JP2009544600A - Ubc13−uev相互作用を阻害することができる化合物、医薬組成物および治療的使用 - Google Patents

Ubc13−uev相互作用を阻害することができる化合物、医薬組成物および治療的使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、UBC13−UEV相互作用に対する阻害活性を有し、抗腫瘍療法あるいはUBC13酵素を含む代謝経路、転写因子NF−κBを含む代謝経路、またはPCNAもしくはRAD6を含む経路に関連する疾病の治療および/または予防を目的とする医薬組成物の製造において使用することができる化合物(I)[式中、Rはヘテロシクリル基であり;RおよびRは、独立に、Hまたはアルキルであり;RはH、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり;RおよびRは、独立に、Hまたはアルキルであり;qは0および1から選択される数である];およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体に関する。
R−(CR)q−CO−N(R)−C(R)−CO−NH
(I)

Description

発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は医化学の分野であり、より具体的には、UBC13−UEV相互作用に対する阻害活性を有する治療化合物の開発、ならびに抗腫瘍療法を目的とするあるいはUBC13酵素を含む代謝経路、転写因子NF−κBを含む代謝経路、またはPCNAもしくはRAD6を含む経路に関連する疾病の治療および/または予防を目的とする医薬組成物の製造または使用に関する。
背景技術
ユビキチン化として知られるタンパク質の翻訳後修飾は、基質タンパク質のリジンとユビキチンペプチドのカルボキシ末端のグリシンとのイソペプチド結合の形成からなる[1]。ユビキチン(Ub)分子は、サイトゾル中や細胞核中に豊富に含まれている76個のアミノ酸を有するポリペプチドである。Ub分子は、ATPを必要とする反応においてUb分子を活性化するE1酵素(Ub活性化酵素)とチオエステル結合を形成し、結果としてE1酵素は、E2またはユビキチン結合酵素と呼ばれる第二のクラスの酵素の触媒システインとのチオエステル結合の形成を促進する状態となる。ヒトでは単一種のE1酵素が存在するが、一方、E2タイプの酵素は30種近く存在する可能性がある。E2酵素は、Ubのカルボキシ末端のグリシンと基質タンパク質のリジンとのイソペプチド結合の形成により、Ub分子を基質タンパク質へ転移することができる。ユビキチンユニットの共有結合付加による基質タンパク質の修飾は、モノユビキチン化と呼ばれている。同じE2酵素は、ユビキチン間でのイソペプチド結合の形成により、基質タンパク質と先に結合した別のUb分子へのUb分子の転移を触媒することができる。この反応は何度も繰り返すことができ、ポリユビキチン鎖の形成を引き起こす。このプロセスはポリユビキチン化として知られている。ユビキチン分子は7個のリジンを有し、ユビキチン間でイソペプチド結合を形成するのにそれらのうちのいずれもを使用することができる。異なるタイプのポリユビキチン鎖の存在量を決定する試験により、ポリユビキチン鎖の形成に最もよく使用されるユビキチン分子のリジンは、ユビキチンの29位、48位および63位に存在するものであることが示されている[2,3]。ポリユビキチン鎖の基質タンパク質における48位のリジン(K48)とのイソペプチド結合を通じての4以上のUbユニットの形成は、プロテアソーム調節粒子のサブユニットにより認識されるシグナルであり[4]、それによってそのように修飾されたタンパク質はプロセシングを受け、プロテアソームによって分解される。それに対して、ユビキチンの63位のリジン(K63)を通じてのイソペプチド結合によって形成されるポリユビキチン鎖はプロテアソームにより認識されないようであり[5]、そのためこのタイプのポリユビキチン化は修飾されたタンパク質のプロテアソームによるプロセシングおよび分解のシグナルではない。他の形式のポリユビキチン化の機能、または基質タンパク質において前記修飾によってもたらされる結果についてはほとんど分かっていない。ユビキチンのリジン48(K48)によるポリユビキチン化は「標準」ポリユビキチン化と呼ばれており、一方、他のリジンのいずれかを使用したポリユビキチン化は「非標準」または「変形」ポリユビキチン化と呼ばれている[6]。多くのE2はUbの転移を触媒して、K48またはK29タイプのポリユビキチン鎖を形成することができるが、一方、K63タイプのポリユビキチン鎖の形成には、ヘテロ二量体UBC13−UEV1またはUBC13−UEV2が特異的に必要であると思われる[6]。ポリユビキチン鎖の形成は、結合のタイプ(K48またはK63)に特異的なヒドロラーゼ(イソペプチダーゼ)の活性によって妨げられる。
ヘテロ二量体UBC13−UEV1およびK63タイプのポリユビキチン化を媒介するためのその活性を必要とする2つの生化学プロセスは、PCNA(増殖細胞核抗原)によって媒介されるDNA修復[7]およびTNFαまたはIL−1などのサイトカインによって開始されるシグナル伝達[8]である。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)酵母では、ヘテロ二量体Ubc13p−Mms2p(Mms2pはUEV1およびUEV2のオーソロガスS.セレビシエタンパク質である)は、PCNAの変形(K63 タイプ)ポリユビキチン化による修飾に不可欠であり[7−11]、エラーフリー」として知られるRAD6(ユビキチン結合酵素)依存性損傷乗り越えDNA修復経路に関与している[12−16]。このタンパク質PCNAは、S期開始時にSUMO化(SUMO分子の共有結合)により修飾され、それによりPCNAは安定し、細胞周期のこのS期の間、DNA複製において作用することができる[7,9]。S期以外では、PCNAは、ユビキチンリガーゼRad18pと関連しているRad6p結合酵素による標準ポリユビキチン化により修飾される。しかしながら、遺伝毒性障害を受けて、ヘテロ二量体Ubc13p−Mms2pの核侵入が起こり、そのヘテロ二量体Ubc13p−Mms2pは、Rad6pによって媒介される標準ポリユビキチン化による修飾と競合して、ユビキチンリガーゼRad5pと関連して、PCNAのK63タイプのポリユビキチン化を触媒し、そのためPCNAの分解を防ぐ。このようにして、ヘテロ二量体Ubc13p−Mms2pは、DNAにおけるニックの損傷乗り越え修復に使用することができる[7−11,17]。哺乳類では、PCNAは、UBC13UEV1(またはUBC13−UEV2)により媒介される変形ポリユビキチン化により修飾されることがはっきりと証明されていないため、S.セレビシエ酵母とは異なり、PCNA依存性DNA修復におけるこのタイプの基質修飾の役割は明らかでない。
哺乳類細胞では、UBC13−UEV1により触媒されるポリユビキチン化活性は、TNFαとその受容体との結合の後のTRAF2およびTRAF6アダプタータンパク質のヘテロ二量体化[18−20]、またはIL−1によって誘導されるTRAF6のヘテロ二量体化[21]に不可欠であることが証明されている。このヘテロ二量体化は、TRAF2またはTRAF6のユビキチンリガーゼ活性を刺激し、それによりK63タイプの鎖自己ポリユビキチン化のためのUBC13−UEV1を補充する。これらのK63ポリユビキチン鎖は、TAB2またはTAB3タンパク質により認識され、TAK1プロテインキナーゼと複合体を形成し、それを活性化し[22]、次に別のキナーゼ、IKKαをリン酸化し、活性化し、それにより細胞質NFκB阻害剤であるIκBのリン酸化および分解を導くシグナル伝達カスケードを開始する。このようにして、IκBは核に転座し、その転写調節作用を発揮することができる[18−22]。
よって、ヘテロ二量体UBC13−UEV1(またはUBC13−UEV2)は、サイトカイン(TNFα)によって媒介される炎症、および、少なくとも酵母における、遺伝毒性障害を受けての複製後修復と同じぐらい重要な2つのプロセスの不可欠なレギュレーターである。UBC13−UEV1(またはUBC13−UEV2)よって媒介されるK63タイプのポリユビキチン化を必要とする他の生物学的プロセス、例えば運動性[23]、リガンド依存性エンドサイトーシス[24]、または抗原T細胞活性化[25]がある。それゆえ、この翻訳後修飾よって媒介される可能性がある多くの生物学的プロセスがあり、それらの研究はほとんど始められていない新規分野の調査である。
UBC13およびUEVタンパク質によって形成されるヘテロ二量体の構造[26、27]は、最も際立った特徴が、UBC13における、上にUEVタンパク質(Mms2p、UEV1またはUEV2)の疎水性残基、とりわけ8位のフェニルアラニン、5位のプロリンおよび36位のイソロイシンもドッキングする2つの非常に区切られた疎水性ポケットの関与であるという相互作用界面を示す。これらの相互作用は、疎水性相互作用の両側に存在する極性残基を含む静電相互作用により安定化される。この配置はユビキチン結合酵素間で独特であるため、UBC13とUEVタンパク質のいずれか(Mms2p、UEV1およびUEV2)との相互作用に高度に特異的である[26−28]。UEVタンパク質との相互作用に関与するUBC13の疎水性ポケットによって区切られていることに加えて、この事実から、この界面はその相互作用を妨害するペプチドミメティック化合物を設計するための興味深い標的となる。このヘテロ二量体の形成の阻害は、その触媒活性、それゆえ関連基質のK63タイプのポリユビキチン化に影響を及ぼすはずであり、この翻訳後修飾が関与するプロセスの遮断を意味する。このような趣旨で、低分子ISG15タンパク質の共有結合によるUBC13の翻訳後修飾はその触媒活性を阻害することが証明されたことを指摘すべきである[29、30]。異なる生体系におけるUBC13の阻害の効果を研究するために、この観察結果は非常に興味深いが、ISG15修飾が多くの他のタンパク質に影響を及ぼすことを指摘しなければならない。
タンパク質表面の認識を目的とする、生物学的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用を変調する能力を有する分子の設計は、化学と生物学との合流点におけるバイオテクノロジーの最大の課題の1つと考えられており、治療学において膨大な可能性を有する。しかしながら、多数のプロテアソーム阻害剤[31,32]、またはユビキチン化に関連する酵素活性の特異的阻害剤[33,34]が開発され、報告されているが、K63タイプのポリユビキチン鎖の形成についての阻害剤も、他のタイプのポリユビキチン鎖(K48、K29、K6など)の形成についての特異的阻害剤も一切、現在まで報告されていない。同様に、UBC13ユビキチン結合酵素の他の薬理学的阻害剤はいずれも分かっていない。
本発明は、UBC13−UEV相互作用に対する阻害活性またはUBC13の酵素活性に対する阻害活性を有する式(I)の新規ファミリーの化合物に関し、それゆえ、該化合物は、抗腫瘍療法においてあるいはUBC13酵素を含む代謝経路または転写因子NF−κBを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および/または予防において有用である。
本発明において、表現「UBC13酵素を含む代謝経路または転写因子NF−κBを含む代謝経路に関連する病態または疾病」には、UCB13またはNF−κBは該疾病/病態において直接の因果的役割を有していないが、UCB13またはNF−κBが該疾病/病態の発症にある程度関与しているという疾病が含まれ、それゆえに、本発明の式(I)の化合物は、抗腫瘍療法においてあるいはUBC13酵素を含む代謝経路または転写因子NF−κBを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および/または予防において有用である。
よって、本発明の第一の態様は、式(I)の化合物、ならびに下記に記載するその塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体(本発明の化合物)に関する。
本発明の第二の態様は、前記式(I)の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体を合成するための方法に関する。
本発明のさらなる態様は、医学的使用のための式(I)の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体に関する。
本発明の別のさらなる態様は、UBC13酵素を含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および/または予防を目的とする医薬品を製造するための、式(I)の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体の使用に関する。
本発明の別のさらなる態様は、転写因子NF−κBを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および/または予防を目的とする医薬品を製造するための、式(I)の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体の使用に関する。
別のさらなる態様では、本発明は、抗腫瘍療法を目的とする医薬品を製造するための、式(I)の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物の使用に関し、該医薬品は、化学または放射線感作作用をもたらすPCNAおよびRAD6によって媒介される遺伝毒性障害耐性経路のアンタゴニストであるか、あるいは化学または放射線感作作用をもたらすPCNAおよびRAD6によって媒介される遺伝毒性障害耐性経路を阻害する。
同様に、本発明の別のさらなる態様は、抗腫瘍薬による処置に対する哺乳類の感受性を高めるための医薬品の製造における、式(I)の化合物の使用に関する。
最後に、本発明の別の態様は、治療上有効な量の式(I)の化合物、またはその薬学上許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物もしくは立体異性体を、薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとともに含んでなる医薬組成物に関する。
発明の具体的説明
タンパク質表面の認識を目的とする、生物学的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用を変調する能力を有する分子の設計は、化学と生物学との合流点におけるバイオテクノロジーの最大の課題の1つと考えられており、治療学において膨大な可能性を有する。
この意味において、UBC13酵素は、新規治療化合物を設計するための有望な治療標的である。結果として、UBC13とUEV1との相互作用を競合的に妨害することができる小分子の同定を可能にする方法を設計し、その出発仮説は、この相互作用を阻害することによりK63タイプのポリユビキチン鎖を形成するUBC13の能力を阻害するというものであった。この薬理学的開発に適用される方法論は、一方で、阻害化合物のバイオアベイラビリティ(すなわちそれらの細胞内局在および侵入能力)を、他方で、UBC13−UEV1相互作用の妨害の特異性を、そして、最後に、UEV1と相互作用するためにUBC13によって使用される表面に対するこれらの小分子の空間および電荷調整を優先する。本発明において行われる方法は、以下を連続的に組み合わせている:
(1)酵母2−ハイブリッドアッセイにより判定される、この相互作用を特異的に阻害する能力を有するものを選抜するための、N−アルキルグリシン(ペプトイド)のコンビナトリアルケミカルライブラリーの試験的スクリーニング。関連するタンパク質−タンパク質相互作用の制御を利用することから、用いるスクリーニング法では、小分子のバイオアベイラビリティと、UBC13とUEV1との相互作用の阻害の特異性の両方にアプローチすると同時に解決することが可能である。
(2)前工程において選択されたペプトイドのUBC13の表面における分子ドッキングを判定するためのコンピューターによる最適化。
(3)UBC13−UEV1相互作用に対する阻害活性を有する薬効のある小分子の合成。前工程において得られた仮想最適化データをこの合成のガイドラインとして用いた。
(4)前工程において合成された化合物のin vitroおよびin vivo機能効果の特性評価。この特性評価には、UBC13−UEV1のユビキチン結合活性を阻害し、さらにこの酵素によって調節されることが分かっている細胞プロセスのいくつかを妨害するこれらの化合物の能力の判定が含まれた。図1は、この薬理学的開発のために従う工程および方法図式的に示す。このスクリーニングに用いたコンビナトリアルモジュールケミカルライブラリーの一般構造(II)を以下に示す:
(式中、R、RおよびRは、それぞれ、前記ケミカルライブラリーの構築に用いられた化学的多様性を表す)[35]。
このようにして、本発明の発明者らは、UBC13タンパク質とUEVタンパク質(Mms2p、UEV1およびUEV2、実施例4参照)との相互作用を阻害することができ、この酵素のタイプK63ポリユビキチン化活性を競合的に阻害し、薬理学上有効な濃度において生物学的効果をもたらすことができる一般式Iを有する新規ファミリーの化合物を同定した。これらの化合物は、UBC13タンパク質とUEV1タンパク質との正確な相互作用を競合的に阻害するため、「K63タイプのポリユビキチン化」として知られるモードでポリユビキチン鎖を形成するそれらの酵素活性を阻止し、後者はこれらの化合物が活性を発揮する機構である(実施例5)ため、次にはこのK63タイプポリユビキチン化によって変調される総ての生化学的経路および生物学的プロセスも変調する。
本発明の薬物対象の生物活性は、UBC13−UEV1、UBC13−UEV2およびUbc13p−Mms2pによって媒介される変形ポリユビキチン化(variant polyubiquitylation variant)によって通常調節される生化学的経路を反映する。特に、このヘテロ二量体酵素によって媒介されるポリユビキチン化は、一方で、RAD6依存性「エラーフリー」経路として知られる経路によるDNA修復を(実施例6)、他方で、サイトカインおよび他の刺激により誘導される転写因子NF−κBの活性化を調節する。この活性の結果として、これらの薬物は、サッカロミセス・セレビシエ酵母細胞と哺乳類細胞(子宮頸癌および前立腺癌それぞれに由来するHeLaおよびPC−3)の両方を、物理的または化学的作用因子(紫外線、メタンスルホン酸メチルまたはドキソルビシンなど)の細胞傷害作用に対して感作する(実施例8)。これらの薬物の活性についての別の生物学的結果は、薬理学上有効な濃度においての、サイトカイン(TNFαなど)による転写因子NF−κB活性化の阻害であり(実施例7)、これらの薬物は従来の抗悪性腫瘍薬の細胞傷害効果を高める。これらの活性から、本発明の薬物対象には、少なくとも2つのタイプの医学的用途がある:
