WO2007119759A1 - ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー１８７ａ５ - Google Patents

ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー１８７ａ５ Download PDF

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Yuichi Ono
Yoshimasa Sakamoto
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Eisai R & D Management Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to the 187A5 gene, which is a donomin-producing / euron progenitor cell marker, and in particular, to a means for detecting dopaminergic neuron progenitor cells, and a method and kit for detecting the cells.
  • the dopamine system is a very important system involved in motor regulation, hormone secretion regulation, emotion regulation and the like important in the mammalian brain.
  • abnormalities in dopaminergic neurotransmission cause various nervous system disorders.
  • Parkinson's disease is an extrapyramidal neurodegenerative disease caused by specific loss of midbrain substantia nigra dopaminergic neurons (HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 2nd edition 2nd edition, Isselbacher et al Ed. McGraw- Hilllnc., NY (1994) pp. 2275-7).
  • L dopa (3, 4-dihydroxyphenol-lanalanin) is orally administered to compensate for a decrease in the amount of donomin produced. It is known that the sustainability is not good.
  • ES cell-derived donomin production-euron has also been confirmed to be functional by transplantation into the lesion striatum of a rat Parkinson's disease model (Kim et al. (2002) Nature 418: 50-56). In the future, it seems that the importance of regenerative treatment of ES cells or the neural stem cell power of the patient himself will increase.
  • Dopamine production-selective enrichment / separation of euron Dopamine production-gene promoters such as tyrosine neuroxylase (TH) expressed in euron
  • TH tyrosine neuroxylase
  • a reporter that expresses a fluorescent protein under the control of a cell is introduced into each cell of the cell population, and the cells that emit fluorescence are separated, thereby visualizing and concentrating and separating the dominamine production-euron alive.
  • an identification method Japanese Patent Publication No. 2002-51775
  • this method necessitates a complicated process of introducing a foreign gene.
  • the presence of a reporter gene is a toxic and immunogenic feature. Is also a problem.
  • Lrp4 is a gene that is expressed in dopaminergic-euron proliferative progenitor cells.
  • dopaminergic-euron progenitor cells preferably dopaminergic-neuron proliferative progenitor cells
  • the inventors From the ventral side of the embryonic midbrain and ventral side of the hindbrain, cells that are positive for Lrp4 protein, a dopamine production-euron proliferative progenitor cell marker gene, were isolated and put into the midbrain by the subtraction (N-RD A) method, As a result of searching for genes specific to Lrp4-positive cells, we found a gene (187A5 gene (sometimes simply referred to as “187A5” in this document)) that is selectively expressed in dopaminergic neuron proliferative progenitor cells. (Example 2). The present invention is based on this finding.
  • the present invention relates to a means for detecting donomin producing-euron progenitor cells (preferably dopamine producing-euron proliferative progenitor cells), dopamine producing-euron progenitor cells (preferably donomin producing-euron proliferating progenitor cells) And a detection kit for dopaminergic production-euron progenitor cells (preferably dopaminergic production-euron proliferative progenitor cells).
  • donomin producing-euron progenitor cells preferably dopamine producing-euron proliferative progenitor cells
  • dopamine producing-euron progenitor cells preferably donomin producing-euron proliferating progenitor cells
  • dopaminergic production-euron progenitor cells preferably dopaminergic production-euron proliferative progenitor cells
  • Another object of the present invention is to provide a screening method for a substance effective for inducing differentiation of dopaminergic-euron progenitor cells (preferably dopaminergic-neuron proliferative progenitor cells).
  • donomin producing-euron precursor cells preferably dopamine producing-euron proliferating progenitor cells
  • 187A5 gene a polynucleotide (hereinafter, sometimes referred to as "187A5 gene” t) in which the following (i), (ii), (iii), and (iv) force are also selected.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or more nucleotides are inserted, substituted, or deleted, and / or one or more nucleotides are attached to one or both ends thereof.
  • the present invention also provides a protein (hereinafter sometimes referred to as "187A5 protein") in which the following (V) (vi) (vii) and (viii) force are also selected. Is:
  • (V) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 one or more amino acids are inserted, substituted, or deleted, and Z or one or more amino acids are attached to one or both ends thereof.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having the same function as the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the present invention is used for detection or selection of a dopaminergic-rong progenitor cell (preferably dopaminergic-rhn progenitor cell) that can be hybridized to the nucleotide sequence of the 187A5 gene or its complementary sequence.
  • Probes or plies hereinafter sometimes referred to as “probes according to the invention” and “primers according to the invention”, respectively).
  • an antibody having a binding property to the 187A5 protein (hereinafter referred to as "the antibody according to the present invention") used for detection or selection of dopamine-producing Ron progenitor cells (preferably dopamine-producing neuron proliferative progenitor cells). Is sometimes provided).
  • a method for detecting or selecting domin producing-Lon progenitor cells comprising the step of detecting expression of 187A5 gene or 187A5 protein (
  • the detection method according to the present invention is provided.
  • a dopaminergic-Lon progenitor cell preferably, dopaminergic-Lon proliferative progenitor cell
  • a kit for selection (hereinafter “detection kit according to the present invention” t) may be provided.
  • a dopaminergic-Lon progenitor cell (preferably, a dopaminergic-Lon proliferative progenitor cell) comprising at least a probe, primer, primer set, or antibody according to the present invention is detected or detected.
  • Reagents for selection hereinafter sometimes referred to as “detection reagents according to the present invention”.
  • a method for producing domin-producing Ron precursor cells preferably dopaminergic neuron proliferative progenitor cells used for the treatment of Parkinson's disease.
  • the probe, ply ply set, and antibody according to the present invention can be used in the midbrain as a marker specific for dopaminergic pro-Lon progenitor cells, preferably dopaminergic progenitor-Lon progenitor cells. Therefore, the present invention is extremely useful in the development of a method for inducing the purity of transplanted materials and in vitro induction of domin producing-Lon progenitor cells, preferably dopamine producing-Lon proliferating progenitor cells. This greatly contributes to promoting the practical application of regenerative medicine.
  • the protein according to the present invention expresses a part of a protein that is not simply expressed outside the cell. Therefore, it is possible to reliably detect living cells by using the extracellular region of the protein according to the present invention as an index, and to separate and acquire the cells, which can be said to contribute greatly to the practical application of regenerative medicine.
  • FIG. 1 is a diagram showing the expression timing of a dominogenic neuron-related marker gene.
  • FIG. 2 shows the results of analysis of Lrp4 TH protein expression in the midbrain and hindbrain of rat 14.5-day embryos by immunostaining.
  • FIG. 3 shows the results of RT-PCR analysis of mRNA expression of 187A5, Lmxla, and Lrp4 in midbrain and hindbrain Lrp4-positive cells.
  • FIG. 4 shows the results of in situ hybridization analysis of 187A5 and Lrp4 mRNA expression in the midbrain and hindbrain of mouse 12.5 day embryos.
  • ES cell force is also a diagram showing the results of RT-PCR analysis of 187A5, Lmxla and Lrp4 mRNA expression in dopamine-producing euron proliferative progenitor cells induced by the SDIA method.
  • FIG. 6 shows the results of RT-PCR analysis of mRNA expression of 187A5, Lmxla, and Lrp4 in dopamine-producing euron precursor cells that were induced from ES cells by the 5-stage method.
  • FIG. 7 shows mice 187A5 and 187A5-SEAP.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of analyzing the signal sequence activity of 187A5.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of analyzing the cell surface expression of 187A51 protein by the method of modification of cell surface protein with pyotin ⁇ .
  • FIG. 10 shows the results of FACS analysis of cell surface expression of 187A5 protein.
  • the part surrounded by a frame in the figure shows 187A5-expressing cells.
  • FIG. 11 shows the results of an immunostaining analysis of the expression of 187A5 protein in the midbrain and hindbrain ventral side of mouse 11.5-day embryos.
  • FIG. 12 shows the results of FACS analysis of the expression of 187A5 and Lrp4 proteins in the midbrain and ventral hindbrain of mouse 12.5 day embryos.
  • This figure shows the results of FACS analysis of the expression of 187A5 and Lrp4 proteins in dopamine production-euron proliferative progenitor cells induced by ES cell differentiation by the SDIA method.
  • FIG. 14 shows the results of isolating and culturing 187A5ZLrp4 co-positive cells in which ES cell force was also induced by the SDIA method.
  • dopamine-producing Ron precursor cells to be detected or selected means dopamine-producing Ron cells before maturation.
  • the "dopaminergic-lon-proliferating progenitor cell” that is the object of detection or selection means a dopaminergic neuron progenitor cell before mitotic arrest.
  • Dopamine-producing Ron is separated from neuroepithelial cells into proliferative progenitor cells and progenitor cells after mitosis, and then into mature domin producing Ron.
  • Dopaminergic neuron progenitor cells are progenitor cells of dominin producing neurons. Among them, dopaminergic progenitor-lon progenitor cells are the earliest progenitor cells of dopaminergic progenitor-Lon. High survival rate and high network formation ability can be expected. Therefore, dopaminergic neuron progenitor cells, especially domininergic neuron proliferative progenitor cells, are useful for transplantation treatment of diseases caused by decreased dopamine due to degenerative loss of dopaminergic neurons such as Parkinson's disease.
  • the cells selected using the probe, ply-ply set, or antibody according to the present invention as an index are dopamine-producing Ron progenitor cells, a conventional mixed cell population or dopamine-producing neurons into which a foreign gene has been introduced. Compared to progenitor cells, it is preferable for transplantation treatment of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease in terms of safety, survival rate, and network formation ability.
  • cells detected or selected with a probe, ply-ply set, or antibody according to the present invention produce dopamine- Euron progenitor cells, i.e.
  • proliferating donomin progenitors-euron progenitor cells may mature in optimal locations in the brain, and may be further in vivo Since progenitor neuron progenitor cells may proliferate, long-term therapeutic effects can be expected. Therefore, it can be said that the present invention opens the way to the practical application of effective transplantation treatment for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease.
  • 187A5 gene means a gene encoding 187A5 protein, and includes not only cDNA but also genomic DNA. The corresponding RNA is also included.
  • 187A5 gene which is an indicator of the presence of dopaminergic-euron progenitor cells, is registered in the database as a sequence whose function is unknown in mice, but human, rat, ushi, inu, In chimpanzees and the like, the sequence is only predicted. Each sequence is disclosed!
  • GenBank accession numbers are as follows.
  • AK028289 (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12), AK157823 (SEQ ID NO: 13 (base sequence)), AK028541 (SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15), AK035053 (SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO :) 17), XM—485684 (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19), AK163356 (SEQ ID NO: 20 (base sequence))
  • the human 187 A5 gene cDNA sequence (as a gene selectively expressed in dopamine producing-euron progenitor cells (preferably donomin producing-euron proliferative progenitor cells) in the midbrain region ( SEQ ID NO: 1), also donomin production-euron progenitor cells ( Preferably, the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of human 187A5 protein (polypeptide) was determined as a protein (polypeptide) that is selectively expressed in dopaminergic cells (Euron proliferative progenitor cells).
  • a person skilled in the art based on the nucleotide sequence of the 187A5 gene of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of the 187A5 protein of SEQ ID NO: 2, has the nucleotide sequence of the 187A5 gene or the amino acid sequence of the 187A5 protein present in various animals. Can be specified. For example, a homology search can be performed based on the human or mouse 187A5 gene or 187A5 protein, and the animal's 187A5 gene or 187A5 protein can be searched and identified. For homology search, BLAST etc. described later can be used.
  • 187A5 gene and “187A5 protein” refers to 187A5 genes that are endogenous to various animals (preferably mammals) in addition to human-derived 187A5 genes. Used to include genes and 187A5 protein.
  • Examples of the 187A5 gene include
  • a polynucleotide encoding the human 187A5 protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12, sequence A polynucleotide encoding the mouse 187A5 protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19; a rat comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 A polyclonal tide that encodes the 187A5 protein;
  • a polynucleotide tide encoding the Usi 187A5 protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24;
  • a polynucleotide encoding Inu 187A5 protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26;
  • a polynucleotide encoding the chimpanzee 187A5 protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 9.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the human 187A5 gene;
  • a polynucleotide sequence comprising the nucleotide sequence of the mouse 187A5 gene represented by SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: 20;
  • a polynucleotide sequence comprising the nucleotide sequence of the rat 187A5 gene represented by SEQ ID NO: 21;
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the chimpanzee 187A5 gene represented by SEQ ID NO: 27
  • the 187A5 gene includes a polynucleotide in which the following (i ′), (ii ′), (iii ′), and (iv ′) forces are also selected:
  • SEQ ID NO: 16 A polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 27;
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, or polynucleotide represented by SEQ ID NO: 27 and nucleotides under conditions that are stringent, and SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 27 have 70% or more identity with the polynucleotide having the nucleotide sequence ability And a polynucleotide encoding a protein having a function equivalent to that of the protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 2.
  • the 187A5 gene also includes a polynucleotide encoding a protein from which the following (v ′), (vi ′), ( ⁇ ′), and (viii ′) forces are also selected:
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, or SEQ ID NO: 28;
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, sequence SEQ ID NO: 2, encoded by a polynucleotide that encodes a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, or SEQ ID NO: 28 under stringent conditions, and SEQ ID NO: 2.
  • a polynucleotide selected from the following '), (ii ,,) ⁇ (iii "), and (iv"):
  • (i ′ ′) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; (ii ′ ′) insertion or substitution of one or more nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • An amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having one or more nucleotides attached to one or both ends thereof, and / or from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polynucleotide encoding a protein having a function equivalent to that of the protein;
  • SEQ ID NO: 1 is equivalent to a polynucleotide having the nucleotide sequence ability represented by SEQ ID NO: 1 and having a stringency under a stringent condition and having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 has 70% or more identity with the polynucleotide having the nucleotide sequence ability represented by SEQ ID NO: 1, and has the same function as the protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 2.
  • a polynucleotide encoding a protein wherein the following (v ,,), (vi ,,), ( ⁇ ',), and (viii ,,) forces are also selected: Will be provided:
  • SEQ ID NO: 2 encoded by a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and polynucleotides that are subjected to hybridization under stringent conditions, and SEQ ID NO: 2 A protein having a function equivalent to that of the protein having the amino acid sequence ability represented;
  • ( ⁇ '' ') Polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1; ( ⁇ ', ') Insertion of one or more nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 , A substitution, a deletion, and / or an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence with one or more nucleotides attached to one or both ends thereof, and represented by SEQ ID NO: 2 A polynucleotide encoding a protein having a function equivalent to that of a protein consisting of sequence;
  • SEQ ID NO: 1 is equivalent to a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and is hybridized under a stringent condition with a polynucleotide having the nucleotide sequence ability represented by SEQ ID NO: 1.
  • a human selected from the following ( ⁇ ',,), ( ⁇ ',,), ( ⁇ ',,), and (V iii' ")
  • a polynucleotide encoding a protein of origin is provided:
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 one or more amino acids are inserted, substituted, deleted, and / or one or more amino acids at one or both ends thereof.
  • SEQ ID NO: 2 encoded by a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a polynucleotide that is allowed to hybridize under stringent conditions, and SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 2 consisting of an amino acid sequence having an identity of 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having the same function as a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a human-derived polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is provided.
  • a polynucleotide encoding a human-derived protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is provided.
  • 187A5 protein examples include
  • a human 187A5 protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 10;
  • Mouse 187A5 protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19;
  • Rat 187A5 protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
  • Usi 187A5 protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;
  • a chimpanzee 187A5 protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and a chimpanzee 187A5 protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.
  • 187A5 protein polypeptide
  • polypeptide also include amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids
  • a protein encoded by a nucleotide sequence comprising the nucleotide sequence of the human 187A5 gene represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 9;
  • SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, or a nucleotide sequence comprising the nucleotide sequence of the mouse 187A5 gene represented by SEQ ID NO: 20 Protein
  • SEQ ID NO: 23 Nucleotide sequence comprising nucleotide sequence of 187A5 gene The protein encoded in the sequence;
  • SEQ ID NO: 27 Chimpanzee Protein encoded by nucleotide sequence comprising nucleotide sequence of 187A5 gene
  • 187A5 protein includes proteins selected from the following (i,), (ii,), (iii,), and (iv,):
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, or NUCL represented by SEQ ID NO: 27
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, or SEQ ID NO: 28;
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, sequence SEQ ID NO: 2, encoded by a polynucleotide that encodes a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, or SEQ ID NO: 28 under stringent conditions, and SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 ( ⁇ ') SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, or amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A protein that has the same function as a powerful protein.
  • a protein selected from the following '), (ii ,,) ⁇ (iii "), and (iv"): (i '') a protein encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 one or more nucleotides are inserted, substituted, or deleted, and / or one or more nucleotides are added to one or both ends thereof.
  • a protein comprising an amino acid sequence encoded by a truncated nucleotide sequence and having a function equivalent to that of a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • a protein is also selected in which the following (v,,), (vi,,), ( ⁇ ',), and (viii,,) forces are also selected: Provided: ( ⁇ ′ ′) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • a human selected from the following ( ⁇ ',,), ( ⁇ ' ,,), ( ⁇ ',,), and (V iii' ") Proteins (polypeptides) derived from are provided:
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 one or more amino acids are inserted, substituted, deleted, and / or one or more amino acids at one or both ends thereof.
  • SEQ ID NO: 2 is encoded by the polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the polynucleotide that is hybridized under stringent conditions, and also has the amino acid sequence capability represented by SEQ ID NO: 2.
  • a protein having a function equivalent to that of a protein; and (viii '' ') consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 A protein having the same function as a protein consisting of a sequence.
  • a human-derived protein encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is provided.
  • a human-derived protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is provided.
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • "And amino acid insertions, substitutions or deletions, and additions to Z or one or both ends thereof in the amino acid sequence” are well-known methods such as site-specific mutagenesis. It means that the modification has been made by a technical method or by substitution of a plurality of nucleotides or amino acids to the extent that can occur naturally.
  • polynucleotide it is meant to include single nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the number of nucleotide and amino acid modifications is, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to: L0, further preferably 1 or several (for example, 9 or less), and particularly preferably 1 -4, most preferably 1-2 nucleotides and amino acids inserted, substituted, or deleted, and attached to Z or one or both ends thereof.
  • the modified nucleotide sequence is preferably one or more (for example, one to several or 1, 2, 3, or 4) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a mutation that does not affect the function of the protein.
  • the modified amino acid sequence is preferably a SEQ ID NO having one or more (eg, one! /, And several! /, 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions. : The amino acid sequence represented by 2.
  • the number of insertions, substitutions, deletions or additions introduced into the nucleotide sequence is preferably 1 Alternatively, it may be several (for example, 9 or less), more preferably 1 to 6, particularly preferably 1 to 4, and most preferably 1 to 2.
  • the number of insertions, substitutions, deletions or additions introduced into the amino acid sequence is Preferably, it may be 1 or several (for example, 9 or less), more preferably 1 to 6, particularly preferably 1 to 4, and most preferably 1 to 2.
  • substitution refers to one or more amino acid residues being replaced with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the function of the protein. Put in It means to change. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted with another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted with another polar residue having the same charge.
  • Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid. Specific examples include non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, norine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • modified nucleotide sequence examples include, for example, substitution of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 512th guanine for adenine, substitution of 844th guanine to adenine, and 1360th guanine to adenine And nucleotide sequence having substitution, substitution of 2458th adenine to guanine, and substitution of 2991st adenine to guanine.
  • the modified nucleotide sequence may have all these substitutions or a combination thereof.
  • the modified amino acid sequence includes, for example, the substitution of the 161st arginine with histidine, the substitution of 272nd palin with isoleucine, and the 44th pallin with isoleucine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Or an amino acid sequence having substitution of 810th arginine with glycine.
  • the modified amino acid sequence may have all these substitutions or a combination thereof.
  • hybridize under stringent conditions means to hybridize to a target polynucleotide under stringent conditions.
  • homology search software such as FASTA, BLAST, Smith-Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)] At least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • Polynucleo with at least% identity Chido is mentioned.
  • “stringent conditions” means that the temperature is 40 ° C to 70 ° C, preferably 60 ° C to 65 ° C, etc. in a hybridization buffer that can be usually used by those skilled in the art.
  • the reaction can be performed according to a method of washing in a washing solution having a salt concentration of 15 to 300 mmol ZL, preferably 15 to 60 mmol ZL.
  • the temperature and salt concentration can be appropriately adjusted according to the length of the probe used.
  • the conditions for washing the hybridized material can be 0.2 or 2 X SSC, 0.1% SDS, and a temperature of 20 ° C to 68 ° C.
  • a difference can be made depending on the salt concentration or temperature at the time of washing. If there is a difference between the salt concentration and the hybridization, use 0.2 X SSC, 0.1% SDS as the stringent wash buffer (low stringency wash buffer), and 2 as the low stringency wash buffer. X SSC, 0.1% SDS. Also, when making the difference of hybrids in temperature, 68 ° C for stringent, 42 ° C for moderate stringency, and room temperature (20 ° C-25 ° C) for mild In case of deviation, 0.2 X SSC, 0.1% SDS can be used.
  • the hybridization can be performed according to a known method.
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • identity (sometimes referred to as homology) with respect to amino acid sequences is used to mean the degree of coincidence of amino acid residues constituting each sequence between sequences to be compared. It is done. At this time, the existence of gaps and the nature of amino acids are considered (Wil bur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726-730 (1983)).
  • commercially available software such as BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Peasron: Methods in Enzymology 183: 63-69 (1990), etc. Can be used.
  • identity may be any value calculated using a homology search program known to those skilled in the art.
  • BRE Basic localism of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) alignment search tool
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the nucleotide sequence having at least 70% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 90% or more, More preferred is a nucleotide sequence having an identity of 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the amino acid sequence having at least 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 90% or more. Even more preferably, it may be an amino acid sequence having an identity of 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the polynucleotide encoding the protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 2 is a cDNA sequence encoding the same amino acid in addition to a part or all of the cDNA sequence represented by SEQ ID NO: 1. It also means a sequence having a degenerate codon as a cDNA sequence. Furthermore, it shall mean a genomic DNA sequence including introns and untranslated regions. In the present invention, RNA sequences corresponding to these are also included.
  • a biological phenomenon or function related to the expression of the 187A5 gene can be determined, for example, by evaluating whether or not the force selectively expressed in the dopamine producing-euron progenitor cells, and preferably in the dopamine producing-euron proliferating progenitor cells, in the midbrain.
  • amino acid residues preferably, at least 6 amino acid residues of the amino acid sequence of 248th to 397th or 792th to 877th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a protein comprising a polypeptide comprising a group) or all of them. Since this protein corresponds to a highly discriminating part of the amino acid sequence of the 187A protein, it can be used as an antibody antigen that can identify the 187A5 protein with higher accuracy. It is possible to be.
  • the 187A5 protein is a type I transmembrane protein, and is expressed on the cell surface with the N-terminal side oriented extracellularly. Therefore, viable cells expressing the protein can be separated by flow cytometry using an antibody having a binding property to the protein.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is represented by the 28th to 927th amino acid sequence, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, the 16th to 1267th amino acid sequence, represented by SEQ ID NO: 6.
  • a protein comprising a polypeptide having at least 5 amino acid residues (preferably at least 6 amino acid residues) in the 1st to 866th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 28, or a polypeptide
  • a protein according to the present invention as an indicator for detecting or selecting dopaminergic neuron progenitor cells, preferably dopaminergic neuron proliferative progenitor cells.
  • the probes and primers according to the invention used for the detection or selection of dopamine producing-euron progenitor cells can specifically hybridize with the 18 7A5 gene.
  • dopamine producing-euron progenitor cells preferably dopamine producing-euron proliferating cells
  • 187A5 mRNA is the mid ventral ventral region of the midbrain where Lrp4 positive dopaminergic-euron progenitor cells are present
  • VZ ventricular zone
  • 187A5 mRNA is dopamine production-euron proliferation It was revealed that it is selectively expressed in progenitor cells.
  • the expression of the 187A5 gene is useful as an indicator of dopaminergic-euron progenitor cells. Therefore, the probe, primer, and primer set according to the present invention can be used as a marker for detecting dopaminergic-euron progenitor cells, preferably dopaminergic-euron proliferating progenitor cells.
  • the probe and primer according to the present invention refer to a polymer comprising a plurality of bases or base pairs such as deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), as long as the expression of the 187A5 gene can be detected.
  • Double stranded cDNA is also known to be available in tissue in situ hybridization, and probes and primers of the invention include such double stranded cDNA.
  • An especially preferred probe and primer for detecting RNA in tissues is an RNA probe (riboprobe).
  • the probes and primers according to the present invention include those containing a nucleotide sequence consisting of at least 10, preferably at least 15 nucleotides of the nucleotide sequence of the 187A5 gene or its complementary sequence.
  • the probes and primers according to the present invention are also preferably 10-50 or 10-30, more preferably 15-50 or 15-30, even more preferably 20-50. Even or 20 or 30 or even more, more preferably 25 to 50 or 25 to 30, most preferably 26 to 39 or 26 to 35 nucleotides that contain a nucleotide sequence. It is done.
  • the probes and primers according to the present invention can be at least 10 bases in length, preferably at least 15 bases in length, more preferably at least 20 bases in length, and even more preferably at least 25 bases in length.
  • the probes and primers according to the present invention are also preferably 10 to 50 bases or 10 to 30 bases long, more preferably 15 to 50 bases or 15 to 30 bases long, still more preferably 20 to 30 bases long. It is 50 bases or 20-30 bases long, more preferably 25-50 bases long or 25-30 bases long, most preferably 26-39 bases long or 26-35 bases long.
  • the probe and primer comprises a nucleotide sequence consisting of at least 10 (more preferably at least 15) consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of the 187A5 gene or its complementary sequence. 15-50 bases in length or 15-30 bases in length, used for detection or selection of donomin-producing neuron progenitor cells in the midbrain, preferably dopaminergic-euron proliferative progenitor cells, that can hybridize to the 187A5 gene More preferably, a polynucleotide of 25 to 50 bases or 25 to 30 bases in length, most preferably 26 to 39 bases or 26 to 35 bases in length is provided.
  • a polynucleotide which can be hybridized to a part of the nucleotide sequence of the 187A5 gene with high discrimination.
  • a polynucleotide for example, a nucleotide comprising part or all of the nucleotide sequence of the nucleotide sequence 774 to 1221 or 2403 to 2666 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples include polynucleotides that hybridize to sequences.
  • a highly discriminating portion can be amplified by a nucleic acid amplification method, or a highly discriminating portion can be hybridized.
  • a polynucleotide that can be provided is provided. By using such a polynucleotide, it becomes possible to detect progenitor cells, preferably proliferating cells with higher accuracy.
  • a polynucleotide for example, a nucleotide sequence comprising a part or all of the nucleotide sequence of the 774th to 1221st or the 2403th to 2666th nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used as the nucleic acid.
  • examples thereof include polynucleotides that can be amplified by an amplification method.
  • the probe according to the present invention can be used as a probe according to a conventional method in a known method for detecting a target gene such as Northern blotting, Southern blotting, or in situ hybridization.
  • Probes according to the present invention can be chemically synthesized based on the nucleotide sequences disclosed herein. Probe preparation is well known, for example, Molecular Cloning, A Laboratory. Manual 2 nd ed. "(Cold Spring Harbor Press (1989) ), it can be carried out according to the" Current Protocols in Molecular BiologyJOohn Wiley & Sons (1987- 1997)).
  • the primer according to the present invention can be used as a primer set composed of two or more kinds of the primers.
  • the primer and primer set according to the present invention are known methods for detecting a target gene using nucleic acid amplification methods such as PCR, RT-PCR, real-time PCR, and in situ PCR. It can be used as a primer and primer set.
  • the primer set according to the present invention can be selected so that the nucleotide sequence of the 187A5 gene can be amplified by a nucleic acid amplification method such as a PCR method.
  • Nucleic acid amplification methods are well known, and selection of primer sets in nucleic acid amplification methods is obvious to those skilled in the art.
  • the PCR method one of two primers (primer pair) pairs with the positive strand of the double-stranded DNA of the 187A5 gene, the other primer pairs with the negative strand of the double-stranded DNA, and one The primer can be selected so that the other primer pairs with the extended strand extended by one primer.
  • 3 regions for the target gene and 3 terminal forces are F3c, F2c, and Flc, and 5 regions from the terminal side are Bl, B2, and B3. Each of these four regions can be used to design four types of primers.
  • the primer according to the present invention can be chemically synthesized based on the nucleotide sequence disclosed herein. Primer preparation is well known and is performed, for example, according to ⁇ Molecular Cloning, A Labora tory Manual 2 '' ed. (Cold Spring Harbor Press (1989)), Current Protocols in Molecular Biology Joohn Wiley & Sons (1987-1997). it can.
