WO2007142243A1

WO2007142243A1 - 変異体及びこれをコードする遺伝子

Info

Publication number: WO2007142243A1
Application number: PCT/JP2007/061391
Authority: WO
Inventors: Yoshinori Nakagawa; Masayasu Takada; Koichi Ogawa; Yuji Hatada; Hiroki Horikoshi
Original assignee: Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd.; Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2007-06-05
Publication date: 2007-12-13
Also published as: JP4989922B2; EP2031066A1; CA2654564A1; EP2031066A4; JP2007325552A

Abstract

親γ-CGTaseのアミノ酸残基の少なくとも１つを、親γ-CGTaseの該当するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換した変異体であって、親γ-CGTaseと比較して、改良されたγ-シクロデキストリン合成に関する比活性を有するCGTase変異体。この変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子。この遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換された又は染色体相同組換えされた形質転換体を培養し、前記形質転換体が生成するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ変異体を回収することを含む、上記CGTase変異体の製造方法。γ-シクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(γ-CGTase)に変異を加えることにより、親γ-CGTaseと比較し、より高い比活性を有し、目的とするCD組成物を得るための必要酵素量を低減し得る改良されたCGTase変異体を提供する。上記CGTase変異体の遺伝子及びこれを用いたCGTase変異体の製造方法を提供する。

Description

明細書

変異体及びこれをコードする遺伝子

関連出願の相互参照

[0001] 本出願は、 2006年 6月 8日出願の日本特願 2006— 160175号の優先権を主張し、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される。

技術分野

[0002] 本発明は、改良された高い比活性を有するシクロデキストリン'グルカノトランスフエラーゼの変異体、及びこの変異体をコードする遺伝子、並びにこの遺伝子を用いた変異体の製造方法に関する。

背景技術

[0003] シクロデキストリン 'グルカノトランスフェラーゼ (CGTase ;EC 2. 4. 1. 19)は澱粉等の α - 1,4-グルカンに作用し、その分子内転移反応により α -1,4ダルコビラノシド結合で結合した環状マルトオリゴ糖であるシクロデキストリン (CD)を生成させる酵素である。 C GTaseにより澱粉等から生成される CDは主としてブドウ糖 6〜8個で構成される a -CD 、 j8 - CD、 γ -CDである。これらの CDは多くの分子 (ゲストィ匕合物)と包接物を形成する能力を有し、ゲストィ匕合物の化学的 ·物理的 ·生理的諸性質を変化させることから、食品、医薬、農薬、化粧品、日用雑貨、化成品分野等において非常に有用である。

[0004] CGTaseは、澱粉等から生成される CDの主成分の違いによって、 a - CDを優先的に生成する (X -CGTase, β -CDを優先的に生成する j8 -CGTase, a -CD及び j8 - C Dを優先的に生成する α Ι -CGTase及び γ -CDを優先的に生成する γ -CGTaseと分類される。過去に報告された多くの CGTaseは α -CGTase, β -CGTase及び a l -CGTaseであり、 γ -CGTaseの報告例は数少ない。又、 γ -CGTaseとして報告されている酵素においても、反応後期に j8 -CDの生成速度が加速され、 γ - CDと同量若しくはそれ以上の j8 -CDが生成する酵素もあり、 10 %以上の高濃度の基質では γ -C Dの生成量が著しく低下するため、 γ -CD生成反応中にエタノールや各種有機溶媒を共存させて γ -CDの生成量を増力！]させる必要があった。本方法は溶媒除去等の煩雑な工程を必要とするため、 γ -CD及び γ -CDを含有する組成物の安全で安価な工業生産には不向きであった。

[0005] これらの問題を解決するため、 CGTaseの構造遺伝子を改変し、 y _CDの生成量を改善する試みも行われている（例えば、 Akira Nakamura, Keiko Haga, and Kunio Ya mane, Biochemstry, 32, 6624—6631, 1993、 Michio Kubota, Yoshiki Matsuura, Shuzo Sakai and Yukiteru Kutsume, Oyo Toshitsu Kagaku, 41 (2), 245—253, 1994、日本特表 2003-531564号公報、日本特表平 11-503906号公報、日本特開平 10-33187号公報参照、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される)。しかし、これも CD合成に関する比活性の低下や、 γ -CD生成量が増加しても元来の活性で生ずる β -C D生成量が顕著に減少せず、工業的観点力も考えると充分とはいえな力つた。それ故、 a -CD及び |8 -CDに関しては、各分野に利用されている力 γ - CDに関しては、ほとんど利用されてヽな、のが現状である。

[0006] CD含有組成物についても同様であり、 α -あるいは j8 -CDを主成分とする CD含有組成物は各分野に利用されているが γ -CDを主成分とする CD含有組成物の利用例は少ない。 CD含有組成物においては、それを調製する際に用いる CGTaseがひ-、 β -あるいは γ -CGTaseであるかによってその CD組成が一律に決定されるため、所望の CD組成を有する CD含有組成物の調製は困難であった。

[0007] この様な状況に鑑み、バチルスクラ一キー (Bacillus £klMi)7364株が、 γ -CDを主生産物とする新規 γ -CGTaseを生産する事が発見され、また、本酵素をコードする遺伝子配列及びアミノ酸配列の決定及び本酵素を利用した γ -CD及び所望の CD組成を有する CD含有組成物製造方法の確立がなされ、特許出願されている（例えば、日本特開 2003-102489号公報、日本特開 2001-327299号公報、日本特開 2001-327284 号公報参照、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される)。