(1)DNAを損傷または修飾する細胞傷害活性を有する化学的または物理的作用因子(遺伝毒性薬)に対する腫瘍細胞の感作。この感作によりかかる遺伝毒性薬の治療上有効な用量を低減しなければならず、そのためかかる作用因子の望ましくない副作用のいくつかが軽減される。
(2)炎症性サイトカインおよびケモカインの活性化を提示する病態における抗炎症効果。
これらの新規薬物は、さらに、UBC13−UEV1(UBC13−UEV2)の活性および種々の形式のユビキチン化およびポリユビキチン化により調節される他の活性を調査するためのツールである。
手短に言えば、新規治療標的となるこのUBC13酵素の薬理学的阻害剤の前例がないことから、これらの化合物は、新規クラスの薬物にさらに相当し、抗新生物、抗炎症用途に関して、さらにUBC13酵素およびK63タイプの非標準ポリユビキチン化を含む代謝経路に関連する他の複数の病理学的プロセスにおいて、独自の新規薬理学的アプローチに相当する。
式(I)の化合物
本発明の第一の態様は、式(I):
R−(CR)q−CO−N(R)−C(R)−CO−NH
[式中、
Rは基:
であり、ここで、
は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換シクロアルキルアルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アリール、置換または非置換アリールアルキル、置換または非置換ヘテロシクリル、および置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり;
Aは、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロシクリルから選択される基であり;
およびRは、H、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され;
oは、0、1、2、3および4から選択される数であり;
nは、0および1から選択される数であり;
直線−は、R基と式(I)の分子の残りの部分との結合部位を示し;
およびRは、H、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され;
は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換シクロアルキルアルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アリール、置換または非置換アリールアルキル、置換または非置換ヘテロシクリル、および置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり;
およびRは、H、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され;
qは、0および1から選択される数である]
の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体に関する。
本発明はまた、本発明の化合物の塩も提供する。例えば、本明細書において提供される化合物の薬学上許容される塩は、酸付加塩、塩基付加塩または金属塩であり得、従来の化学的方法によって塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。かかる塩は、例えば、水中でまたは有機溶媒中でまたはそれら2つの混合物中で、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を化学量論量の好適な塩基または酸と反応させることにより一般に調製される。エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリロ(acetonitrilo)などの非水性媒質が一般に好ましい。酸付加塩の例としては、無機酸付加塩(例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩など)、有機酸付加塩(例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびp−トルエンスルホン酸塩など)が挙げられる。アルカリ付加塩としては、無機塩(例えば、アンモニウム塩など)および有機アルカリ塩(例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、N,N−ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、グルタミンおよび塩基性アミノ酸塩など)が挙げられる。金属塩の例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルミニウム塩およびリチウム塩が挙げられる。
用語「薬学上許容される」とは、生理学的に許容され、かつヒトに投与したときに。アレルギー反応または類似の有害反応(胃の不快感、めまいなど)を通常引き起こさない分子実体および組成物に関する。好ましくは、本明細書において、用語「薬学上許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって認可されているか、または動物、より詳しくはヒトにおけるその使用について米国薬局方(the US pharmacopoeia)または別の一般に有名な薬局方に記載されていることを意味する。
当業者には、薬学上許容される塩を得るための可能な手段として薬学上許容されない塩も本発明の範囲に含まれることは明らかであろう。
本発明の化合物は、遊離化合物としてまたは溶媒和物として結晶形態であり得、両方の形態は本発明の範囲内であることが意図される。この意味において、本明細書における用語「溶媒和物」には、両方の薬学上許容される溶媒和物、すなわち医薬品の製造において使用することができる式(I)の化合物の溶媒和物と、薬学上許容される溶媒和物または塩の調製において有用であり得る薬学上許容されない溶媒和物が含まれる。薬学上許容されるならば、薬学上許容される溶媒和物の性質は重大ではない。溶媒和物は、当業者に周知の従来の溶媒和法によって得ることができる。溶媒和物の例としては、水和物およびアルコラート、好ましくは、C−Cアルコラート、例えば、メタノラートが挙げられる。
本明細書における用語「プロドラッグ」には、個体に投与すると、該個体内で該式(I)の化合物を直接または間接的に提供することができる、式(I)の化合物の任意の誘導体化合物、例えば、エステル(カルボン酸エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、金属塩スルホン酸エステルなどを含む)、カルバメート、アミドなどが含まれる。有利には、前記誘導体は、個体に投与すると、式(I)の化合物のバイオアベイラビリティを増加するか、または生物学的コンパートメント内での式(I)の化合物の放出を促進する化合物である。個体に投与することができ、式(I)の化合物が個体の生物学的コンパートメント内で供給されるならば、前記誘導体の性質は重大ではない。前記プロドラッグは、当業者に公知の従来の方法によって調製することができる。
本発明に、本明細書に記載される化合物の考えられるあらゆる異性体が含まれるということは当業者には直ちに明らかであろう。従って、多重結合の存在に応じて、本発明の化合物にZおよびE異性体が含まれ得る。キラル中心の存在に応じて、光学異性体または鏡像異性体も含まれる。個々の異性体、鏡像異性体またはジアステレオ異性体およびその混合物は、本発明の範囲内である。個々の鏡像異性体またはジアステレオ異性体、ならびにその混合物は、従来の技術によって分離することができる。
立体異性体は、当業者には、同じ一連の結合によって結合している同じ原子から形成された、代替不可能な異なる三次元構造を有する化合物として理解される。
療法に適用する場合には、式(I)の化合物、その異性体、塩、プロドラッグまたは溶媒和物は、好ましくは薬学上許容されるまたは実質的に純粋な形態であり、すなわち希釈剤および担体などの通常の医薬品添加物を除いて、通常の投与量レベルにおいて有毒であると考えられる材料を含まない薬学上許容される純度レベルを有する。有効成分の純度レベルは、好ましくは50%より高く、より好ましくは70%より高く、より好ましくは90%より高い。好ましい実施態様では、有効成分の純度レベルは、式(I)の化合物またはその塩、溶媒和物もしくはプロドラッグのの95%より高い。
特に断りのない限り、本発明の化合物には、1以上の同位体濃縮原子の存在のみが異なる化合物も含まれる。例えば、重水素によるまたは三重水素による水素の置換、あるいは13Cまたは14C濃縮炭素または15N濃縮窒素による炭素の置換を除き、前記構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。
本発明に記載される化合物、その薬学上許容される塩、プロドラッグおよび/または溶媒和物ならびにそれらを含む医薬組成物は、他の追加薬物とともに使用して、併用療法を提供することができる。前記追加薬物は、同じ医薬組成物の一部をなし得るし、あるいは、式(I)の化合物、またはその薬学上許容されるプロドラッグ、溶媒和物、誘導体もしくは塩を含んでなる医薬組成物の投与と同時であろうとなかろうとその投与のために別個の組成物として提供することができる。
本明細書に記載される化合物の定義において、次の用語は示されている意味を有する。
「アルキル」とは、炭素原子と水素原子によって構成され、不飽和を含まず、1〜6個、好ましくは1〜4個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りの部分に結合されている、直鎖または分枝鎖炭化水素基に関し、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、i−プロピル、n−ブチル、t−ブチル、n−ペンチルなどがある。
「アルケニル」とは、炭素原子と水素原子によって構成され、少なくとも1つの不飽和を含み、2〜6個、好ましくは2〜4個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りの部分に結合されている、直鎖または分枝鎖炭化水素基に関する。
「シクロアルキル」とは、3〜6個の間の炭素原子を有する飽和炭素環式環に関する。好適なシクロアルキル基としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルなどのシクロアルキル基が挙げられる。
「シクロアルキルアルキル」とは、アルキル基によって分子の残りの部分に結合されているシクロアルキル基に関し、例えば、シクロペンチルエチルがある。
「アルキニル」とは、炭素原子と水素原子によって構成され、少なくとも1つの共役または非共役炭素炭素三重結合を含み、2〜6個、好ましくは2〜4個の炭素原子を有し、単結合によって分子の残りの部分に結合されている、直鎖または分枝鎖炭化水素基に関し、例えば、−CCH、−CHCCH、−CCCH、−CHCCCHがある。
「アリール」とは、6個の炭素原子を有する芳香族炭化水素基に関し、例えば、フェニルがある。
「アリールアルキル」とは、アルキル基によって分子の残りの部分に結合されているアリール基に関し、例えば、ベンジルおよびフェネチルがある。
「ヘテロシクリル」とは、炭素原子と、窒素、酸素および硫黄からなる群から選択される1〜4個の間のヘテロ原子からなる3〜6員の安定な環、好ましくは、1、2、3または4個のヘテロ原子を有する4〜6員の環、より好ましくは、1、2または3個のヘテロ原子を有する5または6員の環に関する。本発明の目的では、複素環は単環式環系である。ヘテロシクリル基中の窒素、炭素または硫黄原子は場合によって酸化されていてもよく、窒素原子は場合によって第四級化されていてもよく、ヘテロシクリル基は部分的または完全に飽和されていてもよく、あるいは芳香族であってもよい。このような複素環の例としては、限定されるものではないが、アゼピン、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、フラン、イソチアゾール、イミダゾール、インドール、ピペリジン、ピペラジン、チアジアゾール、テトラヒドロフランが挙げられる。
「ヘテロシクリルアルキル」とは、アルキル基によって分子の残りの部分に結合されている複素環式基に関し、例えば、ピリミジニルエチルがある。
特に断りのない限り、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキル基は、場合によって、ハロ(フッ素、塩素または臭素)、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、スルホキシ、o−ベンジル、o−ベンゾイル、カルボキシ、シアノ、カルボニル、アシル、アルコキシカルボニル、スルホニル、スルホニルアミノ、アミノ、イミノおよびニトロなどの1、2または3個の置換基で置換されていてもよい。
「アルコキシカルボニル」とは、式−C(=O)O−(式中、C末端はその分子に結合され、O末端は炭素原子に結合されており、エステル官能基を形成している)を有する化合物に関する。前記炭素原子はアルキル、アルケニル、シクロアルキル、アルキニル、アリール、アラルキルまたはヘテロシクリル基の一部であり得る。
本発明の好ましい実施態様によれば、式(I)の化合物において、Rは、H、置換または非置換アリールアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり、Rは、H、置換または非置換アリールアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基である。
別のより好ましい実施態様によれば、Rは、置換または非置換フェニルプロピル、置換または非置換フェニルエチル、置換または非置換ベンジル、置換または非置換フリルプロピル、置換または非置換フリルエチル、置換または非置換フリルメチル、置換または非置換イミダゾリルプロピル、置換または非置換イミダゾリルエチル、置換または非置換イミダゾリルメチル、置換または非置換ピリジニルプロピル、置換または非置換ピリジニルエチル、置換または非置換ピリジニルメチル、置換または非置換ピペリジニルプロピル、置換または非置換ピペリジニルエチルおよび置換または非置換ピペリジニルメチルから選択される基であり;Rは、置換または非置換フェニルプロピル、置換または非置換フェニルエチル、置換または非置換ベンジル、置換または非置換フリルプロピル、置換または非置換フリルエチル、置換または非置換フリルメチル、置換または非置換イミダゾリルプロピル、置換または非置換イミダゾリルエチル、置換または非置換イミダゾリルメチル、置換または非置換ピリジニルプロピル、置換または非置換ピリジニルエチル、置換または非置換ピリジニルメチル、置換または非置換ピペリジニルプロピル、置換または非置換ピペリジニルエチル、および置換または非置換ピペリジニルメチルから選択される基である。
さらにより好ましい実施態様によれば、Rは、フッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルカルボニル、アルキルアミノ、スルホンアミノ、シアノ、ニトロ、ニトライト、ニトレート、チオニトレートおよびカルボキサミドから選択される1以上の基で置換されている基である。
本発明の別のさらなる実施態様によれば、Rは、フッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルカルボニル、アルキルアミノ、スルホンアミノ、シアノ、ニトロ、ニトライト、ニトレート、チオニトレートおよびカルボキサミドおよび塩から選択される1以上の基で置換されている基である。
本発明の他の異なる実施態様によれば、Rは、p−フルオロフェニルエチルまたは2,4−ジクロロフェニルエチル基であり;置換基Aは置換または非置換アリールであり;置換基Aは塩素、フッ素および/または臭素で置換されているフェニルであり、oは1、2および3から選択される数であり;RおよびRは双方ともHであり、oは2であり、Aはp−フルオロフェニルであり;Rは2−ピリミジニルエチル、2,4−ジクロロフェニルエチルまたは4−メトキシフェニルエチルであり;nは1であり;nは0であり;qは0であり;qは1である。
本発明の好ましい実施態様は、式(Ia)の化合物:バルビン(Varubin)と呼ばれる(N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロ−フェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド):
、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体によって構成される。
本発明のもう1つの好ましい実施態様は、式(Ib)の化合物:(1,4−ビス[2’−(4’’フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’−ピリジル)エチル)−カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン):
、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体によって構成される。
他の好ましい実施態様は、下記化合物:
N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(2’’−ピリジル)エチル)−1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)−1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン;
1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン;
1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン;
N−アミノカルバモイルメチル−N−[2’−{2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
[1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン
によって構成される。
その第二の態様では、本発明は、前記式(I)の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体を合成するための方法に関する。式(I)の本発明の化合物は、化学合成経路の手段によって入手または製造することができるか、あるいは種々の起源の天然材料から得ることができる。本願は、固相合成に基づく式Iの本発明の化合物の合成経路を記載する。本発明の2つの化合物式(Ia)および(Ib)の固相合成スキームを以下に示す。当業者には、下記に示される2つのスキームおよび実施例3)によって示されるこの種の合成を式(I)に含まれる残りの化合物にも適用できることが明らかである。
