must correspond to one, or more, of the peptoids named N37-37-9C, N37-37-13C, Nl 5-37-9C and Nl 5-37-13C , whose chemical structures are represented below:
  • the selected amines are 4'-fluorophenylethyl (peptoids N37-37-9C) or 2'-4'-dichlorophenylethyl (peptoids N15-37-13C); in the R 2 position the amine is 4'-fluorophenylethyl in all cases, and in the R 3 position the amines 4'-methoxyphenyle (peptoids N37-37-9C and N15-37-13C) and 2- (2 '-pyridyl) ethyl (peptoids N37-37-9C and Nl 5-37-9C). Therefore, the IUPAC nomenclature of the four selected peptoids is:
  • N37-37-9C [iV- (2- (4'-fluorophenyl) ethyl) glycyl] - [iV- (2- (4'-fluorophenyl) ethyl) glycyl] - [iV- (2- (2'- ⁇ iridin) ethyl] glycineamide
  • N37-37-13C [iV- (2- (4'-fluorophenyl) ethyl) glycyl] - [iV- (2- (4'fluorophenyl) ethyl) glycyl] - [iV- (2- (4'- methoxyphenylethyl] glycinamide
  • N15-37-9C [ ⁇ T- (2- (2 ', 4'-dichlorophenyl) ethyl) glycyl] - [iV- (2- (4'-fluorofeml) ethyl) glycyl] - [7V- (2- ( 2'-pyridin) ethyl] glycinamide
  • N15-37-13C [iV- (2- (2 ', 4'-dichlorophenyl) ethyl) glycyl] - [iV- (2- (4'-fluorophenyl) ethyl) glycyl] - [iV- (2- ( 4'-methoxyphenylethyl] glycineinide
  • Example 2 Computational optimization of molecular fit (docking) on UBC 13 of conformational variants of cyclic compounds derived from the peptoids selected in Example 1.
  • the initial structure of the protein corresponds to the IJAT entry of the PDB database [26]. From the heterodimeric structure present in the complex, the A chain was separated corresponding to the UBC13 protein, on which the calculations were carried out. The position of the hydrogen atoms was obtained with the protonate utility of the AMBER package [38]. Subsequently, charges and atomic radii were assigned to all protein atoms consistent with the AMBER force field in its parm99 version. Next, the active center of the protein was defined. For this, and after a first visual inspection, residues E55, L56, Y57 and R70 of the UBC 13 protein located at the separation interface between the two proteins that constitute the dimer were identified.
  • ⁇ GU, E vdw + AG C0U ⁇ + ⁇ GL * + ⁇ GJL, + b, G non _ polar + AG C0NF
  • Van der Waals interactions come from the CDOCK program described above.
  • the effect of the solvent was obtained by numerical solution of the Poisson equation through the method of finite differences, such as the one implemented in the DelPhi program, for the electrostatic component (components 2, 3 and 4 of the second member of the equation) , and by a term proportional to the surface accessible to the non-electrostatic component (component 5 of the second member), using a proportionality constant of OO0545.
  • 0.5 cubic grids of spacing were used, and where the dimensions of the grid are such that there is at least 11 ⁇ of separation between any atom and the edges of the box.
  • the interior of the molecules, solute was characterized with a dielectric constant of 4, while for the exterior one of 80 was used. The rest of the parameters used were the program default parameters.
  • Example 3 Synthesis of cyclic compounds with better theoretical fit (docking) on the surface of UBC13 that interacts with UEVl.
  • reaction mixture was stirred for 2 min at 60 0 C in a microwave reactor.
  • the resin was filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL).
  • dichloromethane 3 x 3 mL
  • isopropyl alcohol 3 x 3 mL
  • dimethylformamide 3 x 3 mL.
  • a solution of iV- [2-2 '- (pyridin-2-yl) ethylamine (180 ⁇ L, 5 eq.) And triethylamine (210 ⁇ L, 5 eq.) In 3 mL of dimethylformamide and the suspension was added to the resin it was stirred for 2 min at 90 0 C with microwave activation.
  • the reaction mixture was stirred for 2 min at 60 0 C in a microwave reactor.
  • the resin was filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL).
  • dichloromethane 3 x 3 mL
  • isopropyl alcohol 3 x 3 mL
  • dimethylformamide 3 x 3 mL
  • reaction mixture was stirred at room temperature for 30 min. It was filtered and the resin was washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL) Next, a solution of 2- (4'-fluorophenyl) etuamine (200 ⁇ L, 5 eq.) And triethylamine (210 ⁇ L, 5 eq.) In 3 mL of dimethylformamide was added to the resin and the suspension was stirred for 3 It has room temperature. The reaction was stirred for 16 h at the same temperature.
  • the resin containing the iV-alkylglycine fragment was synthesized following a procedure similar to that described above.
  • this fragment was obtained by treating the resin (290 mg, 0.22 mmol) with 20% piperidine in dimethylformamide, followed by acylation with bromoacetic acid (153 mg, 5 eq.) And JV 5 JV-diisopropylcarbodiimide (175 ⁇ L, 5 eq.), and coupling of the amine with JV- [2-2'- (pyridin-2-yl) ethylamine (135 ⁇ L, 5 eq.) in the presence of triethylamine (155 ⁇ L, 5 eq.).
  • Example 3.3 Compound iV-ammocarbamoylmethyl-iV- (2 '- (2 "-pyridyl) ethyl) -l- [2'-
  • the Rink amide resin (400 mg, 0.3 mmol) is treated with 3 mL of piperidine at
  • the resin is filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL). Finally, treating the resin with a mixture of trifluoroacetic acid / dichloromethane / water (60: 40: 2) releases a reaction mixture containing the desired compound. This mixture is filtered and the solvents are removed by evaporation under reduced pressure followed by lyophilization. The residue is purified by RP-HPLC on a semi-preparative scale by applying a gradient of acetronitrile-water. Example 3.4.
  • the Rink amide resin (400 mg, 0.3 mmol) is treated with 3 mL of piperidine at
  • the resin is filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL). Finally, treating the resin with a mixture of trifluoroacetic acid / dichloromethane / water (60: 40: 2) releases a reaction mixture containing the desired compound. This mixture is filtered and the solvents are removed by evaporation under reduced pressure followed by lyophilization. The residue is purified by RP-HPLC on a semi-preparative scale by applying a gradient of acetronitrile-water.
  • Example 3.5 Compound TV-aminocarbamoylmethyl- iV- (2 '- (4 "-inethoxyphenyl) ethyl) -l, 4- bis [2' - (4" -fluorophenyl) ethyl] -3,7-dioxo- [l, 4] diazepan -5-carboxamide.
  • the Rink amide resin (400 mg, 0.3 mmol) is treated with 3 mL of 20% piperidine in dimethylformamide and the mixture is stirred in a microwave reactor for 2 min at 60 ° C.
  • the resin is filtered and washed with dimethylformamide. (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dichloromethane (3 x 3 mL).
  • the resin is treated with a solution of bromoacetic acid (208 mg, 5 eq.) And TV ⁇ / V-diisopropylcarbodiimide (235 ⁇ L, 5 eq.) In dimethylformamide (3 mL).
  • the reaction mixture is stirred for 2 min at 60 0 C in a microwave reactor.
  • the resin is filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL). Finally, treating the resin with a mixture of trifluoroacetic acid / dichloromethane / water (60: 40: 2) releases a reaction mixture containing the desired compound. This mixture is filtered and the solvents are removed by evaporation under reduced pressure followed by lyophilization. The residue is purified by RP-HPLC on a semi-preparative scale by applying a gradient of acetronitrile-water.
  • Example 3.6 Compound l- [2 '- (2 ", 4" -dichlorophenU) ethyl] -4- [2' - (4 "-fluorofenü) etU] -2- [N-aminocarbonylmetü-iV- (2 '- (2" pyridyl) ethyl) carbonylmethyl] piperazine-3,6-dione.
  • the Rink amide resin (400 mg, 0.3 mmol) is treated with 3 mL of 20% piperidine in dimetüformamida and the mixture stirred in a microwave reactor for 2 min at 60 0 C.
  • the resin is filtered and washed with dimethylformamide (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dichloromethane (3 x 3 mL).
  • the resin is treated with a solution of bromoacetic acid (208 mg, 5 eq.) And ⁇ iV-diisopropylcarbodiimide (235 ⁇ L, 5 eq.) In dimethylformamide (3 mL).
  • the reaction mixture is stirred for 2 min at 60 0 C in a microwave reactor.
  • the resin is filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL).
  • dichloromethane 3 x 3 mL
  • isopropyl alcohol 3 x 3 mL
  • dimethylformamide 3 x 3 mL
  • a solution of 2- (2 ', 4'-dichlorophenyl) ethylamine 240 ⁇ L, 5 eq.
  • triethylamine 210 ⁇ L, 5 eq.
  • the resin containing the N-alkylglycine fragment is synthesized following a procedure similar to that described above.
  • this fragment is obtained by treating the resin with 20% piperidine in dimethylformamide, followed by acylation with bromoacetic acid (5 eq.) And ⁇ JV-diisopropylcarbodiimide (5 eq.), And coupling the amine with iV- [2-2 '- (pyridin-2-yl) ethylamine (5 eq.) In the presence of triethylamine (5 eq.).
  • the Rink amide resin (400 mg, 0.3 mmol) is treated with 3 mL of 20% piperidine in dimethylformamide, the mixture being stirred in a microwave reactor for 2 min at 60 0 C.
  • the resin is filtered and washed with dimethylformamide (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dichloromethane (3 x 3 mL).
  • the resin is treated with a solution of bromoacetic acid (208 mg, 5 eq.) And ⁇ iV-diisopropylcarbodiimide (235 ⁇ L, 5 eq.) In dimethylformamide (3 mL).
  • the reaction mixture is stirred for 2 min at 60 0 C in a microwave reactor.
  • the resin is filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL).
  • dichloromethane 3 x 3 mL
  • isopropyl alcohol 3 x 3 mL
  • dimethylformamide 3 x 3 mL
  • a solution of 2- (2 ', 4'-dichlorophenyl) ethylamine 240 ⁇ L, 5 eq.
  • triethylamine 210 ⁇ L, 5 eq.
  • the resin containing the iv-alkylgricine fragment is synthesized following a procedure similar to that described above.
  • this fragment is obtained by treating the resin with 20% piperidine in dimethylformamide, followed by acylation with bromoacetic acid (5 eq.) And iV ⁇ ⁇ P-diisopropylcarbodiimide (5 eq.), And coupling the amine with 2- (4'-methoxyphenyl) ethylamine (5 eq.) In the presence of triethylamine (5 eq.).
  • the Rink amide resin (400 mg, 0.3 mmol) is treated with 3 mL of 20% piperidine in dimethylformamide, the mixture being stirred in a microwave reactor for 2 min at 60 0 C.
  • the resin is filtered and washed with dimethylformamide (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dichloromethane (3 x 3 mL).
  • the resin is treated with a solution of bromoacetic acid (208 mg, 5 eq.) And iV ⁇ V-diisopropylcarbodiimide (235 ⁇ L, 5 eq.) In dimethylformamide (3 mL).
  • the reaction mixture is stirred for 2 min at 60 0 C in a microwave reactor.
  • the resin is filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL).
  • dichloromethane 3 x 3 mL
  • isopropyl alcohol 3 x 3 mL
  • dimethylformamide 3 x 3 mL
  • triethylamine 210 ⁇ L, 5 eq.
  • reaction mixture is stirred at room temperature for 30 min. Filter and the resin is washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL).
  • dichloromethane 3 x 3 mL
  • isopropyl alcohol 3 x 3 mL
  • dimethylformamide 3 x 3 mL
  • a solution of 2- (4'-fluorophenyl) ethylamine is added to the resin (200 ⁇ L, 5 eq.) And triethylamine (210 ⁇ L, 5 eq.) In 3 mL of dimethylformamide and the suspension is stirred for 3 h at room temperature.
  • the reaction is stirred for 16 h at the same temperature.
  • the resin containing the JV-alkylglycine fragment is synthesized following a procedure similar to that described above.
  • this fragment is obtained by treating the resin (290 mg, 0.22 mmol) with 20% piperidine in dimethylformamide, followed by acylation with bromoacetic acid (153 mg, 5 eq.) And NJf-diisopropylcarbodiimide (175 ⁇ L, 5 eq.), and coupling the amine with 2- (4'-methoxyphenyl) etuamine (235 ⁇ L, 5 eq.) in the presence of triethylamine (155 ⁇ L, 5 eq.).
  • the Rink amide resin (400 mg, 0.3 mmol) was treated with 3 mL of piperidine at
  • the resin was filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL). Finally, treating the resin with a mixture of trifluoroacetic acid / dichloromethane / water (60: 40: 2) released a reaction mixture containing the desired compound. This mixture was filtered and the solvents were removed by evaporation under reduced pressure followed by lyophilization. The residue was purified by RP-HPLC on a semi-preparative scale by applying a gradient of acetronitrile-water (20% acetonitrile?
  • the reaction mixture was stirred for 2 min at 60 0 C in a microwave reactor.
  • the resin was filtered and washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL).
  • dichloromethane 3 x 3 mL
  • isopropyl alcohol 3 x 3 mL
  • dimethylformamide 3 x 3 mL
  • reaction mixture was stirred at room temperature for 30 min. It was filtered and the resin was washed with dichloromethane (3 x 3 mL), isopropyl alcohol (3 x 3 mL) and dimethylformamide (3 x 3 mL). Next, a solution of 2- (4'-fluorophenyl) ethylamine was added to the resin (200 ⁇ L, 5 eq.) And triethylamine (210 ⁇ L, 5 eq.) In 3 mL of dimethylformamide and the suspension was stirred for 3 h at room temperature. The reaction was stirred for 16 h at the same temperature.
  • the resin containing the iV-alkylglycine fragment was synthesized following a procedure similar to that described above.
  • this fragment was obtained by treating the resin (290 mg, 0.22 mmol) with 20% piperidine in dimethylformamide, followed by acylation with bromoacetic acid (153 mg, 5 eq.) And NJ ⁇ -diisopropylcarbodiimide (175 ⁇ L, 5 eq.), and coupling the amine with 2- (2 ', 4'-dichlorophenyl) ethylamine (170 ⁇ L, 5 eq.) in the presence of triethylamine (155 ⁇ L, 5 eq.).
  • Example 4 Effects of compounds Ia and Ib on the interaction between UBC13 and UEVl.
  • Example 2 supports the hypothesis that compounds Ia and Ib fit with a good affinity in the surface hydrophobic groove of UBC 13 normally used for their specific interaction with the first aliphatic helix of UEV proteins (Mms2p , UEVl and UE V2). This suggests that such compounds may competitively interfere with the interaction between UBC13 and UEVl (or Mms2p and UEV2).
  • Mms2p first aliphatic helix of UEV proteins
  • coli strain BL21 were transformed into plasmids pGEX-4Tl-UBC13 or pGEX-4T3-UEVl, selecting colonies transformed by growth in plates with ampicillin (100 ⁇ g / mL). Individual colonies were transferred to 3 L of LB medium without antibiotics, growing under agitation at 37 0 C until the culture reached the exponential phase (OD 600 J1 ⁇ 0.6), at which time the expression of recombinant proteins was induced by the addition to the culture of isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG, Sigma 1-6758) at a concentration of 1 mM for 5 h.
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • a HiTrapBenzamidine FF column (Amersham Biosciences 27-0846-01) was attached to the previous column, so that the GST unit was trapped in the first column, and the thrombin in the second column.
  • the UEVl protein was then eluted, without the GST portion, followed by a subsequent purification step by gel filtration chromatography with a Superdex 75 column.
  • the recombinant GST-UBC13 protein was expressed as indicated above, purified by chromatography of affinity in GSTrap FF columns, followed by filtration chromatography on Superdex 75. Fractions corresponding to the purified proteins were concentrated by centrifugation in Centricon YM-10 columns (Millipore 4205), stored at 4 0 C until use.
  • GST-UBC13 and GST-UBC13-UEV1 complexes were then eluted by incubation with an elution buffer containing 10 mM of reduced glutathione in 50 mM Tris-HCl pH 8.0 (remaining fraction, or B).
  • Fractions E and B were concentrated by centrifugation on Centricon YM-10 columns, denatured by boiling in Laemmli buffer (250 mM Tris-HCl, 10% SDS, 500 mM DTT, 0.5% bromophenol blue, 50% glycerol, pH 6 '8) and separated electrophoretically in 10% polyacrylamide gels - SDS.
  • the proteins were electrophoretically transferred to PVDF membranes, which were pre-incubated for 1 h with blocking buffer (5% skim milk in PBS pH 7'4 with Tween-20 0'l%), and then incubated for 1 h with anti-UEVl or anti-UBCl 3 rabbit antibodies.
  • blocking buffer 5% skim milk in PBS pH 7'4 with Tween-20 0'l%
  • anti-UEVl or anti-UBCl 3 rabbit antibodies were previously produced in our laboratory by immunization of rabbits with synthetic peptides corresponding to specific sequences of UEVl or UBC13, respectively, the antibodies being purified from immune sera by chromatography. affinity with columns on which immunizing peptides were immobilized [37].
  • the membranes were washed three times with 20 mL of PBS-Tween-20, and incubated for 30 min with goat anti-rabbit immunoglobulin antibodies conjugated to horseradish peroxidase (Dako Cytomation) diluted to 1 : 1000 in blocking buffer. After three washes with PBS-Tween-20, the reactions on the membranes were visualized by chemiluminescence with the ECL system (Amersham) and exposure on autoradiographic films.
  • horseradish peroxidase horseradish peroxidase
  • Figure 5 (B) shows that compounds Ia and Ib, but not control cyclic compound VIII-N6-2-1C, efficiently inhibit the binding of UEV1 to GST-UBCl 3, since up to 60% (for compound Ia) or 40% (for compound Ib) of UEVl appears in the eluted fraction and not bound to GST-UBC13.
  • Figure 5 (B) only shows the results of In an assay performed with 100 ⁇ M of cyclic compounds, an efficient inhibition of the interaction of UEVl with UBC 13 was also observed at much lower concentrations of up to 10 nM of compounds Ia and Ib.
  • Example 5 Effects of compound Ia on UBC13-UEV1-mediated polyubiquitilation.
  • UBCl 3 was pre-incubated for 10 min at room temperature with 100 ⁇ M of the compound before being added to the reaction.
  • the reaction was started by adding 2 mM ATP, and was carried out by incubation at 37 0 C for different times, stopping by adding Laemmli (250 mM Tris-HCl, 10% SDS, 500 mM DTT, buffer 0.5% bromophenol blue and 50% glycerol at ⁇ H6.8) and boil for 3 min.
  • the samples were electrophoretically separated on polyacrylamide-SDS gels and electrophoretically transferred to PVDF membranes.
  • the immunodetection procedure described in Example 4 was followed, detecting ubiquitin molecules with rabbit anti-ubiquitin antibody (Biomol UG 9510), and chemiluminescence reactivity is revealed.
  • Figure 6 (A) shows that, in the absence of compound Ia, the reaction described above results in the formation of polyubiquitin chains of increasing size over time, due to the progressive addition of ubiquitin units.
  • the appearance of triubiquitin (Ub 3 ) is evidenced after 30 minutes of reaction, tetraubiquitin (Ub 4 ) at 60 minutes, pentaubiquitin (Ub 5 ) at 90 minutes, and of shapes of size (or complexity) superior to later times.
  • the quantitative analysis of the generation of the different forms of polyubiquitins indicates that the preincubation of UBCl 3 with 100 ⁇ M of compound Varubin (Ia) causes a slower rate of generation of polyubiquitilated forms.
  • Example 6 Biological activities of compounds Ia and Ib. Activity in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • RAD6 or REV3 and its parental strain (control) in viability tests after exposure to ultraviolet or MMS radiation.