[0008] し力しながら、これまでに報告されて、る γ -CGTaseは比活性が比較的低、。そのため、 y -CD及び所望の CD組成を有する CD含有組成物を工業的スケールで生産する場合、 γ -CGTaseを大量に必要とする為、酵素生産のために微生物の大量培養を必要とする。そればかりでなぐ目的とする組成物を得るために酵素を大量に必要とすることから、 CD生成反応後の糖ィ匕液の精製工程における負荷増大と、う経済的に大きな問題があった。 [0009] そこで、本発明は、 y -CGTaseに変異を加えることにより、親 γ -CGTaseと比較し、より高い比活性を有し、目的とする CD組成物を得るための必要酵素量を低減し得る改良された CGTase変異体を提供することを目的とする。

[0010] さらに本発明は、上記 CGTase変異体の遺伝子及びこれを用いた CGTase変異体の製造方法を提供することを目的とする。

[0011] 発明の開示

本発明者等は、上記課題を解決するために、親 γ -CGTaseに比べて改良された比活性を有する CGTase変異体の探索を行なった。その結果、ある種の γ -CGTaseにおいて、当該アミノ酸配列中の特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した CGTase変異体力親 γ -CGTaseに比べてより高い比活性を有することを見出し、本発明を完成させた。

[0012] 本発明は、親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼのアミノ酸残基の少なくとも 1つを、親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼの該当するァミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換した変異体であって、親 γ -シクロデキストリン' ダルカノトランスフェラーゼと比較して、改良された γ -シクロデキストリン合成に関する比活性を有するシクロデキストリン'グルカノトランスフェラーゼ変異体に関する。

[0013] 上記本発明の変異体において、以下の態様が好ましい。

1)前記親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼカ配列表の配列番号 1 で示されるアミノ酸配列を有し、かつ配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列内の 75位、 82位、 91位、 92位、 119位、 134位、 147位、 151位、 223位、 225位、 234位、 32 0位、 347位、 359位、 360位、 361位、 451位、 625位、 656位、及び 662位の少なくとも 1 つのアミノ酸残基が、配列番号 1で示されるアミノ酸配列中の該当位置に示されたァミノ酸残基と異なるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する、

2)前記異なるアミノ酸残基は、

75位が、 Ala Cys Gin Glu His lie Leu Lys Met, Phe Ser Thr Tyr、又は Val であり、

82位が、 Aspであり、

91位が、 Leuであり、 92位が、 Thrであり、

119位力 Valであり、

134位が、 Ala、 Pro, Ser、又は Thrであり、

147位が、 Thrであり、

151位が、 Aspであり、

223位が、 Arg、 His, Lys、又は Valであり、

225位が、 Leuであり、

234位が、 Asnであり、

320位が、 Gluであり、

347位が、 Asn、 Asp、 Cysゝ Gluゝ Hisゝ lieゝ Leuゝ Ser、 Thr、 Tyr、又は Valであり、 359位が、 Ginであり、

360位が、 Argであり、

361位が、 Alaゝ Asn、 Cysゝ Ginゝ Glyゝ Glu、 Hisゝ Heゝ Leu、 Lys、 Metゝ Pheゝ Pro, Ser、 T hr、 Trp、 Tyr、又は Valであり、

451位が、 Valであり、

625位が、 Cysであり、

656位が、 Tyrであり、

662位が、 Leuである、

3)配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列力 75位、 82位、 91位、 92位、 119位、 134位、 147位、 151位、 223位、 225位、 234位、 320位、 347位、 359位、 360位、 361位、 451位、 625位、 656位、及び 662位以外のアミノ酸残基において、 1〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものである、

4)前記親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼカ配列表の配列番号 1 で示されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列中の、配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列内の 75位、 82位、 91位、 92位、 119位、 134位

、 147位、 151位、 223位、 225位、 234位、 320位、 347位、 359位、 360位、 361位、 451位、 625位、 656位、及び 662位に相当するアミノ酸残基の少なくとも 1つのアミノ酸残基 1S 前記親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列中の該当位置に示されたアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する

5)前記変異体は、 ρΗ6〜： L 1のいずれかの ρΗにおいて測定した比活性力親 γ -シクロデキストリン.ダルカノトランスフェラーゼの比活性の 1. 1倍以上である、

6)前記変異体は、 ρΗ7. 5又は ρΗΙΟにおいて測定した比活性力親 γ -シクロデキストリン'ダルカノトランスフェラーゼの比活性の 1. 1倍以上である、

[0014] 本発明はさらに、上記本発明の変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子、この本発明の遺伝子を含有する組換えベクター、この本発明の組換えベクターで形質転換された又は染色体相同組換えされた形質転換体に関する。

[0015] 加えて本発明は、上記本発明の形質転換体を培養し、前記形質転換体が生成するシクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼ変異体を回収することを含む、本発明の変異体の製造方法に関する。

[0016] 本発明によれば、親 γ -CGTaseに比べてより高い比活性を有する改良された CGTa se変異体を提供することができる。さらに、この変異体を用いることで、 CDを含有する組成物の製造の際に、生成される CD量の増大あるいは酵素使用量の低減が可能になり、この変異体は、 γ -CD生成用酵素として産業上非常に有用である。

[0017] 発明を実施するための最良の形態

本発明は、親 γ -CGTaseのアミノ酸残基の少なくとも 1つを、親 γ -CGTaseの該当するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換した CGTase変異体であって、親 γ - CGTaseと比較して、改良された γ _CD合成に関する比活性を有する。

[0018] 本発明において、親 γ -CGTaseとは、澱粉又は澱粉由来の基質に作用させた時、生成する CDのうち、約 50〜100重量％の γ -CDを生成する能力を有する活性を有する CGTaseである。そのような親 γ -CGTaseとしては、配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する γ -CGTase,又はこの γ -CGTaseとは異なる種類の γ - CGTas eを挙げることができ、野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。