スキームI:式Ia化合物:(N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロ−フェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド)の合成
スキームII:式Ibの化合物:(1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’−ピリジル)エチル)−カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン)の合成
本発明のもう1つのさらなる態様は、患者に投与するための、治療上有効な量の少なくとも1つの式(I)の化合物、またはその薬学上許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物もしくは立体異性体を、薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとともに含んでなる医薬組成物(以下、本発明の医薬組成物)によって構成される。
本発明のもう1つのさらなる態様は、式(I)の化合物が下記:N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド(Ia)またはそのR、S鏡像異性体形態および/もしくはラセミ混合物のいずれかである、本発明の医薬組成物によってによって構成される。
本発明の別の特定の実施態様は、式(I)の化合物が下記:1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)カルボニル−メチル]ピペラジン−3,6−ジオン(Ib)、またはそのR、S鏡像異性体形態および/もしくはラセミ混合物のいずれかである、本発明の医薬組成物によってによって構成される。
本発明の別の特定の実施態様は、化合物(I)が
N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(2’’−ピリジル)エチル)−1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)−1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン;
1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン;
1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン;
N−アミノカルバモイルメチル−N−[2’−{2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;および
[1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン
から選択される本発明の医薬組成物によって構成される。
前記組成物に使用することができる薬学上許容されるアジュバントおよびビヒクルは、当業者に公知であり、治療組成物の製造において通常使用されるアジュバントおよびビヒクルである。
本記載において使用される意味において、表現「治療上有効な量」とは、所望の効果をもたらすように算出された、UBC13酵素の阻害を起こすことができる作用因子または化合物の量に関し、いくつかある要因の中で特に、該化合物の典型的な特徴(患者の年齢、状態、変化または障害の重篤度、ならびに(and on)投与の経路および頻度を含む)により一般に決定される。
別の特定の実施態様では、前記治療組成物は、固体形態または薬学上許容される希釈剤中の水性懸濁液として調製される。本発明によって提供される治療組成物は、任意の好適な投与経路により投与することができ、そのために、前記組成物は、選択される投与経路に好適な投与形の処方とされる。特定の実施態様では、本発明によって提供される治療組成物は、経口的に、局所的に、直腸にまたは非経口的に(皮下に、腹膜内に、皮内に、筋肉内に、静脈内になどを含む)投与される。医薬品の投与のための異なる投与形およびそれらを得るために必要な賦形剤についての概説は、例えば、E. W. Martinによる“Tratado de Farmacia Galenica”, C. Fauli i Trillo, 1993, Luzan 5, S. A. Ediciones, Madrid, in “Remington’s Pharmaceutical Sciences”またはスペインおよび米国薬局方の他の通常または類似のものにおいて見い出すことができる。
本発明において使用する化合物の有効な投与量は、選択した化合物の相対的有効性、処置を受ける障害の重症度、または年齢、体重もしくは投与方法によって一般に決まるであろう。それでもなお、前記活性化合物は、通常、0.01〜100mg/kg/日の範囲の典型的な1日総用量で1日1回以上、例えば1日1回、2回、3回、または4回投与される。
本発明において使用する化合物は、併用療法を提供するために他の薬物とともに投与することもできる。前記他の薬物は、同じ組成物の一部をなし得るし、あるいは、その投与のために別個の組成物として同時にまたは異なる時間に投与することができる。
本発明のさらなる態様は、医学的使用のための、式(I)の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物に関する。
本発明の別のさらなる態様は、UBC13酵素を含む代謝経路の変化と関連している病態または疾病の治療および/または予防における、式(I)の化合物、その塩、溶媒和物、プロドラッグおよび立体異性体、またはその混合物の使用に関する。
本発明の別のさらなる態様は、UBC13酵素を含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および/または予防を目的とする医薬品を製造するための、式(I)の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物の使用に関する。
特定の実施態様では、UBC13酵素を含む代謝経路に関連する前記病態または疾病は炎症性および自己免疫疾患である。好ましい実施態様では、前記炎症性および自己免疫病態または疾病は、炎症性腸疾患、炎症性関節病態、アトピー性皮膚炎および他の炎症性皮膚科病態、神経炎、脳炎、脳脊髄炎および中枢神経系または末梢神経系に影響を及ぼす炎症性病態、筋炎、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、炎症を呈する感染性疾患、宿主対移植片拒絶反応、結膜炎および炎症性眼症、耳炎または口腔粘膜炎:であり得る。
別の特定の実施態様では、UBC13酵素を含む代謝経路に関連する前記病態または疾病は癌または新生物であり、限定されるものではないが、いかなる組織起源のいかなるタイプの良性または悪性新生物も含まれ、中でも、限定されるものではないが、いかなるタイプの癌腫(前立腺癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、甲状腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮および子宮頸癌を含む)も、いかなるタイプの肉腫(骨肉腫、軟組織肉腫および血管肉腫を含む)も、いかなるタイプの造血器腫瘍(白血病およびリンパ腫を含む)も、いかなるタイプの神経系腫瘍(神経芽腫、膠芽腫および星状細胞腫を含む)も、いかなる皮膚科癌(黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌を含む)も含まれる。
本発明の別のさらなる態様は、転写因子NF−κBを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および/または予防を目的とする医薬品を製造するための、式(I)の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物の使用に関する。特定の実施態様では、前記病態または疾病は炎症プロセスまたは新生物プロセスである。
別のさらなる態様では、本発明は、抗腫瘍療法を目的とする医薬品を製造するための、式(I)の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体、またはその混合物の使用に関し、該医薬品は、化学または放射線感作作用をもたらすPCNAおよびRAD6によって媒介される遺伝毒性障害耐性経路のアンタゴニストであるか、あるいは該遺伝毒性障害耐性経路を阻害するものである。
本発明の別のさらなる態様は、抗腫瘍薬による処置に対する哺乳類の感受性を高めるための医薬品の製造における式(I)の化合物の使用に関する。
本発明において、「抗腫瘍薬」とは、腫瘍の成長、増殖および/または発生を阻害するために使用することができる抗増殖性、抗発癌性および/または制癌性を有する化学的、物理的または生物学的化合物または作用因子として理解される。
本発明において使用することができる抗腫瘍薬の例は、(i)アルキル化剤(スルホン酸アルキルおよびエチレンイミン誘導体など);(ii)代謝拮抗物質(葉酸拮抗薬およびプリン類似体など);(iii)天然物(抗腫瘍抗生物質および分裂抑制因子など);(iv)ホルモンおよびそのアンタゴニスト(アンドロゲンおよびコルチコステロイドなど);(v)生物学的作用因子(ウイルスベクターなど);ならびに(vi)物理的作用因子(異なるタイプの照射源によって生成される電離放射線(放射線治療薬)など)である。抗腫瘍薬として使用することができる化合物のリストは、特許出願WO2005/112973に記載されている。
本発明の特定の実施態様では、前記抗腫瘍薬はドキソルビシンまたはエトポシドである。
式(I)の化合物は、抗腫瘍薬による処置に対して哺乳類を感作することができるような量で該哺乳類に投与する必要がある。本発明において、「有効な感作量」とは、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトに投与したときに、抗腫瘍薬に対してまたは任意の他の抗腫瘍療法/処置に対して該哺乳類を感作するのに十分な式(I)の化合物の量として定義される。抗腫瘍薬に対して感作効果をもたらすのに必要な、腫瘍組織における式(I)の化合物の有効濃度は、0.01ナノモル〜100マイクロモルの間であり、、任意の経路によって前記被験体に投与しなければならない該化合物の用量は、該腫瘍内濃度に達するように調整しなければならない。哺乳類を「感作する」との用語には、
(i)いかなる抗腫瘍薬または抗腫瘍処置もこれまでに受けたことのない哺乳類(「初回感作」)において抗腫瘍薬または抗腫瘍療法/処置の有効性を高めること
、ならびに/あるいは
(ii)抗腫瘍薬または抗腫瘍処置をすでに受けたことがあり、その抗腫瘍薬または抗腫瘍処置に対してこれまでに抵抗性を提示したかどうかはわからない哺乳類において抗腫瘍薬または抗腫瘍療法/処置の有効性を高めること
が含まれる。
本発明において検討することができる抗腫瘍処置は、例えば、白金化合物(カルボプラチンまたはシスプラチンなど)による、場合によって、ゲムシタビンまたはタキサン(ドセタキセルまたはパクリタキセルなど)と組み合わせての処置である。抗腫瘍処置のさらなる例は、特許出願WO2005/112973において見い出すことができる。
前記抗腫瘍薬による処置に対する哺乳類の感受性を高めるための医薬品の製造において式(I)の化合物を使用することによって効果的に治療することができる癌としては、哺乳類の癌、とりわけ癌または新生物が挙げられ、限定されるものではないが、いかなる組織起源のいかなるタイプの良性または悪性新生物も含まれ、中でも、限定されるものではないが、いかなるタイプの癌腫(前立腺癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、甲状腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮および子宮頸癌を含む)も、いかなるタイプの肉腫(骨肉腫、軟組織肉腫および血管肉腫を含む)も、いかなるタイプの造血器腫瘍(白血病およびリンパ腫を含む)も、いかなるタイプの神経系腫瘍(神経芽腫、膠芽腫および星状細胞腫を含む)も、いかなる皮膚科癌(黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌を含む)も含まれる。
最後に、本発明の別のさらなる態様は、治療上有効な量の式(I)の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体を、薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとともに含んでなることを特徴とする医薬組成物に関する。特定の実施態様では、前記医薬組成物は、治療上有効な量の少なくとも1種の第二の治療薬をさらに含んでなり、本発明の別のさらに特定の実施態様では、該少なくとも1種の第二の治療薬は、式(I)の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体である。
実施例1.UBC13−UEV1相互作用を妨害することができるペプトイド(N−アルキルグリシン)を同定するための試験的スクリーニング
UBC13とUEV1との相互作用を酵母2−ハイブリッドアッセイによって検出する。次の実施例において使用されるUBC13およびUEV1のタンパク質型はヒト(Homo sapiens)のものである。UBC13タンパク質は、UBE2N(HUGO命名法)とも呼ばれ、次の識別子を有する:NCBI−GI:4507793、UniProt:P61088および[EC:6.3.2.19]。UEV1タンパク質は、UBE2V1(HUGO命名法)とも呼ばれ、次の識別子を有する:NCBI−GI:73765546およびUniProt:Q13404。このアッセイでは、UBC13を、プラスミドpBD−UBC13からGal4 DNA−結合ドメイン(DBD−UBC13)との融合タンパク質として発現させ、UEV1を、プラスミドpACT2−UEV1からGal4転写活性化ドメイン(AD−UEV1)との融合タンパク質として発現させる。両方のプラスミドをサッカロミセス・セレビシエ株AH109において同時トランスフェクトし、ロイシンまたはトリプトファンを含まないYPD培地を入れたプレートで増殖させ、これら2つのアミノ酸に対するtRNAシンターゼ、すなわち2つの同時トランスフェクトしたプラスミドを含むものを発現しているコロニーだけを選抜する。株AH109には、そのゲノム内に2つの人工遺伝子座が組み込まれており:1つの遺伝子座は、ヒスチジル−tRNAシンターゼの遺伝子の前にGAL1プロモーターに結合したGal4 DBDの認識配列を含み;別の遺伝子座は、ADE2遺伝子の前にGAL2プロモーターに結合したGal4 DBDを含み、第三の遺伝子座は、β−ガラクトシダーゼ酵素のlacZ遺伝子の前にMEL1プロモーターに結合したGal4 DBDの認識配列を含む。一方で、Gal4 DBDドメインを、他方で、転写活性化ドメインを含む転写因子を株AH109において発現させることで、His−tRNAシンターゼの発現を誘導し、ヒスチジンフリー培地での増殖が可能になり、同時に、好適な基質を用いて酵素活性を比色定量により検出可能であるβ−ガラクトシダーゼの発現も誘導する。DBD−UBC13およびAD−UEV1の発現および物理的相互作用は、Gal4の結合部位と関連しているプロモータを活性化することができる転写因子を、これら2つの遺伝子座のプロモーター上に置く。そのため、プラスミドpBD−UBC13およびpACT2−UEV1で同時トランスフェクトしたAH109細胞のヒスチジンフリー培地での増殖は、UBC13タンパク質とUEV1タンパク質との物理的相互作用が存在することを示す。さらに、この相互作用の程度は、基質としてO−ニトロフェニル−p−ガラクトピラノシド(ONPG)を使用した、β−ガラクトシダーゼ活性の比色定量によって良好な近似値で推測することができ、この酵素活性のレベルはUBC13とUEV1との相互作用の強さに正比例する。
トリアルキルグリシン(ペプトイド)の基づくコンビナトリアル混合物および個別化合物の合成を以下のとおり行った:固相上での位置スキャニング形式による52種の制御された混合物における5120種のペプトイドの最適化ケミカルライブラリー[35]。このライブラリーは、52種の制御された混合物および合計5120種の化合物からなる。混合物1〜20(OXX)には、定義された位置として、選択された、市販の20種の第一級アミンのうちの1種を含め、一方、「X」位置(混合物位置)に16種の第一級アミンの一群を使用した。混合物21〜36(XOX)および37〜52(XXO)には、定義された位置に16種のアミンの群だけを含めた[36]。要約すれば、8つの合成工程による方法をRinkアミド樹脂(0.7m当量/g、Rapp Polymere,Tubingen,Germany)のFmoc保護基の解離で開始した。次いで、クロロ酢酸およびジイソプロピルカルボジイミドを用いてアシル化工程を行い、続いて個別アミンまたはアミンの混合物を用いてクロロメチル化中間体の対応するアミノ化を行った。その後、トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水の混合物を用いて樹脂から生成物を切断し、溶媒を蒸発させ、その残渣を凍結乾燥し、10%ジメチルスルホキシドに5mg/mLの濃度に再び溶かした。上記合成順序を適用して、独立した固相合成によって個別ペプトイドを調製した。高速液体クロマトグラフィー、質量分析およびHおよび13C NMRによって個別N−アルキルグリシンの純度を決定し、同定した。本明細書において示した一般構造(II)は、本発明において使用するコンビナトリアルケミカルライブラリーを構成しているN−アルキルグリシン(ペプトイド)の一般化学構造を示す。