  • the antibody according to the present invention can specifically recognize the 187A5 protein. According to Example 5, it was confirmed that 187A5 protein was present in donomin producing-euron progenitor cells. Thus, the presence of 187A5 protein is useful as an indicator of dopamine production-euron progenitor cells including donomin production-euron proliferative progenitor cells.
  • the antibody according to the invention comprises a dopaminergic-euron progenitor cell, preferably a dopaminergic product. It can be used as a marker for detecting live-euron progenitor cells.
  • the antibody according to the present invention detects donomin-producing euron progenitor cells as living cells or This is advantageous in that it can be selected (Example 6).
  • the antibody according to the present invention is advantageous in that it can also detect or select ES cell-derived cells (Example 7).
  • Examples of the 187A5 protein for obtaining the antibody according to the present invention include the above-described proteins as long as they have the antigenicity of 187A5. Also included are proteins having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence of the 187A5 protein. It is known that such proteins maintain the same biological activity as the original protein (Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 81: 5662-6; Zoller and Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487—500; Wang et al. (L 984) Science 224: 1431—3; Dalbadie—McFarland et al.
  • the antibody according to the present invention includes an antibody specific to a part of the 187A5 protein. That is, the 187A5 protein for obtaining the antibody of the present invention includes at least 6 amino acid residues of the 187A5 protein in addition to the polypeptide having the full-length amino acid sequence of the 187A5 protein (for example, 8, 10, 12 or 15 A polypeptide fragment having the same sequence as amino acid residues or more).
  • the polypeptide fragment of 187A5 protein in this specification may be any fragment as long as it has 187A5 protein or antigenicity thereof.
  • Preferable fragments include polypeptide fragments such as the amino terminal of 187A5 protein.
  • the antigenic determinant of the polypeptide is a method of analyzing hydrophobic Z hydrophilicity on the amino acid sequence of the protein (Kyte-Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-22), a method of analyzing the secondary structure (Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 251-76), and computer programs (Anal.Biochem. 151: 540-6 (1985)) or short peptides were synthesized and their antigens. It can be confirmed by a method such as PEPSCAN method (Japanese Patent Publication No. 60-500684).
  • antibodies having binding to 187A5 protein include
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, or an antibody having a binding property to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a protein that is a part thereof;
  • SEQ ID NO: 12 An antibody having a binding property to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 19, or a protein that is a part thereof;
  • Antibody having binding property to amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28 or a protein having a partial force thereof
  • an antibody that recognizes a highly distinct polypeptide portion in the 187A5 protein.
  • an antibody that recognizes a highly distinct polypeptide portion in the 187A5 protein.
  • progenitor cells preferably proliferating cells with higher accuracy.
  • examples of such an antibody include at least 5 amino acid residues (preferably at least 6 amino acid residues) of the amino acid sequence of 248 to 397 or 792 to 877 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or Examples thereof include antibodies having binding ability to a protein comprising a polypeptide that is also potent.
  • an antibody that is expressed extracellularly of the 187A5 protein and recognizes the polypeptide moiety.
  • an antibody By using such an antibody, it becomes possible to detect progenitor cells, preferably the proliferating cells alive.
  • examples of such antibodies include antibodies having binding properties to the polypeptide portion of the 187A5 protein expressed outside the cell.
  • Antibodies according to the present invention can be obtained using methods well known to those skilled in the art (for example, “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987)), Antibodies: A Lauratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
  • the antibodies according to the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies (scFv), humanized antibodies, multispecific antibodies, and Fab, Fab ', F (ab'), Fc ,
  • Antibody fragments fragments such as Fv are included.
  • the blood of a mammal sensitized with an antigen can be taken out, and the blood serum can be separated by a known method to obtain a serum containing a polyclonal antibody.
  • the fraction containing the serum polyclonal antibody can be further isolated.
  • a monoclonal antibody antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph nodes of a mammal sensitized with the above antigen are taken out and fused with myeloma cells, etc., and the resulting hyperidoma (fusion cell) The antibody can also be recovered to obtain a monoclonal antibody.
  • an immunizing antigen a fragment of the 187A5 protein can be used. Or what was synthesize
  • the antigen may be used as a complex with a carrier protein.
  • various condensing agents can be used. Daltaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, and the like can be used.
  • Carrier protein is bovine serum albumin, thyroglobulin
  • mice examples include mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, pigs, goats, horses, or rabbits, preferably mice, rats, rabbits, guinea pigs, hamsters, and the like.
  • inoculation method include subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal administration. When administered, it can be mixed with complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant, usually once every 2 to 5 weeks.
  • the antibody-producing cells obtained are fused with myeloma cells and isolated as a hyperidoma.
  • myeloma cells those derived from mice, rats, humans and the like are used, and those derived from the same species as antibody-producing cells are preferred.
  • hyperidoma cell fusion
  • fusion promoters include polyethylene glycol and Sendai virus.
  • 20 to 50% polyethylene glycol (average molecular weight 1000 to 4000) is used20.
  • the ratio of the number of antibody-producing cells to the number of myeloma cells is usually about 1: 1 to 10: 1, and cell fusion can be carried out by reacting for about 1 to 10 minutes.
  • ELISA using a microplate coated with 187A5 protein
  • anti-immunity Examples include EIA using a microplate coated with a globulin antibody, and immunoblotting using a nitrocellulose transfer membrane after electrophoresis of a sample containing 187A5 protein.
  • Hypridoma can be obtained from such wells by, for example, limiting dilution. Selection and breeding of Hypridoma is usually performed in a medium for animal cells (eg, RPMI1640) containing 10-20% fetal calf serum with the addition of HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • the clones thus obtained can be transplanted into the abdominal cavity of SCID mice pre-administered with pristane, and ascites containing a high concentration of monoclonal antibody can be collected 10-14 days later and used as a raw material for antibody purification.
  • the clone can be cultured, and the culture can be used as a raw material for antibody purification.
  • the expression of the 187A5 gene is an indicator of the presence of a donomin-producing neuron progenitor cell, preferably a donomin-producing-euron proliferative progenitor cell. Therefore, according to the present invention, by detecting the expression of the 187A5 gene, it is possible to detect or select dominin-producing euron precursor cells, preferably dopamine-producing euron proliferative progenitor cells.
  • the method for "detecting the expression of the 187A5 gene” is not particularly limited as long as it is a method capable of detecting the expression of the 187A5 gene in the test cell sample.
  • the method can be performed by the following steps. :
  • test cell sample is preferably a cell sample that is considered to contain dopamine producing-euron progenitor cells, preferably donomin producing-euron proliferating progenitor cells.
  • dopamine producing-euron progenitor cells preferably donomin producing-euron proliferating progenitor cells.
  • Cells in the ventral region can be used. Cells in the ventral region of the midbrain can be obtained by known methods (Studer, L., et al.
  • fetus preferably human aborted fetus
  • Cells in the ventral region of the patient's own mesencephalon can be used as the test cell sample.
  • cultured cells containing dopamine producing-euron progenitor cells preferably donomin producing-euron proliferating progenitor cells induced in vitro, can be used.
  • In vitro induction of dominomin-producing neuronal progenitor cells or donomin-producing-euron proliferative progenitor cells is induced by known ES cells (Kawasaki et al. Neuron (2000) 28 (l): 31—40, Lee, SH., Et al.
  • the "SDIA method” can be performed by co-culturing ES cells with stromal cell line PA6 in a serum-free medium (Kawasaki et. Al. Neuron. 2000 28 (1): 31- 40).
  • ES cells are cultured in a non-adherent culture dish in the presence of serum to form an embryoid body (EB), followed by EB on the adherent culture dish.
  • EB embryoid body
  • growth factors such as Shh, FGF2, and FGF8 can be added to induce donomin-producing euron progenitor cells (Lee, SH., Et al. Nature Biotech (2000) 18: 675-579 ).
  • the detection polynucleotide is hybridized with a nucleic acid sample (mRNA or a transcription product thereof) using the probe according to the present invention, and a hybridization complex is prepared.
  • the expression of the 187A5 gene in the cell sample can be detected by detecting the body, ie, the nucleotide duplex.
  • the detection of the expression of the 187A5 gene using the hybridization method can be carried out, for example, by the following steps:
  • step (a-l) mRNA prepared from a cell sample considered to contain donomin producing-euron progenitor cells, preferably dopamine producing-euron proliferating progenitors or its mRNA force
  • the target DNA (cDNA) can be contacted with the probe as a polynucleotide from the test cell sample.
  • the probe can be labeled and used.
  • Labels include, for example, radioactivity (eg, 32 P, “C, and 35 S), fluorescence (eg, FIT
  • the detection of the hybridization product can be carried out using a known method such as Northern hybridization, Southern hybridization, or colony hybridization.
  • the cell in which the hybridization complex is detected is a cell expressing the 187A5 gene
  • the cell is designated as a dopaminergic neuron progenitor cell, preferably dopaminergic-euron proliferation It can be determined as a progenitor cell.
  • a nucleic acid sample (mRNA or a transcription product thereof) is amplified by a nucleic acid amplification method using the primer or primer set according to the present invention, and the amplified product is amplified.
  • the expression of the 187A5 gene in the cell sample can be detected.
  • Detection of the expression of the 187A5 gene using a nucleic acid amplification method can be performed, for example, by the following steps:
  • (a-2) a step of performing nucleic acid amplification using a primer or primer set according to the present invention using a polynucleotide derived from a test cell sample as a saddle type;
  • (b-2) A step of detecting the formed amplification product.
  • step (a-2) mRNA prepared from a test sample that is considered to contain donomin producing-euron progenitor cells, preferably dopamine producing-euron proliferating progenitor cells, or its complementary mRNA transcribed DNA (cDNA) can be used as a saddle
  • Amplification products can be detected using nucleic acid amplification methods such as PCR, RT-PCR, real-time PCR, and LAMP.
  • the cell in which the amplification product is detected is a cell expressing the 187A5 gene
  • the cell can be determined as a donomin-producing neuron progenitor cell, preferably a dopamine-producing neuron proliferative progenitor cell.
  • the 187A5 protein serves as an indicator of the presence of a donomin-producing euron progenitor cell, preferably a donomin-producing euron progenitor cell. Therefore, according to the present invention, by detecting the 187A5 protein, donomin producing-euron progenitor cells
  • dopaminergic-euron proliferative progenitor cells can be detected or selected.
  • the method for “detecting 187A5 protein” is not particularly limited as long as it can detect 187A5 protein in a test cell sample, and examples thereof include an antigen-antibody reaction method.
  • the 187A5 protein in the cell sample can be detected by bringing the antibody according to the present invention into contact with the cell sample and detecting the antigen-antibody reaction.
  • Detection of 187A5 protein using an antigen-antibody reaction can be carried out, for example, by the following steps:
  • an antigen-antibody reaction method may be mentioned.
  • the “test cell sample” may be a test cell sample that is considered to contain dopamine producing-euron progenitor cells, preferably donomin producing-euron proliferating progenitor cells.
  • the test cell sample for example, one derived from fetal midbrain can be used. The method for obtaining the test cell sample is as described above.
  • Detection of 187A5 protein using an antigen-antibody reaction method can be performed, for example, by the following steps:
  • test cell sample considered to contain dopamine producing-euron progenitor cells, preferably dopamine producing-euron proliferating progenitor cells, by immunological methods.
  • 187A5 protein can be detected.
  • Immunological methods include cell tissue samples that have been treated appropriately as needed, such as cell separation and extraction procedures, immunohistochemical staining, enzyme immunoassay, Westamplot method, and aggregation methods.
  • a known method such as a competitive method or a sandwich method can be applied.
  • the immunohistochemical staining method can be performed, for example, by a direct method using a labeled antibody or an indirect method using a labeled antibody having a binding property to the antibody.
  • a labeling agent a known labeling substance such as a fluorescent substance, a radioactive substance, an enzyme, a metal, or a dye can be used.
  • the protein derived from the test cell sample is preferably a polypeptide comprising an extracellular region (ie, the N-terminal region)! /.
  • the cell in which the antibody-antigen complex is detected is a cell expressing the 187A5 protein. Therefore, the cell can be determined as a donomin-producing neuron progenitor cell, preferably a dopamine-producing neuron proliferative progenitor cell.
  • dopamine-producing euron progenitor cells preferably donomin-producing euron progenitor cells, have high purity.
  • dopaminergic production-euron progenitor cells preferably dominin production-euron proliferative progenitor cells
  • a donomin production other than the 187A5 gene-euron proliferative progenitor cell marker gene or a protein thereof a post-mitotic donomin production-euron progenitor cell marker gene or a protein thereof
  • a post-mitotic donomin production-euron progenitor cell marker gene or a protein thereof Other than the 187A5 gene, dopamine production-euron progenitor cell marker gene or protein thereof, or mature donomin production-euron cell marker gene or protein thereof.
  • Figure 1 shows the dopamine production-euron-related marker genes that are selectively expressed at each stage.
  • a combination of a dopamine production other than the 187A5 gene and the euron proliferative progenitor cell marker gene or a protein thereof is used in combination, and not only the 187A5 gene but also the 187A5 gene Other dopamine production
  • a neuron proliferative progenitor cell marker gene or its protein it is possible to detect or select a donomin producing-euron progenitor cell, preferably a donomin producing-euron progenitor cell with high accuracy.
  • step (a) as a test cell sample, a cell in which the expression of a dominamine production other than the 187A5 gene-expressed euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein is detected is used. Accordingly, it is possible to detect or select a donomin producing-euron progenitor cell, preferably a donomin producing-euron progenitor cell with high accuracy.
  • the cells in which the reactivity was detected in the step (b) (for example, the cells in which the hybridization complex or the amplification product was detected) expressed the 187A5 gene and produced dominine other than the 187A5 gene.
  • the ability to express the euron proliferative progenitor cell marker gene, or the cell in which the protein is present, so that the cell is detected or selected to proliferate the dopamine-producing euron progenitor cell, preferably a donomin-producing neuron A progenitor cell can be determined with high accuracy.
  • step (b) for cells in which reactivity was detected (for example, cells in which a hybridization complex or an amplification product was detected), (e-1) 187A5 gene Dopamine production-Europnic progenitor cell, preferably dopamine production with high accuracy by carrying out a method further comprising the step of detecting the expression of the euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein. -Euron proliferating progenitor cells can be detected or selected.
  • step (e-1) the cells in which the expression of dopamine other than 187A5 gene-expressing euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein is detected expresses 187A5 gene and other than 187A5 gene.
  • Dopamine production--European proliferative progenitor cell marker gene is expressed and expressed, or the protein thereof is present, so that the detected or selected dopamine production-euron progenitor cell, preferably dopamine production -It can be determined as Euron proliferative progenitor cells with high accuracy.
  • dopamine production after mitotic arrest-Euron progenitor cell marker gene or its protein is used in combination, and 187A5 gene is expressed but dopamine after mitotic arrest.
  • Producing neuron precursor By confirming that the expression of the vesicle marker gene or its protein is not detected, dopaminergic production-euron progenitor cells, preferably dopaminergic production-euron proliferative progenitor cells, can be detected or selected with high accuracy.
  • a dopaminergic neuron progenitor is obtained by using, as a test cell sample, a cell in which expression of dopaminergic neuron progenitor cell marker gene after mitotic arrest or its protein has not been detected.
  • Cells preferably dopaminergic-euron proliferative progenitor cells can be detected or selected with high accuracy.
  • cells in which the reactivity was detected in step (b) express the 187A5 gene, but dopamine production after mitotic arrest- Since the cell does not express the euron progenitor cell marker gene and its protein does not exist, it is detected or selected as a dopamine producing-euron progenitor cell, preferably a donomin producing-euron proliferating progenitor cell. It can be judged with high accuracy.
  • step (b) for cells in which reactivity was detected (for example, cells in which a hybridization complex or an amplification product was detected), (e-2) mitosis Dopaminergic production-Euron progenitor cells, preferably dopaminergic production-Euron proliferation by carrying out a method further comprising the step of detecting post-dopamine production-euron progenitor cell marker gene expression or protein thereof.
  • Progenitor cells can be detected or selected.
  • step (e-2) the cells that do not detect the expression of dopaminergic production-neuron progenitor cell marker gene or its protein after mitotic arrest are
  • a dornomin production-euron progenitor cell marker gene other than the 187A5 gene or its protein is used in combination, and not only the 187A5 gene, Donomin production other than 187A5 gene-by detecting expression of euron progenitor cell marker gene or its protein
  • dopaminergic-Lon progenitor cells preferably dopaminergic-Lon progenitor cells can be detected or selected with high accuracy.
  • step (a) dopamine is produced by using, as a test cell sample, a cell in which the production of a dominamine other than the 187A5 gene-expressed euron progenitor cell marker gene or its protein is detected.
  • Producing neuron progenitor cells, preferably domin-producing proliferating progenitor cells can be detected or selected with high accuracy.
  • the cells in which the reactivity was detected in step (b) (for example, the cells in which the hybridization complex or amplification product was detected) expressed the 187A5 gene and other than the 187A5 gene.
  • the dopamine-producing neuron progenitor cell preferably a dopamine-producing neuron progenitor cell, preferably a dopamine-producing neuron that has been detected or selected
  • a proliferative progenitor cell can be determined with high accuracy.
  • step (b) for cells in which reactivity was detected (for example, cells in which a hybridization complex or an amplification product was detected), (e-3) 187A5 gene Dopamine production-Lon progenitor cell marker gene, or by detecting the expression of the Lon progenitor cell marker gene, or by detecting the protein thereof. Proliferating progenitor cells can be detected or selected.
  • step (e-3) cells in which expression of dopamine other than 187A5 gene-Lon precursor cell marker gene or its protein is detected express 187A5 gene and dopamine production other than 187A5 gene -A Lon progenitor cell marker gene that expresses, or is a cell in which the protein is present, so that the cell is detected or selected-a Lon progenitor cell, preferably a dopaminergic neuron proliferative progenitor cell Can be determined with high accuracy.
  • the detection method characterized by detecting the expression of 187A5 gene the ability to express 187A5 gene in combination with mature dormin production-Lon cell marker gene or its protein is also used. Confirm that the expression of the cell marker gene or its protein is not detected.
  • Oneron progenitor cells preferably dopaminergic-euron proliferative progenitor cells can be detected or selected with high accuracy.
  • step (a) by using, as a test cell sample, a cell in which mature dopamine production-euron cell marker gene expression or its protein was not detected, dopamine production-euron. It is possible to detect or select a progenitor cell, preferably a donomin-producing uron proliferating progenitor cell with high accuracy.
  • the cells in which the reactivity is detected express the 187A5 gene but produce mature dopamine.
  • the donomin producing-euron progenitor cell preferably the dopamine producing-euron proliferating progenitor cell. Can be determined with high accuracy.
  • step (e-4) mature dopamine for the cells in which the reactivity was detected (for example, the cells in which the hybridization complex or the amplification product was detected).
  • Production of a neuron cell marker gene expression or a protein thereof is further detected to detect or select a donamine-producing euron progenitor cell, preferably a dopamine-producing neuron proliferative progenitor cell, with high accuracy. can do.
  • the expression of mature donomin production-euron cell marker gene is expressed in cells where no expression of mature donomin production-euron cell marker gene or its protein is detected. Therefore, the cell is determined with high accuracy as a detected or selected dopamine producing-euron progenitor cell, preferably a donomin producing-euron proliferating progenitor cell. can do.
  • dopamine production other than 187A5 gene-Euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein is used in combination, and not only 187A5 protein but also 187A5 gene Donomin production by detecting the expression of a neuron proliferative progenitor marker gene or its protein, thereby producing donomin production-euron progenitor cells, preferably donomin production-euro Proliferating progenitor cells can be detected or selected with high accuracy.
  • step (c) by using, as a test cell sample, a cell in which the expression of a dominine production other than the 187A5 gene-euron proliferation progenitor cell marker gene or its protein is detected, It is possible to detect or select a donomin producing-euron progenitor cell, preferably a donomin producing-euron progenitor cell with high accuracy.
  • the cells in which the reactivity was detected in the step (d) (for example, the cells in which the antigen-antibody complex was detected) existed in the presence of 187A5 protein and dopaminergic progenitor cells other than the 187A5 gene.
  • the cell is detected or selected as a dopamine producing-euron progenitor cell, preferably a dopamine producing-euron proliferating progenitor cell.
  • the accuracy can be determined.
  • step (d) for cells in which the reactivity was detected (for example, cells in which the antigen-antibody complex was detected), (e-l) production of donomin other than the 187A5 gene-euron
  • a method further comprising the step of detecting the expression of a proliferative progenitor cell marker gene or its protein highly accurate detection of dopamine-producing euron progenitor cells, preferably dopamine-producing neuron proliferative progenitor cells, is achieved. Or you can choose.
  • the expression of dominine other than the 187A5 gene-euron proliferation progenitor cell marker gene or the cell in which the protein is detected contains 1 87A5 protein and other than the 187A5 gene.
  • Donomin production-Euron proliferative progenitor cell marker gene is expressed and expressed, or the protein is present, so that the cell is detected or selected Dominine production-Euron progenitor cell, preferably Dopamine production-Euron proliferative progenitor cells can be determined with high accuracy.
  • dorminamine production-euron progenitor cell marker gene or its protein is used in combination, and 187A5 protein is expressed, but mitotic arrest after dopamine production -Euron progenitor cells
  • Dopamine production-Euron progenitor cells preferably dopamine production-before Euron growth, by confirming that marker gene expression or its protein is not detected It is possible to detect or select the tumor cells with high accuracy.
  • a dopaminergic neuron progenitor is obtained by using, as a test cell sample, a cell in which expression of dopaminergic neuron progenitor cell marker gene after mitotic arrest or its protein has not been detected.
  • Cells preferably dopaminergic-euron proliferative progenitor cells can be detected or selected with high accuracy.
  • cells in which the reactivity was detected in step (d) were detected as dopaminergic-neuron progenitor cell markers after mitotic arrest in which 187A5 protein is present. Since the gene is not expressed and the protein is not present, the cell is determined with high accuracy as the detected or selected donomin producing-euron progenitor cell, preferably dopamine producing-euron proliferating progenitor cell. can do
  • step (d) for cells in which reactivity was detected (for example, cells in which an antigen-antibody complex was detected), (e-2) dopamine production after mitosis-euron precursor
  • step (e-2) dopamine production after mitosis-euron precursor
  • step (e-2) dopamine production after mitotic arrest-expression of the euron progenitor cell marker gene or its protein is not detected, the cell is in the presence of 187A5 protein, dopamine production after mitotic arrest- Since the euron progenitor cell marker gene is not expressed and the protein does not exist, the dopamine production-euron progenitor cell, preferably donomin production-euron proliferative progenitor cell detected or selected, is selected. And can be determined with high accuracy.
  • a dopaminergic neuron progenitor cell marker gene other than 187A5 gene or its protein is used in combination, and not only 187A5 protein but also other than 187A5 gene
  • detecting the expression of the donomin-producing euron progenitor marker gene or its protein it is possible to detect or select dopamine-producing euron progenitor cells, preferably dopamine-producing euron progenitor progenitors with high accuracy. it can.
  • a dopaminergic neuron can be obtained by using, as a test cell sample, a cell in which a dominamine production-euron progenitor cell marker gene other than the 187A5 gene or its protein is detected.
  • Progenitor cells preferably dopamine producing-euron proliferating progenitor cells can be detected or selected with high accuracy.
  • the cells in which the reactivity was detected in step (d) (for example, the cells in which the antigen-antibody complex was detected) contained 187A5 protein and produced donomin other than the 187A5 gene-euron progenitor cells.
  • the marker gene is expressed or is a cell in which the protein is present, the cell is detected with high accuracy with the detected or selected dopamine producing-euron progenitor cell, preferably a dopamine producing neuron proliferating progenitor cell. Can be judged.
  • step (d) for cells in which reactivity was detected (for example, cells in which an antigen-antibody complex was detected), (e-3) production of donomin other than the 187A5 gene-euron
  • step (e) for cells in which reactivity was detected (for example, cells in which an antigen-antibody complex was detected), (e-3) production of donomin other than the 187A5 gene-euron
  • dopaminergic production-euron progenitor cells preferably doromin production-euron proliferative progenitor cells are detected with high accuracy. Or you can choose.
  • step (e-3) the cells in which the expression of the dornomin production other than 187A5 gene-euron progenitor cell marker gene or its protein is detected and the 187A5 protein is present and the dono other than 187A5 gene are present.
  • the detection method characterized by detecting 187A5 protein the mature dopamine production-Euron cell marker gene or a protein thereof is used in combination, and 187A5 protein is expressed. Mature dopamine production-Euron cell marker gene By confirming that the expression or its protein is not detected, it is possible to detect or select dopaminergic-neuron progenitor cells, preferably dopaminergic progenitor-euron proliferative progenitor cells, with high accuracy.
  • step (c) as a test cell sample, mature dopamine production-euro
  • dopamine-producing euron progenitor cells preferably dormin-producing europlon progenitor cells with high accuracy, by using cells that do not detect the expression of the human cell marker gene or its protein be able to.
  • step (d) the cells in which the reactivity was detected (for example, cells in which the antigen-antibody complex was detected).
  • 187A5 protein is a force that does not express mature dopaminergic neuron cell marker gene, nor is the protein present, so the cell is detected or selected dopaminergic neuron progenitor cell, preferably Dopaminergic neuron proliferative progenitor cells can be determined with high accuracy.
  • step (d) for cells in which the reactivity was detected (for example, cells in which the antigen-antibody complex was detected), (e-4) mature dopamine production-euron cell marker gene
  • the method further comprising the step of detecting the expression of the child or its protein, it is possible to detect or select the dopamine producing-euron progenitor cells, preferably the dopamine producing-euron proliferating progenitor cells with high accuracy. it can.
  • step (e-4) cells in which mature dorminamine production-euron cell marker gene expression or its protein is not detected are present in the presence of 187A5 protein mature dopamine production-euron cells Since the marker gene is not expressed and the protein is not present, the cell is treated with the detected or selected donomin producing-euron progenitor cell, preferably dopamine producing-euron proliferating progenitor cell. Can be determined.
  • Donomin production other than 187A5 gene-Euron proliferative progenitor cell marker gene or protein thereof means "Donomin production other than 187A5 gene-Euron proliferative progenitor cell marker gene” or donomin production other than ⁇ 187 ⁇ 5 protein- "Euron proliferative progenitor cell marker protein”.
  • Dominine production other than 187A5 gene-Euron proliferative progenitor cell marker gene refers to production of dominomin other than the 187A5 gene expressed in the ventral ventricular region (VZ region) of the midbrain- Examples include the euron proliferative progenitor cell marker gene, such as the Lrp4 gene, the Nato3 gene, the Msxl gene, the Msx2 gene, and the Mashl gene.
  • the Lrp4 gene is described in WO2004Z065599. Nato3
  • the gene is described in WO2007Z021003.
  • the Msxl gene and the Msx2 gene are described in WO2007Z021004.
  • M ashl remains is a child, Kele J, Simplicio N, Fern AL, Mira H, Guillemot F, Arena s E, Ang SL. Neurogenin 2 is required for the development of ventral midbrain dopa minergic neurons. 2006 Feb; 133 (3): 495-505.
  • the detection of a donomin production-euron growth progenitor cell marker gene other than the 187A5 gene is not particularly limited as long as it is performed using a method capable of detecting the expression of a known gene. Examples include a seed method and a nucleic acid amplification method.
  • Dopamine production other than 187A5 protein-Euron proliferative progenitor cell marker protein refers to dopamine production other than 187A5 protein expressed in the midbrain ventricular ventricular region (VZ region)-Euron growth Examples include progenitor cell marker proteins, and preferably include proteins that are detected only in donomin-producing / euron proliferating progenitor cells.
  • proteins of Lrp4 gene include proteins of Lrp4 gene, Nato3 gene, Msxl gene, Msx2 gene, and Mashl gene.
  • the detection of dopamine production other than 187A5 protein-euron proliferative progenitor cell marker protein is not particularly limited as long as it is performed using a method capable of detecting the expression of a known protein.
  • a method capable of detecting the expression of a known protein for example, the antigen-antibody reaction described above Law.
  • the "post-mitotic dopaminergic neuron progenitor cell marker gene or its protein” includes a gene or its protein that is expressed in the midbrain ventral mantle layer (ML region), For example, Nurrl gene, Enl gene, En2 gene, Ptx3 gene, TH gene can be mentioned.
  • ML region midbrain ventral mantle layer
  • VZ region ventral ventricular region
  • the Enl gene is described in J. Neurosci. 2001 21 (9): 3126-34.
  • the En2 gene is described in J. Neurosci. 2001 21 (9): 3126-34.
  • the Ptx3 gene is described in Pro Natl. Acad. Sci. 1997 94: 13305-10.
  • the TH gene is described in Science. 1997 11; 276 (5310): 248-50. 65B13 gene [Katsu, Tetsuma, WO2004 / 038018, published here!
  • the detection of the dopaminergic neuron progenitor cell marker gene or its protein after mitotic arrest is not particularly limited as long as it is performed using a known gene or a method capable of detecting the expression of the protein. Examples include a hybridization method, a nucleic acid amplification method, and an antigen-antibody reaction method.