[0019] 澱粉又は澱粉由来の基質とは、澱粉としては馬鈴薯、コーン、甘藷、小麦、米、タピ才力、サゴ等力得られる澱粉が挙げられ、これらはもち種、うるち種、高アミロース種のいずれでもよぐまた、澱粉由来の基質としては、アミロース、アミロぺクチン、可溶性澱粉、デキストリン、粉ァメ、マルトオリゴ糖等が挙げられ、 γ -CGTaseをこれらに作用させた時に γ -CDを生成する特性を有する限り、いずれのものでもよい。

[0020] 本発明の変異体の 1つの態様は、親 γ -CGTaseが、配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する CGTase変異体である。この変異体においては、配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列内の 75位、 82位、 91位、 92位、 119位、 134位、 147位、 151位、 223位、 225位、 234位、 320位、 347位、 359位、 360位、 361位、 451位、 625位、 656位、及び 662位の少なくとも 1つのアミノ酸残基力該当位置に示されたアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基に置換され、かつ親 γ -CGTaseである配列表の配列番号 1 で示されるアミノ酸配列を有する γ -CGTaseと比べてより高い比活性を有する改良された CGTase変異体である。

[0021] 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する γ -CGTaseとしては、例えばバチルスクラ一キー 7364株 (FERM BP-7156)由来の γ -CGTaseを挙げることができる。

[0022] 命名法

本明細書及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基についての慣用的な 1文字及び 3文字コードを用いる。引用を容易にするため、本発明の CGTase変異体は以下の命名法を用ヽて記述する。

もとのアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸

この命名法によれば、例えば、位置 75でのトリプトファンのロイシンへの置換は、 Trp75Leu又は W75L

と示す。

[0023] 複数の変異は Zの印で分離され、例えば位置 75及び 82で、トリブトファン及びァスノラギンを各々ロイシン及びァスパラギン酸へ置換する場合は、

Trp75Leu/Asn82Asp又は W75L/N82D

と示す。

[0024] 配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる親 γ -CGTaseの上記のそれぞれの位置におけるアミノ酸残基は 75位： Trp、 82位: Asn、 91位： Phe、 92位： Ser、 119位： Ile、 134 位: Val、 147位: Ala、 151位: Asn、 223位: Ala、 225位： Met、 234位： lieゝ 320位: Asp、 3 47位： Ala、 359位： Lys、 360位： Gly、 361位： Asp、 451位： Asp、 625位： Tyr、 656位： His 、 662位： Serである。

[0025] 本発明の CGTase変異体は、上記位置のアミノ酸残基力配列番号 1で示されるアミノ酸配列中の上記該当位置に示されたアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基に置換されたものである。アミノ酸残基は、全部で、 Ala、 Asn、 Asp、 Arg、 Cys、 Gln、 Glu、 Gly、 His 、 Ile、 Leu、 Lys、 Met, Phe、 Pro, Ser、 Thr、 Trp、 Tyr及び Valの 20種類であり、例えば、配列番号 1で示されるアミノ酸配列中の 75位については、野生型の酵素のアミノ酸残基は Trpである力変異体においては、上記 Trp以外の 19種類から選択することができる。 75位以外のアミノ酸残基についても同様である。但し、変異体力親 γ -CGT aseの比活性に比べて、高、比活性を有するアミノ酸残基に置換する。

[0026] 各アミノ酸残基における置換後の好ましいアミノ酸残基 (該当位置に示されたァミノ酸残基と異なるアミノ酸残基配列)は、以下のとおりである。実施例に具体的に示すように、以下のアミノ酸置換を有する変異体は、親 γ -CGTaseの比活性に比べて、少なくとも 10%(1.1倍)以上高い、比活性を有する。

[0027] 75位については Ala、 Cys、 Gln、 Glu、 His, Ile、 Leu、 Lys、 Met, Phe、 Ser、 Thr、 Tyr又は Valであるのが好ましい。

82位につ!ヽては Aspであるのが好まし!/、。

91位につ!ヽては Leuであるのが好まし!/、。

92位につ!ヽては Thrであるのが好まし!/、。

119位につ!ヽては Valであるのが好まし!/、。

134位については Ala、 Pro, Ser又は Thrであるのが好ましい。

147位につ!ヽては Thrであるのが好まし!/、。

151位につ!ヽては Aspであるのが好まし!/、。

223位については Arg、 His, Lys又は Valであるのが好ましい。

225位につ!、ては Leuであるのが好まし!/、。

234位につ!ヽては Asnであるのが好まし!/、。 320位につ!ヽては Gluであるのが好まし!/、。

347位については Asn、 Asp、 Cys、 Glu、 His, Ile、 Leu、 Ser、 Thr、 Tyr又は Valであるのが好ましい。

359位につ!ヽては Ginであるのが好まし!/、。

360位につ!ヽては Argであるのが好まし!/、。

361位については Ala、 Asn、 Cys、 Ginゝ Gly、 Glu、 His、 Ile、 Leu、 Lys、 Met, Phe、 Pro,

Ser、 Thr、 Trp、 Tyr又は Valであるのが好ましい。

451位につ!ヽては Valであるのが好まし!/、。

625位につ!ヽては Cysであるのが好まし!/、。

656位につ!、ては Tyrであるのが好ま U、。

662位につ!、ては Leuであるのが好まし!/、。

[0028] さらに、本発明の CGTase変異体は、上記の当該位置に相当する位置のいずれかのアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したもののみならず、高ヽ比活性を有する改良された特性を有する限り、該アミノ酸配列中の他の位置において、 1〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものも包含する。その場合の比活性について比較対象となる親 γ -CGTaseは、これら欠失、置換又は付カ卩がないものとする。

