WO2007114496A1 - 新規抗ｃｄ９８抗体 - Google Patents

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WO2007114496A1
WO2007114496A1 PCT/JP2007/057680 JP2007057680W WO2007114496A1 WO 2007114496 A1 WO2007114496 A1 WO 2007114496A1 JP 2007057680 W JP2007057680 W JP 2007057680W WO 2007114496 A1 WO2007114496 A1 WO 2007114496A1
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human
seq
monoclonal antibody
cells
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PCT/JP2007/057680
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Tomoyuki Tahara
Yoshikatsu Kanai
Hitoshi Endou
Shiro Kataoka
Kazumasa Hasegawa
Tetsuya Yoshino
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Kirin Pharma Kabushiki Kaisha
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention is an invention related to the results of development related to a new technology development contract for an “amino acid transfer protein antibody anticancer drug” of the Japan Science and Technology Agency.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody having a specific binding ability to CD98, which is derived from a cell membrane of cancer cells and forms a complex with a protein having amino acid transport activity, and tumor growth inhibition or
  • the present invention relates to a medical use for cancer treatment.
  • Cancer malignant tumor
  • cancer-related antigens cancer-related antigens
  • Antibodies that specifically bind to cancer-related antigens expressed on the cell membrane of cells are antibody-dependent 'cell-dependent cytotoxicity' (ADCC) and ne Attacks cancer cells via immune responses such as complement-dependent cell-mediated cytotoxicity (CDC), or suppresses cell proliferation signaling necessary for cancer cell growth It has been shown to be useful for cancer treatment.
  • ADCC antibody-dependent 'cell-dependent cytotoxicity'
  • CDC complement-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • Cancer types include breast cancer, refractory chronic lymphoma, There are limited types of cancer such as Hodgkin lymphoma and acute myeloid leukemia, and there is still no antibody that can be used to treat various types of cancer with one antibody. Therefore, there has been a demand for obtaining an antibody that binds strongly to various cancer cells and has anticancer activity.
  • CD98 (4F2) is a type II transmembrane glycoprotein chain of about 80 kDa, which is known to be highly expressed in various cancer cells and has a residual capacity of 529 amino acids. It forms a heterodimer with a disulfide bond with an approximately 40 kDa protein with amino acid transport activity and is expressed on the cell membrane. There are six known amino acid transport proteins that are thought to bind to CD98. CD98 is thought to be involved in many biological functions such as force cell proliferation signaling, integrin activation, and cell fusion that have been identified as active lymphocyte antigens of lymphocytes (Haynes B. F et al "J. Immunol, (1981), 126, 1409-1414, Lindst en T.
  • the neutral amino acid transporter may be overexpressed in order to preferentially take in essential amino acids necessary for cancer cell growth to surrounding cells.
  • the amino acid transporter L-type amino acid transporter 1 (LAT1), which is highly expressed specifically in cancer cells, has been cloned (Kanai et al., J. Biol. Chem. (1998), 273, 23629-23 632)
  • LAT1 L-type amino acid transporter 1
  • o LAT1 forms a complex with CD98, and neutral ions of neutral amino acids with large side chains such as leucine, norin, ferrolanine, tyrosin, tributophan, methionine, and histidine. Transport independently.
  • LAT1 is low in expression in most normal tissues except brain, placenta, bone marrow, and testis, but it is not found in colorectal cancer, stomach cancer, breast cancer, knee cancer, kidney cancer, laryngeal cancer, esophageal cancer, lung cancer, etc. It is known that expression is enhanced with CD98 in human malignant tumor tissue (Yanagida et al "Biochem. Biophys. Acta, (2001), 1514, 291-302). It has been reported in a cancer transplanted mouse model that suppression of uptake suppresses tumor growth (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-157286), and suppressing LAT1 activity is considered promising for cancer therapy .
  • a human CD98-expressing cell line is used as a non-human mammal such as a mouse.
  • Mouse monoclonal antibodies made by immunizing animals have been reported (see Haynes et al, Masuko T. et al., Cancer Res., (1986), 46, 1478-1484, and Freid man AW. et al., Cell. Immunol., (1994), 154, 253-263).
  • these anti-CD98 antibodies inhibit amino acid uptake of LAT1.
  • an antibody in the intracellular region of LATI has been obtained, no antibody capable of binding to LAT1 on the living cell membrane has been reported. Therefore, if an antibody that binds to CD98 or LAT1 expressed on the cancer cell membrane and suppresses amino acid uptake of LAT1 is obtained, it will be an excellent therapeutic agent for a wide range of cancers.
  • the present inventors have succeeded in obtaining an antibody having a specific binding ability to CD98, which is a CD98 derived from the cell membrane of cancer cells and forms a complex with a protein having amino acid transport activity. Since the antibody has an action of suppressing the growth of cancer cells, it is said that this antibody is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition, more specifically, as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for tumors. Obtained knowledge. The present invention is based on such knowledge.
  • the present invention relates to a human antibody having a specific binding ability to CD98 that forms a complex with a protein that has CD98 derived from the cell membrane of cancer cells and has amino acid transport activity! Its purpose is to provide functional fragments.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition or tumor preventive or therapeutic agent comprising the above-described human antibody and functional fragment thereof according to the present invention as an active ingredient.
  • the human antibody and the functional fragment thereof according to the present invention have CD98 derived from the cell membrane of cancer cells and have a specific binding ability to CD98 complexed with a protein having amino acid transport activity. It is characterized by.
  • the pharmaceutical composition or the preventive or therapeutic agent for tumor according to the present invention comprises the human antibody or the functional fragment thereof according to the present invention as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to human CD98Z human LAT1-expressing CT26 cell line.
  • FIG. 2A Binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to human CD98-expressing L929 cell line It is a figure which shows sex.
  • FIG. 2B is a diagram showing the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to human CD98-expressing L929 cell line.
  • FIG. 3 shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to uckamycin-treated K562 human cell line.
  • FIG. 4A is a view showing the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to various mouse / human chimeric CD98-expressing L929 cell lines.
  • FIG. 4B shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to various mouse / human chimeric CD98-expressing L929 cell lines.
  • FIG. 5 shows the amino acid uptake inhibitory activity of the human anti-CD98 monoclonal antibody in the T24 human bladder cancer cell line.
  • FIG. 6A shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to human peripheral blood T cells, B cells, and monocytes.
  • FIG. 6B shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to human peripheral blood T cells, B cells, and monocytes.
  • FIG. 7 shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to PHA-activated human peripheral blood T cells and B cells.
  • FIG. 8 shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to human aortic endothelial cells (HAEC) and human colon cancer cell line (DLD-1).
  • FIG. 9A shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to various cancer cell lines.
  • FIG. 9B shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to various cancer cell lines.
  • FIG. 10A shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to various cancer cell lines.
  • FIG. 10B shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibody to various cancer cell lines.
  • FIG. 11 Tumor cells were transplanted with human anti-CD98 monoclonal antibodies K3, 3-69-6, C2IgGl It is a figure which shows the magnitude
  • FIG. 12 is a graph showing the results of measuring the size of a tumor when a human anti-CD98 monoclonal antibody C2IgGl was administered at 100 ⁇ g / mouse 3 times every other day to a tumor-bearing mouse having a tumor grown to 90 mm 3 . It is.
  • FIG. 13 shows cross-reactivity of human anti-CD98 monoclonal antibodies K3 and C2IgGl to monkey cell line COS-7.
  • FIG.14 Human anti-CD98 monoclonal antibodies C2IgGl and Rituximab were administered 3 times / week for each 100 mg / mouse in tumor-bearing mice transplanted with Burkitt lymphoma cell line Ramos after tumors grew to 30-140 mm 3 It is a figure which shows the result of having measured the magnitude
  • FIG. 15 is a graph showing the aggregate content after purification of human anti-CD98 monoclonal antibody C2IgGlNS amino acid-modified antibody measured by HPLC.
  • FIG. 16A shows the binding of human anti-CD98 monoclonal antibodies K3, C2IgGl, and C2IgGl amino acid-modified antibodies to human CD98 or human LAT1 forced expression L929 cells.