  • Dominine-producing neuron progenitor cell marker gene other than 187 ⁇ 5 gene or its protein refers to "Dopamine production other than 187-5 gene-Euron progenitor marker gene” or "Donomin production other than 187 ⁇ 5 protein-Euron progenitor cell” It's a “one-on-one protein”.
  • Donomin production other than 187-5 gene-euron progenitor cell marker gene includes donomin production-euron progenitor cell marker gene other than 187A5 gene expressed in the midbrain, for example, The Lmxla gene can be mentioned.
  • the detection of a donomin-producing-euron progenitor cell marker gene other than the 187A5 gene is not particularly limited as long as it is performed using a method capable of detecting the expression of a known gene.
  • the hybridizer described above is used. Examples include the Chillon method and nucleic acid amplification method.
  • Donomin production other than 187A5 protein-euron progenitor cell marker protein includes dormin production other than 187A5 protein expressed in the midbrain-euron progenitor cell marker protein.
  • An example of such a protein is a protein of Lmxla gene.
  • the detection of dopamine production other than 187A5 protein-euron progenitor cell marker protein is not particularly limited as long as it is performed using a method capable of detecting the expression of a known protein.
  • the antigen-antibody reaction method described above is used. Can be mentioned.
  • “Mature donomin production-euron cell marker gene” includes, for example, the DAT gene.
  • the DAT gene is described in Development 2003 131: 1145-55.
  • Mature donomin production-detection of euron cell marker gene or protein thereof is performed using a method capable of detecting expression of a known gene or protein thereof.
  • the method is not particularly limited, and examples thereof include the above hybridization method, nucleic acid amplification method, and antigen-antibody reaction method.
  • a gene construct in which a promoter of the 187A5 gene and a single gene are operably linked is used in combination, and not only the expression of the 187A5 gene or its protein,
  • dopaminergic production-euron progenitor cells preferably dopaminergic production-euron proliferation precursor cells, can be detected or selected with higher accuracy.
  • Detection of dopaminergic-euron progenitor cells using a vector comprising a gene construct in which a promoter of 187A5 gene and a marker gene are operably linked is carried out according to, for example, JP-A-2002-51775 can do.
  • Donomin production-187A5 gene expressed in euron progenitor cells By introducing a marker gene that can be detected under the control of the promoter Z enhancer into each cell of the cell population, and detecting the expression of the marker gene, Dopaminergic neuron progenitor cells can be detected.
  • a test cell sample is transformed with a vector comprising a gene construct in which a promoter of a gene according to the present invention and a marker gene are operably linked, and the marker gene in the test cell sample is transformed.
  • dopaminergic neuron progenitor cells can be detected or selected.
  • the cell in which the expression of the marker gene is detected can be determined with high accuracy as the detected or selected dopaminergic neuron progenitor cell, preferably a proliferative progenitor cell of donaminergic neuron.
  • examples of the nucleotide sequence of the "promoter of the gene according to the present invention” include the nucleotide sequence of the promoter portion obtained by analysis of the expression region of the 187A5 gene described later. Including its modified sequences It is.
  • the "marker gene” may be any marker gene that can be detected under the control of the promoter 187A5 gene promoter, such as GFP.
  • the "gene construct” is a structure in which the 187A5 gene is linked to the upstream or downstream of the marker gene under the control of the expression control sequence of the 187A5 gene (including promoter, enhancer, etc.). You may have.
  • a gene encoding a marker can be knocked into the 187A5 locus.
  • a construct having a structure schematically described in FIGS. 2 to 4 in FIG. 15 can be exemplified.
  • a detection kit for carrying out the detection method according to the present invention is provided.
  • the first embodiment of the detection kit according to the present invention includes a detection kit for carrying out the first embodiment of the detection method according to the present invention. Specifically, the expression of the 187A5 gene is detected. And a kit comprising at least the probe according to the present invention. This probe may be labeled. This detection kit detects the expression of the 187A5 gene by a hybrid formation method. Accordingly, the detection kit of the first embodiment may optionally include various reagents for carrying out the hybridization method, such as substrate compounds used for detection of the label, hybridization buffer, instructions, and Z or Can further include appliances and the like.
  • detection kits for highly accurate detection include the expression of dominamine production other than the 187A5 gene-euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein, and the dopaminergic neuron progenitor cell marker gene after mitotic arrest. Expression or protein thereof, dopamine production other than 187A5 gene-expression of euron progenitor cell marker gene or protein thereof, or mature donomin production-euron cell marker probe, primer, primer capable of detecting expression of one gene or protein thereof A kit further comprising a set or antibody. These probes and primers The primer set or antibody may be labeled.
  • This detection kit uses any of the hybridization, nucleic acid amplification, and antigen-antibody reaction methods to produce dopamine other than the 187A5 gene-expression of the proliferative progenitor cell marker gene or its protein, and dopamine production after mitotic arrest. -Expression of Lon progenitor cell marker gene or protein thereof, dopamine production other than 187A5 gene-Expression of Lon progenitor cell marker gene or protein thereof, or mature dopamine production-Expression of Lon cell marker gene or protein thereof are further detected.
  • the second embodiment of the detection kit according to the present invention includes a detection kit for carrying out the second embodiment of the detection method according to the present invention. Specifically, the expression of the 187A5 gene is detected. And a kit comprising at least a primer according to the present invention or a primer set according to the present invention.
  • This detection kit detects the expression of the 187A5 gene by nucleic acid amplification. Therefore, the detection kit according to the second aspect includes, as desired, various reagents for carrying out the nucleic acid amplification method, such as a buffer, an internal standard indicating that the amplification reaction can proceed normally, instructions, and Z or It can further include appliances and the like.
  • detection kits for highly accurate detection include the expression of domin production-Lon proliferative progenitor cell marker genes other than the 187A5 gene or its protein, and expression of dopaminergic neuron progenitor cell marker genes after mitosis Or its protein, dopamine production other than 187A5 gene-expression of Lon progenitor cell marker gene or protein thereof, or mature domin production-expression of Lon cell marker gene or probe capable of detecting the protein, primer primer set or A kit further comprising an antibody can be mentioned. These probes, primer primer sets or antibodies may be labeled.
  • This detection kit uses any of the hybridization, nucleic acid amplification, and antigen-antibody reaction methods to produce dopamine other than the 187A5 gene-expression of the proliferative progenitor cell marker gene or its protein, and dopamine production after mitotic arrest.
  • -Ron progenitor cell marker gene expression or its protein dopamine production other than 187A5 gene-Ron progenitor cell marker gene expression or its protein, or mature dopamine production- The expression of the euron cell marker gene or its protein is further detected.
  • a third embodiment of the detection kit according to the present invention includes a detection kit for carrying out the third embodiment of the detection method according to the present invention, specifically, for detecting the 187A5 protein.
  • a kit comprising at least the antibody according to the present invention can be mentioned. This antibody may be labeled.
  • This detection kit detects the expression of the 187A5 protein by detecting the antigen-antibody reaction. Therefore, the detection kit of the third embodiment is used in various reagents for carrying out an antigen-antibody reaction, for example, secondary antibodies used in ELISA methods, coloring reagents, buffers, instructions, and Z or instruments, if desired. Can be further included.
  • detection kits for highly accurate detection include the expression of dominamine production other than the 187A5 gene-euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein, and post-mitotic dopaminergic neuron progenitor cell marker gene. Expression or protein thereof, dopamine production other than 187A5 gene-expression of euron progenitor cell marker gene or protein thereof, or mature donomin production-euron cell marker probe, primer, primer capable of detecting expression of one gene or protein thereof A kit further comprising a set or antibody. These probes, primers, primer sets or antibodies may be labeled.
  • This detection kit can be used to produce dopamine other than the 187A 5 gene-expression of the euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein, dopamine production after mitotic arrest, by any of the hybridization, nucleic acid amplification, and antigen-antibody reaction methods. -Expression of euron progenitor cell marker gene or protein thereof, dopamine production other than 187A5 gene-Expression of euron progenitor cell marker gene or protein thereof, or mature dopamine production-Expression of euron cell marker gene or protein thereof are further detected.
  • the present invention further comprises a vector comprising a gene construct in which a promoter of 187A5 gene and a marker gene are operably linked.
  • a vector comprising a gene construct in which a promoter of 187A5 gene and a marker gene are operably linked. Examples include the detection kit according to the first to third aspects according to the invention.
  • Detection reagent According to the present invention, a detection reagent for carrying out the detection method according to the present invention is provided.
  • the first embodiment of the detection reagent according to the present invention includes a detection reagent for carrying out the first embodiment of the detection method according to the present invention. Specifically, the expression of the 187 A5 gene is detected. And a detection reagent comprising at least the probe according to the present invention. This probe may be labeled. This detection reagent detects the expression of the 187A5 gene by hybridization. Therefore, the detection reagent of the first embodiment may be used in various reagents for carrying out the hybridization method, for example, a substrate compound used for detection of a label, a hybridization buffer, instructions, and a reagent if desired. And Z or a device.
  • detection reagents for highly accurate detection include dopamine production other than the 187A5 gene-expression of the euron proliferative progenitor cell marker gene, or its protein, and post-mitotic dopaminergic neuron progenitor cell marker gene. Expression or its protein, Dopamine production other than 187A5 gene-Euron progenitor cell marker gene expression or its protein, or mature dopamine production-Euron cell marker gene expression or probe, primer, primer capable of detecting the protein Examples include a detection reagent further comprising a set or an antibody. These probes, primers, primer sets or antibodies may be labeled. This detection reagent can be produced by any of hybridization, nucleic acid amplification, and antigen-antibody reaction methods.
  • the second embodiment of the detection reagent according to the present invention includes a detection reagent for carrying out the second embodiment of the detection method according to the present invention. Specifically, the expression of the 187A5 gene is detected. And a detection reagent comprising at least the primer according to the present invention or the primer set according to the present invention.
  • This detection reagent is a nucleic acid 187A5 gene expression is detected by amplification. Therefore, the detection reagent of the second aspect includes various reagents for carrying out the nucleic acid amplification method, for example, a buffer, an internal standard indicating that the amplification reaction can proceed normally, and a Z or It can further include appliances and the like.
  • detection reagents for highly accurate detection include dopamine production other than the 187A5 gene-expression of the euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein, and the dopaminergic neuron progenitor cell marker gene after mitotic arrest. Expression or its protein, Dopamine production other than 187A5 gene-Euron progenitor cell marker gene expression or its protein, or mature dopamine production-Euron cell marker gene expression or probe, primer, primer capable of detecting the protein Examples include a detection reagent further comprising a set or an antibody. These probes, primers, primer sets or antibodies may be labeled. This detection reagent can be produced by any of hybridization, nucleic acid amplification, and antigen-antibody reaction methods.
  • the third embodiment of the detection reagent according to the present invention includes a detection reagent for carrying out the third embodiment of the detection method according to the present invention. Specifically, the 187A5 protein is detected. And a detection reagent comprising at least the antibody according to the present invention. This antibody may be labeled. This detection reagent detects the expression of 187A5 protein by detecting the antigen-antibody reaction. Therefore, the detection reagent of the third embodiment is various reagents for carrying out an antigen-antibody reaction, for example, a secondary antibody used in an ELISA method, a coloring reagent, a buffer solution, instructions, Z, or an instrument, if desired. Can further be included.
  • detection reagents for highly accurate detection include dopamine production other than the 187A5 gene-expression of the euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein. Expression of dopaminergic neuron progenitor marker gene or its protein after mitotic arrest, dopamine production other than 187A5 gene-expression of Ron progenitor cell marker gene or its protein, or mature dopamine production-expression of euron cell marker gene Examples include a detection reagent further comprising a probe, primer, primer set or antibody capable of detecting the protein. These probes, primers, primer sets or antibodies may be labeled. This detection reagent can be obtained by any of hybridization, nucleic acid amplification, and antigen-antibody reaction methods.
  • the detection reagent for performing highly accurate detection further includes a vector comprising a gene construct in which a promoter of the 187A5 gene and a marker gene are operably linked.
  • Examples include the detection reagent according to the first to third aspects according to the invention.
  • the detection method according to the present invention can be applied to screening for a substance effective for inducing differentiation into dopaminergic progenitor cells. That is, by determining whether or not differentiation was induced in a dopamine producing-Lon progenitor cell, preferably a dopamine producing-Lon proliferative progenitor cell, by adding a candidate substance, using the expression of the 187A5 gene or its protein as an indicator. In addition, it is possible to screen a substance effective for inducing domin production into Ron progenitor cells.
  • a screening method for a substance effective for inducing differentiation into dopaminergic neuron progenitor cells comprising the following steps:
  • the cell that can be divided into cells that can be divided into dopamine-producing Ron progenitor cells is preferably a cell that can be divided into dopamine-producing Ron progenitor cells,
  • the cultured cell force including neural progenitor cells differentiated from embryonic midbrain or ES cells can be collected.
  • contact with a test substance means, for example, a cell that can be divided into dopamine producing-euron progenitor cells, preferably a dopamine producing-lon proliferating progenitor cell. It can be performed by adding a test substance to cultured cells containing the obtained cells.
  • Test substances include synthetic low molecular weight compounds, proteins, synthetic peptides, purified or partially purified polypeptides, antibodies, bacterial release substances (including bacterial metabolites), nucleic acids (antisense, ribozyme, RNAi, etc.) Preferably, it is a compound or a salt thereof, or a solvate thereof (for example, a hydrate), but is not limited thereto.
  • the “test substance” may be a novel substance or a known substance.
  • steps (a-1) and (b-1) are used for the detection using the nucleic acid amplification method!
  • steps (a-2) and (b-2) using steps (c-1) and (d-1) respectively for detection using an antigen-antibody reaction method, expression of 187A5 gene or The protein can be detected.
  • the substance is detected as a dominogenic-Lon precursor. It can be determined that the substance is effective for inducing differentiation into cells, preferably dopaminergic progenitor-proliferating progenitor cells.
  • the substance identified by the screening method according to the present invention can be used as an effective substance for inducing differentiation into domin-producing Ron progenitor cells, preferably dopaminergic neuron proliferative progenitor cells.
  • a dopaminergic neuron progenitor cell further comprising the following steps: Methods are provided for screening for substances that are effective in inducing differentiation into:
  • (iii 1) a step of detecting the expression of a dominamine production-euron proliferative progenitor cell marker gene other than the 187A5 gene or a protein thereof in the cells after contact with the test substance.
  • step (ii) expression of 187A5 gene or its protein is detected, and in step (iii-1), dormin production other than 187A5 gene-expression of euron proliferative progenitor cell marker gene
  • the substance is determined with high accuracy as an effective substance for induction of domino-producing euron progenitor cells, preferably dopamine-producing euron progenitor cells. be able to.
  • the step (iii-1) may be performed before or after the step (ii) as long as it is performed after the step (i).
  • a screening method for a substance effective for inducing differentiation into dopaminergic neuron progenitor cells further comprising the following steps:
  • (iii 2) a step of detecting expression of dopamine producing neuron progenitor cell marker gene or protein thereof after mitotic arrest in the cells after contact with the test substance.
  • step (ii) the expression of the 187A5 gene or its protein was detected, but in step (iii 2), the ability to detect dopamine production-euron progenitor cell marker gene or its protein after mitotic arrest was detected.
  • the substance can be determined with high accuracy as an effective substance for inducing differentiation into dopaminergic progenitor cells, preferably donominergic progenitor cells.
  • Step (iii 2) may be performed before or after step (ii) as long as it is performed after step (i).
  • Dopamine production other than 187A5 gene-Euron proliferative progenitor cell marker gene or its protein refers to "Dominamine production other than 187A5 gene-Euron proliferative progenitor cell marker gene” or donomin production other than ⁇ 187 ⁇ 5 protein-Euron “Proliferative progenitor cell marker protein”.
  • Dominine production other than 187A5 gene-Euron proliferative progenitor cell marker gene refers to production of dominomin other than the 187A5 gene expressed in the ventral ventricular region (VZ region) of the midbrain- Examples include the euron proliferative progenitor cell marker gene, such as the Lrp4 gene, the Nato3 gene, the Msxl gene, the Msx2 gene, and the Mashl gene.
  • the detection of a dopaminergic prolonger progenitor cell marker gene other than the 187A5 gene is not particularly limited as long as it is carried out using a method capable of detecting the expression of a known gene.
  • the above hybridizer Examples include the Chillon method and nucleic acid amplification method.
  • Dopamine production other than 187A5 protein-Lon proliferative progenitor cell marker protein includes dopamine production other than 187A5 protein expressed in the ventral ventricular region (VZ region) of the midbrain-Lon proliferation A progenitor cell marker protein is preferable, and a protein that is detected only in domin producing-Lon proliferative progenitor cells is preferable.
  • proteins include the Lrp4 gene, the Nato3 gene, and the Msxl gene.
  • Examples include Msx2 gene and Mashl gene protein.
  • the detection of dopamine production other than 187A5 protein-Lon proliferative progenitor cell marker protein is not particularly limited as long as it is performed using a method capable of detecting the expression of a known protein.
  • a method capable of detecting the expression of a known protein for example, the antigen-antibody reaction described above Law.
  • Post-mitotic dopaminergic neuron progenitor cell marker gene or protein thereof includes a gene or its protein expressed in the midbrain ventral mantle layer (ML region), For example, Nurrl gene, Enl gene, En2 gene, Ptx3 gene TH gene can be mentioned.
  • ML region midbrain ventral mantle layer
  • VZ region ventral ventricular region
  • the detection of a dopaminergic neuron progenitor cell marker gene or its protein after mitotic arrest is not particularly limited as long as it is performed using a known gene or a method capable of detecting the expression of the protein. Examples include a hybridization method, a nucleic acid amplification method, and an antigen-antibody reaction method.
  • a method for screening a substance effective for inducing differentiation into dopaminergic neuron progenitor cells further comprising the following steps:
  • the cell after contact with the test substance is transformed with a vector comprising a gene construct in which the promoter of the 187A5 gene and the marker gene are operably linked, and the marker gene in the cell is transformed. Detecting the expression of.
  • step (ii) the expression of the 187A5 gene or its protein is detected, and
  • step (iii-3) when the expression of the marker gene is detected, the substance is effectively used for induction of doimin-producing euron progenitor cells, preferably dopamine-producing euron proliferative progenitor cells.
  • a substance can be determined with high accuracy.
  • Step (iii-3) may be performed before or after step (ii) as long as it is performed after step (i). Furthermore, it may be performed after step (iii-1) or step (iii-2).
  • the detection method according to the present invention can detect or select dopaminergic-euron progenitor cells.
  • Dopaminergic-euron progenitor cells can be used to treat Parkinson's disease. Therefore, dopaminergic neuron progenitor cells used for the treatment of Parkinson's disease can be produced from the detected or selected dopaminergic-euron progenitor cells using 187A5 gene expression or its protein as an index.
  • the dopamine producing-euron progenitor cell is preferably a dopamine producing-euron proliferating progenitor cell.
  • a therapeutic agent for Parkinson's disease comprising dopaminergic-euron progenitor cells, preferably donomin-producing euron proliferative progenitor cells detected or selected by the detection method according to the present invention.
  • dopamine producing-euron progenitor cells preferably donomin producing-euron proliferation, detected or selected by the detection method according to the present invention for the manufacture of a medicament for use in the treatment of Parkinson's disease Use of progenitor cells is provided.
  • dopaminergic progenitor-euron progenitor cells preferably donomin progenitor-euron proliferative progenitor cells detected or selected by the detection method according to the present invention
  • a method of treating Parkinson's disease comprises the step of transplanting into a mammalian brain.
  • detection includes “identification”. “Detection” includes not only the case where the target cell is identified as a specific type of cell, but also the case where the target cell is not identified as a specific type of cell.
  • Dolphin production-Lrp4 gene strength has been identified as a cell surface marker for isolating Lon proliferative progenitor cells (WO2004 / 065599), and anti-Lrp4 antibody is used! It is possible to separate. Therefore, the isolation of genes selective for dopaminergic progenitor-proliferating progenitor cells and their sequence analysis are described below.
  • rat 13.5 day embryonic mesencephalon ventral and posterior cerebral ventral side were dispersed using accumax (emestetanosystems), then fixed and not permeabilized, anti-Lrp4 monoclonal antibody (source: Hypridoma (Accession Number FERM BP—10315 and Accession Number FERM BP—10316), 1Z10 dilution, 1% urine fetal serum (JRH), 5% rat fetal serum (JRH), lm M EDTA (Invitrogen) / PBS (Sigma )) For 30 minutes at 4 ° C.
  • Amplification conditions consisted of incubation at 72 ° C for 5 minutes, then 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and And 20 minutes of reaction at 72 ° C for 2 minutes, and finally incubation at 72 ° C for 2 minutes.
  • ad2S CAGCTCCACAACCTACATCATTCCGT (SEQ ID NO: 29)
  • ad2A ACGGAATGATGT (SEQ ID NO: 30)
  • PCR was performed in the following reaction system using 4 ng, 0.4 ng, and 0.04 ng of cDNA corresponding to the amplified cDNA in a saddle type.
  • Lrp4 TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG (SEQ ID NO: 31)
  • Lmxla TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG (SEQ ID NO: 33)
  • the Lrp4 gene has the same level of expression in both midbrain Lrp4-positive cells and hindbrain Lrp4-positive cells.
  • Dopamine production-euron and dopamine production- It was confirmed that the Lmxla gene, which is a marker gene for a single progenitor cell (WO2005Z052190), was strongly expressed only in midbrain Lrp4-positive cells (Fig. 3).
  • midbrain L rp4 positive cells are thought to include dopaminergic-euron proliferative progenitors and not hindbrain Lrp4 positive cells.
  • 187A5 ACCAGGAAGGACAATGCCATTCGTCC (SEQ ID NO: 35)
  • cDNA was amplified from human fetal brain mRNA (Clontech) using 5, RACE core kit (TAKARA), and self-ligation was performed. The following primer was used to amplify the 5 ′ end of the cDNA, and the resulting fragment was cloned into pCRII (Invitrogen) and sequenced.
  • PCR amplification was performed in 35 cycles for primary PCR, and secondary PCR was amplified in 20 cycles using a 10-fold diluted primary PCR product in a cage.
  • cDNA was amplified using RNA PCR kit (TAKARA), and PCR was performed using this in a saddle type.
  • TAKARA RNA PCR kit
  • the remaining region was prepared by combining the following primers F12 and R5, and F13 and R4.
  • Human 187A5 F12 CTACCTGTGAGCTACCACATCCTCAG (SEQ ID NO: 44)
  • Human 187A5 R5 TTCTCTGCCAGGATGGAGTCAGACAG (SEQ ID NO: 45)
  • Human 187A5 F13 ACTGGCAGTTCGACATCACTCACCTG (SEQ ID NO: 46)
  • Human 187A5 R4 TGCAGAGG
  • Example 21 Expression analysis of 187A5 gene by in situ hybridization
  • the following protocol was used for in situ hybridization.
  • Expression analysis of 187A5 and Lrp4 mRNA was performed by dialysis.
  • a DIG probe was prepared by the following method.
  • mice obtained from SLC 12. Excise the midbrain hindbrain region from the 5th day embryo, prepare total RNA using RNeasy mini kit (Qiagen), and use cDNA synthesis kit (TAKARA) Strand cDNA was synthesized. Next, 187A5 and Lrp4 cDNA were amplified in the following reaction system using the synthesized cDNA.
  • Amplification conditions were 94 ° C for 5 minutes, then 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and
  • reaction was carried out for 35 cycles at 72 ° C for 2 minutes, and finally incubated at 72 ° C for 2 minutes.
  • Lrp4 GACAGTGAACCTTTGGTCACTGATGG (SEQ ID NO: 50)
  • the amplified cDNA fragment was cloned into pCRII (Invitrogen), and this was used in a cage form to synthesize a DIG probe in the following reaction system (all reagents purchased from Roche).
  • RNA polymerase (T7 or SP6) 2 ⁇ ⁇
  • mouse 12.5 day embryos were removed and fixed with 4% PFA (WAKO) ZPBS for 2 hours at 4 ° C, and then with 20% sucrose (WAKO) ZPBS at 4 ° C. It was replaced with ⁇ and embedded in OCT (Sakura Seiki).
  • a section having a thickness of 12 m was prepared, dried on a slide glass, and then fixed again with 4% PFA at room temperature for 30 minutes. After washing with PBS, hybridization (1 g / ml DIG RNA probe, 50% formamide (Nacalai tex), 5xSSC, 1% SDS, 50 ⁇ g / ml yeast RNA (Sigma), to 50 gZml 68. C for 40 hours.
  • wash (50% formamide, 5xSSC, 1% SDS) at 68 ° C
  • Further washing (50% formamide, 5xSSC) was performed at 68 ° C.
  • blocking (blocking agent: Roche) was performed.
  • Alkaline phosphatase-labeled anti-DIG antibody (DAKO) was reacted at 4 ° C, washed (lxTBST, 2 mM levamisole), and then developed with NBT / BCIP (DAKO) as a substrate.
  • the 187A5 mRNA in the 12.5 day embryo which is the time when donomin production-euron occurs, is the most ventral brain of the midbrain where Lrp4-positive dopamine production-euron progenitor cells are present. It was revealed that it was selectively expressed in the ventricular zone (VZ) and the backmost roof plate region of the midbrain (Fig. 4). On the other hand, no expression was observed on the ventral side of the hindbrain, and it was confirmed that it was not expressed on hindbrain floor plate cells positive for Lrp4.
  • 187A5 mRNA is selectively expressed in dopaminergic-euron proliferative progenitor cells.
  • Cells that simultaneously express both Lrp4 and 187A5 genes are limited to dopamine-producing euron proliferative progenitor cells in the ventral ventricular region of the midbrain. Donomin production-Euron proliferative progenitor cells could be identified.
  • Example 31 Doronian cattle induced to differentiate from ES cells. Current state of 187A5 transmission in neurons.
  • CCE ES cells
  • PCR was carried out in the following reaction system using 4 ng, 0.4 ng, and 0.04 ng of the cDNA corresponding to the amplified cDNA in the vertical form, respectively.
  • Lmxla TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG (SEQ ID NO: 33)
  • the 187A5 gene was expressed when differentiation was induced by any method, and particularly strongly expressed in Lr p4-positive cells (Figs. 5 and 6). Therefore, 187A5 mRNA can be used only in cells derived from mouse and rat fetal mesencephalon, and in differentiation-induced cells using the SDIA method and 5-stage method! It was revealed that it was expressed in cells. In other words, the 187A5 gene is a useful marker for discriminating dominamine-producing euron progenitor cells that are induced in vitro from ES cells in vitro only with dopaminergic neuron progenitor cells derived from fetal midbrain. It became clear that there was.
  • the 187A5 protein has one sequence that appears to be a transmembrane region. If the 187A5 protein is expressed on the cell surface! / It is expected to be useful for the preparation of transplanted materials such as Parkinson's disease, because it becomes possible to isolate 187A5-positive living cells by cytometry. Therefore, the intracellular localization of 187A5 protein was examined.
  • a construct was prepared by ligating the region encoding the amino acid up to the 45th amino acid with the N-terminal force and a secreted alkaline phosphatase cDNA lacking the signal sequence, and transfected into 293E cells. The culture supernatant on the 4th day of culture was collected, and alkaline phosphatase activity was measured using Aurora kit (ICN) (FIG. 7).
  • ICN Aurora kit
  • a construct in which a HA tag was added to the C-terminus of 187A5 was transfected into NS20Y cells. Two days later, after washing the cells twice with chilled PBS, 0.5 mg Zml of EZ—li nk Sulfo-NHS-SS-Biotin (PIERCE) (PBS + ImM CaCl 0.5 mM M 5 ml of (dissolved in gCl) was added and reacted at room temperature for 30 minutes. Wash twice with cold PBS
  • a lysis buffer 1% SDS, 10 mM Tris-CI, lOOmM NaCl, ImM EDTA 600 1 and subjected to sonication. After centrifugation at 14000 rpm for 3 minutes, the supernatant was collected. Streptavidin beads (PIERCE) 20 ⁇ 1 were collected, rotated for 1 hour at room temperature, and washed twice with lysis buffer. Add 75 ⁇ l of SDS-PAGE sample buffer to the beads, collect the bound protein by centrifugation at 100 ° C for 3 minutes, and perform Western blotting with anti-HA antibody (Roche). 187A5 protein was detected.
  • a lysis buffer 1% SDS, 10 mM Tris-CI, lOOmM NaCl, ImM EDTA
  • 187A5 protein could be detected by FACS method.
  • a construct was constructed in which a cDNA encoding the C-terminal side of the predicted 187A5 cleavage site (the 39th amino acid) was ligated immediately below the signal sequence of Preprotrypsin and the sequence encoding the FLAG tag. When this construct is expressed, 187A5 with a FLAG tag attached to the N-terminus can be expressed after cleavage of the signal sequence.