[0029] 本発明の変異体の別の態様は、親 γ -CGTaseが、配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する γ -CGTaseとは異なる種類の γ -CGTaseである変異体である。配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する γ -CGTaseとは異なる種類の γ -CGTaseは、野生型又は野生型の変異体であってもよぐ澱粉又は澱粉由来の基質に作用させた時、生成する CDのうち、約 50〜100重量％が γ -CDとなる活性を有し、配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列と少なくとも約 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものが挙げられる。特に好ましくは、配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なり、バチルスサーキュランス (Bacillus ^Ι£ ^ )251株由来の j8 -CGTase等で同定されて!、る基質結合部位のサブサイト +2〜- 7の内、サブサイト- 3及び/又は- 7において、 α -又は β -CGTase,例えばバチルスマセランス (Bacillus macerans)由来の oc -CGTase (Gen ebank Accession No. AAA22298)又はバチルスサーキュランス 251株由来の j8 - CG Tase (Genebank Accession No. CAA55023)と比較して 1〜数個のアミノ酸残基の欠失又は置換があり、澱粉又は澱粉由来の基質に作用させた時、生成する CDのうち、約 50〜100重量％が γ -CDとなる活性を有する酵素である。

[0030] この変異体においては、親 γ - CGTaseのアミノ酸配列中の、配列表の配列番号 1 で示されるアミノ酸配列内の 75位、 82位、 91位、 92位、 119位、 134位、 147位、 151位、 223位、 225位、 234位、 320位、 347位、 359位、 360位、 361位、 451位、 625位、 656位、及び 662位に相当するアミノ酸残基の少なくとも 1つのアミノ酸残基力前記親 γ - C GTaseのアミノ酸配列中の該当位置に示されたアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ親 γ -CGTaseと比べてより高い比活性を有する改良された CGTase変異体である。

[0031] 相当する位置のアミノ酸残基を特定する方法及びアミノ酸配列の相同性の計算は、例えばリップマン-パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各 CGTaseのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行なうことができる。 CGTaseのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各 CG Taseにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象の CGTaseの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。

[0032] 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる親 γ - CGTaseにおける 75位、 82位、 91位、 92位、 119位、 134位、 147位、 151位、 223位、 225位、 234位、 347位、 359位、 360位、 361位、 451位、 625位、 656位、及び 662位に相当する位置のアミノ酸残基はそれぞれ Trp、 Asn、 Phe、 Ala、 I leゝ Val、 Alaゝ Asn、 Alaゝ Metゝ Val、 Thr、 Asp、 Gly、 Asp、 Ser、 Tyr、 Hisゝ Gluであるものが好ましぐ更にこれにカ卩えて 320位に相当する位置のアミノ酸残基は Asn又は Aspであるものが好ましい。

[0033] バチルスエスピー 290- 3株由来 γ - CGTase及びバチルスエスピー G- 825- 6株由来 γ - CGTaseの、配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列の 75位〜 662位に相当するアミノ酸残基を表 1に示す。バチルスエスピー 290-3株由来 CGTaseのアミノ酸配列は、 Genebank Accession No. CAA01436,バチルスエスピー G- 825- 6株由来 C GTaseのアミノ酸配列は、 Genebank Accession No. AB201304によった。

[0034] [表 1]

662位に相当するアミノ酸残基

[0035] 本発明の CGTase変異体は、上記位置のアミノ酸残基力配列表の配列番号 1で示される y -CGTaseのアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列の、上記該当位置に示されたアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基に置換されたものである。アミノ酸残基は、全部で、 Ala、 Asn、 Asp、 Arg、 Cys、 Gln、 Glu、 Gly、 His, lieゝ Le u、 Lys、 Met, Phe、 Pro, Ser、 Thr、 Trp、 Tyr及び Valの 20種類であり、例えば、配列番号 1で示されるアミノ酸配列中の 75位については、野生型の酵素のアミノ酸残基は Tr pであるが、変異体においては、上記 Trp以外の 19種類力も選択することができる。 75 位以外のアミノ酸残基についても同様である。但し、変異体力親 γ -CGTaseの比活性に比べて、高ヽ比活性を有するアミノ酸残基に置換する。

[0036] 本発明の変異体にお!、て、アミノ酸残基の置換は、親 γ -CGTaseに比べて高、比活性を有する改良された特性を有する限り、 2箇所以上が同時に置換されたものであつてもよい。

[0037] 本発明において比活性とは、 γ -CD生成活性に関する一定タンパク量当りの活性量である。タンパク量の測定は、実施例 2— 3に記載の方法で行うことができる。比活性は、 pH6〜llのいずれかの pHにおいて、好ましくは、 pH7.5又は pHIOにおいて、例えば、 20〜65°C、好ましくは 30〜60°C、より好ましくは 40〜55°Cの温度で、 5〜30分間、好ましくは 10〜15分間の条件で測定された γ -CD生成に関する CGTase活性から求まる値である。 γ -CD生成に関する CGTase活性は、反応液の pH及び温度等により変化する。代表的な γ -CD生成についての比活性の測定及び算出方法は、実施例に具体的に記載する。比活性算出のための CGTase活性測定は、より具体的には、実施例 2—4に記載の方法で行うことができる。即ち、 pH7.5又は pHIOにおいて、 40 °Cの温度で、 10分間の条件で測定する。