  • FIG. 16B Human colorectal cancer cell line (DLD-1), Burkitt lymphoma cell line (Ramos), human colorectal cancer cell line (Colo205), human anti-CD98 monoclonal antibody K3 and amino acid-modified antibodies of C2IgGl and C2IgGl, It is a figure showing the binding to human aortic endothelial cells (HAEC)
  • the plasmid vectors C2IgGl / pCR4 and K3 / pCR4 containing the nucleic acid sequence encoding the variable region of the human antibody provided by the present invention were incorporated by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) as of March 14, 2006.
  • FERM BP-10551 Indication for identification: C2IgGl / pCR4
  • FERM BP— 10552 Indication for identification: K3 / pCR4)
  • G Glycine, (A) Alanine, (V) Valine, (L) Leucine, (I) Isoleucine, (S) Serine, (T) Threonine, (D) Aspartic acid, (E) Glutamic acid, (N) Asparagine, (Q) Glutamine, (K) Lysine, (R) Arginine, (C) Cystine, (M) Methionine, (F) Fe-Laranin, (Y) Tyrosine, (W) Tryptophan, (H) Histidine, ( P) Proline.
  • the meaning of one letter of the alphabet used to describe DNA is as follows.
  • CD98 having the specific binding ability of the human monoclonal antibody according to the present invention and functional fragments thereof (hereinafter, unless otherwise specified, hereinafter abbreviated as “antibody according to the present invention”) is described above. As shown, it is a type II transmembrane glycoprotein chain consisting of 529 amino acid residues, and forms a heterodimer on the cell membrane with a protein having amino acid transport activity.
  • LAT1 is mentioned as a preferable specific example of the protein having amino acid transport activity.
  • CD98 is human CD98.
  • the primary structure of human CD98 protein is known (SEQ ID NO: 66; GenBank / EMBL / DDBJ accession No. AB018010), and the human LAT1 protein is also known (SEQ ID NO: 68; GenBank / EMBL / DDBJ accession no. AB018009).
  • the antibody according to the present invention is a CD98 derived from the cell membrane of cancer cells and has a specific binding ability to CD98 complexed with a protein having amino acid transport activity, while human normal cells, For example, it does not bind to normal human vascular endothelial cells, normal human peripheral blood monocytes, and lymphocytes.
  • cancer cells having binding ability include colon cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, melanoma, brain tumor, lymphoma, bladder cancer, spleen cancer, multiple myeloma, renal cell carcinoma, leukemia, T Cell lymphoma, gastric cancer, spleen cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, liver cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, skin cancer, urinary tract cancer, prostate cancer, choriocarcinoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer , Meningiomas, male embryos, endometrial hyperplasia, endometriosis, embryonal tumors, fibrosarcoma, capodisarcoma, hemangioma, cavernous hemangioma, hemangioblastoma, retinoblastoma, astrocytoma , Neurofibroma, oligodend
  • colon cancer cell lines (DLD-1, Colo205, SW480, SW620, LOVO, LS180, and HT29), lung cancer Cell line (H226), prostate cancer cell line (DU145), melanoma cell line (G361, SK MEL28, CRL1579), non-Hodgkin lymphoma line (Ramos), bladder cancer cell line (T24), breast cancer cell line (MCF, MDA -MB-231), spleen cancer cell line (HS766T), multiple myeloma cell line (IM9), and erythroblastic leukemia line (K562).
  • the antibody according to the present invention is advantageous in that it has the ability to bind to such a variety of cancer cells.
  • the specific binding ability of the antibody according to the present invention to cancer cells makes the antibody of the present invention highly useful. That is, as described later, since the antibody of a preferred embodiment of the present invention significantly inhibits amino acid uptake into cells via LAT 1, it is advantageous to bind only to cancer cells. Can be advantageously used as a targeting agent for binding to other drugs and delivering them to cancer cells.
  • the antibody according to the present invention has antitumor activity.
  • the antibody according to a preferred embodiment of the present invention has the property of significantly inhibiting amino acid uptake into cells via LAT1. Therefore, it is considered that the antitumor activity of the antibody according to the present invention is caused by such inhibition of amino acid incorporation in addition to specific damage using the immune system by ADCC and CDC.
  • the antibody according to the present invention significantly inhibits amino acid uptake of bladder cancer cell line T24 cells.
  • the antibody according to the present invention is any of (a) SEQ ID NOs: 29 and 31, (b) SEQ ID NOs: 41 and 47, and (c) SEQ ID NOs: 43 and 47, which will be described later. These two sequences have a heavy chain variable region and a light chain variable region. Furthermore, according to another embodiment, the antibody according to the present invention contains a sequence other than the sequence derived from the vector pCR4 contained in the plasmid vector K3 / pCR4 (FERM BP-10552) or C2IgGl / pCR4 (FERM BP-10551). The sequence encoded by the sequence is a variable region.
  • the amino acid sequence of the variable region of the antibody according to this embodiment includes the Bglll-BsiWI fragment (light chain variable region) and Sail-Nhel, which do not contain the sequence derived from the vector pCR4, obtained from any of the above plasmid vector forces. It is encoded by a fragment (heavy chain variable region).
  • the functional fragment of the antibody according to the present invention refers to an antigen to which the antibody according to the present invention specifically binds.
  • it means a fragment of an antibody that specifically binds, and more specifically F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv, disulphide—linked FV, Single—Chain FV (scFV) and these Examples include polymers (DJ King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 TJ International Ltd).
  • Such an antibody fragment can be obtained by a conventional method, for example, digestion of an antibody molecule with a protease such as papain or pepsin, or a known genetic engineering technique.
  • human antibody means an antibody that is an expression product of a human-derived antibody gene.
  • a human antibody can be obtained by introducing a human antibody locus as described later and administering an antigen to a transgenic animal having the ability to produce a human-derived antibody.
  • the transgenic animal include mice, and a method for producing a mouse capable of producing a human antibody is described in, for example, International Publication No. WO02 / 43478.
  • the antibody according to the present invention has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequences of the heavy chain and / or light chain constituting the antibody. Monoclonal antibodies comprising heavy and / or light chain forces are also included.
  • Such partial modification (deletion, substitution, insertion, addition) of amino acids into the amino acid sequence of an antibody according to the present invention is achieved by partially modifying the base sequence encoding the amino acid sequence. Can be introduced.
  • This partial modification of the nucleotide sequence can be introduced by a conventional method using a known site-specific mutagenesis method (Proc Natl Acsd Sci USA., 1984 Vol815662; Sambrook et al. , Molecul ar Cloning A Laboratory Manual (1989) Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the antibody according to the present invention is such that isoleucine at the 117th light chain is substituted with another amino acid residue, for example, methionine, asparagine, leucine or cystine.
  • Preferred examples of such antibodies include: (d) SEQ ID NOS: 43 and 77, (e) SEQ ID NOS: 43 and 79, (f) SEQ ID NOS: 43 and 81, and (g) SEQ ID NOS: 43 and 83, Some have these two sequences as a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • the antibody according to the present invention has V, an immortal immunoglobulin class and a subclass.
  • antibodies are also included, according to a preferred embodiment of the present invention are antibodies having human immunoglobulin classes and subclasses, the preferred class, subclass being immunoglobulin G (Ig G), in particular IgGl, preferred The light chain is ⁇ .
  • Ig G immunoglobulin G
  • IgGl immunoglobulin G
  • the antibodies according to the present invention also include antibodies converted to different subclasses by genetic engineering modifications well known to those skilled in the art (for example, EP 0 314 161). That is, using a DNA encoding the variable region of the antibody according to the present invention, an antibody of a subclass different from the original subclass can be obtained by genetic engineering techniques.
  • ADCC is expressed on the surface of Macrophage, NK cells, neutrophils, etc.! / Recognizes cells by binding to the antibody constant region via Fc Receptor, and the recognized cells are active.