UBC13とUEV1との相互作用を阻害することができるペプトイドを酵母2ハイブリッドアッセイによりスクリーニングするために使用される方法を以下に記載する。HepG2細胞系統から逆転写(retrotranscription)およびPCRによってUBC13およびUEV1に対応する相補的DNAを作製した。UBC13を、Gal4 DNA−結合ドメインに従って、ベクターpBD(Stratagene, La Jolla, California, USA)にサブクローニングし、プラスミドpBD−UBC13を作製した。UEV1を、Gal4のトランス活性化ドメインに従って、ベクターpACT2(Clontech)にサブクローニングし、プラスミドpACT2−UEV1を作製した。これらのプラスミドPBD−UBC13およびPACT2−UEV1をサッカロミセス・セレビシエ株AH109中に同時トランスフェクトした。この目的に向けて、最近調製されたコンピテント酵母細胞を前記プラスミドのDNAと、ポリエチレングリコール−酢酸リチウムの溶液(40%PEG、100mM酢酸リチウム、10mM Tris、1mM EDTA)中の担体としてのニシン精巣DNAとともに混合し、攪拌しながら30℃で30分間インキュベートした。次いで、7%ジメチルスルホキシドを加え、前記細胞を水浴中で42℃で30秒間熱ショックに供し、直後に氷上で冷却を行った。それらの細胞を1000gで遠心分離し、TEバッファー(10mM Tris−ClH、pH7.5mM、1mM EDTA)中に再懸濁し、最少培地プレートに播種して、HIS3マーカー、ADE2マーカーおよびLacZマーカーを発現している細胞の選抜を可能にする。増殖の3日後、増殖陽性の(それゆえ、UBC13−UEV1相互作用陽性の)コロニーを選抜し、5mLの最少培地で攪拌しながら30℃で一晩増殖させた。さらに、それを、0.1mMの混合物濃度で52種のペプトイド混合物のうちの1種を含む新しい増殖培地に変更し、30℃で一晩インキュベートした。その培養の吸光度(光学密度またはOD)を695nmで決定し、0.1mMで同じペプトイド混合物を含むYPD培地で初期OD695 0.2を有する新しい培養物を攪拌下30℃で調製し、OD695 0.8に達するまで3〜4時間増殖させた。その時点で、その培養物を遠心分離し、細胞ペレットをZバッファー(16g/L NaHPO、5.50g/L NaHPO、0.75g/L KCl、0.246g/L MgSO pH7.0)に再懸濁し、液体窒素(1分)−37℃(1分)での凍結融解サイクルによって粉砕した分画した。160μLのβ−ガラクトシダーゼ基質、O−ニトロフェニル−ガラクトピラノシド(ONPG、Zバッファー中4mg/mL)をすぐに加え、目に見える基質(黄色)が形成するまで30℃でインキュベートした。0.4mLの1M NaCOを加えることによって反応を停止させ、30分間インキュベートし、続いて遠心分離を行った。この上清を420nmで分光光度を測定するためのセルに移した。本明細書では、1単位のβ−ガラクトシダーゼ活性を、1分当たり1細胞当たりに1μmolのONPGをO−ニトロフェノールおよびD−ガラクトースに加水分解することができる量として記載している(Miller, 1972; Miller, 1992)。この比色定量アッセイにより、酵母2−ハイブリッド法による2タンパク質間の相互作用の強さの半定量的測定が提供される。
52種のペプトイド混合物のそれぞれを、この方法によって3つの独立した試験において三連で解析した。これらの総てのアッセイにおいて、ペプトイドの不在下でのUBC13とUEV1との相互作用およびp53タンパク質とSV40ラージTタンパク質との相互作用を陽性相互作用対照として使用した。ラミニンタンパク質およびp53タンパク質を陰性対照として使用した。UBC13−UEV1相互作用に対するβ−ガラクトシダーゼ活性を、その対応する陽性対照(p53−ラージT)のβ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。そのように標準化したβ−ガラクトシダーゼ活性(The activities β-galactosidase)を図2に示している。このグラフは、混合物番号12、16、37、42および46の場合にUBC13−UEV1相互作用の最大阻害が繰り返し起こったことを示している。これらの混合物の、UBC13−UEV1相互作用に対する阻害能力を、これらの5種の混合物だけを用いて、新規比色定量アッセイによって三連で確認し、混合物番号12、42および46に最大阻害活性があることを確認した。
ケミカルライブラリーのモジュール性および組み合わせ性[35、36]により、この阻害活性に関与するペプトイドの好ましい多様性[すなわち構造(II)のオリゴマーの位置R、RおよびRの第一級アミン]を推測することが可能である。この場合、UBC13−UEV1相互作用を阻害するペプトイドは、N37−37−9C、N37−37−13C、N15−37−9CおよびN15−37−13Cと呼ばれる1以上のペプトイドに一致しなければならず、それらの化学構造を以下に示す:
位置Rでは選択されるアミンは4’−フルオロフェニルエチル(ペプトイド N37−37−9C)または2’−4’−ジクロロフェニルエチル(ペプトイド N15−37−13C)であり;位置Rではアミンは、総ての場合において4’−フルオロフェニルエチルであり、位置Rではアミン4’−メトキシフェニルエチル(ペプトイド N37−37−9CおよびN15−37−13C)および2−(2’−ピリジル)エチル(ペプトイド N37−37−9CおよびN15−37−9C)が選択される。そのため、4つの選択されたペプトイドのIUPAC命名は、
N37−37−9C:[N−(2−(4’−フルオロフェニル)エチル)グリシル]−[N−(2−(4’−フルオロフェニル)エチル)グリシル]−[N−(2−(2’−ピリジン)エチル)グリシンアミド;
N37−37−13C:[N−(2−(4’−フルオロフェニル)エチル)グリシル]−[N−(2−(4’フルオロフェニル)エチル)グリシル]−[N−(2−(4’−メトキシフェニルエチル)グリシンアミド;
N15−37−9C:[N−(2−(2’,4’−ジクロロフェニル)エチル)グリシル]−[N−(2−(4’−フルオロフェニル)エチル)グリシル]−[N−(2−(2’−ピリジン)エチル)グリシンアミド;
N15−37−13C:[N−(2−(2’,4’−ジクロロフェニル)エチル)グリシル]−[N−(2−(4’−フルオロフェニル)エチル)グリシル]−[N−(2−(4’−メトキシフェニルエチル)グリシンアミド
である。
実施例2.実施例1において選抜したペプトイドから誘導される環式化合物の立体配座変形のUBC13における分子ドッキングのコンピューターによる最適化。
酵母2−ハイブリッドアッセイにおいてUBC13−UEV1相互作用を妨害するペプトイドは、UEV1の第一の脂肪族ヘリックスと相互作用するUBC13の表面で競合的に結合することによって貢献するため、この後者のタンパク質はUBC13とのヘテロ二量体相互作用から外れると推測した。UEV1と相互作用するUBC13の表面は、UEV1のフェニルアラニン8がドッキングする疎水性ポケットの中心が、UBC13の残基E55、L56、Y57およびR70の側鎖との疎水性相互作用を受ける三尖頭星形疎水性溝である[26、27]。この仮説を研究するため、そしてこの活性を有する薬効のある化合物を作製する前の一段階として、活性ペプトイド、続いて、その誘導体環式化合物のUBC13における興味深い表面での仮想分子ドッキングの研究を行った。これらの後者の化合物は、同定したN−アルキルグリシンから最も安定な立体配座を見つけるための化学的最適化に相当する。この情報に基づいて、実施例1において選抜したN−アルキルグリシンの立体配座制限類似体8構造のファミリーを設計した。前記8環状構造に一致する構造を示すために、選抜した各ペプトイドを仮想構成し、総ての形態をUBC13タンパク質のモデルに関する分子ドッキング研究に供した。
これらの解析を、UBC13−UEV1ヘテロ二量体複合体(Brookhavenタンパク質データバンク受託番号1JAT)の原子構造において行った。最初に、目視検査および基本的なアクセシビリティの計算により、複合体の界面の記載した残基間に生じる相互作用は、この二元複合体の形成を効果的に防ぐことができる低分子量化合物の開発のガイドラインとすべきことが示唆された。
UBC13タンパク質(受容体)の調製。UBC13タンパク質の初期構造はPDBデータベース登録1JATに一致する[26]。計算を行ったUBC13タンパク質に相当するA鎖を、前記複合体中に存在するヘテロ二量体構造から分離した。AMBERソフトウエアパッケージプロトネートユーティリティー(protonate utility)を用いて水素原子の位置を得た[38]。次いで、parm99バージョンAMBER力場に従い、原子半径および電荷をUBC13タンパク質の総ての原子に割り当てた。さらに、UBC13タンパク質の活性中心を定義した。これを受けて、最初の目視検査後、二量体を形成している2タンパク質間の分離界面に位置するUBC13タンパク質の残基E55、L56、Y57およびR70を同定した。これらに残基は、主としてUEV1タンパク質の残基F8が挿入されるポケットを形成する。
実施例1において選抜したトリペプトイドの誘導体環式化合物(リガンド)の調製。これらの化合物の初期三次元構造(実施例1の各トリペプトイドの環状構造を有する8つの異なる構造ファミリー)をCORINAプログラム[39]および内部プログラム(ALFA)によってそれらの2D構造から得た。この解析に基づいて両方の化合物の配座可動性に代表的な立体配座を選択した。次いで、電荷および半径を各原子に割り当てた。半径についてはparm99バージョンAMBER力場を用い、一方、電荷は、MOPACソフトウエアパッケージ[42]において実行される半経験的ハミルトニアンMNDO法[41]を用いて算出される静電電位(ESP)[40]を調整することにより算出した。
相互作用エネルギーの事前計算。前記リガンドを収容することができる空間領域、またはボックスを、前記タンパク質において予め選択された残基に基づいて定義した。前記リガンドに存在する原子に対応する、いくつかの化学的プローブの相互作用エネルギーを、所定のボックス内に作成した規則的な0.5Å格子で測定した。用いるエネルギー関数は、AMBERプログラムにおいて用いられる分子力学関数の適用であり、[43]において詳細に記載されている。
前記受容体の結合部位における前記リガンドのドッキング。並進空間0.5Åおよび回転間隔30度を用いて、活性中心を形成している各格子点の各リガンドの考えられるあらゆる配向を「徹底的に」作成することによって活性中心内のリガンドの最確位置を得;それらの配向を、予め事前計算した格子により測定したそれらの最低相互作用エネルギーにより配列し、解析したリガンドにつき20配向のリストを選択した。これらの計算は内部プログラム、CDOCKを用いて実行した[43]。
前記リガンドの最終選抜。前記分子をより正確に識別するために、このリガンドリストの相互作用エネルギーに予め計算した補正を行った。これを受けて、溶媒和の寄与を組み込んだ。従って、リガンド−活性中心結合エネルギーは下式により決定される:
ΔGbinding=EvdW+ΔGcoul+ΔG desolv+ΔG desolv+ΔGnon−polar+ΔGCONF
ファンデルワールス相互作用(右辺の第一の項)は、前記CDOCKプログラムからのものである。静電成分(上式の右辺の成分2、3および4)については差分法によるポアソン方程式の数値解法(DelPhiプログラムにおいて実行されるものなど)によって、非静電成分(右辺の成分5)については比例定数0.00545を用いて接触可能表面に比例する項によって溶媒の効果を得た。間隔0.5Åを有し、該格子の寸法が任意の原子とボックスのエッジとの間隔が少なくとも11Åあるようなものである立方体格子を、総ての静電気計算に用いた。前記分子の溶質内部を誘電率4で特徴づけ、一方、溶質外部には誘電率80を用いた。用いた残りのラメーターはプログラムデフォルトパラメーターであった。
見つけた最良の分子および寄与に分配されたそれらの相互作用エネルギーを表1〜表6に示す。最も高い理論親和性を有する化合物N37−37−9C、ファミリーC(化合物Ia)およびN37−37−9C、ファミリーD(化合物Ib)について得られた結合モードの例を図3および図4に示す。
実施例3 UEV1と相互作用するUBC13の表面で良好な理論的ドッキングを示す環状化合物、化合物IaおよびIbの合成
3.1.−化合物Ia(バルビン):N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(2’’−ピリジル)エチル)−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド
化合物Iaの合成は本特許出願に示されている。Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄した。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理した。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄した。この樹脂に3mLのジメチルホルムアミド中、N−[2−2’−(ピリジン−2−イル)エチルアミン(180μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌した。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄した。次に、この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で得られたもの)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理した。この反応混合物を室温で30分間、2回攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄した。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌した。この反応を同じ温度で16時間繰り返した。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄した。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理した。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄した。この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌した。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄した。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で15分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(35mg、0.1当量)およびフェニルシラン(370μL、10当量)で処理した。このプロセスを3回繰り返した。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄した。ジメチルホルムアミド(3mL)中、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(235mg、1.5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(61mg、1.5当量)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(154μL、3当量)で処理する手段によって環化を行った。この反応混合物を室温で3時間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄した。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理して、化合物Iaを含有する反応混合物を遊離させた。これを濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去した。残渣を、アセトニトリル−水勾配(20%アセトニトリル→80%アセトニトリル、30分)を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製し、52mgの目的生成物を得た(収率30%、純度98%以上)。
HRMS−FAB:C3133 理論値[M+H]578.257886;測定値578.257844
3.2.−化合物Ib:[1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−[2’’ピリジル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン
化合物Ibの合成はスキームIIに示されている。固相における固相反応は全て2反復で行った。Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄した。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理した。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌した。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄した。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌した。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄した。この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で製造されたもの)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理した。この反応混合物を室温で30分間攪拌した。これを濾過し、この樹脂をジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄した。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌した。この反応物を同じ温度で16時間攪拌した。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄した。最後に、この樹脂を、室温で30分間、トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理した。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去した。次に環化を、還流条件下で30分間、先の残渣を4mLのジオキサンで処理する手段によって行った(HPLCにより制御)。次に、4N水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール(1:2、1.5mL)の溶液を加え、この混合物を還流下で30分間攪拌した(HPLCにより制御)。この反応混合物を1N塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させた。得られた残渣を2×10mLの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮した。真空濃縮することによって溶媒を除去すると、ジケトピペラジン中間体が無色固体の形態で得られた(90mg、72%)。この材料をさらに精製せずに次の工程で用いた。