[0038] 本発明にお、ては、親 γ -CGTaseと比べて高、比活性とは、上記 γ -CD生成に関する CGTase活性についての比活性力親 γ - CGTaseの比活性に比べて、例えば、約 10%(1.1倍)以上高いことを意味する。より好ましくは約 30%(1.3倍)以上高ぐさらに好ましくは約 50%(1.5倍)以上、最も好ましくは約 100%(2倍)以上高い。

[0039] 本発明の CGTase変異体は、例えば以下の方法により得ることができる。即ち、クロ一ユングされた親 y -CGTase (例えば、配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有する C GTase)をコードする遺伝子 (例えば、配列番号 2で示される塩基配列を有する)に対して置換 (以下、「変異」ともいう)を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。

[0040] 親 γ -CGTaseをコードする遺伝子のクローユングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよぐ例えばバチルスクラ一キー 7364株 (FERM BP-7156)の染色体より、ショットガン法や PCR法により取得できる。

[0041] 親 γ -CGTaseをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行なわれているランダム変異や部位特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、エラープローン PCR法ゃリコンビナント PCR法等を用いて行なうことができる。

[0042] 得られた変異遺伝子を用いた本発明の CGTase変異体の生産は、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターに当該遺伝子を組込み、得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換することにより行なえばよい。

[0043] 斯カるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、 pUC19、 pHY300PLK等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、 pUB110、 pHY300PLK、 pAM a 1等が挙げられる。

[0044] 宿主菌を形質転換するには、コンビテントセル法、エレクト口ポレーシヨン法、プロトプラスト法等を用いればよぐ宿主菌としては、例えば大腸菌等のグラム陰性菌、バチルス属 (枯草菌)等のグラム陽性菌、ストレブトマイセス属等の放線菌、サッカロマイセス属等の酵母あるいはァスペルギルス属等のカビが挙げられる。

[0045] 得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよぐ培養温度及び時間は、使用する形質転換体についての最適条件を考慮して適宜決定することができる。培養後、得られた培養液から、一般的な方法によって分取や精製を行ない、精製酵素を得ることができる。

[0046] 力べして得られる本発明の CGTase変異体は、親 γ -CGTaseよりも高、比活性を有するものである。なお、上記では、本発明の CGTase変異体を、遺伝子工学的手法により調製する方法を説明した。しかし、本発明の CGTase変異体は、親 γ -CGTaseを遺伝子工学的に変異させる方法以外に、そのような変異を含む天然の CGTaseを自然界カも採取することでも、得ることができ、そのような天然の CGTaseも、本発明の C GTase変異体に包含される。

[0047] 得られた本発明の CGTase変異体は親 γ -CGTaseと比べて、高、比活性を有し、

Ύ -CDを含有する組成物の製造の際に、生成される γ -CD量の増大あるいは γ _CG Tase使用量の低減が可能であり、 y _CD生成用酵素として有用である。 [0048] 尚、本発明の CGTase変異体は、上記アミノ酸残基の変異導入により、 γ -CD生成に関する比活性の向上にカ卩え、 a -CD及び Zまたは j8 -CD生成に関する比活性が向上している場合がある。本発明の CGTase変異体は、親 γ -CGTaseの比活性に比ベて、 y -CD生成に関する比活性が少なくとも約 10%(1.1倍)以上高い比活性を有する限り、このような CGTase変異体も包含する。

[0049] CGTaseを澱粉又は澱粉由来の基質に作用させた時、生成する a _CD、 β -CD及び γ -CDの各生成量と割合は、反応時間等の反応条件によっても異なる。さらに本発明の CGTase変異体は、上記アミノ酸残基の変異導入により、 CD生成量と割合に変化が生じる場合がある。反応条件の設定によっては、 a -CD及び Zまたは j8 "CD の生成量や割合と比較して、 y -CDの生成量や割合が相対的に低い場合もあり得る。しかし、そのような場合であっても、反応条件を最適化すれば、本発明の CGTase変異体による γ -CD生成量や割合を高くすることはできる。

[0050] 実施例

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、以下に示す実施例は、例示であって、本発明を限定する意図はないと理解すべきである。

[0051] 実施例 1

CGTase変異体作製

バチルスクラ一キー 7364株由来の CGTase構造遺伝子の開始コドンの 20base上流力終止コドンの lOObase下流までを含む約 2.2kbの範囲に対し、該約 2.2kbの DNAを増幅できるプライマー 1(配列番号 3)、プライマー 2(配列番号 4)及び Takara Taa (タカラ )を用い、エラープローン PCRを行なうことにより、ランダム変異を与えた。プライマー 1 はセンス鎖の 5'末端側に lリンカ一を、プライマー 2はアンチセンス鎖の 5'末端側に lリンカ一を付与した。 PCRの条件は、 94°Cで 5分間铸型 DNAを変性させた後、 94 °Cで 1分間、 55°Cで 1.5分間、 74°Cで 3分間を 1サイクルとし 30サイクル反応させた。増幅した DNA断片を GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (アマシャムバイオサイエンス)にて精製し、末端制限酵素リンカ一を ii、 iにより切断した。切断処理後の DNA断片を GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kitにて精製した。精製した DNA断片を 2 hl、 Sac.I処理した pUC19と混合した後、 Ligation High (東洋紡)により、リガーゼ反応を行なった。リガーゼ反応後液を用い、宿主菌である大腸菌 JM109 を形質転換した。