  • the genotypes of the strains used are the following:
  • Example 7 Biological activities of compounds Ia and Ib. Inhibition of the stimulation of the transcriptional factor NF- ⁇ B by TNF ⁇ .
  • one of the biochemical pathways regulated by K63-type polyubiquitilation, catalyzed by UBC13-UEV1 (or UBC13-UEV2), is the activation of the transcriptional factor NF- ⁇ B by signals induced by cytokines, TNF ⁇ and other polypeptides .
  • induction tests of luciferase activity were carried out (determined with the Dual-Luciferase Repórter Assay System kit, from Promega, catalog number El 910) generated by expression of the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene directed by a promoter containing three recognition sites for NFK-B.
  • HeLa cells were co-transfected with the plasmid pRL-TK, which codes for Renilla reniformis Luciferase and is a transfection efficiency control, and the prLUC plasmid, a plasmid that allows to determine the transcriptional activity of NF-?
  • the cells were incubated with TNF ⁇ (10 ng / mL) for 4 h, after which they were washed with phosphate buffered saline (PBS) and used with 250 ⁇ L lysis buffer, following the manufacturer's instructions (Promise) 100 ⁇ L of luciferase reagent (LARII) was added to the Used to measure the firefly luciferase activity, after which the reaction was stopped with 100 ⁇ L of stop buffer with Renilla reniformis luciferase substrate, at which time this second activity was determined . Luciferase activity of Firefly was normalized in relation to Renilla's luciferase activity.
  • Figure 9 shows that preincubation of HeLa cells with compound Ia or compound Ib inhibits dose-dependent stimulation of TNF ⁇ -induced transcriptional activity of NF- ⁇ B. This inhibition is greater with compound Ia than with compound Ib, reaching an inhibition of about 50% of the activation of NF- ⁇ B by TNF ⁇ when HeLa cells are pre-incubated with Varubin (Ia) at a concentration of 100 ⁇ M. Therefore, compounds Ia and Ib are efficient inhibitors of NF- ⁇ B activation, which will be applicable in processes where this activation is important, including inflammatory and neoplastic processes.
  • Example 8 Biological activities of compounds Ia and Ib. Sensitization of tumor cells to the cytotoxic effects of doxorubicinan and etoposide.
  • the activation of the transcriptional factor NF- ⁇ B is one of the survival mechanisms of normal and tumor cells when subjected to different forms of stress or damage [44-47]. Therefore, one of the consequences of inhibiting the activation of this transcriptional factor is that it produces a greater sensitivity to the cytotoxic effects of various agents, physical or chemical, that cause genotoxic damage or other cell stress. Therefore, incubation of cells with compounds Ia or Ib, due in part to their ability to inhibit the activation of NF- ⁇ B, could cause cellular sensitization to the effects of chemotherapeutic agents such as doxorubicin or etoposide.
  • chemotherapeutic agents such as doxorubicin or etoposide.
  • doxorubicin or etoposide at certain doses
  • compound Ia or Ib should cause a cytotoxic effect greater than doxorubicin or etoposide alone and similar to that which may cause higher doses of doxorubicin or etoposide, respectively.
  • cell count experiments were performed using the CyQuant procedure (Molecular Probes, Cat. No. C-7026). This method of cell quantification is based on a compound whose Fluorescence is quantitatively stimulated after binding to nucleic acids.
  • the IC50 for doxorubicin is in PC-3 cells of about 0.5 ⁇ M at 72 h of treatment, and the IC50 for etoposide is in HeLa cells of approximately 1'25 ⁇ M at 24 h of treatment.
  • the addition of 100 ⁇ M of Ia reduced the IC50 of doxorubicin to 0.01 ⁇ M for PC-3 cells and the IC50 of etoposide to 0.04 ⁇ M for HeLa cells. Therefore, treatment with 100 ⁇ M of compound Ia produces a sensitization to the cytotoxic effects of doxorubicin between 5 times (PC-3 cells) and a sensitization to the cytotoxic effects of 30 times etoposide (HeLa cells).
  • Example 9 Antitumor activity of compound Ia (Varubin) as a chemosensitizer in murine models of human tumor cell xenografts.
  • This last procedure also allows to represent in real time images of the location of the tumor cells in the inoculated animals, as well as the size of the tumor, since the intensity of the light (number of photons) emitted in the presence of luciferin is directly proportional to the number of PC-3.1uc cells.
  • mice 24 male Balb / c nu / nu mice (Charles River Laboratories), 6 weeks old, were used. These animals were kept in a pathogen-free environment at all times, having been kept for 1 week after receiving them in the animal farm, before experimental manipulation. After being anesthetized by intraperitoneal (ip) injection of an equal mixture of 6 mg / kg of droperidol (Roche, Basel, Switzerland) and 12 mg / kg of midazolam (Rovi SA, Madrid, Spain), injections were made intramuscular (im), both in the right thigh and in the left thigh of each animal, of 1 x 10 PC-3 cells. Sluc, suspended in 100 ⁇ L of culture medium lacking fetal bovine serum.
  • the determinations are expressed in relative light units (RLUs, or Relative Light Units).
  • RLUs relative light units
  • a subtraction of the background signal was carried out, corresponding to areas of the animals away from the tumors (thorax).
  • the image was taken of an image with visible light of the same animal in the same position.
  • Quantification and photon analysis were performed with the help of the WASABI image analysis program (Hamamatsu Photonics).
  • the transformation of the quantitative information into images was performed either in pseudocolors or in grayscale, maintaining the same parameters and ranges of intensity and colors for all animals, so that the intensities of gray / black color faithfully represent the quantitative data , being comparable between experiments and between different animals.
  • mice For graphical representations, quantitative data (RLUs) were normalized, for each tumor, in relation to the RLUs on day 0 of treatment.
  • mice treated with doxorubicin only barely experienced growth during the experiment ( Figure 11).
  • mice treated with both doxorubicin iv and Varubin im also did not grow significantly during this experiment.
  • the tumors of the animals treated only with Varubin im also showed very limited growth (without significant differences with respect to those treated with doxorubicin), and in any case significantly lower than that of the tumors of the control mice. Therefore, Varubin shows antitumor activity in this model of transplanted tumors in nu / nu mice, at a concentration of 100 ⁇ M, in intramuscular injection.
  • Himeic acid A a new ubiquitin-activating enzyme inhibitor isolated from a marine-derived fungus, Aspergillus sp. Bioorg Med Chem Lett 15: 191-194, 2005.

Abstract

El compuesto R-(CR1R2)q-CO-N(R3)-C(R4R5)-CO-NH2 (I) en el que R es un radical heterociclilo; R1 y R2 son independientemente H o alquilo; R3 es H, alquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, alquenilo, arilo, arilalquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo; R4 y R5 son independientemente H o alquilo; q es un número seleccionado entre 0 y 1; y sus sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros tienen actividad inhibidora de las interacciones UBC13-UEV y pueden ser utilizados en la elaboración de composiciones farmacéuticas dirigidas a la terapia antitumoral o al tratamiento y/o profilaxis de enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBC13, rutas metabólicas en las que interviene el factor transcripcional NF- ϰB, o rutas en las que intervienen PCNA o RAD6.

Description

COMPUESTOS CON ACTIVIDAD INHIBIDORA DE LAS INTERACCIONES UBC13-UEV, COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y APLICACIONES TERAPÉUTICAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención está dentro del campo de la química médica, y más concretamente se relaciona con el desarrollo de compuestos terapéuticos con actividad inhibidora de las interacciones UBC13-UEV, y con la elaboración o el uso de composiciones farmacéuticas dirigidas a la terapia antitumoral o dirigidas al tratamiento y/o profilaxis de enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBC13, rutas metabólicas en las que interviene el factor transcripcional NF-κB, o rutas en las que intervienen PCNA o RAD6.
ESTADO DE LA TÉCNICA La modificación postraduccional de proteínas conocida como ubiquitilación consiste en la formación de enlaces isopeptídicos entre una Usina de una proteíña sustrato y la glicina carboxiterminal del péptido ubiquitina [I]. La molécula de ubiquitina (Ub) es un polipéptido de 16 amino ácidos, abundante en el citosol y el núcleo celulares. Una molécula de Ub forma un enlace tioéster con una enzima El (enzima de activación de Ub) que, en una reacción que requiere ATP, activa una molécula de Ub, de tal modo que ésta queda en un estado que facilita la formación de un enlace tioéster con la cisterna catalítica de una segunda clase de enzimas, llamada E2 o enzima de conjugación de ubiquitinas. En humanos hay una sola enzima El, mientras que existen cerca de 30 enzimas de tipo E2. Una enzima E2 puede transferir una molécula de Ub a una proteína sustrato, con la formación de un enlace isopeptídico entre la glicina carboxiterminal de la Ub y una Usina de la proteína sustrato. La modificación de una proteína sustrato mediante adición covalente de una unidad de ubiquitina se llama monoubiquitilación. La misma enzima E2 puede catalizar la transferencia de una molécula de Ub a otra molécula de Ub previamente unida a una proteína sustrato, con la formación de enlaces isopeptídicos entre ubiquitinas. Esta reacción se puede repetir numerosas veces, dando lugar a la formación de cadenas de poliubiquitina, siendo este proceso conocido como poliubiquitilación. Una molécula de ubiquitina tiene siete Usinas, cualquiera de las cuales puede ser utilizada para la formación de enlaces isopeptídicos entre ubiquitinas. Experimentos en que se determina la abundancia de cadenas de poliubiquitina de diferentes tipos indican que las Usinas de la molécula de ubiquitina más utilizadas en la formación de cadenas poliubiquitina son las que se encuentran en las posiciones 29, 48 y 63 de la ubiquitina [2, 3]. La formación, sobre proteínas sustrato, de cadenas de poliubiquitina de cuatro o más unidades de Ub a través de enlaces isopeptídicos con la Usina en posición 48 (K48) constituye una señal que es reconocida por subunidades de la partícula regulatoria del proteasoma [4], con lo que la proteína así modificada es procesada y degradada por el proteasoma. En cambio, cadenas de poliubiquitina que se forman mediante enlaces isopeptídicos a través de la Usina en posición 63 (K63) de la ubiquitina no parecen ser reconocidas por el proteasoma [5], y por tanto este tipo de poliubiquitilación no constituye una señal para ' el procesamiento y degradación proteosomal de la proteína modificada. Se sabe muy poco de la función de las otras formas de poliubiquitilación, o de las consecuencias que dichas modificaciones tienen sobre las proteínas sustrato. La poliubiquitilación por Usina 48 (K48) de ubiquitina se llama "canónica", mientras que las poliubiquitilaciones que usan cualquiera de las otras Usinas se llaman "no canónicas" o "variantes" [6]. Muchas E2 pueden catalizar la transferencia de Ub para formar cadenas de poliubiquitina de tipo K48 o K29, mientras que la formación de cadenas poliubiquitina del tipo K63 parece requerir específicamente los heterodímero UBC13-UEV1 o UBC13-UEV2 [6]. La generación de cadenas poliubiquitina se contrarresta mediante la actividad de hidrolasas (isopeptidasas) específicas de tipo de enlace (K48 ó K63).
Dos de los procesos bioquímicos que requieren del heterodímero UBC13-UEV1 y su actividad para mediar poliubiquitilación del tipo K63 son la reparación de ADN mediada por PCNA (proliferating cell nuclear antigen) [7] y la transmisión de señales iniciada por citoquinas como TNFα o IL-I [8]. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, el heterodímero Ubcl3p-Mms2p (Mms2p es la proteína de S. cerevisiae ortóloga de UEVl y UEV2) es esencial para la modificación por poliubiquitilación variante (tipo K63) de PCNA [7-11], participando en la ruta de reparación translesional de ADN, dependiente de RAD6 (enzima de conjugación de ubiquitinas), conocida como "error-free" [12-16]. La proteína PCNA es modificada por sumoilación (unión covalente de una molécula de SUMO) al inicio de la fase S, lo que le confiere estabilidad, permitiendo su actividad en la replicación del ADN durante esa fase del ciclo celular [7, 9]. Fuera de la fase S, PCNA es modificada por poliubiquitilación canónica por el enzima de conjugación Radóp asociado a la ubiquitina ligasa Radlδp. Sin embargo, en respuesta a daños genotóxicos, se produce una entrada nuclear del heterodímero Ubcl3p-Mms2p, que, asociado a la ubiquitina ligasa Rad5p, cataliza la poliubiquitilación de tipo K63 de PCNA, en competencia con la modificación por poliubiquitilación canónica mediada por Radβp, impidiendo así la degradación de PCNA, que puede así ser utilizada en la reparación translesional de mellas en el ADN [7-11, 17]. En mamíferos, no se ha demostrado inequívocamente que PCNA sea modificada por poliubiquitilación variante mediada por UBC13-UEV1 (o UBC13- UEV2), y por tanto, y a diferencia de la levadura S. cerevisiαe, no está claro el papel de este tipo de modificación de sustratos en la reparación de DNA dependiente de PCNA.
En células de mamífero, se ha demostrado que la actividad de poliubiquitilación catalizada por UBC13-UEV1 es imprescindible para la heterodimerización de la proteína adaptadora TRAF2 y TRAF6 que sigue a la unión de TNFα con su receptor [18-20], o la heterodimerización de TRAF6 inducida por IL-I [21]. Esta heterodimerización estimula la actividad ubiquitina ligasa de TRAF2 o TRAF6, que recluían UBC13-UEV1 para una autopoliubiquitilación por cadenas de tipo K63. Estas cadenas de poliubiquitina K63 son reconocidas por las proteínas TAB2 o TAB3, que forman un complejo con la proteína kinasa TAKl, activándola [22], que a su vez fosforila y activa otra kinasa, IKKα, que inicia una cascada de señalización que lleva a la fosforilación y degradación de IKB, el inhibidor citoplasmático de NFKB, que puede así translocarse al núcleo y ejercer su acción de regulador transcripcional [18-22].
Por tanto, el heterodímero UBC13-UEV1 (o UBC13-UEV2) es un regulador esencial de dos procesos tan importantes como la inflamación mediada por citoquinas (TNFα) y, al menos en levaduras, la reparación postreplicativa en respuesta a daños genotóxicos. Hay otros procesos biológicos que requieren de poliubiquitilación de tipo K63 mediada por UBC13-UEV1 (o UBC13-UEV2), tales como motilidad [23], endocitosis dependiente de ligando [24], o activación antigénica de células T [25]. Por tanto, son muchos los procesos biológicos que pueden estar mediados por esta modificación postraduccional, y cuyo estudio representa un nuevo campo de investigación que apenas se ha iniciado.
La estructura del heterodímero formado por UBC 13 y las proteínas UEV [26, 27] muestra una interfaz de interacción en que la característica más llamativa es la participación, en UBCl 3, de 2 bolsas hidrofóbicas muy delimitadas sobre la que encajan residuos también hidrofóbicos de la proteína UEV (Mms2p, UEVl o UEV2), sobre todo la Fenilalanina en posición 8, la Prolina en posición 5 y la Isoleucina en posición 36. Estas interacciones son estabilizadas por interacciones electrostáticas que implican residuos polares situados a uno y otro lado de las interacciones hidrofóbicas. Esta configuración es única entre enzimas de conjugación de ubiquitinas, y por tanto altamente específica de la interacción entre UBC 13 y cualquiera de las proteínas UEV (Mms2ρ, UEVl y UEV2) [26-28]. Este hecho, unido a lo delimitado de las bolsas hidrofóbicas en UBC 13 que participan en la interacción con las proteínas UEV, convierte a esta interfaz en una interesante diana para el diseño de compuestos péptidomiméticos que interfieran con la misma. La inhibición de la formación de este heterodímero debería afectar su actividad catalítica y por tanto la poliubiquitilación de tipo K63 de sustratos relevantes, conllevando un bloqueo de los procesos en que participa esta modificación postraduccional. A este respecto, cabe indicar que se ha demostrado que la modificación postraduccional de UBC 13 mediante unión covalente de la pequeña proteína ISG15 inhibe su actividad catalítica [29, 30]. Esta observación puede ser de gran interés para estudiar el efecto de la inhibición de UBC 13 en diferentes sistemas biológicos, aunque hay que recalcar que las modificaciones por ISGl 5 afectan a muchas otras proteínas.
El diseño de moléculas dirigidas al reconocimiento de superficies proteicas y que posean la capacidad de modular interacciones proteína-proteína de relevancia biológica es considerado como uno de los mayores retos de la biotecnología en el punto de confluencia entre la Química y la Biología y de un enorme potencial en la terapéutica. Sin embargo, y aunque se han desarrollado y descrito numerosos inhibidores del proteasoma [31, 32], o de actividades de enzimas específicos de implicados en ubiquitilación [33, 34], no se ha descrito hasta la fecha ningún inhibidor de la formación de cadenas de poliubiquitina del tipo K63, ni tampoco ningún inhibidor específico de la formación de otros tipos de cadenas de poliubiquitina (K48, K29, K6, etc.). Igualmente, tampoco se conocen otros inhibidores farmacológicos del enzima de conjugación de ubiquitinas UBCl 3.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está relacionada con una nueva familia de compuestos de fórmula (I) que presentan actividad inhibidora de las interacciones UBC13-UEV o actividad inhibidora de la actividad enzimática de UBCl 3, por lo que son útiles en la terapia antitumoral o en el tratamiento y/o profilaxis de patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBC 13 o a rutas metabólicas en las que interviene el factor transcripcional NF-κB. En la presente invención la expresión "patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBC 13 o a rutas metabólicas en las que interviene el factor transcripcional NF-κB" incluye aquellas enfermedades en los que UCB 13 o NF-κB no tienen un papel causal directo en la enfermedad/patología sino que intervienen de algún modo en el desarrollo de dicha enfermedad/patología, motivo por el cual los compuestos de fórmula (I) de la presente invención son útiles en la terapia antitumoral o en el tratamiento y/o profilaxis de patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBC 13 o a rutas metabólicas en las que interviene el factor transcripcional NF-κB.
Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a compuestos de fórmula (I), así como a sus sales, solvatos, profármacos y esteroisómeros de los mismos (compuestos de la invención) como se describen a continuación.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de dichos compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos y esteroisómeros. Un aspecto adicional de la invención se refiere a compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos y esteroisómeros para uso médico.
Otro aspecto adicional de la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos ó esteroisómeros farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento y/o profilaxis de patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBCl 3.
Otro aspecto adicional de la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I), o una sal, solvato, profármaco o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento dirigido al tratamiento y/o profilaxis de patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene el factor transcripcional NF-κB.
En otro aspecto adicional, la invención se refiere al uso de los compuestos de • fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables del mismo, o sus mezclas, para la elaboración de un medicamento dirigido a la terapia antitumoral, en donde dicho medicamento es un antagonista de, o inhibe, la ruta de tolerancia a daños genotóxicos mediada por PCNA y RAD6 produciendo efectos quimio- o radiosensibilizantes. Asimismo, otro aspecto adicional de la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I) en la elaboración de un medicamento para aumentar la sensibilidad de un mamífero al tratamiento con un agente antitumoral.