  • This construct was introduced into the B300. 19 cells using a retrovirus vector.
  • 187A5 is considered to be useful as a marker for isolating live cells of dopaminergic neuron progenitor cells.
  • Example 51187A5 protein expression analysis Of the 187A5 gene, using the gene sequence encoding the extracellular region, an anti-187A5 antibody was prepared by the following protocol, and expression analysis was performed by immunohistochemical staining.
  • Cy3 labeled anti-rat IgG antibody (Jackson, lO ⁇ g / ml, 2.5% Block Ace ZPBS) was allowed to react at room temperature for 1 hour, washed in the same manner, and then washed with PBS (-) at room temperature for 5 minutes. And sealed.
  • Example 61 Detection of cells in which 187A5 protein is present
  • the mouse E12.5 fetal midbrain and ventral region of the hindbrain were dispersed using a cell dispersion buffer (Invitrogen), and then fixed and not permeabilized, and the anti-187A5 monoclonal antibody ( The purified antibody was diluted with 1% sushi fetal serum, ImM EDTAZPBS) and anti-Lrp4 antibody (culture supernatant 1Z2 diluted, 1% sushi fetal serum, ImM EDTAZPBS), and stained at 4 ° C for 20 minutes.
  • a cell population containing 187A5 protein was detected (Fig. 12).
  • cells with 187A5 protein can be detected without fixation and permeabilization, cells with 187A5 protein can be separated in the state of living cells by using a flow cytometer with a cell sorter. It is suggested that it is possible.
  • 187A5 protein is present in all midbrain Lrp4-positive cells, that is, donomin-producing euron progenitor cells, whereas 187 A5 protein is present in hindbrain Lrp4-positive cells that do not contain dopamine-producing neuron progenitor cells. Shina! Was confirmed (Fig. 12)
  • the cultured cells were fixed with 2% PFAZPBS at 4 ° C for 20 minutes, and washed twice with PBS at 4 ° C for 10 minutes. Thereafter, permeabilization treatment was performed with 0.3% Triton X-lOOZPBS at room temperature for 30 minutes, and blocking was performed with 10% normal donkey serumZ Block Ace at room temperature for 20 minutes.
  • anti-Nurrl antibody in house culture supernatant lZlOOO diluted, 10% normal do nkey serum, 2.5% Block Ace, 0.1% Triton X—lOOZPBS), anti-HuC ZD rod (Molecular Probe ⁇ 1/50 ⁇ 4 ⁇ g / mU 10% normal donkey seru m, 2.5% block Ace, 0.1% Triton X—IOOZPBS) was allowed to react at room temperature for 1 hour, followed by 4 ° C reaction.

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Abstract

　本発明は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の検出または選択に用いられるプローブ、プライマー、プライマーセット、および抗体の提供を目的とする。本発明によれば、１８７Ａ５遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができる、中脳ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられるプローブ、プライマー、およびプライマーセット、並びに中脳ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン前駆細胞の検出または選択に用いられる１８７Ａ５タンパク質に結合性を有する抗体が提供される。

Description

明 細 書
ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー 187A5
発明の分野
[0001] 本発明は、ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞マーカーである 187A5遺伝子に関 し、詳細には、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の検出手段、並びに該細胞の検 出方法および検出キットに関する。
背景技術
[0002] ドーパミン系は、哺乳動物の脳において重要な運動調節、ホルモン分泌調節、情 動調節等に関与する非常に重要な系である。従って、ドーパミン作動性神経伝達に おける異常は、様々な神経系の障害を引き起こす。例えば、パーキンソン病は、中脳 黒質のドーパミン産生ニューロンの特異的な脱落が原因で起こる錐体外路系の神経 変性疾患である (HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE第 2卷第 2 3版， Isselbacher et al.編 McGraw- Hilllnc., NY(1994)pp.2275- 7)。
[0003] パーキンソン病の治療法としては、産生されるドーノミン量の低下を補うために L ドーパ（3, 4—ジヒドロキシフエ-ルァラニン）を経口投与する方法が主に採られてい るが、効果の持続性が良くないことが知られている。
[0004] そこで、失われたドーパミン産生-ユーロンを補う方法として、最近では、ドーパミン 産生-ユーロン前駆細胞を含む 6〜9週齢の中絶胎児の中脳腹側領域を移植する 治療法が試みられている（米国特許第 5690927号； Spencer et al.(1992)N.Engl.J.M ed.327: 1541-8; Freed et al.(1992)N.Engl.J.Med.327: 1549-55; Widner et al.(1992)N. Engl.J.Med.327:1556-63; Kordower et al.(1995)N.Engl.J.Med.332: 1118-24; Defer et al.(1996)Brain 119:41—50; Lopez— Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29:977— 80)。しか し、現在のところ、この方法では細胞の供給面、倫理面（Rosenstain(1995)Exp.Neurol .33:106; Turner et al.(1993)Neurosurg.33:1031- 7)で問題があるとともに、感染汚染 の危険性、免疫学的な移植片拒絶 (Lopez- Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29:977- 80; Widner and Brudin(1988)Brain Res.Rev.13:287-324)、胎児組織が糖分解よりも 脂質代謝に主に依存しているための生存率の低さ (Rosenstein(1995)Exp.Neurol.33: l 06)等の様々な面で問題が指摘されて 、る。
[0005] 倫理面や供給不足の問題を解決する方法としては、例えば、ブタ由来の皮質、線 条、および中脳細胞を用いる方法等も提案されている（例えば、特表平 10— 50848 7号公報；特表平 10— 508488号公報；特表平 10— 509034号公報）。し力し、この 方法においては、拒絶反応を抑制するため、細胞表面上の抗原 (MHCクラス I抗原） を改変するという煩雑な操作が必要とされる。移植片拒絶を解消する方法としては、 例えば、セルトーリ細胞を同時に移植することにより、局在的に免疫抑制する方法も 提案されている（特表平 11-509170号公報；特表平 11-501818号公報； Selawly and C ameron(1993)Cell Transplant 2:123-9)。 MHCがマッチする血縁者、他人の骨髄、骨 髄バンク、及び臍帯血バンク等力 移植細胞を得ることも可能であるが、患者自身の 細胞を用いることができれば、余計な操作や手間なしに拒絶反応の問題も解決する ことができる。
[0006] そこで、中絶胎児由来の細胞に代えて、胚性幹細胞 (ES)細胞、骨髄間質細胞など の非神経系細胞からのイン'ビトロにおけるドーパミン産生-ユーロンの分化系の移 植材料としての利用が有望視されている。実際、ラットパーキンソン病モデルの病変 線条への移植により、 ES細胞由来のドーノミン産生-ユーロンが機能的であることも 確認されている (Kim et al.(2002)Nature 418:50-56)。将来的には ES細胞若しくは患 者本人の持つ神経幹細胞力 の再生治療の重要性が増してくるものと思われる。
[0007] 一方で、神経組織の損傷の治療においては脳機能の再構築が必要となり、周囲の 細胞と適切なリンクを形成する（ネットワーク形成)ために、成熟した細胞ではなくイン •ビボにおいて-ユーロンへと分ィ匕し得る前駆細胞を移植する必要がある。しかし、二 ユーロン前駆細胞の移植においては、上述した供給面以外に、前駆細胞が不均一 な細胞集団へと分ィ匕する可能性があるという問題点がある。例えば、パーキンソン病 の治療においては、カテコールアミン含有-ユーロンの中でもドーパミン産生-ユーロ ンを選択的に移植することが必要であり、これまでに、パーキンソン病の治療に用い る移植細胞として、線条体 (Lindvall et al.(1989)Arch.Neurol.46:615- 31; Widner et al .(1992)N.Engl.J.Med.327:1556-63)、ヒト胎児神経由来の不死化セルライン（特表平 8 - 509215号公報；特表平 11 - 506930号公報；特表 2002— 522070号公報）、 N T2Z細胞の有糸分裂後ヒトニューロン（特表平 9 5050554号公報）、ニューロン始 原細胞 (特表平 11 - 509729号公報）、ドーパミン等のカテコールアミンを産生する ように外来遺伝子によりトランスフエタトされた細胞、骨髄ストロマ細胞 (特表 2002— 5 04503号公報；特表 2002— 513545号公報）、遺伝子改変された ES細胞 (Kim et a l(2002)Nature 418:50-56)等が提案されている。しかしながらいずれも、ドーパミン産 生-ユーロンまたはドーパミン産生-ユーロンへと分化する細胞のみを含むものでは ない。
[0008] 未分ィ匕な細胞集団力 ドーパミン産生-ユーロンを選択的に濃縮 ·分離する方法と しては、ドーパミン産生-ユーロンで発現するチロシンノヽイドロキシラーゼ (TH)等の 遺伝子のプロモーター Zェンハンサ一の制御下で蛍光蛋白質を発現するレポータ 一遺伝子を細胞集団の各細胞に導入し、蛍光を発する細胞を分離することにより、ド 一ノ ミン産生-ユーロンを生きたまま可視化して濃縮'分離、または同定する方法 (特 開 2002— 51775号公報）が提案されている。し力しこの方法は、外来遺伝子の導入 という煩雑な工程を不可欠とするものであり、さらに、遺伝子治療に用いることを日的 とする場合、レポーター遺伝子の存在は毒性、免疫原性の面力 も問題である。
[0009] 以上のことから、現時点でのパーキンソン病移植治療における大きな問題の一つは 、中絶胎児の中脳腹側領域由来あるいは分ィ匕誘導されるドーパミン産生-ユーロン 前駆細胞が、いずれも多種の細胞の混合物である点である。神経回路形成における 安全性を考えると、目的の細胞種のみを分離して力 用いるのが望ましい。さらに、 細胞の移植先の脳内での生存や、正しくネットワーク形成する能力を考えると、より早 期の増殖前駆細胞を分離し、移植することが治療効果の観点力 望まし 、と言える。
[0010] これまでに、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞に発現する遺伝子として Lrp4
(WO2004Z065599号公報）力報告されている。その他にも、ドーノ ミン産生-ュ 一ロン前駆細胞のマーカーがいくつか報告されている（WO2004Z038018号公報 、 WO2005Z052190号公報）。
発明の概要
[0011] 本発明者らは、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生-ュ 一ロン増殖前駆細胞に選択的に発現する遺伝子を単離するために、ラット 13. 5日 胚中脳腹側および後脳腹側より、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー 遺伝子である Lrp4タンパク質が陽性である細胞を分離し、サブトラクシヨン (N— RD A)法により中脳にぉ 、て Lrp4陽性細胞に特異的な遺伝子を探索したところ、ドーパ ミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現する遺伝子（187A5遺伝子 (本明 細書において、単に「187A5」と言うことがある））を見出した (実施例 2)。本発明はこ の知見に基づくものである。
[0012] 本発明は、ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞 (好ましくは、ドーパミン産生-ユーロ ン増殖前駆細胞)の検出手段、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞 (好ましくは、ドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞）の検出方法、およびドーパミン産生-ユーロン 前駆細胞 (好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞)の検出キットを提供 することを目的とする。
[0013] 本発明はまた、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞 (好ましくは、ドーパミン産生-ュ 一ロン増殖前駆細胞)の分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法を提供すること を目的とする。
[0014] 本発明はさらに、パーキンソン病の治療に用いられるドーノ ミン産生-ユーロン前 駆細胞 (好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞)の製造方法を提供す ることを目的とする。
[0015] 本発明によれば、以下の (i)、 (ii) , (iii)、および (iv)力も選択される、ポリヌクレオ チド (以下、「187A5遺伝子」 t ヽぅことがある）が提供される：
(i)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
(ii)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列において、 1または複数個のヌクレオチド の挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個の ヌクレオチドの付カ卩がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列か らなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(iii)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力 なるポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件でノヽイブリダィズし、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力もなるタンパ ク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;および (iv)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドと 70%以上の 同一性を有し、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の 機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[0016] 本発明によればまた、以下の (V) (vi) (vii)、および (viii)力も選択される、タンパ ク質（以下、「187A5タンパク質」と 、うことがある）が提供される：
(V)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
(vi)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入 、置換、欠失、および Zまたはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸 の付カ卩がなされたアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(vii)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件で イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および
(viii)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列 からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質。
[0017] 本発明によれば、 187A5遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブ リダィズすることができる、ドーパミン産生- ロン前駆細胞 (好ましくは、ドーパミン 産生- ロン増殖前駆細胞)の検出または選択に用いられるプローブまたはプライ （以下、それぞれ「本発明によるプローブ」および「本発明によるプライマー」と ヽ うことがある）力提供される。
[0018] 本発明によれば、ドーパミン産生- ロン前駆細胞 (好ましくは、ドーパミン産生 ニューロン増殖前駆細胞）の検出または選択に用いられる、 187A5タンパク質に結 合性を有する抗体 (以下「本発明による抗体」と ヽぅことがある）が提供される。
[0019] 本発明によれば、 187A5遺伝子の発現または 187A5タンパク質を検出する工程 を含んでなる、ドー ミン産生- ロン前駆細胞 (好ましくは、ドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞)の検出または選択方法 (以下「本発明による検出方法」と 、うこと 力 Sある）が提供される。 [0020] 本発明によれば、本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗 体を少なくとも含んでなる、ドーパミン産生- ロン前駆細胞 (好ましくは、ドーパミ ン産生- ロン増殖前駆細胞)を検出または選択するためのキット（以下「本発明 による検出キット」 t 、うことがある）が提供される。
[0021] 本発明によれば、本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗 体を少なくとも含んでなる、ドーパミン産生- ロン前駆細胞 (好ましくは、ドーパミ ン産生- ロン増殖前駆細胞)を検出または選択するための試薬 (以下「本発明に よる検出用試薬」ということがある）が提供される。
[0022] 本発明によれば、 187A5遺伝子の発現または 187A5タンパク質を検出する工程 を含んでなる、ドー ミン産生- ロン前駆細胞 (好ましくは、ドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞)の分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される。
[0023] 本発明によれば、パーキンソン病の治療に用いられるドー ミン産生- ロン前 駆細胞 (好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞)の製造方法が提供さ れる。
[0024] 本発明によるプローブ、プライ プライ セット、および抗体は、中脳におい てドーパミン産生- ロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生- ロン増殖前 駆細胞に特異的なマーカーとして使用することができる。したがって、本発明は、移 植材料の純度検定やイン'ビトロでのドー ミン産生- ロン前駆細胞、好ましくは ドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞の分ィヒ誘導法の開発等において極めて有 用であり、再生医療の実用化推進に大きく貢献するものである。また、本発明によるタ ンパク質は、単に発現しているものではなぐタンパク質の一部が細胞外に発現して いる。従って、本発明によるタンパク質の細胞外領域を指標とすることで生きたままの 細胞を確実に検出できるとともに、当該細胞を分離および取得することができ、再生 医療の実用化により大きく貢献すると言える。
図面の簡単な説明
[0025] [図 1]ドー ミン産生ニューロン関連マーカー遺伝子の発現時期を示した図である。
[図 2]ラット 14. 5日胚の中脳および後脳における Lrp4 THのタンパク質発現を免疫 染色法により解析した結果を示した図である。 [図 3]中脳および後脳 Lrp4陽性細胞における、 187A5、 Lmxlaおよび Lrp4の mRN A発現を RT—PCR法により解析した結果を示した図である。
[図 4]マウス 12. 5日胚の中脳および後脳における、 187A5および Lrp4の mRNA発 現を in situハイブリダィゼーシヨンにより解析した結果を示した図である。
圆 5]ES細胞力も SDIA法により分ィ匕誘導したドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細 胞における、 187A5、 Lmxlaおよび Lrp4の mRNA発現を RT—PCR法により解析 した結果を示した図である。
[図 6]ES細胞から 5— stage法により分ィ匕誘導したドーパミン産生-ユーロン前駆細 胞における、 187A5、 Lmxlaおよび Lrp4の mRNA発現を RT—PCR法により解析 した結果を示した図である。
[図 7]マウス 187A5および 187A5— SEAPを示した図である。
[図 8] 187A5のシグナル配列活性について解析した結果を示した図である。
[図 9] 187A51タンパク質の細胞表面発現を、細胞表面タンパク質のピオチンィ匕修飾 法で解析した結果を示した図である。
[図 10]187A5タンパク質の細胞表面発現を、 FACS解析で調べた結果を示した図で ある。図中枠で囲った部分が 187A5発現細胞を示す。
[図 11]マウス 11. 5日胚の中脳および後脳腹側における 187A5タンパク質の発現を 免疫染色法により解析した結果を示した図である。
[図 12]マウス 12. 5日胚の中脳および後脳腹側における 187A5および Lrp4タンパク 質の発現を FACS解析で調べた結果を示した図である。
圆 13]SDIA法により ES細胞力 分ィ匕誘導したドーパミン産生-ユーロン増殖前駆 細胞における 187A5および Lrp4タンパク質の発現を FACS解析で調べた結果を示 した図である。
[図 14]SDIA法により ES細胞力も分ィ匕誘導した 187A5ZLrp4共陽性細胞を分離し 、培養した結果を示した図である。
圆 15]ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞を選択するために利用可能な DNA構築 物の構造を模式的に表した図である。
発明の具体的な説明 [0026] 以下、本発明を詳細に説明する。以下の記述は、本発明を説明するための例示で あり、本発明を記述された実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本明細書中で使 用される全ての技術的用語、科学的用語および専門用語は、本発明が属する技術 分野の通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有し、単に特定の態 様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。本発 明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。本明細 書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特 許文献は、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いること ができる。
[0027] [ドーパミン産生ニューロン前駆細胞]
本発明において、検出または選択の対象である「ドーパミン産生- ロン前駆細 胞」は、成熟前のドーパミン産生- ロン細胞を意味する。
[0028] 本発明においてまた、検出または選択の対象である「ドーパミン産生- ロン増 殖前駆細胞」は、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン前駆細胞を意味する。
[0029] ドーパミン産生- ロンは、神経上皮細胞から、増殖前駆細胞、分裂停止後の前 駆細胞の分ィ匕段階を経て、成熟ドー ミン産生- ロンに分ィ匕する。ドーパミン産 生ニューロン前駆細胞は、ドー ミン産生ニューロンの前駆細胞であり、その中でもド ーパミン産生- ロン増殖前駆細胞は、ドーパミン産生- ロンの最も初期の前 駆細胞であるから、移植先の脳内での高い生存率や、高いネットワーク形成能が期 待できる。従って、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、特にドー ミン産生ニューロ ン増殖前駆細胞は、パーキンソン病等、ドーパミン産生- ロンの変性脱落による ドーパミン減少に起因する疾患の移植治療に有用である。
[0030] 本発明によるプローブ、プライ プライ セット、または抗体を指標として選択 された細胞は、ドーパミン産生- ロン前駆細胞であることから、従来の雑多な細 胞集団または外来遺伝子を導入したドーパミン産生ニューロン前駆細胞と比べて、 安全性、生存率、ネットワーク形成能の面でパーキンソン病等の神経変性疾患の移 植治療に好ましいものである。特に、本発明によるプローブ、プライ プライ セット、または抗体で検出または選択される細胞が、分裂停止前のドーパミン産生- ユーロン前駆細胞、すなわち増殖中のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞である場合 は、脳内の最適な場所で分ィ匕成熟していく可能性があり、また、イン'ビボにおいてさ らにドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞が増殖する可能性があることから、より長期的 な治療効果も期待できる。従って、本発明は、パーキンソン病等の神経変性疾患の 効果的な移植治療の実用化に途を拓くものであるといえる。
[0031] [187A5遺伝子およびタンパク質]
本発明にお 、て「187A5遺伝子」は、 187A5タンパク質をコードするものを意味し 、 cDNAのみならず、ゲノム DNAも含むものである。またこれに対応する RNAも含ま れる。
[0032] 本発明において、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞の存在の指標となる「187A5 遺伝子」は、マウスにおいて機能未知の配列としてデータベースに登録されているが 、ヒト、ラット、ゥシ、ィヌ、チンパンジー等においては配列が予測されているのみであ る。それぞれの配列が開示されて!、る GenBankァクセッション番号は下記の通りで ある。
ヒト: XM— 044062 (配列番号： 3 (塩基配列）、配列番号: 4 (アミノ酸配列）、以下同 様の順に示す）、 AK126715 (配列番号： 5、配列番号： 6)、 HSM803256 (配列番 号： 7、配列番号： 8)、 HSM803467 (配列番号： 9、配列番号： 10)
マウス： AK028289 (配列番号： 11、配列番号： 12)、 AK157823 (配列番号： 13 ( 塩基配列））、 AK028541 (配列番号： 14、配列番号： 15)、 AK035053 (配列番号 ： 16、配列番号： 17)、 XM— 485684 (配列番号： 18、配列番号： 19)、 AK163356 (配列番号: 20 (塩基配列)）
ラット： XM— 344107 (配列番号： 21、配列番号： 22)
ゥシ： XM— 590147 (配列番号： 23、配列番号： 24)
ィヌ： XM— 543360 (配列番号： 25、配列番号： 26)
チンパンジー： XM— 522557 (配列番号： 27、配列番号： 28)
[0033] 本発明において、中脳部位のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞 (好ましくは、ドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞）に選択的に発現している遺伝子として、ヒト 187 A5遺伝子の cDNA配列（配列番号： 1)、また、ドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞（ 好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞）に選択的に発現しているタンパ ク質 (ポリペプチド）として、ヒト 187A5タンパク質 (ポリペプチド)のアミノ酸配列（配列 番号: 2)が決定された。
[0034] 当業者であれば、配列番号 1の 187A5遺伝子のヌクレオチド配列や配列番号 2の 187A5タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、様々な動物に内在する 187A5遺伝 子のヌクレオチド配列や 187A5タンパク質のアミノ酸配列を特定することができる。 例えば、ヒトあるいはマウスの 187A5遺伝子や 187A5タンパク質に基づいて相同性 検索を行い、その動物の 187A5遺伝子や 187A5タンパク質を検索し、特定すること ができる。相同性検索に当たっては後述の BLAST等を利用することができる。従つ て、本発明において「187A5遺伝子」および「187A5タンパク質」とは、ヒト由来の 18 7A5遺伝子ゃヒト由来の 187A5タンパク質にカ卩えて、様々な動物（好ましくは、哺乳 動物）に内在する 187A5遺伝子や 187A5タンパク質を含む意味で用いられる。
[0035] 187A5遺伝子の例としては、
配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、または配列番号： 10で表さ れるアミノ酸配列を含んでなるヒト 187A5タンパク質をコードするポリヌクレオチド； 配列番号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、または配列番号： 19で表されるアミ ノ酸配列を含んでなるマウス 187A5タンパク質をコードするポリヌクレオチド； 配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含んでなるラット 187A5タンパク質をコード するポリヌクレ才チド；
配列番号： 24で表されるアミノ酸配列を含んでなるゥシ 187A5タンパク質をコード するポリヌクレ才チド；
配列番号： 26で表されるアミノ酸配列を含んでなるィヌ 187A5タンパク質をコード するポリヌクレオチド;および
配列番号： 28で表されるアミノ酸配列を含んでなるチンパンジー 187A5タンパク質 をコードするポリヌクレオチド
が挙げられる。
[0036] 187A5遺伝子の例としては、また、
配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、または配列番号： 9で表さ れるヒト 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
配列番号： 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、また は配列番号： 20で表されるマウス 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリ ヌクレ才チド；
配列番号： 21で表されるラット 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリ ヌクレ才チド；
配列番号： 23で表されるゥシ 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌ クレオチド； 配列番号： 25のィヌ 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリ ヌクレオチド；および
配列番号： 27で表されるチンパンジー 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んで なるポリヌクレオチド
が挙げられる。
187A5遺伝子としては、以下の (i' )、（ii' )、（iii' )、および (iv' )力も選択される、 ポリヌクレオチドが挙げられる：
(i' )配列番号: 1、配列番号: 3、配列番号 : 5、配列番号 : 7、配列番号 : 9、配列番号 : 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、配列番号： 20、 配列番号： 21、配列番号： 23、配列番号： 25、または配列番号： 27で表されるヌクレ ォチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
(ϋ' )配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列番号： 9、配列番 号： 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、配列番号： 20 、配列番号： 21、配列番号： 23、配列番号： 25、または配列番号： 27で表されるヌク レオチド配列において、 1または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および Ζ またはその一方または両末端への 1または複数個のヌクレオチドの付カ卩がなされたヌ クレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表され るアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌ クレ才チド；
(ίϋ' )配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列番号： 9、配列番 号： 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、配列番号： 20 、配列番号： 21、配列番号： 23、配列番号： 25、または配列番号： 27で表されるヌク レオチド配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、イブリダィズし、 つ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機能を有するタン パク質をコードするポリヌクレオチド；および
(iv' )配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列番号： 9、配列番 号： 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、配列番号： 20 、配列番号： 21、配列番号： 23、配列番号： 25、または配列番号： 27で表されるヌク レオチド配列力もなるポリヌクレオチドと 70%以上の同一性を有し、かつ配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコード するポリヌクレオチド。
187A5遺伝子としてはまた、以下の (v' )、（vi' )、（νϋ' )、および (viii' )力も選択さ れる、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる：
(ν' )配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、配列番 号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、配列番号： 19、配列番号： 22、配列番号： 24 、配列番号： 26、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク 質；
(νί' )配列番号： 2、配列番号 : 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、配列番 号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、配列番号： 19、配列番号： 22、配列番号： 24 、配列番号： 26、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列において、 1または複 数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1ま たは複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(νη' )配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、配列 番号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、配列番号： 19、配列番号： 22、配列番号： 24、配列番号： 26、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ 、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機能を有する タンパク質；および (νίϋ' )配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、配列 番号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、配列番号： 19、配列番号： 22、配列番号： 24、配列番号： 26、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一 性を有するアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタ ンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
[0039] 本発明によれば、好ましくは、以下の '）、 (ii，，）ゝ (iii" )、および (iv" )から選択 される、ポリヌクレオチドが提供される：
(i' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； (ii' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列において、 1または複数個のヌクレオ チドの挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個 のヌクレオチドの付カ卩がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列 からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(iii' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でノ、イブリダィズし、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力もなるタン ノ ク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;および
(iv' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドと 70%以上 の同一性を有し、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等 の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[0040] 本発明によればまた、好ましくは、以下の (v，，）、（vi，，）、 (νϋ'， )、および (viii，， ) 力も選択される、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される：
(v" )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
(vi' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿 入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個のァミノ 酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列 力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(νϋ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で 表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および
(viii' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配 列からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機 能を有するタンパク質。
[0041] 本発明によれば、より好ましくは、以下の (i， ， ，）、 (ii， ， ，）、 (iii，，，）、および (iv， ， ， ) 力も選択される、ヒト由来のポリヌクレオチドが提供される：
(ί' ' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； (ϋ'， '）配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列において、 1または複数個のヌクレオ チドの挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個 のヌクレオチドの付カ卩がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列 からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(iii' ' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジ ェントな条件でノ、イブリダィズし、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタ ンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;および (ίν' ' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドと 95%以上 の同一性を有し、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等 の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[0042] 本発明によればまた、より好ましくは、以下の (ν' ， ，）、 (νί' ， ，）、 (νϋ'，，）、および (V iii' " )から選択される、ヒト由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され る：
(ν' ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
(νί' ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の 挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個のアミ ノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(νϋ' ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジ ェントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および
(viii' ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と 95%以上の同一性を有するアミノ酸 配列からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の 機能を有するタンパク質。
[0043] 本発明によれば、さらに好ましくは、配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列を含ん でなる、ヒト由来のポリヌクレオチドが提供される。
[0044] 本発明によればまた、さらに好ましくは、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含ん でなるヒト由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
[0045] 187A5タンパク質（ポリペプチド）の例としては、
配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、または配列番号： 10で表さ れるアミノ酸配列を含んでなるヒト 187A5タンパク質；
配列番号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、または配列番号： 19で表されるアミ ノ酸配列を含んでなるマウス 187A5タンパク質；
配列番号： 22のアミノ酸配列を含んでなるラット 187A5タンパク質；
配列番号： 24のアミノ酸配列を含んでなるゥシ 187A5タンパク質；
配列番号： 26のアミノ酸配列を含んでなるィヌ 187A5タンパク質；および 配列番号： 28のアミノ酸配列を含んでなるチンパンジー 187A5タンパク質 が挙げられる。
[0046] 187A5タンパク質（ポリペプチド）の例としては、また、
配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、または配列番号： 9で表さ れるヒト 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列でコードされ るタンノ ク質；
配列番号： 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、また は配列番号： 20で表されるマウス 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌク レオチド配列でコードされるタンパク質；
配列番号： 21のラット 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド 配列でコードされるタンパク質；