N−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成した。要するに、この断片は、樹脂(290mg、0.22mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸(153mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(175μL、5当量)でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン(155μL、5当量)の存在下でN−[2−2’−(ピリジン−2−イル)エチルアミン(135μL、5当量)とカップリングさせることによって得た。次に、このジケトピペラジン中間体(90.0mg、1当量)を、ジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(45mg、1.5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(55μL、1.5当量)の存在下で樹脂とカップリングさせた。この反応混合物を室温で1時間攪拌した。乾燥樹脂をジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄した。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水の60:40:2混合物で処理し、化合物Ibを含有する反応混合物を得た。これを濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去した。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配(30%アセトニトリル→45%アセトニトリル、30分)を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製し、57mgの目的生成物を得た(収率33%、純度98%以上)。
HRMS−FAB:C3133 理論値[M+H]578.2501;測定値578.2573
実施例3.3.化合物N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(2’’−ピリジル)エチル)−1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド
Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に3mLのジメチルホルムアミド中、N−[2−2’−(ピリジン−2−イル)エチルアミン(180μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で得られたもの)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物を室温で30分間、2回攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌する。この反応を同じ温度で16時間繰り返す。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(240μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で15分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(35mg、0.1当量)およびフェニルシラン(370μL、10当量)で処理する。このプロセスを3回繰り返す。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。ジメチルホルムアミド(3mL)中、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(235mg、1.5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(61mg、1.5当量)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(154μL、3当量)で処理する手段によって環化を行う。この反応混合物を室温で3時間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理して、目的化合物を含有する反応混合物を遊離させる。この混合物を濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製する。
実施例3.4.化合物N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)−1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド
Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−メトキシフェニル)エチルアミン(230μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で得られたもの)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物を室温で30分間、2回攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、N−2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌する。この反応を同じ温度で16時間繰り返す。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(2’,4’−ジクロロフェニル)エチルアミン(240μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で15分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(35mg、0.1当量)およびフェニルシラン(370μL、10当量)で処理する。このプロセスを3回繰り返す。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。ジメチルホルムアミド(3mL)中、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(235mg、1.5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(61mg、1.5当量)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(154μL、3当量)で処理する手段によって環化を行う。この反応混合物を室温で3時間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理して、目的化合物を含有する反応混合物を遊離させる。この混合物を濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製する。
実施例3.5.化合物N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド
Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−メトキシフェニル)エチルアミン(235μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で得られたもの)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物を室温で30分間、2回攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌する。この反応を同じ温度で16時間繰り返す。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で15分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(35mg、0.1当量)およびフェニルシラン(370μL、10当量)で処理する。このプロセスを3回繰り返す。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。ジメチルホルムアミド(3mL)中、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(235mg、1.5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(61mg、1.5当量)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(154μL、3当量)で処理する手段によって環化を行う。この反応混合物を室温で3時間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理して、目的化合物を含有する反応混合物を遊離させる。この混合物を濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製する。
実施例3.6.化合物1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’ −(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン
固相反応は全て、2反復で行う。Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に3mLのジメチルホルムアミド中、2−(2’,4’−ジクロロフェニル)エチルアミン(240μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で製造)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物を室温で30分間攪拌する。これを濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌する。この反応物を同じ温度で16時間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂を、室温で30分間、トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理する。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去する。次に環化を、還流条件下で30分間、先の残渣を4mLのジオキサンで処理する手段によって行う(HPLCにより制御)。次に、4N水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール(1:2、1.5mL)の溶液を加え、この混合物を還流下で30分間攪拌する(HPLCにより制御)。この反応混合物を1N塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を2×10mLの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮する。真空濃縮することによって溶媒を除去し、ジケトピペラジン中間体が得られる。この材料をさらに精製せずに次の工程で用いる。
N−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成する。要するに、この断片は、樹脂をジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸(5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(5当量)でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン(5当量)の存在下でN−[2−2’−(ピリジン−2−イル)エチルアミン(5当量)とカップリングさせることによって得る。次に、このジケトピペラジン中間体(1当量)を、ジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(1.5当量)の存在下で樹脂とカップリングさせる。この反応混合物を室温で1時間攪拌する。乾燥樹脂をジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水の60:40:2混合物で処理し、目的化合物を含有する反応混合物を得る。この化合物を濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製する。
実施例3.7.化合物1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン
固相反応は全て2反復で行う。Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(2’,4’−ジクロロフェニル)エチルアミン(240μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で製造されたもの)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物を室温で30分間攪拌する。この混合物を濾過し、この樹脂をジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌する。この反応物を同じ温度で16時間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂を、室温で30分間、トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理する。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去する。次に環化を、還流条件下で30分間、先の残渣を4mLのジオキサンで処理する手段によって行う(HPLCにより制御)。次に、4N水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール(1:2、1.5mL)の溶液を加え、この混合物を還流下で30分間攪拌する(HPLCにより制御)。この反応混合物を1N塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を2×10mLの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮する。真空濃縮することによって溶媒を除去すると、ジケトピペラジン中間体が得られる。この材料をさらに精製せずに次の工程で用いる。
N−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成する。要するに、この断片は、樹脂をジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸(5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(5当量)でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン(5当量)の存在下で2−(4’−メトキシフェニル)エチルアミン(5当量)とカップリングさせることによって得る。次に、このジケトピペラジン中間体(1当量)を、ジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(1.5当量)の存在下で樹脂とカップリングさせる。この反応混合物を室温で1時間攪拌する。乾燥樹脂をジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水の60:40:2混合物で処理し、目的化合物を含有する反応混合物を得る。この化合物を濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製する。
実施例3.8.化合物1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン
固相反応は全て2反復で行う。Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で製造されたもの)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物を室温で30分間攪拌する。この混合物を濾過し、この樹脂をジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌する。この反応物を同じ温度で16時間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂を、室温で30分間、トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理する。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去する。次に環化を、還流条件下で30分間、先の残渣を4mLのジオキサンで処理する手段によって行う(HPLCにより制御)。次に、4N水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール(1:2、1.5mL)の溶液を加え、この混合物を還流下で30分間攪拌する(HPLCにより制御)。この反応混合物を1N塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を2×10mLの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮する。真空濃縮することによって溶媒を除去すると、ジケトピペラジン中間体が得られる。この材料をさらに精製せずに次の工程で用いる。
N−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成する。要するに、この断片は、樹脂(290mg、0.22mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸(153mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(175μL、5当量)でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン(155μL、5当量)の存在下で2−(4’−メトキシフェニル)エチルアミン(235μL、5当量)とカップリングさせることによって得る。次に、このジケトピペラジン中間体(90.0mg、1当量)を、ジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(45mg、1.5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(55μL、1.5当量)の存在下で樹脂とカップリングさせる。この反応混合物を室温で1時間攪拌する。乾燥樹脂をジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水の60:40:2混合物で処理し、目的化合物を含有する反応混合物を得る。この化合物を濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製する。