  • CDC refers to cytotoxic activity induced by the complement system activated by binding of an antibody to an antigen, and these activities are induced by It has been clarified that the strength of the activity varies depending on the subclass of the antibody, and that it is caused by the difference in the structure of the constant region of the antibody (Charles A. Janeway et. Al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd / uarland Publishing In
  • the antibody subclass is preferably IgGl.
  • variable region is isolated from the antibody-producing hyperidoma, and a vector containing the constant region of human IgGl, such as the N5KG1-Val Lark vector (IDEC Pharmaceuticals, N5KG1 ( US patent 6001358).
  • ADCC antibody-dependent cytotoxic activity
  • CDC complement-dependent cytotoxic activity
  • the degree of binding to the Fc receptor is low, and the antibody is more desirable in some cases.
  • antibodies that do not have ADCC activity or CDC activity are desirable, such as when sterically inhibiting only the binding between T cells and antigen-presenting cells.
  • an antibody in which the activity causing toxicity is avoided by changing the mutation or subclass of the Fc portion may be desirable.
  • the antibody according to the present invention may be capable of specifically injuring cancer cells by ADCC or CDC by genetic engineering modification to a different subclass if necessary. it can.
  • the antibody according to the present invention is constituted by at least 8 consecutive or discontinuous amino acid residues in the amino acid sequence of human CD98 (SEQ ID NO: 66). It is preferred that it recognizes epitopes.
  • the antibody according to the present invention has binding to a part of the region of 371 to 529 amino acids in the amino acid sequence of human CD98 or binds to a part of the region of 1 to 371 amino acids. It is preferable to have sex.
  • an antibody having the property of cross-reacting with human CD98 and monkey CD98 as the antibody according to the present invention is provided.
  • Such antibodies are assumed to recognize the same or very similar epitope structure in human CD98 and monkey CD98, and various tests using monkeys as experimental animals are possible prior to clinical trials on humans. Have the advantage.
  • the antibody according to the present invention can be produced, for example, by the method described below.
  • a large amount of human CD98 / human LAT1 or a part thereof, a conjugate with an appropriate substance (for example, bovine serum albumin) for enhancing the antigenicity of an antigen, or human CD98 / human LAT1 is expressed in a large amount on the cell surface.
  • Immunize non-human mammals such as mice, rabbits, goats, horses, etc., or incorporate human CD98 / human LAT1 with immunostimulants (Freund's Adjuvant, etc.) as necessary Immunization is performed by administering the expression vector to a non-human mammal.
  • the antibody according to the present invention is not capable of producing autoantibodies and antibody-producing cells obtained from immunized animals.
  • Hypridoma is prepared from myeloma cells (myeloma cells).
  • the clones can be obtained by cloning clones and hybridomas and selecting a clone that produces a monoclonal antibody exhibiting specific affinity for the antigen used for immunization.
  • the transformant itself obtained by incorporating DNA encoding CD98 into an expression vector for animal cells and introducing the expression vector into animal cells can be used.
  • CD98 forms heterodimers with LAT1 on the surface of many cancer cells
  • DNA encoding LAT1 is also incorporated into an expression vector, and CD98 and LAT1 are coexpressed. It is expected that antibodies that inhibit LAT1 amino acid uptake can be obtained by using transmutation ⁇ tt as an antigen.
  • an expression vector for animal cells for example, a vector such as pEGF-Nl (Betaton 'Dickinson' Biosciences' Clontech) can be used, and the insertion site is cleaved with an appropriate restriction enzyme and the same enzyme is used.
  • a vector for gene transfer By ligating the cleaved human CD98 or human LAT1, a vector for gene transfer can be prepared. Then, by introducing mainly the prepared expression vector into cells such as L929 cells (American Type Culture Collection No. CCL-1), cells that highly express human CD98 and human LAT1 can be produced.
  • Methods for introducing genes into the host are known, and any method (for example, calcium ion And a method used, an electopore position method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a phosphate power method, a lipofusion method, etc.).
  • the transformed cells thus prepared can be used as an immunogen for preparing a CD98 antibody. Furthermore, the expression vector itself can be used as an immunogen.
  • Human CD98 is based on known base sequences or amino acid sequences! / In addition to gene recombination techniques, methods known in the technical field such as chemical synthesis methods, cell culture methods, etc. are appropriately used. It can be manufactured by using. It is also possible to produce a CD98 antibody using the human CD98 protein thus obtained as an antigen.
  • the partial sequence of human CD98 can be produced by a gene recombination technique or a chemical synthesis method according to a method known in the technical field described later, and human CD98 is appropriately cleaved using a proteolytic enzyme or the like. Can be manufactured.
  • the antigen obtained as described above is immunized as follows. That is, the prepared antigen is mixed with an appropriate substance for enhancing antigenicity (for example, bovine serum albumin) and, if necessary, an immunostimulant (Freund complete or incomplete adjuvant etc.), and then mixed with a mouse, a rabbit Immunize non-human mammals such as goats and horses.
  • the antibody of the present invention is a human antibody by using a non-human animal that retains a non-rearranged human antibody gene and produces a human antibody specific for the immunogen by immunization. It's okay.
  • the human antibody-producing animal is, for example, a human antibody-producing transgenic mouse described in the document of Tomituka et al. [Tomizuka et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000 Vol 97: 722]. Can be mentioned.
  • Hybridomas secreting monoclonal antibodies can be prepared according to the method of Köhler and Milsteine et al. (Nature., 1975 Vol. 256: 495-497) and the like. That is, antibody-producing cells contained in the spleen, lymph nodes, bone marrow or tonsil, etc. obtained by immunization as described above, preferably in the lymph nodes or spleen, and preferably in mice, rats, guinea pigs, mice, It is prepared by cell fusion with myeloma cells having no autoantibody-producing ability derived from mammals such as Muster, Usagi or human.
  • antibody-producing cells and myeloma cells are mixed in a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol (for example, molecular weight 1500 to 6000), usually at about 30 to 40 ° C for about 1 to 10 minutes. This can be done by combining. Screening of hyperidoma clones that produce monoclonal antibodies is carried out by culturing the hyperidoma in, for example, a microtiter plate, and then examining the reactivity of the culture supernatant in the wells in which the proliferation has been observed to the immunizing antigen. The enzyme immunoassay method, radioimmunoassay, and fluorescent antibody method can be used for measurement.
  • a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol (for example, molecular weight 1500 to 6000)
  • polyethylene glycol for example, molecular weight 1500 to 6000
  • Screening of hyperidoma clones that produce monoclonal antibodies is carried out by culturing the hyperidoma in, for example
  • Monoclonal antibody production from Hypridoma can be cultivated in vitro and isolated from the culture supernatant.
  • ascites can be isolated by culturing in vivo in ascites such as mouse, rat, guinea pig, wild, musta or rabbit.
  • a gene encoding a monoclonal antibody that produces antibody-producing cell force such as hypridoma is cloned and incorporated into an appropriate vector, which is then used as a host (for example, a mammalian cell line such as Chinese nosester ovary (CHO) cell, E. coli, yeast cell).
  • Insect cells, plant cells, etc. and recombinant antibodies can be prepared using genetic recombination technology (PJ Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQU ES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, JW Goding., Monoclona 1 Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS;).
  • transgenic animal production technology a transgenic ushi, goat, hidge or pig in which the gene of the target antibody is incorporated into the endogenous gene is produced, and the milk's neutral strength of the transgenic animal is produced.
  • hybridomas When hybridomas are cultured in vitro, the hybridomas are grown, maintained and stored in accordance with the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test and the culture method, etc. It can be carried out using any known nutrient medium such as that used to produce antibodies or any known basal medium force-derived preparation.
  • the produced monoclonal antibody can be obtained by methods well known in the art such as chromatography using a protein A column, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, ammonium sulfate salting out method, gel filtration, and affinity chromatography. It is possible to purify from a combination of appropriate combinations. [0049] Medical use of antibody
  • the antibody according to the present invention is first conjugated with a therapeutic agent because of its specific binding ability to CD98 which is a CD98 derived from the cell membrane of the cancer cell and forms a complex with a protein having amino acid transport activity.
  • CD98 which is a CD98 derived from the cell membrane of the cancer cell and forms a complex with a protein having amino acid transport activity.
