CN113620863B - 新的哌嗪和哌啶衍生物、它们的合成及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供哌嗪和哌啶衍生物、它们的合成及其在抑制VDAC寡聚化、细胞凋亡和线粒体功能障碍中的用途。本申请还提供治疗与所述过程相关的疾病例如阿尔茨海默病的方法。

Description

新的哌嗪和哌啶衍生物、它们的合成及其用途
本发明申请是基于申请日为2016年9月13日，申请号为201680065924.7，发明名称为“新的哌嗪和哌啶衍生物、它们的合成及其在抑制VDAC寡聚化、细胞凋亡和线粒体功能障碍中的用途”的专利申请的分案申请。
本发明涉及小的有机化合物用于治疗与增强的细胞凋亡相关的疾病的用途，所述化合物与电压依赖性阴离子通道(VDAC)相互作用、降低其通道电导并作为与细胞凋亡诱导相关的VDAC寡聚化的抑制剂起作用。具体地，本发明涉及用于治疗与增强的细胞凋亡相关的疾病(诸如神经变性疾病和心血管疾病)的通式(I)和(II)的化合物。本发明还包括包含这些化合物的药物组合物以及使用该化合物及其药物组合物的方法。
VDAC通过介导穿过线粒体外膜(OMM)的离子、核苷酸和其他代谢物的流出而形成线粒体与细胞代谢之间的主要界面(interface)(Shoshan-Barmatz,V.,et.al(2010)VDAC,a multi-functional mitochondrial protein regulating bothcell life anddeath.Molecular Aspects of Medicine 31(3),227-286；Shoshan-Barmatz,V.and Ben-Hail,D.(2012)VDAC,a multi-functional mitochondrialprotein as apharmacological target,Mitochondrion,12(1):24-34)。VDAC也被认为是线粒体介导的细胞凋亡的关键蛋白。VDAC介导细胞凋亡诱导蛋白从线粒体释放到胞质中，并通过与促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的相互作用调节细胞凋亡(Shoshan-Barmatz,V.,et.al(2010)VDAC,amulti-functional mitochondrialprotein regulating both cell life anddeath.Molecular Aspects of Medicine31(3),227-286；Shoshan-Barmatz V.and GolanM.(2012)MitochondrialVDAC:Function in cell life and death and a target forcancer therapy,CurrentMedicinal Chemistry 19(5),714-735)。
哌嗪和哌啶被用作各种药物中必需的亚结构基元(motif)。哌嗪吡咯烷-2,5-二酮衍生物也已被证明为苹果酸酶抑制剂(Zhang,Y.John et al.2006.Biorganic&MedicinalChemistry Letters 16,525-528)。
本发明人现已发现，一组新的基于哌嗪和哌啶的化合物的成员与VDAC寡聚化直接相互作用并具有高的VDAC寡聚化抑制活性，因此可用作其通道电导、其寡聚化的抑制剂，并因此作为促凋亡蛋白从线粒体中释放的抑制剂，以及凋亡细胞死亡或其他细胞死亡类型(如坏死)的抑制剂。
本发明提供通式(I)的经取代的哌嗪和哌啶衍生物
其中基团R1、R2、R3、L1、L2和A如下文所定义，包括其立体异构体、对映异构体、混合物及其盐。
如下文所定义，通式(I)和(II)的化合物适合于抑制线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC)蛋白的寡聚化，这是细胞凋亡进程中的早期和关键步骤。通式(I)和(II)的化合物也适用于保护细胞免于细胞凋亡。通式(I)和(II)的化合物进一步适用于保护细胞免于与细胞凋亡诱导和/或受损的细胞能量产生、活性氧自由基(ROS)产生和/或细胞内钙浓度改变相关的线粒体功能障碍。
本发明还涉及制备本发明的通式(I)化合物的方法。
本发明还涉及含有本发明的式(I)或(II)化合物的药物组合物，以及涉及式(I)和(II)化合物在制备用于治疗疾病和病症，特别是与增强的细胞凋亡或其他细胞死亡类型(如坏死)相关的疾病和病症的药物组合物中用途。
根据以下详细描述，本发明的其他方面和实施方案对于本领域技术人员将变得显而易见。
本发明包括：
1.通式(I)化合物：
其中：
A为碳(C)或氮(N)；
R3为氢或杂烷基；其中当A为氮(N)时，R3不存在；
L1为可以不存在或存在的连接基团，但是如果存在则为氨基连接基团-NR4-，其中R4为氢、C1-n-烷基，其中n为2至5的整数(包括端值)；或经取代的烷基CH2-R，其中R为选自以下的官能团：氢、卤素、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；
R1为芳族部分，其任选取代有一个或多个Z；
Z独立地为一个或多个选自以下的官能团：氢、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、全卤代烷氧基或全氟C1-2烷氧基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；
L2为连接基团，如此当A为氮(N)时，L2为包含4-10个原子、任选形成闭合环的基团，其中至少一个原子为氮，所述氮形成酰胺基团的部分；且当A为碳(C)时，则L2为C1-n亚烷基，其中n为2至4的整数(包括端值)；
R2为苯基或萘基，任选取代有卤素；
条件是当A为碳(C)，L1为-NR4-，R4为氢，且R2为取代有氯的苯基时，则L2不为吡咯烷-2,5-二酮；
或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
2.项1的化合物，其中A为氮(N)，且所述连接基团L2选自C4-6-烷基酰胺亚基和吡咯烷亚基，所述连接基团任选取代有一个或两个烷基、羟基、氧代或硫代基团。
3.项2的化合物，其中L2选自丁酰胺亚基、N-甲基丁酰胺亚基、N,N-二甲基丁酰胺亚基、4-羟基丁酰胺亚基、4-氧代丁酰胺亚基、4-羟基-N-甲基丁酰胺亚基、4-氧代-N-甲基丁酰胺亚基、2-吡咯烷酮亚基、吡咯烷-2,5-二酮亚基、5-硫代-2-吡咯烷酮亚基和5-甲氧基-2-吡咯烷酮亚基。
4.项3的化合物，其中当L2为丁酰胺亚基、N-甲基丁酰胺亚基、N,N-二甲基丁酰胺亚基、4-羟基丁酰胺亚基、4-氧代丁酰胺亚基、4-羟基-N-甲基丁酰胺亚基或4-氧代-N-甲基丁酰胺亚基时，则丁酰胺部分第三位的碳(C)与哌嗪环或哌啶环的氮(N)键合，并且丁酰胺部分的氮(N)与R2键合；或其中当L2为2-吡咯烷酮、吡咯烷-2,5-二酮、5-硫代-2-吡咯烷酮或5-甲氧基-2-吡咯烷酮时，则吡咯烷部分的碳(C)与哌嗪环或哌啶环的氮(N)键合，并且吡咯烷部分的氮(N)与R2键合。
5.项1的化合物，其中A为碳(C)，R3为杂烷基，且L2为亚甲基。
6.项1的化合物，其具有通式(Ia)：
其中：
A、R3、Z和L1如项1中所定义，
L2'为选自以下的连接基团：C4-烷基酰胺亚基、C5-烷基酰胺亚基或C6-烷基酰胺亚基，任选取代有一个或两个烷基、羟基、氧代或硫代基团；且
Y为卤素；
或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
7.项6的化合物，其中烷基酰胺亚基L2'的3位的碳(C)与哌嗪环或哌啶环的氮(N)键合，且所述烷基酰胺亚基L2'的氮(N)与苯基键合。
8.项1的化合物，其具有通式(Ib)：
其中：
A、R3和Z如项1所定义，
L1不存在；
L2"为吡咯烷亚基连接基团，其任选取代有一个或两个烷基、羟基、氧代或硫代基团；
Y为卤素；
或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
9.项8的化合物，其中L2"选自2-吡咯烷酮亚基、吡咯烷-2,5-二酮亚基、5-硫代-2-吡咯烷酮亚基和5-甲氧基-2-吡咯烷酮亚基。
10.项8的化合物，其中吡咯烷基部分L2"的碳(C)原子与哌嗪环或哌啶环的氮(N)键合且吡咯烷基部分的氮(N)与苯基键合。
11.项1的化合物，其具有通式(Ic)：
其中：
A、R3和Z如项1所定义，
L1为-NH-；
Y1和Y2可以不存在或存在，但如果存在则独立地为卤素；
或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
12.项11的化合物，其中R3为-C(O)NHCH2C(O)OH基团。
13.前述项中任一项的化合物，其中Z为C1-2-烷氧基或全氟C1-2烷氧基。
14.项2的化合物，其具有通式(Id)：
其中
Z为全氟C1-2烷氧基，且Y为卤素。
15.项14的化合物，其具有式1：
或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
16.项14的化合物，其具有式2：
或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
17.项12的化合物，其具有式3：
或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
18.药物组合物，其含有项1-17中任一项的化合物以及一种或多种药用赋形剂。
19.项1-17中任一项的化合物在制备药物中的用途。
20.项19的化合物在制备用于治疗与增强的细胞凋亡相关的疾病或病症的药物中的用途。
21.项19或20中任一项的化合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症选自神经变性疾病和病症、心血管疾病和病症、阿尔茨海默病、帕金森病、心脏肥大、心力衰竭、心肌梗塞、缺血/再灌注损伤、细胞凋亡、心肌细胞的自噬、心房纤颤(AF)和心律失常。
22.通式(II)化合物或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐在制备用于治疗与增强的细胞凋亡相关的疾病或病症的药物中的用途，所述通式(II)为：
其中：
A为碳(C)或氮(N)；
R3为氢或杂烷基；其中当A为氮(N)时，R3不存在；
L1为可以不存在或存在的连接基团，但如果存在则选自氨基连接基团-NR4-，其中R4为氢；C1-n-烷基或C1-n-亚烷基，其中n为2-5的整数(包括端值)；或经取代的烷基CH2-R，其中R为选自以下的官能团：氢、卤素、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；
R1为芳族部分，其可取代有一个或多个Z；
Z独立地为一个或多个选自以下的官能团：氢、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、全卤代烷氧基或全氟C1-2烷氧基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；
L2为连接基团，如此当A为氮(N)时，L2为包含4-10个原子、任选形成闭合环的基团，其中至少一个原子为氮，所述氮形成酰胺基团的部分；且当A为碳(C)时，则L2为C1-n亚烷基，其中n为2至4的整数(包括端值)；
R2为苯基或萘基，任选取代有卤素。
23.项22的化合物或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐在制备用于治疗与增强的细胞凋亡相关的疾病或病症的药物中的用途，所述化合物具有式(IIa)：
其中：
A为碳(C)；
R3为氢或包含3-12个原子的杂烷基链，其中至少一个所述原子是选自氮、硫和氧的杂原子；
L1为连接基团，其为氨基连接基团-NR4-，其中R4为氢；C1-n-烷基，其中n为2至5的整数(包括端值)；和CH2-R，其中R为选自以下的官能团：氢、卤素、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；
当R3为氢时，则L1为-NR4-；当R3为包含3-12个原子的杂烷基时，则L1与R3形成环；
R1为芳族部分，其任选取代有一个或多个C1-2-烷氧基和/或全氟C1-2烷氧基；
L2为包含4-10个原子、任选形成闭合环的连接基团，其中至少一个所述原子为氮，所述氮形成酰胺基团的部分；或L2为C1-n烷基或C1-n亚烷基，其中n为2-5的整数(包括端值)；所述连接基团L2在氮(N)原子处键合哌啶或哌嗪部分；且
R2为任选取代有卤素的芳基，任选当R2为苯基时，其取代有卤素，进一步任选地当R2为萘基时，L2为亚烷基。
24.项22-23中任一项的用途，其中R3为氢，L1为-NH-，且R1为取代有三氟甲氧基的苯基。
25.项22-24中任一项的用途，其中L2选自丁酰胺亚基、N-甲基丁酰胺亚基、N,N-二甲基丁酰胺亚基、4-羟基丁酰胺亚基、4-氧代丁酰胺亚基、4-羟基-N-甲基丁酰胺亚基、4-氧代-N-甲基丁酰胺亚基、2-吡咯烷酮亚基、吡咯烷-2,5-二酮亚基、5-硫代-2-吡咯烷酮亚基和5-甲氧基-2-吡咯烷酮亚基。
26.项22的用途，其中所述式(II)化合物具有式10：
27.项22的用途，其中所述式(II)化合物具有式11：
28.项22-27中任一项的用途，其中所述药物用于治疗选自以下的疾病或病症：神经变性疾病和病症、心血管疾病和病症、阿尔茨海默病、帕金森病、心脏肥大、心力衰竭、心肌梗塞、缺血/再灌注损伤、细胞凋亡、心肌细胞的自噬、心房纤颤(AF)和心律失常。
29.用于预防和/或治疗疾病的方法，所述疾病选自神经变性疾病和病症、心血管疾病和病症、阿尔茨海默病、帕金森病、心脏肥大、心力衰竭、心肌梗塞、缺血/再灌注损伤、细胞凋亡、心肌细胞的自噬、心房纤颤(AF)和心律失常，所述方法包括向有此需要的受试者给予治疗有效量的如前述项中任一项所定义的通式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(II)的化合物。
附图说明