実施例3.9.化合物N−アミノカルバモイルメチル−N−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−1,4−ビス[2’−4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド
Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に3mLのジメチルホルムアミド中、2−(2’,4’−ジクロロフェニル)エチルアミン(240μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で得られたもの)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物を室温で30分間、2回攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌する。この反応を同じ温度で16時間繰り返す。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂を、室温、アルゴン雰囲気下で15分間、無水ジクロロメタン中、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(35mg、0.1当量)およびフェニルシラン(370μL、10当量)で処理する。このプロセスを3回繰り返す。上清を廃棄し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。ジメチルホルムアミド(3mL)中、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(235mg、1.5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(61mg、1.5当量)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(154μL、3当量)で処理する手段によって環化を行う。この反応混合物を室温で3時間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理して、目的化合物を含有する反応混合物を遊離させる。これを濾過し、減圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。残渣を、アセトニトリル−水勾配(20%アセトニトリル→50%アセトニトリル、30分)を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製し、77.3mgの目的生成物を得る(収率38%、純度98%以上)。
ESI−MS:C3232Cl 理論値[M+H]645.2;測定値:[M+H]645.2
実施例3.10.化合物[1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’、4’’−ジクロロフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン
固相反応は全て2反復で行う。Rinkアミド樹脂(400mg、0.3mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジン3mLで処理し、この混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジメチルホルムアミド(3mL)中、ブロモ酢酸(208mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物をマイクロ波リアクターにて60℃で2分間攪拌する。この樹脂を濾過し、ジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を、マイクロ波で活性化させながら90℃で2分間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。この樹脂をジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、(Z)−3−(アリルオキシカルボニル)アクリル酸(マイクロ波で活性化させながら60℃で50分間、クロロホルム中、無水マレイン酸およびアリルアルコールから85%収率で製造されたもの)(234mg、5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(203mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(235μL、5当量)の溶液で処理する。この反応混合物を室温で30分間攪拌する。この混合物を濾過し、この樹脂をジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。次に、この樹脂に、3mLのジメチルホルムアミド中、2−(4’−フルオロフェニル)エチルアミン(200μL、5当量)およびトリエチルアミン(210μL、5当量)の溶液を加え、この懸濁液を室温で3時間攪拌する。この反応物を同じ温度で16時間攪拌する。上清を除去し、残渣を濾過し、ジメチルホルムアミド(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジクロロメタン(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂を、室温で30分間、トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水(60:40:2)の混合物で処理する。この加水分解混合物を濾過し、濾液をプールし、低圧下での蒸発の手段により溶媒を除去する。次に環化を、還流条件下で30分間、先の残渣を4mLのジオキサンで処理する手段によって行う(HPLCにより制御)。次に、4N水酸化ナトリウムおよびアリルアルコール(1:2、1.5mL)の溶液を加え、この混合物を還流下で30分間攪拌する(HPLCにより制御)。この反応混合物を1N塩酸で酸性化し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を2×10mLの酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮する。真空濃縮することによって溶媒を除去すると、中間体ジケトピペラジン(90mg、72%)が無色固体の形態で得られる。この材料をさらに精製せずに次の工程で用いる。
N−アルキルグリシン断片を含む樹脂を、上記のものと同様のプロセスに従って合成する。要するに、これは、樹脂(290mg、0.22mmol)をジメチルホルムアミド中20%のピペリジンで処理した後、ブロモ酢酸(153mg、5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(175μL、5当量)でアシル化し、このアミンをトリエチルアミン(155μL、5当量)の存在下で2−(2’,4’−ジクロロフェニル)エチルアミン(170μL、5当量)とカップリングさせることによって得る。次に、このジケトピペラジン中間体(90.0mg、1当量)を、ジクロロメタン:ジメチルホルムアミド(2:1、3mL)中、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(45mg、1.5当量)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(55μL、1.5当量)の存在下で樹脂とカップリングさせる。この反応混合物を室温で1時間攪拌する。乾燥樹脂をジクロロメタン(3×3mL)、イソプロピルアルコール(3×3mL)およびジメチルホルムアミド(3×3mL)で洗浄する。最後に、この樹脂をトリフルオロ酢酸/ジクロロメタン/水の60:40:2混合物で処理し、目的化合物を含有する反応混合物を得る。これを濾過し、低圧下での蒸発とその後の凍結乾燥の手段によって溶媒を除去する。得られた残渣を、アセトニトリル−水勾配(30%アセトニトリル→45%アセトニトリル、30分)を適用する半分取スケールでのRP−HPLCの手段によって精製し、71.7mgの目的生成物を得る(収率35%、純度99%以上)。ESIMS:C3232Cl 理論値[M+H]645.2;側定値:[M+H]645.1
実施例4.UBC13とUEV1との相互作用に対する化合物IaおよびIbの効果
実施例2に記載したコンピュータ−解析により、化合物IaおよびIbは、UEVタンパク質(Mms2p、UEV1およびUEV2)の第一の脂肪族ヘリックスとのその特異的相互作用に通常使用されるUBC13の表面の疎水性溝において良好な親和性でドッキングするという仮説が示唆される。これは、前記化合物がUBC13とUEV1(またはMms2pおよびUEV2)との相互作用を競合的に妨害することができるということを示唆する。それを試験によって証明するために、UBC13−UEV1相互作用を阻害する化合物IaおよびIbの能力を2タイプのアッセイを用いて解析した:
(1)実施例1に記載した方法を適用しての、UBC13−UEV1相互作用についての酵母2−ハイブリッドアッセイ;および
(2)大腸菌(Escherichia coli)において生産した組換えタンパク質を用いての、無細胞系におけるUBC13タンパク質とUEV1タンパク質との相互作用。
酵母2−ハイブリッドアッセイにおけるUBC13−UEV1相互作用に対する化合物IaおよびIbの効果を選択培地で増殖したサッカロミセス・セレビシエ株AH109の細胞を、100μMのいずれかの化合物とともにインキュベートすることにより行った。Sv40ラージTタンパク質とp53タンパク質との相互作用を陽性相互作用対照として用いた。相互作用の強さは、基質としてO−ニトロフェニル−p−ガラクトピラノシド(ONPG)を使用して、β−ガラクトシダーゼ活性を検出することによって比色定量により測定し、各測定を三連で行った。これらの条件において、図5(A)では、化合物Iaは、100μMの濃度において、UBC13とUEV1との相互作用をほぼ60%阻害し、一方、化合物Ibによるこの相互作用の阻害はほぼ40%であることを示している。これら2つの化合物はいずれも、対照として用いた、p53とラージTとの相互作用を阻害せず、これは両方の化合物がUBC13とUEV1との相互作用を特異的に阻害することを示す。これらの結果は、化合物Iaが化合物Ibより高い効率でこの相互作用を阻害することも示唆している。
無細胞アッセイにおいてこれらの化合物の活性を決定するために、タンパク質−タンパク質相互作用試験を、大腸菌において生産した組換えタンパク質を用いて行った。UBC13およびUEV1を発現させるために、大腸菌株BL21の細菌細胞をプラスミドpGEX−4T1−UBC13またはPGEX−4T3−UEV1で形質転換し、形質転換されたコロニーを、アンピシリン(100μg/mL)を加えたプレートで増殖させることによって選抜した。個別コロニーを、抗生物質を加えない3LのLB培地に移し、培養物が指数増殖期(OD600nm〜0.6)に達するまで攪拌しながら37℃で増殖させ、その時点においてイソプロピルα−D−チオガラクトピラノシド(IPTG、Sigma社製I−6758)を1mMの濃度で培養物に5時間加えることによって組換えタンパク質の発現を誘導した。これらの培養物を試験管に移し、遠心分離し、細胞ペレットをその2倍容量のpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、細胞破壊装置(Constant Systems)で破壊した。これらの細胞溶解物を45μM孔のセルロースアセテートフィルター(Millipore社製SLHA033SS)で濾過し、GSTrap FFカラム(Amersham Biosciences社製17−5131−01)に適用した。UEV1の場合、カラムに特異的に結合したタンパク質を同じカラムで50単位のトロンビン(Amersham Biosciences社製27−0846−01)を用いて酵素消化に25℃で一晩供した。GSTユニットが第一のカラムに捕捉され、トロンビンが第二のカラムに捕捉されるように、HiTrapBenzamidine FFカラム(Amersham Biosciences社製27−0846−01)を前のカラムと連結した。次いで、GST部分のないUEVTタンパク質を溶出し、続いて、Superdex 75カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって次の精製工程を行った。GST−UBC13組換えタンパク質を上述のとおり発現させ、GSTrap FFカラムでのアフィニティークロマトグラフィー、続いて、Superdex 75での濾過クロマトグラフィーによって精製した。精製タンパク質に相当する画分を、Centricon YM−10カラム(Millipore社製4205)での遠心分離によって濃縮し、それらを使用するまで4℃で保存した。
UBC13とUEV1との相互作用に対する化合物IaおよびIbの効果を判定するために、50mM Hepesバッファー、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM DTT pH7.6中4.09μmg/mLの濃度のGST−UBC13キメラ組換えタンパク質2μLを、終濃度10nM、100nM、1μM、10μMまたは100μMの化合物バルビン、Ibまたは環式対照化合物VTII−N6−2−1Cとともに室温で30分間プレインキュベートした。これらの混合物を、グルタチオンセファロース4Bマトリックス(Amersham Biosciences)とともに60分間インキュベートすることによって固相に固定し、続いて、10マトリックス容量の50mM Hepesバッファー、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM DTT pH7.6で洗浄を行った。次いで、これらのカラムを、同じバッファー中0.15μg/mLの濃度の10μLのUEV1タンパク質とともに45分間インキュベートした。カラムと結合していないUEV1タンパク質(溶出画分、またはE)を14,000gでの遠心分離によって集めた後、これらのカラムを10容量の前のバッファーで洗浄した。さらに、GST−UBC13およびGST−UBC13−UEV1複合体を、50mM Tris−HCl pH8.0中10mMの還元グルタチオンを含む溶出バッファーとともにインキュベートすることによって溶出した(残留画分、またはB)。画分Eおよび画分BをCentricon YM−10カラムでの遠心分離によって濃縮し、Laemmliバッファー(250mM Tris−HCl、10%SDS、500mM DTT、0.5%ブロモフェノールブルー、50%グリセロール、pH6.8)中で沸騰させることによって変性させ、電気泳動により10%ポリアクリルアミド−SDSゲルで分離した。電気泳動後、これらのタンパク質を電気泳動的にPVDF膜に転写し、これをブロッキングバッファー(0.1%Tween−20を含むPBS pH7.4中5%脱脂乳)とともに1時間プレインキュベートした後、ウサギ抗UEV1抗体または抗UBC13抗体とともに1時間インキュベートした。これらの抗体は、ウサギを特異的UEV1配列またはUBC13配列それぞれに対応する合成ペプチドで免疫することによってこの研究室において予め作製し、免疫ペプチドが固定されるカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってこれらの抗体を免疫血清から精製した[37]。これらの抗体とのインキュベーション後、前記膜を20mLのPBS−Tween−20で3回洗浄し、ブロッキングバッファーで1:1000希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体(Dako Cytomation)とともに30分間インキュベートした。PBS−Tween−20で3回洗浄後、前記上の反応物をECLシステム(Amersham)を用いた化学発光およびオートラジオグラフィーフィルムへの露光によって観察した。
このアッセイの結果を図5(B)に示し、この図より、溶出され、GST−UBC13と結合しない画分中にUEV1の最大60%(化合物Iaの場合)または40%(化合物Ibの場合)が見られることから、化合物IaおよびIbは、UEV1とGST−UBC13との結合を効果的に阻害するが、環式対照化合物VIII−N6−2−1Cは阻害しないということが分かる。図5(B)は、100μMの環状化合物を用いて行ったアッセイの結果だけを示しているが、ずっと低い濃度、最大10nMの化合物IaおよびIbでのUEV1とUBC13との相互作用の効果的な阻害も観察された。UEV1タンパク質およびUBC13タンパク質が高親和性(KD?5x10−10M、Biacore T100装置により測定された定数)で互いに相互作用することを考慮すると、これらの結果は、化合物IaおよびIbによるUBC13とUEV1との相互作用の阻害が、UEV1の第一の脂肪族ヘリックスとのその相互作用に通常使用されるUBC13の表面とのこれらの化合物の競合的相互作用によるものであることを示唆している。
実施例5.UBC13−UEV1によって媒介されるポリユビキチン化に対する化合物Iaの効果
実施例4に記載した、化合物IaおよびIbによるUBC13とUEV1との相互作用の阻害によれば、これらの化合物がUBC13の酵素活性を阻害することができることが示される。背景に記載のとおり、UBC13−UEV1によって触媒されるK63タイプのポリユビキチン化には、ヘテロ二量体の両方のサブユニット間の相互作用が必要である。この酵素活性に影響を及ぼす化合物Ia(UBC13とUEV1との相互作用の阻害剤として2化合物のうちの最も活性なもの)の能力をin vitro遊離ポリユビキチン鎖形成アッセイによって解析した。このアッセイでは、0.1μMのE1酵素(Boston Biochem)、0.2μMのUBC13、0.2μMのUEV1(実施例4に記載のとおり作製したもの)、117μMの野生型ユビキチン(Biomol社製UW8795)または63位(ユビキチン K63)または48位(ユビキチン K48;Boston Biochem)のリジン以外の総てのリジンが突然変異したものを含む反応物でのポリユビキチン鎖の形成を50mMのpH7.6のTris−HC、5mMのMgClおよび0.5mMのジチオトレイトールを含む反応バッファー中で行う。化合物Ia(バルビン)での処置のために、UBC13を100μMのこの化合物とともに室温で10分間プレインキュベートした後、反応物に加えた。2mMのATPを加えることによって反応を開始し、37℃で異なる時間においてインキュベートすることによって行い、Laemmliバッファー(250mM Tris−HCl、10%SDS、500mM DTT、0.5%ブロモフェノールブルーおよび50%グリセロール pH6.8)を加え、3分間沸騰させることによって停止させた。これらのサンプルを電気泳動によりポリアクリルアミド−SDSゲルで分離し、電気泳動的にPVDF膜に転写した。実施例4に記載した免疫検出法に従って、これらのユビキチン分子をウサギ抗ユビキチン抗体(Biomol社製UG 9510)を用いて検出し、化学発光により反応性を明示した。
