CN101506196A - 能够抑制ubc13-uev相互作用的化合物、药物组合物及治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化合物(I)及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其中：R为杂环基；R1和R2独立地是H或烷基；R3为H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、芳基、芳基烷基、杂环基或杂环基烷基；R4和R5独立地是H或烷基；q为0或1，其能够抑制UBC13－UEV相互作用并用于生产用于抗肿瘤治疗或治疗和/或预防与涉及UBC13酶的代谢途径、涉及转录因子NF－κB的代谢途径或涉及PCNA或RAD6的途径相关的疾病的药物组合物。

Description

能够抑制UBC13-UEV相互作用的化合物、药物组合物及治疗用途
发明领域
本发明属于药物化学领域，并且更具体地涉及对UBC13-UEV相互作用具有抑制活性的治疗化合物的开发，并涉及用于抗肿瘤治疗或用于治疗和/或预防与涉及UBC13酶的代谢途径、涉及转录因子NF-κB的代谢途径或涉及PCNA或RAD6的途径相关的疾病的药物组合物的生产或应用。
背景技术
蛋白的翻译后修饰被称为泛素化，其包括在底物蛋白的赖氨酸和泛素肽的羧基端甘氨酸之间形成异肽键[1]。泛素(Ub)分子是具有76个氨基酸的多肽，富含于胞浆和细胞核中。Ub分子与E1酶(Ub-激活酶)形成硫酯键，所述E1酶在需要ATP的反应中激活Ub分子，使后者处于有利于与被称为E2或泛素缀合酶的第二类酶的催化半胱氨酸形成硫酯键的状态。人类只有一种E1酶，但是可能有接近30种E2型酶。E2酶能够向底物蛋白转移Ub分子，在Ub的羧基端甘氨酸和底物蛋白的赖氨酸之间形成异肽键。底物蛋白通过共价加成泛素单元而进行的修饰被称为单泛素化。相同的E2酶能够催化Ub分子向预先与底物蛋白连接的另一Ub分子的转移，在泛素之间形成异肽键。该反应能够重复多次，从而形成多聚泛素链，该过程被称为多泛素化。泛素分子有七个赖氨酸，其中任何一个都能够用于在泛素之间形成异肽键。测定不同类型的多聚泛素链丰度的试验表明，在多聚泛素链的形成中使用最多的泛素分子赖氨酸是位于泛素的29、48和63位的那些[2，3]。通过与48位(K48)赖氨酸的异肽键在底物蛋白上形成具有四个或多个Ub单元的多聚泛素链是被蛋白酶体调节颗粒的亚单位识别的信号[4]，从而被如此修饰的蛋白被蛋白酶体处理和降解。相反，通过经由泛素的63位(K63)赖氨酸的异肽键而形成的多聚泛素链似乎不被蛋白酶体识别[5]，因此这种多泛素化不是被修饰蛋白的蛋白酶体处理和降解的信号。人们对其它形式的多泛素化的功能或所述修饰对底物蛋白的意义了解不多。通过泛素的赖氨酸48(K48)的多泛素化被称为“典型的”多泛素化，而使用任一其它赖氨酸的多泛素化被称为“非典型的”或“变异的”多泛素化[6]。许多E2能够催化Ub的转移以形成K48或K29型多聚泛素链，而K63型多聚泛素链的形成似乎特异性地需要异二聚体UBC13-UEV1或UBC13-UEV2[6]。通过对这种键(K48或K63)有特异性的水解酶(异肽酶)的活性而阻碍多聚泛素链的产生。
需要异二聚体UBC13-UEV1及其介导K63型多泛素化的活性的两种生物化学过程是PCNA(增殖细胞核抗原)介导的DNA修复[7]和诸如TNFα或IL-1的细胞因子引发的信号传输[8]。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，异二聚体Ubc13p-Mms2p(Mms2p是UEV1和UEV2的直系同源酿酒酵母蛋白)对于通过变异的(K63型)多泛素化的PCNA修饰十分重要[7-11]，其参与被称为“无错”的RAD6(泛素缀合酶)依赖的跨损伤DNA修复路径[12-16]。蛋白PCNA通过在S期开始时的SUMO化(SUMO分子的共价键接)而被修饰，这为其提供了稳定性，允许其在细胞周期的该期间内在DNA复制中的活性[7，9]。S期之外，PCNA通过与泛素连接酶Rad18p相关的Rad6p缀合酶而被典型的多泛素化修饰。然而，作为对基因毒性损伤的响应，发生异二聚体Ubc13p-Mms2p的入核，这与泛素连接酶Rad5p相关，催化PCNA的K63型多泛素化，与通过Rad6p介导的典型的多泛素化修饰竞争，从而防止PCNA的降解，这因此能够用于DNA中切口的跨损伤修复[7-11，17]。在哺乳动物中，尚未明确证实PCNA被UBC13-UEV1(或UBC13-UEV2)介导的变异多泛素化修饰，并且因此，与酿酒酵母不同，这种底物修饰在PCNA依赖的DNA修复中的作用是不清楚的。
在哺乳动物细胞中，已经证实UBC13-UEV1催化的多泛素化活性对于TNFα与其受体结合后TRAF2和TRAF6衔接蛋白的异二聚体化[18-20]，或IL-1诱导的TRAF6的异二聚体化十分重要[21]。该异二聚体化刺激TRAF2或TRAF6的泛素连接酶活性，其吸收UBC13-UEV1用于K63型链自体多泛素化。这些K63多聚泛素链被TAB2或TAB3蛋白识别，与TAK1蛋白激酶形成配合物，使其活化[22]，这又使另一激酶IKKα磷酸化并活化，其引发导致细胞质NFκB抑制剂IκB的磷酸化和降解的信号级联放大，因此能够将所述IκB转移至细胞核中并发挥其转录调节剂活性[18-22]。
因此，异二聚体UBC13-UEV1(或UBC13-UEV2)是两个过程的基本调节剂，所述过程与细胞因子(TNFα)介导的炎症和至少酵母中的应答基因毒性损伤的复制后修复同样重要。有需要UBC13-UEV1(或UBC13-UEV2)介导的K63型多泛素化的其它生物学过程，如运动性[23]、依赖配体的内吞作用[24]或抗原T细胞活化作用[25]。因此，这种翻译后修饰能够介导的生物学过程有许多，并且对其的研究代表刚刚开始的新研究领域。
UBC13和UEV蛋白形成的异二聚体的结构[26，27]显示相互作用界面，其中最明显的特征是UBC13中两个非常明确的疏水袋的参与，所述疏水袋上还对接有UEV蛋白(Mms2p、UEV1或UEV2)的疏水残基，尤其是8位的苯丙氨酸、5位的脯氨酸和36位的异亮氨酸。这些相互作用被与位于疏水相互作用两侧的极性残基有关的静电相互作用稳定。该构型在泛素缀合酶之间是独特的，因此对UBC13与任一UEV蛋白(Mms2p、UEV1和UEV2)之间的相互作用有高度特异性[26-28]。这一事实，加上UBC13中参与与UEV蛋白的相互作用的疏水袋所限定的事实，使该界面成为用于设计阻碍它的肽模拟化合物的有趣靶。抑制该异二聚体的形成应当影响它的催化活性并因此影响相关底物的K63型多泛素化，这意味着对这种翻译后修饰所参与的过程的阻碍。为了那个目的，应当指出，已经证实UBC13通过小ISG15蛋白的共价结合的翻译后修饰抑制了其催化活性[29，30]。该观察结果对于研究UBC13抑制在不同生物系统中的影响可能是非常有趣的，尽管必须指出，ISG15修饰影响许多其它蛋白。
设计用于识别蛋白表面并且能够调节生物学相关的蛋白-蛋白相互作用的分子被认为是处于化学与生物学之间汇合点的生物工程学的最大挑战之一，并且在治疗学中具有巨大潜能。然而，尽管已经开发并描述了许多蛋白酶体抑制剂[31，32]，或参与泛素化的酶活性的特异性抑制剂[33，34]，至今还没有描述K63型多聚泛素链的形成的抑制剂，或者其它类型的多聚泛素链(K48、K29、K6等)的形成的任何特异性抑制剂。同样，人们也不知道UBC13泛素缀合酶的其它药理学抑制剂。
发明概述
本发明涉及新一类通式(I)化合物，其对UBC13-UEV相互作用具有抑制活性，或对UBC13的酶活性具有抑制活性，因此，它们可用于抗肿瘤治疗或用于治疗和/或预防与涉及UBC13酶的代谢途径或涉及转录因子NF-κB的代谢途径相关的病理学或疾病。
在本发明中，措辞“与涉及UBC13酶的代谢途径或涉及转录因子NF-κB的代谢途径相关的病理学或疾病”包括其中UCB13或NF-κB在疾病/病理学中不是直接原因，而是以某种方式参与所述疾病/病理学的发展的疾病，由于这个原因，本发明的通式(I)化合物可用于抗肿瘤治疗或用于治疗和/或预防与涉及UBC13酶的代谢途径或涉及转录因子NF-KB的代谢途径相关的病理学或疾病。
因此，本发明的第一方面涉及通式(I)化合物，及其如下所述的盐、溶剂化物、前药和立体异构体(本发明的化合物)。
本发明的第二方面涉及所述通式(I)化合物、其盐、溶剂化物、前药和立体异构体的合成方法。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物、其盐、溶剂化物、前药和立体异构体用于医药用途。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体在制备用于治疗和/或预防与涉及UBC13酶的代谢途径相关的病理学或疾病的药品中的用途。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体在生产用于治疗和/或预防与涉及转录因子NF-κB的代谢途径相关的病理学或疾病的药品中的用途。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体或其混合物在生产用于抗肿瘤治疗的药品中的用途，其中所述药品是引起化学或辐射敏化效果的PCNA和RAD6介导的基因毒性损伤耐受途径的拮抗剂，或抑制所述基因毒性损伤耐受途径。
同样地，本发明的另一方面涉及通式(I)化合物在生产用于增加哺乳动物对于抗肿瘤剂治疗的敏感性的药品中的用途。
最后，本发明的另一方面涉及包含治疗有效量的通式(I)化合物或其药物可接受的盐、前药、溶剂化物或立体异构体以及药物可接受的载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。
附图描述
图1.本发明用于开发UBC13和UEV1之间相互作用的抑制剂所遵循的步骤和方法学的图。
图2.52种拟肽的混合物关于它们抑制UBC13和UEV1之间相互作用的能力的筛选结果，所述能力通过在酵母中的双杂交测试测定。孵育阳性细胞用于与5μM每一拟肽混合物进行UBC13-UEV1相互作用。相互作用活性相对于无拟肽的细胞以及相对于相同拟肽混合物存在下阳性相互作用对照(大T-p53)的β-半乳糖苷酶活性进行标准化。实心黑条对应于对相互作用具有较高抑制活性的混合物。
图3.对接结果。化合物Varubin或Ia在UBC13表面上的分子对接的结构模型。插图对应于UBC13表面的Connolly表示法，其接近于通过CDOCK在UBC13表面上具有最佳对接的化合物Varubin的表示法。这种表示法以两种不同的放大倍率显示，以便能够更好地观察化合物Varubin在通常用来与UEV蛋白(Mms2p、UEV1和UEV2)相互作用的UBC13表面的疏水袋上的对接。
图4.对接结果。化合物Ib在UBC13表面上的分子对接的结构模型。插图对应于通常用于与UEV1相互作用的UBC13表面的Connolly表示法，其接近于通过CDOCK在UBC13表面上具有最佳对接的化合物Ib的条棒形式的表示法。这种表示法以两种不同的放大倍率显示，以便能够更好地观察化合物Ib在通常用来与UEV蛋白(Mms2p、UEV1和UEV2)相互作用的UBC13表面的疏水袋上的对接。
图5.化合物Ia(Varubin)和Ib对UBC13和UEV1蛋白之间相互作用的抑制。(A)酵母中的双杂交测试。用100μM的化合物Ia或Ib孵育用于UBC13-UEV1相互作用的阳性细胞。将相互作用活性相对于无环状化合物的细胞以及相对于相同浓度的两种化合物存在下阳性相互作用对照(大T-p53)的β-半乳糖苷酶活性进行标准化。(B)纯化的重组蛋白相互作用测试。用100μM的化合物Ia或Ib预孵育重组GST-UBC13，并测定配合物在谷胱甘肽-琼脂糖柱上结合后UEV1在GST-UBC13上相互作用的能力。E，从柱上洗脱的馏分(未与GST-UBC13结合)，B，保留在柱中的馏分(与GST-UBC13结合，用含有还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱)。
图6.体外多泛素化测试中UBC13-UEV1催化活性的抑制。(A)对照反应中或100μM化合物Ia存在下游离多聚泛素随时间的累积。这些反应中使用的泛素是野生型泛素(具有七个可用于形成异肽键的赖氨酸)。单泛素化(Ub)和二泛素化(Ub2)形式出现于0时间点并且它们的丰度在整个动力学期间没有显著变化。三泛素化(Ub3)和四泛素化(Ub4)形式以三级动力学累积，如(B)所示。在(C)中，反应用泛素K63(在可用的七个赖氨酸中，只有63位的赖氨酸可用；其余的赖氨酸已经变异成精氨酸，因此不能用于形成异肽键)进行。反应在与(A)中所示相同的条件下，在存在或不存在(对照)100μM Ia的情况下进行。
图7.酿酒酵母Δrad6突变体中通过化合物Ia和Ib对紫外辐射和甲磺酸甲酯处理的敏化。剂量-响应曲线。使无RAD6的酿酒酵母菌株在无(YPD)或有100μM化合物Ia或化合物Ib的情况下经受不同的紫外辐射剂量(上图)或经受不同的暴露于0.03％MMS的时间(下图)。测定相对于未经过处理的细胞的存活率。
图8.酿酒酵母Δrev3突变体中通过化合物Ia和Ib对紫外辐射和甲磺酸甲酯处理的敏化。剂量-响应曲线。使无REV3的酿酒酵母菌株在无(YPD)或有100μM化合物Ia或化合物Ib的情况下经受不同的紫外辐射剂量(上图)或经受不同的暴露于0.03％MMS的时间(下图)。测定相对于未经过处理的细胞的存活率。
图9.化合物Ia和Ib对TNFα诱导NF-κB的反式激活的抑制。剂量-响应曲线。将用指示NF-κB转录活性(荧光素酶的活化)的质粒转染并且用或未用不同浓度的化合物Ia或化合物Ib预孵育的HeLa细胞用10ng/mL的TNFα处理2小时，定量NF-κB的活化。荧光素酶活性单位已经相对于无化合物Ia或Ib时TNFα诱导的活性进行了标准化。
图10.化合物Ia对PC-3细胞中阿霉素的细胞毒性效应以及对HeLa细胞中依托泊苷的细胞毒性效应的敏化。剂量-响应曲线。分别将PC-3和HeLa细胞用或不用100μM化合物Ia预孵育，并暴露于不同的阿霉素或依托泊苷剂量下。通过CyQuant进行存活细胞的定量并相对于未经过处理的细胞进行标准化。
图11.对照、单独用阿霉素处理(静脉注射，5mg/Kg，每周一次)、单独用Varubin处理(100μM，肌肉注射，每周两次)或用两种化合物一起处理的小鼠的肿瘤相对尺寸(相对于每一肿瘤的第0天进行标准化的RLU)的图示。给出了每组6至8个肿瘤的平均值及其相应的标准偏差条柱状图。
图12.对应于连续追踪发光度52天以上、固定在HamamatsuPhotonics仪器(对于仪器和使用的具体型号，参见正文)中的每一处理组(对照、仅用阿霉素处理、仅用Varubin处理或联合处理)中的代表性小鼠(最接近平均值的一只)的照片(由伪彩色向灰度级转变)。肿瘤位于每一动物的两腿中。在每一肿瘤中，清晰度最高的区域与RLU最高的区域相关，并因此与肿瘤尺寸最大的区域相关。
发明详述
设计用于识别蛋白表面并且能够调节生物学相关的蛋白-蛋白相互作用的分子被认为是处于化学与生物学之间汇合点的生物工程学的最大挑战之一，并且在治疗学中具有巨大潜能。
在这种意义上，UBC13酶是设计新治疗化合物的有前景的治疗靶。因此，设计了可以鉴定能够竞争性地阻碍UBC13与UEV1之间相互作用的小分子的方法，起始的假设是抑制这种相互作用会抑制UBC13形成K63型多聚泛素链的能力。这种药理学开发所应用的方法学优先考虑，一方面，抑制性化合物的生物利用度(即，它们的细胞内定位和进入的能力)，另一方面，对UBC13-UEV1相互作用的阻碍的特异性，以及最后，这些小分子对UBC13用来与UEV1相互作用的表面的空间和电荷调整。本发明中进行的方法依次结合了：
(1)实验筛选N-烷基甘氨酸(拟肽)的组合化学库以选择能够特异性地抑制这种相互作用的那些，所述能力通过酵母中的双杂交测试测定。所用的筛选方法可以同时处理并解决小分子的生物利用度和抑制UBC13与UEV1之间相互作用的特异性，因为使用了有关的蛋白-蛋白相互作用对照。
(2)计算机优化以确定在前一步骤中选择的拟肽在UBC13表面上的分子对接。
(3)对UBC13-UEV1相互作用具有抑制活性的医药小分子的合成。前一步骤中产生的虚拟优化数据已经用作该合成的指导方针。
(4)前一步骤中合成的化合物的体外和体内功能效果的表征。该表征包括测定这些化合物抑制UBC13-UEV1的泛素缀合活性的能力，以及阻碍某些已知由该酶调节的细胞过程的能力。图1示意性显示了这种药理学开发所遵循的步骤和方法。该筛选中使用的拟肽的组合模块化学库的一般结构(II)如下所示：
其中R1、R2和R3分别表示化学库的构建中所使用的化学多样性[35]。
本发明的发明人因此已经鉴定了能够抑制UBC13蛋白与UEV蛋白(Mms2p、UEV1和UEV2，参见实施例4)之间相互作用、能够竞争性地抑制这种酶的K63型多泛素化活性并在药理学有效浓度下引起生物学作用的具有通式I的新一类化合物。这些化合物竞争性地抑制UBC13蛋白与UEV1蛋白之间的正确相互作用，从而阻止它们的酶活性以被称为“K63型多泛素化”的方式形成多聚泛素链，后者是这些化合物发挥其活性的机制(实施例5)，从而反过来调节通过这种K63型多泛素化而调节的所有那些生物化学途径和生物学过程。
本发明的药物对象的生物活性反映出通常由UBC13-UEV1、UBC13-UEV2和Ubc13p-Mms2p介导的变异的多泛素化变异体调节的生物化学途径。尤其是，由该异二聚体酶介导的多泛素化一方面调节通过被称为RAD6依赖的“无错”途径的DNA修复(实施例6)，并且另一方面，调节由细胞因子和其它刺激物诱导的转录因子NF-κB的活化。由于这种活性，这些药物敏化酿酒酵母细胞和哺乳动物细胞(HeLa和PC-3，分别衍生自宫颈癌和前列腺癌)对诸如紫外光、甲磺酸甲酯或阿霉素的物理或化学剂的细胞毒性作用(实施例8)。这些药物的活性的另一生物学结果是在药理学有效浓度下抑制转录因子NF-κB通过诸如TNFα的细胞因子的活化(实施例7)，并且它们增强传统抗肿瘤剂的细胞毒性效应。由于这些活性，本发明的药物对象具有至少两种医药应用：
(1)肿瘤细胞对具有损伤或修饰DNA的细胞毒性的化学或物理剂(基因毒性剂)的敏化，这一定可以减少这样的基因毒性剂的治疗有效剂量，因此减少这样的制剂的某些不期望的副作用。
(2)显示出炎性细胞因子和趋化因子的活化的病理学中的抗炎效果。
这些新的药物还是研究UBC13-UEV1(UBC13-UEV2)的活性和由各种形式的泛素化和多泛素化调节的其它活性的工具。
简而言之，这些化合物还代表一类新的药物，因为没有这种形成新治疗靶的UBC13酶的药理学抑制剂的先例；并代表独创而新颖的在与涉及UBC13酶和K63型非典型多泛素化的代谢途径相关的其它多种病理学过程中具有抗肿瘤、抗炎应用的药理学方法。
通式(I)化合物
本发明的第一方面涉及通式(I)化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体：
R-(CR1R2)q-CO-N(R3)-C(R4R5)-CO-NH2    (I)
其中：
-R是基团
Figure A200780031330D00191