配列番号： 23のゥシ 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配 列でコードされるタンパク質；
配列番号： 25のィヌ 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配 列でコードされるタンパク質;および
配列番号： 27のチンパンジー 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるヌク レオチド配列でコードされるタンパク質
が挙げられる。
187A5タンパク質 (ポリペプチド）としては、以下の（i，）、（ii，）、（iii，）、および (iv，） カゝら選択される、タンパク質が挙げられる：
(i' )配列番号: 1、配列番号: 3、配列番号 : 5、配列番号 : 7、配列番号 : 9、配列番号 : 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、配列番号： 20、 配列番号： 21、配列番号： 23、配列番号： 25、または配列番号： 27で表されるヌクレ ォチド配列でコードされるタンパク質；
(ϋ' )配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列番号： 9、配列番 号： 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、配列番号： 20 、配列番号： 21、配列番号： 23、配列番号： 25、または配列番号： 27で表されるヌク レオチド配列において、 1または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および Ζ またはその一方または両末端への 1または複数個のヌクレオチドの付カ卩がなされたヌ クレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表され るアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(ίϋ' )配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列番号： 9、配列番 号： 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、配列番号： 20 、配列番号： 21、配列番号： 23、配列番号： 25、または配列番号： 27で表されるヌク レオチド配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジ工ントな条件でノ、イブリダィズするポ リヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタン ノ ク質と同等の機能を有するタンパク質;および
(iv' )配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列番号： 9、配列番 号： 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、配列番号： 20 、配列番号： 21、配列番号： 23、配列番号： 25、または配列番号： 27で表されるヌク レオチド配列力もなるポリヌクレオチドと 70%以上の同一性を有するポリヌクレオチド によりコードされ、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等 の機能を有するタンパク質。
[0048] 187A5タンパク質（ポリペプチド）としてはまた、以下の（ν' )、（vi' )、（νϋ' )、および
(νίϋ' )カゝら選択される、タンパク質が挙げられる：
(ν' )配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、配列番 号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、配列番号： 19、配列番号： 22、配列番号： 24 、配列番号： 26、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク 質；
(vi' )配列番号： 2、配列番号 : 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、配列番 号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、配列番号： 19、配列番号： 22、配列番号： 24 、配列番号： 26、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列において、 1または複 数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1ま たは複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(νη' )配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、配列 番号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、配列番号： 19、配列番号： 22、配列番号： 24、配列番号： 26、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドとストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ 、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機能を有する タンパク質；および
(νίϋ' )配列番号： 2、配列番号： 4、配列番号： 6、配列番号： 8、配列番号： 10、配列 番号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、配列番号： 19、配列番号： 22、配列番号： 24、配列番号： 26、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一 性を有するアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタ ンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
[0049] 本発明によれば、好ましくは、以下の '）、 (ii，，）ゝ (iii" )、および (iv" )から選択 される、タンパク質 (ポリペプチド)が提供される： (i' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列でコードされたタンパク質；
(ii' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列において、 1または複数個のヌクレオ チドの挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個 のヌクレオチドの付カ卩がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列 からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質；
(iii' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で 表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および (iv' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドと 70%以上 の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で表されるアミ ノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
[0050] 本発明によればまた、好ましくは、以下の (v， ，）、（vi， ，）、 (νϋ'， )、および (viii， ， ) 力も選択される、タンパク質 (ポリペプチド)が提供される：（ν' ' )配列番号: 2で表され るアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
(vi' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿 入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個のァミノ 酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列 力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(νϋ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で 表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および (viii' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配 列からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機 能を有するタンパク質。
[0051] 本発明によれば、より好ましくは、以下の (i， ， ，）、 (ii， ， ，）、 (iii，，，）、および (iv， ， ， ) 力も選択される、ヒト由来のタンパク質 (ポリペプチド)が提供される：
(ί' ' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列でコードされたタンパク質； (ϋ'， '）配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列において、 1または複数個のヌクレオ チドの挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個 のヌクレオチドの付カ卩がなされたヌクレオチド配列でコードされたアミノ酸配列力 なり 、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機能を有する タンパク質；
(iii' ' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジ ェントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および (ίν' ' ' )配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドと 95%以上 の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で表されるアミ ノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
[0052] 本発明によればまた、より好ましくは、以下の (ν' ，，）、 (νί' ，，）、 (νϋ'，，）、および (V iii' " )から選択される、ヒト由来のタンパク質 (ポリペプチド)が提供される：
(ν' ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
(νί' ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の 挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個のアミ ノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(νϋ' ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジ ェントな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および (viii' ' ' )配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と 95%以上の同一性を有するアミノ酸 配列からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の 機能を有するタンパク質。
[0053] 本発明によれば、さらに好ましくは、配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列でコー ドされたヒト由来のタンパク質が提供される。
[0054] 本発明によればまた、さらに好ましくは、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含ん でなるヒト由来のタンパク質が提供される。 [0055] 本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて、 1または複数個のヌクレオチドの 挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個のヌク レオチドの付カ卩がなされた」および「アミノ酸配列において、のアミノ酸の挿入、置換ま たは欠失、および Zまたはその一方または両末端への付加がなされた」とは、部位特 異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ得る程度の 複数個の数のヌクレオチドあるいはアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味 する。ポリヌクレオチドの場合、一塩基多型（SNPs)も含む意味である。ヌクレオチド およびアミノ酸の改変の個数は、例えば 1〜30個、好ましくは 1〜20個、より好ましく は 1〜： L0個、さらに好ましくは 1または数個（例えば、 9個以下）、特に好ましくは 1〜4 個、最も好ましくは 1〜2個のヌクレオチドおよびアミノ酸の挿入、置換、または欠失、 および Zまたはその一方または両末端への付カ卩がなされたものであることができる。
[0056] 改変ヌクレオチド配列は、好ましくは、 1個または複数個（例えば、 1個ないし数個あ るいは 1、 2、 3、または 4個）の、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク 質の機能に影響を与えない変異を有する配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列で あることができる。
[0057] 改変アミノ酸配列は、好ましくは、 1または複数個（例えば、 1個な!/、し数個ある!/、は 1、 2、 3、または 4個）の保存的置換を有する配列番号： 2で表されるアミノ酸配列であ ることがでさる。
[0058] (ϋ)、（ϋ' )、（ϋ' ' )、または (ii' ' ' )において、ヌクレオチド配列に導入される挿入、 置換、欠失、または付加の個数は、好ましくは、 1または数個（例えば、 9個以下）、よ り好ましくは、 1〜6個、特に好ましくは 1〜4個、最も好ましくは 1〜2個とすることがで きる。
[0059] (vi)、 (νί' )、 (νί'， )、または (νί'，， )にお 、て、アミノ酸配列に導入される挿入、置 換、欠失、または付加の個数は、好ましくは、 1または数個（例えば、 9個以下）、より 好ましくは、 1〜6個、特に好ましくは 1〜4個、最も好ましくは 1〜2個とすることができ る。
[0060] 本願明細書において、「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しな いように、 1または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置 換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する 場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが 挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎 に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性 (疎水性)アミノ酸と しては、ァラニン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フエ二ルァラ ニン、メチォニンなどが挙げられる。極性（中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、ス レオニン、チロシン、グルタミン、ァスパラギン、システィンなどが挙げられる。陽電荷 をもつ（塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。 負電荷をもつ（酸性)アミノ酸としては、ァスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられ る。
[0061] 改変ヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列の 512番目のグァニンのアデニンへの置換、 844番目のグァニンのアデニンへの置換 、 1360番目のグァニンのアデニンへの置換、 2458番目のアデニンのグァニンへの 置換、 2991番目のアデニンのグァニンへの置換を有するヌクレオチド配列が挙げら れる。改変ヌクレオチド配列は、これらすベての置換またはその一部を組み合わせて 有していてもよい。
[0062] 改変アミノ酸配列としては、例えば、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 161番 目のアルギニンのヒスチジンへの置換、 272番目のパリンのイソロイシンへの置換、 4 44番目のパリンのイソロイシンへの置換、または 810番目のアルギニンのグリシンへ の置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。改変アミノ酸配列は、これらすベての置 換またはその一部を組み合わせて有して 、てもよ 、。
[0063] 本願明細書にぉ 、て「ストリンジェントな条件でノヽイブリダィズする」とは、ストリンジェ ントな条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダィズすることを意味する。具体的に は、 FASTA、 BLAST, Smith- Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕など の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト (初期設定)のノ ラメーターを用いて計算 したときに、標的ヌクレオチド配列と少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、より好 ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に 好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の同一性を有するポリヌクレオ チドが挙げられる。また、「ストリンジ ントな条件」とは、当業者が通常使用し得るハイ ブリダィゼーシヨン緩衝液中で、温度が 40°C〜70°C、好ましくは 60°C〜65°Cなどで 反応を行い、塩濃度が 15〜300mmolZL、好ましくは 15〜60mmolZLなどの洗 浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプロ一 ブの長さに応じて適宜調整することが可能である。さらに、ハイブリダィズしたものを 洗净するときの条件は、 0. 2または 2 X SSC、0. 1%SDS、温度 20°C— 68°Cで行う ことができる。ストリンジェント（high stringency)な条件にするかマイルド（low stringenc y)な条件にするかは、洗浄時の塩濃度又は温度で差を設けることができる。塩濃度 でノ、イブリダィズの差を設ける場合には、ストリンジェント洗浄バッファー (high stringe ncy wash buffer)として 0. 2 X SSC、 0. 1 %SDS、マイルド洗浄バッファー（low string ency wash buffer)として 2 X SSC、 0. 1%SDSで行うことができる。また、温度でハイ ブリダィズの差を設ける場合には、ストリンジェントの場合は 68°C、中等度 (moderate stringency)の場合は 42°C、マイルドの場合は室温（20°C— 25°C)で!、ずれの場合も 0. 2 X SSC、0. 1%SDSで行えばよい。
[0064] 通常、プレハイブリダィズを実施する場合にはハイブリダィズと同じ条件で実施する 力 ハイブリダィズとプレ（予備)洗浄は同じ条件で行うとは限らない。
[0065] ノ、イブリダィゼーシヨンは、公知の方法に従って行うことができる。また、巿販のライ ブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる
[0066] 本願明細書において、アミノ酸配列について「同一性」（相同性という場合もある）と は、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度 の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される (Wil bur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983))。相同性の計算には、市販のソフト である BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))、 FASTA(Peasron: Met hods in Enzymology 183:63-69 (1990》等を用いることができる。
[0067] 「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出 される数値であればよぐ例えば全米バイオテクノロジー情報センター (NCBI)の相 ノレコリスム BLAST (Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.ni h.gov/BLAST/にお 、てデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算 出することができる。
[0068] 配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列と少なくとも 70%以上の同一性を有するヌ クレオチド配列は、好ましくは、 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好 ましくは 99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることができる。
[0069] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の同一性を有するァミノ 酸配列は、好ましくは、 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 90%以 上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 9 9%以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
[0070] 本発明において、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコー ドするヌクレオチド配列は容易に決まり、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコード する種々のヌクレオチド配列を選択することができる。従って、配列番号： 2で表され るアミノ酸配列力もなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号： 1で表 される cDNA配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードする cDNA配列 であって縮重関係にあるコドンを cDNA配列として有する配列をも意味するものとす る。更に、イントロンや非翻訳領域も含むゲノム DNA配列をも意味するものとする。本 発明においてはさらに、これらに対応する RNA配列も含まれる。
[0071] 本願明細書において「配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同 等の機能を有する」かどうかにつ!/、ては、 187A5遺伝子の発現と関連する生体現象 あるいは機能を評価することにより、例えば、中脳においてドーパミン産生-ユーロン 前駆細胞、好ましくはドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞において選択的に発 現している力否かを評価することにより決定することができる。
[0072] 本発明によれば、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 248番目〜397番目また は 792番目〜877番目のアミノ酸配列の少なくとも 5アミノ酸残基 (好ましくは、少なく とも 6アミノ酸残基)または全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質が提供さ れる。このタンパク質は、 187Aタンパク質のアミノ酸配列のうち識別性が高い部分に 相当することから、 187A5タンパク質をより高精度で識別できる抗体の抗原として用 いることがでさる。
[0073] 187A5タンパク質は、 I型の 1回膜貫通タンパク質であり、 N末端側を細胞外とする 向きで細胞表面に発現している。従って、該タンパク質に結合性を有する抗体を用 いたフローサイトメトリーにより、該タンパク質を発現する生細胞を分離することができ る。
[0074] 本発明によれば、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 28番目〜927番目、配列 番号: 4で表されるアミノ酸配列の 16番目〜1267番目、配列番号： 6で表されるァミノ 酸配列の 1番目〜550番目、配列番号： 8で表されるアミノ酸配列の 1番目〜542番 目、配列番号： 10で表されるアミノ酸配列の 1番目〜418番目、配列番号： 12で表さ れるアミノ酸配列の 76番目〜964番目、配列番号： 15で表されるアミノ酸配列の 40 番目〜928番目、配列番号： 17で表されるアミノ酸配列の 1番目〜540番目、配列 番号： 19で表されるアミノ酸配列の 40番目〜： L 106番目、配列番号： 22で表されるァ ミノ酸配列の 24番目〜1524番目、配列番号： 24で表されるアミノ酸配列の 43番目 〜1018番目、配列番号： 26で表されるアミノ酸配列の 43番目〜908番目、または 配列番号： 28で表されるアミノ酸配列の 1番目〜866番目のアミノ酸配列の少なくとも 5アミノ酸残基 (好ましくは、少なくとも 6アミノ酸残基)または全部力もなるポリペプチド を含んでなるタンパク質が提供される。このタンパク質は、 187Aタンパク質のアミノ酸 配列の細胞外領域に相当することから、検出対象の細胞を生きたまま検出できる抗 体を作製するための抗原として用いることができる。
[0075] 本発明によれば、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生 ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するための指標としての、本発明によるタ ンパク質の使用が提供される。
[0076] [プローブ、プライマー、およびプライマーセット]
ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生-ユーロン増殖前駆 細胞の検出または選択に用いられる本発明によるプローブおよびプライマーは、 18 7A5遺伝子と特異的にハイブリダィズすることができる。実施例 2によれば、ドーパミ ン産生ニューロンの発生する時期であるマウス 12. 5日胚において、 187A5の mRN Aは、 Lrp4陽性ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞の存在する中脳最腹側脳室領 域 (ventricular zone ; VZ)と中脳最背側 roof plate領域に選択的に発現する力 Lr p4陽性である後脳 floor plate細胞には発現しないことから、 187A5の mRNAは、 ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞に選択的に発現することが明らかになった。 よって、 187A5遺伝子の発現はドーパミン産生-ユーロン前駆細胞の指標として有 用である。従って、本発明によるプローブ、プライマー、およびプライマーセットは、ド ーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細 胞検出用のマーカーとして用いることができる。
[0077] 本発明によるプローブおよびプライマーは、 187A5遺伝子の発現を検出すること ができればよぐ複数のデォキシリボ核酸 (DNA)またはリボ核酸 (RNA)等の塩基ま たは塩基対からなる重合体を指す。二本鎖 cDNAも組織 in situハイブリダィゼーシ ヨンにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマ 一にはそのような二本鎖 cDN Aも含まれる。組織中の RNAの検出にぉ 、て特に好ま しいプローブおよびプライマーとしては、 RNAプローブ（リボプローブ）を挙げることが できる。
[0078] 本発明によるプローブおよびプライマーは、 187A5遺伝子のヌクレオチド配列また はその相補配列の連続する少なくとも 10個、好ましくは、少なくとも 15個のヌクレオチ ドカ なるヌクレオチド配列を含むものが挙げられる。本発明によるプローブおよびプ ライマーは、また、好ましくは、 10〜50個または 10〜30個、より好ましくは、 15〜50 偶また ίま 15〜30偶、さら【こ好ましく ίま、 20〜50偶また ίま 20〜30偶、さら【こより好ま しくは、 25〜50個または 25〜30個、最も好ましくは、 26〜39個または 26〜35個の ヌクレオチド力もなるヌクレオチド配列を含むものが挙げられる。
[0079] 本発明によるプローブおよびプライマーは、少なくとも 10塩基長であることができ、 好ましくは、少なくとも 15塩基長、より好ましくは、少なくとも 20塩基長、さらに好ましく は、少なくとも 25塩基長である。本発明によるプローブおよびプライマーは、また、好 ましくは、 10〜50塩基長または 10〜30塩基長、より好ましくは、 15〜50塩基長また は 15〜30塩基長、さらに好ましくは、 20〜50塩基長または 20〜30塩基長、さらに より好ましくは、 25〜50塩基長または 25〜30塩基長、最も好ましくは、 26〜39塩基 長または 26〜35塩基長である。 [0080] 本発明によるプローブおよびプライマーの好ましい態様によれば、 187A5遺伝子 のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも 10個（より好ましくは、 少なくとも 15個）のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含んでなり、 187A5遺伝 子にハイブリダィズすることができる、中脳におけるドーノミン産生ニューロン前駆細 胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いら れる 15〜50塩基長または 15〜30塩基長、より好ましくは 25〜50塩基長または 25 〜30塩基長、最も好ましくは 26〜39塩基長または 26〜35塩基長のポリヌクレオチ ドが提供される。
[0081] 本発明によるプローブの好ましい態様によればまた、 187A5遺伝子のヌクレオチド 配列のうち、識別性の高 、部分にノ、イブリダィズすることができるポリヌクレオチドが 提供される。このようなポリヌクレオチドを用いることにより、前駆細胞、好ましくは、増 殖前記細胞をより高い精度で検出することが可能となる。このようなポリヌクレオチドと しては、例えば、配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列の 774番目〜1221番目ま たは 2403番目〜2666番目のヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌク レオチド配列にハイブリダィズするポリヌクレオチドが挙げられる。
[0082] 本発明によるプライマーの好ましい態様によればまた、 187A5遺伝子のヌクレオチ ド配列のうち、識別性の高い部分を核酸増幅法により増幅することができるものや、 識別性の高 、部分にハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドが提供される。こ のようなポリヌクレオチドを用いることにより、前駆細胞、好ましくは、増殖前記細胞を より高い精度で検出することが可能となる。このようなポリヌクレオチドとしては、例え ば、配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列の 774番目〜1221番目または 2403番 目〜2666番目のヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列 を核酸増幅法により増幅することができるポリヌクレオチドが挙げられる。
[0083] 本発明によるプローブは、ノーザンブロット法、サザンブロット法、 in situハイブリダ ィゼーシヨン等の目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプロ一 ブとして使用することができる。
[0084] 本発明によるプローブは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合 成できる。プローブの調製は周知であり、例えば、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989))、『Current Protocols in Molecular BiologyJOohn Wiley & Sons(1987- 1997))に従って実施できる。
[0085] 本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとし てち使用することがでさる。
[0086] 本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、 PCR法、 RT—PCR法、リアル タイム PCR法、 in situ PCR等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公 知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用するこ とがでさる。
[0087] 本発明によるプライマーセットは 187A5遺伝子のヌクレオチド配列を PCR法等の 核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、 核酸増幅法におけるプライマーセットの選択は当業者に自明である。例えば、 PCR 法においては、二つのプライマー（プライマーペア）の一方が 187A5遺伝子の二本 鎖 DNAのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖 DNAのマイナス鎖に対合 し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合す るようにプライマーを選択することができる。また、 LAMP法 (WO00Z28082号公 報）においては、標的遺伝子に対して 3，末端側力も F3c、 F2c、 Flcという 3つの領 域を、 5，末端側から Bl、 B2、 B3という 3つの領域を、それぞれ規定し、この 6つの領 域を用いて 4種類のプライマーを設計することができる。
[0088] 本発明によるプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学 合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、『Molecular Cloning, A Labora tory Manual 2" ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989))、『Current Protocols in Molec ular BiologyJOohn Wiley & Sons(1987- 1997》に従って実施できる。
[0089] [抗体]
本発明による抗体は、 187A5タンパク質を特異的に認識することができる。実施例 5によれば、 187A5タンパク質は、ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞に存在するこ とが確認された。よって、 187A5タンパク質の存在はドーノ ミン産生-ユーロン増殖 前駆細胞を含むドーパミン産生-ユーロン前駆細胞の指標として有用である。従って 、本発明による抗体は、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産 生-ユーロン前駆細胞検出用のマーカーとして用いることができる。
[0090] 187A5タンパク質は、 N末端側を細胞外とする向きで細胞表面に発現していること から (実施例 4)、本発明による抗体は、ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞を生細胞 として検出または選択することができる点で有利である（実施例 6)。また、本発明によ る抗体は、 ES細胞由来の細胞についても検出または選択することができる点で有利 である（実施例 7)。
[0091] 本発明による抗体を得るための 187A5タンパク質は、 187A5の抗原性を有してい ればよぐ上述のタンパク質が挙げられる。また、 187A5タンパク質のアミノ酸配列に おいて 1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸 配列を有するタンパク質が包含される。このようなタンパク質が元のタンパク質と同じ 生物学的活性が維持されることは公知である (Mark et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 81:5662— 6;Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res. 10:6487— 500;Wang et al.(l 984)Science 224:1431— 3;Dalbadie—McFarland et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7 9:6409-13)。あるタンパク質において、元のタンパク質の抗原性を維持した状態で、 1 若しくは複数個のアミノ酸を欠失、挿入、置換または付加させる方法は公知である。 例えば、部位特異的変異誘発法により変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドを調 製し、適宜発現させて得ることができる (Molecular Cloning.A Laboratory Manual 2nd e d.'Cold Spring Harbor Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology, John Wil ey & Sonsズ 1987— 1997),Section8.1—8.5;Hashimoto— Goto et al.(1995)Gene 152:271— 5;Kinkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 :488-92 ;Kramer and Fritz(1987)Method.E nzymol 154:350- 67;Kunkel(1988)Method.Enzymol.85:2763- 6)。
[0092] 本発明による抗体には、 187A5タンパク質の一部に対して特異的な抗体も含まれ る。即ち、本発明の抗体を得るための 187A5タンパク質には、 187A5タンパク質の 全長アミノ酸配列を有するポリペプチドに加えて、 187A5タンパク質の少なくとも 6ァ ミノ酸残基以上 (例えば、 8、 10、 12または 15アミノ酸残基以上）と同一の配列を有す るポリペプチド断片である。本明細書における 187A5タンパク質のポリペプチド断片 は、 187A5タンパク質またはその抗原性さえ有すればどのような断片であってもよい [0093] 好ましい断片としては、 187A5タンパク質のァミノ末端等のポリペプチド断片を挙 げることができる。ポリペプチドの抗原決定部位は、タンパク質のアミノ酸配列上の疎 水性 Z親水性を解析する方法 (Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Biol. 157: 105-22)、二次 構造を解析する方法 (Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem. 47:251-76)により推定 し、さらにコンピュータープログラム (Anal.Biochem. 151:540-6(1985))または短いぺプ チドを合成しその抗原性を確認する PEPSCAN法 (特表昭 60— 500684号公報)等 の手法により確認することができる。
[0094] 187A5タンパク質に結合性を有する抗体の例としては、
配列番号： 2、配列番号: 4、配列番号: 6、配列番号: 8、または配列番号： 10で表さ れるアミノ酸配列またはその一部力 なるタンパク質に結合性を有する抗体； 配列番号： 12、配列番号： 15、配列番号： 17、または配列番号： 19で表されるアミ ノ酸配列またはその一部力 なるタンパク質に結合性を有する抗体；
配列番号： 22で表されるアミノ酸配列またはその一部力 なるタンパク質に結合性 を有する抗体；
配列番号： 24で表されるアミノ酸配列またはその一部力 なるタンパク質に結合性 を有する抗体；
配列番号： 26で表されるアミノ酸配列またはその一部力 なるタンパク質に結合性 を有する抗体;および
配列番号： 28で表されるアミノ酸配列またはその一部力 なるタンパク質に結合性 を有する抗体
が挙げられる。
[0095] 本発明による抗体の好ましい態様によれば、 187A5タンパク質において識別性の 高いポリペプチド部分を認識する抗体が提供される。このような抗体を用いることによ り、前駆細胞、好ましくは、増殖前記細胞をより高い精度で検出することが可能となる 。このような抗体としては、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 248番目〜 397番 目または 792番目〜877番目のアミノ酸配列の少なくとも 5アミノ酸残基 (好ましくは、 少なくとも 6アミノ酸残基)または全部力もなるポリペプチドを含んでなるタンパク質に 結合性を有する抗体が挙げられる。 [0096] 本発明による抗体の好ましい態様によればまた、 187A5タンパク質の細胞外に発 現して 、るポリペプチド部分を認識する抗体が提供される。このような抗体を用いるこ とにより、前駆細胞、好ましくは、増殖前記細胞を生きたまま検出することが可能とな る。このような抗体としては、細胞外に発現している 187A5タンパク質のポリペプチド 部分に結合性を有する抗体が挙げられ、例えば、配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列の 28番目〜927番目、配列番号： 4で表されるアミノ酸配列の 16番目〜1267番 目、配列番号: 6で表されるアミノ酸配列の 1番目〜550番目、配列番号: 8で表され るアミノ酸配列の 1番目〜542番目、配列番号： 10で表されるアミノ酸配列の 1番目 〜418番目、配列番号： 12で表されるアミノ酸配列の 76番目〜964番目、配列番号 ： 15で表されるアミノ酸配列の 40番目〜928番目、配列番号： 17で表されるアミノ酸 配列の 1番目〜540番目、配列番号： 19で表されるアミノ酸配列の 40番目〜 1106 番目、配列番号： 22で表されるアミノ酸配列の 24番目〜1524番目、配列番号： 24 で表されるアミノ酸配列の 43番目〜： L018番目、配列番号： 26で表されるアミノ酸配 列の 43番目〜908番目、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列の 1番目〜86 6番目のアミノ酸配列の少なくとも 5アミノ酸残基 (好ましくは、少なくとも 6アミノ酸残基 )または全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質に結合性を有する抗体が 挙げられる。
[0097] 本発明による抗体は、当業者に周知の方法を用いて得ることができる（例えば、『Cu rrent Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))、 Antibodies:A Laoo ratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。
[0098] 本発明による抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一 本鎖抗体 (scFv)、ヒト化抗体、多特異性抗体、並びに、 Fab, Fab '、 F (ab ' ) 、 Fc、
2
Fv等の抗体断片 (フラグメント）が含まれる。
[0099] ポリクローナル抗体であれば、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血 液力 公知の方法により血清を分離し、ポリクローナル抗体を含む血清とすることが できる。
[0100] 必要に応じてこの血清力 ポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもで きる。 [0101] モノクローナル抗体であれば、上記抗原を感作した哺乳動物の脾臓あるいはリンパ 節から得られた抗体産生細胞を取り出し、骨髄腫細胞などと細胞融合させ、得られた ハイプリドーマ（融合細胞）をクローユングして、その培養物力も抗体を回収しモノクロ ーナル抗体とすることができる。
[0102] 免疫抗原としては、 187A5タンパク質のフラグメントを用いることができる。あるいは 、上記アミノ酸配列に基づき合成したものを用いることができる。抗原はキャリア蛋白 質との複合体として用いてもよい。抗原とキャリアタンパク質の複合体の調製には種 々の縮合剤を用いることができる力 ダルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活 性エステル等が使用できる。キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、サイログロブリン
、へモシァニン等の常用されているものでよぐ通常 1〜5倍量の割合でカップリング させる方法が用いられる。
[0103] 免疫される動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ゥサギ、ネコ、ィヌ 、ブタ、ャギ、ゥマあるいはゥシ、好ましくはマウス、ラット、ゥサギ、モルモット、ハムス ターなどが挙げられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内の投与が挙げられる。 投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して 投与してもよぐ投与は通常 2〜5週毎に 1回ずつ行われる。
[0104] 免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節力 得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞 と細胞融合させ、ハイプリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、 ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ま 、 力 異種間においても可能な場合もある。
[0105] ハイプリドーマ（細胞融合）の操作は既知の方法、例えば、 Nature, 256,495, 1975 に従って実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウィルス などが挙げられ、通常には、 20〜50%程度の濃度のポリエチレングリコール (平均分 子量 1000〜4000)を用いて 20。C〜40。C、好ましくは 30。C〜37。Cの温度下、抗体 産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常 1： 1〜10： 1程度、約 1〜10分間程度反応 させることにより細胞融合を実施することができる。
[0106] 抗体産生ノ、イブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる 。例えば、 187A5タンパク質をコートしたマイクロプレートを用いる ELISA法、抗免疫 グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いる EIA法、 187A5タンパク質を含 むサンプルを電気泳動後、ニトロセルロース転写膜を用いるィムノブロット法などが挙 げられる。