Finalmente, otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o una sal, profármaco, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en cantidad terapéuticamente efectiva, junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Esquema de los pasos y metodologías seguidos en la presente invención para el desarrollo de inhibidores de la interacción entre UBC 13 y UEVl. Figura 2. Resultados del escrutinio de las 52 mezclas de peptoides en cuanto a su capacidad de inhibir la interacción entre UBC13 y UEVl, determinada por ensayos de doble híbrido en levaduras. Se incubaron células positivas para la interacción UBCl 3- UEVl con 5 μM de cada mezcla de peptoides. Las actividades de interacción se normalizaron con respecto a células sin peptoides, y con respecto a actividades β- galactosidasa del control positivo de interacción (T grande — p53) en presencia de las mismas mezclas de peptoides. Las barras rellenas en negro corresponden a las mezclas con mayor actividad inhibidora de la interacción. Figura 3. Resultados de docking. Modelos estructurales del encaje molecular del compuesto Varubin o Ia sobre la superficie de UBC13. La ilustración corresponde a una representación de Connolly de la superficie de UBCl 3, junto a una representación del compuesto Varubin con el encaje óptimo mediante CDOCK sobre la superficie de UBCl 3. Esta representación se ilustra a dos aumentos diferentes, para permitir apreciar mejor el encaje del compuesto Varubin sobre la bolsa hidrofóbica de la superficie de UBCl 3 normalmente utilizada para interaccionar con las proteínas UEV (Mms2p, UEVl y UEV2). Figura 4. Resultados de docking. Modelos estructurales del encaje molecular del compuesto Ib sobre la superficie de UBC13. La ilustración corresponde a una representación de Connolly de la superficie de UBC 13 normalmente utilizada para interaccionar con UEVl, junto a una representación en forma de barras del compuesto Ib con el encaje óptimo mediante CDOCK sobre la superficie de UBCl 3. Esta representación se ilustra a dos aumentos diferentes, para permitir apreciar mejor el encaje del compuesto Ib sobre la bolsa hidrofóbica de la superficie de UBC13 normalmente utilizada para interaccionar con las proteínas UEV (Mms2p, UEVl y UEV2). Figura 5. Inhibición por los compuestos Ia (Varubin) y Ib de la interacción entre las proteínas UBC13 y UEVl. (A) Ensayo de doble híbrido en levaduras. Se incubaron células positivas para la interacción UBC13-UEV1 con 100 μM de compuesto Ia o Ib. Las actividades de interacción se normalizaron con respecto a células sin compuestos cíclicos, y con respecto a actividades β-galactosidasa del control positivo de interacción (T grande — ρ53) en presencia de las mismas concentraciones de los 2 compuestos. (B) Ensayo de interacción de proteínas recombinantes purificadas. Se preincubó GST- UBC 13 recombinante con 100 μM de compuesto Ia o Ib, y se determinó la capacidad de interacción de UEVl sobre GST-UBC13 tras la unión del complejo sobre columnas de glutation-Sepharose. E, fracción eluída de la columna (no unida a GST-UBC 13), B fracción remanente en la columna (unida a GST-UBCl 3, eluída con tampón que contiene glutation reducido).
Figura 6. Inhibición de la actividad catalítica de UBC13-UEV1, en ensayos de poliubiquitilación in vitro. (A) Acumulación a lo largo del tiempo de poliubiquitinas libres en reacciones control, o en presencia de 100 μM de compuesto Ia. La ubiquitina utilizada en estas reacciones es la silvestre (con las 7 lisinas disponibles para formar enlaces isopeptídicos). Las formas monoubiquitiladas (Ub) y diubiquitiladas (Ub2) están presentes a tiempo 0 y su abundancia no varía significativamente a lo largo de toda la cinética. Las formas triubiquitiladas (Ub3) y tetraubiquitiladas (Ub4) se acumulan con cinéticas de tercer orden, tal como se muestra en (B). En (C) las reacciones se han llevado a cabo con ubiquitina K63 (de las 7 lisinas disponibles, solamente está disponible la de la posición 63; el resto de lisinas se han mutado a argininas y por tanto no están disponibles para formar enlaces isopeptídicos). Las reacciones se realizaron en las mismas condiciones que las ilustradas en (A), en presencia, o no (control) de 100 μM de Ia.
Figura 7. Sensibilización por los compuestos Ia y Ib a radiación ultravioleta y tratamiento con metil-metano sulfonato en mutantes Δradó de S. cerevisiae. Curvas dosis-respuesta. Cepas de S. cerevisiae carentes de RAD6 se sometieron a diferentes dosis de radiación ultravioleta (gráfico superior) o a distintos tiempos de exposición a MMS al 0'03% (gráfico inferior), sin (YPD) o con 100 μM de compuesto Ia o compuesto Ib. La supervivencia se determinó en relación a células no sometidas a tratamiento. Figura 8. Sensibilización por los compuestos Ia y Ib a radiación ultravioleta y tratamiento con metil-metano sulfonato en mutantes Δrev3 de S. cerevisiae. Curvas dosis-respuesta. Cepas de S. cerevisiae carentes de REV3 se sometieron a diferentes dosis de radiación ultravioleta (gráfico superior) o a distintos tiempos de exposición a MMS al 0'03% (gráfico inferior), sin (YPD) o con 100 μM de compuesto Ia o compuesto Ib. La supervivencia se determinó en relación a células no sometidas a tratamiento.
Figura 9. Inhibición por los compuestos Ia y Ib de la inducción por TNFα de la transactivación de NF-κB. Curva dosis-respuesta. Células HeLa transfectadas con un plásmido indicador de actividad transcripcional NF-κB (activación de luciferasa), y preincubadas o no con distintas concentraciones de compuesto Ia o compuesto Ib, fueron tratadas con 10 ng/mL de TNFα durante 2 h, cuantificándose la activación de NF-κB. Las unidades de actividad luciferasa se han normalizado en relación a la actividad inducida por TNFα en ausencia de compuestos Ia o Ib. Figura 10. Sensibilización por el compuesto Ia a los efectos citotóxicos de la doxorubicina en células PC-3 y a los efectos citotóxicos del etopósido en células HeLa. Curvas dosis-respuesta. Las células PC-3 y HeLa se preincubaron, o no, con 100 μM de compuesto Ia, y fueron expuestas a distintas dosis de doxorrubicina o etopósido, respectivamente. La cuantificación de las células supervivientes se realizó mediante CyQuant y se normalizó con respecto a las células no sometidas a tratamiento. Figura 11. Representación gráfica de los tamaños relativos de los tumores (RLUs normalizados respecto al día 0 de cada tumor) de ratones control, tratados únicamente con doxorubicina (i. v., 5 mg/Kg, 1 vez a la semana), únicamente con Varubin (100 μM, i.m., 2 veces a la semana), o tratados con ambos compuestos. Se representan las medias de entre 6 y 8 tumores de cada grupo, con sus correspondientes barras de desviación estándar.
Figura 12. Imágenes (transformadas desde pseudocolor a escala de grises) correspondientes a un ratón representativo (el más cercano a la media) de cada grupo de tratamiento (control, doxorrubicina sola, Varubin sola, o tratamiento combinado), con seguimiento secuencial a lo largo de 52 días de la luminosidad, captada en un instrumento de Hamamatsu Photonics (ver texto para la descripción del instrumento y el modelo concreto utilizado). Los tumores se localizan en los 2 muslos de cada animal. Dentro de cada tumor, las áreas de mayor claridad se correlacionan con las de mayor
RLUs, y por tanto de mayor tamaño del tumor.
DESCRIPCIÓNDETALLADADE LAINVENCIÓN
El diseño de moléculas dirigidas al reconocimiento de superficies proteicas y que posean la capacidad de modular interacciones proteína-proteína de relevancia biológica es considerado como uno de los mayores retos de la biotecnología en el punto de confluencia entre la Química y la Biología y de un enorme potencial en la terapéutica.
En este sentido la enzima UBCl 3 costituye una prometedora diana terapéutica para el diseño de nuevos compuestos terapéuticos. En consecuencia, se diseñó un procedimiento que permite identificar pequeñas moléculas capaces de interferir competitivamente con la interacción entre UBC 13 y UEVl, siendo la hipótesis de partida que la inhibición de esta interacción inhibiría la capacidad de UBC 13 de formar cadenas de poliubiquitina del tipo K63. Las metodologías aplicadas para este desarrollo farmacológico priorizan, por un lado, la biodisponibilidad de los compuestos inhibidores (es decir, su capacidad de entrada y localización intracelular), por otro lado la especificidad de interferencia con la interacción UBC 13 -UEVl, y, finalmente, el ajuste espacial y de cargas de estas pequeñas moléculas a la superficie que UBC 13 emplea para interaccionar con UEVl . El procedimiento llevado a cabo en la presente invención combina de forma secuencial :
(1) Un cribaje experimental de una quimioteca combinatoria de iV-alquilglicinas (peptoides) para seleccionar aquéllos con capacidad de inhibición específica de esta interacción, determinada por ensayos de doble híbrido en levaduras. El método de escrutinio empleado permite abordar y resolver simultáneamente tanto la biodisponibilidad de las pequeñas moléculas como la especificidad de la inhibición de la interacción entre UBC 13 y UEVl, ya que se utilizan controles pertinentes de interacción proteína-proteína. (2) Una optimización computacional para determinar el encaje molecular sobre la superficie de UBCl 3 de los peptoides seleccionados en el anterior paso.
(3) La síntesis de pequeñas moléculas medicinables con actividad inhibidora de la interacción UBC13-UEV1. Como guía para esta síntesis se han utilizado los datos de optimización virtual generados en el anterior paso. (4) Una caracterización de los efectos funcionales, in vitro e in vivo, de los compuestos sintetizados en el anterior paso. Esta caracterización incluyó la determinación de la capacidad de estos compuestos para inhibir la actividad de conjugación de ubiquitinas de UBCl 3 -UEVl, así como de interferir con varios de los procesos celulares que se sabe que están regulados por esta enzima. En la Figura 1 se ilustran esquemáticamente los pasos y procedimientos seguidos para este desarrollo farmacológico. La estructura general (II) de la quimioteca modular combinatoria de peptoides empleados en nuestro escrutinio se muestra a continuación:
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(II) donde R1, R2 y R3 representan respectivamente la diversidad química empleada en la construcción de la quimioteca [35].
De esta forma, los inventores de la invención han identificado una nueva familia de compuestos con la fórmula general I capaces de inhibir la interacción entre las proteínas UBC13 y las proteínas UEV (Mms2p, UEVl y UEV2, ver Ejemplo 4),. capaces de inhibir competitivamente la actividad de poliubiquitilación de tipo K63 de esta enzima y que producen efectos biológicos a concentraciones farmacológicamente eficaces. Estos compuestos impiden competitivamente la correcta interacción entre las proteínas UBC 13 y la pro teína UEVl, impidiendo así su actividad enzimática para formar cadenas de poliubiquitinas en la modalidad conocida como "poliubiquitilación de tipo K63", siendo éste el mecanismo por el que estos compuestos ejercen su actividad (Ejemplo 5), modulando de esta manera a su vez todas aquellas rutas bioquímicas y procesos biológicos modulados por esta poliubiquitilación del tipo K63.
Las actividades biológicas de los fármacos objeto de la presente invención reflejan las vías bioquímicas que normalmente están reguladas por poliubiquitilación variante mediada por UBC13-UEV1, UBC13-UEV2 y Ubcl3p-Mms2p. En particular, la poliubiquitilación mediada por esta enzima heterodimérica regula, por un lado, la reparación de ADN por la ruta conocida como "libre de error", dependiente de RAD6 (Ejemplo 6), y, por otro, la activación del factor transcripcional NF-κB inducida por citoquinas y otros estímulos. Como consecuencia de esta actividad, estos fármacos sensibilizan tanto a células de la levadura Saccharomyces cerevisiae como a células de mamífero (HeLa y PC-3, derivadas de carcinoma de cérvix y de próstata, respectivamente) a la acción citotóxica de agentes físicos o químicos tales como luz ultravioleta, metil-metansulfonato o doxorrubicina (Ejemplo 8). Otra de las consecuencias biológicas de la actividad de estos fármacos es la inhibición de la activación del factor transcripcional NF-κB por citoquinas como el TNFα a concentraciones farmacológicamente eficaces (Ejemplo 7) y potencian los efectos citotóxicos de agentes antineoplásicos convencionales. Debido a estas actividades, los fármacos objeto de la presente invención tienen al menos dos clases de aplicaciones médicas:
(1) la sensibilización de células tumorales a agentes químicos o físicos con actividad citotóxica que dañan o modifican el ADN (agentes genotóxicos), lo que debe permitir disminuir la dosis terapéutica efectiva de tales agentes genotóxicos, disminuyendo por tanto algunos de los efectos secundarios indeseables de tales agentes. (2) efectos antiinflamatorios en patologías que cursan con activación de citoquinas y quimioquinas inflamatorias.
Además, estos nuevos fármacos constituyen herramientas para la investigación de la actividad de UBC13-UEV1 (UBC13-UEV2) y de otras actividades que regulan diversas formas de ubiquitilación y poliubiquitilación. En resumen, estos compuestos representan, además, una nueva clase de fármacos, ya que no existen precedentes de inhibidores farmacológicos de esta enzima UBCl 3, que se constituye en una nueva diana terapéutica, y representan un abordaje farmacológico original y novedoso con aplicaciones antineoplásicas, antiinflamatorias, y en múltiples otros procesos patológicos asociados a rutas metabólicas en que intervienen la enzima UBC 13 y la poliubiquitilación no canónica de tipo K63. Compuestos de fórmula (I)
Un primer aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula (I):
R-(CR1R2)q-CO-N(R3)-C(R4R5)-CO-NH2 (I) donde: - R es el radical
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donde: - R6 es un radical seleccionado entre: H, alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilalquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, arilalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir, heterociclilalquilo sustituido o sin sustituir; - A es un radical seleccionado entre arilo sustituido o sin sustituir y heterociclilo sustituido o sin sustituir;
- R7 y R8 se seleccionan independientemente de H, metilo, etilo, propilo e isopropilo,
- o es un número seleccionado entre 0, 1, 2, 3 y 4, - n es un número seleccionado entre O y I,
- la linea indica el lugar de enlace del radical R con el resto de la molécula de fórmula (I);
- Ri y R2 se seleccionan independientemente de H, metilo, etilo, propilo e isopropilo;
- R3 es un radical seleccionado entre: H, alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilalquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, arilalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir, heterociclilalquilo sustituido y sin sustituir;
- R4 y R5 se seleccionan independientemente de H, metilo, etilo, propilo e isopropilo;
- q es un número seleccionado entre O y I; y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
La invención también proporciona sales de los compuestos de la invención. Por ejemplo, las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos proporcionados en el presente documento pueden ser sales de adición de ácido, sales de adición de base o sales metálicas, y se pueden sintetizar a partir de los compuestos parentales que contengan un resto básico o ácido mediante procedimientos químicos convencionales. Generalmente, tales sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas ácido o base libres de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Los ejemplos de las sales de adición acida incluyen sales de adición de ácidos minerales tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodohidrato, sulfato, nitrato, fosfato, sales de adición de ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y />-toluensulfonato. Los ejemplos de sales de adición de álcalis incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de amonio y sales alcalinas orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, N5N- dialquilenetanolamina, trietanolamina, glutamina y sales de aminoácidos básicos. Los ejemplos de sales metálicas incluyen, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y litio. El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y normalmente no producen una reacción alérgica o adversa similar, tal como malestar gástrico, mareos y similares, cuando se administra a un humano. Preferentemente, como se usa en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea reconocida de manera general para su uso en animales, y más particularmente en humanos.
Para aquellos expertos en la materia será evidente que el alcance de la presente invención también engloba sales que no sean farmacéuticamente aceptables como posibles medios para obtener sales farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcance de la presente invención. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos por los técnicos en la materia. Los ejemplos de solvatos incluyen hidratos y alcoholatos, preferentemente alcoholatos C1- C6, por ejemplo, metanolato. El término "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye a cualquier compuesto derivado de un compuesto de fórmula (I), por ejemplo, esteres, incluyendo esteres de ácidos carboxílicos, esteres de aminoácidos, esteres de fosfato, esteres de sulfonato de sales metálicas, etc., carbamatos, amidas, etc., que, cuando se administra a un individuo es capaz de proporcionar, directa o indirectamente, dicho compuesto de fórmula (I) en dicho individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Para la persona experta será inmediatamente evidente que la presente invención engloba todos los posibles isómeros de los compuestos descritos en el presente documento. Así, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples, los compuestos de la invención pueden incluir isómeros Z y E. También se incluyen isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales. Un esteroisómero se entiende, para la persona experta, como compuestos formados de los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces, pero con diferentes estructuras tridimensionales que no son intercambiables.
Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I), sus isómeros, sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% del compuesto de fórmula (I), o de sus sales, solvatos o profármacos. A menos que se indique lo contrario, los compuestos de la invención también incluyen compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos que tienen dicha estructura, a excepción de la sustitución de un hidrógeno por un deuterio o por tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C o un nitrógeno enriquecido en 15N, están dentro del alcance de esta invención.
Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y/o solvatos así como las composisiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o un profármaco, solvato, derivado o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En las definiciones de los compuestos descritos en el presente documento los siguientes términos tienen el significado indicado:
"Alquilo" se refiere a un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada constituido por átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturaciones, con uno a seis, preferentemente uno a cuatro átomos de carbono y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, «-propilo, ¿-propilo, n- butilo, ¿-butilo, n-pentilo, etc.
"Alquenilo" se refiere a un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada constituido por átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos una insaturación, con dos a seis, preferentemente dos a cuatro átomos de carbono y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo.
"Cicloalquilo" se refiere a un anillo carbocíclico saturado que tiene entre tres y seis átomos de carbono. Los grupos cicloalquilo adecuados incluyen, pero no están limitados a grupos cicloalquilo tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.
"Cicloalquilalquilo" se refiere a un grupo cicloalquilo unido al resto de la molécula por un grupo alquilo tal como ciclopentiletilo.
"Alquinilo" se refiere a un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada constituido por átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono, conjugado o no, con dos a seis, preferentemente dos a cuatro átomos de carbono y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo, tales como —
CCH, -CH2CCH, -CCCH3, -CH2CCCH3.
"Arilo" se refiere a un radical hidrocarbonado aromático que tiene seis átomos de carbono como fenilo.
"Arilalquilo" se refiere a un grupo arilo unido al resto de la molécula por un grupo alquilo tal como bencilo y fenetilo.
"Heterociclilo" se refiere a un anillo estable de 3 a 6 miembros que consta de átomos de carbono y entre uno y cuatro heteroátomos seleccionados del grupo constituido por nitrógeno, oxígeno, y azufre, preferentemente un anillo de 4 a 6 miembros con uno, dos, tres o cuatro heteroátomos, más preferentemente un anillo de 5 ó 6 miembros con uno, dos, o tres heteroátomos. Para los propósitos de esta invención, el heterociclo es un sistema anular monocíclico. Los átomos de nitrógeno, carbono o azufre en el radical heterociclilo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado; y el radical heterociclilo puede estar parcial o completamente saturado o ser aromático. Los ejemplos de tales heterociclos incluyen, pero no están limitados a, azepinas, bencimidazol, benzotiazol, furano, isotiazol, imidazol, indol, piperidina, piperacina, tiadiazol, tetrahidrofurano. 'Ηeterociclüalquilo"se refiere a un grupo heterociclo unido al resto de la molécula por un grupo alquilo tal como pirimidiniletüo.
A no ser que se indique lo contrario los radicales alquilo, cicloalquüo, cicloalquilalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, arilalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno, dos o tres sustituyentes tales como halo (flúor, cloro o bromo), alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquüo, hidroxi, alcoxi, sulfoxi, O-Bencilo, O-Benzoilo, carboxi, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, sulfonilo, sulfonilamino, amino, imino y nitro.
El término "alcoxicarbonilo" se refiere a compuestos con la fórmula -C(=O)O-, en la que el C-término está unido a la molécula y el O-término está unido a un átomo de carbono para formar una función éster. Dicho átomo de carbono puede ser parte de un grupo alquilo, alquenilo, cicloalquüo, alquinilo, arilo, aralquilo o heterociclilo.