其中：
-R6是选自如下的基团：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基；
-A是选自取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂环基的基团；
-R7和R8独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基，
-o是选自0、1、2、3和4的数字，
-n是选自0和1的数字，
-线条——表示基团R与通式(I)的分子其余部分的结合点；
-R1和R2独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基；
-R3是选自如下的基团：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基；
-R4和R5独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基；
-q是选自0和1的数字。
本发明还提供了本发明化合物的盐。例如，本文提供的化合物的药物可接受的盐能够是酸加成盐、碱加成盐或金属盐，并且能够通过传统的化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。这样的盐通常通过例如使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水中或有机溶剂中或在两者的混合物中进行反应。通常优选非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。酸加成盐的实例包括无机酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐；有机酸加成盐，例如乙酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐包括无机盐例如铵盐；以及有机碱盐例如乙二胺、乙醇胺、N，N-二烯基乙醇胺、三乙醇胺、谷氨酸盐和碱性氨基酸盐。金属盐的实例包括例如钠、钾、钙、镁、铝和锂盐。
术语“药物可接受的”涉及生理学可耐受的并且在被给予人类时通常不引起过敏或类似不良反应如胃部不适、眩晕等的分子实体或组合物。优选地，本文使用的术语“药物可接受的”意思是由联邦或州政府的管理机构批准的或美国药典或另一通常公认的药典列出其用于动物，更具体地用于人类的。
对于本领域技术人员，本发明的范围明显还包括作为获得药物可接受的盐的可能手段的非药物可接受的盐。
本发明的化合物能够是作为游离化合物或作为溶剂化物的晶体形式，并且两种形式都预期在本发明的范围之内。在该意义上，本文使用的术语“溶剂化物”包括药物可接受的溶剂化物即能够用于生产药品的通式(I)化合物的溶剂化物，以及能够用于制备药物可接受的溶剂化物或盐的非药物可接受的溶剂化物。药物可接受的溶剂化物的性质不重要，只要它是药物可接受的。溶剂化物能够通过本领域技术人员熟知的传统溶剂化方法获得。溶剂化物的实例包括水合物和醇化物，优选C1-C6醇化物，例如甲醇化物。
本文使用的术语“前药”包括通式(I)化合物的任何衍生化合物，例如酯，包括羧酸酯、氨基酸酯、磷酸酯、金属盐磺酸酯等，氨基甲酸酯，酰胺等，其在被给予个体时能够直接或间接在所述个体中提供所述通式(I)化合物。有利地，所述衍生物是在被给予个体时增加通式(I)化合物的生物利用度或促进通式(I)化合物在生物腔室中释放的化合物。所述衍生物的性质不重要，只要它能够被给予个体并在个体的生物腔室中提供通式(I)化合物。所述前药能够通过本领域技术人员已知的传统方法制备。
本发明包括本文描述的化合物的所有可能的异构体，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，取决于多重键的存在，本发明的化合物能够包括Z和E异构体。取决于手性中心的存在，还包括光学异构体或对映体。各个异构体、对映体或非对映异构体及其混合物在本发明的范围之内。各个对映体或非对映异构体及其混合物能够通过传统技术分开。
对于技术人员，立体异构体被理解为由相同原子通过相同顺序的键连接形成但是具有不可互换的不同三维结构的化合物。
为了它们在治疗中的应用，通式(I)化合物、其异构体、盐、前药或溶剂化物优选地为药物可接受的或基本上纯的形式，即它具有药物可接受的纯度水平，不含一般的药物添加剂如稀释剂和载体，并且不含在一般的剂量水平下被认为有毒的材料。活性成分的纯度水平优选大于50％，更优选大于70％，更优选大于90％。在优选实施方案中，它们是大于95％的通式(I)化合物或其盐、溶剂化物或前药。
除非另外指明，本发明的化合物还包括仅在一种或多种同位素富集原子的存在方面不同的化合物。例如，除了氢被氘或氚取代、或碳被富含13C或14C的碳取代或氮被富含15N的氮取代之外具有所述结构的化合物在本发明的范围之内。
本发明描述的化合物、其药物可接受的盐、前药和/或溶剂化物以及含有它们的药物组合物能够与其它别的药物一起使用以提供联合治疗。所述别的药物能够形成相同药物组合物的一部分，或者可选地，它们能够以分开的组合物的形式提供，其给药与包含通式(I)化合物或其药物可接受的前药、溶剂化物、衍生物或盐的药物组合物的给药同时或不同时。
在本文描述的化合物的定义中，以下术语的含义为：
“烷基”涉及由碳和氢原子形成的不含不饱和键的直链或支链烃基，其具有一至六个、优选一至四个碳原子并且通过单键与分子的其余部分连接，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等。
“烯基”涉及由碳和氢原子形成的含有至少一个不饱和键的直链或支链烃基，其具有二至六个、优选二至四个碳原子并且通过单键与分子的其余部分连接。
“环烷基”涉及具有三至六个碳原子的饱和碳环。适当的环烷基包括但不限于诸如环丙基、环丁基、环戊基或环己基的环烷基。
“环烷基烷基”涉及通过烷基与分子的其余部分连接的环烷基，如环戊基乙基。
“炔基”涉及碳和氢原子形成的含有至少一个共轭或非共轭的碳-碳三键的直链或支链烃基，其具有二至六个、优选二至四个碳原子并且通过单键与分子的其余部分连接，如-CCH、-CH2CCH、-CCCH3、-CH2CCCH3。
“芳基”涉及具有六个碳原子的芳香烃基，如苯基。
“芳基烷基”涉及通过烷基与分子的其余部分连接的芳基，如苄基或苯乙基。
“杂环基”涉及稳定的由碳原子和一至四个选自氮、氧和硫的杂原子组成的三至六元环，优选具有一、二、三或四个杂原子的四至六元环，更优选具有一、二或三个杂原子的五至六元环。为了本发明的目的，杂环是单环的环系统。杂环基中的氮、碳或硫原子能够任选地被氧化；氮原子能够任选地被季铵化；并且杂环基能够部分或全部是饱和的或芳香的。这样的杂环的实例包括但不限于氮杂卓、苯并咪唑、苯并噻唑、呋喃、异噻唑、咪唑、吲哚、哌啶、哌嗪、噻二唑、四氢呋喃。
“杂环基烷基”涉及通过烷基与分子的其余部分连接的杂环基，如嘧啶基乙基。
除非另外指明，烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂环基和杂环基烷基基团能够任选地被一个、两个或三个取代基取代，所述取代基例如卤素(氟、氯或溴)、烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、磺酰氧基、O-苄基、O-苯甲酰基、羧基、氰基、羰基、酰基、烷氧羰基、磺酰基、磺酰氨基、氨基、亚氨基和硝基。
术语“烷氧羰基”涉及具有式-C(＝O)O-的化合物，其中C端与分子连接并且O端与碳原子连接形成酯官能团。所述碳原子能够是烷基、烯基、环烷基、炔基、芳基、芳烷基或杂环基的一部分。
根据本发明的优选实施方案，通式(I)化合物中的R6是选自H、取代或未取代的芳基烷基和取代或未取代的杂环基烷基的基团，并且R3是选自H、取代或未取代的芳基烷基和取代或未取代的杂环基烷基的基团。
根据另一更优选的实施方案，R6是选自如下的基团：取代或未取代的苯丙基、取代或未取代的苯乙基、取代或未取代的苄基、取代或未取代的呋喃丙基、取代或未取代的呋喃乙基、取代或未取代的呋喃甲基、取代或未取代的咪唑丙基、取代或未取代的咪唑乙基、取代或未取代的咪唑甲基、取代或未取代的吡啶丙基、取代或未取代的吡啶乙基、取代或未取代的吡啶甲基、取代或未取代的哌啶丙基、取代或未取代的哌啶乙基和取代或未取代的哌啶甲基；并且R3是选自如下的基团：取代或未取代的苯丙基、取代或未取代的苯乙基、取代或未取代的苄基、取代或未取代的呋喃丙基、取代或未取代的呋喃乙基、取代或未取代的呋喃甲基、取代或未取代的咪唑丙基、取代或未取代的咪唑乙基、取代或未取代的咪唑甲基、取代或未取代的吡啶丙基、取代或未取代的吡啶乙基、取代或未取代的吡啶甲基、取代或未取代的哌啶丙基、取代或未取代的哌啶乙基和取代或未取代的哌啶甲基。
根据更优选的实施方案，R6是被一个或多个选自如下的基团取代的基团：氟、氯、溴、三氟甲基、羟基、烷氧基、烷基羰基、烷基氨基、磺酰氨基、氰基、硝基、亚硝酸基(nitrite)、硝酸基(nitrate)、硫代硝酸基(thionitrate)和甲酰氨基。
根据本发明的另一实施方案，R3是被一个或多个选自如下的基团取代的基团：氟、氯、溴、三氟甲基、羟基、烷氧基、烷基羰基、烷基氨基、磺酰氨基、氰基、硝基、亚硝酸基、硝酸基、硫代硝酸基和甲酰氨基和盐。
根据本发明的其它不同实施方案：R6是对氟苯乙基或2，4-二氯苯乙基基团；取代基A是取代或未取代的芳基；取代基A是被氯、氟和/或溴取代的苯基，并且o是选自1、2和3的数字；R7和R8都是H，o是2，并且A是对氟苯基；R3是2-嘧啶乙基、2，4-二氯苯乙基或4-甲氧基苯乙基；n是1；n是0；q是0；q是1。
本发明的优选实施方案由被称为Varubin的式(Ia)的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体形成：(N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙基)-1，4-双[2’-(4”-氟-苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺)：
Figure A200780031330D00241
本发明的另一优选实施方案通过式(Ib)的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体形成：(1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(2”-吡啶基)乙基)-羰甲基]哌嗪-3，6-二酮)：
Figure A200780031330D00242
其它优选实施方案由如下化合物形成：
Figure A200780031330D00251
N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(2”-吡     N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(4”-甲
啶基)乙基)-1-[2’-(2”，4”-二氯苯  氧基苯基)乙基)-1-[2’-(2”，4”-二
基)乙基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙      氯苯基)乙基]-4-[2’-(4”-氟苯基)
基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚    乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环
烷-5-甲酰胺                         庚烷-5-甲酰胺
Figure A200780031330D00252
N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(4”-甲      1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙
氧基苯基)乙基)-1，4-双[2’-(4”-氟   基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-
苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮    氨基羰甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙
杂环庚烷-5-甲酰胺                    基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮
Figure A200780031330D00261
1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙         1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙
基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-   基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(4”-
氨基羰甲基-N-(2’-(4”-甲氧基苯      甲氧基苯基)乙基)羰甲基]哌嗪
基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮        -3，6-二酮
Figure A200780031330D00262
N-氨基甲酰基甲基-N-[2’-(2”，4”-     [1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙
二氯苯基)乙基]-1，4-双[2’-(4”-氟     基]-2-[N-氨基羰甲基
苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮      -N-(2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基)羰
杂环庚烷-5-甲酰胺                     甲基]哌嗪-3，6-二酮
在其第二方面中，本发明涉及所述通式(I)化合物、其盐、溶剂化物、前药和立体异构体的合成方法。通式(I)的本发明化合物能够通过化学合成途径获得或生产或者得自不同来源的天然材料。本申请描述了基于固相合成的通式I的本发明化合物的合成途径。下文包括了两种本发明化合物式(Ia)和(Ib)化合物的固相合成。将下文列出的两种方案和实施例3)所显示的这种类型的合成应用于通式(I)中包括的其余化合物对本领域技术人员会是显而易见的。
方案I：式Ia化合物：(N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙基)-1，4-双[2’-(4”-氟-苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺)的合成。
Figure A200780031330D00271
方案II：式Ib化合物：(1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(2”-吡啶基)乙基)-羰甲基]哌嗪-3，6-二酮)的合成。
Figure A200780031330D00281
本发明的另一方面由药物组合物形成，下文称本发明的药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种通式(I)化合物或其药物可接受的盐、前药、溶剂化物或立体异构体以及药物可接受的载体、佐剂或赋形剂，用于向患者给药。
本发明的另一具体实施方案由本发明的药物组合物形成，其中通式(I)化合物如下：N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙基)-1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺(Ia)或其R、S对映体形式和/或外消旋混合物中的任何一种。
本发明的另一具体实施方案由本发明的药物组合物形成，其中通式(I)化合物如下：1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙基)羰基-甲基]哌嗪-3，6-二酮(Ib)，或其R、S对映体形式和/或外消旋混合物中的任何一种。
本发明的另一具体实施方案由本发明的药物组合物形成，其中化合物(I)选自：
N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(2”-吡啶基)乙基)-1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺；
N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(4”-甲氧基苯基)乙基)-1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺；
N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(4”-甲氧基苯基)乙基)-1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺；
1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮；
1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(4”-甲氧基苯基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮；
1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(4”-甲氧基苯基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮；
N-氨基甲酰基甲基-N-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基]-1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺；和
[1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮。
能够用于所述组合物的药物可接受的佐剂和赋形剂是本领域技术人员已知并且通常用于生产治疗组合物的佐剂和赋形剂。
在本说明书所用的意义上，措辞“治疗有效量”涉及能够对UBC13酶产生抑制的试剂或化合物的量，所述量经计算以引起期望效果，并且通常会通过化合物的典型特征以及其它因素来确定，所述其它因素包括患者的年龄、疾病状态，不适或病症的严重程度，以及给药途径和频率。