图1示出与中间体1相关的两个感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱图。
图2a示出与式2化合物相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图2b示出与式2化合物相关的代表性NMR谱。
图3示出与中间体2相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图4a示出与式1化合物相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图4b示出与式1化合物相关的代表性NMR谱。
图5示出与中间体3相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图6示出与中间体4相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图7示出与中间体5相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图8示出与中间体6相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图9示出与中间体7相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图10示出与中间体8相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图11a示出与式3化合物相关的感兴趣的峰的代表性色谱图和各自的质谱。
图11b示出与式3化合物相关的氘化DMSO中的代表性NMR谱。
图11c示出与式3化合物相关的氘化DMSO和氘化水(D2O)中的代表性NMR谱。
图12a和12b示出与式1化合物的分离的单一对映异构体(分别鉴定为BGD-4-1和VBIT-4-2)相关的氘代DMSO中的代表性NMR谱。
图13a示出在不存在或存在亚硒酸盐的情况下，具有或不具有VDAC1二聚化抑制剂DNDS(Ben-Hail D,Shoshan-Barmatz V.VDAC1-interactinganion transport inhibitorsinhibit VDAC1 oligomerization and apoptosis.BiochimBiophys Acta.2016Jul；1863(7Pt A):1612-2)的VDAC1二聚化实验中的BRET2信号。
图13b示出在不存在或存在亚硒酸盐的情况下，具有或不具有VDAC1二聚化抑制剂DNDS(Ben-Hail D,Shoshan-Barmatz V.VDAC1-interactinganion transport inhibitorsinhibit VDAC1 oligomerization and apoptosis.BiochimBiophys Acta.2016Jul；1863(7Pt A):1612-2)的VDAC1寡聚化实验中电印迹凝胶的代表性VDAC1免疫印迹。通过EGS交联稳定VDAC寡聚体。
图14a示出在亚硒酸盐存在下，具有或不具有式1的单一对映异构体或外消旋化合物的VDAC1低聚化实验中代表性VDAC1免疫印迹的电印迹凝胶(VDAC1 immunoblottedelectroblotted gel)。通过EGS交联稳定VDAC1寡聚体。
图14b示意性示出在亚硒酸盐存在下，作为式1的单一对映异构体或外消旋化合物的浓度的函数的凋亡细胞死亡抑制。
图15a示出在亚硒酸盐存在下，具有或不具有式1的外消旋化合物及式2和式10化合物的VDAC1寡聚化实验中代表性VDAC1免疫染色的电印迹凝胶(VDAC1 immunostainedelectroblotted gel)。
图15b示出在亚硒酸盐存在下，作为式1、2和10化合物浓度的函数的VDAC1寡聚化的抑制。实心圆(●)表示式1化合物，空心圆(○)表示式10化合物，且空心方形(□)表示式2化合物。
图15c示意性示出作为式1、2和10化合物浓度的函数的亚硒酸盐诱导的凋亡性细胞死亡的抑制。实心圆(●)表示式1化合物，空心圆(○)表示式10化合物，且空心方形(□)表示式2化合物。
图15d示出暴露于亚硒酸盐和式1、2和10化合物后线粒体和胞质部分中Cyto c和VDAC1的代表性VDAC1免疫染色的电印迹凝胶条带。
图15e示出作为式1、2和10化合物浓度的函数的亚硒酸盐诱导的CytoC释放的抑制。实心圆(●)表示式1化合物，空心圆(○)表示式10化合物，且空心方形(□)表示式2化合物。
图16a示出在SH-SY5Y细胞中，在不存在或存在顺铂的情况下，暴露于式1和10化合物后，VDAC1的代表性免疫染色的电印迹凝胶。
图16b示出在Bax-/-/Bak-/-MEF细胞中，在顺铂存在下，暴露于式1和10化合物后，VDAC1的代表性免疫染色的电印迹凝胶。
图16c示出在SH-SY5Y细胞中，在顺铂存在下，在式1和10化合物存在下，凋亡细胞死亡和VDAC1二聚体形成的抑制。
图16d示出在Bax-/-/Bak-/-MEF细胞中，在顺铂存在下，在式1和10化合物存在下，细胞凋亡细胞Cyto C释放和VDAC1二聚体形成的抑制。
图17a示出在亚硒酸盐存在下，暴露于浓度增加的式10化合物后，VDAC1的代表性VDAC1免疫染色的电印迹凝胶。
图17b示出在亚硒酸盐存在下，作为暴露于增加浓度的式10化合物的函数的细胞凋亡和VDAC1二聚体形成的抑制。
图17c示出在顺铂存在下，暴露于增加浓度的式10化合物后，VDAC1的代表性VDAC1免疫染色的电印迹凝胶。
图17d示出在顺铂存在下，作为暴露于增加浓度的式10化合物的函数的细胞凋亡和VDAC1二聚体形成的抑制。
图17e示出作为VDAC1二聚化抑制的函数的细胞凋亡抑制的程度，其在相同浓度的式10和由顺铂(空心方形-□)或亚硒酸盐(实心正方形-■)诱导时得到。
图18a示出在式1、2和10化合物存在下，通过经纯化的VDAC1通道的电流。
图18b示出在变化的施加电压，在式1(实心圆)、2(空心方形)或10(空心圆)化合物存在下，经纯化的VDAC1的最大电导率分数。
图18c示出式1、式2和式10化合物与经纯化的VDAC1的结合分数，作为其浓度的函数。
图19a示出在经亚硒酸盐处理的细胞中，式1和式10化合物对细胞内钙离子浓度的影响。
图19b示出在经亚硒酸盐处理的细胞中，式1和式10化合物对线粒体膜电位的影响。
图19c示出在经亚硒酸盐处理的细胞中，式1和10化合物对ROS水平的影响。
图19d示意性示出在经亚硒酸盐处理的细胞中，式1和式10化合物对线粒体超氧化物水平的影响。
图20A示出式1化合物对使用旋臂水迷宫(Radial Arm Water Maze)测试的具有阿尔茨海默病样症状的转基因小鼠的学习和记忆的影响；错误的数量以学习区块的函数示出。
图20B示出式1化合物对使用旋臂水迷宫测试的具有阿尔茨海默病样症状的转基因小鼠的学习和记忆的影响；每个测试的总时间以学习区块的函数示出。
根据本发明的一个方面，提供通式(I)化合物：
其中：
A为碳(C)或氮(N)；
R3为氢或杂烷基；其中当A为氮(N)时，R3不存在；
L1为可以不存在或存在的连接基团，但是如果存在则为氨基连接基团-NR4-，其中R4为氢；C1-n-烷基，其中n为2至5的整数(包括端值)；或经取代的烷基CH2-R，其中R为选自以下的官能团：氢、卤素、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰胺基团、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；优选R4为氢；
R1为芳族部分，优选苯基，其可取代有一个或多个Z；
Z独立地为一个或多个选自以下的官能团：氢、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、全卤代烷氧基或全氟C1-2烷氧基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰胺基团、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；优选Z为全氟C1-2烷氧基；优选R1为苯基且Z为三氟甲氧基；优选R1为取代有一个三氟甲氧基的苯基，最优选在对位；
L2为连接基团，如此当A为氮(N)时，L2为包含4-10个原子(除氢原子外)、任选形成闭合环的基团，其中至少一个原子为氮，所述氮形成酰胺基团的部分；优选所述连接基团选自C4-6-烷基酰胺亚基和吡咯烷亚基，所述连接基团任选取代有一个或两个烷基、羟基、氧代或硫代基团；最优选L2最优选丁酰胺亚基、N-甲基丁酰胺亚基、N,N-二甲基丁酰胺亚基、4-羟基丁酰胺亚基(HO-CH2-C*H-CH2-C(O)NH-，其中星号表示连接点)、4-氧代丁酰胺亚基、4-羟基-N-甲基丁酰胺亚基、4-氧代-N-甲基丁酰胺亚基、2-吡咯烷酮亚基、吡咯烷-2,5-二酮亚基、5-硫代-2-吡咯烷酮亚基和5-甲氧基-2-吡咯烷酮亚基；
且当A为碳(C)时，则L2为C1-n亚烷基，其中n为2至4的整数(包括端值)；L2优选为亚甲基(-CH2-)；
R2为苯基或萘基，任选取代有卤素，优选当R2为苯基，则其取代有卤素，优选在对位取代有氯，优选当R2为萘基，L2为亚烷基，优选-CH2-；
条件是当A为碳(C)，L1为-NR4-，R4为氢，且R2为取代有氯的苯基时，则L2不为吡咯烷-2,5-二酮。
在一个实施方案中，当A为氮(N)时，连接基团L2选自C4-6-烷基酰胺亚基和吡咯烷亚基，所述连接基团任选取代有一个或两个烷基、羟基、氧代或硫代基团。例如，L2可为丁酰胺亚基、N-甲基丁酰胺亚基、N,N-二甲基丁酰胺亚基、4-羟基丁酰胺亚基、4-氧代丁酰胺亚基、4-羟基-N-甲基丁酰胺亚基、4-氧代-N-甲基丁酰胺亚基、2-吡咯烷酮亚基、吡咯烷-2,5-二酮亚基、5-硫代-2-吡咯烷酮亚基或5-甲氧基-2-吡咯烷酮亚基。优选地，当L2为丁酰胺亚基、N-甲基丁酰胺亚基、N,N-二甲基丁酰胺亚基、4-羟基丁酰胺亚基、4-氧代丁酰胺亚基、4-羟基-N-甲基丁酰胺亚基或4-氧代-N-甲基丁酰胺亚基，则丁酰胺部分第三位的碳(C)优选与哌嗪环或哌啶环的氮(N)键合，并且丁酰胺部分的氮(N)与R2键合。例如，当L2为2-吡咯烷酮、吡咯烷-2,5-二酮、5-硫代-2-吡咯烷酮或5-甲氧基-2-吡咯烷酮时，则优选吡咯烷部分的碳(C)与哌嗪环或哌啶环的氮(N)键合，并且吡咯烷部分的氮(N)与R2键合。
在另一个实施方案中，A为碳(C)，R3为杂烷基且L2为亚甲基。
本发明还涉及本发明的通式(I)化合物的立体异构体、对映异构体、其混合物和盐，特别是生理学上可接受的盐。
根据本发明的另一个方面，提供通式(Ia)化合物：
其中：
A、R3、Z和L1如先前关于式(I)化合物所定义；优选A为氮(N)；
L2'为选自以下的连接基团：C4-烷基酰胺亚基、C5-烷基酰胺亚基或C6-烷基酰胺亚基，任选取代有一个或两个烷基、羟基、氧代或硫代基团；优选L2'最优选丁酰胺亚基、N-甲基丁酰胺亚基、N,N-二甲基丁酰胺亚基、4-羟基丁酰胺亚基、4-氧代丁酰胺亚基、4-羟基-N-甲基丁酰胺亚基或4-氧代-N-甲基丁酰胺亚基；最优选L2'为4-羟基丁酰胺亚基；其中优选烷基酰胺亚基L2'的烷基部分3位的碳(C)与哌嗪环或哌啶环的氮(N)键合，且丁酰胺部分的氮(N)与苯基键合；优选L2'为HO-CH2-C*H-CH2-C(O)NH-，其中星号表示连接点；
Y为卤素，优选氯，例如在对位；
或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
根据本发明的另一个方面，提供通式(Ib)化合物：
其中：
A、R3和Z如先前关于式(I)化合物所定义；优选A为氮(N)；
L1不存在；
L2"为吡咯烷亚基连接基团，其任选取代有一个或两个烷基、羟基、氧代或硫代基团，优选L2"选自2-吡咯烷酮亚基、吡咯烷-2,5-二酮亚基、5-硫代-2-吡咯烷酮亚基和5-甲氧基-2-吡咯烷酮亚基；最优选L2"为吡咯烷-2,5-二酮亚基；其中优选吡咯烷基部分L2"的4位的碳(C)或3位的碳(C)与哌嗪环或哌啶环的氮(N)和吡咯烷基部分的氮(N)与取代有Y的苯基键合；
Y为卤素，优选氯，例如在对位；
条件是当A为碳(C)，L1存在且R4为氢时，L2"不为吡咯烷-2,5-二酮。
根据本发明的又一个方面，提供通式(Ic)化合物：
其中：
A、R3和Z如先前关于通式(I)化合物所定义；
L1为-NH-；
Y1和Y2可以不存在或存在，但如果存在则独立地为卤素；
或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
优选的式(Ic)化合物为这样的化合物，其中R3为-C(O)NHCH2C(O)OH基团，和/或其中Z为C1-2-烷氧基或卤代C1-2-烷氧基，例如全氟C1-2烷氧基。
根据本发明的另一个方面，提供通式(Id)化合物：
其中
L2选自C4-6-烷基酰胺亚基(例如HO-CH2-C*H-CH2-C(O)NH-，其中星号表示连接点)和吡咯烷亚基(例如吡咯烷-2,5-二酮亚基)，任选取代有一个或两个烷基、羟基、氧代或硫代基团；
Z为卤代烷氧基，例如全氟C1-2烷氧基，且Y为卤素。
本发明还涉及本发明通式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)化合物的立体异构体、对映异构体、其混合物及其盐。
表1提供通式(I)化合物的非限制性实例。其包括如下化合物：N-(4-氯苯基)-4-羟基-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-哌嗪-1-基)丁酰胺(式1)、1-(4-氯苯基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2,5-二酮(式2)、1-(萘-1-基)甲基)-4-(苯基氨基)-哌啶-4-羰基)甘氨酸(式3)、1-(4-氯苯基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2-酮(式4)、1-(4-氯苯基)-5-硫代-3-(4-(4-(三氟-甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2-酮(式5)、1-(4-氯苯基)-5-甲氧基-4-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-哌嗪-1-基)吡咯烷-2-酮(式6)、1-(4-氯苯基)-5-硫代-4-(4-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基)哌啶-1-基)吡咯烷-2-酮(式7)、4-(4-氯苯基)-4-氧代-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酰胺(式8)、N-(4-氯苯基)-4-羟基-N-甲基-3-(4-(4-(三氟-甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酰胺(式9)。