[0107] このようなゥエルから更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行い、クロー ンを得ることができる。ハイプリドーマの選別、育種は、通常、 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、チミジン）を添加して、 10〜20%牛胎児血清を含む動物細胞用培地 (例、 RPMI1640)で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタ ンを投与した SCIDマウスの腹腔内へ移植し、 10〜14日後にモノクローナル抗体を 高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを 培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。
[0108] モノクローナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いれば よぐたとえば、硫安分画法、 PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利 用、さらに 187A5タンパク質を用いるァフィ-ティクロマトグラフィーなどの手段により 容易に達成することができる。
[0109] 血清力ものポリクローナル抗体の精製も同様に行うことができる。
[0110] [検出方法]
187A5遺伝子の発現は、前記のように、ドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞、好ま しくは、ドーノミン産生-ユーロン増殖前駆細胞の存在の指標となる。従って、本発明 によれば、 187A5遺伝子の発現を検出することにより、ドーノ ミン産生-ユーロン前 駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を検出または選択する ことができる。
[0111] ここで、「187A5遺伝子の発現を検出する」方法としては、被験細胞試料における 1 87A5遺伝子の発現を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、下記工程 により実施することができる：
(a)被験細胞試料と本発明によるプローブ、プライマー、またはプライマーセットとを 接触させる工程；および (b)反応性の有無を検出する工程。
[0112] ここで「反応性の有無を検出する」方法としては、例えば、ハイブリダィゼーシヨン法 、核酸増幅法が挙げられる。 [0113] ここで、「被験細胞試料」とは、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を含むと考えられる細胞試料であればよぐ好ま しくは、中脳腹側領域の細胞を用いることができる。中脳腹側領域の細胞は公知の 方法により取得することができ（Studer, L., et al. Nature Neurosci (1998) 1:290-295) 、例えば、胎児 (好ましくは、ヒト中絶胎児)または患者自身の中脳腹側領域の細胞を 被験細胞試料として用いることができる。また、イン'ビトロで分ィ匕誘導されたドーパミ ン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーノミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を含 む培養細胞を用いることができる。イン'ビトロにおけるドーノミン産生ニューロン前駆 細胞あるいはドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞への分ィ匕誘導は、公知の ES 細胞（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(l):31— 40, Lee, SH.， et al. Nature Biotech (20 00) 18:675-579)、骨髄間質細胞、神経由来の不死化セルライン (特表平 8— 50921 5号公報；特表平 11 - 506930号公報；特表 2002— 522070号公報）、ニューロン 始原細胞 (特表平 11 509729号公報)等の細胞を出発材料として、公知の方法、 例えば、 SDIA法（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(l):31- 40)、 5— stage法 (Lee, SH ., et al. Nature Biotech (2000) 18:675- 579)等による分化させる処理を行うことにより 実施することができる。好ましくは、 SDIA法による分ィ匕させる処理が行われた ES細 胞を被験細胞試料として用いることができる。
[0114] ここで「SDIA法」は、無血清培地中で、 ES細胞をストローマ細胞株 PA6と共培養 することにより行うことができる（Kawasaki et. al. Neuron. 2000 28(1):31- 40)。また、「 5— stage法」は、 ES細胞を血清存在下で非付着性培養皿上で培養することにより e mbryoid body (EB)を形成させ、続!、て EBを付着性培養皿上に付着させることで 、神経前駆細胞を選択する。最後に、 Shh、 FGF2、 FGF8等の成長因子を添加し、 ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞を誘導することにより行うことができる (Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675—579)。
[0115] 本発明による検出方法の第一の態様によれば、本発明によるプローブを用いて、 該検出用ポリヌクレオチドを核酸試料 (mRNAまたはその転写産物）とハイブリダィズ させ、ハイブリダィゼーシヨン複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を検出することに より細胞試料における 187A5遺伝子の発現を検出することができる。 [0116] ハイブリダィゼーシヨン法の詳細な手順にっ 、ては、『Molecular Cloning, A Labora tory Manual 2nd ed.J(Cold Spring Harbor Press(1989)、特に Section 9.47-9.58)、『Cu rrent Protocols in Molecular Biology JRjohn Wiley & Sons(1987— 1997)、特に Section 6.3-6.4)、『DNA Cloning l:Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University(1995)、条件については特に Section 2.10)を参照することができる。
[0117] ノ、イブリダィゼーシヨン法を利用した 187A5遺伝子の発現を検出は、例えば、下記 工程により実施することができる：
(a— 1)被験細胞試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させ る工程；および
(b— 1)ハイブリダィゼーシヨン複合体を検出する工程。
[0118] 工程 (a—l)において、ドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産 生-ユーロン増殖前駆細胞を含むと考えられる細胞試料から調製された mRNAまた はその mRNA力 転写された相補的 DNA (cDNA)を、被験細胞試料由来のポリヌ クレオチドとして、プローブと接触させることができる。
[0119] プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標 識としては例えば、放射能活性 (例えば、 32P、 "C、および35 S)、蛍光 (例えば、 FIT
C、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応 (例えば、ペルォキシダーゼ、アルカリ フォスファターゼ)等を利用した標識が挙げられる。
[0120] ハイブリダィゼーシヨン産生物の検出は、ノーザンハイブリダィゼーシヨン、サザンハ イブリダィゼーシヨン、コロニーハイブリダィゼーシヨン等の周知の方法を用いて実施 できる。
[0121] ノ、イブリダィゼーシヨン複合体が検出された細胞は、 187A5遺伝子を発現している 細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と判定することができる。
[0122] 本発明による検出方法の第二の態様によれば、本発明によるプライマーまたはブラ イマ一セットを用いて核酸増幅法により核酸試料 (mRNAまたはその転写産物）を増 幅させ、増幅産物を検出することにより、細胞試料における 187A5遺伝子の発現を 検出することができる。 [0123] 核酸増幅法を利用した 187A5遺伝子の発現の検出は、例えば、下記工程により実 施することができる：
(a— 2)被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを铸型とし、本発明によるプライマーま たはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および
(b - 2)形成された増幅産物を検出する工程。
[0124] 工程 (a— 2)において、ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産 生-ユーロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験試料から調製された mRNAまた はその mRNA力も転写された相補的 DNA(cDNA)を铸型として用いることができる
[0125] 増幅産物の検出は、 PCR法、 RT—PCR法、リアルタイム PCR法、 LAMP法等の 核酸増幅法を用いて実施できる。
[0126] 増幅産物が検出される細胞は、 187A5遺伝子を発現している細胞であるので、該 細胞を、ドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン 増殖前駆細胞と判定することができる。
[0127] 187A5タンパク質は、前記のように、ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましく は、ドーノミン産生-ユーロン増殖前駆細胞の存在の指標となる。従って、本発明に よれば、 187A5タンパク質を検出することにより、ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞
、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を検出または選択することがで きる。
[0128] ここで、 「187A5タンパク質を検出する」方法としては、被験細胞試料における 187 A5タンパク質を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、抗原抗体反応法 が挙げられる。
[0129] 本発明による検出方法の第三の態様によれば、本発明による抗体と細胞試料とを 接触させ、抗原抗体反応を検出することにより細胞試料における 187A5タンパク質 を検出することができる。
[0130] 抗原抗体反応を利用した 187A5タンパク質の検出は、例えば、下記工程により実 施することができる：
(c)被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程；およ び
(d)反応性に有無を検出する工程。
[0131] ここで、「反応性の有無を検出する」方法としては、例えば、抗原抗体反応法が挙げ られる。
[0132] ここで、「被験細胞試料」とは、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料であればよぐ 好ましくは、中脳腹側領域の細胞、あるいはイン'ビトロで分ィ匕誘導されたドーパミン 産生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を含む 培養細胞である。被験細胞試料は、例えば、胎児中脳由来のものを用いることができ る。被験細胞試料の取得方法等は前記の通りである。
[0133] 抗原抗体反応法を利用した 187A5タンパク質の検出は、例えば、下記工程により 実施することができる：
(c 1)被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程； および
(d— 1)抗体抗原複合体を検出する工程。
[0134] 抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、 ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆 細胞を含むと考えられる被験細胞試料中の 187A5タンパク質を検出することができ る。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の 分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ゥェ スタンプロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することが できる。免疫組織染色法は、例えば標識ィ匕抗体を用いる直接法、該抗体に結合性を 有する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識ィ匕 剤としては螢光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用す ることがでさる。
[0135] 被験細胞試料由来のタンパク質は、細胞外領域 (すなわち N末端領域)を含んでな るポリペプチドであることが好まし!/、。
[0136] 抗体抗原複合体が検出される細胞は、 187A5タンパク質を発現している細胞であ るので、該細胞を、ドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生 ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
[0137] パーキンソン病の治療に用いるためには、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好 ましくはドーノミン産生-ユーロン増殖前駆細胞は純度が高 、ことが望ま 、。
[0138] 前記の各検出工程は 1回のみならず、同工程を繰り返し行うことにより、ドーパミン 産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノミン産生-ユーロン増殖前駆細胞の検 出または選択の精度を高めて 、くことができる。
[0139] 従って、本発明による検出方法によれば、前記の工程を 2回以上行うことにより、ド ーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細 胞をより高精度に検出または選択することができる。
[0140] また、他のマーカー遺伝子、好ましくは 187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユー ロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子、を併用することにより、さらにドーノミン産生-ュ 一ロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞の検出または 選択の精度を高めて 、くことができる。
[0141] 従って、本発明による検出方法によればまた、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産 生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質、分裂停止後ドー ノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質、 187A5遺伝 子以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質、 あるいは成熟ドーノ ミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を 併用し、 187A5遺伝子の発現またはそのタンパク質のみならず、前記した他のマー カー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出することにより、ドーパミン産生-ュ 一ロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞をより高精度に 検出または選択することができる。
[0142] 各分ィヒ段階において選択的に発現するドーパミン産生-ユーロン関連マーカー遺 伝子を図 1に示す。
[0143] 187A5遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においては、 187A5 遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタ ンパク質を併用し、 187A5遺伝子のみならず、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生 ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出する ことにより、ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産生-ユーロ ン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
[0144] 具体的には、工程 (a)にお ヽて、被験細胞試料として、 187A5遺伝子以外のドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が 検出された細胞を使用することにより、ドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましく は、ドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することがで きる。この場合、工程 (b)において、反応性が検出された細胞 (例えば、ハイブリダィ ゼーシヨン複合体または増幅産物が検出された細胞）は、 187A5遺伝子を発現し、 かつ、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝 子を発現している力、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、 検出または選択されたドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産 生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
[0145] また、工程 (b)にお 、て、反応性が検出された細胞 (例えば、ハイブリダィゼーショ ン複合体または増幅産物が検出された細胞）について、（e— 1) 187A5遺伝子以外 のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパ ク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミ ン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を 検出または選択することができる。この場合、工程 (e— 1)において、 187A5遺伝子 以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタ ンパク質が検出された細胞は、 187A5遺伝子を発現し、かつ、 187A5遺伝子以外 のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現して 、る力、または そのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパ ミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と 高精度に判定することができる。
[0146] 187A5遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、分裂 停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を 併用し、 187A5遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細 胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されないことを確認することに より、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖 前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
[0147] 具体的には、工程 (a)において、被験細胞試料として、分裂停止後ドーパミン産生 ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されなかつ た細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この 場合、工程 (b)において、反応性が検出された細胞 (例えば、ハイブリダィゼーシヨン 複合体または増幅産物が検出された細胞）は、 187A5遺伝子は発現するが、分裂 停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタ ンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン 産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と高 精度に判定することができる。
[0148] また、工程 (b)にお 、て、反応性が検出された細胞 (例えば、ハイブリダィゼーショ ン複合体または増幅産物が検出された細胞）について、（e— 2)分裂停止後ドーパミ ン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する 工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生-ユーロ ン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を検出または選択 することができる。この場合、工程 (e— 2)において、分裂停止後ドーパミン産生-ュ 一ロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されない細胞は
、 187A5遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マー カー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を 、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン 産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
[0149] 187A5遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、 187 A5遺伝子以外のドーノミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタン ノ ク質を併用し、 187A5遺伝子のみならず、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生- ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出することによ り、ドーパミン産生- ロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生- ロン増殖前 駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
[0150] 具体的には、工程 (a)において、被験細胞試料として、 187A5遺伝子以外のドー ノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出 された細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ド ミン産生- ロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。 この場合、工程 (b)において、反応性が検出された細胞 (例えば、ハイブリダィゼーシ ヨン複合体または増幅産物が検出された細胞）は、 187A5遺伝子を発現し、かつ、 1 87A5遺伝子以外のドー ミン産生- ロン前駆細胞マーカー遺伝子を発現して いるか、またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選 択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドー ミン産生ニューロン 増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
[0151] また、工程 (b)にお 、て、反応性が検出された細胞 (例えば、ハイブリダィゼーショ ン複合体または増幅産物が検出された細胞）について、（e— 3) 187A5遺伝子以外 のドーパミン産生- ロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質 を検出する工程を更に含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産 生- ロン前駆細胞、好ましくは、ドー ミン産生- ロン増殖前駆細胞を検出 または選択することができる。この場合、工程 (e— 3)において、 187A5遺伝子以外 のドーパミン産生- ロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質 が検出された細胞は、 187A5遺伝子を発現し、かつ、 187A5遺伝子以外のドーパミ ン産生- ロン前駆細胞マーカー遺伝子を発現して 、る力、またはそのタンパク質 が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生- ロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定 することができる。
[0152] 187A5遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、成熟 ドー ミン産生- ロン細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、 187 A5遺伝子は発現する力 成熟ドー ミン産生- ロン細胞マーカー遺伝子の発 現またはそのタンパク質が検出されないことを確認することにより、ドーパミン産生-ュ 一ロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を高精度に検 出または選択することができる。
[0153] 具体的には、工程 (a)において、被験細胞試料として、成熟ドーパミン産生-ユーロ ン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されな力つた細胞を使用 することにより、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産生-ュ 一ロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ b)において、反応性が検出された細胞 (例えば、ハイブリダィゼーシヨン複合体また は増幅産物が検出された細胞）は、 187A5遺伝子は発現するが、成熟ドーパミン産 生-ユーロン細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しな 、細 胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞 、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができ る。
[0154] また、工程 (b)にお 、て、反応性が検出された細胞 (例えば、ハイブリダィゼーショ ン複合体または増幅産物が検出された細胞）について、（e— 4)成熟ドーパミン産生 ニューロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に 含んでなる方法を実施することにより、高精度にドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞、 好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができ る。この場合、工程 (e— 4)において、成熟ドーノミン産生-ユーロン細胞マーカー遺 伝子の発現またはそのタンパク質が検出されない細胞は、 187A5遺伝子は発現す る力 成熟ドーノ ミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタン ノ ク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産 生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と高精 度に判定することができる。
[0155] 187A5タンパク質を検出することを特徴とする検出方法においては、 187A5遺伝 子以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパ ク質を併用し、 187A5タンパク質のみならず、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生 ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出する ことにより、ドーノミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産生-ユーロ ン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
[0156] 具体的には、工程 (c)において、被験細胞試料として、 187A5遺伝子以外のドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が 検出された細胞を使用することにより、ドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましく は、ドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することがで きる。この場合、工程 (d)において、反応性が検出された細胞 (例えば、抗原抗体複 合体が検出された細胞）は、 187A5タンパク質が存在し、かつ、 187A5遺伝子以外 のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現して 、る力、または そのタンパク質が存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパ ミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と 高精度に判定することができる。
[0157] また、工程 (d)にお 、て、反応性が検出された細胞 (例えば、抗原抗体複合体が検 出された細胞）について、（e—l) 187A5遺伝子以外のドーノミン産生-ユーロン増 殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含 んでなる方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好 ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる 。この場合、工程 (e—l)において、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン 増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された細胞は、 1 87A5タンパク質が存在し、かつ、 187A5遺伝子以外のドーノミン産生-ユーロン増 殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現して 、る力、またはそのタンパク質が存在する細 胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞 、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができ る。
[0158] 187A5タンパク質を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、分裂停止 後ドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し 、 187A5タンパク質は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞 マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されないことを確認することによ り、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前 駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
[0159] 具体的には、工程 (c)において、被験細胞試料として、分裂停止後ドーパミン産生 ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されなかつ た細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この 場合、工程 (d)において、反応性が検出された細胞 (例えば、抗原抗体複合体が検 出された細胞）は、 187A5タンパク質は存在する力 分裂停止後ドーパミン産生-ュ 一ロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しな 、細胞 であるから、該細胞を、検出または選択されたドーノミン産生-ユーロン前駆細胞、 好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる
[0160] また、工程 (d)にお 、て、反応性が検出された細胞 (例えば、抗原抗体複合体が検 出された細胞）について、（e— 2)分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マ 一力一遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を 実施することにより、高精度にドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、 工程 (e— 2)において、分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝 子の発現またはそのタンパク質が検出されな 、細胞は、 187A5タンパク質は存在す る力、分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現せず、 またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたド ーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細 胞と高精度に判定することができる。
[0161] 187A5タンパク質を検出することを特徴とする検出方法においてはさらに、 187A 5遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタン パク質を併用し、 187A5タンパク質のみならず、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産 生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質をも検出すること により、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増 殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。 [0162] 具体的には、工程 (c)において、被験細胞試料として、 187A5遺伝子以外のドー ノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質が検出された 細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミ ン産生-ユーロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場 合、工程 (d)において、反応性が検出された細胞 (例えば、抗原抗体複合体が検出 された細胞）は、 187A5タンパク質が存在し、かつ、 187A5遺伝子以外のドーノミン 産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子を発現して 、る力、またはそのタンパク質が 存在する細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生-ユーロ ン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定す ることがでさる。
[0163] また、工程 (d)にお 、て、反応性が検出された細胞 (例えば、抗原抗体複合体が検 出された細胞）について、（e— 3) 187A5遺伝子以外のドーノミン産生-ユーロン前 駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでな る方法を実施することにより、高精度にドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましく は、ドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この 場合、工程 (e— 3)において、 187A5遺伝子以外のドーノミン産生-ユーロン前駆 細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された細胞は、 187A5タン パク質が存在し、かつ、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マ 一力一遺伝子を発現して 、る力 またはそのタンパク質が存在する細胞であるから、 該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ド 一ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
[0164] 187A5タンパク質を検出することを特徴とする検出方法においてはさらに、成熟ド ーパミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質を併用し、 187A 5タンパク質は発現する力 成熟ドーパミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子の発 現またはそのタンパク質が検出されないことを確認することにより、ドーパミン産生-ュ 一ロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を高精度に検 出または選択することができる。
[0165] 具体的には、工程 (c)において、被験細胞試料として、成熟ドーパミン産生-ユーロ ン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されな力つた細胞を使用 することにより、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産生-ュ 一ロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ d)において、反応性が検出された細胞 (例えば、抗原抗体複合体が検出された細胞
)は、 187A5タンパク質は存在する力 成熟ドーパミン産生ニューロン細胞マーカー 遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しない細胞であるから、該細胞を、検 出または選択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生 ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
[0166] また、工程 (d)にお 、て、反応性が検出された細胞 (例えば、抗原抗体複合体が検 出された細胞）について、 （e— 4)成熟ドーパミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝 子の発現またはそのタンパク質を検出する工程を更に含んでなる方法を実施するこ とにより、高精度にドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生- ユーロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程 (e— 4)に ぉ 、て、成熟ドーノ ミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタン ノ ク質が検出されない細胞は、 187A5タンパク質は存在する力 成熟ドーパミン産 生-ユーロン細胞マーカー遺伝子は発現せず、またそのタンパク質も存在しな 、細 胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーノミン産生-ユーロン前駆細胞 、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができ る。
[0167] 「187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子ま たはそのタンパク質」とは「187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆 細胞マーカー遺伝子」または Γ187Α5タンパク質以外のドーノミン産生-ユーロン増 殖前駆細胞マーカータンパク質」である。
[0168] 「187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」と しては、中脳最腹側脳室領域 (VZ領域）に発現している 187A5遺伝子以外のドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、 Lrp4遺伝 子、 Nato3遺伝子、 Msxl遺伝子、 Msx2遺伝子、 Mashl遺伝子が挙げられる。
[0169] Lrp4遺伝子については、 WO2004Z065599号公報に記載されている。 Nato3 遺伝子については、 WO2007Z021003号公報に記載されている。 Msxl遺伝子 および Msx2遺伝子については、 WO2007Z021004号公報に記載されている。 M ashl遺 is子につ ヽて ίま、 Kele J, Simplicio N, Fern AL, Mira H, Guillemot F, Arena s E, Ang SL.Neurogenin 2 is required for the development of ventral midbrain dopa minergic neurons. Development. 2006 Feb;133(3):495- 505に記載されている。
[0170] 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の 検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定 されず、例えば、上記のハイブリダィゼーシヨン法、核酸増幅法が挙げられる。
[0171] 「187A5タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカータンパ ク質」としては、中脳最腹側脳室領域 (VZ領域）に発現している 187A5タンパク質以 外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカータンパク質が挙げられ、好まし くは、ドーノミン産生-ユーロン増殖前駆細胞のみで検出されるタンパク質が挙げら れる。
[0172] このようなタンパク質としては、例えば、 Lrp4遺伝子、 Nato3遺伝子、 Msxl遺伝子 、 Msx2遺伝子、 Mashl遺伝子のタンパク質が挙げられる。
[0173] 187A5タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカータンパク 質の検出は、公知のタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば 特に限定されず、例えば、上記の抗原抗体反応法が挙げられる。
[0174] 「分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパ ク質」としては、中脳最腹側外套層（ML領域）に発現して 、る遺伝子またはそのタン パク質が挙げられ、例えば、 Nurrl遺伝子、 Enl遺伝子、 En2遺伝子、 Ptx3遺伝子 、 TH遺伝子が挙げられる。また、中脳最腹側脳室領域 (VZ領域）に発現している遺 伝子またはそのタンパク質が挙げられ、例えば、 65B13遺伝子が挙げられる。
[0175] Nurrl遺伝子については、 Science. 1997 11;276(5310):248-50に記載されている。
Enl遺伝子については、 J. Neurosci.2001 21(9): 3126-34に記載されている。 En2遺 伝子については、 J. Neurosci.2001 21(9): 3126- 34に記載されている。 Ptx3遺伝子 については、 Pro Natl.Acad.Sci.1997 94: 13305- 10に記載されている。 TH遺伝子 については、 Science. 1997 11;276(5310):248-50に記載されている。 65B13遺伝子 【こつ ヽて ίま、 WO2004/038018号公報【こ記載されて!ヽる。
[0176] 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク 質の検出は、公知の遺伝子またはそのタンパク質の発現を検出できる方法を用いて 行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダィゼーシヨン法、核酸増 幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
[0177] 「187Α5遺伝子以外のドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子または そのタンパク質」とは「187Α5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マー カー遺伝子」または「187Α5タンパク質以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マ 一力一タンパク質」である。
[0178] 「187Α5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子」として は、中脳最腹側に発現している 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆 細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、 Lmxla遺伝子が挙げられる。
[0179] Lmxla遺伝子については、 WO2005Z052190号公報に記載されている。
[0180] 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子の検出 は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定され ず、例えば、上記のハイブリダィゼーシヨン法、核酸増幅法が挙げられる。
[0181] 「187A5タンパク質以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカータンパク質」 としては、中脳最腹側に発現している 187A5タンパク質以外のドーノ ミン産生-ユー ロン前駆細胞マーカータンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、例え ば、 Lmxla遺伝子のタンパク質が挙げられる。
[0182] 187A5タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカータンパク質の 検出は、公知のタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に 限定されず、例えば、上記の抗原抗体反応法が挙げられる。
[0183] 「成熟ドーノ ミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子」としては、例えば、 DAT遺伝 子が挙げられる。
[0184] DAT遺伝子については、 Development 2003 131: 1145-55に記載されている。