[0052] 大腸菌 JM 109の形質転換体を LB-AG寒天培地 [ポリペプトン (ディフコ） l%(w/v)、酵母エキス (ディフコ) 0.5%(w/v)、塩化ナトリウム l%(w/v)、アンピシリン 50ppm、グルコース 0.5%(w/v)、寒天 1.5%(w/v)]上に 30°Cで 14〜20時間培養した。大腸菌 JM109の形質転換体が生育した LB-AG寒天培地にイソプロピル- β -D-チォガラタトピラノシド (IPTG) 含有澱粉ァズール寒天 [澱粉ァズール (シグマ) 0.5%(w/v)、可溶性澱粉 0.5%(w/v)、寒天 1.5%(w/v)、 O.lmM IPTG, 25mM HEPES- NaOH(pH 7.5)]を重層し、 30°Cで 4〜8時間反応させた。ハローの形成状況により、親 γ -CGTaseに比べてより高い比活性を有する改良された CGTase変異体を生産する形質転換体の候補株を得た。

[0053] 実施例 2

CGTase変異体の評価

実施例 2—1

CGTase変異体をコードする遺伝子の塩基配列の決定

前記候補株を 2mlの LB- A培地 [ポリペプトン (ディフコ） l%(w/v)、酵母エキス (ディフコ )0.5%(w/v)、塩化ナトリウム l%(w/v)、アンピシリン 50ppm]に植菌し、 30°Cで 12〜16時間培養後、遠心分離により得られた菌体から GFX Micro Plasmid Prep Kit (アマシャムノィォサイエンス)を用いて、プラスミドを回収した。回収したプラスミド中に挿入された CGTase変異体をコードする遺伝子の塩基配列の決定を MegaBACE 1000マルチキヤビラリ一システム (アマシャムバイオサイエンス)を用いて行なった。

[0054] 実施例 2— 2 CGTase変異体の精製

前記候補株を 5mlの LB-A培地に植菌し、 30°Cで 12〜20時間培養後、 300mlの LB- A培地に植菌し、 30°Cで振盪培養を行ない、 600nmにおける濁度が 0.4〜1.0の時に I PTGを終濃度 O.lmMになるよう添カ卩し、さらに 12〜20hr培養した。培養液から遠心分離により得られた菌体を ULTRASONIC DISRUPTOR UD-201(トミー)を用いる 5分間の超音波破砕処理を行なヽ、超音波処理液から遠心分離により菌体内粗酵素溶液を得た。該粗酵素溶液について、 Sepharose6B (アマシャムバイオサイエンス)に γ -C Dを固定化した γ -CD固定化 Sepharose6Bを用いたァフィユティークロマトグラフィー法により、電気泳動的に均質なレベルにまで精製を行なった。

[0055] 実施例 2— 3タンパク濃度測定

精製 CGTaseのタンパク質濃度は DCプロテインアツセィキット (バイオラッド)を用いて測定した。標準タンパク質として牛血清アルブミンを用いた。

[0056] 実施例 2— 4 CGTase活性測定

450 μ 1の 1.5%可溶性澱粉溶液/各緩衝液 (ρΗ5- 7： 1/4 X Mcllvaine緩衝液、 pH7.5- 8 .5 : 25mM HEPES- NaOH緩衝液、 pH9- 10.5 : 25 mM Gly-NaCFNaOH緩衝液、 pHll -11.9 : 25mM Na HPO -NaOH緩衝液)を 40°Cで保温し、適当に希釈した酵素溶液 50

2 4

μ 1を添加することで反応を開始した。反応開始 10分後に 500 1の 0.05 N HC1を添加する事で反応を停止した。反応液に 5 mM BCG溶液 (in 20 % Ethanol)を添加混合後、 20分間室温で保持し、 2mlの 1M BCG緩衝液 (pH 4.2)をカ卩ぇ 630 nmの吸光度を測定した。該吸光度値力もあら力じめ作成した検量線を用いて反応液中の γ -CD含量を求めた。 CGTase活性 lunitを上記反応条件で単位時間当りに 1 μ molの γ -CDを生成させる酵素量と定義した。

[0057] 実施例 2— 5

CGTase変異体の評価法

前記候補株由来の精製 CGTase変異体の CGTase活性値及びタンパク質濃度から比活性を算出した。本比活性をバチルスクラ一キー 7364株由来の CGTase (親 CGTa se)の比活性と比べることで、改良された比活性を有する CGTase変異体を選別した。選別した CGTase変異体をコードする遺伝子の塩基配列決定により特定した変異部位を比活性の改良に関与する変異部位とした。

[0058] 実施例 2— 6

CGTase変異体の評価

親 CGTase及び各 CGTase変異体の pH7.5及び 10.0における CGTase活性及びタンパク質濃度を測定し、比活性を算出した。表 2に比活性の実測値及び親 CGTaseの比活性を 100とした時の本発明の CGTase変異体の相対値を示した。親 CGTaseの pH 7. 5における比活性は 0.47U/mg、 pH 10.0においては 5.41U/mgであった。それに対して、各 CGTase変異体の比活性は pH 7.5において 0.39- 4.35U/mg、 pH 10.0において 2.98-9.28U/mgであった。 pH 7.5と pHlO.Oの両方あるいはどちらか一方での比活性が 1.1倍以上向上した CGTase変異体が得られた。

[表 2] 親 CGTase及び各 CGTase変異体の pH7.5及び 10.0における CGTase比活性

実施例 2— 7

75位における各種変異体の評価

PH7.5及び pHlO.Oにおける大幅な比活性の向上が認められた 75位の Trpから Leu への置換にっ、て、 75位の Trpのその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマー 3〜 15(配列番号 5〜 17)、 CGTase遺伝子内に存在する適当な対向プライマー及び Pyrobest DNAポリメラーゼ (タカラ)を用いて、親 CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行な!ヽ、各 CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌 JM109を培養し、調製した精製酵素について比活'性の評価を行なったところ、 W75A、 W75C、 W75E、 W75F、 W75H、 W75I、 W75K、 W75M、 W75Q、 W75S、 W75T、 W75V、 W75Yにおいて、 pH 7.5と pHIO .0の両方あるいはどちらか一方での比活性の向上が認められた。表 3参照。