在另一实施方案中，所述治疗组合物被制备为固体形式或药物可接受的稀释液中的水悬浮液。本发明提供的治疗组合物能够通过任何适当的给药途径给药，为此所述组合物会是适合于所选给药途径的剂型的制剂。在具体实施方案中，本发明提供的治疗组合物通过口服、局部、直肠或肠胃外(包括皮下、腹膜内、皮内、肌肉内、静脉内等)给药。药物给药的不同剂型和获得它们所必需的赋形剂的综述能够见于例如E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药学)”中的“Tratado de Farmacia Galénica(盖伦制剂论文)”，C.Fauli iTrillo，1993，Luzán 5，S.A.Ediciones，Madrid或西班牙和美国药典的其它常见和类似的那些。
本发明使用的化合物的有效给药量通常会取决于所选化合物的相对功效，所治疗疾病的严重性，或年龄、体重或给药方法。但是活性化合物通常每天给予一次或多次，例如每天1、2、3或4次，通常每日总剂量为0.01至100mg/kg/天。
本发明中使用的化合物还能够与其它药物一起给药以提供联合治疗。其它药物能够形成相同组合物的一部分，或者它们能够以分开的组合物的形式在相同或不同的时间给药。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物或其盐、溶剂化物、前药或立体异构体或混合物用于医药用途。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物或其盐、溶剂化物、前药和立体异构体或混合物在治疗和/或预防与涉及UBC13酶的代谢途径的变化相关的病理学或疾病中的用途。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物或其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体或混合物用于制备适合治疗和/或预防与涉及UBC13酶的代谢途径相关的病理学或疾病的药品中的用途。
在具体实施方案中，与涉及UBC13酶的代谢途径相关的病理学或疾病是炎症性和自体免疫疾病。在优选实施方案中，炎症性和自体免疫病理学和疾病能够是：炎症性肠病、炎症性关节病理学、特应性皮炎和其它炎症性皮肤病病理学、神经炎、脑炎、脑脊髓炎和感染中枢或周围神经系统的炎症性病理学、肌炎、血管炎、系统性红斑狼疮、表现出炎症的传染性疾病、宿主抗移植物排斥反应、结膜炎和炎症性眼病、耳炎或粘膜炎。
在另一具体实施方案中，与涉及UBC13酶的代谢途径相关的病理学或疾病是癌症或瘤形成，包括但不限于源于任何组织的任何类型的良性或恶性瘤形成，包括但不限于任何类型的癌，包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、食管癌、喉癌、甲状腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、子宫癌和子宫颈癌；任何类型的肉瘤，包括骨肉瘤、软组织肉瘤和血管肉瘤；任何类型的造血系统肿瘤，包括白血病和淋巴瘤；任何类型的神经系统肿瘤，包括成神经细胞瘤、胶质母细胞瘤和星形细胞瘤；任何皮肤病学癌症，包括黑色素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，或其混合物在制备用于治疗和/或预防与涉及转录因子NF-κB的代谢途径相关的病理学或疾病的药品中的用途。在具体实施方案中，病理学或疾病是炎症或肿瘤过程。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，或其混合物，在生产用于抗肿瘤治疗的药品中的用途，其中所述药品是引起化学或辐射敏化效果的PCNA和RAD6介导的基因毒性损伤耐受途径的拮抗剂，或抑制所述基因毒性损伤耐受途径。
本发明的另一方面涉及通式(I)化合物在生产用于增加哺乳动物对于抗肿瘤剂治疗的敏感性的药品中的用途。
在本发明中，“抗肿瘤剂”应理解为能够用来抑制肿瘤的生长、增殖和/或发展的具有抗增殖、抗致癌和/或制癌性质的化学、物理或生物学化合物或制剂。能够用于本发明的抗肿瘤剂的实例是(i)烷基化剂，如烷基磺酸盐和乙烯亚胺衍生物；(ii)抗代谢物，如叶酸拮抗剂和嘌呤类似物；(iii)天然产物，如抗肿瘤抗生素和有丝分裂抑制剂；(iv)激素及其拮抗剂，如雄激素和皮质甾类；(v)生物学制剂，如病毒载体；和(vi)物理制剂，如由不同类型的放射源产生的电离辐射(放射治疗制剂)。能够用作抗肿瘤剂的化合物列表描述于专利申请WO2005/112973中。
在本发明的具体实施方案中，抗肿瘤剂是阿霉素或依托泊苷。
向哺乳动物给予通式(I)化合物的量必须使其能够增加所述哺乳动物对抗肿瘤剂治疗的敏感性。在本发明中，“有效敏化量”被定义为通式(I)化合物的量，在向动物、优选哺乳动物、更优选人类给予所述化合物时，所述量足以增加哺乳动物对抗肿瘤剂或对其它抗肿瘤治疗/处理的敏感性。引起对抗肿瘤剂的敏化效果所必需的通式(I)化合物在肿瘤组织中的有效浓度为0.01纳摩尔至100微摩尔，并且必须将必须通过任何途径给予个体的所述化合物的剂量调节至达到所述瘤内浓度。术语“敏化”哺乳动物包括：
(i)增加以前没有接受任何抗肿瘤剂或抗肿瘤治疗的哺乳动物中抗肿瘤剂或抗肿瘤治疗/处理的效能(“初始敏化”)，和/或
(ii)增加已经接受抗肿瘤剂或抗肿瘤治疗并且以前对其有或没有显示抗性的哺乳动物中抗肿瘤剂或抗肿瘤治疗/处理的效能。
能够在本发明中考虑的抗肿瘤治疗是例如，用任选地与吉西他滨或诸如多烯紫杉醇或紫杉醇的紫杉烷联合的诸如卡铂或顺铂的铂化合物治疗。抗肿瘤治疗的更多实例能够见于专利申请WO2005/112973。
通过将通式(I)化合物用于生产用于增加哺乳动物对用抗肿瘤剂治疗的敏感性的药品而能够有效治疗的癌症包括哺乳动物癌症，尤其是癌症或瘤形成，包括但不限于源于任何组织的任何类型的良性或恶性瘤形成，包括但不限于任何类型的癌，包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、食管癌、喉癌、甲状腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、子宫癌和子宫颈癌；任何类型的肉瘤，包括骨肉瘤、软组织肉瘤和血管肉瘤；任何类型的造血系统肿瘤，包括白血病和淋巴瘤；任何类型的神经系统肿瘤，包括成神经细胞瘤、胶质母细胞瘤和星形细胞瘤；任何皮肤病学癌症，包括黑色素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌。
最后，本发明的另一方面涉及药物组合物，其特征在于其包含治疗有效量的通式(I)化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体以及药物可接受的载体、佐剂或赋形剂。在具体实施方案中，所述药物组合物还包含治疗有效量的至少一种第二治疗剂，所述第二治疗剂在本发明的另一更具体的实施方案中是通式(I)化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体。
实施方案
实施例1.实验筛选以鉴定能够阻碍UBC13-UEV1相互作用的拟肽(N- 烷基甘氨酸)
通过酵母中的双杂交测试检测UBC13与UEV1之间的相互作用。在以下的实施例中使用的UBC13和UEV1的蛋白形式是人类的。UBC13蛋白也被称为UBE2N(HUGO命名法)，其具有如下标识符：NCBI-GI：4507793，UniProt：P61088和[EC：6.3.2.19]。UEV1蛋白也被称为UBE2V1(HUGO命名法)，其具有如下标识符：NCBI-GI：73765546和UniProt：Q13404。在本测试中，UBC13被表达为与来自质粒pBD-UBC13的Gal4DNA结合域(DBD-UBC13)的融合蛋白，并且UEV1被表达为与来自质粒pACT2-UEV1的Gal4转录激活域(AD-UEV1)的融合蛋白。两种质粒都在酿酒酵母菌株AH109中被共转染，在板上用无亮氨酸或色氨酸的YPD培养基生长，仅选择表达这两种氨基酸的tRNA合酶的菌落，即那些含有两种共转染的质粒的菌落。菌株AH109在其基因组中整合两种人造基因座：一种基因座含有在组氨酰-tRNA合酶的基因前面与GAL1启动子连接的Gal4DBD的识别序列；另一基因座含有在ADE2基因前面与GAL2启动子连接的Gal4DBD并且第三基因座含有在β-半乳糖苷酶的lacZ基因前面与MEL1启动子连接的Gal4 DBD的识别序列。一方面含有Gal4DBD域另一方面含有转录激活域的转录因子在菌株AH109中的表达诱导允许在无组氨酸的培养基中的生长的His-tRNA合酶的表达，并且同时诱导β-半乳糖苷酶的表达，所述β-半乳糖苷酶的酶活性可通过使用适当的底物进行比色检测。DBD-UBC13和AD-UEV1的表达和物理相互作用在这两种基因座的启动子上放置能够活化与Gal4的结合位点相关的启动子的转录因子。因此，用质粒pBD-UBC13和pACT2-UEV1共转染的AH109细胞在无组氨酸的培养基中的生长表明UBC13与UEV1蛋白之间物理相互作用的存在。此外，使用O-硝基苯基-p-吡喃半乳糖苷(ONPG)作为底物，通过比色测定β-半乳糖苷酶活性，能够以良好的相似度推导这种相互作用的程度，这种酶活性的水平与UBC13与UEV1之间相互作用的强度直接成正比。
基于三烷基甘氨酸(拟肽)的组合混合物和各个化合物的合成如下进行：通过在固相上的位置扫描程式优化的52种受控制的混合物中5120种拟肽的化学库[35]。该库由52种受控制的混合物和总共5120种化合物组成。混合物1至20(O1XX)含有所选择的可商购的20种伯胺之一作为明确的位置，而在‘X’位置(混合物位置)使用16种伯胺的组。混合物21至36(XO2X)和37至52(XXO3)在明确的位置仅含有16种胺的组[36]。总之，八个合成步骤的方法开始于释放Rink酰胺树脂(0.7mEq/g，Rapp Polymere，Tübingen，德国)的Fmoc保护基。然后，用氯乙酸和二异丙基碳二亚胺进行酰化步骤，然后用个别胺或胺的混合物对氯甲基化中间体进行相应的氨基化。然后用三氟乙酸/二氯甲烷/水的混合物将产物从树脂上裂解，将溶剂蒸发，将残留物冻干并以5mg/mL的浓度再溶解于10％的二甲亚砜中。应用上述合成顺序，通过独立的固相合成制备各个拟肽。各个N-烷基甘氨酸的纯度和鉴别通过高效液相、质谱以及1H和13C NMR测定。本说明书中示出的一般结构(II)显示了构成本发明中使用的组合化学库的N-烷基甘氨酸(拟肽)的一般化学结构。
下面描述用于筛选能够在酵母中的双杂交测试中抑制UBC13与UEV1之间相互作用的拟肽的方法。通过自HepG2细胞系的逆转录和PCR产生与UBC13和UEV1相应的互补DNA。按照Gal4DNA-结合域，将UBC13亚克隆入载体pBD(Stratagene，La Jolla，California，USA)中，产生质粒pBD-UBC13。按照Gal4的反式激活域，将UEV1亚克隆入载体pACT2(Clontech)中，产生质粒pACT2-UEV1。在酿酒酵母菌株AH109中共转染质粒pBD-UBC13和pACT2-UEV1。为此，将最近制备的感应酵母细胞与质粒的DNA以及作为载体的herringtestes DNA在聚乙二醇-乙酸锂溶液(40％ PEG，100mM乙酸锂，10mMTris，1mM EDTA)中混合，搅拌下在30℃孵育30分钟。然后加入7％的二甲亚砜，并将细胞在42℃的水浴中进行热休克30秒，然后立即在冰上冷却。将细胞在1000g下离心并在TE缓冲液(10mM Tris-C1H，pH7.5mM，1mM EDTA)中重悬浮并将其接种在基础培养基板中以便能够用HIS3、ADE2和LacZ标志物的表达来选择细胞。生长3天后，选择阳性生长(并且因此UBC13-UEV1相互作用阳性)的菌落，并使其在5mL的基础培养基中在搅拌下于30℃生长过夜。然后将其换至含有52种拟肽混合物之一的新生长培养基中，混合物浓度为0.1mM，30℃下孵育过夜。在695nm下测定培养物的吸光度(光密度或OD)，搅拌下于30℃在具有0.1mM拟肽的相同混合物的YPD培养基中制备初始OD695为0.2的新培养物，使生长进行3至4小时直至OD695达到0.8。在那时，离心培养物，将细胞团重悬浮于Z缓冲液(16g/LNa2HPO4，5.50g/L NaH2PO4，0.75g/L KCl，0.246g/L MgSO4，pH7.0)中，并通过液氮中(1分钟)至37℃(1分钟)的冻融循环打碎。立即添加160μLβ-半乳糖苷酶底物、O-硝基苯基-吡喃半乳糖苷(ONPG，在Z缓冲液中，4mg/mL)，在30℃下孵育直至形成可见的底物(黄色)。通过添加0.4mL1M的Na2CO3使反应终止，孵育30分钟然后离心。将上清液转移至细胞以便在420nm下进行分光光度法读数。1单位的β-半乳糖苷酶活性在本文中被描述为每细胞每分钟能够将1μmol ONPG水解成O-硝基酚和D-半乳糖的量(Miller，1972；Miller，1992)。这种比色测试提供了在酵母中的双杂交过程中两种蛋白之间相互作用强度的半定量量度。
在三次独立的试验中，用这种方法一式三份地分析52种拟肽混合物中的每一种。在所有这些测试中，将无拟肽存在时UBC13与UEV1之间的相互作用和p53与SV40大T蛋白之间的相互作用用作阳性相互作用对照。将层粘连蛋白和p53蛋白用作阴性对照。将UBC13-UEV1相互作用的β-半乳糖苷酶活性相对于其对应的阳性对照(p53-大T)的β-半乳糖苷酶活性进行标准化。以那种方式标准化的β-半乳糖苷酶活性如图2所示。该图显示，第12号、16号、37号、42号和46号混合物分别产生对UBC13-UEV1相互作用的最大抑制。通过仅用这5种混合物进行的一式三份的新比色测试证实了这些混合物对UBC13-UEV1相互作用的抑制能力，证实最大抑制活性在第12号、42号和46号混合物中。
化学库的模块和组合性质[35，36]允许推导负责这种抑制活性的拟肽的优选多样性[即结构(II)低聚体的R1、R2和R3位的伯胺]。在这种情况下，抑制UBC13-UEV1相互作用的拟肽必须对应于被称为N37-37-9C、N37-37-13C、N15-37-9C和N15-37-13C的拟肽中的一种或多种，其化学结构如下所示：
Figure A200780031330D00361
在R1位，所选择的胺是4’-氟苯乙基(拟肽N37-37-9C)或2’-4’-二氯苯乙基(拟肽N15-37-13C)；R2位的胺在所有情况下都是4’-氟苯乙基，并且在R3位选择胺4’-甲氧基苯乙基(拟肽N37-37-9C和N15-37-13C)和2-(2’-吡啶基)乙基(拟肽N37-37-9C和N15-37-9C)。因此，所选的四种拟肽的IUPAC命名法是：
N37-37-9C：[N-(2-(4’-氟苯基)乙基)甘氨酰]-[N-(2-(4’-氟苯基)乙基)甘氨酰]-[N-(2-(2’-吡啶)乙基]甘氨酰胺
N37-37-13C：[N-(2-(4’-氟苯基)乙基)甘氨酰]-[N-(2-(4’氟苯基)乙基)甘氨酰]-[N-(2-(4’-甲氧基苯乙基]甘氨酰胺
N15-37-9C：[N-(2-(2’，4’-二氯苯基)乙基)甘氨酰]-[N-(2-(4’-氟苯基)乙基)甘氨酰]-[N-(2-(2’-吡啶)乙基]甘氨酰胺
N15-37-13C：[N-(2-(2’，4’-二氯苯基)乙基)甘氨酰]-[N-(2-(4’-氟苯基)乙基)甘氨酰]-[N-(2-(4’-甲氧基苯乙基]甘氨酰胺
实施例2.源自实施例1中选择的拟肽的环状化合物的构象变异体在 UBC13上的分子对接的计算优化。
据估计，拟肽在酵母中的双杂交测试中对UBC13-UEV1相互作用的阻碍通过如下来实现：其在与UEV1的第一脂肪族螺旋相互作用的UBC13表面竞争性结合，因此从与UBC13的异二聚体相互作用中置换UEV1。与UEV1相互作用的UBC13表面是中心在疏水袋中的3点星形疏水沟槽，UEV1的苯丙氨酸8在所述疏水袋中对接，与UBC13的E55、L56、Y57和R70残基侧链具有相互作用[26，27]。为了研究这种假设并作为产生具有该活性的医药化合物之前的步骤，进行了在活性拟肽的UBC13中所关注的表面上的虚拟分子对接研究，以及随后对其衍生环状化合物的研究。这些后面的化合物对应于在所鉴别的N-烷基甘氨酸中寻找最稳定构象的化学优化。基于该信息，设计了实施例1中选择的N-烷基甘氨酸的八种构象受限的类似物的结构家族。虚拟设计所选择的每一拟肽以给出对应于八种环状结构的结构，并且对所有的形式都用UBC13蛋白的模型进行分子对接研究。
对UBC13-UEV1异二聚体配合物的原子结构进行这些分析(Brookhaven蛋白数据库索引号1JAT)。起初，视觉检测和基本的可达性计算表明，应当将配合物界面的所述残基之间发生的相互作用作为开发能够有效阻止该二元配合物形成的小分子的指导方针。
UBC13蛋白(受体)的制备。该蛋白的起始结构对应于PDB数据库条目1JAT[26]。将对应于UBC13蛋白的对其进行过计算的A链与存在于配合物中的异二聚体结构分开。用AMBER软件包protonate应用程序获得氢原子的位置[38]。然后将原子半径和电荷分配至与parm99版AMBER力场一致的蛋白的所有原子。然后定义该蛋白的活性中心。为此，以及在第一视觉检测之后，鉴别出位于形成二聚体的这两种蛋白之间的分隔界面上的UBC13蛋白的E55、L56、Y57和R70残基。这些残基形成袋，其中主要插入UEV1蛋白的F8残基。
实施例1中选择的三拟肽的衍生环状化合物(配体)的制备。这些化合物(具有实施例1的每一三拟肽的环状构型的8种不同的结构家族)的起始三维结构通过CORINA程序[39]和内部程序(ALFA)由它们的2D结构获得。基于该分析选择代表两种化合物的构象灵活性的构象。然后将电荷和半径分配至每一原子。parm99版AMBER力场被用于半径，而电荷通过调节静电电压(ESP)[40]来计算，所述静电电压用MOPAC软件包[42]中执行的半经验的哈密顿MNDO方法[41]计算。
相互作用能量的预计算。基于蛋白中预先选择的残基来定义将容纳配体的空间或盒子的区域。然后，在建在预先定义的盒子中的规则的0.5
Figure A200780031330D0038085548QIETU
格中测量与配体中存在的原子相应的若干化学探针的相互作用能量。所用的能量函数是AMBER程序中所用的分子力学函数的修改，并详细描述于[43]中。
在受体的结合位点对接配体。通过使用
Figure A200780031330D00381
的平移空间和30度的旋转间隔在形成活性中心的格的每一点“全面”产生每一配体所有可能的定向，从而获得配体在活性中心中最可能的位置；根据它们的最低相互作用能量来安排所述定向，在之前预计算的格中测量，每一所分析的配体选择20种定向的列。用内在程序CDOCK[43]进行这些计算。
配体的最终选择。为了获得对分子更精确的鉴别，对该列配体的相互作用能量作预先计算的修正。所以加入了溶剂化的贡献。因此，通过如下方程确定配体-活性中心结合能量：
范德华相互作用(右端的第一个术语)来自前述CDOCK程序。溶剂的影响如下获得：通过有限差分方法经由泊松方程的数解，例如在用于静电组分的DelPhi程序中执行的方法(方程右端的组分2、3和4)，并经由与非静电组分(右端的组分5)的易接近表面成比例的术语，所用的比例常数为0.00545。间隔为0.5