  • Examples of the therapeutic agent to be bound to the antibody are not particularly limited, but include, for example, odod (1 31 Iodine: 131 I, 125 Iodine 12 3 ⁇ 4, yttrium ( 9 , Yttrium: 9, Y), indium. ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ), radionuclides such as technetium ( 99m T ec hnetium: 99m T C ) Ci. W.
  • Pseudomonas aeruginosa toxin Bacterial toxins such as Pseudomonas exotoxin, diphtheria toxin, ricin, and chemotherapeutic agents such as methotrexate, mitomycin, calicheamicin (DJ King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibod ies., 1998 TJ International Ltd, ML Grossbard., Monoclonal Anti body-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc), and more preferably, selenium compounds that induce radical formation. Et It is.
  • the binding between the antibody and the therapeutic agent may be covalent or non-covalent (eg, ionic)!
  • a reactive group for example, an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, etc.
  • a coordinating group in an antibody molecule is used, and if necessary, a reactive group is bonded to a force or a reactive group.
  • functional groups that can react with the reactive groups to form bonds bacterial toxins, in the case of chemotherapeutic agents
  • ionic groups that can form complexes with the coordinating groups
  • the complex of the present invention can be obtained by contacting a therapeutic drug having the above and an antibody.
  • a piotin-avidin system may be used for complex formation.
  • the therapeutic agent when it is a protein or peptide, it can be produced as a fusion protein of the antibody and the protein or peptide by genetic engineering techniques.
  • the antibody according to the present invention has antitumor activity, it itself is used as an antitumor agent. Can be used. Furthermore, it can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition, particularly a preventive or therapeutic agent for tumors.
  • the antibody or pharmaceutical composition according to the present invention can be applied to the treatment or prevention of various diseases or symptoms that may be caused by V, which expresses human CD98 / human LAT1. is there.
  • diseases or symptoms include various malignant tumors.
  • tumors include colon cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, melanoma, brain tumor, lymphoma, bladder cancer, spleen cancer, multiple cancers.
  • Myeloma renal cell carcinoma, leukemia, T cell lymphoma, gastric cancer, spleen cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, liver cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, skin cancer, urinary tract cancer , Prostate cancer, choriocarcinoma, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, capsuloma, male embryo, endometrial hyperplasia, endometriosis, germoma, fibrosarcoma, force positive sarcoma, hemangioma, cavernous hemangioma, Hemangioblastoma, retinoblastoma, astrocytoma, neurofibroma, oligodendroma, medulloblastoma, neuroblastoma, glioma, rhabdomyosarcoma, glioblastoma, osteogenic sarcoma, smooth
  • the medicament containing the antibody according to the present invention or an antibody conjugated with a therapeutic agent is preferably provided as a pharmaceutical composition.
  • Such a pharmaceutical composition contains a therapeutically effective amount of a therapeutic agent, and is formulated into various forms for oral and parenteral administration.
  • the therapeutically effective amount is an amount that gives a therapeutic effect according to a given symptom. Uh.
  • composition of the present invention contains physiologically acceptable pharmaceutical additives such as diluents, preservatives, solubilizers, emulsifiers, adjuvants, antioxidants, isotonic agents in addition to antibodies.
  • physiologically acceptable pharmaceutical additives such as diluents, preservatives, solubilizers, emulsifiers, adjuvants, antioxidants, isotonic agents in addition to antibodies.
  • an agent, excipient and carrier can be included. It can also be a mixture with other drugs or other drugs such as antibiotics.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline, glucose solution, and buffered saline. Yes. Further, it may contain stabilizers such as amino acids, saccharides, surfactants and the like and anti-adsorption agents that are well known in the art.
  • the form of the preparation includes a freeze-dried preparation (in this case, it can be reconstituted by adding a buffered aqueous solution as described above), a sustained-release preparation, an enteric preparation, an injection or an infusion.
  • a preparation containing an agent or the like can be selected according to the therapeutic purpose and the therapeutic plan.
  • the route of administration may be determined as appropriate, but for example, the oral route and parenteral routes including intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injection or drug delivery are conceivable. Alternatively, a method of bringing the composition of the present invention into direct contact with an affected area of a patient is also possible.
  • the dose is appropriately determined by conducting studies using animals and clinical trials. In general, the patient's condition or severity, age, weight, sex, etc. should be considered. In general, oral administration is about 0.01 mg to 1000 mg per day for adults, and these can be administered once or divided into several times. In parenteral administration, about 0.01 mg to 1000 mg can be administered by subcutaneous injection, intramuscular injection or intravenous injection.
  • the present invention also includes the prevention or treatment of the above-mentioned diseases using the antibody or pharmaceutical composition according to the present invention, and the present invention further relates to the production of a prophylactic or therapeutic agent for the above-mentioned diseases of the antibody of the present invention. Includes use.
  • the antibody according to the present invention is used as an ampule of a sterile solution or suspension dissolved in water or other pharmacologically acceptable solution.
  • a sterile powder preparation (preferably lyophilized the molecule of the present invention) may be filled in an ampule and diluted with a pharmacologically acceptable solution at the time of use.
  • Example 1 Preparation of human CD98 or human LAT1 expression vector
  • Plasmid vector pcDNA3.1 holding DNA of human CD98 (hCD98, GenBank / EMBL / DDBJ accession no.AB018010; SEQ ID NO: 6 5) and human LATl (hLATl, GenBank / EMBL / DDBJ accession no. AB018009; SEQ ID NO: 67) -Polymerase chain reaction (PCR) was performed using hCD98 and pcDNA3.1-h LAT1 as a saddle type.
  • the modified hCD98 sequence was isolated as an EcoRI-Notl fragment and ligated into pTracer-EF / Bsd vector (Invitrogen) cleaved with the same enzyme.
  • CD98 v2 U (5'-AGT CTC TTG CAA TCG GCT AAG AAG AGC ATC CGT GTC ATT CTG -3, (SEQ ID NO: 61)) primer and CD98 v2 L (5, -CAG AAT GAC ACG GAT GCT CTT CTT CTT AGC CGA TTG CAA GAG ACT-3, (SEQ ID NO: 62))
  • primers 591 and 594 of hCD98DNA (702 and 705 in SEQ ID NO: 65) A to G changed.
  • the modified hLATl sequence was isolated as an EcoRI-Kpnl fragment and ligated into a pEGFP-N1 (Clontech) vector cleaved with the same enzyme. Further, the obtained plasmid was isolated as an EcoRI-Notl fragment and ligated to a pEFlV5His / Neo (Invitrogen) vector cleaved with the same enzyme. The obtained plasmid was designated as pEFl / hLATl-EG FP.
  • Example 2 Preparation of hCD98ZhLATl-expressing cells
  • the hCD98ZhLATl-expressing cells were prepared using the expression vectors pEF6 / hCD98 and pEFl / hLATl—EGFP (hLATl—E) prepared in Example 1 using Invitrogen's Lipofectamine and Plus reagent, and Colon26 (CT26) cells and L929 cells. (American Type Culture Collecti on No. CCL-1). Gene transfer was performed according to the manual method.
  • the transfected cells are cultured on a cell culture plate (6 well plate, Betaton Dickinson) for 24 hours at 37 ° C under 5% carbon dioxide, and in the case of the CT26 cell line, blasticidin ( The cells were further cultured for 3 days in a medium containing 5 ⁇ g / mL) and G418 (500 ⁇ g / mL), and in the case of the L929 cell line, a medium containing blastsidine g / mL) and G418 (lmg / mL).
  • hLATl-E and CD98 positive cells were separated by FACS Vantage using an RPE fluorescently labeled mouse anti-human CD98 antibody (Betaton Dickinson, Ca. No. 556076).
  • hCD98-expressing L929 cells or hLATl-E-expressing L929 cells were prepared.
  • Example 3 Human piled cattle. Production of mice
  • the mouse used for immunization has a homozygous genetic background for both endogenous Ig heavy chain and kappa light chain disruption, and a chromosome 14 fragment (SC 20) containing the Hg heavy chain locus.