[表 3]

75位における各種 CGTase変異体の比活性

25mM HEPES-NaOH(pH 7.5)中に 10%(w/v)可溶性澱粉を加熱溶解させた基質に精製親 CGTase及び各精製 CGTase変異体をそれぞれ 0.15mg/g乾燥澱粉になるように添加し、 50°C、 8時間反応させた。反応液を 100°Cで 10分間保持することで酵素を失活させ、 CD含有組成物を調製し、その糖組成を HPLC法で求めた。表 4に示すように、親 CGTaseを使用したときの CD生成量に対して、 CGTase変異体を使用した場合、 CD生成量の増加が認められた。

[0063] [表 4] 親 CGTase及び CGTase変異体を用いた CD含有組成物の CD組成

n. d.二検出限界以下

[0064] 実施例 2— 8

134位における各種変異体の評価

PH7.5における大幅な比活性の向上が認められた 134位の Valから Alaへの置換について、 134位の Valのその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマー 16〜18(配列番号 18〜20) 、 CGTase遺伝子内に存在する適当な対向プライマー及び Pyrobest DNAポリメラーゼ (タカラ)を用いて、親 CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行な、、各 CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌 JM109を培養し、調製した精製酵素について比活性の評価を行なったところ、 V134P、 V134S、 V134Tにおいて、 pH 7.5と ρΗΙΟ.Ο の両方あるいはどちらか一方での比活性の向上が認められた。表 5参照。

[0065] [表 5]

1 34位における各種 CGTase変異体の比活性

[0066] 25mM HEPES-NaOH(pH 7.5)中に 10%(w/v)可溶性澱粉をカ卩熱溶解させた基質に精製親 CGTase及び各精製 CGTase変異体をそれぞれ 0.15mg/g乾燥澱粉になるように添加し、 50°C、 8時間反応させた。反応液を 100°Cで 10分間保持することで酵素を失活させ、 CD含有組成物を調製し、その糖組成を HPLC法で求めた。表 6に示すように、親 CGTaseを使用したときの CD生成量に対して、 CGTase変異体を使用した場合、 CD生成量の増加が認められた。

[0067] [表 6] 親 CGTase及び CGTase変異体を用いた CD含有組成物の CD組成

n. d =検出限界以下

実施例 2— 9

223位における各種変異体の評価

223位のおけるアミノ酸残基の置換につ!、て、 Val以外のその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマー 19〜21(配列番号 21〜23)、 CGTase遺伝子内に存在する谪当な対向プライマー及び Pyrobest DNAポリメラーゼ (タカラ)を用いて、親 CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行な、、各 CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌 JM109 を培養し、調製した精製酵素について比活性の評価を行なったところ、 A223H、 A223 K、 A223Rにおいて比活性の向上が認められた。表 7参照。

[0069] [表 7]

223位における各種 CGTase変異体の比活性

[0070] 25mM HEPES-NaOH(pH 7.5)中に 10%(w/v)可溶性澱粉をカ卩熱溶解させた基質に精製親 CGTase及び各精製 CGTase変異体をそれぞれ 0.15mg/g乾燥澱粉になるように添加し、 50°C、 8時間反応させた。反応液を 100°Cで 10分間保持することで酵素を失活させ、 CD含有組成物を調製し、その糖組成を HPLC法で求めた。表 8に示すように、親 CGTaseを使用したときの CD生成量に対して、 CGTase変異体を使用した場合、 CD生成量の増加が認められた。

[0071] [表 8] 親 CGTase及び CGTase変異体を用いた CD含有組成物の CD組成

n. d. =検出限界以下 [0072] 実施例 2— 10

347位における各種変異体の評価

PH7.5及び ρΗΙΟ.Οにおける大幅な比活性の向上が認められた 347位の Alaから Val への置換にっ、て、 347位の Alaのその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマー 22〜31(配列番号 24〜33)、 CGTase遺伝子内に存在する適当な対向プライマー及び Pyrobest DNAポリメラーゼ (タカラ)を用いて、親 CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行な、、各 CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌 JM109を培養し、調製した精製酵素について比活性の評価を行なったところ、 A347C、 A347D、 A347E、 A347H、 A 3471、 A347L、 A347N、 A347S、 A347T、 A347Yにおいて、 pH 7.5と pHlO.Oの両方あるいはどちらか一方での比活性の向上が認められた。表 9参照。

[0073] [表 9]

347位における各種 CGTase変異体の比活性

25mM HEPES-NaOH(pH 7.5)中に 10%(w/v)可溶性澱粉を加熱溶解させた基質に精製親 CGTase及び各精製 CGTase変異体をそれぞれ 0.15mg/g乾燥澱粉になるように添加し、 50°C、 8時間反応させた。反応液を 100°Cで 10分間保持することで酵素を失活させ、 CD含有組成物を調製し、その糖組成を HPLC法で求めた。表 10に示すように、親 CGTaseを使用したときの CD生成量に対して、 CGTase変異体を使用した場合、 CD生成量の増加が認められた。

[表 10]