Figure A200780031330D0038085548QIETU
的立方体网格用于所有的静电计算，在所述网格中网格的尺寸使得任何原子与盒子的边缘之间分开至少11
Figure A200780031330D0038085548QIETU
。分子内部的溶质的特征是介电常数为4，而对于外部所用的介电常数为80。所使用的其余参数是程序默认的参数。
所发现的最好的分子和它们划分成贡献的相互作用能量包括在表1至6中。对于具有最高理论亲和力的化合物N37-37-9C，家族C(化合物Ia)和N37-37-9C，家族D(化合物Ib)所获得的结合模式的实例包括在图3和图4中。
表1.化合物N37-37-9C，家族C的能量计算。显示两种对映体中每一种的20种最佳构象的结果。
Figure A200780031330D00392
Figure A200780031330D00401
表2.化合物N37-37-9C，家族D的能量计算。显示两种对映体中每一种的20种最佳构象的结果。
Figure A200780031330D00403
Figure A200780031330D00411
表3.化合物N37-37-13C，家族C的能量计算。显示两种对映体的20种最佳构象的结果。
Figure A200780031330D00413
表4.化合物N37-37-13C，家族D的能量计算。显示两种对映体中每一种的20种最佳构象的结果。
Figure A200780031330D00422
Figure A200780031330D00423
Figure A200780031330D00431
表5.化合物N15-37-9C，家族C的能量计算。显示两种对映体中每一种的20种最佳构象的结果。
Figure A200780031330D00432
Figure A200780031330D00433
Figure A200780031330D00441
表6.化合物N15-37-9C，家族D的能量计算。显示两种对映体中每一种的20种最佳构象的结果。
Figure A200780031330D00442
Figure A200780031330D00443
Figure A200780031330D00451
实施例3.在与UEV1相互作用的UBC13的表面上具有较好理论对接 的环状化合物的合成。化合物Ia和Ib。
3.1.-化合物Ia(Varubin)：N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙 基)-1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氯杂环庚烷-5-甲酰 胺
化合物Ia的合成在本专利申请中说明。用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入N-[2-2’-(吡啶-2-基)乙胺(180μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液并将悬浮液在90℃、微波活化下搅拌2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率获得)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷∶二甲基甲酰胺(2∶1，3mL)溶液处理树脂。将一式两份的反应混合物在室温下搅拌30分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液并将悬浮液在室温下搅拌3小时。在相同的温度下重复该反应16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。将反应混合物于60℃下在微波反应器中搅拌2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后在室温下和氩气氛中用四(三苯基膦)钯(0)(35mg，0.1eq.)和苯基硅烷(370μL，10eq.)的无水二氯甲烷溶液处理树脂15分钟。重复该过程三次。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。通过用苯并三唑-1-基氧-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸盐(235mg，1.5eq.)、1-羟基苯并三唑(61mg，1.5eq.)和N，N-二异丙基乙胺(154μL，3eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理进行环化。在室温下搅拌反应混合物3小时。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。最后，用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60:40:2)的混合物处理树脂，释放含有化合物Ia的反应混合物。将后者过滤并通过减压蒸发然后冻干除去溶剂。残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度(20％乙腈→80％乙腈，30分钟)纯化，得到52mg所寻求的产物(收率30％，纯度≥98％)。
HRMS-FAB：C31H33F2N5O4计算值[M+H+]578.257886；测得值578.257844。
3.2.-化合物Ib：[1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基 -N-(2’-(2”吡啶基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮
Figure A200780031330D00471
化合物Ib的合成如方案II所示。固相中的所有固相反应进行双份。用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后，向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率制备)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液处理树脂。在室温下搅拌反应混合物30分钟。过滤反应混合物并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤树脂。然后向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液并将悬浮液在室温下搅拌3小时。在相同的温度下搅拌反应物16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。最后，在室温下用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60:40:2)的混合物处理树脂30分钟。过滤水解混合物，收集滤液并通过低压蒸发除去溶剂。通过在回流条件下用4mL二氧杂环己烷处理先前的残余物30分钟(通过HPLC控制)来完成随后的环化。然后添加4N氢氧化钠和烯丙醇(1:2，1.5mL)的溶液，在回流下搅拌混合物30分钟(通过HPLC控制)。将反应混合物用1N盐酸酸化并将溶剂蒸发。将所得残余物用2×10mL乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥并真空浓缩。通过真空浓缩除去溶剂，得到无色固体形式的哌嗪二酮中间体(90mg，72％)。该物质被用于以下步骤中，无需进一步纯化。
按照与上述类似的方法合成含有N-烷基甘氨酸片段的树脂。简要地，该片段通过如下获得：用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液处理树脂(290mg，0.22mmol)，然后用溴乙酸(153mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(175μL，5eq.)酰化，以及在三乙胺(155μL，5eq.)的存在下用N-[2-2’-(吡啶-2-基)乙胺(135μL，5eq.)将胺偶合。然后在1-羟基苯并三唑(45mg，1.5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(55μL，1.5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液的存在下将哌嗪二酮中间体(90.0mg，1eq.)与树脂偶合。在室温下搅拌反应混合物1小时。用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤干树脂。最后，用60:40:2的三氟乙酸/二氯甲烷/水混合物处理树脂，得到含有化合物Ib的反应混合物。将后者过滤并通过低压蒸发，然后冻干除去溶剂。所获得的残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度(30％乙腈→45％乙腈，30分钟)纯化，得到57mg所寻求的产物(收率33％，纯度≥98％)。
HRMS-FAB：C31H33F2N5O4计算值[M+H+]578.2501；测得值578.2573。
实施例3.3.化合物N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(2”-吡啶基)乙 基)-1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代 -[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺。
用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入N-[2-2’-(吡啶-2-yl)乙胺(180μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率获得)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液处理树脂。将一式两份的反应混合物在室温下搅拌30分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在室温下搅拌悬浮液3小时。在相同温度下重复该反应16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入2-(2’，4’-二氯苯基)乙胺(240μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后在室温下和氩气氛中用四(三苯基膦)钯(0)(35mg，0.1eq.)和苯基硅烷(370μL，10eq.)的无水二氯甲烷溶液处理树脂15分钟。重复该过程三次。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。通过用苯并三唑-1-基氧-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸盐(235mg，1.5eq.)、1-羟基苯并三唑(61mg，1.5eq.)和N，N-二异丙基乙胺(154μL，3eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理而进行环化。在室温下搅拌反应混合物3小时。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。最后，用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60:40:2)的混合物处理树脂，释放含有所寻求的化合物的反应混合物。过滤该混合物并通过减压蒸发然后冻干除去溶剂。残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度进行纯化。
实施例3.4.化合物N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(4”-甲氧基苯基)乙 基)-1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代 -[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺。
用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入2-(4’-甲氧基苯基)乙胺(235μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率获得)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液处理树脂。将一式两份的反应混合物在室温下搅拌30分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后向树脂中加入N-2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在室温下搅拌悬浮液3小时。在相同的温度下重复该反应16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入2-(2’，4’-二氯苯基)乙胺(240μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后在室温下和氩气氛中用四(三苯基膦)钯(0)(35mg，0.1eq.)和苯基硅烷(370μL，10eq.)的无水二氯甲烷溶液处理树脂15分钟。重复该过程三次。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。通过用苯并三唑-1-基氧-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸盐(235mg，1.5eq.)、1-羟基苯并三唑(61mg，1.5eq.)和N，N-二异丙基乙胺(154μL，3eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理而进行环化。在室温下搅拌反应混合物3小时。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。最后，用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60∶40∶2)的混合物处理树脂，释放含有所寻求化合物的反应混合物。过滤该混合物并通过减压蒸发然后冻干除去溶剂。残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度进行纯化。
实施例3.5.化合物N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(4”-甲氧基苯基)乙 基)-1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰 胺。
Figure A200780031330D00521
用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入2-(4’-甲氧基苯基)乙胺(235μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率获得)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷∶二甲基甲酰胺(2∶1，3mL)溶液处理树脂。将一式两份的反应混合物在室温下搅拌30分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在室温下搅拌悬浮液3小时。在相同的温度下重复该反应16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后在室温下和氩气氛中用四(三苯基膦)钯(0)(35mg，0.1eq.)和苯基硅烷(370μL，10eq.)的无水二氯甲烷溶液处理树脂15分钟。重复该过程三次。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。通过用苯并三唑-1-基氧-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸盐(235mg，1.5eq.)、1-羟基苯并三唑(61mg，1.5eq.)和N，N-二异丙基乙胺(154μL，3eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理而进行环化。在室温下搅拌反应混合物3小时。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。最后，用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60∶40∶2)的混合物处理树脂，释放含有所寻求化合物的反应混合物。过滤混合物并通过减压蒸发然后冻干除去溶剂。残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度进行纯化。
实施例3.6.化合物1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基]-4-[2’-(4”-氟苯基)乙 基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮
所有固相反应进行双份。用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后，向树脂中加入2-(2’，4’-二氯苯基)乙胺(240μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率制备)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液处理树脂。在室温下搅拌反应混合物30分钟。过滤混合物并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤树脂。然后向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在室温下搅拌悬浮液3分钟。在相同的温度下搅拌反应物16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。最后，在室温下用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60:40:2)的混合物处理树脂30分钟。过滤水解混合物，收集滤液并通过低压蒸发除去溶剂。通过在回流条件下用4mL二氧杂环己烷处理先前的残余物30分钟(通过HPLC控制)来完成接下来的环化。然后添加4N氢氧化钠和烯丙醇(1:2，1.5mL)的溶液，在回流下搅拌混合物30分钟(通过HPLC控制)。用1N盐酸将反应混合物酸化并将溶剂蒸发。将所得残余物用2×10mL乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥并真空浓缩。通过真空浓缩除去溶剂，得到哌嗪二酮中间体。该物质被用于以下步骤中，无需进一步纯化。