表1
本文用于描述本发明化合物的一些术语在下文更具体地定义。
术语卤素表示选自F、Cl、Br和I的原子，优选Cl和Br。
本文关于通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的R3部分所用的术语杂烷基是指具有3-12个原子(除氢原子外)的饱和或不饱和基团，其中一个或多个(优选1、2或3个)原子为氮、氧或硫原子，例如烷基氧基，例如甲氧基或乙氧基，或甲氧基甲基-、氰基-、甲基羧基烷基酯-或2,3-二氧基乙基-基团；优选杂烷基基团为包含亚烷基和至少一个羧酸部分、羰基部分、胺部分、羟基部分、酯部分、酰胺部分的链。术语杂烷基还指羧酸或衍生自羧酸的基团，例如酰基、酰基氧基、羧基烷基、羧基烷基酯，诸如甲基羧基烷基酯、羧基烷基酰胺、烷氧基羰基或烷氧基羰基氧基；优选该术语是指-C(O)NHCH2C(O)OH基团。
术语C1-n-烷基，其中n可具有如本文所定义的值，表示具有1至n个碳(C)原子的饱和、分支或未分支烃基。这类基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基等。
术语C1-n-烷氧基，其中n可具有如本文所定义的值，表示经由-O-(氧)连接基键合的如本文所定义的烷基。
术语全氟C1-n-烷氧基，其中n可以具有如本文所定义的值，表示其中氢原子被氟原子取代的烷氧基。
术语C1-m-烷基酰胺基，其中m可具有如本文所定义的值，表示包含1至m个碳(C)原子和由Cm-a烷基-COOH与H2N-Ca烷基或Cm-a烷基-NH2与HOOC-Ca烷基形成的酰胺基的基团，其中a小于或等于m。类似地，术语C4-烷基酰胺亚基、C5-烷基酰胺亚基和C6-烷基酰胺亚基是指二价Cm-烷基酰胺基，其中m分别是4、5或6。
除非上下文另有明确规定，否则本文使用的术语“VDAC”是指电压依赖性阴离子通道蛋白，涉及其所有同工型，例如，涉及同工型VDAC1、同工型VDAC2或同工型VDAC3。
根据本发明的另一个方面，本文提供了制备式(I)化合物的方法。本发明的式(I)化合物可使用已知的合成方法获得。优选地，所述化合物通过下文更全面描述的制备方法获得。
某些通式(I)化合物(其中L1不存在且A为氮)可如下制备：将式R1-X的芳基卤化物(其中X为卤素，优选溴)与单保护的哌嗪，例如与BOC-保护的哌嗪反应，并且在脱保护后，与可与仲胺反应的L2-连接基前体反应，随后用合适的式(Y)R2-NH2的胺将L2-连接基前体部分酰胺化或转酰胺基化。L2-连接基前体可为不饱和的C4-6羧酸衍生物化合物，例如不饱和C4-6内酯或C4-6羧酸的β-、γ-、δ-或ε-不饱和直链酯，及合适的醇，例如C1-6醇。或者，脱保护的R1-哌嗪可与通过公知的方法制备的合适的N-R2-吡咯烷酮或N-R2-吡咯烷-二酮反应(例如在Synthesis,anticonvulsant activity and 5-HT1A,5-HT2Areceptor affinity of newN-[(4-arylpiperazin-1-yl)-alkyl]derivatives of 2-azaspiro[4.4]nonane and[4.5]decane-1,3-dione,by Obniska,J.；Kolaczkowski,M.；Bojarski,A.J.；Duszynska,B.,European Journal of Medicinal Chemistry(2006),41(7),874-881中)。
通式(Ia)和(Ib)的化合物可根据方案1至3中所示的方法(a)从通式A化合物开始制备，其中Z如上文所定义。
方案1
通过使通式A化合物与其中一个氮被保护基团(例如叔丁氧基羰基保护基团(BOC基团))保护的哌嗪反应获得通式C化合物。通式A的起始化合物或者是可商购的，或者可通过使用已知方法从可商购获得的化合物制备。碳-氮(C-N)偶联反应在特别合适的钯催化剂诸如三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3)存在下进行。该反应在二齿膦配体和碱存在下进行。合适的二齿膦配体为二苯基膦基联萘(BINAP)和二苯基膦基二茂铁(DPPF)，而BINAP为特别优选的。合适的碱包括叔丁醇钠、叔丁醇钾、双(三甲基甲硅烷基)氨基锂，而叔丁醇钠是特别合适的。反应在合适的非质子溶剂诸如甲苯、四氢呋喃(THF)、二噁烷中，但优选在甲苯中，在氮气气氛下，在55℃至110℃的温度，优选在65℃至110℃的温度，最优选80℃和110℃的温度进行。反应完成后，将溶剂蒸发，得到粗的式C化合物，为可用于下一步而无需进一步纯化的残余物。
通过移去通式C化合物中的保护基团例如BOC，获得通式D化合物，保护基团的移去可用强酸诸如三氟乙酸(其为纯态或在二氯甲烷中)，或用浓HCl在甲醇或二氯甲烷(DCM)中完成，而浓HCl/DCM为优选的。该反应优选在室温进行。在反应完成后，弃去有机相并将水相蒸发至干。将残余物溶于碱和适当的溶剂中，诸如DCM、二氯乙烷或2-甲基四氢呋喃(MeTHF)、NaOH(2.0M)且DCM为优选的。在反应完成后，收集有机溶剂相例如DCM并浓缩，得到粗的通式D产物，其可用于下一步而无需进一步纯化。
由通式D化合物获得通式(Ia)和(Ib)的化合物。例如，某些优选的通式(Ia)化合物可根据方案2如下获得：使通式D化合物与合适的内酯例如2-呋喃酮反应，得到通式E化合物，将其与合适的氨基苯基反应生成通式(Ia)化合物。
方案2
例如，可根据方案3，通过使通式D化合物与合适的吡咯二酮例如1-苯基-1H-吡咯-2,5-二酮(其为可商购的或可通过本领域技术人员熟悉的方法容易地制备)反应获得某些优选的通式(Ib)化合物，得到通式(Ib)化合物。
方案3
可由通式(Y1)(Y2)R2-L2-X的卤代化合物制备某些通式(I)化合物，其中R3存在且不为氢且其中L1存在，所述通式(Y1)(Y2)R2-L2-X的卤代化合物与经保护的哌啶酮在碱存在下，并且回收的酮为R3-硅烷化的例如次氮基硅烷化的，在通式R1-L1-H(L1-H为-NR4-基团，其中R4如上所定义)的胺存在下，在酸性环境中偶联，得到通式(Y1)(Y2)R2-L2-N[-CH2-CH2-]2C(R3)L1-R1化合物，其中R3为腈。此后，腈可在强酸中水解成相应的酰胺并且进一步在强碱中水解成相应的羧酸，其通过肽方法反应成经保护的甘氨酸酯，最后脱保护，得到式(I)化合物。
某些优选的通式(Ic)化合物可根据方案4和4a中所示的方法(b)制备，起始于通式F的萘化合物，其中X为卤素，优选氯，p为具有1、2或3的值的整数且Y1和Y2如上文所定义。
方案4
通常，通式H化合物如下获得：使通式F化合物与哌啶酮(优选4-哌啶酮)反应，所述哌啶酮用合适的二醇例如乙二醇保护，随后脱去酮的保护。反应在极性溶剂诸如二甲基甲酰胺(DMF)或四氢呋喃(THF)中在碱存在下进行。合适的碱可为碳酸盐，例如碳酸钾、碳酸钠。反应可在0℃至60℃之间，优选15℃至40℃之间的温度进行，最优选在环境温度进行，例如，在室温。反应可保持约6-18小时，优选约10-14小时。产品可被纯化，例如通过色谱法纯化，并通过在酸性条件下加热产物进行去保护。脱保护可在合适的溶剂中进行，例如，溶解所使用的酸(例如盐酸)的醇，诸如乙醇。
所获得的式H化合物可进一步与合适的经取代硅烷例如三甲基硅腈(TMSCN)，在合适的伯胺或仲胺例如苯胺、哌啶、乙胺、丙胺、乙基丙胺、二丙胺存在下，在合适的溶剂中在酸性条件下例如在乙酸、三氟乙酸、苯甲酸中反应。试剂可在低于60℃，优选低于40℃，进一步优选在0℃和40℃之间的温度和优选在10℃和20℃之间的温度组合。反应可保持约6-18小时，优选约10-14小时。在中和酸之后，可将反应混合物萃取到非极性溶剂诸如二氯甲烷中，得到式J的腈化合物，其可不经进一步纯化而使用。
式J的腈化合物可根据下面的方案4a进一步转化为通式(Ic)化合物：
方案4a
式K化合物通过将式J的腈化合物在强酸例如在浓硫酸、硝酸、氢溴酸(HBr)和盐酸(HCl)中水解来制备。反应可保持约6-18小时，优选约10-14小时。在中和反应混合物之后，式K化合物可被纯化，例如，通过反相制备型HPLC纯化。
式K化合物可进一步水解成式N化合物，例如用氢氧化钾在极性溶剂中，例如在乙二醇中。试剂可在110℃和170℃之间的温度，最优选在140℃和160℃之间的温度组合。反应可保持约6-18小时，优选约10-14小时。在反应混合物冷却后，式N化合物可被纯化，例如，通过反相制备型HPLC纯化。然后式N化合物可在偶联剂例如1-[二(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]-吡啶鎓-3-氧化物六氟磷酸盐(称为HATU)和二异丙基乙胺存在下与DMF中的甘氨酸甲酯反应约6-18小时，优选约10-14小时，然后纯化，例如通过反相制备型HPLC纯化，得到式Q化合物。可使用的其他偶联剂为N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、3-(乙基亚氨基亚甲基氨基)-N,N-二甲基丙-1-胺(EDC)、3-[双(二甲基氨基)-甲基鎓离子(methyliumyl)]-3H-苯并三唑-1-氧化物六氟磷酸盐(HBTU)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)，1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代乙亚基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉亚甲基)]-甲基六氟磷酸铵(COMU)。
最后，式Q化合物可用碱例如氢氧化锂在非质子溶剂诸如四氢呋喃中水解约6-18小时，优选约10-14小时，以释放甲酯并提供粗的通式(Ic)化合物。然后可将反应混合物中和至pH约7，然后纯化，例如，通过制备型HPLC，提供通式(Ic)化合物。
通式(Id)化合物根据对通式(Ia)和(Ib)的化合物所述的方法制备。
在上述反应中，任何反应性基团，诸如氨基、烷基氨基、羟基或羧基，可在反应过程中通过本领域已知的方法由反应后裂解的常规保护基保护。
本发明还涉及通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的立体异构体诸如非对映异构体和对映异构体、混合物和盐，特别是生理上可接受的盐，以及结构式1、2、3、4、5、6、7、8和9的化合物。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物或合成通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的中间体产物可基于它们的物理-化学差异使用本领域已知的方法拆分为其对映异构体和/或非对映异构体。例如，顺式/反式混合物可通过色谱法拆分为其顺式和反式异构体。例如，对映异构体可通过色谱或手性相或通过从光学活性溶剂中重结晶或通过富含对映异构体的种晶来分离。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物及结构式1、2、3、4、5、6、7、8和9的化合物可转化为其盐，特别是生理上可接受的药用盐。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物及结构式1、2、3、4、5、6、7、8和9的化合物的盐可与有机或无机酸形成，诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸或马来酸。含有羧基的通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物可与有机或无机碱转化为其盐，特别是转化为生理上可接受的药用盐。用于此目的的合适碱包括例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、精氨酸或乙醇胺。
根据另一个方面，本文提供了通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，诸如但不限于，结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物的用途，例如作为电压依赖性阴离子通道(VDAC)的寡聚化抑制剂。
本发明的另一个方面涉及如下定义的根据通式(II)化合物在制备用于治疗本文所述疾病的药物中的用途。
其中：
A为碳(C)或氮(N)；
R3为氢或杂烷基，其包含除氢之外的3-12个原子，其中至少一个为杂原子，优选选自氮、硫和氧；其中当A为氮(N)时，R3不存在；
L1为可以不存在或存在的连接基团，但如果存在则选自氨基连接基团-NR4-，其中R4为氢；C1-n-亚烷基，其中n为2-5的整数(包括端值)；或经取代的烷基，CH2-R，其中R为选自以下的官能团：氢、卤素、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰胺基团、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；优选R4为氢，任选地L1与R3形成环；
R1为芳族部分，优选苯基，其可取代有一个或多个C1-2-烷氧基、全氟C1-2烷氧基；优选R1为取代有三氟甲氧基的苯基；优选R1为取代有一个三氟甲氧基的苯基，优选在对位；