[0185] 成熟ドーノ ミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質の検出は 、公知の遺伝子またはそのタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであ れば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダィゼーシヨン法、核酸増幅法、抗原 抗体反応法が挙げられる。
[0186] また、 187A5遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された 遺伝子構築物を含んでなるベクターを併用することにより、さらにドーパミン産生-ュ 一ロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞の検出または 選択の精度を高めて 、くことができる。
[0187] 従って、本発明による検出方法によればまた、 187A5遺伝子のプロモーターとマ 一力一遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を併用し、 187A5遺伝子の 発現またはそのタンパク質のみならず、マーカー遺伝子の発現をも検出することによ り、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前 駆細胞をより高精度に検出または選択することができる。
[0188] 187A5遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝 子構築物を含んでなるベクターを利用したドーパミン産生-ユーロン前駆細胞の検出 は、例えば、特開 2002— 51775号公報に従って実施することができる。
[0189] ドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞で発現する 187A5遺伝子のプロモーター Zェ ンハンサ一の制御下で検出可能なマーカー遺伝子を細胞集団の各細胞に導入し、 マーカー遺伝子の発現を検出することにより、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を 検出することができる。
[0190] 具体的には、本発明による遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能 に連結された遺伝子構築物を含んでなるベクターにより被験細胞試料を形質転換し 、該被験細胞試料における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程を実施すること により、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を検出または選択することができる。この 場合、該工程において、マーカー遺伝子の発現が検出された細胞を、検出または選 択されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、好ましくは、ドーノミン産生ニューロン 増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
[0191] ここで、「本発明による遺伝子のプロモーター」のヌクレオチド配列としては、後述す る 187A5遺伝子の発現領域解析により得られたプロモーター部分のヌクレオチド配 列が挙げられるが、プロモーター活性を有する同等程度有するその改変配列も含ま れる。
[0192] ここで、「マーカー遺伝子」としては、 187A5遺伝子のプロモーター Zェンハンサー の制御下で検出可能なマーカー遺伝子であればよぐ例えば、 GFP等が挙げられる
[0193] ここで、「遺伝子構築物」としては、 187A5遺伝子の発現制御配列（プロモーター、 ェンハンサ一等を含む）の制御下に、 187A5遺伝子がマーカー遺伝子の上流もしく は下流に連結された構造を有していてもよい。その他、 187A5遺伝子座へマーカー をコードする遺伝子をノックインすることができる。該遺伝子構築物の好まし 、態様と しては、例えば、図 15において 2〜4に模式的に記載された構造の構築物を例示す ることがでさる。
[0194] [検出キット]
本発明によれば、本発明による検出方法を実施するための検出キットが提供される
[0195] 本発明による検出キットの第一の態様としては、本発明による検出方法の第一の態 様を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には 187A5遺伝子の発現を検 出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙 げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリ ッド形成法により 187A5遺伝子の発現を検出する。従って第一の態様の検出キット は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検 出に用いられる基質化合物、ハイブリダィゼーシヨン緩衝液、説明書、および Zまた は器具などを更に含むことができる。
[0196] また、精度の高い検出を行うための検出キットとしては、 187A5遺伝子以外のドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタ ンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子 の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーノミン産生-ユーロン細胞マーカ 一遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマ 一セットまたは抗体を更に含んでなるキットが挙げられる。これらのプローブ、プライマ プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは ハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、 187A 5遺伝子以外のドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現また はそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生- ロン前駆細胞マーカー遺伝子 の発現またはそのタンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生- ロン前駆 細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生- ロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
[0197] 本発明による検出用キットの第二の態様としては、本発明による検出方法の第二の 態様を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、 187A5遺伝子の発現を 検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマ セットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法に より 187A5遺伝子の発現を検出する。従って第二の態様の検出キットは、所望により 、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、増幅反応が正常に進 行し得ることを示す内部標準、説明書、および Zまたは器具などを更に含むことがで きる。
[0198] また、精度の高い検出を行うための検出キットとしては、 187A5遺伝子以外のドー ミン産生- ロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタ ンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生- ロン前駆細胞マーカー遺伝子 の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドー ミン産生- ロン細胞マーカ 遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライ プライマ セットまたは抗体を更に含んでなるキットが挙げられる。これらのプローブ、プライマ プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは ハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、 187A 5遺伝子以外のドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現また はそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生- ロン前駆細胞マーカー遺伝子 の発現またはそのタンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生- ロン前駆 細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生- ユーロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
[0199] 本発明による検出キットの第三の態様としては、本発明による検出方法の第三の態 様を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、 187A5タンパク質を検出 するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられ る。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検 出することにより 187A5タンパク質の発現を検出する。従って第三の態様の検出キッ トは、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えば ELISA法等 に用いる 2次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および Zまたは器具などを更に含 むことができる。
[0200] また、精度の高い検出を行うための検出キットとしては、 187A5遺伝子以外のドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタ ンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子 の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーノミン産生-ユーロン細胞マーカ 一遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマ 一セットまたは抗体を更に含んでなるキットが挙げられる。これらのプローブ、プライマ 一、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは ハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、 187A 5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現また はそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子 の発現またはそのタンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロン前駆 細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生- ユーロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
[0201] さらに、精度の高い検出を行うための検出キットとしては、 187A5遺伝子のプロモ 一ターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベタ ターを更に含んでなる、本発明による第一ないし第三の態様の検出キットが挙げられ る。
[0202] [検出用試薬] 本発明によれば、本発明による検出方法を実施するための検出用試薬が提供され る。
[0203] 本発明による検出用試薬の第一の態様としては、本発明による検出方法の第一の 態様を実施するための検出用試薬が挙げられ、具体的には 187 A5遺伝子の発現を 検出するための試薬であって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなる検出用 試薬が挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用試薬は ハイブリッド形成法により 187A5遺伝子の発現を検出する。従って第一の態様の検 出用試薬は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば 標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダィゼーシヨン緩衝液、説明書、およ び Zまたは器具などを更に含むことができる。
[0204] また、精度の高い検出を行うための検出用試薬としては、 187A5遺伝子以外のド ーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質 、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはその タンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝 子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生-ユーロン細胞マー カー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライ マーセットまたは抗体を更に含んでなる検出用試薬が挙げられる。これらのプローブ 、プライマー、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出 用試薬はハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法によ り、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の 発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー 遺伝子の発現またはそのタンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロ ン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン 産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
[0205] 本発明による検出用試薬の第二の態様としては、本発明による検出方法の第二の 態様を実施するための検出用試薬が挙げられ、具体的には、 187A5遺伝子の発現 を検出するための試薬であって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライ マーセットを少なくとも含んでなる検出用試薬が挙げられる。この検出用試薬は核酸 増幅法により 187A5遺伝子の発現を検出する。従って第二の態様の検出用試薬は 、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、増幅反応 が正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および Zまたは器具などを更に 含むことができる。
[0206] また、精度の高い検出を行うための検出用試薬としては、 187A5遺伝子以外のド ーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質 、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはその タンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝 子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生-ユーロン細胞マー カー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライ マーセットまたは抗体を更に含んでなる検出用試薬が挙げられる。これらのプローブ 、プライマー、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出 用試薬はハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法によ り、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の 発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー 遺伝子の発現またはそのタンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロ ン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン 産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
[0207] 本発明による検出用試薬の第三の態様としては、本発明による検出方法の第三の 態様を実施するための検出用試薬が挙げられ、具体的には、 187A5タンパク質を検 出するための試薬であって、本発明による抗体を少なくとも含んでなる検出用試薬が 挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用試薬は抗原抗体 反応を検出することにより 187A5タンパク質の発現を検出する。従って第三の態様 の検出用試薬は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えば ELISA法等に用いる 2次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および Zまたは器具な どを更に含むことができる。
[0208] また、精度の高い検出を行うための検出用試薬としては、 187A5遺伝子以外のド ーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質 、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはその タンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生- ロン前駆細胞マーカー遺伝 子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン産生-ユーロン細胞マー カー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライ マーセットまたは抗体を更に含んでなる検出用試薬が挙げられる。これらのプローブ 、プライマー、プライマーセットまたは抗体は、標識したものであってもよい。この検出 用試薬はハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法によ り、 187A5遺伝子以外のドー ミン産生- ロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の 発現またはそのタンパク質、分裂停止後ドーパミン産生- ロン前駆細胞マーカー 遺伝子の発現またはそのタンパク質、 187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロ ン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質、あるいは、成熟ドーパミン 産生- ロン細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を更に検出する。
[0209] さらに、精度の高い検出を行うための検出用試薬としては、 187A5遺伝子のプロモ ターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された遺伝子構築物を含んでなるベタ ターを更に含んでなる、本発明による第一ないし第三の態様の検出用試薬が挙げら れる。
[0210] [スクリーニング方法]
本発明による検出方法は、ドーパミン産生- ロン前駆細胞への分ィ匕誘導に有 効な物質のスクリーニングに適用することができる。すなわち、候補物質の添カ卩により 、ドーパミン産生- ロン前駆細胞、好ましくはドーパミン産生- ロン増殖前駆 細胞に分化誘導されたか否かを、 187A5遺伝子の発現またはそのタンパク質を指 標として判定することにより、ドー ミン産生- ロン前駆細胞への分ィ匕誘導に有 効な物質をスクリーニングすることができる。
[0211] 従って、本発明によれば、下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆 細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
(i)ドーパミン産生- ロン前駆細胞に分ィ匕し得る細胞と、被験物質とを接触させる 工程；および
(ii)被験物質を接触させた後の前記細胞における 187A5遺伝子の発現またはその タンパク質を検出する工程。
[0212] 工程 (i)において、ドーパミン産生- ロン前駆細胞に分ィ匕し得る細胞に分ィ匕し 得る細胞は、好ましくはドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞に分ィヒし得る細胞で あり、好ましくは、胎児中脳、または ES細胞より分化誘導した神経前駆細胞を含む培 養細胞力 採取することができる。
[0213] 工程 (i)において、「被験物質を接触させる」とは、例えば、ドーパミン産生-ユーロ ン前駆細胞に分ィヒし得る細胞、好ましくはドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞に 分ィ匕し得る細胞を含む培養細胞に被験物質を添加することにより行うことができる。
[0214] 「被験物質」としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または 部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質 (細菌代謝産物を含む)、核酸 (アンチ センス、リボザィム、 RNAi等）等が挙げられ、好ましくは、化合物もしくはその塩また はそれらの溶媒和物（例えば、水和物）であるが、これらに限定されるものではない。 「被験物質」は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
[0215] X@ (ii)においては、本発明による検出方法に従って、 187A5遺伝子の発現また はそのタンパク質を検出することができる。
[0216] 具体的には、ハイブリダィゼーシヨン法を利用した検出については工程 (a— 1)およ び (b - 1)を、核酸増幅法を利用した検出につ!、ては工程 (a- 2)および (b— 2)を、 抗原抗体反応法を利用した検出にっ 、ては工程 (c- 1)および (d— 1)それぞれ実 施することにより、 187A5遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出することができ る。
[0217] 工程 (ii)にお 、て、被験物質を接触させて、被験細胞試料にぉ ヽて 187A5遺伝 子の発現またはそのタンパク質が検出された場合に、該物質をドー ミン産生- ロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞への分ィ匕誘導に 有効な物質であると判定することができる。
[0218] 本発明によるスクリーニング法により特定された物質は、ドー ミン産生- ロン 前駆細胞、好ましくはドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効 な物質として用いることができる。
[0219] 本発明によれば、更に下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞 への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
(iii 1)被験物質を接触させた後の前記細胞における、 187A5遺伝子以外のドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を 検出する工程。
[0220] 工程 (ii)にお 、て、 187A5遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出され、かつ、 工程 (iii— 1)において、 187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細 胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出された場合に、該物質をドー ノ ミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞 への分ィ匕誘導に有効な物質であると高精度に判定することができる。
[0221] 工程 (iii— 1)は、工程 (i)の後に行われればよぐ工程 (ii)の前でも後でもよい。
[0222] 本発明によれば、更に下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞 への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
(iii 2)被験物質を接触させた後の前記細胞における、分裂停止後ドーパミン産生 ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク質の発現を検出する工程。
[0223] 工程 (ii)において、 187A5遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出されたが、 工程 (iii 2)において、分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺 伝子またはそのタンパク質が検出されな力つた場合に、該物質をドーパミン産生-ュ 一ロン前駆細胞、好ましくは、ドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞への分ィ匕誘導 に有効な物質であると高精度に判定することができる。
[0224] 工程 (iii 2)は、工程 (i)の後に行われればよぐ工程 (ii)の前でも後でもよい。
[0225] 「187A5遺伝子以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子ま たはそのタンパク質」とは「187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆 細胞マーカー遺伝子」または Γ187Α5タンパク質以外のドーノミン産生-ユーロン増 殖前駆細胞マーカータンパク質」である。
[0226] 「187A5遺伝子以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」と しては、中脳最腹側脳室領域 (VZ領域）に発現している 187A5遺伝子以外のドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、 Lrp4遺伝 子、 Nato3遺伝子、 Msxl遺伝子、 Msx2遺伝子、 Mashl遺伝子が挙げられる。 [0227] 187A5遺伝子以外のドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の 検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定 されず、例えば、上記のハイブリダィゼーシヨン法、核酸増幅法が挙げられる。
[0228] 「187A5タンパク質以外のドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞マーカータンパ ク質」としては、中脳最腹側脳室領域 (VZ領域）に発現している 187A5タンパク質以 外のドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞マーカータンパク質が挙げられ、好まし くは、ドー ミン産生- ロン増殖前駆細胞のみで検出されるタンパク質が挙げら れる。
[0229] このようなタンパク質としては、例えば、 Lrp4遺伝子、 Nato3遺伝子、 Msxl遺伝子
Msx2遺伝子、 Mashl遺伝子のタンパク質が挙げられる。
[0230] 187A5タンパク質以外のドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞マーカータンパク 質の検出は、公知のタンパク質の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば 特に限定されず、例えば、上記の抗原抗体反応法が挙げられる。
[0231] 「分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパ ク質」としては、中脳最腹側外套層（ML領域）に発現して 、る遺伝子またはそのタン パク質が挙げられ、例えば、 Nurrl遺伝子、 Enl遺伝子、 En2遺伝子、 Ptx3遺伝子 TH遺伝子が挙げられる。また、中脳最腹側脳室領域 (VZ領域）に発現している遺 伝子またはそのタンパク質が挙げられ、例えば 65B13遺伝子が挙げられる。
[0232] 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子またはそのタンパク 質の検出は、公知の遺伝子またはそのタンパク質の発現を検出できる方法を用いて 行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダィゼーシヨン法、核酸増 幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
[0233] 本発明によれば、更に下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞 への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
(iii— 3) 187A5遺伝子のプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された 遺伝子構築物を含んでなるベクターにより、被験物質を接触させた後の前記細胞を 形質転換し、該細胞における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程。
[0234] 工程 (ii)にお 、て、 187A5遺伝子の発現またはそのタンパク質が検出され、かつ、 工程 (iii— 3)において、マーカー遺伝子の発現が検出された場合に、該物質をドー ノ ミン産生-ユーロン前駆細胞、好ましくは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞 への分ィ匕誘導に有効な物質であると高精度に判定することができる。
[0235] 工程 (iii— 3)は、工程 (i)の後に行われればよぐ工程 (ii)の前でも後でもよい。さら に、工程 (iii- 1)または工程 (iii - 2)の後に行われてもよ 、。
[0236] [製造方法]
本発明による検出方法は、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞を検出または選択す ることができる。ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞はパーキンソン病の治療に用いる ことができる。従って、 187A5遺伝子の発現またはそのタンパク質を指標として、検 出または選択されたドーパミン産生-ユーロン前駆細胞から、パーキンソン病の治療 に用いられるドーパミン産生ニューロン前駆細胞を製造することができる。
[0237] ここで、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞は、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆 細胞であることが好ましい。
[0238] 本発明によれば、下記工程を含んでなる、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞の製 造方法が提供される：
(i)ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞を含み得る細胞を取得する工程；
(ii)本発明による検出方法を用いて、ドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞を検出また は選択する工程;および
(iii) (ii)の工程で得られた細胞を増殖する工程
を含んでなる、方法。
[0239] 本発明によれば、本発明による検出方法により検出または選択されたドーパミン産 生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を含んで なる、パーキンソン病治療剤が提供される。
[0240] 本発明によれば、パーキンソン病の治療に用いられる薬剤を製造のための、本発 明による検出方法により検出または選択されたドーパミン産生-ユーロン前駆細胞、 好ましくはドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞の使用が提供される。
[0241] 本発明によれば、本発明による検出方法により検出または選択されたドーパミン産 生-ユーロン前駆細胞、好ましくはドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を、ヒトを 含む哺乳類の脳に移植する工程を含んでなる、パーキンソン病の治療方法が提供さ れる。
[0242] なお、本願明細書において、「検出」には「識別」も含まれる。また、「検出」とは、対 象となる細胞が特定の種類の細胞であると識別する場合のみならず、対象となる細 胞が特定の種類の細胞ではないと識別する場合も含まれる。
実施例
[0243] 「 施例 ίΙ ーパミン 牛ニューロン流駆細 巽択的遣伝早の単離あ び西 R歹 II解析
ドー ミン産生- ロン増殖前駆細胞を分離するための細胞表面マーカーとして Lrp4遺伝子力同定されており（WO2004/065599)、抗 Lrp4抗体を用!ヽて ES糸田 胞由来ドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞を分離することが可能になっている。 そこで、ドーパミン産生- ロン増殖前駆細胞に選択的な遺伝子の単離およびそ の配列解析について以下に説明する。
[0244] (l) Lrp4陽性細胞の単離
まず、ラット 13. 5日胚中脳腹側および後脳腹側を accumax (ェムエステタノシステ ムズ)を用いて分散させた後、固定'透過処理せずに、抗 Lrp4モノクローナル抗体（ 入手先：ハイプリドーマ（受託番号 FERM BP— 10315および受託番号 FERM B P— 10316)、 1Z10希釈、 1 %ゥシ胎児血清 (JRH)、 5%ラット胎児血清 (JRH)、 lm M EDTA (Invitrogen) /PBS (Sigma) )を用いて 4°Cで 30分間染色した。その後、 F ACSバッファー（PBS + 1 %ゥシ胎児血清（JRH) + lmM EDTA)を用いて 4°Cで 3 分間の洗浄を 3回行い、 PE標識抗ハムスター IgG抗体（Becton Dickinson, 8 μ g/ ml 1 %ゥシ胎児血清、 5%ラット胎児血清、 ImM EDTAZPBSを用いて 4°Cで 2 0分間染色し、同様に洗浄した。染色後、セルソーター（FACS vantage SE Bee ton Dickinson)により Lrp4陽性細胞を分離した（図 2)。分離直後の細胞から RNeas y mini kit (Qiagen)を用いて全 RNAを調製し、 cDNA synthesis kit (TAKAR A)を用いて二本鎖 cDNAを合成した。次に、合成した cDNAを制限酵素 RsaI(TAK ARA)で消化したのち、 ad2を付加し、 ad2Sをプライマーとして、 PCRを行い、 cDNA を増幅した。
[0245] 増幅条件は、 72°Cで 5分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、およ び 72°Cで 2分の反応を 20サイクル行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。 ad2S： CAGCTCCACAACCTACATCATTCCGT (配列番号： 29)
ad2A： ACGGAATGATGT (配列番号： 30)
PCRは以下の反応液組成で行った。
lOXExTaq 5^1
2. 5mM dNTP 4 μ 1
ExTaq 0. 25^1
100 プライマー 0. 5^1
cDNA 2 μ 1
蒸留水 38. 25^1
[0246] 次に、増幅した cDNA 4ng、 0.4ng、 0.04ng相当分の cDNAを铸型に用いて、 以下の反応系で PCRを行った。
10 X ExTaq ΙμΙ
2. 5mM dNTP 0.8^1
ExTaq 0.05 μ\
100 /zM プライマー 各 0. ΙμΙ
cDNA 1 μ 1
蒸留水 6. 95^1
[0247] 94°Cで 2分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 2分の 増幅反応を行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。 PCRの増幅は、 26サイクル で行った。
[0248] 下記プライマーを PCRに使用した。
Lrp4 ： TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG (配列番号：31)
CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG (配列番号： 32)
Lmxla： TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG (配列番号： 33)
GAGTTGTAGACGCTCTGTTCAATGGC (配列番号： 34)
[0249] その結果、 Lrp4遺伝子は、中脳 Lrp4陽性細胞と後脳 Lrp4陽性細胞のいずれに おいても同程度に発現する力 ドーパミン産生-ユーロンおよびドーパミン産生-ュ 一ロン前駆細胞のマーカー遺伝子である Lmxla遺伝子は（WO2005Z052190)、 中脳 Lrp4陽性細胞のみに強く発現することが確認された（図 3)。したがって、中脳 L rp4陽性細胞にはドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞が含まれ、後脳 Lrp4陽性 細胞には含まれないと考えられる。
[0250] そこで、次にこのサンプルを用いて、中脳において Lrp4陽性細胞に特異的な遺伝 子をサブトラクシヨン（N— RDA)法 (WO2004Z065599に記載）により探索したとこ ろ、単離した cDNA断片の一つ（187A5)は機能未知な遺伝子をコードする断片で あった。次に、この遺伝子の発現を、下記のプライマーを使用して、上記の RT—PC R法により確認した。
187A5： ACCAGGAAGGACAATGCCATTCGTCC (配列番号： 35)
CCTTCTTCACCTTGGCTCTTAGGATG (配列番号： 36)
[0251] その結果、 187A5遺伝子は、 Lmxla遺伝子と同様に、中脳において Lrp4陽性細 胞に特異的に発現していることが確認された（図 3)。
[0252] (2)配列解析
データベースサーチの結果、この遺伝子の全長と思われるラットおよびマウス cDN A配列を得た（例えば、配列番号： Mouse 187A5 AK028289, Mouse 187A5 AK15782 3 (frame shift)ゝ Mouse 187A5 AK028541, Mouse 187A5 XM— 485684 (alternative)ゝ M ouse 187A5 AK163356 (frame shift), Rat 187A5 XM— 344107 (predicted))。ヒト相同 遺伝子と思われる部分配列 (配列番号： 1)も得られたが、全長配列は得ることができ なかった。そこで、ヒトゲノム配列に対してホモロジ一サーチを行い、ヒト cDNA配列を 予想した。しかし、 5'末端付近については相同性の高い領域は見出すことができな かった。そこで、 5 'RACE法を用いて配列の決定を行った。
[0253] ヒト胎児脳 mRNA (クローンテック） から、 5， RACE core kit (TAKARA)を 用いて cDNAを増幅し、セルフライゲーシヨン（self—ligation)を行った。以下のプラ イマ一を用いて cDNA 5'末端の増幅を行い、得られた断片を pCRII(Invitrogen)に クローニングし、配列を決定した。
RT反応 ： CATCCCAGTCTC (配列番号： 37)
1次 PCR： TGGAGAAGGTTGTGCCTCTGGACTTG (配列番号： 38) CTGGTTGGCTTCCTTGAGGAAGAAGG (配列番号： 39) 2次 PCR: TCCTGCGGGACAAAGTCTACCTGAGC (配列番号： 40)
CTGAGGATGTGGTAGCTCACAGGTAG (配列番号 :41)
[0254] PCR反応は以下の組成で行った。
lOXExTaq 5^1
2. 5mM dNTP 4 μ 1
ExTaq 0. 25^1
100 μ Μ プライマー 各 0. 5 μ 1
铸型 1μ\
DMSO 1. 5^1
蒸留水 37. 25^1
[0255] 94°Cで 2分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 2分の 増幅反応を行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。 PCRの増幅は、 1次 PCR は 35サイクルで行い、 2次 PCRは、 1次 PCR産物を 10倍希釈したものを铸型に用い て 20サイクルで増幅した。
[0256] 次に、予想した配列が正しいものである力確認するために、 3つの領域に分けてそ れぞれ RT—PCRで増幅し、 PCR産物を pCRII(Invitrogen)にクローユングして、配 列を決定した。
[0257] ヒト胎児脳 mRNA (クローンテック） 0. から、 RNA PCR kit (TAKARA) を用 、て cDNAを増幅し、これを铸型に用 、て PCRを行つた。
[0258] 5'末端付近は以下のプライマーを用いて増幅した。
(配列番号: 42)
ヒト 187a5 Rl: GGGTCCATAGCTGGCATTGAGCACTG (配列番号： 43) [0259] PCR反応は以下の組成で行った。
10XLA Taq 5^1
MgCl 5 μ 1
2
2. 5mM dNTP 8 μ 1 LATaq 0. 5 1
100 プライマー 各 0. 5 1
cDNA 1 1
DMSO 1. 5 μ \
蒸留水 28 μ \
[0260] 94°Cで 2分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 3. 5 分の増幅反応を 35サイクル行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。
[0261] 残りの領域は、以下のプライマー F12と R5、 F13と R4の組み合わせで行った。
ヒト 187A5 F12 : CTACCTGTGAGCTACCACATCCTCAG (配列番号： 44) ヒト 187A5 R5 ： TTCTCTGCCAGGATGGAGTCAGACAG (配列番号： 45) ヒト 187A5 F13 : ACTGGCAGTTCGACATCACTCACCTG (配列番号： 46) ヒ卜 187A5 R4 ： GAGGAATTCCAGTACAAGGAAGGCATCTGGGCAGG (配 列番号: 47)
[0262] 配列を決定した結果、このヒト遺伝子をコードするタンパク質は、マウス 187A5タン ノ ク質と全域に渡り高い相同性を示し、 77%同一、 87%相同アミノ酸であったことか ら、ヒトの 187A5相同遺伝子であると考えられる（配列番号： 1)。
[0263] 「実施例 21 187A5遣伝子の in situハイブリダィゼーシヨンによる発現解析 187A 5遺伝子のドーパミン産生ニューロン系列の細胞における詳細な発現パターンを調 ベるため、以下のプロトコールによる in situハイブリダィゼーシヨンにより、 187A5お よび Lrp4の mRNAの発現解析を行つた。
[0264] まず、以下の方法で DIG化プローブを作製した。
[0265] マウス（SLCより入手） 12. 5日胚より中脳後脳領域を切り出し、 RNeasy mini ki t (Qiagen)を用いて全 RNAを調製し、 cDNA synthesis kit (TAKARA)を用い て二本鎖 cDNAを合成した。次に、合成した cDNAを铸型に用いて以下の反応系で 187A5および Lrp4の cDNAを増幅した。
lO X ExTaq 5 ^ 1
2. 5mM dNTP 4 ^ 1
ExTaq 0. 25 ^ 1 100 プライマー 各 0. 5 1
cDNA 1 1
DMSO 1. 5 μ \
蒸留水 37.25 1
[0266] 増幅条件は、 94°Cで 5分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び
72°Cで 2分の反応を 35サイクル行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。
[0267] 下記プライマーを PCRに使用した。
187A5： AGCTGAGCCACCTTCTCAGTCCAGAC (配列番号： 48)
CCACGTCCAGGTCTTGACAAACCCAC (配列番号： 49)
Lrp4 ： GACAGTGAACCTTTGGTCACTGATGG (配列番号： 50)
GCCTTCCTGTCCTGGGATCAGCTTGG (配列番号： 51)
[0268] 増幅した cDNA断片を pCRII (Invitrogen)にクロー-ングし、これを铸型に用いて D IG化プローブを以下の反応系で合成した (試薬は全て Rocheより購入)。
RNA ポリメラーゼバッファー 2 1
ΝΤΡ ラベリング ミックス 2 1
RNase インヒビター Ι μ Ι
RNA ポリメラーゼ （T7または SP6) 2 μ \
铸型 DNA l ^u g
蒸留水 総量 20 1
[0269] 37°C2時間の後、 DNasel (Roche)処理を 37°Cで 15分行!、、 DIG化 RNAプロ一 ブをエタノール沈殿により回収した。
[0270] 次に、マウス 12. 5日胚を摘出し 4%PFA (WAKO) ZPBSを用いて 4°Cで 2時間固 定した後、 20%ショ糖 (WAKO) ZPBSを用いて 4°Cでー晚置換し、 OCT (サクラセィ キ）で包埋した。厚さ 12 mの切片を作製し、スライドガラス上で乾燥させた後に 4% PF Aを用いて室温で 30分間再固定した。 PBSで洗浄した後、ハイブリダィゼーショ ン（1 g/ml DIG化 RNAプローブ、 50%ホルムアミド（ナカライテクス）、 5xSSC、 1% SDS, 50 μ g/ml 酵母 RNA (Sigma)、 50 gZml へノ《リン）を 68。Cで 40 時間行った。その後、洗浄（50%ホルムアミド、 5xSSC、 1%SDS)を 68°Cで行い、 さらに洗浄（50%ホルムアミド、 5xSSC)を 68°Cで行った。 lxTBSTで、室温で洗浄 ののち、ブロッキング（ブロッキング剤： Roche)を行った。アルカリフォスファターゼ標 識抗 DIG抗体（DAKO)を 4°Cでー晚反応させ、洗浄（lxTBST、 2mM レバミソー ル）の後、 NBT/BCIP (DAKO)を基質として発色させた。
[0271] その結果、ドーノ ミン産生-ユーロンの発生する時期であるマウス 12. 5日胚にお いて、 187A5の mRNAは、 Lrp4陽性ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞の存在す る中脳最腹側脳室領域 (ventricular zone ;VZ)と中脳最背側 roof plate領域に選 択的に発現することが明らかになった（図 4)。一方、後脳腹側には発現が認められ ず、 Lrp4陽性である後脳 floor plate細胞には発現しないことが確認された。
[0272] 以上のことから、 187A5の mRNAは、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞に 選択的に発現することが明らかになった。 Lrp4と 187A5の両遺伝子を同時に発現 する細胞は中脳最腹側脳室領域に存在するドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細 胞に限定されることから、これらのマーカーを組み合わせて用いれば、より正確にドー ノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞を識別することができると考えられる。
[0273] 「実施例 31ES細胞より分化誘導したドーノ^ン産牛.ニューロンにおける 187A5遣伝 の 現.