按照与上述类似的方法合成含有N-烷基甘氨酸片段的树脂。简要地，该片段通过如下获得：用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液处理树脂，然后用溴乙酸(5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(5eq.)酰化，以及在三乙胺(5eq.)的存在下用N-[2-2’-(吡啶-2-基)乙胺(5eq.)将胺偶合。然后在1-羟基苯并三唑(1.5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(1.5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液的存在下将哌嗪二酮中间体(1eq.)与树脂偶合。在室温下搅拌反应混合物1小时。用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤干树脂。最后，用60:40:2的三氟乙酸/二氯甲烷/水混合物处理树脂，得到含有所寻求化合物的反应混合物。过滤该化合物并通过低压蒸发然后冻干除去溶剂。所获得的残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度进行纯化。
实施例3.7.化合物1-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基]-4-[2，-(4”-氟苯基)乙 基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(4”-甲氧基苯基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二 酮。
Figure A200780031330D00561
所有固相反应进行双份。用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后，向树脂中加入2-(2’，4’-二氯苯基)乙胺(240μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率制备)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液处理树脂。在室温下搅拌反应混合物30分钟。过滤混合物并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤树脂。然后向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在室温下搅拌悬浮液3分钟。在相同的温度下搅拌反应物16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。最后，在室温下用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60:40:2)的混合物处理树脂30分钟。过滤水解混合物，收集滤液并通过低压蒸发除去溶剂。通过在回流条件下用4mL二氧杂环己烷处理先前的残余物30分钟(通过HPLC控制)来完成接下来的环化。然后添加4N氢氧化钠和烯丙醇(1:2，1.5mL)的溶液，在回流下搅拌混合物30分钟(通过HPLC控制)。用1N盐酸将反应混合物酸化并将溶剂蒸发。将所得残余物用2×10mL乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥并真空浓缩。通过真空浓缩除去溶剂，得到哌嗪二酮中间体。该物质被用于以下步骤中，无需进一步纯化。
按照与上述类似的方法合成含有N-烷基甘氨酸片段的树脂。简要地，该片段通过如下获得：用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液处理树脂，然后用溴乙酸(5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(5eq.)酰化，以及在三乙胺(5eq.)的存在下用2-(4’-甲氧基苯基)乙胺(5eq.)将胺偶合。然后在1-羟基苯并三唑(1.5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(1.5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液的存在下将哌嗪二酮中间体(1eq.)与树脂偶合。在室温下搅拌反应混合物1小时。用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤干树脂。最后，用60:40:2的三氟乙酸/二氯甲烷/水混合物处理树脂，得到含有所寻求化合物的反应混合物。过滤该化合物并通过低压蒸发然后冻干除去溶剂。所获得的残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度进行纯化。
实施例3.8.化合物1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基 -N-(2’-(4”-甲氢基苯基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮。
所有固相反应进行双份。用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后，向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率制备)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液处理树脂。在室温下搅拌反应混合物30分钟。过滤混合物并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤树脂。然后向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在室温下搅拌悬浮液3小时。在相同的温度下搅拌反应物16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。最后，在室温下用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60:40:2)的混合物处理树脂30分钟。过滤水解混合物，收集滤液并通过低压蒸发除去溶剂。通过在回流条件下用4mL二氧杂环己烷处理先前的残余物30分钟(通过HPLC控制)来完成接下来的环化。然后添加4N氢氧化钠和烯丙醇(1:2，1.5mL)的溶液，在回流下搅拌混合物30分钟(通过HPLC控制)。用1N盐酸将反应混合物酸化并将溶剂蒸发。将所得残余物用2×10mL乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥并真空浓缩。通过真空浓缩除去溶剂，得到哌嗪二酮中间体。该物质被用于以下步骤中，无需进一步纯化。
按照与上述类似的方法合成含有N-烷基甘氨酸片段的树脂。总之，该片段通过如下获得：用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液处理树脂(290mg，0.22mmol)，然后用溴乙酸(153mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(175μL，5eq.)酰化，以及在三乙胺(155μL，5eq.)的存在下用2-(4’-甲氧基苯基)乙胺(235μL，5eq.)将胺偶合。然后在1-羟基苯并三唑(45mg，1.5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(55μL，1.5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液的存在下将哌嗪二酮中间体(90.0mg，1eq.)与树脂偶合。在室温下搅拌反应混合物1小时。用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤干树脂。最后，用60:40:2的三氟乙酸/二氯甲烷/水混合物处理树脂，得到含有所寻求化合物的反应混合物。过滤该化合物并通过低压蒸发然后冻干除去溶剂。所获得的残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度进行纯化。
实施例3.9.化合物N-氨基甲酰基甲基-N-[2’-(2”，4”-二氯苯基)乙 基]-1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰 胺。
Figure A200780031330D00601
用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入2-(2’，4’-二氯苯基)乙胺(240μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并将悬浮液在90℃、微波活化下搅拌2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率获得)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液处理树脂。将一式两份的反应混合物在室温下搅拌30分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并将悬浮液在室温下搅拌3小时。在相同的温度下重复该反应16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。将反应混合物于60℃下在微波反应器中搅拌2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。然后在室温下和氩气氛中用四(三苯基膦)钯(0)(35mg，0.1eq.)和苯基硅烷(370μL，10eq.)的无水二氯甲烷溶液处理树脂15分钟。重复该过程三次。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。通过用苯并三唑-1-基氧-三-吡咯烷-鳞六氟磷酸盐(235mg，1.5eq.)、1-羟基苯并三唑(61mg，1.5eq.)和N，N-二异丙基乙胺(154μL，3eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理而进行环化。在室温下搅拌反应混合物3小时。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。最后，用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60:40:2)的混合物处理树脂，释放含有所寻求的化合物的反应混合物。过滤化合物并通过减压蒸发然后冻干除去溶剂。残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度(20％乙腈→50％乙腈，30分钟)纯化，得到77.3mg所寻求的产物(收率38％，纯度≥98％)。
ESI-MS：C32H32Cl2F2N4O4计算值[M+H+]645.2；测得值：[M+H+]645.2。
实施例3.10.化合物[1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基 -N-(2’-(2”，4”-二氯苯基)乙基)羰甲基]哌嗪-3，6-二酮。
Figure A200780031330D00621
所有固相反应进行双份。用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液3mL处理Rink酰胺树脂(400mg，0.3mmol)，并于60℃下在微波反应器中搅拌该混合物2分钟。过滤树脂并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用溴乙酸(208mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二甲基甲酰胺(3mL)溶液处理树脂。于60℃下在微波反应器中搅拌反应混合物2分钟。过滤树脂并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤。然后，向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在90℃、微波活化下搅拌悬浮液2分钟。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。用(Z)-3-(烯丙氧基羰基)丙烯酸(由马来酸酐和烯丙醇的氯仿溶液在60℃、微波活化下反应50分钟以85％的收率制备)(234mg，5eq.)、1-羟基苯并三唑(203mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(235μL，5eq.)的二氯甲烷:二甲基甲酰胺(2:1，3mL)溶液处理树脂。在室温下搅拌反应混合物30分钟。过滤混合物并用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤树脂。然后向树脂中加入2-(4’-氟苯基)乙胺(200μL，5eq.)和三乙胺(210μL，5eq.)的3mL二甲基甲酰胺溶液，并在室温下搅拌悬浮液3小时。在相同的温度下搅拌反应物16小时。弃去上清液，过滤残余物并用二甲基甲酰胺(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二氯甲烷(3×3mL)洗涤。最后，在室温下用三氟乙酸/二氯甲烷/水(60:40:2)的混合物处理树脂30分钟。过滤水解混合物，收集滤液并通过低压蒸发除去溶剂。通过在回流条件下用4mL二氧杂环己烷处理先前的残余物30分钟(通过HPLC控制)来完成接下来的环化。然后添加4N氢氧化钠和烯丙醇(1:2，1.5mL)的溶液，在回流下搅拌混合物30分钟(通过HPLC控制)。用1N盐酸将反应混合物酸化并将溶剂蒸发。将所得残余物用2×10mL乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥并真空浓缩。通过真空浓缩除去溶剂，得到无色固体形式的哌嗪二酮中间体(90mg，72％)。该物质被用于以下步骤中，无需进一步纯化。
按照与上述类似的方法合成含有N-烷基甘氨酸片段的树脂。简要地，该片段通过如下获得：用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液处理树脂(290mg，0.22mmol)，然后用溴乙酸(153mg，5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(175μL，5eq.)酰化，以及在三乙胺(155μL，5eq.)的存在下用2-(2’，4’-二氯苯基)乙胺(170μL，5eq.)将胺偶合。然后在1-羟基苯并三唑(45mg，1.5eq.)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(55μL，1.5eq.)的二氯甲烷∶二甲基甲酰胺(2∶1，3mL)溶液的存在下将哌嗪二酮中间体(90.0mg，1eq.)与树脂偶合。在室温下搅拌反应混合物1小时。用二氯甲烷(3×3mL)、异丙醇(3×3mL)和二甲基甲酰胺(3×3mL)洗涤干树脂。最后，用60:40:2的三氟乙酸/二氯甲烷/水混合物处理树脂，得到含有所寻求化合物的反应混合物。过滤该化合物并通过低压蒸发然后冻干除去溶剂。所获得的残余物通过半制备规模的RP-HPLC应用乙腈-水梯度(30％乙腈→45％乙腈，30分钟)进行纯化，得到71.7mg所寻求的产物(收率35％，纯度≥99％)。ESI-MS：C32H32Cl2F2N4O4计算值[M+H+]645.2；测得值：[M+H+]645.1。
实施例4.化合物Ia和Ib对UBC13与UEV1之间相互作用的影响。
实施例2中描述的计算分析支持化合物Ia和Ib在UBC13表面的通常用于其与UEV蛋白(Mms2p，UEV1和UEV2)的第一脂肪族螺旋特定地相互作用的疏水沟槽中以良好的亲和力对接。这表明所述化合物能够竞争性地阻碍UBC13与UEV1(或Mms2p与UEV2)之间的相互作用。为了在实验上证实，使用两步测试法分析化合物Ia和Ib抑制UBC13-UEV1相互作用的能力：
(1)酵母中对UBC13-UEV1相互作用的双杂交测试，应用实施例1中描述的方法；以及
(2)非细胞系统中UBC13与UEV1蛋白之间的相互作用，使用大肠杆菌(Escherichia coli.)中产生的重组蛋白。
在酵母中的双杂交测试中，化合物Ia和Ib对UBC13-UEV1相互作用的影响通过孵育在含有100μM任何一种化合物的选择性培养基中生长的酿酒酵母菌株AH109的细胞来进行。Sv40大T与p53蛋白的相互作用被用作阳性相互作用对照。通过使用O-硝基苯基-p-吡喃半乳糖苷(ONPG)作为底物检测β-半乳糖苷酶活性，比色测定相互作用的强度，每一测定进行三份。在这些条件下，图5(A)表明在100μM的浓度下，化合物Ia抑制UBC13与UEV1之间的相互作用接近60％，而化合物Ib对该相互作用的抑制为接近40％。这两种化合物都不抑制用作对照的p53与大T之间的相互作用，这表明两种化合物都特异性抑制UBC13与UEV1之间的相互作用。这些结果还表明化合物Ia抑制这种相互作用的效能比化合物Ib高。
为了在非细胞测试中测定这些化合物的活性，用大肠杆菌中产生的重组蛋白进行蛋白-蛋白相互作用试验。为了表达UBC13和UEV1，用质粒pGEX-4T1-UBC13或pGEX-4T3-UEV1转化大肠杆菌菌株BL21的细菌细胞，转化的菌落通过在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的盘中的生长来选择。将各个菌落转移至3L无抗生素的LB培养基中，在37℃、搅拌下生长直至培养物达到指数期(OD600nm～0.6)，此时通过向培养物中添加浓度为1mM的异丙基α-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，SigmaI-6758)5小时来诱导重组蛋白的表达。将培养物转移至管中，离心，将细胞团在两倍于它们体积的pH7.4的磷酸缓冲盐(PBS)中重悬浮并在Cell Disruptor仪器(Constant Systems)中打碎。通过具有45μM孔的乙酸纤维素过滤器(Millipore SLHA033SS)过滤细胞裂解液并将其加载至GSTrap FF柱(Amersham Biosciences17-5131-01)。对于UEV1，在25℃下用50单位的凝血酶(Amersham Biosciences27-0846-01)在相同的柱上对与该柱特异性结合的蛋白进行酶消化过夜。将HiTrapBenzamidine FF柱(Amersham Biosciences 27-0846-01)与前面的柱相连，使得GST单元被截留在第一柱中，凝血酶被截留在第二柱中。然后洗脱无GST部分的UEV1蛋白，然后通过具有Superdex75柱的凝胶滤过色谱进行纯化步骤。如上所述表达GST-UBC13重组蛋白，通过GSTrap FF柱中的亲和色谱和Superdex 75柱中的滤过色谱进行纯化。与纯化蛋白相应的馏分通过在Centricon YM-10柱(Millipore 4205)中离心进行浓缩，在4℃下储存直至使用。