L2为包含4-10个原子，优选5-6个原子，任选形成闭合环的连接基团，其中至少一个原子为氮，所述氮形成酰胺基团的部分，优选所述连接基团选自C4-6-烷基酰胺亚基或吡咯烷亚基，所述连接基团任选取代有一个或两个烷基、羟基、氧代或硫代基团；更优选L2选自丁酰胺亚基、N-甲基丁酰胺亚基、N,N-二甲基丁酰胺亚基、4-羟基丁酰胺亚基、4-氧代丁酰胺亚基、4-羟基-N-甲基丁酰胺亚基、4-氧代-N-甲基丁酰胺亚基、2-吡咯烷酮亚基、吡咯烷-2,5-二酮亚基、5-硫代-2-吡咯烷酮亚基和5-甲氧基-2-吡咯烷酮亚基；或L2为C1-n亚烷基，其中n为2-5的整数(包括端值)，优选为亚甲基(-CH2-)；所述连接基团L2在氮(N)原子处键合哌啶或哌嗪部分；且
R2为芳基，优选苯基或萘基，任选取代有卤素，任选当R2为苯基时，其取代有卤素，优选氯，优选在对位，进一步任选当R2为萘基时，L2为亚烷基，优选亚甲基(-CH2-)。
本发明的另一个方面涉及如下定义的通式(IIa)化合物在制备用于治疗本文所述疾病的药物中的用途。
其中：
A为碳(C)；
R3为氢或包含3-12个原子的杂烷基链，其中至少一个是选自氮、硫和氧的杂原子；
L1为连接基团，其为氨基连接基团-NR4-，其中R4为氢；C1-n-烷基，其中n为2至5的整数(包括端值)；和CH2-R，其中R为选自以下的官能团：氢、卤素、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、羧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰胺基团、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；
当R3为氢时，则L1为-NR4-；当R3为包含3-12个原子的杂烷基时，则L1与R3形成环；
R1为芳族部分，其任选取代有一个或多个C1-2-烷氧基，例如卤代烷氧基，诸如全氟C1-2烷氧基；
L2为包含4-10个原子、任选形成闭合环的连接基团，其中至少一个原子为氮，所述氮形成酰胺基团的部分或L2为C1-n烷基或C1-n亚烷基，其中n为2-5的整数(包括端值)；所述连接基团L2在氮(N)原子处键合哌啶或哌嗪部分；优选地，L2最优选丁酰胺亚基、N-甲基丁酰胺亚基、N,N-二甲基丁酰胺亚胺、4-羟基丁酰胺亚基、4-氧代丁酰胺亚基、4-羟基-N-甲基丁酰胺亚基、4-氧代-N-甲基丁酰胺亚基、2-吡咯烷酮亚基、吡咯烷-2,5-二酮亚基、5-硫代-2-吡咯烷酮亚基和5-甲氧基-2-吡咯烷酮亚基；且
R2为任选取代有卤素的芳基，任选当R2为苯基时，其取代有卤素，进一步任选地当R2为萘基时，L2为亚烷基。在一个具体的实施方案中，R3为氢，L1为-NH-，且R1为取代有三氟甲氧基的苯基。
本发明还涉及通式(II)和(IIa)的化合物的立体异构体、对映异构体、其混合物和盐，特别是生理上可接受的盐的用途。
在具体的实施方案中，本文提供通式(II)和(IIa)的化合物的用途，其具有结构式10和11：
式10化合物在本文中也被标示为AKOS022或AKOS022075291。
式11化合物在本文中也被标示为DIV 00781。
通式(II)和(IIa)的化合物，诸如但不限于结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，可被转化为其盐，特别是生理上可接受的药用盐。通式(II)和(IIa)的化合物的合适的盐，诸如但不限于结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，可与有机或无机酸形成，诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸或马来酸。含有羧基的通式(II)和(IIa)的化合物可与有机碱或无机碱转化为其盐，具体转化为生理上可接受的药用盐。用于此目的的合适的碱包括例如钠盐、钾盐、精氨酸盐、铵盐或乙醇胺盐。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3和10的具体化合物，为电压依赖性阴离子通道(VDAC)寡聚化和细胞凋亡的抑制剂。通过生物发光共振能量转移(BRET2)技术确定本发明化合物和式1、2、3、10和11的具体化合物对VDAC寡聚化的作用(即它们抑制VDAC寡聚化的能力)，该技术允许直接监测活细胞中天然膜中VDAC分子的寡聚化状态。BRET2筛选可如本领域所述进行(Keinan et al.,(2010)Oligomerizationofthe mitochondrial protein voltage-dependent anion channel is coupled totheinduction of apoptosis.Mol Cell Biol 30,5698-5709)。
通式(II)和(IIa)的化合物具有范围为0.1μM至10μM的若干活性的IC50值。
VDAC与通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物之间的直接相互作用，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，可通过在其重构为平面脂质双层(PLB)后评估VDAC通道电导来测量。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物与VDAC相互作用并降低其通道电导。为了获得这种相互作用的定量参数并导出解离常数，例如可进行微量热泳(microscalethermophoresis,MST)相互作用测定。以这种方式，从显示本发明化合物对VDAC的亲和性的曲线得到解离值。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，被发现保护细胞免于凋亡性细胞死亡。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物抑制细胞凋亡的能力可通过膜联蛋白-V/碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术进行分析。
细胞凋亡被激活的一种方式是通过将细胞色素c(Cyto c)从线粒体释放到胞质中。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，被发现如细胞凋亡刺激诱导的那样抑制Cytoc从线粒体的释放，由此保护细胞免于凋亡性细胞死亡。通过使用Cyto c特异性抗体进行免疫印迹可分析释放到胞质中的Cyto c。
显示细胞凋亡诱导破坏细胞Ca2+稳态和能量产生。实际上，许多抗癌药物及其他细胞毒性剂，诸如毒胡萝卜素(thapsigargin)、星形孢菌素(staurosporine)、As2O3和亚硒酸盐，诱导凋亡性细胞死亡以及破坏细胞Ca2+稳态(Keinan et al.,(2013)The role ofcalciumin VDAC1 oligomerization andmitochondria-mediated apoptosis.BiochimBiophys Acta 1833,1745-1754))。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，被发现抑制由细胞凋亡刺激引起的细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的升高。增加的[Ca2+]i与线粒体Ca2+增加有关，这一过程预期会导致线粒体电位(mΔΨ)的耗散(Baumgartner et al.,(2009)Calcium elevation inmitochondriais the main Ca2+requirement for mitochondrial permeabilitytransition pore(mPTP)opening.J Biol Chem 284,20796-20803)。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，被发现有效预防由细胞毒性剂引起的mΔΨ降低。本发明化合物预防由细胞毒剂诱导的mΔΨ降低的能力可使用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)测量。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，为总体细胞反应性氧化物(ROS)产生和线粒体ROS产生的抑制剂。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，对抑制细胞内ROS产生的作用可以通过2′,7′二氯荧光素(DCF)荧光来确定。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，作为线粒体ROS产生的抑制剂的作用，可通过MitoSOX Red(一种线粒体超氧化物指示剂)测量。
鉴于通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，抑制VDAC的寡聚化和/或VDAC的通道离子电导或细胞凋亡和/或Cyto c从线粒体的释放和/或由细胞毒剂引起的细胞内钙浓度升高([Ca2+]i)和/或反应性氧化物质(ROS)的产生当中一种或多种的能力，通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，及其药用盐，可适用于治疗和/或预防可通过抑制VDAC的寡聚化、Cyto c从线粒体的释放、细胞内钙浓度升高([Ca2+]i)和反应性氧化物质(ROS)的产生当中一种或多种起作用的所有病症或疾病。因此，通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，及其药用盐，特别适用于预防或治疗与增强的细胞凋亡相关的疾病或病症，诸如但不限于神经变性和心血管疾病和病症。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，尤其是1、2、3、10和11的具体化合物，及其药用盐，也特别适用于预防或治疗以下疾病或病症，诸如阿尔茨海默病、帕金森病、心脏肥大、心力衰竭、心肌梗塞、局部缺血/再灌注损伤、细胞凋亡和心肌细胞的自噬、心房纤颤(AF)、心律失常和相关疾病。已经发现用式1化合物治疗改善了阿尔茨海默病样转基因小鼠的学习和记忆任务，其类似于野生型小鼠的学习和记忆任务，如以下实施例中所述。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，诸如但不限于结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，尤其是式1、2、3、10和11的具体化合物，及其药用盐，可配制在药物组合物中，任选包含其他活性物质和一种或多种惰性常规赋形剂，如本领域技术人员所已知。药物组合物可根据本领域提供的通用指南制备，例如，Remington,TheScience andPractice of Pharmacy(以前称为Remington’s Pharmaceutical Sciences),ISBN978-0-85711-062-6。药物组合物，例如固体剂型、局部剂型和/或肠胃外剂型，例如片剂、胶囊、乳膏、软膏、贴剂、注射剂和本领域已知的其他剂型，构成本发明的另一个方面。
具体地，通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，特别是结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，尤其是式1、2、3、10和11的具体化合物，及其药用盐，可配制成纳米颗粒。纳米颗粒可在公知的聚合物中制备，例如聚乳酸-共-乙醇酸，例如如H.K.Makadia,S.J.Siegel,Poly Lactic-co-Glycolic Acid(PLGA)as BiodegradableControlled Drug DeliveryCarrier,Polymers(Basel),3(2011)1377-1397等所述。通常，化合物可与聚合物在合适的有机溶剂中共同溶解，然后可将有机相分散在包含稳定剂和/或表面活性剂的水相中。稳定剂可为，例如，分子量约为89000至98000和约99％的水解度的聚乙烯醇。从水相蒸发有机溶剂后，纳米颗粒可被纯化，例如通过离心和洗涤。
包囊的通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，诸如但不限于结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，尤其是式1、2、3、10和11的具体化合物，及其药用盐，例如纳米颗粒形式，可有利地用于各种给药途径。在这方面，鼻内途径可能是合适的给药模式。或者，纳米颗粒可全身给药以在癌组织中累积。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，诸如但不限于结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，尤其是式1、2、3、10和11的具体化合物，及其药用盐，达到治疗或预防疾病或障碍或病症的剂量，通常取决于待给药的化合物的药代动力学和药效学性质，患者，疾病、障碍或病症的性质，以及给药的方法和频率。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物，诸如但不限于结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，尤其是式1、2、3、10和11的具体化合物，及其药用盐，可为1.0至100mg/kg体重。
带有至少一个氟原子例如作为三氟甲基的一部分的式(I)、(Ia-d)、(II)和(IIa)的化合物，诸如但不限于结构式1、2、4、5、6、7、8、9和10的化合物，尤其是式1、2和10的具体化合物，可适用为正电子发射断层扫描的诊断剂。为此目的，这些化合物可用本领域已知的18F同位素进行修饰或合成。这些18-氟代化合物可适用于活生物体中VDAC过表达的成像。特别地，通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的18-氟代化合物可用于检测由于治疗引起的病理状况或变化，特别是对于病症的早期检测，例如阿尔茨海默病、心血管疾病、胰腺β细胞和其他组织中VDAC表达模式的变化。