Según una forma de realización preferida de la invención, en los compuestos de fórmula (I) R6 es un radical seleccionado entre H, arilalquilo sustituido o sin sustituir y heterociclalquilo sustituido o sin sustituir, y R3 es un radical seleccionado entre H, arilalquilo sustituido o sin sustituir y heterociclalquilo sustituido o sin sustituir. *
Según otra forma de realización más preferida, R6 es un radical seleccionado entre fenilpropüo sustituido o sin sustituir, feniletilo sustituido o sin sustituir, bencilo sustituido o sin sustituir, furilpropilo sustituido o sin sustituir, furiletilo sustituido o sin sustituir, furilmetilo sustituido o sin sustituir, imidazolüpropüo sustituido o sin sustituir, imidazoliletilo sustituido o sin sustituir, imidazolilmetilo sustituido o sin sustituir piridinilpropilo sustituido o sin sustituir, piridiniletilo sustituido o sin sustituir, piridinilmetilo sustituido o sin sustituir, piperidinilpropilo sustituido o sin sustituir, piperidiniletilo sustituido o sin sustituir y piperidinilmetilo sustituido o sin sustituir; y R3 es un radical seleccionado entre fenilpropüo sustituido o sin sustituir, feniletilo sustituido o sin sustituir, bencilo sustituido o sin sustituir, furilpropilo sustituido o sin sustituir, furiletüo sustituido o sin sustituir, furilmetilo sustituido o sin sustituir, imidazolüpropüo sustituido o sin sustituir, imidazoliletilo sustituido o sin sustituir, imidazolilmetilo sustituido o sin sustituir, piridinilpropilo sustituido o sin sustituir, piridiniletilo sustituido o sin sustituir, piridinilmetilo sustituido o sin sustituir, piperidinilpropilo sustituido o sin sustituir, piperidiniletilo sustituido o sin sustituir, y piperidinilmetilo sustituido o sin sustituir. Según una forma aún más preferida, R6 es un radical sustituido por uno o más radicales seleccionados entre flúor, cloro, bromo, trifluorometilo, hidroxilo, alcoxilo, alquilcarbonilo, alquilamino, sulfonamino, ciano, nitro, nitrito, nitrato, tionitrato y carboxamido. Según otra realización adicional de la invención, R3 es un radical sustituido por uno o más radicales seleccionados entre flúor, cloro, bromo, trifluorometilo, hidroxilo, alcoxilo, alquilcarbonilo, alquilamino, sulfonamino, ciano, nitro, nitrito, nitrato, tionitrato y carboxamido y sales.
Según otras formas diferentes de realización de la invención: R6 es el radical p- fluorofeniletilo o 2,4-diclorofeniletüo; el sustituyente A es un arilo sustituido o sin sustituir; el sustituyente A es un fenilo sustituido por cloro, flúor y/o bromo, y o es un número seleccionado entre 1, 2 y 3; R7 y R8 son ambos H, o es 2, y A es p-fluorofenilo; R3 es 2-pirimidiniletilo, 2,4-diclorofeniletilo o 4-metoxifeniletilo; n es 1 ; n es 0; q es 0; q es 1. Una forma preferida de realización de la invención la constituye el compuesto de fórmula (Ia): (N-aminocarbamoilmetil-N-(2'-(2"piridil)etil)-l,4-bis[2'-(4"-fluoro- fenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5-carboxamida), denominado Varubin:
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(Ia) y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
Otra forma preferida de realización de la invención la constituye el compuesto de fórmula (Ib): (l,4-bis[2'-(4"-fluorofenfl)etü]-2-[N-aminocarbonilmetü-N-(2'-(2"- piridil) etil)-carbonilmetil] piperazina-3,6-diona):
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(Ib) y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
Otras formas preferidas de realización las constituyen los siguientes compuestos:
Figure imgf000021_0002
N-aminocarbamoilmetil-iV-(2'-(2"-ρiridil)etil)-l- iV-aminocarbamoilmetil-JV-(2'-(4"-
[2'-(2",4' '-diclorofenil)etil]-4-[2'-(4' '- metoxifenil)etil)-l-[2'-(2",4' '-diclorofenil)etil]-4- fluorofenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5- [2'-(4"-fluorofenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan- carboxamida 5-carboxamida
Figure imgf000021_0003
l-[2'-(2",4"-diclorofenil)etil]-4-[2'-(4"-
Figure imgf000021_0004
Λr-aminoc N-(2'-(4"- ^S^^2^láa^^ metoXifenil)etil)-l,4-bis[2'-(4"-fluorofeπil)etil]- (2"pmdü)etü) carbomlmetil] pφerazma-S^-dxona
3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5-carboxamida
Figure imgf000022_0001
l-[2'-(2",4"-diclorofenil)etil]-4-[2'-(4"- l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etíl]-2-[N- fluorofenil)etil]-2-[N-aminocarbonilmetil-A''-(2'- aminocarbonilmetil-N-(2'-(4"-
(4"-metoxifenil)etil) carbonilmetil] piperazina- metoxifenil)etil)carbonilmetil]piperazina-3,6-diona 3,6-diona
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000022_0003
[l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-2-[iV- iV-aminocarbamoilmetil-Λ''-[2' -(2 " ,4 "- aminocarbonilmetil-N-(2'-(2",4"- diclorofenil)etil]-l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]- diclorofenil)etil)carbonilmetil]ρiperazina-3,6-
3,7-dioxo-[l,4]diazeρan-5-carboxamida diona
En su segundo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de dichos compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos y esteroisómeros. Los compuestos de la presente invención de formula (I) pueden ser obtenidos o producidos mediante una vía sintética química u obtenidos a partir de una materia natural de distinto origen. En la presente solicitud se describe una vía sintética de los compuestos de la invención de fórmula I basada en una síntesis en fase sólida. A continuación se incluyen los esquemas de las síntesis en fase sólida de dos de los compuestos de la invención, aquellos de fórmula (Ia) y (Ib). Para aquellos expertos en la materia será evidente aplicar este tipo de síntesis, ilustrada por los dos esquemas expuestos a continuación y por el Ejemplo 3), al resto de los compuestos englobados por la fórmula (I). Esquema I: Síntesis del compuesto de fórmula Ia: (N-aminocarbamoilmetil-N- (2'-(2"ρiridil)etil)-l,4-bis[2'-(4"-fluoro-fenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5- carboxamida).
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Esquema II: Síntesis del compuesto de fórmula Ib: (l,4-bis[2'-(4"-fluorofenfl)etil]-2- [N-aminocarbonilmetil-N-(2'-(2"-piridil) etil)-carbonilmetil] piperazina-3,6-diona).
1.
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Otro aspecto adicional de la invención lo constituye una composición farmacéutica, en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende al menos un compuesto de fórmula (I), o una sal, profármaco, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en cantidad terapéuticamente efectiva, junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración a un paciente.
Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto de formula (I) es el siguiente: N- aminocarbamoilmetil-N-(2'-(2"piridil)etil)-l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-3,7-dioxo- [l,4]diazepan-5-carboxamida (Ia) o cualquiera de sus formas enantioméricas R, S y/o mezclas racémicas.
Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto de formula (I) es el siguiente: 1,4- bis[2'-(4"-fluorofenfl)etil]-2-[N-aminocarbonilmetil-N-(2'-(2"piridil)etil)carbonil- metil]piperazina-3,6-diona (Ib), o cualquiera de sus formas enantioméricas R, S y/o mezclas racémicas.
Otra forma particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto (I) se selecciona entre: iV-aminocarbamoilmetil-iV-(2'-(2' '-piridil)etil)-l -[2'-(2",4' '-diclorofenil)etil]-4-[2'-
(4' ' -fluorofenil)etil]-3 ,7-dioxo-[ 1 ,4]diazepan-5-carboxamida; iV-aminocarbamoilmetil-iV-(2'-(4"-metoxifenil)etil)-l-[2'-(2",4"-diclorofenil)etil]-4-
[2'-(4"-fluorofenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5-carboxamida; N-aminocarbamoilmetil- N-(2'-(4"-metoxifenil)etil)-l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-
3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5-carboxamida; l-[2'-(2'%4''-diclorofenil)etil]-4-[2'-(4''-fluorofenil)etil]-2-[iV-aminocarbonilmetil-iV-
(2'-(2"piridil)etil) carbonilmetil] piperazina-3,6-diona; l-[2'-(2",4"-diclorofenil)etil]-4-[2'-(4"-fluorofenil)etil]-2-[N-aminocarbonilmetil-N- (2'-(4"-metoxifenil)etil) carbonilmetil] piperazina-3,6-diona;
1 ,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-2-[iV-aminocarbonilmetil-iV-(2'-(4"- metoxifenil)etil)carbonilmetil]piperazina-3,6-diona;
N-aminocarbamoilmetil-N-[2'-(2",4"-diclorofenil)etil]-l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-
3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5-carboxamida; y [1 ,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-2-[N-aminocarbonilmetil-iV-(2'-(2",4' '- diclorofenil)etil)carbonilmetil]piperazina-3,6-diona.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar inhibición de la enzima UBCl 3, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración. En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía oral, tópica, rectal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intravenosa, etc.). Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid, en el "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin u en otros habituales o similares de la Farmacopeas Española y en Estados Unidos.
Generalmente, una cantidad administrada eficaz de un compuesto usado en la invención dependerá de la eficacia relativa del compuesto elegido, la gravedad del trastorno tratado, o la edad, peso o modo de administración. No obstante, normalmente los compuestos activos se administrarán una o más veces al día, por Ejemplo 1, 2, 3, ó 4 veces al día, con una dosis diaria total típica en el intervalo de 0,01 a 100 mg/kg/día.
Los compuestos usados en la presente invención también se pueden administrar con otros fármacos para proporcionar una terapia de combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición, o se pueden suministrar en forma de composición separada para la administración al mismo tiempo o en un momento diferente.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos o esteroisómeros, o sus mezclas, para uso médico.
Otro aspecto adicional de la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos y esteroisómeros, o sus mezclas, en el tratamiento y/o profilaxis de patologías o enfermedades asociadas a alteraciones de las rutas metabólicas en que interviene la enzima UBGl 3. Otro aspecto adicional de la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos ó esteroisómeros farmacéuticamente aceptables del mismo, o sus mezclas, para la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento y/o profilaxis de patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBCl 3.
En una realización particular, las patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBCl 3 son enfermedades inflamatorias y autoinmunes. En una realización preferida, las patologías o enfermedades inflamatorias y autoinmunes pueden ser: enfermedad inflamatoria intestinal, patologías articulares inflamatorias, dermatitis atópicas y otras patologías dermatológicas inflamatorias, neuritis, encefalitis, encefalomielitis y patologías inflamatorias que afectan al sistema nervioso central o periférico, miositis, vasculitis, lupus eritematoso sistémico, enfermedades infecciosas que cursan con inflamación, reacciones de rechazo de huésped contra injerto, conjuntivitis y oculopatías inflamatorias, otitis o mucositis.
En otra realización particular, las patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBC 13 son el cáncer o neoplasia, incluyendo pero no limitándose a cualquier tipo de neoplasia benigna o maligna de cualquier origen tisular, entre ellos, pero no limitados a, cualquier tipo de carcinomas incluyendo los de próstata, mama, pulmón, páncreas, colorrectal, gástrico, esofágico, de laringe, de tiroides, hepático, de vejiga urinaria, renal, uterino, y de cérvix, cualquier tipo de sarcomas incluyendo osteosarcomas, sarcomas de partes blandas y angiosarcomas, cualquier tipo de tumor hematopoyético incluyendo de leucemias y linfomas, cualquier tipo de tumor del sistema nervioso incluyendo neuroblastomas, glioblastomas y astrocitomas, cualquier cáncer dermatológico incluyendo melanoma, carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas.
Otro aspecto adicional de la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos ó esteroisómeros farmacéuticamente aceptables del mismo, o sus mezclas, para la preparación de un medicamento dirigido al tratamiento y/o profilaxis de patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene el factor transcripcional NF-κB. En una realización particular, las patologías o enfermedades son procesos inflamatorios o neoplásicos.
En otro aspecto adicional, la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I), sus sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables del mismo, o sus mezclas, para la elaboración de un medicamento dirigido a la terapia antitumoral, en donde dicho medicamento es un antagonista de, o inhibe, la ruta de tolerancia a daños genotóxicos mediada por PCNA y RAD6 produciendo efectos quimio- o radiosensibilizantes. Otro aspecto adicional de la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I) en la elaboración de un medicamento para aumentar la sensibilidad de un mamífero al tratamiento con un agente antitumoral.
En la presente invención se entiende por "agente antitumoral" aquel compuesto o agente químico, físico o biológico con propiedades antiproliferativas, antioncogénicas y/o carcinostáticas que puede emplearse para inhibir el crecimiento, la proliferación y/o el desarrollo de tumores. Ejemplos de agentes antitumorales que pueden emplearse en la presente invención son (i) agentes alquilantes, tal como, sufonatos de alquilo y derivados de etilenimina; (ii) antimetabolitos, tales como antifolatos y análogos de purina; (iii) productos naturales, tales como antibióticos antitumorales e inhibidores mitóticos; (iv) hormonas y antagonista de las mismas, tales como andrógenos y corticosteroides; (v) agentes biológicos, como vectores virales; y (vi) agentes físicos como radiaciones ionizantes generadas por diferentes tipos de fuente de irradiación
(agentes radioterapéuticos). Una relación de compuestos que pueden emplearse como agentes antitumorales se describe en la solicitud de patente WO2005/112973.
En una realización particular de la invención, el agente antitumoral es doxorrubicina o etopósido.
El compuesto de fórmula (I) tiene que administrarse a un mamífero en una cantidad tal que sea capaz de sensibilizar a dicho mamífero frente al tratamiento con un agente antitumoral. En la presente invención se define "cantidad efectiva sensibilizadora" a aquella cantidad de compuesto de formula (I) que, cuando se administra a un animal, preferiblemente, un mamífero, más preferiblemente un humano, es suficiente para sensibilizar al mamífero frente a un agente antitumoral o frente a cualquier otra terapia/tratamiento antitumoral. La concentración efectiva en el tejido tumoral de los compuestos de fórmula (I) que es necesaria para producir un efecto sensibilizador frente a un agente antitumoral varía desde OO 1 nanomolar hasta 100 micromolar, y la dosis de dichos compuestos que es necesario administrar al sujeto, por cualquier vía, se deberá ajustar para alcanzar dichas concentraciones intratumorales. El término "sensibilizar" a un mamífero incluye: (i) incrementar la eficacia de un agente antitumoral o de una terapia/tratamiento antitumoral en un mamífero que no ha recibido previamente ningún agente antitumoral o tratamiento antitumoral ("sensibilización inicial"), y/o (ii) incrementar la eficacia de un agente antitumoral o de una terapia/tratamiento antitumoral en un mamífero que ya ha recibido un agente antitumoral o tratamiento antitumoral y frente al cual, ha podido previamente presentar o no resistencia. Tratamientos antitumorales que pueden considerarse en la presente invención son, por ejemplo, el tratamiento con un compuesto de platino, tal como carboplatino o cisplatino, opcionalmente en combinación con gemcitabina o un taxano como docetaxel o paclitaxel. Más ejemplos de tratamientos antitumorales se pueden encontrar en la solicitud de patente WO2005/112973. Cánceres que pueden tratarse de forma efectiva mediante el uso de los compuetos de fórmula (I) en la elaboración de un medicamento para aumentar la sensibilidad de un mamífero al tratamiento con un agente antitumoral incluyen cánceres de mamíferos, especialmente, cáncer o neoplasia, incluyendo pero no limitándose a cualquier tipo de neoplasia benigna o maligna de cualquier origen tisular, entre ellos, pero no limitados a, cualquier tipo de carcinomas incluyendo los de próstata, mama, pulmón, páncreas, colorrectal, gástrico, esofágico, de laringe, de tiroides, hepático, de vejiga urinaria, renal, uterino, y de cérvix, cualquier tipo de sarcomas incluyendo osteosarcomas, sarcomas de partes blandas y angiosarcomas, cualquier tipo de tumor hematopoyético incluyendo de leucemias y linfomas, cualquier tipo de tumor del sistema nervioso incluyendo neuroblastomas, glioblastomas y astrocitomas, cualquier cáncer dermatológico incluyendo melanoma, carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas.
Finalmente, otro aspecto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica caracterizada porque comprende los compuestos de fórmula (I), una sal, solvato, profármacos o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en cantidad terapéuticamente efectiva, junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende adicionalmente, en una cantidad terapéuticamente efectiva, al menos, un segundo agente terapéutico el cuál, en otra realización todavía más particularde la invenición, es un compuesto de fórmula (I), una sal, solvato, pro fármaco o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN Ejemplo 1. Cribado experimental para identificar peptoides (iV-alquilglicinas) capaces de interferir con la interacción UBC13-UEV1.
La interacción entre UBCl 3 y UEVl se detecta mediante ensayos de doble híbrido en levadura. Las formas proteicas de UBC13 y UEVl utilizadas en los siguientes ejemplos son de Homo sapiens. La proteína UBC13, también denominada UBE2N (nomenclatura HUGO), presenta los siguientes identificadores: NCBI-GI: 4507793, UniProt: P61088 y [EC:6.3.2.19]. La proteína UEVl, también denominada UBE2V1 (nomenclatura HUGO), presenta los siguientes identificadores: NCBI-GI: 73765546 y UniProt: Q13404. En este ensayo, UBC13 se expresa como una proteína de fusión con el dominio de unión a DNA (DBD-UBC13) de Gal4 desde el plásmido pBD- UBC13, y UEVl se expresa como una proteína de fusión con el dominio de activación transcripcional de Gal4 (AD-UEVl), desde el plásmido pACT2-UEVl). Ambos plásmidos se cotransfectan en la cepa de Saccharomyces cerevisiae AH 109, haciéndose crecer sobre placas de medio YPD sin Leucina ni Triptófano, seleccionando únicamente las colonias que expresan tRNA sintasa para estos dos aminoácidos, es decir, las que contienen los dos plásmidos co-transfectados. La cepa AHl 09 integra en su genoma dos loci artificiales: un locus contiene secuencias de reconocimiento para el DBD de Gal4 unido al promotor GALl delante del gen para la histidil tRNA sintasa; otro locus contiene el DBD de Gal4 ligado al promotor GAL2 ante el gen ADE2 y el tercer locus contiene secuencias de reconocimiento para el DBD de Gal4 unido al promotor MELl delante del gen lacZ para la enzima β-galactosidasa. La expresión en la cepa AHl 09 de factores transcripcionales que contengan, por un lado, un dominio Gal4DBD, y, por otro, un dominio de activación transcripcional, induce la expresión de His tRNA sintasa, permitiendo el crecimiento en medio carente de Histidina, y, al mismo tiempo, induce la expresión de β-galactosidasa, cuya actividad enzimática es detectable colorimétricamente usando substratos adecuados. La expresión e interacción física de DBD-UBCl 3 y AD-UEVl sitúa sobre los promotores de estos dos loci un factor transcripcional capaz de activar el promotor asociado a sitio de unión para Gal4. Por tanto, el crecimiento en medio carente de Histidina de células AH 109 co-transfectadas con los plásmidos pBD-UBC13 y pACT2-UEVl indica la existencia de interacción física entre las proteínas UBCl 3 y UEVl. Además, el grado de esta interacción puede deducirse con bastante aproximación mediante determinaciones colorimétricas de actividad β-galactosidasa, usando como sustrato la O-nitrofenil-p-galactopiranósido (ONPG), siendo los niveles de esta actividad enzimática directamente proporcionales a la intensidad de la interacción entre UBC 13 y UEVl.