ES細胞をイン'ビトロでドーノミン産生-ユーロンに分ィ匕誘導させた場合に、 187A 5遺伝子が発現するか否かを検討した。
[0274] まず、 SDIA法（Kawasaki et. al. Neuron. 2000 Oct;28(l):31- 40.)に従い、 ES細胞
(理研 CDB西川氏から提供されたマウス由来 CCE株、 Kawasaki et. al. Neuron. 2000 28(1):31- 40.)よりドーパミン産生-ユーロンへの分ィ匕誘導を行った。誘導 6日目の細 胞カも Lrp4陽性および陰性細胞を分離し (WO2004Z065599号公報の実施例 5 )、分離直後の細胞から全 RNAを調製した。これを铸型に cDNAを合成し、増幅した
[0275] また、 5— stage法（Lee et. al. (2000) Nat. Biotech. 18: 675—679、 mouse dopaminergic neuron differentiation kit (R&D Systems))に従い、 ES細胞（CCE)よりドーパミン産生 ニューロンへの分ィ匕誘導を行った。ステージ 4、 7日目の細胞より Lrp4陽性および陰 性細胞を分離し (WO2004Z065599号公報の実施例 8)、分離直後の細胞から全 RNAを調製した。これを铸型に cDNAを合成し、増幅した。
[0276] 次に、増幅した cDNA 4ng、 0. 4ng、 0. 04ng相当分の cDNAをそれぞれ铸型 に用いて、以下の反応系で PCRを行った。
lO X ExTaq 1 μ \
2. 5mM dNTP 0. 8 ^ 1
ExTaq 0. 05 μ \
100 /z M プライマー 各 0. 1 μ \
cDNA 1 μ 1
DMSO 0. 3 ^ 1
蒸留水 6. 65 ^ 1
[0277] 94°Cで 2分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 2分の 増幅反応を行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。 PCRの増幅は、 26サイクル で行った。
[0278] 下記のプライマーを PCRに使用した。
Lmxla： TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG (配列番号： 33)
TCTGAGGTTGCCAGGAAGCAGTCTCC (配列番号： 52)
[0279] なお、 Lrp4および 187A5は実施例 1のプライマーを使用した。
[0280] その結果、 187A5遺伝子は、いずれの方法で分化誘導した際にも発現し、特に Lr p4陽性細胞に強く発現することが確認された（図 5、図 6)。したがって、 187A5の m RNAは、マウスおよびラット胎児中脳由来の細胞だけでなぐ SDIA法および 5— sta ge法の 、ずれの方法による分化誘導細胞にお!、ても、ドーパミン産生-ユーロン前 駆細胞において発現していることが明らかになった。すなわち、 187A5遺伝子は、胎 児中脳由来のドーパミン産生ニューロン前駆細胞だけでなぐイン'ビトロで ES細胞 より分ィ匕誘導したドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞を識別するのにも有用なマーカ 一であることが明らかになった。
[0281] 「実施例 4Ί 187Α5タンパク質の細朐表面での発現
187A5タンパク質には膜貫通領域と思われる配列が 1箇所存在する。 187A5タン パク質が細胞表面に発現して!/、れば、これに結合性を有する抗体を用いてフローサ ィトメトリーにより、 187A5陽性である生細胞を分離することが可能となり、パーキンソ ン病などの移植材料の調製に有用であると期待される。そこで、 187A5タンパク質の 細胞内局在にっ 、て検討した。
[0282] (1)シグナル配列の解析
通常 I型の膜貫通タンパク質の場合、 N末端付近にシグナル配列が存在し、その直 下で切断されることにより膜上に発現することができる。コンピューターサーチ (PSOR T II, http：〃 psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.html)の結果、マウス 187A5遺伝子には シグナル配列と予想される配列は見出されな力つた。一方、ヒト 187A5遺伝子の N末 端近傍にはシグナル配列様の配列が存在していた。そこで、 187A5遺伝子に機能 的なシグナル配列が存在するかどうかを検討した。
[0283] マウス cDNAのうち、 N末端力 45番目のアミノ酸までをコードする領域と、シグナ ル配列を欠く分泌型アルカリフォスファターゼ cDNAとを連結したコンストラクトを作製 し、 293E細胞にトランスフエクシヨンした。培養 4日目の培養上清を回収し、 Aurora kit (ICN)を用いてアルカリフォスファターゼ活性を測定した（図 7)。
[0284] その結果、シグナル配列を欠く分泌型アルカリフォスファターゼ (コントロール）を発 現させた際には、このタンパク質は分泌されないため、上清中にアルカリフォスファタ ーゼ活性が認められな ヽのに対し、 N末端配列を連結させた融合タンパク質の場合 、上清中に強い活性が認められたことから、 187A5の N末端配列により融合タンパク 質が効率よく分泌されることが明らかになった（図 8)。したがって、 187A5の N末端 付近には機能的なシグナル配列が存在することが明らかになった。このことは、 187 A5タンパク質力 型の 1回膜貫通分子であることを示して！/、る。
[0285] (2) 187A5の細胞表面での発現 (ピオチン化修飾法）
187A5タンパク質が細胞表面に発現する力否かを確認するために、細胞表面のタ ンパク質のみをピオチンィ匕修飾する際に、 187A5タンパク質がピオチンィ匕されるかど うかを検討した。
[0286] 187A5の C末端に HAタグを付カ卩したコンストラクトを NS20Y細胞にトランスフエク シヨンした。 2日後、冷却した PBSで細胞を 2回洗浄した後に、 0. 5mgZmlの EZ— li nk Sulfo - NHS - SS - Biotin (PIERCE) (PBS + ImM CaCl 0. 5mM M gClに溶解）を 5ml添カ卩し、室温で 30分間反応させた。冷却した PBSで 2回洗浄し
2
た後に、細胞を回収し、溶解バッファー（1%SDS, 10mM Tris— CI, lOOmM NaCl, ImM EDTA) 600 1に懸濁し、超音波処理を行った。 14000回転で 3分間の遠心の後、上清を回収した。ストレプトアビジンビーズ（PIERCE) 20 μ 1をカロ え、室温で 1時間ローテーションした後、溶解バッファーで 2回洗浄した。ビーズに SD S— PAGEサンプルバッファー 75 μ 1をカ卩えて、 100°C3分間の後、遠心して結合タ ンパク質を回収し、抗 HA抗体（Roche)を用いたウェスタンブロティングにより。 187A 5タンパク質を検出した。
[0287] その結果、 187A5タンパク質が高効率にピオチンィ匕されていることが明らかになつ た（図 9)。したがって、 187A5タンパク質は細胞表面に発現すると考えられる。
[0288] (3) 187A5の細胞表面での発現（FACS解析）
187A5タンパク質を F ACS法で検出できるかどうか検討した。 187A5の予想切断 部位（39番目のアミノ酸）より C末端側をコードする cDNAを Preprotrypsinのシグナ ル配列と FLAGタグをコードする配列の直下に連結したコンストラクトを作製した。こ のコンストラクトを発現させると、シグナル配列切断後に、 N末端に FLAGタグを付カロ した 187A5を発現させることができる。このコンストラクトを、 B300. 19細胞にレトロゥ ィルスべクタ一によりステーブルに導入した。親細胞および形質転換体を FACSバッ ファー（PBS + 1%ゥシ胎児血清 (JRH) + ImM EDTA)で洗浄した後、 10 μ gZ mlの抗 FLAG抗体（SIGMA)と氷上で 30分間反応させ、 FACSバッファーで洗浄し た。続いて、 PE標識抗マウス IgG抗体 (Jackson) (1/200希釈）と氷上で 30分間反 応させ、 FACSバッファーで洗浄した。染色後、フローサイトメトリー（FACS calibur 、 Becton Dickinson)で解析しァこ。
[0289] その結果、親株と異なり、ステーブル形質転換体では FLAG抗体に強く反応する 集団が検出された（図 10)。したがって、 187A5は N末端側を細胞外とする向きで細 胞表面に発現し、抗体を用いて FACSで検出可能であることが明らかになった。すな わち、 187A5は、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞の生細胞を分離する際のマー カーとして有用であると考えられる。
[0290] 「実施例 51187A5タンパク質の発現解析 187A5遺伝子のうち、細胞外領域をコードする遺伝子配列を用いて、以下のプロト コールにより抗 187A5抗体を作製し、免疫組織染色による発現解析を行った。
[0291] まず、マウス 187A5遺伝子のうち、細胞外領域（配列番号： 15の 1番目〜 919番目 のアミノ酸)をコードする遺伝子配列を 293E細胞に遺伝子導入して、 187A5タンパ ク質の細胞外領域を発現させて回収した。回収したタンパク質をラットに免疫したの ち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞と融合させた。融合させた細胞集団より 、 187A5に反応性を持つクローンを選択した。このクローンの培養上清より、抗 187 A5モノクローナル抗体を精製した。次にマウス 11. 5日胚を 4%PFAZPBS (—）で 4°C、 2時間固定したのち、 20%ショ糖 ZPBS (—）で 4°C、ー晚置換し、 OCTで包埋 した。厚さ 12umの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で 30分乾燥さ せ、 PBS (—）で再び湿潤させた。その後、ブロッキング（25%ブロックエース（大日本 製薬株式会社)）を室温、 30分間行い、作製した抗 187A5モノクローナル抗体 (培 養上清 2倍希釈、 2. 5%ブロックエース ZPBS)を室温、 2. 5時間反応させた後、 0 . 01%Triton X—IOOZPBS (—）で、室温、 10分間の洗浄を 4回行った。 Cy3標 識抗ラット IgG抗体 (Jackson、 lO ^ g/ml, 2. 5%ブロックエース ZPBS)を室温、 1 時間反応させ、同様に洗浄を行った後、 PBS (-)によって室温、 5分間洗浄し、封入 した。
[0292] 作製した抗 187A5モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色による発現解析の結 果、実施例 2の結果と同様に、ドーパミン産生-ユーロンの発生する時期である E11 . 5で、中脳腹側に 187A5タンパク質の存在が認められ、ドーノ ミン産生-ユーロン の発生しな ヽ後脳腹側ではその存在が認められな力つた（図 11)。
[0293] これらの結果から、 187A5タンパク質はドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞に存在 することが確認された。
[0294] 「実施例 61 187A5タンパク質が存在する細胞の検出
実施例 5で作製した抗 187A5モノクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリーに より 187A5タンパク質が存在する細胞の検出を行った。
[0295] まず、マウス E12. 5胎児中脳および後脳腹側領域を細胞分散バッファー（Invitrog en)を用いて分散させた後、固定'透過処理せずに、抗 187A5モノクローナル抗体（ 精製抗体 ΙΖΙΟ希釈、 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTAZPBS)および抗 Lrp4 抗体 (培養上清 1Z2 希釈、 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTAZPBS)で 4°C、 2 0分間染色した。その後、 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTAZPBS—で 4°C、 3分間 の洗浄を 3回行い、ピオチン標識抗アルメニアンハムスター IgG抗体 (Jackson、 10 g/mU 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTAZPBS)で 4°C、 20分間染色し、同様に 洗浄したのち、 APC標識ストレプトアビジン（Pharmingen、 8ug/mU 1%ゥシ胎児血 清、 ImM EDTAZPBS)および PE標識抗ラット IgG抗体 (Jackson、 20/ζ 8Ζπι1、 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTAZPBS)で 4°C、 20分間染色し、同様に洗浄した 。染色後、フローサイトメーターによる検出を行った。
[0296] 作製した抗 187A5モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーの結果、 187A 5タンパク質が存在する細胞集団が検出された（図 12)。ここで、固定'透過処理する ことなく、 187A5タンパク質が存在する細胞を検出できることから、セルソーターを付 属したフローサイトメーターを用いることにより、 187A5タンパク質が存在する細胞を 生細胞の状態で分離することが可能であるが示唆された。また、中脳 Lrp4陽性細胞 、すなわちドーノミン産生-ユーロン前駆細胞においては全て 187A5タンパク質が 存在することが確認され、一方、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含まない後脳 Lrp4陽性細胞においては 187 A5タンパク質が存在しな!、ことが確認された（図 12)
[0297] これらの結果から、 187A5抗体はドーパミン産生-ユーロン前駆細胞の分離に有 用であることが示された。
[0298] 「実施例 71ES細胞より分化誘導したドーノミン産牛.ニューロンにおける 187A5タンノ ク晳の発現
SDIA法により in vitroにおいて ES細胞より分ィ匕誘導させたドーノミン産生-ユー ロン前駆細胞を含む細胞群を、細胞分散バッファー (Invitrogen)を用いて分散させた 後、固定'透過処理せずに、実施例 5で作製した抗 187A5モノクローナル抗体 (精製 抗体 1Z10希釈、 10% knockout serum replacement, 1%ゥシ胎児血清、 1 mM EDTAZSDIA分化培地）および抗 Lrp4抗体 (培養上清 1,2 希釈、 10% knockout serum replacement, 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTA/SDIA分 化培地）で 4°C、 20分間染色した。その後、 10% knockout serum replacemen t、 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTAZSDIA分化培地で 4°C、 3分間の洗浄を 3回 行い、ピオチン標識抗アルメニアンハムスター IgG抗体 (Jackson、 10 gZml、 10% knockout serum replacement, 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTA/SDIA分 化培地)で 4°C、 20分間染色し、同様に洗浄したのち、 APC標識ストレプトアビジン（ Pharmingen、 8ugz ml、 10% knockout serum replacement^ 1%ワン胎児血 清、 ImM EDTAZSDIA分化培地）および PE標識抗ラット IgG抗体 (Jackson、 20 μ g m 10% knockout serum replacement^ 1%ゥシ月台児血清、 ImM E DTAZSDIA分ィ匕培地)で 4°C、 20分間染色し、同様に洗浄した。染色後、フローサ イトメーターにて 187A5および Lrp4発現細胞を検出した。
[0299] フローサイトメトリーの結果、マウス胎児中脳と同様に、 187A5および Lrp4タンパク 質が存在する細胞集団が検出された (図 13)。
[0300] これらの結果から、 187A5抗体は ES細胞由来ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞 の分離にも有用であることが示された。
[0301] 「実施例 8Ί杭体による LrO4発現細胞の分離
分離した 187A5および Lrp4共陽性細胞がドーノ ミン産生-ユーロンに分ィ匕するこ とを確認するため、分裂停止後ドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞マーカーである N urrlを用いて以下の実験を行った。
[0302] SDIA法により in vitroにおいて ES細胞より分化誘導させてから、分離した細胞を ポリ一 L—オル-チン（sigma、 0. 002% in PBS)、ラミニン（invitrogen、 2. 5 g/ ml in PBS)、フイブロネクチン（sigma、 5 /z gZml in PBS)コートしたスライドガラ ス上に播き、 N2 (Invitrogen、 lx)、 B27 (Invitrogen、 lx)、ァスコルビン酸（sigmaゝ 200uM) BDNF (Invitrogen、 20ng/ ml)、 10% knockout serum replaceme nt (Invitrogen) ZSDIA分化培地中で、 37°C、 6日間培養した。培養した細胞を 2% PFAZPBSで 4°C、 20分間固定し、 PBSで 4°C、 10分間の洗浄を 2回行った。その 後、 0. 3% Triton X— lOOZPBSで室温、 30分間の透過処理を行い、 10% n ormal donkey serumZブロックエースで室温、 20分間のブロッキングを行った。 続いて、抗 Nurrl抗体（in house 培養上清 lZlOOO希釈、 10% normal do nkey serum, 2. 5%ブロックエース、 0. 1% Triton X— lOOZPBS)、抗 HuC ZD饥体 (Molecular Probe^ 1/ 50^ 4 μ g/ mU 10% normal donkey seru m、 2. 5%ブロックエース、 0. 1% Triton X—IOOZPBS)で、室温、 1時間反応 させ、引き続き、 4°C、ー晚反応させた。翌日、 0. 1% Triton X— lOOZPBSで、 室温、 10分間の洗浄を 4回行った後、 FITC標識した抗マウス IgG抗体、 Cy3標識し た抗フット IgGjn'体 (いすれも Jackson、 3 gZml、 10% normal donkey serum 、 2. 5%ブロックエース、 0. 1% Triton X—IOOZPBS)で室温、 1時間反応させ た。その後、同様に洗浄し、 PBSで室温、 5分間洗浄し、封入して観察した。
[0303] フローサイトメトリーにより分離した細胞を in vitroで 6日間培養した結果、対照であ る分離していない細胞に比べて明らかに多くの Nurrl陽性ドーノ ミン産生-ユーロン が誘導された (図 14)。
[0304] これらの結果から、 187A5ZLrp4共陽性細胞は、確かにドーパミン-ユーロン系 列の前駆細胞であり、 in vitroで成熟可能であることが明らかになった。

Claims

請求の範囲
以下の (i)、 （ii)、 （iii)、および (iv)から選択されるポリヌクレオチド：
(i)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
(ii)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列において、 1または複数個のヌクレオチド の挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個の ヌクレオチドの付カ卩がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列か らなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(iii)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力 なるポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件でノヽイブリダィズし、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力もなるタンパ ク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;および
(iv)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドと 70%以上の 同一性を有し、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の 機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
以下の (v)、 （vi)、 （vii)、および (viii)力も選択されるタンパク質をコードするポリヌ クレ才チド：
(V)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
(vi)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入 、置換、欠失、および Zまたはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸 の付カ卩がなされたアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(vii)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および
(viii)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列 からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質
のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダィズすることができる、ドーパミン 産生-ユーロン前駆細胞の検出または選択に用いられるプローブまたはプライマー。
[2] ポリヌクレオチド力 ヒト、マウス、ラット、ゥシ、ィヌまたはチンパンジーに由来する、 請求項 1に記載にプローブまたはプライマー。
[3] ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、 配列番号： 7、配列番号： 9、配列番号： 11、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号 : 16、配列番号： 18、配列番号： 20、配列番号： 21、配列番号： 23、配列番号： 25、 および配列番号： 27からなる群力も選択される、請求項 1または 2に記載にプローブ またはプライマー。
[4] ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列力 配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列の 7 74番目〜1221番目または 2403番目〜2666番目のヌクレオチド配列の一部また は全部を含んでなるヌクレオチド配列である、請求項 1〜3の 、ずれか一項に記載の プローブまたはプライマー。
[5] ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも 10個 のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド力もなる、請求項 1〜4のいずれか一項 に記載のプローブまたはプライマー。
[6] 少なくとも 25塩基長である、請求項 1〜5のいずれか一項に記載のプローブまたは プライマー。
[7] ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞が、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞で ある、請求項 1〜6のいずれか一項に記載のプローブまたはプライマー。
[8] 請求項 1〜7のいずれか一項に記載の二種以上のプライマーからなる、プライマー セット。
[9] 以下の (V)、 (vi)、 (vii)、および (viii)から選択されるタンパク質またはその一部に 結合性を有する抗体：
(V)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
(vi)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入 、置換、欠失、および Zまたはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸 の付カ卩がなされたアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質； (vii)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および
(viii)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列 からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質。
[10] タンパク質またはその一部力 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 248番目〜3 97番目または 792番目〜877番目のアミノ酸配列の少なくとも 5アミノ酸残基または 全部からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質である、請求項 9に記載の抗体。
[11] タンパク質またはその一部力 細胞外に発現しているポリペプチド部分である、請 求項 9に記載の抗体。
[12] タンパク質またはその一部力 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 28番目〜92 7番目、配列番号: 4で表されるアミノ酸配列の 16番目〜1267番目、配列番号： 6で 表されるアミノ酸配列の 1番目〜550番目、配列番号: 8で表されるアミノ酸配列の 1 番目〜542番目、配列番号： 10で表されるアミノ酸配列の 1番目〜418番目、配列 番号： 12で表されるアミノ酸配列の 76番目〜964番目、配列番号： 15で表されるアミ ノ酸配列の 40番目〜928番目、配列番号： 17で表されるアミノ酸配列の 1番目〜54 0番目、配列番号： 19で表されるアミノ酸配列の 40番目〜： L 106番目、配列番号： 22 で表されるアミノ酸配列の 24番目〜 1524番目、配列番号： 24で表されるアミノ酸配 列の 43番目〜1018番目、配列番号： 26で表されるアミノ酸配列の 43番目〜908番 目、または配列番号： 28で表されるアミノ酸配列の 1番目〜866番目のアミノ酸配列 の少なくとも 5アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドを含んでなる、請求項 11 に記載の抗体。
[13] タンパク質またはその一部力 少なくとも 6アミノ酸残基力もなるポリペプチドである、 請求項 9〜 12のいずれか一項に記載の抗体。
[14] ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞が、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞で ある、請求項 9〜 13のいずれか一項に記載の抗体。
[15] 請求項 1に記載のポリヌクレオチドの発現を検出する工程または請求項 9に記載の タンパク質を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞を検出 または選択する方法。
[16] ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞が、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞で ある、請求項 15に記載の方法。
[17] ポリヌクレオチドの発現を検出する工程力 下記工程を含んでなる、請求項 15また は 16に記載の方法：
(a)被験細胞試料と請求項 1〜8のいずれか一項に記載のプローブ、プライマー、ま たはプライマーセットとを接触させる工程;および
(b)反応性の有無を検出する工程。
[18] ポリヌクレオチドの発現を検出する工程力 下記工程を含んでなる、請求項 15また は 16に記載の方法：
(a— 1)被験細胞試料由来のポリヌクレオチドと請求項 1〜7のいずれか一項に記載 のプローブとを接触させる工程;および
(b— 1)ハイブリダィゼーシヨン複合体を検出する工程。
[19] 工程（a— 1)にお!/、て、被験細胞試料から調製された mRNAまたはその mRNAか ら転写された相補的 DNAを、プローブと接触させる、請求項 18に記載の方法。
[20] ポリヌクレオチドの発現を検出する工程力 下記工程を含んでなる、請求項 15また は 16に記載の方法：
(a 2)被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを铸型とし、請求項 1〜7の 、ずれか一 項に記載のプライマーまたは請求項 8に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅法 を実施する工程;および
(b - 2)形成された増幅産物を検出する工程。
[21] 工程（a— 2)にお!/、て、被験細胞試料から調製された mRNAまたはその mRNAか ら転写された相補的 DNAを铸型として用いる、請求項 20に記載の方法。
[22] タンパク質を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項 15または 16に記載 の方法：
(c)被験細胞試料と請求項 9〜 14の 、ずれか一項に記載の抗体とを接触させる工程 ；および (d)反応性の有無を検出する工程。
[23] タンパク質を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項 15または 16に記載 の方法：
(c— 1)被験細胞試料由来のタンパク質と請求項 9〜14のいずれか一項に記載の抗 体とを接触させる工程；および
(d— 1)抗体抗原複合体を検出する工程。
[24] 被験細胞試料が、ドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞へ分化させる処理が行 われた ES細胞である、請求項 17〜23のいずれか一項に記載の方法。
[25] 分化させる処理が、 SDIA法によるものである、請求項 24に記載の方法。
[26] 被験細胞試料が、胎児中脳腹側領域から得られた細胞である、請求項 17〜23の V、ずれか一項に記載の方法。
[27] 工程 (a)または工程 (c)にお 、て、被験細胞試料として、前記ポリヌクレオチド以外 のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞 もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカータン ノ ク質が検出された細胞;分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー 遺伝子の発現もしくはそのタンパク質が検出されな力つた細胞;前記ポリヌクレオチド 以外のドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞 もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカータンパク 質が検出された細胞;または成熟ドーパミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子の 発現もしくはそのタンパク質が検出されなかった細胞;を使用することを特徴とする、 請求項 17〜26のいずれか一項に記載の方法。
[28] 工程 (b)または工程 (d)の後に、
(e- 1)前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー 遺伝子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞 マーカータンパク質を検出する工程；
(e 2)分裂停止後ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしく はそのタンパク質を検出する工程；
(e 3)前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー遺伝 子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカー タンパク質を検出する工程；または
(e— 4)成熟ドーノ ミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタン パク質を検出する工程
を更に含んでなる、請求項 17〜26のいずれか一項に記載の方法。
[29] 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝 子が、中脳最腹側脳室領域に発現する遺伝子である、請求項 27または 28に記載の 方法。
[30] 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝 子が、 Lrp4遺伝子、 Msxl遺伝子、 Msx2遺伝子、 Nato3遺伝子、および Mashl遺 伝子力もなる群力も選択される、請求項 27または 28に記載の方法。
[31] 前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカータンパク質 力 中脳最腹側脳室領域に発現するタンパク質である、請求項 27または 28に記載 の方法。
[32] 前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカータンパク質 1S Lrp4遺伝子、 Msxl遺伝子、 Msx2遺伝子、 Nato3遺伝子および Mashl遺伝 子力もなる群力も選択される遺伝子のタンパク質である、請求項 27または 28に記載 の方法。
[33] 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子が、中脳最腹側外 套層領域に発現する遺伝子である、請求項 27または 28に記載の方法。
[34] 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子力 Nurrl遺伝子
、 Enl遺伝子、 En2遺伝子、 Ptx3遺伝子、 TH遺伝子、または 65B13遺伝子からな る群力も選択される、請求項 27または 28に記載の方法。
[35] 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子が
、中脳最腹側に発現する遺伝子である、請求項 27または 28に記載の方法。
[36] 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子が
、 Lmxla遺伝子である、請求項 27または 28に記載の方法。
[37] 前記タンパク質以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカータンパク質が、 中脳最腹側に発現するタンパク質である、請求項 27または 28に記載の方法。
[38] 前記タンパク質以外のドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞マーカータンパク質力 L mxla遺伝子のタンパク質である、請求項 27または 28に記載の方法。
[39] 成熟ドーパミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子力 DAT遺伝子である、請求 項 27または 28に記載の方法。
[40] 前記ポリヌクレオチドのプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された 遺伝子構築物を含んでなるベクターにより被験細胞試料を形質転換し、該被験細胞 試料における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程
を更に含んでなる、請求項 17〜39のいずれか一項に記載の方法。
[41] 請求項 1〜7のいずれか一項に記載のプローブもしくはプライマー、請求項 8に記 載のプライマーセット、または請求項 9〜 14のいずれか一項に記載の抗体を少なくと も含んでなる、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞を検出または選択するためのキット
[42] ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞が、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞で ある、請求項 41に記載のキット。
[43] 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝 子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マー カータンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体； 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくはその タンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体； 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の 発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカータン ノ ク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体;または 成熟ドーノ ミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質 を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体
を更に含んでなる請求項 41または 42に記載のキット。
[44] 前記ポリヌクレオチドのプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された 遺伝子構築物を含んでなるベクターを更に含んでなる、請求項 41〜43のいずれか 一項に記載のキット。
[45] 請求項 1〜7のいずれか一項に記載のプローブもしくはプライマー、請求項 8に記 載のプライマーセット、または請求項 9〜 14のいずれか一項に記載の抗体を少なくと も含んでなる、ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞を検出または選択するための試薬
[46] ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞が、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞で ある、請求項 45に記載の試薬。
[47] 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝 子の発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マー カータンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体； 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現もしくはその タンパク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体； 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の 発現もしくは前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン前駆細胞マーカータン ノ ク質を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体;または 成熟ドーノ ミン産生-ユーロン細胞マーカー遺伝子の発現もしくはそのタンパク質 を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、もしくは抗体
を更に含んでなる請求項 45または 46に記載の試薬。
[48] 前記ポリヌクレオチドのプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連結された 遺伝子構築物を含んでなるベクターを更に含んでなる、請求項 45〜47のいずれか 一項に記載の試薬。
[49] 下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞分ィ匕誘導に有効な物 質のスクリーニング方法：
(i)ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞に分ィ匕し得る細胞と、被験物質とを接触させる 工程；および
(ii)被験物質を接触させた後の前記細胞における請求項 1に記載のポリヌクレオチド の発現または請求項 9に記載のタンパク質を検出する工程。
[50] ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞が、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞で ある請求項 49に記載のスクリーニング方法。
[51] (iii 1)被験物質を接触させた後の前記細胞における前記ポリヌクレオチド以外のド ーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現または前記タンパク質 以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカータンパク質を検出する工程 を更に含んでなる請求項 50に記載の方法。
[52] 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝 子が、中脳最腹側脳室領域に発現する遺伝子である、請求項 51に記載の方法。
[53] 前記ポリヌクレオチド以外のドーノ ミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカー遺伝 子が、 Lrp4遺伝子、 Msxl遺伝子、 Msx2遺伝子、 Nato3遺伝子、または Mashl遺 伝子からなる群から選択される、請求項 51に記載の方法。
[54] 前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカータンパク質 力 中脳最腹側脳室領域に発現するタンパク質である、請求項 51に記載の方法。
[55] 前記タンパク質以外のドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞マーカータンパク質 力 Lrp4遺伝子、 Msxl遺伝子、 Msx2遺伝子、 Nato3遺伝子、または Mashl遺伝 子力もなる群力も選択される遺伝子のタンパク質である、請求項 51に記載の方法。
[56] (iii 2)被験物質を接触させた後の前記細胞における、分裂停止後ドーパミン産生 ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現またはそのタンパク質を検出する工程 を更に含んでなる請求項 50に記載の方法。
[57] 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子が、中脳最腹側外 套層領域に発現する遺伝子である、請求項 56に記載の方法。
[58] 分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子力 Nurrl遺伝子
、 Enl遺伝子、 En2遺伝子、 Ptx3遺伝子、 TH遺伝子、または 65B13遺伝子からな る群から選択される、請求項 56に記載の方法。
[59] (iii 3)前記ポリヌクレオチドのプロモーターとマーカー遺伝子とが作動可能に連 結された遺伝子構築物を含んでなるベクターにより、被験物質を接触させた後の前 記細胞を形質転換し、該細胞における、マーカー遺伝子の発現を検出する工程 を更に含んでなる請求項 50に記載の方法。
[60] ドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞の製造方法であって、 (i)ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞を含み得る細胞を取得する工程；
(ii)請求項 15〜40のいずれか一項に記載の方法を用いて、ドーパミン産生-ユーロ ン前駆細胞を検出する工程；および
(iii)工程 (ii)で検出または選択された細胞を増殖する工程
を含んでなる、方法。
[61] ドーノ ミン産生-ユーロン前駆細胞がパーキンソン病治療用のドーパミン産生-ュ 一ロン前駆細胞である請求項 60の製造方法。
[62] ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞が、ドーパミン産生-ユーロン増殖前駆細胞で ある請求項 60または 61に記載の製造方法。
[63] 以下の (i)、 (ii) , (iii)、および (iv)力も選択される、ポリヌクレオチド：
(i)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
(ii)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列において、 1または複数個のヌクレオチド の挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への 1または複数個の ヌクレオチドの付カ卩がなされたヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列か らなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力 なるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(iii)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力 なるポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件でノヽイブリダィズし、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力もなるタンパ ク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;および
(iv)配列番号： 1で表されるヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドと 70%以上の 同一性を有し、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の 機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[64] ヒト、マウス、ラット、ゥシ、ィヌまたはチンパンジーに由来する、請求項 63に記載に ポリヌクレオチド。
[65] 配列番号： 1、配列番号： 3、配列番号： 5、配列番号： 7、配列番号： 9、配列番号： 1 1、配列番号： 13、配列番号： 14、配列番号： 16、配列番号： 18、配列番号： 20、配 列番号: 21、配列番号 : 23、配列番号 : 25、および配列番号 : 27からなる群力 選択 される、請求項 63または 64に記載にポリヌクレオチド。
[66] 以下の (v)、 (vi)、 (vii)、および (viii)力も選択される、タンパク質： (V)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
(vi)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入 、置換、欠失、および Zまたはその一方または両末端への 1または複数個のアミノ酸 の付カ卩がなされたアミノ酸配列力 なり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
(vii)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェン トな条件でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号： 2で表 されるアミノ酸配列力もなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質;および
(viii)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列 からなり、かつ配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質。
[67] I型の膜貫通タンパク質である、請求項 66に記載のタンパク質。
[68] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 248番目〜397番目または 792番目〜877 番目のアミノ酸配列の少なくとも 5アミノ酸残基または全部力もなるポリペプチド、ある いは配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 28番目〜927番目、配列番号: 4で表さ れるアミノ酸配列の 16番目〜1267番目、配列番号： 6で表されるアミノ酸配列の 1番 目〜550番目、配列番号： 8で表されるアミノ酸配列の 1番目〜542番目、配列番号： 10で表されるアミノ酸配列の 1番目〜418番目、配列番号： 12で表されるアミノ酸配 列の 76番目〜964番目、配列番号： 15で表されるアミノ酸配列の 40番目〜928番 目、配列番号： 17で表されるアミノ酸配列の 1番目〜540番目、配列番号： 19で表さ れるアミノ酸配列の 40番目〜： L 106番目、配列番号： 22で表されるアミノ酸配列の 24 番目〜1524番目、配列番号： 24で表されるアミノ酸配列の 43番目〜1018番目、配 列番号： 26で表されるアミノ酸配列の 43番目〜908番目、または配列番号： 28で表 されるアミノ酸配列の 1番目〜866番目のアミノ酸配列の少なくとも 5アミノ酸残基また は全部カゝらなるポリペプチドを含んでなるタンパク質。
[69] 請求項 66〜68の!、ずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[70] ドーパミン産生-ユーロン前駆細胞を検出または選択するための指標としての、請 求項 66〜68のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。 ドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、ドーパミン産生二. ある、請求項 70に記載の使用。
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