因此，另一方面提供用于预防或治疗选自以下的疾病：神经变性疾病和病症、心血管疾病和病症、阿尔茨海默病、帕金森病、心脏肥大、心力衰竭、心肌梗塞、缺血/再灌注损伤、细胞凋亡，心肌细胞的自噬、心房纤颤(AF)和心率失常，包括向有需要的受试者给予治疗有效量的如本文所定义通式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(II)和(IIa)的化合物或其药学可接受的盐。
实施例
材料
羰基氰化物间氯苯基腙(CCCP)、羧甲基纤维素(CMC)、顺铂、细胞松弛素B、二甲基亚砜(DMSO)、DL-二硫代苏糖醇(DTT)、EDTA、HEPES、亮抑酶肽(leupeptine)、苯基甲基磺酰氟(PMSF)、N-癸烷亚硒酸钠、大豆磷脂(soybean asolectin)，星形孢菌素(STS)、四甲基罗丹明甲酯(TMRM)和Tris购自Sigma(St.Louis,MO)。N,N-月桂基-(二甲基)-胺氧化物(LDAO)获自Fluka(Buchs,Switzerland)。腔肠素(Coelenterazine)(Deep Blue C[DBC])获自Bioline(Taunton,MA)。羟基磷灰石(Bio-Gel HTP)购自Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA)。洋地黄皂苷(Digitonin)来自Calbiochem-Novobiochem(Nottingham,UK)。硅藻土(Celite)购自British Drug Houses(London,UK)。针对VDAC1的兔单克隆抗体(ab154856)和针对GAPDH的小鼠单克隆抗体(ab9484)来自Abcam(Cambridge,UK)。针对肌动蛋白的单克隆抗体获自Millipore(Billerica,MA)，并且抗细胞色素c抗体(556433)获自BDBioscience(San Jose,CA)。多克隆抗AIF(细胞凋亡诱导因子)抗体来自R&D Systems(Minneapolis,MN)。Fluo-4-AMTM(CAS名称/编号：甘氨酸，N-[4-[6-[(乙酰基氧基)甲氧基]-2,7-二氟-3-氧代-3H-呫吨-9-基]-2-[2-[2-[双[2-[(乙酰基氧基)甲氧基]-2-氧代乙基]氨基]-5-甲基苯氧基]乙氧基]苯基]-N-[2-[(乙酰基氧基)甲氧基]-2-氧代乙基]-,(乙酰基氧基)甲酯273221-67-3)，羧基-H2DCFDATM(5-(和-6)-羧基-2",7"-二氯二氢荧光素二乙酸酯(羧基-H2DCFDA)和MitoSOXTM Red(红色线粒体超氧化物指示剂)获自Invitrogen(Grand Island,NY)。辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠和抗兔抗体获自Promega(Madison,WI)。乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯](EGS)获自Pierce(Rockford,IL)。膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)来自Enzo Life Sciences(Lausen,Switzerland)。Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)和补充剂胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素购自BiologicalIndustries(Beit-Haemek,Israel)。式10化合物(AKOS022)获自AKosConsulting&Solutions GmbH(Germany)，目录号为AKOS022075291。聚乳酸-共-乙醇酸(聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯,30,000-60,000Da)获自Sigma。Sigma提供聚乙烯醇，Mw89000-98000，水解度99％。
方法
LC-MS分析
使用常规Bridge C18柱(4.6×50mm，3.5μm，保持在40℃)进行色谱分析。以2mL/min洗脱物质：使用0.01M碳酸铵水溶液和乙腈的混合物，用乙腈从5％升至100％，持续如下所述的时间，并用100％乙腈洗脱，检测目标质量。
组织培养
HEK-293、HeLa、SH-SY5Y和K-Ras转化的Bax-/-/Bak-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞系在37℃，在95％空气和5％CO2气氛下，在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1000U/ml青霉素和1mg/ml链霉素的DMEM中生长。稳定表达hVDAC1-shRNA并显示低(10-20％)内源性VDAC1表达的T-REx-293细胞(稳定地含有pcDNA6/TR调控载体并由此表达四环素阻遏物；Invitrogen)(在本文中也称为T-REx-pS10)在与HEK-293细胞相同的条件(添加5μg/ml杀稻瘟素)下生长。
VDAC-1交联
在处理后收获PBS中合适的测试细胞(2.5-3mg/ml)，并与交联剂EGS以100-300μM的比例孵育2-3mg蛋白质/ml浓度(pH 8.3)的样品15分钟。根据Lowry测定法确定蛋白质浓度。通过标准技术对样品(60-80μg蛋白质)进行SDS-PAGE，并使用抗VDAC1抗体进行免疫印迹。将凝胶电转移到硝酸纤维素膜上进行免疫染色。将膜与含有5％脱脂奶粉和0.1％Tween-20的封闭溶液在Tris缓冲盐水中孵育，然后与单克隆抗-VDAC1、抗-细胞色素c、抗-AIF或抗-肌动蛋白抗体孵育。然后将膜与HRP缀合的抗-小鼠或抗-兔IgG(1:10,000)一起孵育，用作二抗。通过化学发光检测抗体标记。为了检测VDAC1寡聚体，在免疫印迹之前用0.1M甘氨酸(pH 2.0)处理膜，并在Tris缓冲盐水中用0.1％Tween-20洗涤数次。使用FUSION-FX(Vilber Lourmat,France)进行免疫反应性VDAC1二聚体、三聚体和多聚体条带的定量分析。
VDAC1纯化
简言之，将10mM Tris-HCl(pH 7.2)中的大鼠肝线粒体(5mg/ml)与2％LDAO在0℃孵育20分钟，接着离心(30分钟，14,000g)，并将获得的上清液加载到干硅藻土:羟基磷灰石(2:1)柱上。用含有2％LDAO、10mM Tris-HCl(pH 7.2)、50mM NaCl和20至22mM NaH2PO4的溶液洗脱VDAC1，通过考马斯蓝染色检测VDAC1。含有VDAC1的馏分用10mM Tris-HCl(pH 7.2)透析，然后在羧甲基纤维素(CMC)柱上进行第二次色谱步骤，用含有10mMTris-HCl(pH7.2)、0.1％LDAO和500mM NaCl的溶液洗脱VDAC1，如上检测。收集含VDAC1的馏分并用于VDAC1通道电导和MST测定。
VDAC1通道电导
如下进行纯化的大鼠VDAC1重构成平面脂质双层(PLB)和随后的单通道和多通道电流记录和数据分析。简言之，PLB由溶于正癸烷(30mg/ml)的大豆磷脂制备。将经纯化的VDAC1(1ng)添加至含有1M NaCl,10mM Hepes(pH 7.4)的定义为顺式侧(cis side)的室中。使用Bilayer Clamp BC-535B放大器(Warner Instrument,Hamden,CT)在电压钳下记录电流。将相对于膜(地)的反式侧测量的电流以1kHz进行低通滤波，并使用Digidata1440接口板和pClampex 10.2软件(Axon Instruments,Union City,CA)进行在线数字化。
微量热泳(MST)分析
使用NanoTemper Monolith NT.115装置进行MST分析。简言之，根据生产商说明书(L001,NanoTemper Technologies)使用NanoTempers蛋白质标记试剂盒BLUE对经纯化的VDAC1 10μM进行荧光标记。将恒定浓度的蛋白质与不同浓度的测试抑制剂在PBS中孵育。此后，将3-5μl样品装载到玻璃毛细管(Monolith NT毛细管)中并进行热泳分析(LED 20％,IR激光20％)。
测量超氧化物产生
使用氧化剂敏感性染料DCFDA(2',7'-二氯荧光素二乙酸酯)荧光探针监测ROS(活性氧物种)产生，所述荧光探针是ROS的细胞渗透性指示剂，其被H2O2和过氧化物酶转化为DCF(2',7'-二氯荧光素)荧光衍生物。简言之，将未处理和经处理的细胞与DCFDA (4μM)孵育30分钟。对于线粒体累积的ROS，根据制造商的方案(Invitrogen,Grand Island,NY)使用用于活细胞成像的线粒体超氧化物指示剂MitoSOX Red(4μM)。使用FACSCaliburTM流式细胞仪软件(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)测量荧光。
线粒体膜电位确定
使用电位敏感性染料TMRM(四甲基罗丹明，甲基酯，高氯酸盐)和平板读数器确定线粒体膜电位(mΔΨ)。用测试化合物和凋亡诱导剂处理HEK-293细胞，随后用TMRM(0.5μM，20分钟)孵育。然后将细胞用PBS洗涤两次并用FACSCaliburTM流式细胞仪软件(BDBiosciences,Franklin Lakes,NJ)检查。CCCP(羰基氰化物间氯苯基肼)介导的ΔΨ耗散作为对照。
细胞Ca2+浓度分析
Fluo-4 AMTM用于监测胞质Ca2+水平的变化。在处理后收获细胞，例如HeLa细胞(1x106个细胞/ml)，收集(1,500xg相对离心力(RCF))(持续10min)，用补充有1.8mM CaCl2(HBSS+)的HBSS(Hanks平衡盐溶液)缓冲液pH 7.3-7.4(5.33mM KCl、0.44mM KH2PO4、138mMNaCl、4mM NaHCO3、0.3mMNa2HPO4、5.6mM葡萄糖0.03mM酚红)缓冲液洗涤，并在37℃的黑暗中与2.5μM Fluo-4 AMTM/200μl(HBSS+)孵育30分钟。洗涤剩余的染料后，将细胞与200μl(HBSS+)缓冲液孵育，并立即用FACS分析测量细胞游离Ca2+浓度的变化。在FL1检测器上记录至少10,000个事件，以直方图表示，并用FACS Calibur流式细胞术软件分析。阳性细胞显示向增强水平的绿色荧光的转移(FL1)。
从线粒体的细胞色素c释放
在存在或不存在测试化合物的情况下收获用细胞凋亡诱导剂处理的细胞，用PBS(pH 7.4)洗涤两次并轻轻地以6mg/ml重悬于含有0.025％洋地黄皂苷的冰冷缓冲液(100mMKCl、2.5mM MgCl2、250mM蔗糖、20mMHEPES/KOH pH 7.5、0.2mM EDTA、1mM二硫代苏糖醇、1μg/ml亮抑肽酶、5mg/ml细胞松弛素B和0.1mM PMSF)中并在冰上孵育10分钟。将样品在4℃以10,000xg(相对离心力-RCF)离心5分钟以获得上清液(不含线粒体的胞质提取物)和沉淀(含有线粒体的部分)。使用细胞色素c特异性抗体通过免疫印迹分析释放到胞质中的细胞色素c。使用抗-VDAC1和抗-GAPDH抗体来验证胞质提取物不含线粒体。
使用碘化丙啶(PI)和膜联蛋白V-FITC染色的流式细胞术
使用PI、膜联蛋白V-FITC和流式细胞仪分析未处理或用细胞凋亡诱导试剂处理的细胞例如HeLa细胞(2×105)的凋亡性细胞死亡。收集细胞(1500×g，10min)，洗涤并重悬于200μl结合缓冲液(10mM HEPES/NaOH(pH7.4)、140mM NaCl和2.5mM CaCl2)中。根据推荐的方案(Enzo Life Sciences,Switzerland)添加膜联蛋白V-FITC，并将细胞在黑暗中孵育15分钟。然后用结合缓冲液洗涤细胞并重悬于200μl结合缓冲液中，在流式细胞术分析前立即向其中添加PI。收集至少10,000个事件，记录在点阵图上，并通过FACSCaliburTM流式细胞仪软件(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)进行分析。
中间体1的制备
步骤A
根据以下方案合成中间体1。
使用起始物质试剂1(对三氟甲氧基-溴苯；1-溴-4-(三氟甲氧基)苯)。向试剂1(2.41g,10mmol)于甲苯(50mL)中的溶液中相继添加以下化合物：试剂2(1-Boc-哌嗪；哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(1.68g,9mmol)、Pd2(dba)3(三(二亚苄基丙酮)二钯)(290mg,0.5mmol)、2,2'-双(二苯基膦基)-1,1'-联萘(BINAP)(311mg,0.5mmol)和叔丁醇钠(1.92g,20mmol)。混合物在N2气氛下回流过夜。蒸发溶剂以提供作为残余物的粗制试剂3(4-(4-(三氟甲基)-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯)。
步骤B
试剂3未经进一步纯化直接用于下一步骤。
根据以下方案通过酸水解移去Boc基团。
将包含在50mL浓盐酸和50mL二氯甲烷中的粗制试剂3的混合物在室温搅拌1.5小时。分相后，弃去二氯甲烷相，将水相真空蒸发至干。将残余物溶于50mL氢氧化钠水溶液(2.0M)中，添加50mL二氯甲烷并再搅拌1.5小时。收集有机相并真空浓缩，得到中间体1，其为棕色油状物(2.0g，步骤A和B的产率为80％)。
使用如上所述的LC-MS方法分析中间体1，在1.6分钟内上升并洗脱1.4分钟，在+246处检测。与中间体1有关的两个感兴趣的峰的代表性色谱图和相应的质谱示于图1。
实施例1
式2化合物(VBIT-3,1-(4-氯苯基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2,5-二酮)的制备
根据以下反应方案合成式2化合物(VBIT-3)：