La síntesis de mezclas combinatorias y compuestos individuales basados en trialquilglicinas (peptoides) se llevó a cabo del siguiente modo: se procedió a sintetizar una quimioteca optimizada de 5120 peptoides en 52 mezclas controladas, mediante el formato de rastreo posicional sobre fase sólida [35]. La quimioteca consiste en 52 mezclas controladas y un total de 5120 compuestos. Las mezclas 1 a 20 (O1XX) contenían como posición definida una de las 20 aminas primarias seleccionadas disponibles comercialmente, mientras que en las posiciones 'X' (posiciones de mezcla) se usó un conjunto de 16 aminas primarias. Las mezclas 21 a 36 (XO2X) y 37 a 52 (XXO3) contenían en la posición definida sólo el conjunto de 16 aminas [36]. De forma resumida, el procedimiento en ocho pasos sintéticos se inició con la liberación del grupo protector Fmoc de la resina de amida Rink (0.7 mEq/g, Rapp Polymere, Tubingen, Alemania). A continuación, se procedió a una etapa de acilación con ácido cloroacético y diisopropilcarbodiimida, seguida de la correspondiente aminación del intermediario clorometilado con la amina individual o la mezcla de aminas. Posteriormente, los productos se escindieron de la resina con una mezcla de ácido trifluoroacético/diclorometano/agua, se evaporaron los disolventes, y los residuos se liofilizaron y se redisolvieron en dimetil sulfóxido al 10% a una concentración de 5 mg/mL. La preparación de peptoides individuales se llevó a cabo mediante síntesis independientes en fase sólida, aplicando la secuencia sintética descrita arriba. La pureza y la identidad de las JV-alquilglicinas individuales se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución, espectrometría de masas y RMN de 1H y 13C. La estructura general (II) representada en la memoria descriptiva muestra la estructura química general de las N-alquilglicinas (peptoides) que componen la quimioteca combinatoria utilizada en esta invención.
A continuación se describe el procedimiento utilizado para el cribado de peptoides capaces de inhibir la interacción entre UBCl 3 y UEVl en ensayos de doble híbrido en levaduras. Los ADN complementarios correspondientes a UBCl 3 y UEVl se generaron mediante retrotranscripción y PCR a partir de la línea celular HepG2. UBCl 3 fue subclonado en el vector pBD (Stratagene, La Jolla, California, EE. UU.), en pauta con el dominio de unión a ADN de Gal4, dando lugar al plásmido pBD-UBC13. UEVl se subclonó en el vector pACT2 (Clontech), en pauta con el dominio de transactivación de Gal4, generándose el plásmido pACT2-UEVl. Los plásmidos pBD-UBC13 y pACT2-UEVl se co-transfectaron en la cepa AHl 09 de Saccharomyces cerevisiae. Para ello, células competentes de levadura recién preparadas se mezclaron con el ADN de los plásmidos junto con ADN de testículo de arenque como portadora, en una solución de polietilenglicol-acetato de litio (PEG al 40%, acetato de litio 100 mM, Tris 10 mM, EDTA ImM), incubándose durante 30 min a 30 0C con agitación. A continuación se añadió dimetil sulfóxido al 7%, y se sometieron las células a choque térmico en un baño de agua a 42°C durante 30 segundos, seguido inmediatamente de enfriamiento sobre hielo. Las células se centrifugaron a 1000 g y se resuspendieron en tampón TE (Tris- ClH 10 mM, pH 7.5 mM, EDTA 1 mM) y se sembraron en placas de medio mínimo para permitir la selección de células con expresión de los marcadores HIS3, ADE2 y LacZ. Tras 3 días de crecimiento, se seleccionaron colonias positivas para crecimiento (y por tanto, positivas para la interacción UBC13-UEV1), y se hicieron crecer en 5 mL de medio mínimo durante una noche a 300C, con agitación. A continuación, se cambió a medio de crecimiento nuevo conteniendo una de las 52 mezclas de peptoides, a una concentración de 0'I mM de mezcla, incubándose durante una noche a 300C. Se determinó la absorbancia (densidad óptica, o D.O.) de los cultivos a 695 mn, y se prepararon nuevos cultivos con una D.O.69S inicial de 0'2 en medio YPD con la misma mezcla de peptoides a 0'I mM en agitación a 30 0C, permitiéndose el crecimiento durante 3-4 h hasta alcanzar D.0.695 de 0'8. En ese momento los cultivos se centrifugaron, los botones celulares se resuspendieron en tampón Z (Na2HPO4 16 g/L, NaH2PO4 5'50 g/L, KCl 0'75 g/L, MgSO4 0'246 g/L a pH 7'O) y se fragmentaron mediante ciclos de congelado-descongelado en nitrógeno líquido (1 minuto) - 37 0C (1 minuto). Seguidamente se añadió 160 μL del sustrato de β-galactosidasa, O-nitrofenil- galactopiranósido (ONPG, a 4 mg/mL en tampón Z), incubándose a 30 0C hasta la formación de sustrato visible (color amarillo). La reacción se detuvo mediante adición de 0.4 mL de Na2CO3 1 M, incubándose durante 30 min, seguido de centrifugado. Los sobrenadantes se transfirieron a cubetas para su lectura espectrofotométrica a 420 nm. Se define aquí 1 unidad de actividad β-galactosidasa como la cantidad capaz de hidrolizar 1 μmol de ONPG a O-nitrofenol y D-galactosa por minuto por célula (Miller, 1972; Miller, 1992). Este ensayo colorimétrico proporciona una medida semicuantitativa de la intensidad de la interacción entre 2 proteínas en el procedimiento de doble híbrido en levaduras. Cada una de las 52 mezclas de peptoides se analizó mediante este procedimiento por triplicado, en tres experimentos independientes. Como controles positivos de interacción en todos estos ensayos se utilizó la interacción entre UBCl 3 y UEVl en ausencia de peptoides, y la interacción entre p53 y la proteína T grande de SV40. Como control negativo se utilizaron las proteínas laminina y p53. Las actividades β- galactosidasa para la interacción UBC13-UEV1 se normalizaron con respecto a las actividades β-galactosidasa de su correspondiente control positivo (p53-T grande). Las actividades β-galactosidasa normalizadas de ese modo se ilustran en la Figura 2. Este gráfico muestra que, de forma repetitiva, la mayor inhibición de la interacción UBC 13- UEVl se produjo con las mezclas números 12, 16, 37, 42 y 46. Se confirmó la capacidad inhibitoria de estas mezclas sobre la interacción UBC13-UEV1 mediante nuevos ensayos colorimétricos por triplicado, utilizando únicamente estas 5 mezclas, confirmándose que la mayor actividad inhibidora se encontraba en las mezclas números 12, 42 y 46. La naturaleza modular y combinatoria de la quimioteca [35, 36] permite deducir la diversidad preferente [es decir, las aminas primarias en las posiciones R1, R2 y R3 del oligómero de estructura (II)], de los peptoides responsables de esta actividad inhibidora. En este caso, los peptoides que inhiben la interacción UBC13-UEV1 deben corresponder a uno, o más, de los peptoides denominados N37-37-9C, N37-37-13C, Nl 5-37-9C y Nl 5-37-13C, cuyas estructuras químicas se representan a continuación:
Figure imgf000034_0001
N37-37-9C N37-37-13C
Figure imgf000034_0002
N15-37-9C N15-37-13C
En la posición R1 las aminas seleccionadas son 4'-fluorofeniletil (peptoides N37-37-9C) o 2'-4'-diclorofeniletil (peptoides N15-37-13C); en la posición R2 la amina es 4'-fluorofeniletil en todos los casos, y en la posición R3 se seleccionan las aminas 4'- metoxifenietil (peptoides N37-37-9C y N15-37-13C) y 2-(2'-piridil)etil (peptoides N37- 37-9C y Nl 5-37-9C). Por tanto, la nomenclatura IUPAC de los cuatro peptoides seleccionados es:
N37-37-9C: [iV-(2-(4'-fluorofenil)etil)glicil]-[iV-(2-(4'-fluorofenil)etil)glicil]-[iV-(2-(2'- ρiridin)etil] glicinamida N37-37-13C: [iV-(2-(4'-fluorofenil)etil)glicil]-[iV-(2-(4'fluorofenil)etil)glicil]-[iV-(2-(4'- metoxifeniletil] glicinamida
N15-37-9C: [ΛT-(2-(2',4'-diclorofenil)etil)glicil]-[iV-(2-(4'-fluorofeml)etil)glicil]-[7V-(2- (2 ' -piridin)etil] glicinamida N15-37-13C: [iV-(2-(2',4'-diclorofenil)etil)glicil]-[iV-(2-(4'-fluorofenil)etil)glicil]-[iV- (2-(4'-metoxifeniletil]glicinainida
Ejemplo 2. Optimización computacional de encaje molecular (docking) sobre UBC 13 de variantes conformacionales de compuesto cíclicos derivados de los peptoides seleccionados en el Ejemplo 1.
Se estimó que los peptoides que interfieren con la interacción UBC13-UEV1 en ensayos de doble híbrido en levaduras lo hacen mediante la unión competitiva sobre la superficie de UBC13 que interactúa con la primera hélice alifática de UEVl, desplazando por tanto esta última proteína de la interacción heterodimérica con UBC 13. La superficie de UBCl 3 que interacciona con UEVl es un surco hidrofóbico en forma de estrella de 3 puntas con centro en una bolsa hidrofóbica donde encaja la Fenilalanina 8 de UEVl, con interacciones hidrofóbicas con las cadenas laterales de los residuos E55, L56, Y57 y R70 de UBC13 [26, 27]. Para estudiar esta hipótesis, y como paso previo a la generación de compuestos medicinables con esta actividad, se llevó a cabo estudios de encaje molecular virtual (docking) sobre la superficie de interés en UBC 13 de los peptoides activos, así como, posteriormente, de compuestos cíclicos derivados de los mismos. Estos últimos compuestos corresponden a una optimización química para buscar las conformaciones más estables de entre las JV-alquilglicinas identificadas. A partir de esta información, se diseñó una familia de ocho estructuras de análogos conformacionalmente restringidos de las N-alquilglicinas seleccionadas en el Ejemplo 1. Cada peptoide seleccionado se configuró virtualmente para presentar las estructuras correspondientes a las ocho estructuras cíclicas, y todas las formas se sometieron a un estudio de docking molecular con el modelo de la proteína UBCl 3. Estos análisis se realizaron sobre la estructura atómica del complejo heterodimérico UBC13-UEV1 (número de acceso IJAT del Brookhaven Protein Data Bank). Inicialmente, una inspección visual y cálculos básicos de accesibilidad sugirieron que la interacción que se produce entre los residuos descritos de la interficie del complejo debería servir como guía para el desarrollo de pequeños compuestos capaces de prevenir efectivamente la formación de este complejo binario.
Preparación de la proteína UBC13 (receptor). La estructura inicial de la pro teína corresponde a la entrada IJAT de la base de datos del PDB [26]. De la estructura heterodimérica presente en el complejo se separó la cadena A correspondiente a la proteína UBC13, sobre la que se llevaron a cabo los cálculos. La posición de los átomos de hidrógeno se obtuvo con la utilidad protonate del paquete de AMBER [38]. Seguidamente se asignaron cargas y radios atómicos a todos los átomos de la proteína consistentes con el campo de fuerzas de AMBER en su versión parm99. A continuación se definió el centro activo de la proteína. Para ello, y tras una primera inspección visual, se identificaron los residuos E55, L56, Y57 y R70 de la proteína UBC 13 situados en la interfaz de separación entre las dos proteínas que constituyen el dímero. Estos residuos conforman un bolsillo en el que se introduce principalmente el residuo F8 de la proteína UEVl. Preparación de los compuestos cíclicos derivados de los tripeptoides seleccionados en el Ejemplo 1 (ligandos). La estructura tridimensional inicial de estos compuestos (8 diferentes familias estructurales de configuración cíclica para cada uno de los tripeptoides del Ejemplo 1) se obtuvo a partir de sus estructuras 2D mediante el programa CORINA [39] y un programa propio (ALFA). A partir de este análisis se seleccionaron conformaciones representativas de la flexibilidad conformacional de ambos compuestos. A continuación, se asignaron cargas y radios a cada uno de los átomos. Para los radios se usó el campo de fuerzas de AMBER en su versión parm99, mientras que las cargas se calcularon por ajuste del potencial electrostático (ESP) [40] calculado con el hamiltoniano semiempírico MNDO [41] implementado en el paquete MOPAC [42].
Precálculo de las energías de interacción. A partir de los residuos seleccionados anteriormente en la proteína, se definió una región del espacio, o caja, en la que acomodar los ligandos. Se midió entonces la energía de interacción de diversas sondas químicas, correspondientes a átomos presentes en los ligandos, en un grid regular de 0'5 Á construido dentro de la caja predefinida. La función de energía empleada es una adaptación de la función de mecánica molecular empleada en el programa AMBER, y se encuentra descrita en detalle en [43].
Encaje de los ligandos en el sitio de unión del receptor. Las posiciones más probables de los ligandos dentro del centro activo se obtuvieron mediante la generación "exhaustiva" de todas las posibles orientaciones de cada ligando en cada uno de los puntos de la grid que forman el centro activo, usando un espacio traslacional de 0.5 ? y un espaciado rotacional de 30 grados; las orientaciones se ordenaron en función de su mejor energía de interacción, medida en el grid precalculado anteriormente, seleccionándose una lista de 20 orientaciones por ligando analizado. Estos cálculos se realizaron con un programa propio, CDOCK [43].
Selección final de los ligandos. Para esta lista de ligandos se llevaron a cabo correcciones a la energía de interacción previamente calculadas, con objeto de obtener una discriminación más fina entre las moléculas. Para ello se incorporó la contribución de solvatación. Así, la energía de unión ligando-centro activo viene determinada por la siguiente ecuación:
ΔGU, = Evdw + AGC0U¡ + ΔGL* + ΔGJL, + b,Gno_polar + AGC0NF
Las interacciones de Van der Waals (primer término del segundo miembro) proceden del programa CDOCK descrito anteriormente. El efecto del disolvente se obtuvo mediante la solución numérica de la ecuación de Poisson a través del método de las diferencias finitas, como el implementado en el programa DelPhi, para la componente electrostática (componentes 2, 3 y 4 del segundo miembro de la ecuación), y mediante un término proporcional a la superficie accesible para la componente no electrostática (componente 5 del segundo miembro), utilizando una constante de proporcionalidad de OO0545. Para todos los cálculos electrostáticos se utilizaron grids cúbicos de 0'5 Á de espaciado, y donde las dimensiones de la grid son tales que al menos hay 11 Á de separación entre cualquier átomo y los bordes de la caja. El interior de las moléculas, soluto, se caracterizó con una constante dieléctrica de 4, mientras que para el exterior se usó una de 80. El resto de los parámetros empleados fueron los parámetros por defecto del programa.
Las mejores moléculas encontradas y sus energías de interacción, particionadas en contribuciones, se encuentran en las Tablas 1 a 6. Ejemplos de los modos de unión obtenidos para los compuestos N37-37-9C, familia C (compuesto Ia) y N37-37-9C, familia D (compuesto Ib) con mayor afinidad teórica se encuentran en las Figuras 3 y 4. TABLA 1. Cálculos de energías para el compuesto N37-37-9C, familia C. Se muestran los resultados para las 20 mejores conformaciones de cada uno de los dos enantiómeros.
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TABLA 2. Cálculos de energías para el compuesto N37-37-9C, familia D. Se muestran los resultados para las 20 mejores conformaciones de cada uno de los dos enantiómeros.
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TABLA 3. Cálculos de energías para el compuesto N37-37-13C, familia C. Se muestran los resultados para las 20 mejores conformaciones de los dos enantiómeros.
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TABLA 4. Cálculos de energías para el compuesto N37-37-13C, familia D. Se muestran los resultados para las 20 mejores conformaciones de cada uno de los dos enantiómeros.
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TABLA 5. Cálculos de energías para el compuesto N15-37-9C, familia C. Se muestran los resultados para las 20 mejores conformaciones para cada uno de los dos enantiómeros.
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TABLA 6. Cálculos de energías para el compuesto N15-37-9C, familia D. Se muestran los resultados para las 20 mejores conformaciones para cada uno de los dos enantiómeros.
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Ejemplo 3. Síntesis de los compuestos cíclicos con mejor encaje teórico (docking) sobre la superficie de UBC13 que interacciona con UEVl. Compuestos Ia y Ib. 3.1.- Compuesto Ia (Varubin): Λ/-aminocarbamoilmetil-iV-(2'-(2"piridil)etil)-l,4- bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5-carboxamida
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La síntesis del compuesto Ia se ilustra en esta solicitud de patente. La resina de amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trató con 3 mL de piperidina al 20% en dimetilformamida y la mezcla se agitó en un reactor de microondas durante 2 min a 60 0C. La resina se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trató con una solución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y A^/V-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añadió a la resina una disolución de iV-[2-2'-(piridin-2-il)etilamina (180 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se eliminó el sobrenadante, y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trató con una solución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil) acrílico (obtenido con un rendimiento del 85% a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por microondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y N^-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min por duplicado. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Posteriormente, se añadió a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se repitió durante 16 h a la misma temperatura. Se eliminó el sobrenadante, y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trató con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y AζN'-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añadió a la resina una solución de 2-(4'- fluorofenil)etilamma (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se descartó el sobrenadante, y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trató con tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (35 mg, 0.1 eq.) y fenilsilano (370 μL, 10 eq.) en diclorometano anhidro durante 15 min a temperatura ambiente y bajo una atmósfera de argón. Este procedimiento se repitió tres veces. Se descartó el sobrenadante y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La ciclación se llevó a cabo mediante tratamiento con hexafiuorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris- pirrolidino-fosfonio (235 mg, 1.5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (61 mg, 1.5 eq.) y N,N- diisopropiletilamina (154 μL, 3 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) liberó una mezcla de reacción que contenía el compuesto Ia. Esta mezcla se filtró y los disolventes se eliminaron mediante evaporación bajo presión reducida seguida de liofilización. El residuo se purificó mediante RP-HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetronitrilo-agua (acetonitrilo 20% ? acetonitrilo 80%, 30 min), proporcionando 52 mg del producto deseado (rendimiento 30%, = 98% pureza). HRMS-FAB: C31H33F2N5O4 caled [M+H+] 578.257886; observado 578.257844. 3.2.- Compuesto Ib: [l,4-bis[2'-(4"-fluorofenfl)etü]-2-[iV-aminocarbonilinetü-Λr- (2'-(2"piridil)etil)carbonilmetil]piperazina-3,6-diona
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La síntesis del compuesto Ib se muestra en el esquema II. Todas las reacciones en fase sólida se llevaron a cabo por duplicado. La resina amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trató con 3 mL de piperidina al 20% en dimetilformamida, agitándose la mezcla en un reactor de micróondas durante 2 min a 600C. La resina se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dicloromethano (3 x 3 mL). Se trató la resina con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y ΛyV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min a 60 0C en un reactor de micróondas. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Seguidamente, se añadió a la resina una disolución de 2- (4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.), y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 2 min a 90 0C con activación por micróondas. Se eliminó el sobrenadante, y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trató con una disolución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil)acrílico (preparado con un rendimiento del 85% de rendimiento a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por micróondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y N^V-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2: 1, 3 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se filtró y la resina se lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). A continuación, se añadió a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etüamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se agitó durante 16 h a la misma temperatura. Se eliminó el sobrenadante, el residuo se filtró y se lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). Finalmente, la resina se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla de hidrólisis se filtró, los filtrados se agruparon y los disolventes se eliminaron mediante evaporación a baja presión. La posterior ciclación se consiguió mediante tratamiento del anterior residuo con 4 mL de dioxano durante 30 min en condiciones de reflujo (controlado por HPLC). A continuación, se añadió una solución de hidróxido sódico 4 N y alcohol alílico (1:2, 1.5 mL), agitándose la mezcla durante 30 min con reflujo (controlado por HPLC). La mezcla de reacción se acidificó con ácido clorhídrico I N y se evaporó el disolvente. El residuo resultante se extrajo con 2 x 10 mL de acetat de etilo, secándose sobre sulfato magnésico anhidro y concentrado al vacío. El disolvente se eliminó por concentración al vacío, produciéndose el intermediario dicetopiperacina (90 mg, 72%) en forma de un sólido incoloro. Este material se utilizó en el siguiente paso sin ulterior purificación.