为了测定化合物Ia和Ib对UBC13与UEV1的相互作用的影响，将在pH7.6下以4.09μmg/mL的浓度溶于50mM Hepes缓冲液、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM DTT中的2μL GST-UBC13嵌合重组蛋白在室温下与终浓度为10nM、100nM、1μM、10μM或100μM的化合物Varubin、Ib或环状对照化合物VIII-N6-2-1C预孵育30分钟。通过用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B基质(Amersham Biosciences)孵育60分钟而将这些混合物固定在固相中，然后pH7.6下用10倍基质体积的50mM Hepes缓冲液、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM DTT洗涤。然后在相同缓冲液中用10μL浓度为0.15μg/mL的UEV1蛋白将该柱孵育45分钟。通过在14,000g下离心收集未与柱结合的UEV1蛋白(洗脱的馏分，或E)，然后用10倍柱体积的前述缓冲液洗柱。然后通过用在50mM pH8.0的Tris-HCl中含有10mM还原型谷胱甘肽的洗脱缓冲液孵育来洗脱GST-UBC13和GST-UBC13-UEV1配合物(保留的馏分，或B)。馏分E和B通过在Centricon YM-10柱中离心进行浓缩，通过在Laemmli缓冲液(250mM Tris-HCl，10％SDS，500mM DTT，0.5％溴酚蓝，50％甘油，pH6.8)中煮沸进行变性，并在10％聚丙烯酰胺-SDS凝胶中电泳分离。电泳后，将蛋白电泳转移至PVDF膜，然后用兔抗UEV1或抗UBC13抗体孵育1小时，所述PVDF膜用封闭缓冲液(含有0.1％ Tween-20的pH7.4的PBS中的5％的脱脂奶)预孵育1小时。这些抗体在本实验室中通过用分别与具体的UEV1或UBC13序列对应的合成肽对兔进行免疫接种而预先制备，通过用其上固定有免疫接种的肽的柱的亲和色谱而由免疫血清中纯化抗体[37]。在用这些抗体孵育之后，用20mL PBS-Tween-20洗涤膜三次，并用在封闭缓冲液中稀释至1:1000的辣根过氧化物酶缀合的羊抗兔免疫球蛋白抗体(Dako Cytomation)孵育30分钟。在用PBS-Tween-20洗涤三次之后，通过用ECL系统(Amersham)化学发光和在放射能照像膜上曝光来观察膜上的反应。
该测试的结果如图5(B)所示，其表明化合物Ia和Ib，有效地抑制UEV1与GST-UBC13的结合，而环状对照化合物VIII-N6-2-1C不抑制，因为高达60％(化合物Ia)或40％(化合物Ib)的UEV1出现在被洗脱并且未与GST-UBC13结合的馏分中。尽管图5(B)仅显示用100μM环状化合物进行测试的结果，但仍观察到了在直至10nM的低得多的浓度下化合物Ia和Ib对UEV1与UBC13的相互作用的有效抑制。考虑到UEV1和UBC13蛋白彼此以高亲合力(KD≈5×10-10M，已在Biacore T100仪器中测定的常数)相互作用，这些结果表明化合物Ia和Ib对UBC13与UEV1之间的相互作用的抑制是由于这些化合物与通常用于其与UEV1的第一脂肪族螺旋相互作用的UBC13表面的竞争性相互作用。
实施例5.化合物Ia对由UBC13-UEV1介导的多泛素化的影响。
实施例4中描述的化合物Ia和Ib对UBC13与UEV1之间的相互作用的抑制表明，这些化合物能够抑制UBC13的酶活性。如背景技术中描述的那样，由UBC13-UEV1催化的K63型多泛素化需要该异二聚体的两种亚单位之间的相互作用。通过体外游离多聚泛素链形成测试来分析作为UBC13与UEV1之间相互作用的抑制剂的两种化合物中最有活性的化合物Ia影响这种酶活性的能力。在该测试中，在含有pH7.6的50mM Tris-HCl、5mM MgCl2和0.5mM二硫苏糖醇的反应缓冲液中，可以在含有0.1μM E1酶(Boston Biochem)、0.2μM UBC13、0.2μM UEV1(如实施例4所述制备)、117μM野生型泛素(BiomolUW8795)或除了63位(泛素K63)或48位(泛素K48；Boston Biochem)的赖氨酸之外所有赖氨酸都突变的泛素的反应中形成多聚泛素链。对于用化合物Ia(Varubin)进行的处理，在添加至反应之前将UBC13在室温下用100μM化合物预孵育10分钟。通过添加2mM ATP引发反应，并通过在不同的时间点在37℃下孵育使之进行，通过添加Laemmli缓冲液(250mM Tris-HCl、10％SDS、500mM DTT、0.5％溴酚蓝和50％甘油，pH6.8)并煮沸3分钟使之终止。将样品在聚丙烯酰胺-SDS凝胶中电泳分离并电泳转移至PVDF膜。按照实施例4中描述的免疫检测方法，用兔抗泛素抗体(Biomol UG 9510)检测泛素分子，并通过化学发光揭示其反应性。
图6(A)表明，无化合物Ia时，由于不断加入泛素单元，上述反应导致形成尺寸随时间增加的多聚泛素链。对照反应表明，反应约30分钟时出现三泛素(Ub3)，60分钟时出现四泛素(Ub4)，90分钟时出现五泛素(Ub5)，并在更晚的时间出现更大尺寸(或复杂度)的形式。如图6(B)所示，不同形式的多聚泛素的产生的定量分析表明UBC13与100μM化合物Varubin(Ia)的预孵育导致多泛素化形式的产生速率降低。对照反应曲线与用化合物Ia处理的曲线的斜率的显著差异也表明这种化合物对UBC13-UEV1的酶活性的抑制为竞争型。这种体外多泛素化特异性地使用泛素分子63位的赖氨酸，因为它在反应中使用野生型泛素和泛素K63时都发生(图6(C))，但在使用泛素48时不发生。此外，用化合物Ia预孵育UBC13抑制使用泛素K63作为底物的多泛素化，效率与底物为野生型泛素(图6(C))时类似。因此，结论是化合物Ia有效地抑制UBC13-UEV1体外催化的K63型多泛素化。
实施例6.化合物Ia和Ib的生物活性。酿酒酵母中的活性。
在酿酒酵母中，由Ubc13p-Mms2p介导的PCNA蛋白的K63型多泛素化对于被称为“无错修复”的RAD6分途径中的复制后DNA修复至关重要[7-17]。在该途径中，UBC13和MMS2相对于RAD6都是上位的，虽然具有删除UBC13而不删除MMS2部分地救援rad6显型的特性[14]。两种基因都与RAD6调节的第二修复分途径即所谓的“无错修复”的突变异种或REV3、REV7和REV1参与的诱变分途径的突变异种协作。失去UBC13或MMS2引起rev3突变异种对诸如紫外辐射或暴露于甲基磺酸甲酯(MMS)下的基因毒性损伤的更高敏化的事实显示了这种协作[13-15]。
为了确定化合物Ia和Ib是否抑制Ubc13p-Mms2p的功能，评价了它们在酿酒酵母中模拟由ubc13的无效突变产生的DNA修复显型的能力。因此，在暴露于紫外辐射或MMS之后，将RAD6或REV3及其母株(对照)中的突变菌株用于活性检测。所使用的菌株的基因型如下：
1)母株(对照)BY4741：位于his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0的MAT
2)菌株Δrad6：位于his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 rad6::kanMX4的MAT
3)菌株Δrev3：位于his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 rev3::kanMX4的MAT
将细胞接种入含有YPD培养基的液态培养物中，30℃过夜，直至达到对数生长期。对于用紫外辐射处理，在图7和8中指示的能量下在Stratalinker仪器(Stratagene)中照射在有或没有100μM化合物Ia或Ib存在时生长的细胞等份。对于用诱变剂MMS处理，孵育在或未在含有100μM化合物Ia或Ib的培养基中生长的细胞等份，添加0.03％MMS，然后如图7和8中指示的时间孵育。在每一处理后，将500个细胞接种在含有YPD培养基的盘中，2天后对菌落进行计数。
如所期望的那样，在这些测试中Δrad6突变异种显示出对UV照射和MMS的高敏感性，在诱变剂的剂量增加时存活率迅速降低(图7)。然而，100μM化合物Ia或化合物Ib的存在明显地救援了UV照射所诱导的rad6显型，并且以较小的程度救援了由MMS处理产生的显型(图7)。这是Δubc13突变异种的特征性显型，因此化合物Ia和Ib模拟这种显型，这表明它们通过抑制UBC13起作用。在另一方面，用化合物Ia和在较小程度上用化合物Ib孵育Δrev3突变异种引起了细胞对UV照射或暴露于MMS的影响的较高敏化，其具有与Δubc13突变相似的协作(图8)。因此，所分析的两种显型表明化合物Ia和Ib影响由RAD6调节的DNA修复路径，并且这通过抑制Ubc13p来实现。
实施例7.化合物Ia和Ib的生物活性。抑制转录因子NF-κB被TNFα 的刺激。
如在背景技术中描述的那样，由UBC13-UEV1(或UBC13-UEV2)催化的、由K63型多泛素化调节的生化途径之一，是转录因子NF-κB被细胞因子、TNFα和其它多肽所诱导的信号的活化。
为了测定化合物Ia和Ib对NFκ-B活性被TNFα刺激的活性，进行了用于诱导荧光素酶活性(用Promega的双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒测定，目录号E1910)的测试，所述荧光素酶活性是通过由含有三个NFκ-B识别位点的启动子引导的萤火虫(北美萤火虫(Photinus pyralis))荧光素酶基因的表达产生的。所以，用编码海肾(Renilla reniformis)荧光素酶并作为转染效率对照的质粒pRL-TK和允许测定NF-κB的转录活性的质粒prLUC，使用Fugene(Roche)作为转染载体，来共转染HeLa细胞。将100,000个细胞接种在6孔板(Costar)中。下一天，用0.5μg每一质粒和3μl Fugene15分钟形成转染复合物。将该复合物添加至Optimem培养基(InVitrogen)中的细胞，并在5小时后被换至添加或不添加不同浓度的化合物Varubin(Ia)或Ib的完全培养基(含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、补加有青霉素和链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium))中。下一天，将细胞用TNFα(10ng/mL)孵育4小时，此后用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤并按照厂家(Promega)的说明用250μL裂解液溶解。将100μL荧光素酶试剂(LARII)添加至溶解产物以测定萤火虫荧光素酶活性，此后用100μL含有海肾荧光素酶底物的终止缓冲液终止反应，此时测定这种第二活性。萤火虫荧光素酶活性相对于海肾荧光素酶活性进行标准化。将与用TNFα转染但未被其刺激的细胞相应的值用作其余实验值的标准化值。最后，进行第三标准化，其中相对于不添加本发明的药物对象(TNFα对照)的情况下TNFα诱导荧光素酶活性的值考虑了所有的值。
图9表明，用化合物Ia或化合物Ib预孵育HeLa细胞以剂量依赖的方式抑制TNFα诱导的NF-κB的转录活性的刺激。化合物Ia的这种抑制比化合物Ib大，当用Varubin(Ia)在100μM的浓度下预孵育HeLa细胞时，达到对NF-κB通过TNFα的活化的接近50％的抑制。因此，化合物Ia和Ib是NF-κB活化的有效抑制剂，因而它们可应用于这种活化很重要的过程中，包括发炎和瘤过程。
实施例8.化合物Ia和Ib的生物活性。肿瘤细胞对阿霉素和依托泊苷 的细胞毒性效应的敏化。
当正常和肿瘤细胞受到不同形式的应激或损伤时，转录因子NF-κB的活化是它们的存活机制之一[44-47]。因此，抑制这种转录因子活化的后果之一是它引起对不同物理或化学剂的细胞毒性效应的较高敏感性，这导致基因毒性损伤或另一类型的细胞应激。因此，部分由于化合物Ia或Ib能够抑制NF-κB的活化，用它们孵育细胞能够引起细胞对诸如阿霉素或依托泊苷的化疗剂的作用的敏化。换句话说，阿霉素或依托泊苷(以一定的剂量)与化合物Ia或Ib的联合应当引起比单独用阿霉素或依托泊苷更大的细胞毒性效应并且类似于分别用较大剂量的阿霉素或依托泊苷引起的细胞毒性效应。
为了在实验上证实这种预测，通过CyQuant法(Molecular Probes，目录号C-7026)进行细胞计数试验。这种细胞定量方法基于在与核酸结合后其荧光被定量激发的化合物。将10,000个细胞接种在96孔板的每一孔中，使它们在37℃、5％ CO2和90％湿度的空气中粘附在板的表面上过夜，此后对细胞进行不同的处理。当实验处理结束时，用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤孔一次，然后将板在-70℃下冷冻直至进行CyQuant测试的时间。对于定量，在室温下将板解冻并向每一孔中添加200μL含有CyQuant GR染料的裂解液(按照厂家的说明书)。在室温下孵育2至5分钟之后，在480nm和520nm下定量所发射的荧光。为了计算与荧光计读数相应的细胞数量，根据已知数目的细胞产生标准发射荧光，并用这一数据来外推试验数据。
如图10所示，分别用浓度为0.05μM至50μM、添加或不添加100μM化合物Ia的依托泊苷和阿霉素处理HeLa细胞(来自子宫颈癌)或PC-3细胞(来自前列腺癌)。从图10的图能够推断，阿霉素在PC-3细胞中处理72小时后的IC50接近0.5μM，并且依托泊苷在HeLa细胞中处理24小时后的IC50为大约1.25μM。添加100μM Ia将阿霉素对PC-3细胞的IC50减少至0.1μM并将依托泊苷对HeLa细胞的IC50减少至0.04μM。因此，用100μM化合物Ia处理导致对阿霉素细胞毒性效应5倍的敏化(PC-3细胞)和对依托泊苷的细胞毒性效应30倍的敏化(HeLa细胞)。
实施例9.化合物Ia(Varubin)作为人类肿瘤细胞异种移植物的小鼠模 型中化疗增敏剂的抗肿瘤活性。
为了确定Varubin是否具有体内抗肿瘤活性，分析了其在具有由PC-3细胞形成的肿瘤的小鼠中的效果。实验肿瘤通过肌肉接种PC-3.Sluc细胞形成[48]。PC-3.Sluc细胞是PC-3前列腺细胞，其中它们已经通过转染在哺乳动物细胞q中表达萤火虫(北美萤火虫)荧光素酶基因的质粒pRC/CMV-luc被整合。用荧光素酶底物D-荧光素孵育PC-3.1uc细胞产生能够以绝对的方式(光子数)定量的光，所述定量或者通过照度计或者通过用CCD(电荷耦合器件)照相机检测。后一方法还可以实时表现被接种的动物中肿瘤细胞位置的图像以及肿瘤尺寸，因为在荧光素的存在下所发射的光的强度(光子数)与PC-3.1uc细胞的数量直接成比例。
为了这些研究，使用了24只6周龄的雄性Balb/c nu/nu小鼠(Charles River Laboratories)。这些动物一直被饲养在无病原体的环境中，接收后在试验处理前已经在动物饲养实验室中饲养了1周。在通过腹膜内(i.p.)注射6mg/Kg氟哌利多(Roche，Basel，Switzerland)和12mg/Kg咪达唑仑(Rovi S.A，Madrid，Spain)的等份混合物被麻醉之后，在每只动物的右腿和左腿都进行悬浮于100μL无胎牛血清的培养基中的1×106PC-3.Sluc细胞的肌肉(i.m.)注射。接种点中肿瘤的发展进行2周，此后进行发射光子的第一测定，并用配备有C4742-98-LWG-MOD型CCD照相机(在-80℃冷却)的ORCA-2BT成像系统仪器(Hammamatsu Photonics)在512×512像素的分辨率下拍摄第一图像。对于肿瘤的光发射水平的体内追踪，如上所述对动物进行麻醉，之后立即进行150μl D-荧光素(Promega)的i.p.注射，剂量为100mg/Kg。四分钟以后，在上述仪器中检测光子并定量5分钟。测定结果表达为相对发光单位(RLU)。在所有的测定结果中，均扣除对应于远离肿瘤的动物区域(胸腔)的背景信号。获得第一图像之后，立即用可见光在相同位置对相同动物照相。在图像分析程序WASABI(HamamatsuPhotonics)的辅助下对光子进行定量和分析。定量信息向图像的转化以伪彩色或灰度进行，对所有动物保持相同的参数和强度范围和颜色，使得灰/黑颜色强度真实地代表定量数据，并且可在各试验之间和不同的动物之间可比。对于图示，每一肿瘤的定量数据(RLU)都相对于第0天处理的RLU进行标准化。
在两腿都有发光肿瘤的24只小鼠被分配在4个试验组中：(1)对照组，其中进行了100μL pH7.4的磷酸缓冲盐(PBS)和50μL肿瘤内(i.t.)PBS的静脉内(i.v.)注射。(2)用阿霉素(Sigma，Alcobendas，Madrid，Spain)静脉注射处理的组，在100μL PBS中5mg/Kg，每周一次。(3)用Varubin肿瘤内注射处理的组，在50μL PBS中100μM，每周两次。(4)用每周一次的阿霉素静脉注射和每周两次的Varubin联合处理的组，剂量和给药途径如上所述。从开始处理后整个56天中都分析肿瘤的光发射。结果表明除了在试验开始后14天内的减小之外，对照动物的肿瘤在整个试验中以基本不变的速度生长(图11)。RLU(并且因此肿瘤尺寸)的这种减小在所有组中都观察到了，与各组的处理方法无关，并且因此对应于这些细胞在本试验的异种移植物状态中的内在生长模式。与对照小鼠的肿瘤不同，单独用阿霉素处理的肿瘤(第2组)在试验期间几乎没有发生生长(图11)。同样地，用阿霉素静脉注射和Varubin肌肉注射两者处理的小鼠在试验期间也没有显著生长。最后，单独用Varubin肌肉注射处理的动物的肿瘤也显示出非常有限的生长(相对于用阿霉素处理的小鼠没有显著差异)，并且在任一情况下都显著小于对照小鼠的肿瘤生长。
因此，Varubin在浓度为100μM，肌肉注射的情况下在移植于nu/nu小鼠中的这种肿瘤模型中显示出抗肿瘤活性。
文献
[1]Pickart CM，Eddins MJ.Ubiquitin：structures，functions，mechanisms(泛素：结构、功能、机制).Biochim Biophys Acta 1695，55-72，2004.