向中间体1(207mg,1mmol)于甲醇(2mL)中的溶液中添加试剂5(1-(4-氯苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)(246mg,1mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。将最终混合物浓缩并通过制备型反相HPLC纯化，得到式2化合物(VBIT-3)，其为白色固体(100mg,22％产率)。
使用如上所述的LC-MS方法分析产物(式2化合物(VBIT-3))，在3分钟内上升并洗脱1分钟，在+453检测。色谱图示于图2a。
NMR谱在400MHz装置(Varian)上获得。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.592(d,J＝2.2Hz,2H),7.339(d,J＝2.2Hz,2H),7.201(d,J＝2.2Hz,2H),7.021(d,J＝2.1Hz,2H),4.137(dd,J＝1.3Hz,1H),3.159(m,J＝1.1Hz,4H),3.00(m,J＝2.4Hz,3H),2.871(m,J＝1.3Hz,H),2.680(m,J＝2.0Hz,2H)。
图谱示于图2b。
实施例2
式1化合物(VBIT-4,N-(4-氯苯基)-4-羟基-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酰胺)的制备
根据以下反应方案合成式1化合物(VBIT-4)：
步骤A
将中间体1(2.0g,8mmol)和呋喃-2(5H)-酮(2(5H)-呋喃酮)(1.3g,16mmol)于甲醇(MeOH)(5mL)中的混合物在室温搅拌过夜。将混合物真空蒸发，残余物通过反相制备型HPLC纯化，得到中间体2[3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)-二氢呋喃-2(3H)-酮)，其为白色固体(1.3g,0.4mmol,50％产率)。
使用如上所述的LC-MS方法分析产物(中间体2)，在1.6分钟内上升并洗脱1.4分钟，在+330处检测。色谱图示于图3。
步骤B
向4-氯苯胺(254mg,2mmol)于甲苯(5mL)中的溶液中添加三甲基铝(AlMe3)(2.0M于甲苯中的溶液，2mL)。搅拌10分钟后，将中间体2(330mg,1.0mmol)添加至该溶液中，并将所得混合物加热至80℃持续8小时。冷却至室温后，真空蒸发溶剂，残余物通过反相制备型HPLC纯化，得到式1化合物(VBIT-4)，其为白色固体(200mg,44％产率)。
使用如上所述的LC-MS方法分析产物(式1化合物)，在3分钟内上升并洗脱1分钟，在+457检测。色谱图示于图4a。
NMR谱在400MHz装置(Varian)上获得。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.081(s,H),7.601(d,J＝0.5Hz,2H),7.341(d,J＝1.2Hz,2H),7.177(d,J＝2.2Hz,2H),6.980(d,J＝2.3Hz,2H),4.538(dd,J＝1.2Hz,1H),3.561(m,J＝1.3Hz,H),3.440(m,J＝1.4Hz,H),3.112(m,J＝1.2Hz,5H),2.807(m,J＝1.6Hz,2H),2.709(m,J＝1.5,Hz,2H),2.400(m,J＝1.4,Hz,H),2.150(m,J＝1.4,Hz,H)。图谱示于图4b。
实施例3
式3化合物(VBIT-12,2-(1-(萘-1-基甲基)-4-(苯基氨基)哌啶-4-甲酰胺基)乙酸)的制备
步骤1
将1-(氯甲基)萘(8.8g,50mmol)溶于二甲基甲酰胺(DMF)(100mL)中，添加碳酸钾(13.8g,100mmol)，随后添加4-哌啶酮乙二缩酮(1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷)(7.2g,50mmol)。将混合物在室温搅拌过夜。真空蒸发溶剂，残余物通过硅胶色谱(用二氯甲烷洗脱)纯化，得到纯的萘化缩酮(中间体3)，其为白色固体(8.5g,60％产率)。
使用如上所述的LC-MS方法分析中间体3，在1.6分钟内上升并洗脱1.4分钟，在+283处检测。色谱图示于图5。
步骤2
将中间体3(步骤1的产物)(1.42g,5mmol)于20ml 3N盐酸(HCl)/乙醇(EtOH)中的溶液回流过夜。将所得混合物真空浓缩，得到中间体4(1-(萘-1-基甲基)哌啶-4-酮)，其不经进一步纯化即使用。
使用如上所述的LC-MS方法分析产物(中间体4)，在1.6分钟内升高并洗脱1.4分钟，在+239处检测。色谱图示于图6。
步骤3
中间体4(N-甲基萘基-4-哌啶酮)(2.4g,10mmol)和苯胺(930mg,10mmol)溶于冰醋酸(AcOH)(25mL)中。此后，历经10分钟逐滴添加三甲基氰硅烷(TMSCN)(1.3mL,10mmol)，使用冷水浴保持温度低于40℃。将该溶液搅拌过夜，然后倒入由50mL浓氢氧化铵溶液和100g碎冰形成的氢氧化铵冰混合物中。缓慢添加另外的浓氢氧化铵直到pH升至10。将所得混合物用100mL氯仿萃取三次，合并的有机层以硫酸钠干燥，过滤并浓缩成黄色腈残余物(中间体5,1-(萘-1-基甲基)-4-(苯基氨基)哌啶-4-腈)，其不经进一步纯化而直接用于下一步。
使用如上所述的LC-MS方法分析产物(中间体5)，在1.6分钟内上升并洗脱1.4分钟，在+341处检测。色谱图示于图7。
步骤4
根据以下方案水解腈(中间体5)：
中间体5(步骤3的产物)与10mL浓硫酸(H2SO4)混合。将混合物在室温搅拌过夜。缓慢添加浓氢氧化铵溶液直至pH升高至10。将最终混合物浓缩并通过反相制备HPLC纯化，得到酰胺(中间体6,1-(萘-1-基甲基)-4-(苯基氨基)哌啶-4-甲酰胺)，其为白色固体(400mg,步骤2-4的产率为11％)。
使用如上所述的LC-MS方法分析产物(中间体6)，上升1.6分钟并洗脱1.4分钟，在+359检测。色谱图示于图8。
步骤5
根据以下方案将中间体6进一步水解成羧酸：
中间体6(360mg,1.0mmol)溶于乙二醇(10mL)中，添加氢氧化钾(KOH)(280mg,5mmol)。将所得混合物加热至150℃并搅拌过夜。冷却至室温后，将最终混合物真空浓缩并通过反相制备型HPLC纯化，得到游离羧酸(中间体7,1-(萘-1-基甲基)-4-(苯基氨基)-哌啶-4-羧酸)，其为白色固体(200mg,50％产率)。
使用如上所述的LC-MS方法分析产物(中间体7)，升高1.6分钟并洗脱1.4分钟，在+360检测。色谱图示于图9。
步骤6
根据以下方案将中间体7用2-氨基乙酸甲酯(甘氨酸甲酯)甘氨酸化(glycinated)：
中间体7(180mg,0.5mmol)、HATU(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]-吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)(380mg,1.0mmol)、N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)(260mg,2.0mmol)和甘氨酸甲酯(90mg,1.0mmol)溶于DMF(10mL)中，并将溶液在室温搅拌过夜。将所得混合物真空浓缩并通过反相制备型HPLC纯化，得到甘氨酸酯甲酯(中间体8,(1-(萘-1-基甲基)-4-(苯基氨基)哌啶-4-羰基)甘氨酸甲酯)，其为白色固体(100mg,46％产率)。
使用如上所述的LC-MS方法分析产物(中间体8)，上升1.6分钟并洗脱1.4分钟，在+431检测。色谱图示于图10。
步骤7
根据以下方案用氢氧化锂/四氢呋喃水解中间体8(步骤6的甘氨酸甲酯产物)：
向中间体8(100mg,0.23mmol)于5mL THF中的溶液中添加氢氧化锂(LiOH)(40mg,1.0mmol)于5mL水中的溶液，将所得混合物在室温搅拌过夜。此后，用1.0N HCl将pH调节至约7。将混合物真空浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到式3化合物(VBIT-12)，其为白色固体(20mg,20％产率)。
使用如上所述的LC-MS方法分析产物(式3化合物；IUPAC名称：2-(1-(萘-1-基甲基)-4-(苯基氨基)哌啶-4-甲酰氨基)乙酸)，在3分钟内上升并洗脱1分钟，在+417处检测。色谱图示于图11a。
NMR谱在400MHz装置(Varian)上获得。
1H NMR(400MHz,DMSO/D2O-d6):δ8.63(d,H),8.1(s,H),7.9(d,J＝1.2Hz,2H),7.89(d,J＝2.2Hz,2H),7.87(d,J＝2.3Hz,2H),7.71(dd,J＝1.2Hz,2H),7.67(d,J＝1.3Hz,2H),7.16(2,J＝1.4Hz,2H),6.78(m,4H),3.80(s,2H),3.71(s,2H),2.31(d,J＝2.4,Hz,2H),2.25(s,2H),2.17(t,J＝2.4,2H),1.98(t,J＝1.9,2H),1.88(t,J＝1.8,2H)
d6-DMSO和含有D2O的d6-DMSO中的图谱分别示于图11b和11c。
实施例4
式1化合物(VBIT-4)对映异构体的手性分离
通过分析手性型HPLC分析外消旋的式1化合物(VBIT-4)。简言之，将物质在Chiralpak-IC3柱(4.6x100mm,3μm)上，保持在35℃，以2mL/min，用乙腈和20％的0.1％DEA/甲醇溶液洗脱。以预期比率约50.0％获得两个峰，保留时间差异为0.38分钟(2.32和2.7分钟)。然后进行制备型手性HPLC。单独收集每个峰。通过400MHz NMR分析对映异构体，但在氘代DMSO中不可辨别。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.081(s,H),7.601(d,J＝0.5Hz,2H),7.341(d,J＝1.2Hz,2H),7.177(d,J＝2.2Hz,2H),6.980(d,J＝2.3Hz,2H),4.538(dd,J＝1.2Hz,1H),3.561(m,J＝1.3Hz,H),3.440(m,J＝1.4Hz,H),3.112(m,J＝1.2Hz,5H),2.807(m,J＝1.6Hz,2H),2.709(m,J＝1.5,Hz,2H),2.400(m,J＝1.4,Hz,H),2.150(m,J＝1.4,Hz,H)。
图12a示出与式1化合物的分离的单一对映体VBIT-4-1(也称为BGD-4-1)有关的氘代DMSO中的代表性NMR谱。图12b示出与式1化合物的分离的单一对映体VBIT-4-2(也称为BGD-4-2)有关的氘代DMSO中的代表性NMR谱。
实施例5
用于监测活细胞中VDAC1寡聚化的生物发光共振能量转移(BRET-2)测定法
使用BRET2质粒(Perkin Elmer,Waltham,MA)构建编码融合蛋白大鼠(r)VDAC1-GFP2和rVDAC1-luc的质粒。将rVDAC1基因克隆到BRET2质粒(N2变体)的BamHI和HindIII位点，并使用正向引物CGAAGCTTATGGCTGTGCCACCCACGTATGCC和反向引物GGATCCGCCGCCGCCGGAGCCGCCGCCGCCTGCTTGAAAT-TC扩增。反向引物设计为含有连接VDAC1和向该区域引入柔性的RLuc或GFP2基因的双接头序列((GGGS)2)。
将编码针对用于特异性沉默内源性人VDAC1的人VDAC1(hVDAC1)的shRNA的质粒引入shRNA表达载体。使用两个互补的寡核苷酸序列产生hVDAC1-shRNA编码序列，每个寡核苷酸序列含有hVDAC1的19个核苷酸靶序列(337-355)，随后是靶标的短间隔基和反义序列：
寡核苷酸1，
AGCTTAAAAACACTAGGCACCGAGATTATCTCTTGAATAATCTCGGTGCCTAGTGTG和
寡核苷酸2，
GATCCACACTAGGCACCGAGATTATTCAAGAGATAATCTCGGTGCCTAGTGTTTTTTA,其中VDAC1衍生序列加下划线。将hVDAC1-shRNA-编码序列克隆到含有嘌呤霉素抗性基因的pSUPERretro质粒(OligoEngine,Seattle,WA)的BglII和HindIII位点中。该序列在RNA聚合酶III的H1 RNA启动子控制下的转录产生发夹结构(hVDAC1-shRNA)。
显示低(10-20％)内源性VDAC1表达(称为T-REx-pS10细胞)的稳定表达hVDAC1-shRNA的T-REx-293细胞以每孔9,000个细胞的密度接种在96孔板上并孵育至少24小时直至连接。
使用磷酸钙方法转染细胞。用0.2μg编码rVDAC1-Rluc的质粒和0.8μg编码rVDAC1-GFP2的质粒进行转染。作为阴性对照，用编码rVDAC1-Rluc(0.2μg DNA)和GFP2(0.8μg)的质粒转染细胞。在另一个对照(对照细胞)中，细胞还用编码rVDAC1-luc(0.2μg)的质粒和质粒pcDNA4/TO(0.8μg)转染。
BRET2信号表示在其发射波长(510nm)测量的GFP2荧光相对于在395nm发射的光强度(发光)之比。所有测量均使用Infinite 200ELISA读数器(Tecan)进行。BRET2信号被定义为GFP2/Rluc强度比并计算如下：
(a)从在表达VDAC1-Rluc和VDAC1-GFP2的细胞中获得的信号中扣除在VDAC1-RLuc/pcDNA4/TO细胞(对照细胞)中获得的BRET2信号。
(b)计算海肾荧光素酶(Renilla luciferase)和GFP2活性的净比率(从对照细胞扣除BRET2信号后的GFP2/荧光素酶比率)。
(c)比较暴露和未暴露于细胞凋亡诱导剂的不同细胞之间的BRET2信号比率。
(d)为验证BRET2测定的稳固性(robustness)，通过细胞凋亡诱导剂STS(Starosporine)诱导VDAC1寡聚化。作为测定稳固性度量的Z-因子和Z’-因子如下计算：
Z＝[BRET2比率(AVG+STS)-(AVG-STS)]/SD(+STS).