La resina que contiene el fragmento iV-alquilglicina fue sintetizada siguiendo un procedimiento similar al descrito arriba. De forma resumida, este fragmento se obtuvo mediante tratamiento de la resina (290 mg, 0.22 mmol) con piperidina al 20% en dimetilformamida, seguido de acilación con ácido bromoacético (153 mg, 5 eq.) y JV5JV- diisopropilcarbodiimida (175 μL, 5 eq.), y acoplamiento de la amina con JV-[2-2'- (piridin-2-il)etilamina (135 μL, 5 eq.) en presencia de trietilamina (155 μL, 5 eq.). A continuación, el intermediario dicetopiperazínico (90.0 mg, 1 eq.) se acopló a la resina en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (45 mg, 1.5 eq.) y ΛζN'-diisopropilcarbodiimida (55 μL, 1.5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La resina seca se lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de 60:40:2 ácido trifluoroacético / diclorometano / agua produjo una mezcla de reacción que contenía el compuesto Ib. Este se filtró y los disolvents se eliminaron mediante evaporación a baja presión, seguido de liofilización. El residuo obtenido se purificó mediante RP-HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetonitrilo-agua (acetonitrilo al 30% ? acetonitrilo al 45%, 30 min) para proporcionar 57 mg del producto deseado (rendimiento 33 %, = 98% pureza).
HRMS-FAB: C31H33F2N5O4 caled [M+H+] 578.2501; observado 578.2573.
Ejemplo 3.3. Compuesto iV-ammocarbamoilmetil-iV-(2'-(2"-piridil)etil)-l-[2'-
(2",4"-diclorofenü)etíl]-4-[2'-(4"-fluorofenU)etU]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5- carboxamida.
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La resina de amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trata con 3 mL de piperidina al
20% en dimetilformamida y la mezcla se agita en un reactor de microondas durante 2 min a 60 0C. La resina se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trata con una solución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y TV^V-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añade a la resina una disolución de N-[2-2'-(piridin-2-il)etilamina (180 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se elimina el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trata con una solución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil) acrílico (obtenido con un rendimiento del 85% a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por microondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y N/Z'-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 30 min por duplicado. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Posteriormente, se añade a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietüamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se repite durante 16 h a la misma temperatura. Se elimina el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trata con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y ΛyV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añade a la resina una solución de 2-(2',4'- diclorofenil)etilamina (240 μL, 5 eq.) y trietüamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se descarta el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trata con tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (35 mg, 0.1 eq.) y fenilsilano (370 μL, 10 eq.) en diclorometano anhidro durante 15 min a temperatura ambiente y bajo una atmósfera de argón. Este procedimiento se repite tres veces. Se descarta el sobrenadante y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La ciclación se lleva a cabo mediante tratamiento con hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris- pirrolidino-fosfonio (235 mg, 1.5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (61 mg, 1.5 eq.) y N,N- diisopropiletilamina (154 μL, 3 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 3 h. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) libera una mezcla de reacción que contiene el compuesto deseado. Esta mezcla se filtra y los disolventes se elimina mediante evaporación bajo presión reducida seguida de liofilización. El residuo se purifica mediante RP-HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetronitrilo-agua. Ejemplo 3.4. Compuesto Ar-aminocarbamoilmetil-Λ'-(2'-(4"-metoxifenil)etil)-l-[2'- (2",4"-diclorofenü)etü]-4-[2'-(4"-fluorofenil)etü]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5- carboxamida.
Figure imgf000050_0001
La resina de amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trata con 3 mL de piperidina al
20% en dimetilformamida y la mezcla se agita en un reactor de microondas durante 2 min a 60 0C. La resina se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trata con una solución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y A^V-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añade a la resina una disolución de 2-(4'-metoxifenil)etilamina (235 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL,,5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se elimina el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trata con una solución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil) acrílico (obtenido con un rendimiento del 85% a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por microondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y iV,ΛP-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 30 min por duplicado. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Posteriormente, se añade a la resina una disolución de iV-2-(4'- fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se repite durante 16 h a la misma temperatura. Se elimina el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trata con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y T^/V-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añade a la resina una solución de 2-(2',4'-diclorofenil)etilamina (240 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se descarta el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trata con tetrakis(trifenilfosfma)paladio(0) (35 mg, 0.1 eq.) y fenilsilano (370 μL, 10 eq.) en diclorometano anhidro durante 15 min a temperatura ambiente y bajo una atmósfera de argón. Este procedimiento se repite tres veces. Se descarta el sobrenadante y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La ciclación se lleva a cabo mediante tratamiento con hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris- pirrolidino-fosfonio (235 mg, 1.5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (61 mg, 1.5 eq.) y N,N- diisopropiletilamina (154 μL, 3 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 3 h. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) libera una mezcla de reacción que contiene el compuesto deseado. Esta mezcla se filtra y los disolventes se elimina mediante evaporación bajo presión reducida seguida de liofilización. El residuo se purifica mediante RP-HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetronitrilo-agua.
Ejemplo 3.5. Compuesto TV-aminocarbamoilmetil- iV-(2'-(4"-inetoxifenil)etil)-l,4- bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5-carboxamida.
Figure imgf000052_0001
La resina de amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trata con 3 mL de piperidina al 20% en dimetilformamida y la mezcla se agita en un reactor de microondas durante 2 min a 60 0C. La resina se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trata con una solución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y TV^/V-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añade a la resina una disolución de 2-(4'-metoxifenil)etüamina (235 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se elimina el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trata con una solución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil) acrílico (obtenido con un rendimiento del 85% a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por microondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y A^V-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 30 min por duplicado. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Posteriormente, se añade a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se repite durante 16 h a la misma temperatura. Se elimina el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trata con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y NJP -diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añade a la resina una solución de 2-(4'- fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se descarta el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trata con tetrakis(tiifenilfosfina)paladio(0) (35 mg, 0.1 eq.) y fenilsilano (370 μL, 10 eq.) en diclorometano anhidro durante 15 min a temperatura ambiente y bajo una atmósfera de argón. Este procedimiento se repite tres veces. Se descarta el sobrenadante y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La ciclación se lleva a cabo mediante tratamiento con hexafíuorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris- pirrolidino-fosfonio (235 mg, 1.5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (61 mg, 1.5 eq.) y N,N- diisopropiletilamina (154 μL, 3 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 3 h. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) libera una mezcla de reacción que contiene el compuesto deseado. Esta mezcla se filtra y los disolventes se elimina mediante evaporación bajo presión reducida seguida de liofilización. El residuo se purifica mediante RP-HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetronitrilo-agua.
Ejemplo 3.6. Compuesto l-[2'-(2",4"-diclorofenU)etil]-4-[2'-(4"-fluorofenü)etU]-2- [N-aminocarbonilmetü-iV-(2'-(2"piridil)etil) carbonilmetil] piperazina-3,6-diona.
Figure imgf000054_0001
Todas las reacciones en fase sólida se llevan a cabo por duplicado. La resina amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trata con 3 mL de piperidina al 20% en dimetüformamida, agitándose la mezcla en un reactor de microondas durante 2 min a 60 0C. La resina se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dicloromethano (3 x 3 mL). Se trata la resina con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y ΛζiV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Seguidamente, se añade a la resina una disolución de 2-(2',4'-diclorofenil)etilamina (240 μL, 5 eq.), y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se elimina el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trata con una disolución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil)acrílico (preparado con un rendimiento del 85% de rendimiento a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por microondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y ΛyV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 30 min. Se filtra y la resina se lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). A continuación, se añade a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se agita durante 16 h a la misma temperatura. Se elimina el sobrenadante, el residuo se filtra y se lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). Finalmente, la resina se trata con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla de hidrólisis se filtra, los filtrados se agrupan y los disolventes se eliminan mediante evaporación a baja presión. La posterior ciclación se consigue mediante tratamiento del anterior residuo con 4 mL de dioxano durante 30 min en condiciones de reflujo (controlado por HPLC). A continuación, se añade una solución de hidróxido sódico 4 N y alcohol alílico (1:2, 1.5 mL), agitándose la mezcla durante 30 min con reflujo (controlado por HPLC). La mezcla de reacción se acidifica con ácido clorhídrico I N y se evapora el disolvente. El residuo resultante se extrae con 2 x 10 mL de acetato de etilo, secándose sobre sulfato magnésico anhidro y concentrado al vacío. El disolvente se elimina por concentración al vacío, produciéndose el intermediario dicetopiperacina. Este material se utiliza en el siguiente paso sin posterior purificación.
La resina que contiene el fragmento N-alquilglicina se sintetiza siguiendo un procedimiento similar al descrito arriba. De forma resumida, este fragmento se obtiene mediante tratamiento de la resina con piperidina al 20% en dimetilformamida, seguido de acilación con ácido bromoacético (5 eq.) y ΛζJV-diisopropilcarbodiimida (5 eq.), y acoplamiento de la amina con iV-[2-2'-(piridin-2-il)etilamina (5 eq.) en presencia de trietilamina (5 eq.). A continuación, el intermediario dicetopiperazínico (1 eq.) se acopla a la resina en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (1.5 eq.) y NJST- diisopropilcarbodiimida (1.5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 h. La resina seca se lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de 60:40:2 ácido trifluoroacético / diclorometano / agua produce una mezcla de reacción que contiene el compuesto deseado. Este se filtra y los disolventes se eliminan mediante evaporación a baja presión, seguido de liofilización. El residuo obtenido se purifica mediante RP- HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetonitrilo-agua. Ejemplo 3.7. Compuesto l-[2'-(2",4"-diclorofenU)etü]-4-[2'-(4"-fluorofenü)etíl]-2- [iV-aminocarbonümetil-iV-(2'-(4"-metoxifenil)etU) carbonilmetil] piperazina-3,6- diona.
Figure imgf000056_0001
Todas las reacciones en fase sólida se llevan a cabo por duplicado. La resina amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trata con 3 mL de piperidina al 20% en dimetilformamida, agitándose la mezcla en un reactor de microondas durante 2 min a 60 0C. La resina se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dicloromethano (3 x 3 mL). Se trata la resina con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y ΛζiV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Seguidamente, se añade a la resina una disolución de 2-(2',4'-diclorofenil)etilamina (240 μL, 5 eq.), y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se elimina el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trata con una disolución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil)acrílico (preparado con un rendimiento del 85% de rendimiento a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por microondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y Λ^/V-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 30 min. Se filtra y la resina se lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). A continuación, se añade a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se agita durante 16 h a la misma temperatura. Se elimina el sobrenadante, el residuo se filtra y se lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). Finalmente, la resina se trata con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla de hidrólisis se filtra, los filtrados se agrupan y los disolventes se eliminan mediante evaporación a baja presión. La posterior ciclación se consigue mediante tratamiento del anterior residuo con 4 mL de dioxano durante 30 min en condiciones de reflujo (controlado por HPLC). A continuación, se añade una solución de hidróxido sódico 4 N y alcohol alílico (1:2, 1.5 mL), agitándose la mezcla durante 30 min con reflujo (controlado por HPLC). La mezcla de reacción se acidifica con ácido clorhídrico I N y se evapora el disolvente. El residuo resultante se extrae con 2 x 10 mL de acetato de etilo, secándose sobre sulfato magnésico anhidro y concentrado al vacío. El disolvente se elimina por concentración al vacío, produciéndose el intermediario dicetopiperacina. Este material se utiliza en el siguiente paso sin posterior purificación.
La resina que contiene el fragmento iv-alquilgricina se sintetiza siguiendo un procedimiento similar al descrito arriba. De forma resumida, este fragmento se obtiene mediante tratamiento de la resina con piperidina al 20% en dimetilformamida, seguido de acilación con ácido bromoacético (5 eq.) y iV^ΛP-diisopropilcarbodiimida (5 eq.), y acoplamiento de la amina con 2-(4'-metoxifenil)etilamina (5 eq.) en presencia de trietilamina (5 eq.). A continuación, el intermediario dicetopiperazínico (1 eq.) se acopla a la resina en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (1.5 eq.) y NJf- diisopropilcarbodiimida (1.5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 h. La resina seca se lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de 60:40:2 ácido trifluoroacético / diclorometano / agua produce una mezcla de reacción que contiene el compuesto deseado. Este se filtra y los disolventes se eliminan mediante evaporación a baja presión, seguido de liofilización. El residuo obtenido se purifica mediante RP- HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetonitrilo-agua. Ejemplo 3.8. Compuesto l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-2-[iV-am¡iiocarbonilmetü- iV-(2'-(4"-metoxifenü)etil)carbonilmetil]piperazma-3,6-diona.
Figure imgf000058_0001
Todas las reacciones en fase sólida se llevan a cabo por duplicado. La resina amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trata con 3 mL de piperidina al 20% en dimetilformamida, agitándose la mezcla en un reactor de microondas durante 2 min a 60 0C. La resina se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dicloromethano (3 x 3 mL). Se trata la resina con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y iV^V-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtra y lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Seguidamente, se añade a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.), y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se elimina el sobrenadante, y el residuo se filtra y lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trata con una disolución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil)acrílico (preparado con un rendimiento del 85% de rendimiento a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por microondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y iV^iV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 30 min. Se filtra y la resina se lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). A continuación, se añade a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agita durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se agita durante 16 h a la misma temperatura. Se elimina el sobrenadante, el residuo se filtra y se lava con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). Finalmente, la resina se trata con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla de hidrólisis se filtra, los filtrados se agrupan y los disolventes se eliminan mediante evaporación a baja presión. La posterior ciclación se consigue mediante tratamiento del anterior residuo con 4 mL de dioxano durante 30 min en condiciones de reflujo (controlado por HPLC). A continuación, se añade una solución de hidróxido sódico 4 N y alcohol alílico (1:2, 1.5 mL), agitándose la mezcla durante 30 min con reflujo (controlado por HPLC). La mezcla de reacción se acidifica con ácido clorhídrico I N y se evapora el disolvente. El residuo resultante se extrae con 2 x 10 mL de acetato de etilo, secándose sobre sulfato magnésico anhidro y concentrado al vacío. El disolvente se elimina por concentración al vacío, produciéndose el intermediario dicetopiperacina. Este material se utiliza en el siguiente paso sin posterior purificación.
La resina que contiene el fragmento JV-alquilglicina se sintetiza siguiendo un procedimiento similar al descrito arriba. De forma resumida, este fragmento se obtiene mediante tratamiento de la resina (290 mg, 0.22 mmol) con piperidina al 20% en dimetilformamida, seguido de acilación con ácido bromoacético (153 mg, 5 eq.) yNJf- diisopropilcarbodiimida (175 μL, 5 eq.), y acoplamiento de la amina con 2-(4'- metoxifenil)etüamina (235 μL, 5 eq.) en presencia de trietilamina (155 μL, 5 eq.). A continuación, el intermediario dicetopiperazínico (90.0 mg, 1 eq.) se acopla a la resina en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (45 mg, 1.5 eq.) y λζiV-diisopropilcarbodiimida (55 μL, 1.5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 h. La resina seca se lava con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de 60:40:2 ácido trifluoroacético / diclorometano / agua produce una mezcla de reacción que contiene el compuesto deseado. Este se filtra y los disolventes se eliminan mediante evaporación a baja presión, seguido de liofilización. El residuo obtenido se purifica mediante RP- HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetonitrilo-agua. Ejemplo 3.9. Compuesto iV-aminocarbamoilmetil-iV-[2'-(2",4"-diclorofenU)etil]- l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-5-carboxamida.
Figure imgf000060_0001
La resina de amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trató con 3 mL de piperidina al
20% en dimetilformamida y la mezcla se agitó en un reactor de microondas durante 2 min a 60 0C. La resina se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trató con una solución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y ΛyV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añadió a la resina una disolución de 2-(2',4'-diclorofenil)etilamina (240 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se eliminó el sobrenadante, y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trató con una solución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil) acrílico (obtenido con un rendimiento del 85% a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por microondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y ΛζiV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min por duplicado. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Posteriormente, se añadió a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se repitió durante 16 h a la misma temperatura. Se eliminó el sobrenadante, y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trató con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y NJV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Se añadió a la resina una solución de 2-(4'- fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se descartó el sobrenadante, y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). A continuación, la resina se trató con tetrakis(trifenilfosfma)paladio(0) (35 mg, 0.1 eq.) y fenilsilano (370 μL, 10 eq.) en diclorometano anhidro durante 15 min a temperatura ambiente y bajo una atmósfera de argón. Este procedimiento se repitió tres veces. Se descartó el sobrenadante y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La ciclación se llevó a cabo mediante tratamiento con hexafiuorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tris- pirrolidino-fosfonio (235 mg, 1.5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (61 mg, 1.5 eq.) y N,N- diisopropiletilamina (154 μL, 3 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) liberó una mezcla de reacción que contenía el compuesto deseado. Esta mezcla se filtró y los disolventes se eliminaron mediante evaporación bajo presión reducida seguida de liofilización. El residuo se purificó mediante RP- HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetronitrilo-agua (acetonitrilo 20% ? acetonitrilo 50%, 30 min) proporcionando 77.3 mg del producto deseado (rendimiento 38%, = 98% pureza). ESI-MS: C32H32Cl2F2N4O4 caled. [M+H+] 645.2; found: [M+H+] 645.2. Ejemplo 3.10. Compuesto [l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-2-[iV- aminocarbonilmetil-iV-(2'-(2'',4''-diclorofenil)etil)carbonilmetil]piperazina-3,6- diona.
Figure imgf000062_0001
Todas las reacciones en fase sólida se llevaron a cabo por duplicado. La resina amida Rink (400 mg, 0.3 mmol) se trató con 3 mL de piperidina al 20% en dimetilformamida, agitándose la mezcla en un reactor de microondas durante 2 min a 60 0C. La resina se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dicloromethano (3 x 3 mL). Se trató la resina con una disolución de ácido bromoacético (208 mg, 5 eq.) y i\yV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en dimetilformamida (3 mL). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min a 60 0C en un reactor de microondas. La resina se filtró y lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Seguidamente, se añadió a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.), y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 2 min a 90 0C con activación por microondas. Se eliminó el sobrenadante, y el residuo se filtró y lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). La resina se trató con una disolución de ácido (Z)-3-(aliloxicarbonil)acrílico (preparado con un rendimiento del 85% de rendimiento a partir de anhídrido maleico y alcohol alílico en cloroformo durante 50 min a 60 0C con activación por microondas) (234 mg, 5 eq.), 1-hidroxibenzotriazol (203 mg, 5 eq.) y ΛyV-diisopropilcarbodiimida (235 μL, 5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se filtró y la resina se lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). A continuación, se añadió a la resina una disolución de 2-(4'-fluorofenil)etilamina (200 μL, 5 eq.) y trietilamina (210 μL, 5 eq.) en 3 mL de dimetilformamida y la suspensión se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. La reacción se agitó durante 16 h a la misma temperatura. Se eliminó el sobrenadante, el residuo se filtró y se lavó con dimetilformamida (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y diclorometano (3 x 3 mL). Finalmente, la resina se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético / diclorometano /agua (60:40:2) durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla de hidrólisis se filtró, los filtrados se agruparon y los disolventes se eliminaron mediante evaporación a baja presión. La posterior ciclación se consiguió mediante tratamiento del anterior residuo con 4 mL de dioxano durante 30 min en condiciones de reflujo (controlado por HPLC). A continuación, se añadió una solución de hidróxido sódico 4 N y alcohol alílico (1:2, 1.5 mL), agitándose la mezcla durante 30 min con reflujo (controlado por HPLC). La mezcla de reacción se acidificó con ácido clorhídrico I N y se evaporó el disolvente. El residuo resultante se extrajo con 2 x 10 mL de acetat de etilo, secándose sobre sulfato magnésico anhidro y concentrado al vacío. El disolvente se eliminó por concentración al vacío, produciéndose el intermediario dicetopiperacina (90 mg, 72%) en forma de un sólido incoloro. Este material se utilizó en el siguiente paso sin ulterior purificación.