親 GGTase及び CGTase変異体を用いた GD含有組成物の GD組成

n. d. =検出限界以下実施例 2— 11

361位における各種変異体の評価

PH7.5における大幅な比活性の向上が認められた 361位の Aspから Glyへの置換について、 361位の Aspのその他のアミノ酸への置換の影響を確認するため、プライマ一 32〜48(配列番号 34〜50)、 CGTase遺伝子内に存在する適当な対向プライマー及び Pyrobest DNAポリメラーゼ (タカラ)を用いて、親 CGTase構造遺伝子に部位特異的変異を行な、、各 CGTase変異体をコードする遺伝子を有するプラスミドを作製した。作製したプラスミドで形質転換した大腸菌 JM109を培養し、調製した精製酵素について比活性の評価を行なったところ、 D361A、 D361C、 D361E、 D361F、 D361H、 D361I 、 D361K、 D361L、 D361M、 D361N、 D361P、 D361Q、 D361S、 D361T、 D361V、 D361 W、 D361Yにおいて、 pH 7.5と pHlO.Oの両方あるいはどちらか一方での比活性の向上が認められた。表 11参照。

[表 11]

361位における各種 GGTase変異体の比活性

25mM HEPES-NaOH(pH 7.5)中に 10%(w/v)可溶性澱粉をカ卩熱溶解させた基質に精製親 CGTase及び各精製 CGTase変異体をそれぞれ 0.15mg/g乾燥澱粉になるように添加し、 50°C、 8時間反応させた。反応液を 100°Cで 10分間保持することで酵素を失活させ、 CD含有組成物を調製し、その糖組成を HPLC法で求めた。表 12に示すように、親 CGTaseを使用したときの CD生成量に対して、 CGTase変異体を使用した場合、 CD生成量の増加が認められた。 [0079] [表 12] 親 CGTase及び CGTase変異体を用いた CD含有組成物の CD組成

n. d. =検出限界以下

[0080] 実施例 2— 12

変異体の各種 pHにおける比活性の評価

親 CGTase (図 1中參)、 A223R (図 1中▲)、 D361V (図 1中國）について、 pH5- 11.9における比活性の評価を行なった。結果を図 1に示す。その結果、 A223R, D361V変異体共に pH6-l 1にお、て比活性の向上効果が認められた。

産業上の利用可能性

[0081] 本発明は、 γ -CD及び γ -CD含有組成物の製造分野に有用である。図面の簡単な説明

[図 1]実施例 2— 12で求めた、変異体の各種 pH(_PH5-11.9)における比活性の評価結果である。

Claims

請求の範囲

[1] 親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼのアミノ酸残基の少なくとも 1つを、親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼの該当するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換した変異体であって、親 γ -シクロデキストリン'グルカノトランスフエラーゼと比較して、改良された γ -シクロデキストリン合成に関する比活性を有するシクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼ変異体。

[2] 前記親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼカ配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列を有し、かつ配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列内の 7 5位、 82位、 91位、 92位、 119位、 134位、 147位、 151位、 223位、 225位、 234位、 320位、 347位、 359位、 360位、 361位、 451位、 625位、 656位、及び 662位の少なくとも 1つのアミノ酸残基が、配列番号 1で示されるアミノ酸配列中の該当位置に示されたアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する、請求項 1に記載の変異体。

[3] 前記異なるアミノ酸残基は、

75位が、 Alaゝ Cysゝ Ginゝ Gluゝ Hisゝ lieゝ Leuゝ Lys、 Met, Pheゝ Serゝ Thr、 Tyr、又は Val であり、

82位が、 Aspであり、

91位が、 Leuであり、

92位が、 Thrであり、

119位力 Valであり、

134位が、 Ala、 Pro, Ser、又は Thrであり、

147位が、 Thrであり、

151位が、 Aspであり、

223位が、 Arg、 His, Lys、又は Valであり、

225位が、 Leuであり、

234位が、 Asnであり、

320位が、 Gluであり、

360位が、 Argであり、

451位が、 Valであり、

625位が、 Cysであり、

656位が、 Tyrであり、

662位が、 Leuである、

請求項 2に記載の変異体。

[4] 配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列力 75位、 82位、 91位、 92位、 119位、 13 4位、 147位、 151位、 223位、 225位、 234位、 320位、 347位、 359位、 360位、 361位、 45 1位、 625位、 656位、及び 662位以外のアミノ酸残基において、 1〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたものである請求項 2または 3に記載の変異体。

[5] 前記親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼカ配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列中の、配列表の配列番号 1で示されるアミノ酸配列内の 75位、 82位、 91位、 92位、 119位、 134位、 147位、 151位、 223位、 225位、 234位、 320位、 347位、 359位、 360位、 361位、 451位、 625位、 656位、及び 662位に相当するアミノ酸残基の少なくとも 1つのアミノ酸残基 1S 前記親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼのアミノ酸配列中の該当位置に示されたアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する、請求項 1に記載の変異体。

[6] 前記変異体は、 ρΗ6〜： L 1のいずれかの ρΗにおいて測定した比活性力親 γ -シクロデキストリン 'ダルカノトランスフェラーゼの比活性の 1. 1倍以上である請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の改良変異体。

[7] 前記変異体は、 ρΗ7. 5又は ρΗΙΟにおいて測定した比活性力親 γ -シクロデキストリン'グルカノトランスフェラーゼの比活性の 1. 1倍以上である請求項 1〜6のいずれ力 1項に記載の改良変異体。

[8] 請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子。

[9] 請求項 8に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。

[10] 請求項 9に記載の組換えベクターで形質転換された又は染色体相同組換えされた形質転換体。

[11] 請求項 10に記載の形質転換体を培養し、前記形質転換体が生成するシクロデキストリン'グルカノトランスフェラーゼ変異体を回収することを含む、請求項 1〜7のいずれ力 1項に記載の変異体の製造方法。