  • SC 20 chromosome 14 fragment
  • KCo5 human Ig kappa chain transgene
  • This mouse was produced by crossing a strain A mouse having a heavy Hg heavy chain locus with a strain B mouse having a human Ig kappa chain transgene.
  • Strain A is a homozygote for both endogenous Ig heavy chain and kappa light chain disruption and is a mouse strain that carries the 14th chromosome fragment (SC20) that can be transmitted to progeny.
  • Line B is a mouse strain (transgenic mouse) that is homozygous for both endogenous Ig heavy chain and ⁇ light chain disruption and carries the Hg K chain transgene (KCo5).
  • KCo5 Hg K chain transgene
  • Monoclonal antibodies were prepared according to a general method as described in the introduction to monoclonal antibody experimental procedures (authored by Tamie Ando, published by Kodansha, 1991).
  • the immunogen hCD98 / hLATl As the immunogen hCD98 / hLATl, the hCD98 / hLATl-E expression CT26 cell prepared in Example 2 and the human colon cancer cell line Colo205 cell in which hCD98 expression was confirmed were used.
  • the human antibody-producing mouse producing human immunoglobulin prepared in Example 3 was used as the immunized animal.
  • the culture was performed in a 96-well microtiter plate (Betaton Dickinson). Selection (screening) of hybridoma clones producing the target human monoclonal antibody and characterization of the human monoclonal antibodies produced by each hybridoma were carried out by measuring with a fluorescent activity cell sorter (FACS) described later.
  • FACS fluorescent activity cell sorter
  • Hypridoma clones represent single clones: 4-35-14 (C2), 4-32-9 (K3), 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6, 5-80 -1 (above hCD98 / hLATl- clones expressing CT26 cells as immunogen), 1-40- clones using Colo205 cells as immunogen).
  • Example 5 Subclass identification of each monochrome nanore pile
  • Example 4 The subclass of each monoclonal antibody obtained in Example 4 was identified by FACS analysis. 2 x 10 6 / ml Colo205 cells were mixed with PBS SB (stm with ImM EDTA, 0.1% NaN, 5% FCS
  • aining buffer The cell suspension was dispensed into 96-well round bottom plates (Betaton Dickinson) (50 1 / well). Further, the culture supernatant of the hybridoma (50 1) cultured in Example 4 was added, stirred, allowed to react for 30 minutes at ice temperature, and then centrifuged (2000 rpm, 4 ° C, 2 minutes). The supernatant was removed. After washing the pellet once with 100 1 / well SB, FITC fluorescently labeled Usagi anti-Hg F (ab ') antibody (Dakosite Méssion) 50 times in SB
  • Example 6 Preparation of a gene encoding a monoclonal antibody and construction of a recombinant antibody expression vector
  • the cells were cultured in DMEM medium (manufactured by Gibco) containing 10% FCS and the cells were collected by centrifugation, and then ISOGEN (manufactured by Futtsubon Gene) was added and total RNA was extracted according to the instruction manual. Cloning of the variable region of the antibody cDNA was performed using SMART RACE cD NA amplification Kit (Clontech) according to the attached instructions.
  • 1st strand cDNA was prepared using 5 ⁇ g of total RNA as a cage.
  • RNA 5 g / 3 1, 5, CDS 1 ⁇ 1 and SMART oligo 1 ⁇ 1 reaction mixture was incubated at 70 ° C for 2 minutes, then 5 X Buffer 2 1, DTT 1 ⁇ 1, DNTP Mix 1 1 and Superscript II 1 ⁇ 1 were incubated at 42 ° C for 15 hours. Furthermore, 100 ⁇ l of Tricine Buffer was prepared and incubated at 72 ° C for 7 minutes to obtain 1st strand cDNA.
  • Toyobo KOD-Plus was used for cDNA amplification.
  • Reaction solution consisting of cDNA 151, lOxKOD—Plus Buffer 51, dNTP mix 51, KOD—Plus 1 ⁇ 1, 25 mM MgSO 3 / z l, Primer 1 and Primer 2 with double distilled water
  • the final volume was 50 1 and subjected to PCR.
  • UMP and hk-2 (5, -GTT GAA GCT CTT TGT GAC GG G CGA GC-3 '(SEQ ID NO: 1)) primer were used, 94 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 3 minutes Repeat cycle 5 times, then repeat 5 cycles of 94 ° C for 5 seconds, 70 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 3 minutes, and then 94 ° C for 5 seconds: 68 ° C for 10 seconds: 72 ° C for 3 minutes. Repeated 25 times.
  • the 5-fold diluted solution 1 1 of this reaction solution was made into a saddle type and 94 ° using NUMP and hk5 (5, -AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC-3, (SEQ ID NO: 2)) primer. The cycle of C15 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 1 minute was repeated 30 times.
  • This reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis.
  • the amplified PCR product was purified using a QIAquick gel extraction kit (Qiagen).
  • the purified PCR product was ligated to pCR4Blunt-TOPO vector (Invitrogen) and subcloned according to the attached instructions. Then T3 (5 '-ATT AAC CCT CAC
  • the nucleotide sequence was determined using TAA AGG GA-3 ′ (SEQ ID NO: 3)) and hk5 as primers. Based on the sequence information, DNPL15Bglp (5,-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TG G AAG CCC CAG CTC AGC TTC TCT -3, (SEQ ID NO: 4)) was synthesized and subcloned with pCR4Blunt-TOPO vector 94 ° C for 15 seconds, 55 ° using DNPL15Bglp and 20 2LR (5 '-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TAA TCT CCA GTC GTG TCC CTT G GC -3' (SEQ ID NO: 5)) primer A cycle of C30 seconds and 68 ° C for 1 minute was repeated 30 times.
  • This reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 400 bp was purified with a QIAquick gel extraction kit (Qiagen).
  • the light chain amplified cDNA fragment was digested with BglII and BsiWI and introduced into the N5KG1-Val Lark vector (modified vector of IDE C Pharmaceuticals, N5KG1 (US patent 6001358)) that had been cleaved with the same enzymes.
  • the obtained vector was named N5KG1-Val K3L.
  • the base sequence was determined using GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G—3 ′ ( ⁇ Self-lj number 8)) as a primer. Based on the sequence information, K3HcSalI (5 '-AGA GAG AGA GGT CG A CCA CCA TGG GGT CAA CCG CCA TCC TCG CCC TCC TC-3' (SEQ ID NO: 9)) was synthesized and subcloned with pCR4Blunt-TOPO vector K3HcSalI and F24HNhe (5, 1 AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CG G TGA CCA GGG TTC-3, (SEQ ID NO: 10)) was used, and a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 450 bp was purified by QIAquick gel extraction kit.
  • the heavy chain amplified cDNA fragment was digested with Sa II and Nhel and introduced into N5KG1-Val K3L which had been cleaved with the same enzyme.
  • the DNA base sequence of the inserted portion was determined, and it was confirmed that the inserted sequence after PCR amplification was not different from the truncated gene sequence.
  • the resulting vector was named N5KG1-Val K3IgGl.
  • UMP and IgGlp primers For heavy chain amplification, use UMP and IgGlp primers, repeat 5 cycles of 94 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 3 minutes, followed by 94 ° C for 5 seconds, 70 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 3 minutes. The cycle was repeated 5 times, and a cycle of 94 ° C for 5 seconds, 68 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 3 minutes was repeated 25 times. Further, 1 ⁇ 1 of a 5-fold dilution of this reaction solution was used as a saddle type, and a cycle of 94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1 minute was repeated 30 times using NUMP and IgG2p primer.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the amplified PCR product was purified by QIAquick gel extraction kit.
  • the purified PCR product was ligated to the pCR4Blunt-TOPO vector and subcloned. Next, the base sequence was determined using T3 and hh2 as primers.
  • 205HP5SalI (5,-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT GGG TTT -3, (SEQ ID NO: 11)) was synthesized and subcloned with pCR4Blunt-TOPO vector The cycle of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute was repeated 25 times using 205HP5SalI and F24Hnhe primer as the heavy chain gene.
  • This reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 450 bp was purified by a QIAquick gel extraction kit.