Z因子>3被认为是好的，获得约为28的计算的Z值。
Z'＝1-[3xSD(+STS)+3xSD(-STS)]/[AVG(+STS)-AVG(-STS)]
获得值为0.58的Z'因子，其在0.5-1的要求范围内；其中
SD表示标准偏差，AVG＝几个样品的BRET2信号的平均值(重复10-36)。
或者，使用以下等式计算Z因子：Z＝[BRET2比率(AVG+STS)-(AVG-STS)]/SD(+STS)，其中Z因子>3被认为是好的。
作为测定稳固性的量度，使用以下等式获得Z'因子：Z'＝1-[3×SD(+STS)+3×SD(-STS)]/[AVG(+STS)-AVG(-STS)]。
a)Z'因子的值为0.58，基于细胞的测定法在0.5-1的要求范围内。
编码融合蛋白rVDAC1-Rluc(其中RLuc通过接头(GGGS)在C末端位置与rVDAC1连接)和rVDAC1-GFP2(其中GFP2与rVDAC1C末端融合)的DNA被克隆到BRET2载体中。rVDAC1-GFP2和rVDAC1-Rluc在稳定表达shRNA-hVDAC1和低水平的内源性hVDAC1的T-REx-293细胞(称为T-REx-pS10细胞)中表达。hVDAC1-shRNA对人VDAC1具有特异性，允许rVDAC1的表达并降低内源性hVDAC1参与寡聚化，从而增强BRET2信号。rVDAC1-GFP2和rVDAC1-Rluc表达水平与所用质粒的量相关。具体而言，发现0.8μg rVDAC1-GFP2和0.1μg rVDAC1-Rluc产生最佳信号。
最近，本发明人证明亚硒酸盐诱导细胞凋亡和VDAC1寡聚化。因此，使用亚硒酸盐增强BRET-2可检测的VDAC1寡聚化。相反，作为VDAC1通道电导和细胞凋亡的抑制剂的4,4-二异硫氰基二苯乙烯-反式-2,2-二磺酸(Ben-Hail D,Shoshan-Barmatz V.VDAC1-interacting anion transport inhibitors inhibit VDAC1 oligomerization andapoptosis.Biochim Biophys Acta.2016Jul；1863(7Pt A):1612-2)用于抑制任何亚硒酸盐诱导的BRET2信号。化学交联和Western印迹分析也用于证明VDAC1寡聚化的任何增强或抑制。
如下处理T-REx-293细胞：首先将细胞孵育1小时(不含或含有DNDS，终浓度为200μM，100μL)，然后与浓度为30μM的亚硒酸再孵育3小时。
孵育后，使用胰蛋白酶收获细胞，用PBS洗涤两次，接着在1000xg离心5分钟，重悬于200μl PBS中，并在96孔透明底板(Grenier)的两个孔之间分开。使用在补充有氯化镁(1g/L)和葡萄糖(1g/L)的PBS中的膜可渗透底物DBC测定荧光素酶活性，其中在测量发光之前添加DBC至5μM的终浓度。
结果示于图13a。
实施例6
鉴定VDAC1寡聚化抑制剂
通过以下方法A和B测试本发明化合物抑制VDAC1寡聚化的能力：
方法A-凋亡诱导试剂诱导的VDAC1寡聚化-BRET2测定法
如上所述，使用BRET2测定法进行筛选。简言之，将如上所述培养的含有低VDAC1水平的T-Rex-293细胞转染以表达rVDAC1-GFP2(0.8μg)和rVDAC1-Rluc(0.1μg)，并以9,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。将测试化合物用DMSO稀释至2mM的测试化合物的浓度并冷冻储存。将测试化合物(1μl的2mM储备溶液)添加(使用机器人系统)至细胞中，至100μl中的终浓度为10μM(1％终DMSO浓度)。将细胞与测试化合物预孵育1小时，然后与下列细胞凋亡诱导剂中的一种孵育：STS,1μM(3h)或亚硒酸盐,30μM(3h)或As2O3,60μM(3h)，将其全部在生长培养基中。处理后，除去培养基并如上所述测定BRET2信号。用Tecan(Switzerland)Freedom150Robotic&MCA Liquid Handling System进行液体处理，同时通过机器人集成的Tecan Infinite M1000读取器获得荧光素酶发光和荧光读数。
方法A用于筛选VDAC1寡聚化抑制剂。例如，使用该方法测试由美国国家癌症研究所(NCI)提供的类药化合物文库，并且以BRET2信号的抑制百分比表示的结果示于下表2中。
表2.来自NCI文库的化合物的抗-VDAC1寡聚化活性的基于BRET2的筛选结果的总结
表2提供了来自NCI文库的化合物的抗-VDAC1寡聚化活性的基于BRET2的筛选结果的总结。结果表示为由所指示的促凋亡剂诱导的BRET2信号的抑制百分比。如通过使用三种诱导剂该测试所鉴定的，12种最具活性的来自NCI文库的化合物是以下化合物编号：15362、601359、42199、10428、154389、19487、680515、15364、146771、39047和19115。
方法B-通过化学交联测定VDAC1寡聚化
如上文实施例5中所述处理T-Rex-293细胞，并如上文方法(VDAC1交联)中所述用EGS交联，进行SDS电泳并对VDAC1进行免疫印迹。结果示于图13b。
本发明人先前报道了方法A和B针对细胞凋亡抑制剂4,4'-二硝基二苯乙烯-2,2'-二磺酸(DNDS)的等价性(Ben-Hail D,Shoshan-Barmatz V.VDAC1-interacting aniontransport inhibitors inhibit VDAC1 oligomerization and apoptosis.BiochimBiophys Acta.2016 1863(2016)1612-1623)。
通过方法B测试本发明化合物抑制VDAC1寡聚化的能力，结果在下文的实施例8-12中提供。
实施例8
通过外消旋VBIT-4和对映异构体抑制VDAC1寡聚化
将HEK-293细胞与外消旋的式1化合物(VBIT-4)、式1化合物的对映异构体1(VBIT-4-1(也被鉴定为BGD-4-1))或式1化合物的对映异构体2(VBIT-4-2(也称为BGD-4-2))(10μM)孵育2小时，然后使用或不使用亚硒酸盐(15μM,4小时)。收获细胞，如上所述用EGS交联(300μM,5分钟)，并使用抗-VDAC1抗体通过免疫印迹进行分析。
结果示于图14a。指出了VDAC1单体和多聚体的位置。星号表示具有改变的电泳迁移率的单体VDAC1，代表分子内交联的单体VDAC1。
实施例9
外消旋的式1化合物(VBIT-4)和式1化合物的对映异构体(VBIT-4-1和VBIT-4-2)抑制凋亡性细胞死亡
将HeLa细胞与不同浓度(2-20μM)的外消旋的式1化合物(VBIT-4)和式1化合物的对映异构体(VBIT-4-1和VBIT-4-2)孵育1小时，然后使用或不使用亚硒酸盐(25μM,3小时)。收获细胞并使用PI染色和FACS分析测定凋亡性细胞死亡。图14b中显示的结果对应于平均值±SD(n＝3)。
实施例10
式10化合物(AKOS-022)、式2化合物(VBIT-3)和外消旋的式1化合物(VBIT-4)在HEK-293细胞中抑制VDAC1寡聚化、细胞凋亡和细胞色素C释放
a.将HEK-293细胞不使用或使用以下测试化合物孵育2小时：式10化合物(AKOS-022)、式2化合物(VBIT-3)或外消旋的式1化合物(VBIT-4)(2.5-15μM)，然后使用或不使用亚硒酸盐(15μM,4小时)，胰蛋白酶消化，用PBS洗涤，测定蛋白质浓度并收获，与EGS(3mg蛋白质/ml,300μM,15min)交联，和通过使用抗-VDAC1抗体的免疫印迹进行分析。VDAC1单体和多聚体的位置示于图15a。星号表示具有改变的电泳迁移率的单体VDAC1，表示分子内交联的单体VDAC1。
在图15b中，由测试化合物形成的亚硒酸盐诱导的VDAC1二聚体的定量数据表示为抑制百分位数。结果显示平均值±SD(n＝3)。实心圆(●)表示VBIT-4(式1化合物)，空心圆(○)表示式10化合物，空心方形(□)表示VBIT-3(式2化合物)。
b.另外，图15c中显示了使用膜联蛋白V-FITC/PI染色和FACS分析的化合物抑制亚硒酸盐诱导的细胞凋亡。
c.细胞色素c(Cyto c)释放如上述方法(从线粒体的细胞色素c释放)所述确定。简言之，为了评估Cyto c释放，将细胞与0.025％洋地黄皂苷在冰上孵育10分钟，离心，并将沉淀(线粒体-Mito)和上清液(胞质-Cytos)进行SDS-PAGE和免疫印迹(使用抗-Cyto c抗体)。使用抗-VDAC1和抗-GAPDH抗体来验证胞质提取物不含线粒体。在图15d中，由亚硒酸盐诱导的线粒体中Cyto c释放的结果表示为免疫印迹，分别通过GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和VDAC1的免疫印迹确认胞质和线粒体部分。图15e示出亚硒酸盐诱导的Cyto c通过测试化合物释放到胞质的定量数据。数据以抑制百分比表示。所示结果对应于平均值±SD(n＝3)。实心圆(●)表示VBIT-4(式1化合物)，空心圆(○)表示式10化合物(AKOS-022)，空心方形(□)表示VBIT-3(式2化合物)。
d.测试化合物的IC50值来自所获得的数据。所示结果对应于平均值±SD(n＝3)。
表3.