図6(A)は、化合物Iaの不在下で、上記反応によりポリユビキチン鎖の形成が起こり、ユビキチンユニットが漸進的に付加されることにより経時的にサイズが増加することを示している。この対照反応では、反応の約30分の時点においてトリユビキチン(Ub)、60分の時点においてテトラユビキチン(Ub)、90分の時点においてペンタユビキチン(Ub)、その後の時間においてより大きなサイズ(または複雑性)の形態の出現を示す。図6(B)にて示されるように、異なる形態のポリユビキチンの生成についての定量分析では、UBC13と100μMの化合物バルビン(Ia)とのプレインキュベーションにより、ポリユビキチン化形態の生成速度の低下が起こることが示される。対照反応の曲線の傾きと化合物Iaでの処置のものとの有意差から、この化合物によるUBC13−UEV1の酵素活性の阻害は競合的タイプのものであることも示される。このin vitroポリユビキチン化は、野生型ユビキチンを用いる場合と、前記反応においてユビキチンK63を用いるときに起こり(図6(C))、その代わりにユビキチン48を用いるときには起こらないことから、ユビキチン分子の63位のリジンを特異的に用いる。さらに、UBC13と化合物Iaとのプレインキュベーションでは、基質が野生型ユビキチンである(図6(C))ときと同様の効率で基質としてユビキチンK63を用いてポリユビキチン化を阻害する。よって、化合物Iaは、UBC13−UEV1によりin vitroで触媒されるK63タイプのポリユビキチン化を効果的に阻害するという結論に達する。
実施例6.化合物IaおよびIbの生物活性
サッカロミセス・セレビシエ酵母における活性
S.セレビシエ酵母において、PCNAタンパク質の、Ubc13p−Mms2pによって媒介されるK63タイプのポリユビキチン化は、「エラーフリー修復」と呼ばれるRAD6副経路における複製後DNA修復に不可欠である[7−17]。この経路では、UBC13およびMMS2の両方がRAD6に対して上位であるが、UBC13の欠失はrad6表現型を部分的に救済するが、MMS2の欠失は救済しないという特異性を有する[14]。両方の遺伝子は、RAD6によって調節される第二の修復副経路、いわゆる「エラーを起こしやすい修復」、またはREV3、REV7およびREV1が関与する突然変異誘発副経路の変異株と相乗作用する。この相乗作用は、UBC13またはMMS2の欠失により遺伝毒性障害(紫外線放射またはメタンスルホン酸メチル(MMS)への曝露など)に対するrev3変異株のより高い感作が起こるという事実によって示される[13−15]。
化合物IaおよびIbがUbc13p−Mms2pの機能を阻害するかどうかを判定するために、ubc13のヌル突然変異によって生じるDNA修復表現型をS.セレビシエにおいて再現するそれらの能力を評価した。従って、紫外線放射またはMMSへの曝露後の生存能力アッセイにRAD6またはREV3の変異株およびその親株(対照)を用いた。用いた株の遺伝子型は以下である:
1)親株(対照)BY4741:his3AΔ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0におけるMAT
2)株Δrad6:his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 rad6::kanMX4におけるMAT
3)株Δrev3:his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 rev3::kanMX4におけるMAT
細胞を、YPD培地を加えた液体培養物に、対数増殖期に達するまで30℃で一晩接種した。紫外線放射での処置では、100μMの化合物IaまたはIbの存在下または不在下で増殖させた細胞のアリコートにStratalinker装置(Stratagene)により図7および図8に示したエネルギーにおいて照射した。突然変異誘発物質MMSでの処置では、100μMの化合物IaまたはIbを加えた培地中で増殖させたまたは増殖していない細胞のアリコートをインキュベートし、0.03%MMSを加え、その後、インキュベーションを図7および図8に示した時間の間行った。各処置の後、500個の細胞をYPD培地を入れたプレートに播種し、2日後にコロニーを計数した。
予想通り、これらのアッセイにおいてΔrad6変異株は紫外線照射に対してもMMSに対してもより高い感受性を示し、突然変異誘発物質の用量を増加するにつれて生存が急激に減少している(図7)。しかしながら、100μMの化合物Iaまたは化合物Ibの存在は、紫外線照射によって誘導されるrad6表現型を、それほどではないが、MMSでの処置によって生じた表現型も明らかに救済している(図7)。これはΔubc13変異株に特徴的な表現型であるため、化合物IaおよびIbはこの表現型を再現しており、このことはそれらの化合物がUBC13の阻害と通じて作用することを示唆している。他方、Δrev3変異株と化合物Ia、それほどではないが、化合物Ibとのインキュベーションにより、Δubc13突然変異のもののと同様の相乗作用で、紫外線放射またはMMSへの曝露の効果に対する細胞のより高い感作が起こった(図8)。よって、解析した2つの表現型は、化合物IaおよびIbが、RAD6によって調節されるDNA修復経路に影響を及ぼすこと、そしてそれらの化合物がUbc13pの阻害によって貢献することを示している。
実施例7.化合物IaおよびIbの生物活性
TNFαによる転写因子NF−κBの刺激の阻害
背景に記載のとおり、K63タイプのポリユビキチン化によって調節され、UBC13−UEV1(またはUBC13−UEV2)によって触媒される生化学的経路の1つは、サイトカイン、TNFαおよび他のポリペプチドによって誘導されるシグナルによる転写因子NF−κBの活性化である。
TNFαによるNFκ−B活性の刺激に対する化合物IaおよびIbの活性を判定するために、3つのNFκ−B認識部位を含むプロモーターによって命令されるホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって生じるルシフェラーゼ活性を誘導するためのアッセイ(デュアル−ルシフェラーゼリポーターアッセイ合成システム、Promega、カタログ番号E1910を用いて判定する)を行った。この目的に向けて、HeLa細胞を、トランスフェクションビヒクルとしてFugene(Roche)を使用して、ウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼをコードし、トランスフェクション効率対照であるプラスミドPRL−TK、およびプラスミドprLUC(NFκ−Bの転写活性の判定を可能にするプラスミド)で同時トランスフェクトした。100,000個の細胞を6ウェルプレート(Costar)に播種した。その翌日、0.5μgの各プラスミドおよび3μlのFugeneを用いて15分間トランスフェクション複合体を作製した。この複合体をOptimem培地(InVitrogen)中の細胞に加え、5時間後、その培地を完全培地(ペニシリンおよびストレプトマイシンを補給した、10%ウシ胎児血清、2mMのグルタミンを含むダルベッコの改変イーグル培地)に変更し、それに異なる濃度の化合物バルビン(Ia)またはIbを加えたまたは加えなかった。その翌日、これらの細胞をTNFα(10ng/mL)ともに4時間インキュベートし、その後、それらをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、製造業者(Promega)の指示に従って、250μLの溶解バッファーで溶解した。この溶解物に100μLのルシフェラーゼ試薬(LARII)を加えて、ホタルルシフェラーゼ活性を測定し、その後、反応を、100μLのウミシイタケルシフェラーゼ基質を含む停止バッファーを加えて停止させ、その時点においてこの第二の活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した。トランスフェクトしたがTNFαで刺激しなかった細胞に対応する値を、残りの試験値を標準化する対象として使用した。最後に、第三の標準化を行い、その総ての値は本発明の薬物対象を加えないTNFαによるルシフェラーゼ活性の誘導の値(TNFα対照)に関連して反映される。
図9は、HeLa細胞と化合物Iaまたは化合物Ibとのプレインキュベーションにより、TNFαによって誘導されるNFκ−Bの転写活性の刺激が用量依存的に阻害されることを示している。この阻害は、化合物Ibを用いた場合よりも化合物Iaを用いた場合により顕著であり、HeLa細胞を100μM濃度のバルビン(Ia)とともにプレインキュベートしたときのTNFαによるNF−κBの活性化の50%に近い阻害に達する。よって、化合物IaおよびIbはNF−κBの活性化の効果的な阻害剤であり、それによって、それらの化合物は、炎症プロセスまたは新生物プロセスを含む、この活性化が重要であるプロセスにおいて適用できるであろう。
実施例8.化合物IaおよびIbの生物活性
ドキソルビシンおよびエトポシドの細胞傷害効果に対する腫瘍細胞の感作
転写因子NF−κBの活性化は、正常細胞および腫瘍細胞が異なる形のストレスまたは損傷を受けたときのそれらの生存機構の1つである[44−47]。そのため、この転写因子の活性化の阻害によって生じた結果の1つは、遺伝毒性障害または別のタイプの細胞ストレスを引き起こす異なる物理的または化学的作用因子の細胞傷害効果に対してより高い感受性をもたらすことである。よって、細胞と化合物IaまたはIbとのインキュベーションでは、部分的にはNF−κBの活性化を阻害するそれらの能力によって、化学療法薬(ドキソルビシンまたはエトポシドなど)の効果に対する細胞感作が起こるかもしれない。言い換えれば、(ある特定の用量の)ドキソルビシンまたはエトポシドと化合物IaまたはIbとの組合せでは、ドキソルビシンまたはエトポシド単独よりも大きな細胞傷害効果およびより多くの用量のドキソルビシンまたはエトポシドそれぞれによって起こり得る細胞傷害効果と同様の細胞傷害効果が起こるはずである(should case)。
この予測を試験によって証明するために、細胞計数試験をCyQuant法(molecular probes、カタログ番号C−7026)によって行った。この細胞定量法は、核酸との結合後にその蛍光を定量的に刺激する化合物に基づく。96ウェルプレートの各ウェルに10,000個の細胞を播種し、5%COおよび90%湿度の雰囲気下でこれらのプレートの表面に37℃で一晩それらを付着させ、その後、これらの細胞を異なる処置に供した。この試験処置が終了した時に、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、その後、CyQuantアッセイを行う時間までプレートを−70℃で冷凍した。定量のために、プレートを室温で解凍し、(製造業者の使用説明書に従って)各ウェルに200μLのCyQuant GR色素含有溶解バッファーを加えた。室温で2〜5分間インキュベートした後、480nmおよび520nmで放射された蛍光を定量した。蛍光分析による測定値に対応する細胞数を計算するために、既知数の細胞によって標準放射蛍光線を作成し、このデータを用いて、試験データを推定した。
図10にて示されるように、HeLa細胞(子宮頸癌由来)またはPC−3細胞(前立腺癌由来)を、100μMの化合物Iaを加えてまたは加えないで、0.05μM〜50μM間の濃度のエトポシドおよびドキソルビシンそれぞれで処置した。図10のグラフから、ドキソルビシンのIC50はPC−3細胞における処置の72時間後0.5μMに近く、エトポシドのIC50はHeLa細胞における処置の24時間後およそ1.25μMであることを推測することができる。100μMのIaの添加により、ドキソルビシンのIC50はPC−3細胞で0.1μMに低下し、エトポシドのIC50はHeLa細胞で0.04μMに低下した。よって、100μMの化合物Iaでの処置は、ドキソルビシンの細胞傷害効果に対する5倍の感作(PC−3細胞)、エトポシドの細胞傷害効果に対する30倍の感作(HeLa細胞)を引き起こす。
実施例9.ヒト腫瘍細胞異種移殖片のネズミモデルにおける化学感作物質としての化合物Ia(バルビン)の抗腫瘍活性
バルビンがin vivo抗腫瘍活性を有するかどうかを判定するために、PC−3細胞から形成された腫瘍を有するマウスにおけるその効果を解析した。試験腫瘍をPC−3.Sluc細胞の筋肉内接種によって行った[48]。PC−3.Sluc細胞は、哺乳類細胞qにおいてホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子を発現する、プラスミドpRC/CMV−lucをトランスフェクトすることによって組み込んだPC−3前立腺細胞である。PC−3.1uc細胞と、ルシフェラーゼ基質であるD−ルシフェリンとのインキュベーションでは発光し、この光を照度計によってまたはCCD(電荷結合素子)カメラでの検出によって絶対的に(光子数)定量することができる。後者の方法は、ルシフェリンの存在下での発光強度(光子数)がPC−3.1uc細胞の数に正比例することから、さらに、接種した動物における腫瘍細胞の位置、ならびに腫瘍サイズの画像をリアルタイムで表すことができる。
これらの研究では、24匹の6週齢の雄Balb/c nu/nuマウス(Charles River Laboratories)を使用した。これらの動物を常に無菌環境に維持し、動物を受け取ってから試験処置まで動物飼育設備に1週間維持した。6mg/Kgのドロペリドール(Roche, Basel, Switzerland)および12mg/Kgのミダゾラム(Rovi S. A, Madrid, Spain)の等量混合物の腹腔内(i.p.)注射によって麻酔をかけた後、各動物の右足および左足の両方に100μLのウシ胎児血清フリー培養培地に懸濁した1x10個のPC−3.Sluc細胞の筋肉内(i.m.)注射を行った。2週間、接種部位において腫瘍を発生させ、その後、放出光子の第一回目の測定を行い、C4742−98−LWG−MODモデルCCDカメラ(−80℃に冷却)を備えたORCA−2BTイメージングシステム装置(Hammamatsu Photonics)を用いて第一回目の画像の取り込みを解像度512x512ピクセルで行った。腫瘍の発光レベルのin vivoトラッキングでは、上記のように動物に麻酔をかけ、そのすぐ後に150μlのD−ルシフェリン(Promega)のI.p.注射を100mg/Kgの用量で行った。4分後、光子を検出し、上記装置で5分間定量した。測定値は相対発光量(RLU)で表される。総ての測定値において、腫瘍から遠い動物の領域(胸部)に対応するバックグラウンドシグナルを減じた。第一の画像を取得した直後に、同じ位置における同じ動物の画像を可視光で撮影した。光子の定量および解析を画像解析プログラムWASABI(Hamamatsu Photonics)を用いて行った。定量的情報のイメージへの変換を疑似カラーでまたはグレースケールで行い、グレー/黒色の強度が定量データを忠実に表すように、総ての動物に対して同じパラメーターならびに強度および色の範囲を維持し、試験間および異なる動物間で同程度であるようにした。グラフ表示では、各腫瘍について、定量データ(RLU)を処置第0日のRLUに対して標準化した。
両足に発光腫瘍を有する24匹のマウスを4試験群に含めた:(1)100μLのリン酸緩衝生理食塩水pH7.4(PBS)および50μLの腫瘍内(i.t.)PBSの静脈内(i.v.)注射を行った対照群。(2)ドキソルビシン(Sigma, Alcobendas, Madrid, Spain)(100μLのPBS中5mg/Kg)で週に1回、i.v.処置した群。(3)バルビン(50μLのPBS中100μM)で週に2回、i.t.処置した群。(4)上記に示した投与用量および経路を用いた、ドキソルビシンで週に1回、i.v.とバルビンで週に2回の併用処置群。処置開始から56日にわたって腫瘍の発光を解析した。これらの結果は、対照動物の腫瘍は、試験開始から14日後の減少を除き、試験の間中一般に一定のペースで増殖したことを示している(図11)。RLU(ゆえに腫瘍サイズ)のこの減少は、各群の処置に関係なく、総ての群において観察されため、この試験の異種移殖片条件におけるこれらの細胞の固有の増殖パターンに相当する。対照マウスの腫瘍とは異なり、ドキソルビシン単独で処置したマウス(群2)の腫瘍は、試験中ほとんど増殖しなかった(図11)。同様に、ドキソルビシンでi.v.とバルビンでi.m.の両方で処置したマウスも、この試験中にあまり増殖しなかった。最後に、バルビン単独でi.m.処置した動物の腫瘍も、非常に限られた増殖を示し(ドキソルビシンで処置したものに対して有意な差はない)、いずれにせよ、対照マウスの腫瘍のものよりも有意に小さかった。
よって、バルビンは、筋肉内注射により100μMの濃度において、nu/nuマウスに移植したこの腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示す。
参考文献