  • the heavy chain amplified cDNA fragment was digested with Sall and Nhel and introduced into the N5KG1-Val Lark vector which had been cleaved with the same enzyme. The obtained vector was named N5KG1-Val 1-40-1H.
  • This reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and the amplified PCR product was purified by QIAquick gel extraction kit.
  • the purified PCR product was ligated to the pCR4Blunt-TOPO vector and subcloned.
  • the base sequence was determined using T3 and hk5 as primers. Based on the sequence information, A27RN202 (5 '-AGA GAG AG A GCG TAC GTT TGA TTT CCA CCT TGG TCC CTT GGC -3, (SEQ ID NO: 12)) was synthesized and subcloned in the pCR4Blunt-TOPO vector.
  • DNPL15Bglp and A27RN202 as the chain gene, the cycle of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 400 bp was purified by QIAquick gel extraction kit.
  • the light chain amplified cDNA fragment was deleted with BglII and BsiWI and introduced into the N5KG1-Val 1-40-1H vector that had been cleaved with the same enzymes.
  • the DNA base sequence of the insertion site was determined, and it was confirmed that there was no difference from the truncated gene sequence in the sequence inserted by PCR amplification.
  • N5KG1-Val 1-40-lIgGl was named N5KG1-Val 1-40-lIgGl. Confirmation that N5KG1-Val 1-40-lIgGl is the same as the antibody derived from recombinant 1-40-1 antibody obtained by gene transfer into FreeStyle293 cells described below ⁇ -40-1 Neubridoma This was done by examining the binding activity to hCD98 / hLATl-expressing cell lines.
  • UMP and hk-2 primers were used, and a cycle of 94 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 3 minutes was repeated 5 times, followed by 94 ° C for 15 seconds, 70 ° C for 10 seconds, 72 ° C3 The cycle of minutes was repeated 5 times, and the cycle of 94 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 3 minutes was repeated 25 times.
  • a 5 ⁇ l dilution of this reaction solution, 2 ⁇ 1 was used as a saddle, and a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute was repeated 30 times using NUMP and hk5.
  • A27_F (5 '-AGA GAG AGA GAT CTC T CA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3' (SEQ ID NO: 15)) and 39— 20 ⁇ 3Bsi (5 '-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TCT CCA GCT TGG TCC CC T G-3, (SEQ ID NO: 16)), using A27_F and 39_20 ⁇ 3Bsi using the light chain gene subcloned with pCR4Blunt-TOPO vector A cycle of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 400 bp was purified by QIAquick gel extraction kit.
  • the light chain amplified cDNA fragment was digested with BglII and BsiWI and introduced into the N5KG1-Val Lark vector that had been cleaved with the same enzymes.
  • the obtained vector was designated as N5KG1-Val 3-69-6L.
  • the base sequence was determined using M13F, M13R and IgG2p as primers. Based on the sequence information, Z3HP5Sal (5,-AGA GAG AGA GGT CGA CCCACCATG GAC TGG AGC ATC CTT TT-3, (SEQ ID NO: 17)) and F24HNhe (5,-AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC-3, (SEQ ID NO: 10)), and using Z3HP5SalF and F24HN helium as the saddle type heavy chain gene subcloned with pCR4Blunt-T ⁇ vector, 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 The cycle of ° C 1 minute second was repeated 25 times.
  • Z3HP5Sal 5,-AGA GAG AGA GGT CGA CCCACCATG GAC TGG AGC ATC CTT TT-3, (SEQ ID NO: 17)
  • F24HNhe
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 450 bp was purified by a QIAquick gel extraction kit.
  • the heavy chain amplified cDNA fragment was digested with Sall and Nhel and introduced into the N5KG1-Val 3-69-6L vector that had been cleaved with the same enzymes. Determine the DNA base sequence of the insertion site and confirm that there is no difference from the truncated gene sequence in the inserted sequence after PCR amplification. did.
  • the obtained vector was named N5KG1-Val 3-69-6IgGl.
  • the C2 antibody variable region was isolated by PCR using primers designed to include the variable region expected from IgG derived from the same germ line (C2 IgGDo
  • UMP and hk-2 primers were used, and a cycle of 94 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 3 minutes was repeated 5 times, followed by 94 ° C for 5 seconds, 70 ° C for 10 seconds, 72 A cycle of 3 minutes at ° C was repeated 5 times, and a cycle of 94 ° C for 5 seconds, 68 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 3 minutes was repeated 25 times. Furthermore, 1 ⁇ 1 of a 5-fold diluted solution of this reaction was used as a saddle, and a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute was repeated 30 times using NUMP and hk5.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the amplified PCR product was purified by the QIAquick gel extraction kit.
  • the purified PCR product was ligated to the pCR4Blunt-TOPO vector and subcloned. Next, the base sequence was determined using M13F, M13R and hk5 as primers.
  • C2-1 Lc Bgl II F (5,-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TT C TCT TC -3, (SEQ ID NO: 18)) and C2-1 Lc BsiWI R ( 5′-AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TAT CCA CTT TGG TCC CAG GG -3 ′ (SEQ ID NO: 19)), and the light chain gene subcloned with pCR4 Blunt-TOPO vector is Using 1 Lc Bg 1 II F and C2-1 Lc BsiWI R, a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 1 minute was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 400 bp was purified by a QIAquick gel extraction kit.
  • the light chain amplified cDNA fragment was digested with BglII and BsiWI and introduced into the N5KG1-Val Lark vector that had been cleaved with the same enzymes.
  • the obtained vector was named N5KG1-Val C2L.
  • UMP and M655R (5,-GGC GAA GAC CCG GAT GGC TAT GTC-3 '(SEQ ID NO: 20)) primer were used for amplification of heavy chain, 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 A cycle of ° C for 1 minute was repeated 30 times.
  • 1 ⁇ 1 of a 5-fold dilution of this reaction solution is made into a bowl shape, and NUMP and ⁇ 393 Using R (5, -AAA CCC GTG GCC TGG CAG ATG AGC -3, (SEQ ID NO: 21)), a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 1 minute was repeated 30 times.
  • C2hcSalI F (5,-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGA AGCACC TGT GGT TCT TC C TCC TGC T—3, (SEQ ID NO: 22)) and C2hcNheI (5, — AGA GAG AGA GGC TAG CT G AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC CCT GG -3, (SEQ ID NO: 58)), using the C2hcSa 1IF and C2hcNheI as the saddle-shaped heavy chain gene subcloned with pCR4Blunt-TOPO vector, 94 ° The cycle of C15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 30 seconds was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 450 bp was purified by a QIAquick gel extraction kit.
  • the heavy chain amplified cDNA fragment was digested with Sall and Nhel and introduced into the N5KG1-Val C2L vector that had been cleaved with the same enzymes.
  • the DNA base sequence of the inserted portion was determined, and it was confirmed that there was no difference from the gene sequence in a truncated form in the sequence inserted by PCR amplification.
  • the obtained vector was named N5KG1-Val C2IgGl.
  • the C2IgGl gene cloned as described above had a mutation that was not observed in the original germ line in the frame region of the heavy chain. Therefore, the C2 variable region sequence having the original germ line sequence was isolated by the following method.
  • C2hc NS F (5'-CGT CCA AGA ACC AGT TCT CCC TGA AGC TGA-3, (SEQ ID NO: 23)
  • C2hc NSR 5, -TCA GCT TCA GGG AGA ACT GGT TCT TGG ACG-3, (SEQ ID NO: 24)
  • Using the primers change the 290 and 299th G and T of the C2 antibody heavy chain to A and C, respectively.
  • Val C2IgGlNS was prepared.
  • the form of the binding site of heavy chain and light chain may be different from the original IgM, so the following sequence conversion was performed. That is, the 26 amino acids adjacent to the variable region side from the common sequence (GCL sequence) in the CHI constant region of the IgG ⁇ chain and the IgM ⁇ chain are used as the chain sequence, and the GCL alignment power is also changed to the ⁇ chain. Converted (C2 I gi u Gl). The above sequence conversion was performed by the following method.