实施例11
用式10化合物(AKOS-022)和外消旋的式1化合物(VBIT-4)抑制神经元细胞和Bax/Bak-缺乏细胞中VDAC1寡聚化和细胞凋亡
将SH-SY5Y细胞和Bax-/-/Bak-/-MEFs细胞与下列测试化合物孵育：式10化合物(AKOS-022)或外消旋的式1化合物(VBIT-4)(30μM,2小时)，然后使用或不使用顺铂(20μM,20小时)。收获细胞，用EGS交联(200μM,15分钟)，并使用抗-VDAC1抗体通过免疫印迹进行分析。
SH-SY5Y细胞的结果示于图16a。Bax-/-/Bak-/-MEFs细胞的结果示于图16b。指出了VDAC1单体和多聚体的位置。星号表示具有改变的电泳迁移率的单体VDAC1，表示分子内交联的单体VDAC1。
图16c示出，在存在和存在测试化合物的情况下，在SH-SY5Y细胞中顺铂诱导的VDAC1二聚体形成(灰色柱)及使用膜联蛋白V-FITC/PI染色和FACS分析的细胞凋亡(黑色柱)的定量分析。所示结果对应于平均值±SD(n＝3)，p<0.001(***)。
图16d示出，在Bax-/-/Bak-/-MEFs细胞中，测试化合物的顺铂诱导的VDAC1二聚体形成和细胞色素c释放的定量分析。
实施例12
式10化合物(AKOS-022)的抑制细胞凋亡和VDAC1寡聚化的程度之间的相关性
将HeLa细胞与0-20μM的式10化合物(AKOS-022)孵育2小时，并进一步使用或不使用亚硒酸盐(30μM,3小时)或顺铂(15μM,20小时)孵育。收获细胞并如上所述用EGS(300μM,15分钟)交联，并使用抗-VDAC1抗体通过免疫印迹分析VDAC1寡聚化作用，或使用膜联蛋白V-FITC/PI染色和FACS分析测定凋亡性细胞死亡。亚硒酸盐实验的凝胶示于图17a。
图17b示出，作为式10化合物(AKOS-022)浓度的函数的亚硒酸盐诱导的VDAC1二聚体水平和经历细胞凋亡的细胞的抑制的定量分析。结果反映平均值±SD(n＝3)。
顺铂实验的凝胶示于图17c。在图17d示出，作为式10化合物(AKOS-022)浓度的函数的顺铂诱导的VDAC1二聚体水平和经历细胞凋亡的细胞的抑制的定量分析。结果反映平均值±SD(n＝3)。
图17e示出，作为VDAC1二聚体形成抑制的函数的细胞凋亡抑制程度的定量分析。细胞凋亡是由亚硒酸盐(实心方形-■)或顺铂(空心方形-□)诱导的，并且如上所述在相同的AKOS-022浓度进行分析。
实施例13
测试化合物与经纯化的VDAC1及其与脂质双层重构的纯化VDAC1和降低的通道电导的相互作用
按照上述方法(VDAC1纯化)中所述纯化VDAC1。在添加40μM下列测试化合物之前和之后30分钟记录经纯化的VDAC1重构成平面脂质双层(PLB)膜，和响应于0-10mV的电压阶跃的通过VDAC1的电流：式10化合物(AKOS-022)、式2化合物(VBIT-3)或外消旋的式1化合物(VBIT-4)，如图18a所示。
此外，还测量了通过多通道记录的通道电导(作为电压的函数)以及VDAC1的平均稳态电导。
图18b显示添加式10化合物(AKOS-022)(空心圆)、式2化合物(VBIT-3)(空心方形)化合物或外消旋的式1化合物(VBIT-4)(实心圆)之前(实心正方形)和之后30分钟的通道电导。在给定的电压确定相对电导(电导/最大电导)。根据在-10mV的电导(最大电导)将数据标准化。
实施例14
测试化合物与经纯化的VDAC1的结合亲和力
按照制造商的说明，将使用NanoTemper荧光蛋白标记试剂盒BLUE(Nano Tempertechnologies,Munich,Germany)标记的经纯化的VDAC1(133nM)与递增浓度的下列测试化合物一起孵育：式10化合物(AKOS-022)、式2化合物(VBIT-3)或外消旋的式1化合物(VBIT-4)。孵育20分钟后，将样品(3-5μL)装载到MST级玻璃毛细管(Monolith NT Capillaries)中，并使用Monolith-NT115装置测量热泳过程。结果在图18c中表示为式10化合物(AKOS-022)(空心圆)、式2化合物(VBIT-3)(空心方形)或外消旋的式1化合物(VBIT-4)(实心圆)(0.3μM to 100μM)的结合分数的％，各自含有经纯化的VDAC-1。
结合分数如下计算：
Fmax和Fmin分别表示最大和最小荧光，F表示在测试化合物存在下测量的荧光。
由MST测量结果计算测试化合物的VDAC1结合亲和力。平均值±SD(n＝3)的结果，对于式10化合物(AKOS022)为15.4±2.9μM，对于式2化合物(VBIT-3)为31.3±1.7μM，对于外消旋的式1化合物(VBIT-4)为17±5.3μM。
实施例15
测试化合物对亚硒酸盐诱导的细胞内钙水平、线粒体膜电位和活性氧物质(ROS)水平的增加的作用
a.将HEK-293细胞与下列测试化合物一起孵育：式10化合物(AKOS-022)、式2化合物(VBIT-3)或式1化合物(VBIT-4)(15μM,2小时)，然后使用或不使用亚硒酸盐(15μM,4小时)。如上所述收获细胞并使用Fluo-4和FACS分析测量细胞内钙([Ca2+]i)水平。结果(最大[Ca2+]i的百分位数)的定量分析示于图19a。
b.用TMRM和FACS分析线粒体膜电位(ΔΨ)。CCCP(25μM,30分钟)作为线粒体ΔΨ)耗散和CCCP-敏感的TMRM荧光的阳性对照。相应的结果示于图19b。
c.用羧基-H2DCFDA和FACS分析分析细胞ROS水平。用MitoSOXRed和流式细胞术检测线粒体超氧化物。相应的结果示于图19c-d。
图19a-d中所示的所有结果对应于平均值±SD(n＝3)，p<0.05(*)、<0.01(**)或<0.001(***)。
实施例16
制备式10化合物的PLGA纳米颗粒
将约10mg的AKOS-022溶于1mL的丙酮中，然后溶解50mg的PLGA。将该有机相混合物以逐滴方式(约0.5ml/min)添加至20ml含有1％聚乙烯醇(PVA)(w/v)作为稳定剂的水溶液中。然后在室温通过实验室磁力搅拌器以400rpm搅拌该混合物直至有机溶剂完全蒸发。通过在4℃以15,000×g离心20分钟从纳米颗粒分散体除去多余的稳定剂。将沉淀重悬于无菌双蒸水中并洗涤三次。
除了添加AKOS-022之外，以相同的方式制备空白纳米颗粒。
实施例17
制备式1化合物的PLGA纳米颗粒
用10mg的VBIT-4代替10mg的AKOS022，根据实施例16制备含有式1化合物(VBIT-4)的PLGA纳米颗粒。
实施例18
式1和10化合物的脑渗透及对式1和10化合物的暴露
使用C57BL/6小鼠(20克)。动物接受用式1和10的游离化合物或根据实施例16和17制备的包囊化合物的处理。如下表4中所示的剂量通过口服灌胃在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中给予。12小时和24小时后，处死各组随机选择的小鼠，收集它们的脑并储存在-80℃。通过HPLC/MS分析确定组织中化合物的浓度。将组织样品在磷酸盐缓冲盐溶液中均化，然后用乙腈稀释至50％v/v，以10,000g离心10分钟，并分析上清液。从校准曲线确定脑提取物中的化合物浓度。结果是来自每个处理组/时间点的2只小鼠的平均值。
表4.
化合物 处理 脑提取物中的化合物,μM
式10 50 mg/kg,12小时 4.2±0.714
式10 50 mg/kg,24小时 1.24±0.23
式10 50 mg/kg于PLGA中,12小时 4.36±0.148
式10 50mg/kg于PLGA中,24小时 2.8±1.19
式1 50 mg/kg于PLGA中,24小时 0.190±0.07
式1 50 mg/kg,24小时 0.120±0.02
当给予溶液或包囊于PLGA纳米颗粒中时，口服给予的式1和10化合物(AKOS-022和VBIT-4)均到达大脑。然而，在给药后12小时，脑中AKOS-022的水平在两种情况下相似，在24小时后，当包囊于PLGA中时AKOS022或VBIT-4的水平超过2倍。脑中的AKOS-022和VBIT-4水平处于其有效范围内(IC50＝1μM)。因此，当给予非PLGA包囊或PLGA包囊的分子时，分子可到达脑。
实施例19
使用测试学习和记忆任务的旋臂水迷宫，式1化合物对具有阿尔茨海默样病的5XFAD转基因的小鼠学习和记忆任务的作用
如Webster,S.J.,et al,(2014)Frontiers in genetics 5,88,([5XFAD B6.Cg-Tg APPSwFlLon,PSEN1*M146Ln*L286V6799Vas/J])中所公开，测试式1化合物(VBIT-4)对具有AD样疾病的5XFAD转基因小鼠的学习和记忆任务的作用。这些小鼠在2月龄时出现细胞内和细胞外淀粉样蛋白斑块的可检测表型，在4-5个月时出现认知障碍并在9个月时表现出神经元死亡。
式1化合物(VBIT-4)如下溶于饮用水中。将约24 mg的VBIT-4转移至Eppendorf管中并通过Vortex混合器溶于120μl的100％DMSO中。获得澄清溶液。由Pierce,Rockford,Ill,USA提供的6-M HCl溶液制备1 M HCl的溶液(约10 mL)。使用约370μL的1M HCl溶液酸化120 mL饮用水。将VBIT-4 DMSO溶液(120μL)缓慢添加(通过滴加)至酸性水中并通过磁力搅拌进行混合。最终的pH为4.8-5.0。如果溶液变成乳白色，再加入10-30μL的HCl溶液以获得澄清溶液。对于24只小鼠，每只小鼠每天20mg/kg的剂量和5mL饮用量的量是足够的。
将2月龄的动物分为三组：转基因处理(TG-T，8只雄性和3只雌性)、转基因媒介物(TG-V，8只雄性和3只雌性)和野生型(WT，10只雄性和8只雌性)。其中，TG-T组中的2只雄性在研究期间死亡。
向2月龄的5XFAD小鼠提供饮用水中的0.9％DMSO溶液或VBIT-4溶液(20mg/kg于0.9％DMSO)，其在第一个月每周三次用新鲜溶液代替，此后每周两次再进行3个月。
当小鼠达到6月龄时，如先前所述进行两天的旋臂水迷宫(RAWM)试验JenniferAlamed,et al,Nature Protocols 1,(2006)1671-1679)以测试VBIT-4对学习和记忆任务的作用。使用含有六条泳道(臂)的RAWM。臂从一个开放的中心区域伸出，在一个臂(目标臂)的末端设有逃生平台。给定小鼠标的目标臂位置保持不变。在第1天，对小鼠进行15次试验(间隔3小时)的训练，试验在可见平台和隐藏平台之间交替进行。在第2天，使用隐藏平台对小鼠进行15次试验的训练。
进入不正确臂得分记为错误，记录动物寻找平台所花费的时间。结果示于图20A和20B。图20A示出错误的数量，而图20B示出在水迷宫中所花费的总时间，作为学习区块的数量的函数。使用ANOVA检验评估来自RAWM的错误数据的数量(图20A，数据表示为平均值±平均值的标准误差)；在不同测量次数(试验)中获得三组之间动物记忆训练中的显著差异：用VBIT-4(n＝9)处理的WT-小鼠(n＝18)、5XFAD/APOE(n＝13)和5XFAD/APOE，其中F(9,159)＝2.03(p＝0.03)。为了检验差异的根源，使用了Bonferroni型的事后(post-hoc)检验。与未处理的TG小鼠相比，非转基因小鼠训练得更好(p＝0.007)。用VBIT-4处理的TG小鼠比未处理的TG更好，并且TG VBIT-4处理组与WT组之间没有差异。与未处理的TG组相比，观察到VBIT-4-TG处理组的改善性能(训练)的趋势(p＝0.06)。
使用重复测量ANOVA检验分析来自RAWM的所花费的总时间的数据(图20B，数据表示为平均值±平均值的标准误差)；在不同测量次数(试验)中获得三个小鼠组之间动物记忆训练中的显著差异：用VBIT-4(n＝9)处理的WT-小鼠(n＝18)、5XFAD/APOE(n＝13)和5XFAD/APOE，其中F(2,35)＝6.91,p＝0.003。为了检验差异的根源，使用了Bonferroni型的事后检验。与未处理的TG小鼠相比，非转基因小鼠训练得更好(p＝0.003)。用VBIT-4处理的TG小鼠比未处理的TG更好，并且TG VBIT-4处理组与WT组之间没有差异。

Claims (11)

1.一种化合物或其盐，其中所述化合物为式3：
的化合物。
2.药物组合物，其含有权利要求1的化合物或其盐以及一种或多种药用赋形剂。
3.权利要求1的化合物或其盐，其用作药物。
4.权利要求1的化合物或其盐或权利要求2所述的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症选自神经变性疾病和病症、心血管疾病和病症、缺血/再灌注损伤和细胞凋亡。
5.权利要求4所述的用途，其中所述疾病或病症为神经变性疾病和病症。
6.权利要求5所述的用途，其中所述疾病或病症为帕金森病。
7.权利要求5所述的用途，其中所述疾病或病症为阿尔茨海默病。
8.权利要求4所述的用途，其中所述疾病或病症为缺血/再灌注损伤。
9.权利要求4所述的用途，其中所述疾病或病症为心血管疾病和病症。
10.权利要求9所述的用途，其中所述心血管疾病和病症选自心脏肥大和心力衰竭。
11.权利要求1的化合物或其盐或权利要求2所述的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症选自心肌细胞的自噬、心房纤颤、心律失常和心肌梗塞。
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