La resina que contiene el fragmento iV-alquilglicina fue sintetizada siguiendo un procedimiento similar al descrito arriba. De forma resumida, este fragmento se obtuvo mediante tratamiento de la resina (290 mg, 0.22 mmol) con piperidina al 20% en dimetilformamida, seguido de acilación con ácido bromoacético (153 mg, 5 eq.) yNJΨ- diisopropilcarbodiimida (175 μL, 5 eq.), y acoplamiento de la amina con 2-(2',4'- diclorofenil)etilamina (170 μL, 5 eq.) en presencia de trietilamina (155 μL, 5 eq.). A continuación, el intermediario dicetopiperazínico (90.0 mg, 1 eq.) se acopló a la resina en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (45 mg, 1.5 eq.) y ΛζN'-diisopropilcarbodiimida (55 μL, 1.5 eq.) en diclorometano: dimetilformamida (2:1, 3 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La resina seca se lavó con diclorometano (3 x 3 mL), alcohol isopropílico (3 x 3 mL) y dimetilformamida (3 x 3 mL). Finalmente, el tratamiento de la resina con una mezcla de 60:40:2 ácido trifluoroacético / diclorometano / agua produjo una mezcla de reacción que contenía el compuesto deseado. Este se filtró y los disolventes se eliminaron mediante evaporación a baja presión, seguido de liofilización. El residuo obtenido se purificó mediante RP- HPLC a escala semipreparativa aplicando un gradiente de acetonitrilo-agua (acetonitrilo al 30% ? acetonitrilo al 45%, 30 min) para proporcionar 71.7 mg del producto deseado (rendimiento 35 %, = 99% pureza). ESI-MS: C32H32Cl2F2N4O4 caled. [M+H+] 645.2; found: [M+H+] 645.1.
Ejemplo 4. Efectos de los compuestos Ia y Ib sobre la interacción entre UBC13 y UEVl.
El análisis computacional descrito en el Ejemplo 2 apoya la hipótesis de que los compuestos Ia y Ib encajan con una buena afinidad en el surco hidrofóbico de la superficie de UBC 13 utilizado normalmente para su interacción específica con la primera hélice alifática de las proteínas UEV (Mms2p, UEVl y UE V2). Esto sugiere que dichos compuestos pueden interferir competitivamente con la interacción entre UBC13 y UEVl (o Mms2p y UEV2). Para demostrarlo experimentalmente, se analizó la capacidad de los compuestos Ia y Ib para inhibir la interacción UBC 13 -UEVl, utilizando dos tipos de ensayos: (1) doble híbrido en levaduras para la interacción UBC13-UEV1, aplicando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1; y
(2) interacción entre las proteínas UBC13 y UEVl en sistemas acelulares, usando proteínas recombinantes producidas en Escherichia coli.
El efecto de los compuestos Ia y Ib sobre la interacción UBC13-UEV1 en ensayos de doble híbrido en levaduras se llevó a cabo incubando células de la cepa AH 109 de Saccharomyces cerevisiae, crecidas en medio selectivo, con 100 μM de uno u otro compuesto. Como control positivo de interacción, se usó la de las proteínas p53 y T grande de SV40. La intensidad de las interacciones se determinó colorimétricamente mediante la detección de actividad β-galactosidasa, usando como sustrato O-mtrofenil- />-galactopiranósido (ONPG), realizándose cada determinación por triplicado. En estas condiciones, se ilustra en la Figura 5(A) que el compuesto Ia, a una concentración de 100 μM, inhibe en cerca de un 60% la interacción entre UBCl 3 y UEVl, mientras que la inhibición de esta interacción por el compuesto Ib es de cerca de un 40%. Ninguno de estos dos compuestos inhibe la interacción, usada como control, entre p53 y T grande, lo que indica que ambos compuestos inhiben de forma específica la interacción entre UBCl 3 y UEVl. Estos resultados sugieren también que el compuesto Ia inhibe esta interacción con mayor eficacia que el compuesto Ib. Para determinar la actividad de estos compuestos en ensayos acelulares, se realizaron experimentos de interacción proteína-protema con proteínas recombinantes producidas en Escherichia coli. Para expresar UBCl 3 y UEVl, se transformaron células bacterianas de la cepa BL21 de E. coli los plásmidos pGEX-4Tl-UBC13 o pGEX-4T3- UEVl, seleccionándose colonias transformadas mediante crecimiento en placas con ampicilina (100 μg/mL). Se transfirieron colonias individuales a 3 L de medio LB sin antibióticos, creciéndose en agitación a 37 0C hasta que el cultivo alcanzó la fase exponencial (D.O.600 J1n ~ 0'6), momento en que se indujo la expresión de las proteínas recombinantes mediante la adición al cultivo de isopropil α-D-tiogalactopiranósido (IPTG, Sigma 1-6758) a una concentración de 1 mM durante 5 h. Los cultivos se transfirieron a tubos, se centrifugaron y los botones celulares se resuspendieron en el doble de su volumen de suero salino tamponado con fosfatos (PBS) a pH 7.4 y se rompieron en un instrumento CeIl Disruptor (Constant Systems). Los Usados celulares se filtraron a través de filtros de acetato de celulosa con poros de 45 μM (Millipore SLHA033SS) y se aplicaron a columnas GSTrap FF (Amersham Biosciences 17-5131- 01). En el caso de UEVl, la proteína unida específicamente a la columna fue sometida a digestión enzimática sobre la misma columna con 50 unidades de trombina (Amersham Biosciences 27-0846-01) a 25 0C durante una noche. A la anterior columna se acopló una columna HiTrapBenzamidine FF (Amersham Biosciences 27-0846-01), de tal modo que la unidad GST quedó atrapada en la primera columna, y la trombina en la segunda columna. A continuación se eluyó la proteína UEVl, sin la porción GST, seguido de un paso posterior de purificación mediante cromatografía de filtración en gel con una columna Superdex 75. La proteína recombinante GST-UBC13 se expresó como se indica más arriba, purificándose mediante cromatografía de afinidad en columnas GSTrap FF, seguida de cromatografía de filtración en Superdex 75. Las fracciones correspondientes a las proteínas purificadas se concentraron mediante centrifugación en columnas Centricon YM-10 (Millipore 4205), guardándose a 4 0C hasta su utilización.
Para determinar los efectos de los compuestos Ia y Ib sobre la interacción de UBC 13 con UEVl, se pre-incubaron durante 30 min a temperatura ambiente 2 μL de la proteína recombinante quimérica GST-UBCl 3, a una concentración de 4'09 μg/mL en un tampón Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA ImM, DTT 0'5 mM a pH 7'6, con los compuestos Varubin, Ib o el compuesto cíclico control VIII-N6-2-1C a concentraciones finales de 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM o 100 μM. Estas mezclas se inmovilizaron en fase sólida mediante incubación durante 60 min min con matriz Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences), seguido de lavados con 10 volúmenes de matriz de tampón Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA ImM, 0'5 mM DTT a pH 7'6. A continuación las columnas se incubaron durante 45 min con 10 μL de proteína UEVl a una concentración de 0'15 μg/mL en el mismo tampón. La proteína UEVl no unida a las columnas (fracción eluída, o E) fue recogida mediante centrifugación a 14.000 g, lavándose a continuación las columnas con 10 volúmenes del tampón anterior. A continuación fueron eluídos GST-UBC13 y complejos GST-UBC13-UEV1 mediante incubación con un tampón de elución conteniendo 10 mM de glutatión reducido en Tris- HCl 50 mM pH 8.0 (fracción remanente, o B). Las fracciones E y B se concentraron mediante centrifugación en columnas Centricon YM-10, desnaturalizadas mediante ebullición en tampón Laemmli (250 mM Tris-HCl, 10% SDS, 500 mM DTT, 0'5% bromofénol azul, 50% glicerol, pH 6'8) y se separaron electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 10% - SDS. Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron electroforéticamente a membranas PVDF, que fueron preincubadas durante 1 h con tampón bloqueante (leche desnatada al 5% en PBS pH 7 '4 con Tween-20 0'l%), y a continuación incubadas durante 1 h con anticuerpos de conejo anti-UEVl o anti- UBCl 3. Estos anticuerpos fueron producidos previamente en nuestro laboratorio mediante inmunización de conejos con péptidos sintéticos correspondientes a secuencias específicas de UEVl o UBC13, respectivamente, purificándose los anticuerpos a partir de los sueros inmunes mediante cromatografía de afinidad con columnas sobre las que se inmovilizaron los péptidos inmunizantes [37]. Tras la incubación con estos anticuerpos, las membranas se lavaron tres veces con 20 mL de PBS-Tween-20, y se incubaron durante 30 min con anticuerpos de cabra anti- inmunoglobulina de conejo conjugados con peroxidasa de rábano (Dako Cytomation) diluido a 1:1000 en tampón bloqueante. Tras tres lavados con PBS-Tween-20, las reacciones sobre las membranas se visualizaron mediante quimioluminiscencia con el sistema ECL (Amersham) y exposición sobre películas autorradiográficas.
Los resultados de este ensayo se ilustran en la Figura 5(B), que muestra que los compuestos Ia y Ib, pero no el compuesto cíclico control VIII-N6-2-1C, inhiben eficientemente la unión de UEVl a GST-UBCl 3, ya que hasta un 60% (para el compuesto Ia) o un 40% (para el compuesto Ib) de UEVl aparece en la fracción eluída y no unida a GST-UBC13. Aunque la Figura 5(B) sólo muestra los resultados del ensayo realizado con 100 μM de compuestos cíclicos, también se observó una eficiente inhibición de la interacción de UEVl con UBC 13 a concentraciones muy inferiores, de hasta 10 nM de los compuestos Ia y Ib. Teniendo en cuenta que las proteínas UEVl y UBCl 3 interaccionan entre sí con gran afinidad (KD ~ 5 X 10"10 M, constante que se ha determinado en un instrumento Biacore TlOO), estos resultados sugieren que la inhibición por los compuestos Ia y Ib de la interacción entre UBC13 y UEVl se debe a la interacción competitiva de estos compuestos con la superficie de UBCl 3 normalmente utilizada para su interacción con la primera hélice alifática de UEVl .
Ejemplo 5. Efectos del compuesto Ia sobre la poliubiquitilación mediada por UBC13-UEV1.
La inhibición por los compuestos Ia y Ib de la interacción entre UBC13 y UEVl, descrita en el Ejemplo 4, indica que estos compuestos pueden inhibir la actividad enzimática de UBCl 3. Como se describe en los Antecedentes, la poliubiquitilación del tipo K63 catalizada por UBC13-UEV1 requiere de la interacción entre ambas subunidades del heterodímero. La capacidad del compuesto Ia, el más activo de los 2 compuestos como inhibidor de la interacción entre UBC13 y UEVl, para afectar esta actividad enzimática se analizó mediante ensayos de formación de cadenas libres de poliubiquitina in vitro. En este ensayo, se permite la formación de cadenas de poliubiquitina en reacciones que contienen 0'I μM de enzima El (Boston Biochem), 0'2 μM de UBC13, 0'2 μM de UEVl (producidas tal como se describe en el Ejemplo 4), 117 μM de ubiquitina silvestre (Biomol UW8795) o mutada en todas las lisinas excepto la lisina en posición 63 (ubiquitina K63) o en la posición 48 (ubiquitina K48; Boston Biochem), en un tampón de reacción con 50 mM de Tris-HC a pH 7'6, 5 mM de MgCl2 y 0'5 mM de ditiotreitol. Para los tratamientos con el compuesto Ia (Varubin), UBCl 3 se preincubó durante 10 min a temperatura ambiente con 100 μM del compuesto antes de añadirse a la reacción. La reacción se inició mediante la adición de 2 mM de ATP, y se llevó a cabo mediante incubación a 37 0C a diferentes tiempos, deteniéndose mediante la adición de tampón Laemmli (250 mM Tris-HCl, 10% SDS, 500 mM DTT, 0,5% bromofenol azul y 50% glycerol a ρH6.8) y ebullición durante 3 min. Las muestras se separaron electroforéticamente en geles de poliacrilamida-SDS y se transfirieron electroforéticamente a membranas PVDF. Se siguió el procedimiento de inmunodetección descrito en el Ejemplo 4, detectándose las moléculas de ubiquitina con anticuerpo de conejo anti-ubiquitina (Biomol UG 9510), y revelándose la reactividad por quimioluminiscencia.
En la Figura 6(A) se muestra que, en ausencia de compuesto Ia, la reacción descrita arriba da lugar a la formación cadenas de poliubiquitinas de tamaño creciente con el tiempo, debido a la adición progresiva de unidades de ubiquitina. En la reacción control se evidencia la aparición de triubiquitina (Ub3) hacia los 30 minutos de reacción, tetraubiquitina (Ub4) a los 60 minutos, de pentaubiquitina (Ub5) a los 90 minutos y de formas de tamaño (o complejidad) superior a tiempos más tardíos. Como se ilustra en la Figura 6(B), el análisis cuantitativo de la generación de las diferentes formas de poliubiquitinas indica que la preincubación de UBCl 3 con 100 μM de compuesto Varubin (Ia) causa una menor velocidad de generación de formas poliubiquitiladas. La diferencia significativa en las pendientes de las curvas de las reacciones control y las del tratamiento con compuesto Ia indica también que la inhibición de la actividad enzimática de UBC13-UEV1 por este compuesto es de tipo competitivo. Esta poliubiquitilación in vitro utiliza específicamente la Usina en posición 63 de la molécula de ubiquitina, ya que se produce tanto con la ubiquitina silvestre como cuando en la reacción se usa la ubiquitina K63 (Figura 6(C)), pero no cuando en su lugar se usa ubiquitina 48. Además, la preincubación de UBC 13 con el compuesto Ia inhibe la poliubiquitilación que usa como substrato ubiquitina K63 con una eficiencia semejante a cuando el sustrato es ubiquitina silvestre (Figura 6(C)). La conclusión, por tanto, es que el compuesto Ia inhibe eficientemente la poliubiquitilación de tipo K63 catalizada in vitro por UBC13-UEV1.
Ejemplo 6. Actividades biológicas de los compuestos Ia y Ib. Actividad en la levadura Saccharomyces cerevisiae.
En la levadura S. cerevisiae, la poliubiquitilación de tipo K63, mediada por Ubcl3p-Mms2p, de la proteína PCNA es crucial para la reparación postreplicativa de ADN en la subruta de RAD6 llamada de "reparación libre de error" [7-17]. En esta ruta, tanto UBCl 3 como MMS2 son epistásicas respecto a RAD6, aunque con la peculiaridad de que la deleción de UBC 13, pero no MMS2, rescata parcialmente el fenotipo radó. [14]. Ambos genes son sinérgicos con mutantes de la segunda subruta de reparación regulada por RAD6, la llamada de "reparación tendente al error", o mutagénica, en que participan REV3, REV7 y REVI. Esta sinergia se manifiesta por el hecho de que la pérdida de UBC 13 o MMS2 produce una mayor sensibilización de imitantes rev3 a daños genotóxicos tales como irradiación ultravioleta o la exposición a metil-metano sulfonato (MMS) [13-15].
Para determinar si los compuestos Ia y Ib inhiben la función de Ubcl3p-Mms2p, se evaluó su capacidad de mimetizar en S. cerevisiae los fenotipos de reparación de
ADN generados por la mutación nula de ubcl3. Así, se utilizaron cepas imitantes en
RAD6 o REV3 y su cepa parental (control) en ensayos de viabilidad tras la exposición a radiación ultravioleta o MMS. Los genotipos de las cepas usadas son los siguientes:
1) Cepa parental (control) BY4741: MAT a his3Δl leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 2) Cepa Δradó: MAT a his3Δl leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 radó: :kanMX4
3) Cepa Δrev3: MAT a his3Δl leu2Δ0.1ys2Δ0 ura3Δ0 rev3::kanMX4 Se inocularon células en cultivos líquidos con medio YPD durante una noche a 30 0C, hasta alcanzar la fase logarítmica de crecimiento. Para los tratamientos con radiación ultravioleta, alícuotas de células, crecidas en presencia o no de 100 μM de los compuestos Ia o Ib fueron irradiadas en un instrumento Stratalinker (Stratagene) a las energías indicadas en las Figuras 7 y 8. Para los tratamiento con el agente mutagénico MMS, se incubaron alícuotas de células crecidas o no en medio con 100 μM de los compuestos Ia o Ib, añadiéndose MMS al 0'03%, con incubación posterior durante los tiempos indicados en las Figuras 7 y 8. Tras uno u otro tratamiento, se sembraron 500 células en placas con medio YPD, procediendo al recuento de colonias al cabo de 2 días.
Tal como se esperaba, en estos ensayos los imitantes Δrad6 presentan una alta sensibilidad tanto a irradiación UV como a MMS, con un rápido descenso de la supervivencia a medida que se aumentan las dosis de los agentes mutágenos (Figura 7). Sin embargo, la presencia de 100 μM de compuesto Ia o compuesto Ib rescató claramente el fenotipo radó inducido por irradiación UV, y, en menor grado, el fenotipo generado por el tratamiento con MMS (Figura 7). Este es un fenotipo característico de imitantes Δubcl3, y por tanto los compuestos Ia y Ib mimetizan este fenotipo, sugiriendo que actúan a través de la inhibición de UBCl 3. Por otra parte, la incubación de los imitantes Δrev3 con el compuesto Ia y, en menor medida, el compuesto Ib, produjo una mayor sensibilización de las células a los efectos de la radiación UV o la exposición al MMS, con una sinergia semejante al de una mutación Δubcl3 (Figura 8). Por tanto, los dos fenotipos analizados indican que los compuestos Ia y Ib afectan la ruta de reparación de ADN regulada por RAD6, y que lo hacen mediante la inhibición de Ubcl3p.
Ejemplo 7. Actividades biológicas de los compuestos Ia y Ib. Inhibición de la estimulación del factor transcripcional NF-κB por TNFα.
Tal como se describe en los Antecedentes, una de las rutas bioquímicas reguladas por poliubiquitilación tipo K63, catalizada por UBC13-UEV1 (o UBC13- UEV2), es la activación del factor transcripcional NF-κB por señales inducidas por citoquinas, TNFα y otros polipéptidos.
Para determinar la actividad de los compuestos Ia y Ib sobre la estimulación de la actividad NFK-B por TNFα se llevaron a cabo ensayos de inducción de actividad luciferasa (determinada con el kit Dual-Luciferase Repórter Assay System, de Promega, número de catálogo El 910) generada por expresión del gen de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) dirigida por un promotor que contiene tres sitios de reconocimiento para NFK-B. Para ello, se co-tranfectaron células HeLa con el plásmido pRL-TK, que codifica para la Luciferasa de Renilla reniformis y es un control de eficiencia de transfección, y el plásmido prLUC, plásmido que permite determinar la actividad de transcripcional de NF-? B, usando como vehículo de transfección Fugene (Roche). Se sembraron 100.000 células en placas de 6 pocilios (Costar). Al día siguiente, se procedió a formar el complejo de transfección con 0'5 μg de cada plásmido y 3 μl de Fugene durante 15 minutos. El complejo se añadió a las células en medio Optimem (InVitrogen), y al cabo de 5 horas se cambió a medio completo (Dulbecco's Modified Eagle's Médium con suero fetal bovino al 10%, 2 mM de glutamina, suplementado con penicilina y estreptomicina), al que se añadió, o no, compuesto Varubin (Ia) o Ib a distintas concentraciones. Al día siguiente, las células se incubaron con TNFα (10 ng/mL) durante 4 h, tras lo cual se lavaron con suero salino tamponado con fosfatos (PBS) y se Usaron con 250 μL de tampón de lisis, siguiendo las indicaciones del fabricante (Promega). Al Usado se añadieron 100 μL de reactivo de luciferasa (LARII) para medir la actividad luciferasa de luciérnaga, tras lo cual se paró la reacción con 100 μL de tampón de parada con sustrato para luciferasa de Renilla reniformis, determinándose en ese momento esta segunda actividad. La actividad luciferasa de luciérnaga se normalizó en relación a la actividad luciferasa de Renilla. Los valores correspondientes a células transfectadas pero no estimuladas con TNFα se usaron como normalizadores para el resto de valores experimentales. Finalmente, se realizó una tercera normalización en que todos los valores se reflejan en relación a los valores de inducción de actividad luciferasa por TNFα, sin añadir los fármacos objeto de la presente invención (control TNFα).