[2]Pickart CM，Fushman D.Polyubiquitin chains：polymeric proteinsignals(多聚泛素链：聚合蛋白信号).Curr Opin Chem Biol 8，610-616，2004.
[3]Thrower JS，Hoffman L，Rechsteiner M，Pickart CM.Recognition ofthe polyubiquitin proteolytic signal(多聚泛素蛋白水解信号的识别).EMBO J 19：94-102，2000.
[4]Hofmann RM，Pickart CM.In vitro assembly and recognition ofLys-63 Polyubiquitin chains(Lys-63多聚泛素链的体外组装与识别).JBiol Chem 276：27936-27943，2001.
[5]Spence J，Gali RR，Dittmar G，Sherman F，Karin M，Finley D.Cellcycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitinchain(不同的多聚泛素链对核糖体的细胞循环调节的修饰).Cell102：67-76，2000.
[6]Hofmann RM，Pickart CM.Noncanonical MMS2-encodedubiquitin-conjugating enzyme functions in assembly of novelpolyubiquitin chains for DNA repair(非典型的MMS2编码的泛素缀合酶在用于DNA修复的新型多聚泛素链的组装中起作用).Cell96：645-653，1999.
[7]Hoege C，Pfander B，Moldovan GL，Pyrowolakis G，Jentsch S.RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA byubiquitin and SUMO(RAD6-依赖的DNA修复与PCNA通过泛素和SUMO的修饰相关).Nature 419：135-41，2002.
[8]Torres-Ramos CA，Prakash S，Prakash L.Requirement of RAD5 andMMS2 for postreplication repair of UV-damaged DNA in Saccharomycescerevisiae(酿酒酵母中UV损伤的DNA的复制后修复对RAD5和MMS2的需求).Mol Cell Biol 22：2419-2426，2002.
[9]Haracska L，Torres-Ramos CA，Johnson RE，Prakash S，Prakash L.Opposing effects of ubiquitin conjugation and SUMO modification ofPCNA on replicational byPass of DNA lesions in Saccharomycescerevisiae(PCNA的泛素缀合和SUMO修饰对酿酒酵母中DNA损伤的复制旁路的相反作用).Mol Cell Biol 24：4267-4274，2004.
[10]Branzei D，Seki M，Enomoto T.Rad18/Rad5/Mms2-mediatedpolyubiquitination of PCNA is implicated in replication completionduring replication stress(复制应激期间的复制完成中涉及由Rad18/Rad5/Mms2介导的PCNA的多泛素化).Genes Cells 9：1031-1042，2004.
[11]Haracska L，Unk I，Prakash L，Prakash S.Ubiquitylation of yeastproliferating cell nuclear antigen and its implications for translesion DNAsynthesis(酵母增殖细胞核抗原的泛素化及其对跨损伤DNA合成的暗示).Proc Natl Acad Sci U S A 103：6477-82，2006.
[12]Smirnova M，Klein HL.Role of the error-free damage bypasspostreplication repair pathway in the maintenance of genomic stability(无错损伤旁路复制后修复路径在维持基因组稳定性中的作用).MutatRes532：117-135，2003.
[13]Broomfield S，ChowBL，Xiao W.MMS2，encoding aubiquitin-conjugating-enzyme-like protein，is a member of the yeasterror-free postreplication repair pathway(编码泛素缀合酶样蛋白的MMS2是酵母无错复制后修复路径的成员).Proc Natl Acad Sci U S A95：5678-5683，1998.
[14]Brusky J，Zhu Y，Xiao W.UBC13，a DNA-damage-inducible gene，is a member of the error-free postreplication repair pathway inSaccharomyces cerevisiae(DNA损伤诱导基因UBC13是酿酒酵母中的无错复制后修复路径的成员).Curr Genet：168-174，2000.
[15]Xiao W，Chow BL，Broomfield S，Hanna M.The Saccharomycescerevisiae RAD6 group is composed of an error-prone and two error-freepostreplication repair pathways(酿酒酵母RAD6组由易错和两种无错复制后修复路径构成).Genetics 155：1633-1641，2000.
[16]Tsui C，Raguraj A，Pickart CM.Ubiquitin binding site of theubiquitin E2 variant(UEV1)protein Mms2 is required for DNA damagetolerance in the yeast RAD6 pathway(在酵母RAD6途径中DNA损伤耐受需要泛素E2变异体(UEV1)蛋白Mms2的泛素结合位点).J BiolChem 280：19829-19835，2005.
[17]Ulrich HD，Jentsch S.Two RING finger proteins mediatecooperation between ubiquitin-conjugating enzymes in DNA repair(两种环指蛋白介导DNA修复中的泛素缀合酶之间的协作).EMBO J19：3388-3397，2000.
[18]Chen ZJ.Ubiquitin signalling in the NF-kappaB pathway(NF-κB途径中的泛素信号传输).Nat Cell Biol 7：758-765，2005.
[19]Deng L，Wang C，Spencer E，Yang L，Braun A，You J，Slaughter C，Pickart C，Chen ZJ.Activation of the IkappaB kinase complex by TRAF6requires a dimeric ubiquitin-conjugating enzyme complex and a uniquepolyubiquitin chain(TRAF6对IκB激酶复合物的活化需要二聚泛素缀合酶复合物和独特的多聚泛素链).Cell 103：351-361，2000.
[20]Wang C，Deng L，Hong M，Akkaraju GR，Inoue J，Chen ZJ.TAK1is a ubiquitin-dependent kinase of MKK and IKK(TAK1是MKK和IKK的泛素依赖性激酶).Nature 412：346-351，2001.
[21]Ea CK，Sun L，Inoue J，Chen ZJ.GIFA activates IkappaB kinase(IKK)by promoting oligomerization and ubiquitination of TRAF6(TIFA通过促进TRAF6的寡聚化和泛素化活化IκB激酶(IKK)).Proc NatlAcad Sci U S A 101：15318-15323，2004.
[22]Kanayama A，Seth RB，Sun L，Ea CK，Hong M，Shaito A，ChiuYH，Deng L，Chen ZJ.TAB2 and TAB3 activate the NF-kappaB pathwaythrough binding to polyubiquitin chains(TAB2和TAB3通过与多聚泛素链结合活化NF-κB途径).Mol Cell 15：535-548，2004.
[23]Didier C，Broday L，Bhoumik A，Israeli S，Takahashi S，NakayamaK，Thomas SM，Turner CE，Henderson S，Sabe H，Ronai Z.RNF5，aRING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillinubiquitination and altered localization(通过靶向桩蛋白泛素化和改变的定位来调节细胞运动的环指蛋白RNF5).Mol Cell Biol 23：5331-5345，2003.
[24]Duncan LM，Piper S，Dodd RB，Saville MK，Sanderson CM，LuzioJP，Lehner PJ.Lysine-63-linked ubiquitination is required forendolysosomal degradation of class I molecules(I类分子的内吞溶酶体降解需要赖氨酸-63连接的泛素化).EMBO J 25：1635-1645，2006.
[25]Zhao H，Li CC，Pardo J，Chu PC，Liao CX，Huang J，Dong JG，Zhou X，Huang Q，Huang B，Bennett MK，Molineaux SM，Lu H，Daniel-Issakani S，Payan DG，Masuda ES.A novel E3 ubiquitin ligaseTRAC-1 positively regulates T cell activation(新的E3泛素连接酶TRAC-1正性调节T细胞活化).J Immunol 174：5288-5297，2005.
[26]VanDemark AP，Hofmann RM，Tsui C，Pickart CM，Wolberger C.Molecular insights into polyubiquitin chain assembly：crystal structure ofthe Mms2/Ubc13 heterodimer(多聚泛素链组装的分子洞察：Mms2/Ubc13异二聚体的晶体结构).Cell 105：711-720，2001.
[27]Moraes TF，Edwards RA，McKenna S，Pastushok L，Xiao W，Glover JN，Ellison MJ.Crystal structure of the human ubiquitinconjugation enzyme complex，hMms2-hUbc13(人泛素缀合酶复合物hMms2-hUbc13的晶体结构).Nat Struct Biol 8：669-673，2001.
[28]Pastushok L，Moraes TF，Ellison MJ，Xiao W.A single Mms2“key”residue insertion into a Ubc13 pocket determines the interfacespecificity of a human Lys63 ubiquitin conjugation complex(插入Ubc13袋中的单Mms2“钥匙”残基插入物决定人Lys63泛素缀合复合物的界面特异性).J Biol Chem 280：17891-17900，2005.
[29]Takeuchi T，Yokosawa H.ISG15 modification of Ubc13suppresses its ubiquitin-conjugating activity(Ubc13的ISG15修饰抑制其泛素缀合活性).Biochem Biophys Res Commun 336：9-13，2005.
[30]Zou W，Papov V，Malakhova O，Kim KI，Dao C，Li J，Zhang DE.ISG15 modification of ubiquitin E2 Ubc13 disrupts its ability to formthioester with ubiquitin(泛素E2Ubc13的ISG15修饰破坏其与泛素形成硫酯的能力).Biochem Biophys Res Commun 336：61-68，2005.
[31]Richardson PG，Mitsiades C，Hideshima T，Anderson KC.Bortezomib：proteasome inhibition as an effective anticancer therapy(硼替佐米：作为有效抗癌疗法的蛋白酶体抑制).Annu Rev Med 57：33-47，2006.
[32]Gaczynska M，Osmulski PA.Small-molecule inhibitors ofproteasome activity(蛋白酶体活性的小分子抑制剂).Methods Mol Biol301：3-22，2005.
[33]Tsukamoto S，Yokosawa H.Natural products inhibiting theubiquitin-protesome proteolytic pathway，a target for drug development(抑制药物开发靶泛素-蛋白酶体蛋白水解途径的天然产物).Curr MedChem13：745-754，2006.
[34]Tsukamoto S，Hirota H，Imachi M，Fujimuro M，Onuki H，Ohta T，Yokosawa H.Himeic acid A：a new ubiquitin-activating enzyme inhibitorisolated from a marine-derived fungus，Aspergillus sp(腐植酸A：从源自海洋的真菌曲霉菌(Aspergillus sp)分离的新泛素-激活酶抑制剂).Bioorg Med Chem Lett 15：191-194，2005.
[35]Masip I，Cortes N，Abad MJ，Guardiola M，Perez-Paya E，FerragutJ，Ferrer-Montiel A，Messeguer A.Design and synthesis of an optimizedpositional scanning library of peptoids：identification of novel multidrugresistance reversal agents(拟肽的优化位置扫描库的设计与合成：新多药耐药性逆转剂的识别).Bioorg Med Chem 13：1923-1929，2005.
[36]Humet M，Carbonell T，Masip I，Sanchez-Baeza F，Mora P，Canton E，Gobernado M，Abad C，Perez-Paya E，Messeguer A.Apositional scanning combinatorial library of peptoids as a source ofbiological active molecules：identification of antimicrobials(作为生物活性分子来源的拟肽的位置扫描组合库：抗菌剂的识别).J Comb Chem5：597-605，2003.
[37]Plans V，Scheper J，Soler M，Loukili N，Okano Y，Thomson TM.The RING finger protein RNF8 recruits UBC13 for lysine 63-based selfpolyubiquitylation(环指蛋白RNF8吸收UBC13用于基于赖氨酸63的自体多泛素化).J Cell Biochem 97：572-582，2006.
[38]Case DA，Darden TA，Cheatham TE，III，Simmerling CL，Wang J，Duke RE，Luo R，Merz KM，WangB，Pearlman DA，Crowley B，BrozellS，Tsui V，Gohlke H，Mongan J，Hornak V，Cui G，Beroza P，Schafmeister C，Caldwell JW，Ross WS，Kollman PA.AMBER 8，University of California，San Francisco，2004.
[39]Corina Molecular Networks，GmbH Computerchemie(Corina分子网，GmbH计算机化学)Langemarckplatz 1，Erlangen，Germany，2000.
[40]Besler BH，K.M.Merz KH，Kollman PA.Atomic charges derivedfrom semiempirical methods(源自半经验方法的原子电荷)J CompChem 11：431-439，1990.
[41]Deward MJS，Thiel W.Ground states of molecules.38.TheMNDO method.Approximations and parameters(分子的基态。38.MNDO方法：近似值与参数).J Am Chem Soc 99：4899-4907，1977.
[42]Stewart JJ.MOPAC：a semiempirical molecular orbital program(MOPAC：半经验分子轨道程序).J Comput Aided-Mol Des 4：1-105，1990.
[43]Pérez C，Ortiz AR.Evaluation of docking functions forprotein-ligand docking(对蛋白-配体对接的对接功能的评价).J MedChem 44：3768-3785，2001.
[44]Huang TT，Wuerzberger-Davis SM，WuZH，Miyamoto S.Sequential modification of NEMO/IKKgamma by SUMO-1 and ubiquitinmediates NF-kappaB activation by genotoxic stress(SUMO-1和泛素对NEMO/IKKγ的连续修饰通过基因毒性应激介导NF-κB活化).Cell115：565-576，2003.