UBC13とUEV1との相互作用の阻害剤を開発するための、本発明において従う工程および方法論のダイヤグラム。 酵母2−ハイブリッドアッセイにより判定される、UBC13とUEV1との相互作用を阻害する能力に関連した52のペプトイド混合物のスクリーニングの結果。UBC13−UEV1相互作用について陽性細胞を5μMの各ペプトイド混合物とともにインキュベートした。相互作用活性を、ペプトイドを加えない細胞に対して、さらに同じペプトイド混合物の存在下での陽性相互作用対照(ラージT−p53)のβ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。黒色のバーは、相互作用に対してより高い阻害活性を有する混合物に相当する。 ドッキング結果。UBC13の表面における化合物バルビンすなわちIaの分子ドッキングの構造モデル。説明図は、UBC13の表面のコナリー表示(a Connolly representation)であり、UBC13の表面においてCDOCKによる最適ドッキング状態にある化合物バルビンの表示が隣接している。UEVタンパク質(Mms2p、UEV1およびUEV2)と相互作用するのに通常使用されるUBC13の表面の疎水性ポケットにおける化合物バルビンのドッキングをよく観察するために、この表示を2つの異なる倍率で示している。 ドッキング結果。UBC13の表面における化合物Ibの分子ドッキングの構造モデル。説明図は、UEV1と相互作用するのに通常使用されるUBC13の表面のコナリー表示であり、UBC13の表面においてCDOCKによる最適ドッキング状態にある化合物Ibのバー形態での表示が隣接している。UEVタンパク質(Mms2p、UEV1およびUEV2)と相互作用するのに通常使用されるUBC13の表面の疎水性ポケットにおける化合物Ibのドッキングをよく観察するために、この表示を2つの異なる倍率で示している。 化合物Ia(バルビン)およびIbによる、UBC13タンパク質とUEV1タンパク質との相互作用の阻害。(A)酵母2ハイブリッドアッセイ。UBC13−UEV1相互作用について陽性細胞を100μMの化合物IaまたはIbとともにインキュベートした。相互作用活性を、環式化合物を加えない細胞に対して、さらに同じ濃度の前記2化合物の存在下での陽性相互作用対照(ラージT−p53)のβ−ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。 化合物Ia(バルビン)およびIbによる、UBC13タンパク質とUEV1タンパク質との相互作用の阻害。(B)精製組換えタンパク質相互作用アッセイ。組換えGST−UBC−13を100μMの化合物IaまたはIbとともにプレインキュベートし、グルタチオン−セファロースカラム上で複合体を結合した後のGST−UBC13に相互作用するUEV1の能力を判定した。E、カラムから溶出した(GST−UBC13と結合していない)画分、B カラム中に残留する(GST−UBC13と結合した、還元グルタチオン含有バッファーで溶出される)画分。 in vitroポリユビキチン化アッセイにおけるUBC13−UEV1の触媒活性の阻害。(A)対照反応においてまたは100μMの化合物Iaの存在下での遊離ポリユビキチンの経時的蓄積。これらの反応において使用されるユビキチンは、野生型ユビキチン(イソペプチド結合を形成するために利用可能な7個のリジンを有する)である。モノユビキチン化(Ub)形態およびジユビキチン化(Ub)形態は時間0において存在し、それらの存在量は動態を通して大きく変化しない。 in vitroポリユビキチン化アッセイにおけるUBC13−UEV1の触媒活性の阻害。トリユビキチン化(Ub3)形態およびテトラユビキチン化(Ub4)形態は、(B)にて示されるように、三次速度式で蓄積する。前記反応は、(A)において示したものと同じ条件で、100μMのIaの存在下でまたは不在下(対照)で実施した。 in vitroポリユビキチン化アッセイにおけるUBC13−UEV1の触媒活性の阻害。(C)では、前記反応はユビキチンK63を用いて行われる(利用可能な7個のリジンのうち、63位のものだけが利用可能であり;残りのリジンはアルギニンに突然変異したため、イソペプチド結合を形成するために利用できない)。前記反応は、(A)において示したものと同じ条件で、100μMのIaの存在下でまたは不在下(対照)で実施した。 S.セレビシエΔrad6突然変異株における化合物IaおよびIbによる、紫外線放射およびメタンスルホン酸メチルによる処置に対する感作。用量反応曲線。RAD6欠失S.セレビシエ株を、100μMの化合物Iaもしくは化合物Ibを使用せずに(YPD)または使用して、異なる紫外線放射線量(上のグラフ)または異なる時間の0.03%MMSへの曝露(下のグラフ)に供した。処置に供していない細胞と比べて生存を判定した。 S.セレビシエΔrev3突然変異株における化合物IaおよびIbによる、紫外線放射およびメタンスルホン酸メチルによる処置に対する感作。用量反応曲線。REV3欠失S.セレビシエ株を、100μMの化合物Iaもしくは化合物Ibを使用せずに(YPD)または使用して、異なる紫外線放射線量(上のグラフ)または異なる時間の0.03%MMSへの曝露(下のグラフ)に供した。処置に供していない細胞と比べて生存を判定した。 化合物IaおよびIbによる、NF−κBのトランス活性化のTNFαによる誘導の阻害。用量反応曲線。NF−κB転写活性を示すプラスミドでトランスフェクトし(ルシフェラーゼの活性化)、異なる濃度の化合物Iaまたは化合物IbとともにプレインキュベートしたまたはプレインキュベートしていないHeLa細胞を、10ng/mLのTNFκで2時間処置し、NF−κBの活性化を定量した。ルシフェラーゼ活性単位を、化合物IaまたはIbの不在下でTNFαにより誘導された活性に対して標準化した。 化合物Iaによる、PC−3細胞におけるドキソルビシンの細胞傷害効果およびHeLa細胞におけるエトポシドの細胞傷害効果に対する感作。用量反応曲線。PC−3細胞およびHeLa細胞を、100μMの化合物Iaとともにプレインキュベートしまたはプレインキュベートせず、それぞれ、異なるドキソルビシンまたはエトポシド用量に曝露した。生存細胞の定量は、CyQuantによって行い、処置に供していない細胞に対して標準化した。 ドキソルビシン単独で(i.v.、5mg/Kg、週に1回)、バルビン単独で(100μM、i.m.、週に2回)処置した、または両方の化合物で処置した対照マウスの腫瘍の相対的サイズ(各腫瘍の0日に対して標準化したRLU)のグラフ表示。各群6〜8個の腫瘍間の平均をそれらの対応する標準偏差バーとともに表示している。 Hamamatsu Photonics社製の機器により記録した、明度の52日にわたる連続トラッキングに関する、各処置群(対照、ドキソルビシン単独、バルビン単独、または併用処置)の代表的なマウス(平均に最も近いもの)の(疑似カラーからグレースケールに変換した)画像(使用した機器および特定のモデルの説明については本文を参照)。腫瘍は各動物の2本の足に存在する。各腫瘍内において、最も明瞭な領域は、最大RLUを有する領域、ゆえに最大腫瘍サイズを有する領域と相関する。

Claims (30)

  1. 式(I)の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体:
    R−(CR)q−CO−N(R)−C(R)−CO−NH
    [式中、
    Rは基:
    であり、ここで、
    は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換シクロアルキルアルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アリール、置換または非置換アリールアルキル、置換または非置換ヘテロシクリル、および置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり;
    Aは、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロシクリルから選択される基であり;
    およびRは、H、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され;
    oは、0、1、2、3および4から選択される数であり;
    nは、0および1から選択される数であり;
    直線−は、R基と式(I)の分子の残りの部分との結合部位を示し;
    およびRは、H、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され;
    は、H、置換または非置換アルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換シクロアルキルアルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アリール、置換または非置換アリールアルキル、置換または非置換ヘテロシクリル、および置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり;
    およびRは、H、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから独立に選択され;
    qは、0および1から選択される数である]。
  2. がH、置換または非置換アリールアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基であり、RがH、置換または非置換アリールアルキルおよび置換または非置換ヘテロシクリルアルキルから選択される基である、請求項1に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  3. が、置換または非置換フェニルプロピル、置換または非置換フェニルエチル、置換または非置換ベンジル、置換または非置換フリルプロピル、置換または非置換フリルエチル、置換または非置換フリルメチル、置換または非置換イミダゾリルプロピル、置換または非置換イミダゾリルエチル、置換または非置換イミダゾリルメチル、置換または非置換ピリジニルプロピル、置換または非置換ピリジニルエチル、置換または非置換ピリジニルメチル、置換または非置換ピペリジニルプロピル、置換または非置換ピペリジニルエチルおよび置換または非置換ピペリジニルメチルから選択される基であり;Rが、置換または非置換フェニルプロピル、置換または非置換フェニルエチル、置換または非置換ベンジル、置換または非置換フリルプロピル、置換または非置換フリルエチル、置換または非置換フリルメチル、置換または非置換イミダゾリルプロピル、置換または非置換イミダゾリルエチル、置換または非置換イミダゾリルメチル、置換または非置換ピリジニルプロピル、置換または非置換ピリジニルエチル、置換または非置換ピリジニルメチル、置換または非置換ピペリジニルプロピル、置換または非置換ピペリジニルエチル、および置換または非置換ピペリジニルメチルから選択される基である、請求項2に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  4. が、フッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルカルボニル、アルキルアミノ、スルホンアミノ、シアノ、ニトロ、ニトライト、ニトレート、チオニトレート、およびカルボキサミドから選択される1以上の基で置換されている基である、請求項3に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  5. が、フッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキルカルボニル、アルキルアミノ、スルホンアミノ、シアノ、ニトロ、ニトライト、ニトレート、チオニトレート、およびカルボキサミドから選択される1以上の基で置換されている基である、請求項3に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  6. が、p−フルオロフェニルエチルまたは2,4−ジクロロフェニルエチル基である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  7. Aが、塩素、フッ素および/または臭素で置換されているフェニルであり、oが1、2および3から選択される数である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  8. およびRが双方ともHであり、oが2であり、Aがp−フルオロフェニルである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  9. が2−ピリミジニルエチル、2,4−ジクロロフェニルエチルまたは4−メトキシフェニルエチルである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  10. nが1である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  11. nが0である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  12. qが0である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  13. qが1である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  14. 式Ia(N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド):
    を有する、請求項1に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  15. 式Ib(1,4−ビス[2’−(4’’フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)−カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン):
    を有する、請求項1に記載の化合物、およびその塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  16. 下式:
    N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(2’’−ピリジル)エチル)−1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
    N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)−1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
    N−アミノカルバモイルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
    1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’ピリジル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン;
    1−[2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−4−[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン;
    1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(4’’−メトキシフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン;
    N−アミノカルバモイルメチル−N−[2’−{2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル]−1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−3,7−ジオキソ−[1,4]ジアゼパン−5−カルボキサミド;
    [1,4−ビス[2’−(4’’−フルオロフェニル)エチル]−2−[N−アミノカルボニルメチル−N−(2’−(2’’,4’’−ジクロロフェニル)エチル)カルボニルメチル]ピペラジン−3,6−ジオン
    の1つを有する、請求項1に記載の化合物。
  17. 医学的使用のための、請求項1〜16のいずれか一項に記載の化合物、その薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグまたは立体異性体。
  18. UBC13酵素を含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および/または予防を目的とする医薬品の製造のための、請求項1〜16のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体の使用。
  19. UBC13酵素を含む代謝経路に関連する前記病態または疾病が、炎症性および自己免疫疾患である、請求項18に記載の使用。
  20. 前記炎症性および自己免疫病態または疾病が、炎症性腸疾患、炎症性関節病態、アトピー性皮膚炎および他の炎症性皮膚科病態、神経炎、脳炎、脳脊髄炎および中枢神経系または末梢神経系に影響を及ぼす炎症性病態、筋炎、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、炎症を呈する感染性疾患、宿主対移植片拒絶反応、結膜炎および炎症性眼症、耳炎または口腔粘膜炎である、請求項19に記載の使用。
  21. UBC13酵素を含む代謝経路に関連する前記病態または疾病が、癌または新生物である、請求項18に記載の使用。
  22. 前記癌または新生物が、前立腺癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、甲状腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮および子宮頸癌;骨肉腫、軟組織肉腫および血管肉腫;白血病およびリンパ腫を含む造血器腫瘍;神経芽腫、膠芽腫および星状細胞腫;黒色腫、皮膚の基底細胞癌または扁平上皮癌である、請求項21に記載の使用。
  23. 転写因子NF−κBを含む代謝経路に関連する病態または疾病の治療および/または予防を目的とする医薬品の製造のための、請求項1〜16のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体の使用。
  24. 前記病態または疾病が炎症プロセスまたは新生物プロセスである、請求項23に記載の使用。
  25. 抗腫瘍療法を目的とする医薬品を製造するための、請求項1〜16のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体の使用であって、前記医薬品が、化学または放射線感作作用をもたらすPCNAおよびRAD6によって媒介される遺伝毒性障害耐性経路のアンタゴニストであるか、あるいは該遺伝毒性障害耐性経路を阻害するものである、使用。
  26. 抗腫瘍薬による処置に対する哺乳類の感受性を高めるための医薬品の製造における、請求項1〜16のいずれか一項に記載の化合物の使用。
  27. 前記抗腫瘍薬がドキソルビシンまたはエトポシドである、請求項26に記載の使用。
  28. 治療上有効な量の請求項1〜16のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体を、薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとともに含んでなる、医薬組成物。
  29. 治療上有効な量の少なくとも1種の第二の治療薬をさらに含んでなる、請求項28に記載の医薬組成物。
  30. 第二の治療薬が、請求項1〜16のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学上許容される塩、溶媒和物、プロドラッグもしくは立体異性体である、請求項29に記載の医薬組成物。
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