En la Figura 9 se muestra que la preincubación de células HeLa con compuesto Ia o compuesto Ib inhibe de forma dependiente de dosis la estimulación de la actividad transcripcional de NF-κB inducida por TNFα. Esta inhibición es mayor con el compuesto Ia que con el compuesto Ib, llegando a una inhibición de cerca del 50% de la activación de NF-κB por TNFα cuando las células HeLa se preincuban con Varubin (Ia) a una concentración de 100 μM. Por tanto, los compuestos Ia y Ib son eficientes inhibidores de la activación de NF-κB, con lo que serán de aplicación en procesos en que esta activación es importante, incluyendo procesos inflamatorios y neoplásicos.
Ejemplo 8. Actividades biológicas de los compuestos Ia y Ib. Sensibilización de células tumorales a los efectos citotóxicos de la doxorrubicinan y el etopósido.
La activación del factor transcripcional NF-κB es uno de los mecanismos de supervivencia de células normales y tumorales cuando se les somete a diferentes formas de estrés o daño [44-47]. Por ello, una de las consecuencias de la inhibición de la activación de este factor transcripcional es que produce una mayor sensibilidad a los efectos citotóxicos de diversos agentes, físicos o químicos, que causan daño genotóxico u otro tipo de estrés celular. Por tanto, la incubación de células con los compuestos Ia o Ib, debido en parte a su capacidad para inhibir la activación de NF-κB, podría causar una sensibilización celular a los efectos de agentes quimioterápicos tales como doxorrubicina o etopósido. Es decir, la combinación de doxorrubicina o etopósido (a determinadas dosis) con compuesto Ia o Ib debería causar un efecto citotóxico mayor que la doxorrubicina o el etopósido por sí solos y semejante al que puedan causar dosis superiores de doxorrubicina o etopósido, respectivamente. Para demostrar experimentalmente esta predicción, se realizaron experimentos de recuentos de células mediante el procedimiento CyQuant (Molecular Probes, núm. cat. C-7026). Este método de cuantificación de células se basa en un compuesto cuya fluorescencia es estimulada cuantitativamente tras unirse a ácidos nucleicos. Se sembraron 10.000 células en cada pocilio de placas de 96 pocilios, permitiendo su adhesión a la superficie de las placas durante una noche a 37 0C en una atmósfera de 5% de CO2 y 90% de humedad, tras lo cual las células fueron sometidas a los distintos tratamientos. Al finalizar los tratamientos experimentales, los pocilios se lavaron una vez con suero salino tamponado con fosfatos (PBS), congelándose a continuación las placas a -70 0C hasta el momento de realizar el ensayo CyQuant. Para la cuantificación, las placas se descongelaron a temperatura ambiente y a cada pocilio se añadieron 200 μL de tampón de lisis que contenía el colorante CyQuant GR (siguiendo indicaciones del fabricante). Tras incubar a temperatura ambiente durante 2-5 minutos, se procedió a cuantificar la fluorescencia emitida a 480 nm y 520 nm. Para el cálculo del número de células correspondiente a las lecturas fluorimétricas, se generaron rectas patrón de fluorescencia emitida según números conocidos de células, y se utilizaron estos datos para extrapolar los datos experimentales. Como se muestra en la Figura 10, se trataron células HeLa (procedentes de un carcinoma de cérvix) o PC-3 (procedentes de un carcinoma de próstata) con etopósido y doxorrubicina, respectivamente, a concentraciones de entre 0'05 μM hasta 50 μM, añadiendo, o no, 100 μM de compuesto Ia. Del gráfico de la Figura 10 puede deducirse que la IC50 para doxorrubicina es en células PC-3 de cerca de 0'5 μM a las 72 h de tratamiento, y la IC50 para etopósido es en células HeLa de aproximadamente 1 '25 μM a las 24 h de tratamiento. La adición de 100 μM de Ia redujo la IC50 de doxorrubicina hasta 0'I μM para células PC-3 y la IC50 de etopósido hasta 0'04 μM para células HeLa. Por tanto, el tratamiento con 100 μM de compuesto Ia produce una sensibilización a los efectos citotóxicos de la doxorrubicina de entre 5 veces (células PC-3) y una sensibilización a los efectos citotóxicos de etopósido de 30 veces (células HeLa).
Ejemplo 9. Actividad antitumoral del compuesto Ia (Varubin) como quimiosensibilizante en modelos murinos de xenoinjertos de células tumorales humanas.
Con el fin de determinar si Varubin presenta una actividad antitumoral in vivo, se analizaron sus efectos en ratones portadores de tumores formados a partir de células PC-3. Los tumores experimentales se formaron mediante la inoculación intramuscular de células PC-3.Sluc [48]. Estas últimas son células prostáticas PC-3 en las que se han integrado mediante transfección del plásmido pRC/CMV-luc, que expresa en células de mamífero el gen para la luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis). La incubación de las células PC-3.1uc con D-luciferina, sustrato de la luciferasa, produce luz, que se puede cuantificar de forma absoluta (número de fotones) bien mediante un luminómetro, o bien mediante detección con una cámara CCD (charge-coupled device). Este último procedimiento permite, además, representar en tiempo real imágenes de la localización de las células tumorales en los animales inoculados, así como el tamaño del tumor, ya que la intensidad de la luz (número de fotones) emitida en presencia de luciferina es directamente proporcional al número de células PC-3.1uc.
Para estos estudios se utilizaron 24 ratones macho Balb/c nu/nu (Charles River Laboratories) de 6 semanas de edad. Estos animales se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos en todo momento, habiéndose mantenido durante 1 semana después de su recepción en el animalario, antes de la manipulación experimental. Tras ser anestesiados mediante inyección intraperitoneal (i. p.) de una mezcla a partes iguales de 6 mg/Kg de droperidol (Roche, Basilea, Suiza) y 12 mg/Kg de midazolam (Rovi S.A, Madrid, España), se procedió a realizar inyecciones intramusculares (i. m.), tanto en el muslo derecho como en el muslo izquierdo de cada animal, de 1 x 10 células PC- 3.Sluc, suspendidas en 100 μL de medio de cultivo carente de suero fetal bovino. Se permitió el desarrollo de tumores en los sitios de inoculación durante 2 semanas, tras lo cual se realizó una primera medición de fotones emitidos y una primera captación de imágenes con un instrumento ORCA-2BT Imaging System, (Hammamatsu Photonics) dotado de una cámara CCD (refrigerada a -80 0C) modelo C4742-98-LWG-MOD, a una resolución de 512 x 512 pixels. Para el seguimiento in vivo de los niveles de emisión lumínica de los tumores, los animales fueron anestesiados como se describe arriba, e inmediatamente después se procedió a la inyección i. p. de 150 μl de D-luciferina (Promega), a una dosis de 100 mg/Kg. Cuatro minutos después, se procedió a la detección y cuantificación de fotones durante 5 min en el instrumento arriba descrito. Las determinaciones se expresan en unidades lumínicas relativas (RLUs, o Relative Light Units). En todas las determinaciones se llevó a cabo una sustracción de la señal de fondo, correspondiente a áreas de los animales alejadas de los tumores (tórax). Inmediatamente después de la adquisición de la primera imagen, se procedió a la toma de una imagen con luz visible del mismo animal en la misma posición. La cuantificación y el análisis de fotones se realizaron con ayuda del programa de análisis de imagen WASABI (Hamamatsu Photonics). La transformación de la información cuantitativa en imágenes se realizó bien en pseudocolores o en escala de grises, manteniendo los mismos parámetros y rangos de intensidad y colores para todos los animales, de modo que las intensidades de color de gris/negro representan fielmente los datos cuantitativos, siendo comparables entre experimentos y entre distintos animales. Para las representaciones gráficas, los datos cuantitativos (RLUs) fueron normalizados, para cada tumor, en relación con las RLUs del día 0 de tratamiento. Los 24 ratones, portadores de tumores luminiscentes en ambos muslos, se encuadraron en 4 grupos experimentales: (1) Grupo control, en los que se procedió a una inyección intravenosa (i. v.) de 100 μL de suero salino tamponado con fosfatos pH 7.4 (PBS) y 50 μL de PBS intratumoral (i. t). (2) Grupo tratado con doxorrubicina (Sigma, Alcobendas, Madrid, España) i. v., 5 mg/Kg en 100 μL de PBS, una vez a la semana. (3) Grupo tratado con Varubin i. t, 100 μM en 50 μL de PBS, dos veces a la semana. (4) Grupo de tratamiento combinado con doxorrubicina i. v. una vez a la semana y con Varubin dos veces a la semana, con las dosis y vías de administración indicadas arriba. La emisión lumínica de los tumores fue analizada a lo largo de 56 días desde el inicio del tratamiento Los resultados muestran que los tumores de los animales controles crecieron a un ritmo generalmente constante a lo largo del experimento, con excepción de un descenso a los 14 días de iniciado el experimento (Figura 11). Este descenso de RLUs (y por tanto del tamaño de los tumores) se observó en todos los grupos, independientemente del tratamiento de cada grupo, y por tanto corresponde al patrón intrínseco de crecimiento de estas células en las condiciones de xenoinjerto de este experimento. A diferencia de los tumores de los ratones control, los tumores de los ratones tratados únicamente con doxorrubicina (grupo 2) apenas experimentaron crecimiento durante el experimento (Figura 11). Igualmente, los ratones tratados tanto con doxorrubicina i. v. como con Varubin i. m. tampoco crecieron significativamente durante este experimento. Finalmente, los tumores de los animales tratados únicamente con Varubin i. m. presentaron asimismo un crecimiento muy limitado (sin diferencias significativas con respecto a los tratados con doxorrubicina), y en cualquier caso significativamente inferior al de los tumores de los ratones controles. Por tanto, Varubin muestra actividad antitumoral en este modelo de tumores transplantados en ratones nu/nu, a una concentración de 100 μM, en inyección intramuscular.
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Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un compuesto de fórmula (I):
R-(CR1R2)q-CO-N(R3)-C(R4R5)-CO-NH2 donde:
- R es el radical
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donde:
- R6 es un radical seleccionado entre: H, alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilalquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, arilalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir y heterociclilalquilo sustituido o sin sustituir;
- A es un radical seleccionado entre arilo sustituido o sin sustituir y heterociclilo sustituido o sin sustituir;
- R7 y R8 se seleccionan independientemente de H, metilo, etilo, propilo e isopropilo,
- o es un número seleccionado entre 0, 1 , 2, 3 y 4,
- n es un número seleccionado entre O y I, - la linea indica el lugar de enlace del radical R con el resto de la molécula de fórmula (I);
- R1 y R2 se seleccionan independientemente de H, metilo, etilo, propilo e isopropilo;
- R3 es un radical seleccionado entre: H, alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilalquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, arilalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir, heterociclilalquilo sustituido y sin sustituir; - R4 y R5 se seleccionan independientemente de H, metilo, etilo, propilo e isopropilo;
- q es un número seleccionado entre O y I; y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
2.- Compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque R6 es un radical seleccionado entre H, arilalquilo sustituido o sin sustituir y heterociclalquilo sustituido o sin sustituir, y porque R3 es un radical seleccionado entre H, arilalquilo sustituido o sin sustituir y heterociclalquilo sustituido o sin sustituir, y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
3.- Compuesto según la reivindicación 2 caracterizado porque R6 es un radical seleccionado entre fenilpropilo sustituido o sin sustituir, feniletilo sustituido o sin sustituir, bencilo sustituido o sin sustituir, furilpropilo sustituido o sin sustituir, furiletilo sustituido o sin sustituir, furilmetilo sustituido o sin sustituir, imidazolilpropilo sustituido o sin sustituir, imidazoliletilo sustituido o sin sustituir, imidazolilmetilo sustituido o sin sustituir piridinilpropilo sustituido o sin sustituir, piridiniletilo sustituido o sin sustituir, piridinilmetilo sustituido o sin sustituir, piperidinilpropilo sustituido o sin sustituir, piperidiniletilo sustituido o sin sustituir, piperidinilmetilo sustituido o sin sustituir; y porque R3 es un radical seleccionado entre fenilpropilo sustituido o sin sustituir, feniletilo sustituido o sin sustituir, bencilo sustituido o sin sustituir, furilpropilo sustituido o sin sustituir, furiletilo sustituido o sin sustituir, furilmetilo sustituido o sin sustituir, imidazolilpropilo sustituido o sin sustituir, imidazoliletilo sustituido o sin sustituir, imidazolilmetilo sustituido o sin sustituir, piridinilpropilo sustituido o sin sustituir, piridiniletilo sustituido o sin sustituir, piridinilmetilo sustituido o sin sustituir, piperidinilpropilo sustituido o sin sustituir, piperidiniletilo sustituido o sin sustituir, piperidinilmetilo sustituido o sin sustituir, y sales, solvatos, profármacos, o estereoisómeros del mismo.
4.- Compuesto según la reivindicación 3 caracterizado porque R6 es un radical sustituido por uno o más radicales seleccionados entre flúor, cloro, bromo, trifluorometilo, hidroxilo, alcoxilo, alquilcarbonilo, alquilamino y sulfonamino, ciano, nitro, nitrito, nitrato, tionitrato, carboxamido y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
5.- Compuesto según la reivindicación 3 caracterizado porque R3 es un radical sustituido por uno o más radicales seleccionados entre flúor, cloro, bromo, trifluorometilo, hidroxilo, alcoxilo, alquilcarbonilo, alquilamino y sulfonamino, ciano, nitro, nitrito, nitrato, tionitrato, carboxamido y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
6.- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque R6 es el radical /7-fluorofeniletilo o 2,4-diclorofeniletilo, y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
7.- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque A es un fenilo sustituido por cloro, flúor y/o bromo, y o es un número seleccionado entre 1, 2 y 3, y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
8.- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque R7 y R8 son ambos H, o es 2, y A es j5-fluorofenilo y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
9.- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque R3 es 2-pirimidiniletilo, 2,4-diclorofeniletilo o 4-metoxifeniletilo, y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
10.- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque n es 1, y sales, solvatos, pro fármacos o estereoisómeros del mismo.
11.- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque n es 0, y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
12.- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque q es 0, y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
13.- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque q es 1, y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
14- Compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque presenta fórmula Ia (N- aminocarbamoilmetil-N-(2'-(2"piridil)etil)-l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-3,7-dioxo- [ 1 ,4]diazepan-5-carboxamida):
Figure imgf000083_0001
(Ia) y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
15- Compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque presenta la fórmula Ib (l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-2-[N-aminocarbonilmetil-N-(2'-(2"ρiridil)etil)- carbonilmetil] piperazina-3,6-diona):
Figure imgf000083_0002
(Ib) y sales, solvatos, profármacos o estereoisómeros del mismo.
16.- Compuesto según la reivindicación 1 caracterizado porque presenta una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000084_0001
N-aminocarbamoilmetil-JV-(2'-(2' '- N-aminocarbamoilmetil-iV-(2'-(4"- piridil)etil)-l-[2'-(2",4"- metoxifenil)etil)-l-[2'-(2",4"- diclorofenil)etil]-4-[2'-(4"- diclorofenil)etil]-4-[2'-(4"- fluorofenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan- fluorofenil)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan-
5-carboxamida 5-carboxamida
Figure imgf000084_0002
l-[2'-(2",4"-diclorofenil)etil]-4-[2'-(4"-
Figure imgf000084_0003
fluorofenil)etil]-2-[N-aminocarbonilmetil-
N-aminocarbamoilmetil- N-(T -(4"- N-(2'-(2"piridil)etil) carbonilmetil] metoxifenil)etil)-l,4-bis[2'-(4"- piperazina-3,6-diona fluorofenil)etil] -3 ,7-dioxo- [ 1 ,4] diazepan- 5-carboxamida
Figure imgf000084_0004
l-[2'-(2",4"-diclorofenil)etil]-4-[2'-(4"- l,4-bis[2'-(4"-fluorofenil)etil]-2-[N- fluorofenil)etil]-2-[iV-aminocarbonilmetil- aminocarbonilmetil-N-(2'-(4"- iV-(2'-(4"-metoxifenil)etil) carbonilmetil] metoxifenil)etil)carbonilmetil]piperazina- piperazina-3,6-diona 3,6-diona
Figure imgf000085_0001
N-aminocarbamoilmetil-iV-[2'-(2",4"- [1 ,4-bis[2'-(4' '-fluorofenil)etil]-2-[JV- diclorofenil)etil]- 1 ,4-bis[2'-(4' '- aminocarbonilnietil-7V-(2'-(2",4' '- fluorofenii)etil]-3,7-dioxo-[l,4]diazepan- diclorofenil)etil)carbonilmetii]piperazina-
5-carboxamida 3,6-diona
17.- Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, una sal, solvato, profármaco o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo para uso médico.
18.- Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o una sal, solvato, profármaco o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento dirigido al tratamiento y/o profilaxis de patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBCl 3.
19.- Uso según la reivindicación 18 donde las patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBC 13 son enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
20.- Uso según la reivindicación 19 donde las patologías o enfermedades inflamatorias y autoinmunes son: enfermedad inflamatoria intestinal, patologías articulares inflamatorias, dermatitis atópicas y otras patologías dermatológicas inflamatorias, neuritis, encefalitis, encefalomielitis y patologías inflamatorias que afectan al sistema nervioso central o periférico, miositis, vasculitis, lupus eritematoso sistémico, enfermedades infecciosas que cursan con inflamación, reacciones de rechazo de huésped contra injerto, conjuntivitis y oculopatías inflamatorias, otitis o mucositis.
21.- Uso según la reivindicación 18 donde las patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene la enzima UBC 13 son el cáncer o neoplasia
22.- Uso según la reivindicación 21 donde el cáncer o neoplasia es carcinoma de próstata, mama, pulmón, páncreas, colorrectal, gástrico, esofágico, de laringe, de tiroides, hepático, de vejiga urinaria, renal, uterino, y de cerviz; osteosarcoma, sarcoma de partes blandas y angiosarcoma; tumor hematopoyético incluyendo de leucemias y linfomas, neuroblastomas, glioblastomas y astrocitomas, melanoma, carcinoma dérmico de células básales o carcinoma dérmico de células escamosas.
23.- Uso de un compuesto según cada una de las reivindicaciones 1 a 16, o una sal, solvato, profármaco o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento dirigido al tratamiento y/o profilaxis de patologías o enfermedades asociadas a rutas metabólicas en las que interviene el factor transcripcional NF-κB.
24.- Uso según reivindicación 23 donde las patologías o enfermedades son procesos inflamatorios o neoplásicos.
25. -Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o una sal, solvato, profármaco o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, para la elaboración de un medicamento dirigido a la terapia antitumoral, en donde dicho medicamento es un antagonista de, o inhibe, la ruta de tolerancia a daños genotóxicos mediada por PCNA y RAD6 produciendo efectos quimio- o radiosensibilizantes.
26.- Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en la elaboración de un medicamento para aumentar la sensibilidad de un mamífero al tratamiento con un agente antitumoral.
27.- Uso según reivindicación 26 en el que el agente antitumoral es doxorrubicina o etopósido.
28.- Composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto según las reivindicaciones 1 a 16, o una sal, solvato, profármacos o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en cantidad terapéuticamente efectiva, junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
29.- Composición farmacéutica según la reivindicación 28 caracterizada porque comprende adicionalmente, en una cantidad terapéuticamente efectiva, al menos, un segundo agente terapéutico.
30.- Composición farmacéutica según la reivindicación 29 caracterizada porque el segundo agente terapéutico es un compuesto según las reivindicaciones 1 a 16, una sal, solvato, profármaco o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo.
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