[45]Zerbini LF，Wang Y，Czibere A，Correa RG，Cho JY，Ijiri K，WeiW，Joseph M，Gu X，Grall F，Goldring MB，Zhou JR，Libermann TA.NF-kappaB-mediated repression of growth arrest- andDNA-damage-inducible proteins 45alpha and gamma is essential forcancer cell survival(NF-κB介导的对生长停滞与DNA损伤诱导蛋白45α和γ的抑制对癌细胞存活至关重要).Proc Natl Acad Sci U S A101：13618-13623，2004.
[46]Salvatore C，Camarda G，Maggi CA，Goso C，Manzini S，BinaschiM.NF-kappaB activation contributes to anthracycline resistance pathwayin human ovarian carcinoma cell line A2780(NF-κB活化在人卵巢癌细胞系A2780中促进蒽环霉素耐药途径).Int J Oncol 27：799-806，2005.
[47]Janssens S，Tinel A，Lippens S，Tschopp J.PIDD mediatesNF-kappaB activation in response to DNA damage(PIDD介导应答DNA损伤的NF-κB活化).Cell 123：1079-1092，2005.
[48]Wu ZH，Shi Y，Tibbetts RS，Miyamoto S.Molecular linkagebetween the kinase ATM and NF-kappaB signal in ginresponse togenotoxic stimuli(应答基因毒性刺激的激酶ATM与NF-κB信号传导之间的分子键合).Science 311：1141-1146，2006.
[49]Rubio N，Villacampa MM，El Hilali N，Blanco J.Metastaticburden in nude mice organs measured using prostate tumor PC-3 cellsexpressing the luciferase gene as a quantifiable tumor cell marker(使用表达荧光素酶基因的前列腺肿瘤PC-3细胞作为可以计量的肿瘤细胞标记而测定的裸鼠器官中的转移性负荷).Prostate 44：133-1343，2000.

Claims (30)

1.通式(I)化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体：
R-(CR1R2)q-CO-N(R3)-C(R4R5)-CO-NH2
其中：
-R是基团
Figure A200780031330C00021
其中：
-R6是选自如下的基团：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂环基和取代或未取代的杂环基烷基；
-A是选自取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂环基的基团；
-R7和R8独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基，
-o是选自0、1、2、3和4的数字，
-n是选自0和1的数字，
-线条——表示所述基团R与所述通式(I)的分子其余部分的结合点；
-R1和R2独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基；
-R3是选自如下的基团：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基；
-R4和R5独立地选自H、甲基、乙基、丙基和异丙基；
-q是选自0和1的数字。
2.如权利要求1所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于R6是选自H、取代或未取代的芳基烷基和取代或未取代的杂环基烷基的基团，并且在于R3是选自H、取代或未取代的芳基烷基和取代或未取代的杂环基烷基的基团。
3.如权利要求2所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于R6是选自如下的基团：取代或未取代的苯丙基、取代或未取代的苯乙基、取代或未取代的苄基、取代或未取代的呋喃丙基、取代或未取代的呋喃乙基、取代或未取代的呋喃甲基、取代或未取代的咪唑丙基、取代或未取代的咪唑乙基、取代或未取代的咪唑甲基、取代或未取代的吡啶丙基、取代或未取代的吡啶乙基、取代或未取代的吡啶甲基、取代或未取代的哌啶丙基、取代或未取代的哌啶乙基、取代或未取代的哌啶甲基；并且在于R3是选自如下的基团：取代或未取代的苯丙基、取代或未取代的苯乙基、取代或未取代的苄基、取代或未取代的呋喃丙基、取代或未取代的呋喃乙基、取代或未取代的呋喃甲基、取代或未取代的咪唑丙基、取代或未取代的咪唑乙基、取代或未取代的咪唑甲基、取代或未取代的吡啶丙基、取代或未取代的吡啶乙基、取代或未取代的吡啶甲基、取代或未取代的哌啶丙基、取代或未取代的哌啶乙基、取代或未取代的哌啶甲基。
4.如权利要求3所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于R6是被一个或多个选自如下的基团取代的基团：氟、氯、溴、三氟甲基、羟基、烷氧基、烷基羰基、烷基氨基和磺酰氨基、氰基、硝基、亚硝酸基、硝酸基、硫代硝酸基和甲酰氨基。
5.如权利要求3所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于R3是被一个或多个选自如下的基团取代的基团：氟、氯、溴、三氟甲基、羟基、烷氧基、烷基羰基、烷基氨基和磺酰氨基、氰基、硝基、亚硝酸基、硝酸基、硫代硝酸基、甲酰氨基。
6.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于R6是对氟苯乙基或2，4-二氯苯乙基基团。
7.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于A是被氯、氟和/或溴取代的苯基，并且o是选自1、2和3的数字。
8.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于R7和R8都是H，o是2，A是对氟苯基。
9.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于R3是2-嘧啶乙基、2，4-二氯苯乙基或4-甲氧基苯乙基。
10.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于n为1。
11.如权利要求1至9中任一权利要求所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于n为0。
12.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于q为0。
13.如权利要求1至11中任一权利要求所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于q为1。
14.如权利要求1所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于所述化合物具有式Ia(N-氨基甲酰基甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙基)-1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-3，7-二氧代-[1，4]二氮杂环庚烷-5-甲酰胺)：
Figure A200780031330C00051
15.如权利要求1所述的化合物及其盐、溶剂化物、前药或立体异构体，其特征在于所述化合物具有式Ib(1，4-双[2’-(4”-氟苯基)乙基]-2-[N-氨基羰甲基-N-(2’-(2”吡啶基)乙基)-羰甲基]哌嗪-3，6-二酮)：
Figure A200780031330C00052
16.如权利要求1所述的化合物，其特征在于它具有下列式之一：
Figure A200780031330C00061
17.如权利要求1至16中任一权利要求所述的化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体用于医药用途。
18.权利要求1至16中任一权利要求所述的化合物或其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体在生产用于治疗和/或预防与涉及UBC13酶的代谢途径相关的病理学或疾病的药品中的用途。
19.如权利要求18所述的用途，其中与涉及UBC13酶的代谢途径相关的所述病理学或疾病是炎症性和自体免疫疾病。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述炎症性和自体免疫疾病是：炎症性肠病、炎症性关节病理学、特应性皮炎和其它炎症性皮肤病病理学、神经炎、脑炎、脑脊髓炎和感染中枢或周围神经系统的炎症性病理学、肌炎、血管炎、系统性红斑狼疮、表现出炎症的传染性疾病、宿主抗移植物排斥反应、结膜炎和炎症性眼病、耳炎或粘膜炎。
21.如权利要求18所述的用途，其中与涉及UBC13酶的代谢途径相关的所述病理学或疾病是癌症或瘤形成。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述癌症或瘤形成是前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、食管癌、喉癌、甲状腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、子宫癌和子宫颈癌；骨肉瘤、软组织肉瘤和血管肉瘤；包括白血病和淋巴瘤在内的造血系统肿瘤，成神经细胞瘤、胶质母细胞瘤和星形细胞瘤，黑色素瘤、基底细胞皮肤癌或鳞状细胞皮肤癌。
23.权利要求1至16中每一权利要求所述的化合物或其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体在生产用于治疗和/或预防与涉及转录因子NF-κB的代谢途径相关的病理学或疾病的药品中的用途。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述病理学或疾病是炎症或肿瘤过程。
25.权利要求1至16中任一权利要求所述的化合物或其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体在生产用于抗肿瘤治疗的药品中的用途，其中所述药品是引起化学或辐射敏化效果的PCNA和RAD6介导的基因毒性损伤耐受途径的拮抗剂，或抑制所述引起化学
或辐射敏化效果的PCNA和RAD6介导的基因毒性损伤耐受途径。
26.权利要求1至16中任一权利要求所述的化合物在生产用于增加哺乳动物对于抗肿瘤剂治疗的敏感性的药品中的用途。
27.如权利要求26所述的用途，其中抗肿瘤剂是阿霉素或依托泊苷。
28.药物组合物，其特征在于其包含治疗有效量的权利要求1至16所述的化合物或其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体以及药物可接受的载体、佐剂或赋形剂。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其特征在于其还包含至少一种治疗有效量的第二治疗剂。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其特征在于所述第二治疗剂是权利要求1至16所述的化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104136419A (zh) * 2011-10-27 2014-11-05 麻省理工学院 能够形成药物封装微球的在n末端上官能化的氨基酸衍生物
US9315472B2 (en) 2013-05-01 2016-04-19 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
US9439968B2 (en) 2012-08-13 2016-09-13 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
US9556110B2 (en) 2008-11-07 2017-01-31 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
US9840479B2 (en) 2014-07-02 2017-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
US10022455B2 (en) 2014-05-30 2018-07-17 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
US10117934B2 (en) 2011-03-28 2018-11-06 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
US10138213B2 (en) 2014-06-24 2018-11-27 Translate Bio, Inc. Stereochemically enriched compositions for delivery of nucleic acids
US10201618B2 (en) 2015-06-19 2019-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Alkenyl substituted 2,5-piperazinediones, compositions, and uses thereof

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9006487B2 (en) 2005-06-15 2015-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
ES2727711T3 (es) * 2009-07-30 2019-10-18 Spiral Therapeutics Inc Compuestos inhibidores de Apaf-1
DK3338765T3 (en) 2009-12-01 2019-03-04 Translate Bio Inc STEROID DERIVATIVE FOR THE SUPPLY OF MRNA IN HUMANGENETIC DISEASES
WO2012027675A2 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
JP2014511839A (ja) * 2011-03-23 2014-05-19 インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレイション 抗癌治療薬
PL2717893T3 (pl) 2011-06-08 2019-12-31 Translate Bio, Inc. Kompozycje nanocząstek lipidowych i sposoby do dostarczania mRNA
US20130236504A1 (en) * 2012-03-06 2013-09-12 Medical University Of South Carolina Delivery System for Enhancing Drug Efficacy
WO2013185067A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
BR112015022660A2 (pt) 2013-03-14 2017-10-31 Shire Human Genetic Therapies métodos para a purificação de rna mensageiro
ES2689523T3 (es) 2013-03-14 2018-11-14 Translate Bio, Inc. Composiciones a base de ARNM del gen CFTR y métodos y usos relacionados
EA201992208A1 (ru) 2013-10-22 2020-07-31 Транслейт Био, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
EP3501605B1 (en) 2013-10-22 2023-06-28 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
CN105813656B (zh) 2013-10-22 2021-01-15 夏尔人类遗传性治疗公司 用于递送信使rna的脂质制剂
JP6295767B2 (ja) 2014-03-25 2018-03-20 富士通株式会社 スイッチ装置、情報処理システムおよびスイッチ装置の制御方法
CN110511927A (zh) 2014-04-25 2019-11-29 川斯勒佰尔公司 信使rna的纯化方法
EA201991747A1 (ru) 2017-02-27 2020-06-04 Транслейт Био, Инк. НОВАЯ КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННАЯ мРНК CFTR
US11173190B2 (en) 2017-05-16 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mRNA encoding CFTR
AU2019325702A1 (en) 2018-08-24 2021-02-25 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
US20220267753A1 (en) * 2019-06-14 2022-08-25 Children's Hospital Medical Center Rational therapeutic targeting of oncogenic immune signaling states in myeloid malignancies via the ubiquitin conjugating enzyme ube2n
KR20220017075A (ko) 2020-08-04 2022-02-11 삼성전자주식회사 홈 화면을 복원하는 방법 및 이를 적용한 전자 장치
WO2023225277A1 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Ohio State Innovation Foundation Peptidyl flavor modifiers

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4234295A1 (de) * 1992-10-12 1994-04-14 Thomae Gmbh Dr K Carbonsäurederivate, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
JP2001511814A (ja) * 1997-02-15 2001-08-14 プロスクリプト・インコーポレイテッド ＮＦ−κＢの阻害を介する梗塞の治療
CA2419132A1 (en) * 2000-08-08 2002-02-14 Antonella Favit Prevention of beta-amyloid neurotoxicity by blockade of the ubiquitin-proteasome proteolytic pathway
ES2169690B1 (es) * 2000-10-06 2004-03-16 Diverdrugs Sl Trimeros de n-alquilglicina capaces de proteger a neuronas contra agresiones excitotoxicas, y composiciones que los contienen.
TW200538149A (en) 2004-05-20 2005-12-01 Telik Inc Sensitization to another anticancer therapy and/or amelioration of a side effect of another anticancer therapy by treatment with a GST-activated anticancer compound
ES2296484B1 (es) * 2005-11-23 2009-04-01 Fundacion De La Comunidad Valenciana Centro De Investigacion Principe Felipe (90%) Composicion farmaceutica para inhibir la apoptosis.

Cited By (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11414393B2 (en) 2008-11-07 2022-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
US10189802B2 (en) 2008-11-07 2019-01-29 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
US10844028B2 (en) 2008-11-07 2020-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
US9556110B2 (en) 2008-11-07 2017-01-31 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
US10933139B2 (en) 2011-03-28 2021-03-02 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
US10117934B2 (en) 2011-03-28 2018-11-06 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
US9512073B2 (en) 2011-10-27 2016-12-06 Massachusetts Institute Of Technology Amino acid-, peptide-and polypeptide-lipids, isomers, compositions, and uses thereof
CN113149869A (zh) * 2011-10-27 2021-07-23 麻省理工学院 能够形成药物包封微球的在n末端上官能化的氨基酸衍生物
US10086013B2 (en) 2011-10-27 2018-10-02 Massachusetts Institute Of Technology Amino acid-, peptide- and polypeptide-lipids, isomers, compositions, and uses thereof
CN104136419B (zh) * 2011-10-27 2017-11-03 麻省理工学院 能够形成药物封装微球的在n末端上官能化的氨基酸衍生物
US10682374B2 (en) 2011-10-27 2020-06-16 Massachusetts Intstitute Of Technology Amino acid-, peptide- and polypeptide-lipids, isomers, compositions, and uses thereof
CN104136419A (zh) * 2011-10-27 2014-11-05 麻省理工学院 能够形成药物封装微球的在n末端上官能化的氨基酸衍生物
US11458158B2 (en) 2011-10-27 2022-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Amino acid-, peptide- and polypeptide-lipids, isomers, compositions, and uses thereof
US9439968B2 (en) 2012-08-13 2016-09-13 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
US9315472B2 (en) 2013-05-01 2016-04-19 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
US10293057B2 (en) 2014-05-30 2019-05-21 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
US10493166B2 (en) 2014-05-30 2019-12-03 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
US10286082B2 (en) 2014-05-30 2019-05-14 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
US11433144B2 (en) 2014-05-30 2022-09-06 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
US10912844B2 (en) 2014-05-30 2021-02-09 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
US10022455B2 (en) 2014-05-30 2018-07-17 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
US10286083B2 (en) 2014-05-30 2019-05-14 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
US10138213B2 (en) 2014-06-24 2018-11-27 Translate Bio, Inc. Stereochemically enriched compositions for delivery of nucleic acids
US11104652B2 (en) 2014-06-24 2021-08-31 Translate Bio, Inc. Stereochemically enriched compositions for delivery of nucleic acids
US9840479B2 (en) 2014-07-02 2017-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
US10201618B2 (en) 2015-06-19 2019-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Alkenyl substituted 2,5-piperazinediones, compositions, and uses thereof
US10695444B2 (en) 2015-06-19 2020-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Alkenyl substituted 2,5-piperazinediones, compositions, and uses thereof

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