  • the purified PCR product was ligated to the pCR4 Blunt-TOPO vector and subcloned.
  • M13Foward (-20) primer (5,-GTA AAA CGA CGG CCA G -3, (SEQ ID NO: 13)
  • M13 Reverse primer 5,-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • the nucleotide sequence was determined using M393R as a primer.
  • C2hcSalIF (5,-AGA GAG AGA GGT CGA CCA CC A TGA AGCACC TGT GGT TCT TCC TCC TGC T -3, (SEQ ID NO: 22)) and Mu- GC L-Gamma L (5,-CAC CGG TTC GGG GAA GTA GTC CTT GAC GAG GCA GC A AAC GGC CAC GCT GCT CGT-3, (SEQ ID NO: 25)) and a heavy chain gene subcloned with the pCR4Blunt-TOPO vector as a saddle and C2hcSalIF Using Mu-GCL-Ga mma L, a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 1 minute was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the PCR amplification product was purified with a QIAquick gel extraction kit.
  • This PCR amplification product was named C2V.
  • Mu— GCL— Gamma U (5, — ACG AGCAGC GTG GCC GTT GG C TGC CTC GTCAAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG-3 ′ (SEQ ID NO: 26)) and hlgGl BamHI L (5,-CGC GGA TCC TCA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT-3 '(SEQ ID NO: 27)), 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 90 seconds Repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the PCR amplification product was purified by the QIAquick gel extraction kit.
  • This PCR amplification product was named C ⁇ 1.
  • a 5-fold dilution of C2 V and C ⁇ 1 3 times each was added, and a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 2 minutes was repeated 3 times without primer.
  • This reaction solution is heated at 99 ° C for 5 minutes, diluted 10-fold, and then 5 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 2 times are repeated 25 times using C2hcSalIF and hlgGl BamHI L It was.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the PCR amplification product was purified by the QIAquick gel extraction kit.
  • This PCR amplified cDNA fragment was digested with Sall and Smal, cleaved with the same enzymes! And introduced into the N5KG1-Val Lark vector containing the C2 light chain gene.
  • the DNA base sequence of the inserted portion was determined, and it was confirmed that there was no difference from the gene sequence in the shape of the truncated sequence after PCR amplification.
  • the resulting vector was named N5KG1- Val C2I gi u G1.
  • the binding activity of the C2Ig G1 antibody was determined by examining the binding activity of the recombinant obtained by gene transfer of N5KG1-Val C2I g ⁇ G1 to FreeStyle293 cells described later to an hCD98 / hLATl-expressing cell line.
  • DNA sequence including the heavy chain variable region and the light chain variable region of K3, 1-40-1, and 3-69-6, and the amino acid sequence including the heavy chain variable region and the light chain variable region are as follows: It was the arrangement
  • DNAs including C2 heavy chain variable region and light chain variable region are shown below.
  • the K3 and C2IgGl light chain variable regions and heavy chain variable regions (ie, the nucleic acids of SEQ ID NOs: 28 and 30 and SEQ ID NOs: 40 and 46) were transferred to the pCR4Blunt-TOPO vector.
  • the introductions were deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. – Deposit numbers of 10552 (Indicator for identification: 3 R4) and FERM BP-10551 (Indicator for identification: C2IgGl / pCR4).
  • Each antibody variable region includes a heavy chain and a light chain part and a restriction enzyme recognition sequence used for binding and isolation.
  • Bglll and BsiWI are used.
  • the heavy chain variable region can be isolated by using Sail and Nhel restriction enzymes.
  • the gene sequence including each antibody variable region and restriction enzyme recognition site inserted into the pCR4Blunt-TOPO vector is shown below.
  • the recombinant antibody expression vector constructed in Example 6 was introduced into a host cell to produce a recombinant antibody-expressing cell.
  • a dhfr-deficient strain of CHO cells (ATC C CRL-9096) was used as a host cell for expression.
  • Introduction of the vector into the host cells was performed by electo-position.
  • About 2 g of the antibody expression vector was linearized with a restriction enzyme, and the gene was introduced into 4 ⁇ 10 ° CHO cells under conditions of 350 V and 500 F using a Bio-Rad electrophoreter and seeded on a 96we 11 culture plate.
  • the drug corresponding to the selection marker of the expression vector was added and the culture was continued. After confirming the colonies, antibody-expressing strains were selected by the method shown in Example 4.
  • the antibody purification of the selected cell force was performed according to Example 8.
  • the recombinant antibody expression vector was introduced into FreeStyle293 cells (Invitrogen) according to the attached instructions to express the recombinant
  • Preparation of hypridoma culture supernatant containing HI HgG antibody was carried out by the following method.
  • Antibody-producing hybridomas were treated with usulin (5 ⁇ g / ml, Gibconnet), human transferrin (5 ⁇ g / ml, Gibcone), ethanolamine (0.01 mM, Sigma), sodium selenite. (2.5x10- 5 mM, sigma) was conditioned to contain eRDF medium (Kyokuto pharmaceutical Co., Ltd.). Culturing was performed in a tissue culture flask, and the culture supernatant was collected when the viable cell rate of Hypridoma reached 90%.
  • the collected supernatant was applied to 10 ⁇ m and 0.2 ⁇ m filters (manufactured by Gelman Science) to remove miscellaneous wastes such as hypridoma.
  • the culture supernatant containing the antibody is diluted with Protein A (a Masham) and was purified using PBS as an adsorption buffer and 20 mM sodium quenate buffer (PH3.0) as an elution buffer.
  • the elution fraction was adjusted to around pH 6.0 by adding 50 mM sodium phosphate buffer (pHLO).
  • the prepared antibody solution is replaced with PBS using a dialysis membrane (10,000 cut, manufactured by Spectrum Laboratories), sterilized by filtration with a membrane filter MILLEX-GV (manufactured by Millipore) with a pore size of 0.22 ⁇ m, and purified antibody Got.
  • concentration of the purified antibody was calculated by measuring absorbance at 280 nm and lmg / ml as 1.45 Optimal density.
  • Example 4 The reactivity of each monoclonal antibody obtained in Example 4 was examined by the same method as the FACS analysis specified in Example 5.
  • the cell line prepared in Example 2 was prepared to 2 ⁇ 1 oVml with Staining Buffer (SB), and the cell suspension was dispensed into 96-well round bottom plates (Betaton Dickinson) (50 1 / well).
  • SB Staining Buffer
  • Each recombinant antibody prepared in Example 4 to Example 8 was prepared to 5 / zg / ml with SB, and 50 1 was added to each well and stirred.
  • an anti-dinitrophenyl (DNP) human IgGl antibody prepared with KM mice was used.
  • DNP anti-dinitrophenyl
  • Antibody (Dacosite Machining Co., Ltd.) 50 1 / ul was added and reacted for 30 minutes under ice temperature. Wash once with SB, then resuspend in 300 SB and measure the fluorescence intensity of antibody binding with FACS.
  • both antibodies had strong binding activity against hCD98 / hLATl—E-expressing CT26 cells (Fig. 1) or hCD98 / hLATl-E-expressing L929 cells (Fig. 2), while CT26 cells And binding activity to L929 cells was not observed. Furthermore, since neither antibody binds to hLAT 1-E expressing L929 cells but binds to hCD98 expressing L929 cells, C2, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69- 6. The binding site of the 1-40-1 antibody was found to be located in hCD98 (Fig. 2).
  • each antibody does not show cross-reactivity with mouse CD98 (mCD98)
  • mCD98 mouse CD98
  • a chimeric CD98 in which mCD98 and hCD98 are artificially bound was used to examine the region of human CD98 protein that is important for the binding reaction of each antibody.
  • Chimeric CD98 was prepared as follows. From the sequence information of mCD98 and hCD98, EcoRIhC D98U (5 '-CCG GAA TTC cCa cCa TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA-3' (SEQ ID NO: 50)), NotIhCD98 (5 '-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAG CAG-3 '(SEQ ID NO: 51)), EcoRI mCD98 (5,-CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AAG TGG ACA TGA AA-3' (SEQ ID NO: 52)) , NotImCD98L (5'-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CAC AAA GGG GAA CTG TAA CAG CA-3, (SEQ ID NO: 53)), cCD98D2-F (5, -TCA TTC TTC T
  • mCD98 GenBank / EMBL / DDBJ accession no.U25708
  • plasmid vector pcDNA3.1-mCD98 carrying cDNA encoding human CD98 and pEF6 / produced in Example 1 were used.
  • hCD98 a template for PCR.
  • Toyobo KOD-Plus was used for cDNA amplification.
  • the reaction solution composed of R primer was made up to 50 1 with double-distilled water and subjected to PCR.
  • Chimera CD98-1, Chimera CD98-2, and Chimera CD98-3 are respectively the following combinations of (cDNAl: F primer 1: R primer 1; cDNA 2 and F primer 2: R primer 2) (pEF6 / hCD98: EcoRIhCD98U: cCD98D2—R; pcDNA3.1—mCD98: cCD98 D2-F: NotImCD98L), (pEF6 / hCD98: EcoRIhCD98U: cCD98D3-R; pcDNA3.1-mCD98: cCD98D3-F: NotImCD98L), (pcDNA3.
  • HBSS (-) (Na + -free) containing the body was added and cultured at 37 ° C, 5% C02 for another 10 minutes.
  • Example 13 Fluorescent labeling of anti-hCD98 / hLATl antibody for each monoclonal antibody
  • Fluorescent labeling of each antibody was performed by the following method. Fluorescein isothiocyanate (FITC, manufactured by Sigma) was bound to each recombinant antibody prepared in Examples 4 to 8 according to the attached instruction. Add 1 to 2 mg / ml of antibody with 200 mM sodium carbonate buffer (pH 8.3 to 8.5), FITC dissolved in dimethylformamide in an amount of 20 to 40 times the amount of the antibody molecule, and mix at room temperature with stirring. Reacted for hours. The mixed solution was applied to a gel filtration column (NAP5, manufactured by Amersham “Falmacia” Biotech) equilibrated with PBS to remove FIT C unbound to the antibody. Under this condition, about 3 FITCs bound to one antibody molecule. All of the fluorescently labeled antibodies bound to the human colon cancer cell line DLD-1 cell line in which hCD98 expression was confirmed.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • Example 14 Anti-human peripheral aortic endothelial cells (HAEC) against peripheral human blood T cells, B cells, monocytes and normal human aortic endothelial cells (HAEC)
  • Human peripheral blood-derived T cells were prepared by the following method. 10 ml of human peripheral blood containing 1 ml of parin (Novo) diluted with PBS twice and layered on 20 ml of Fico 11-Paque PLUS solution (Amersham 'Falmasia' Biotech), 30 at 1500 rpm Collected after centrifugation for 1 minute. Mononuclear cells were prepared by washing twice with PBS.
  • the cells were cultured at 37 ° C for 72 hours. CD25 expression was observed in human peripheral blood-derived T cells and B cells by PHA stimulation (FITC-labeled anti-human CD25 antibody (Ca.555431 manufactured by Betaton Dickinson) was used) FACS analysis).
  • FITC-labeled anti-human CD25 antibody (Ca.555431 manufactured by Betaton Dickinson) was used) FACS analysis).
  • SB Staining Buffer
  • the cell suspension 96 Ueru was dispensed into a round bottom plate (manufactured by solid tons di luck Nso emissions Co.) (50 mu 1 / Ueru ).
  • Each FITC-labeled antibody prepared in Example 13 was anti-human CD3 antibody (Betaton Dickinson Ca. No.
  • HAEC manufactured by Cambrex
  • Example 15 Anti-monoclonal piles needled into cancer cell lines] ⁇
  • C2IgGl, K3, and 3-69-6 colon cancer cell lines DLD-1
  • lung cancer cell lines H226)
  • prostate cancer cell lines DU145
  • melanoma cell lines G361, SKMEL28, CRL1579
  • non- Hodgkin lymphoma line Ramos
  • bladder cancer cell line T24
  • breast cancer cell line MF, MDA-MB-231
  • spleen cancer cell line H766T
  • IM9 multiple myeloma cell line
  • erythroblast The reactivity of each antibody against the human leukemia strain (K562, see Fig. 3) was examined by FACS analysis in the same manner as in Example 9.
  • the antibody prepared in 5 ⁇ gZml or FITC-labeled antibody was allowed to react for 50 minutes at 50 1 / ulker under ice temperature.
  • anti-DNP human IgGl antibody or FITC-labeled anti-DNP human IgGl antibody was used.
  • RPE fluorescence labeled goat anti-human 3 ⁇ 4 ⁇ F (ab ') antibody (SuthernBiotech
  • Example 16 Antitumor effect of K3, C2IgGl, 3-69-6 in mouse cancer model
  • mice Five-week-old Balb / c nude mice (purchased from Nippon Clare Co., Ltd.) were divided into groups of 5 mice based on the weight of each individual. A mixture of 5 ⁇ 10 6 colon cancer cells Colo205 and 5 ⁇ g of antibody in 100 ⁇ l of PBS was implanted subcutaneously in the abdomen. On the 2nd, 4th, and 6th days after transplantation, an antibody dissolved in 100 ⁇ g / 100 1 solvent (PBS containing 1% mouse serum) was administered intraperitoneally to the mice, and the size of the tumor was determined. It was measured. Solvent was used as a negative control for the antibody.
  • PBS containing 1% mouse serum an antibody dissolved in 100 ⁇ g / 100 1 solvent
  • the mean volumetric volume SE of the tumor mass in the control group was 197 7.64 ⁇ 442.04, and the C2IgGl antibody administration group was 775.31 ⁇ 622.47, and the C2IgGl antibody significantly suppressed the growth of tumors derived from Colo205 cancer cells (p. ⁇ 0.01).
  • the K3 and 3-69-6 groups were all individuals, and no cancer survival was observed after 30 days.
  • the average body weight of each group decreased only in the control group (on the 30th day after transplantation, about 20% lower than that in the K3 group).
  • K3, C2IgGl, and 3_69_6 are antibodies having cancer cell growth inhibitory activity.
  • Example 17 Anti-tumor effect of C2IgGl monoclonal antibody against mouse syngeneic tumor-bearing model
  • the anti-tumor effect of the recombinant monoclonal antibody C2IgGl prepared in Example 4 to Example 8 was determined according to the method described below. The study was conducted using a syngeneic cancer model. Balb / c (female) transplanted with 5 ⁇ 10 6 cells of hCD98 / hLATl—E-expressing CT26 cells prepared in Example 2 were divided into two groups of 5 mice from the tumor volume.
  • C2IgGl The antitumor activity of C2IgGl was examined using a mouse tumor bearing model according to the method described below.
  • mice purchased from Clea Japan Co., Ltd.
  • Burkitt lymphoma cell line Ramos purchased from ATCC
  • the size of the engrafted tumor was measured, and 6 tumor-bearing mice having a tumor size of 30 to 140 mm 3 were divided into groups of 6 mice.
  • C2IgGl was administered into the peritoneal cavity of tumor-bearing mice at a dose of 3 mg / mouse (dissolved in 200 ml of PBS) 3 times / week.
  • Example 20 C2IgGlNS amino acid variant
  • C2IgGl and C2IgGlNS have high aggregate content when recombinant antibodies are prepared. Therefore, in the light chain variable region sequence of C2IgGlNS represented by SEQ ID NO: 47, the 5th M (methionine) corresponding to the translation initiation codon ATG is defined as the 1st amino acid, and the force is counted as the 11th 7th I (isoleucine). A modified product in which is substituted with other amino acid was prepared.
  • C2IgGlNS / II 17N in which light chain 117 isoleucine is substituted with asparagine the N5KG1-Val C2IgGlNS vector prepared in Example 6 is used as a saddle type Gene Editor TM in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Promega Various mutant DNAs encoding amino acid substitutions were prepared by site-directed mutagenesis using the company No.Q9280).
  • the dsDNA template was incubated under alkaline conditions (0.2 M NaOH, 0.2 mM EDTA (final concentration)) at room temperature for 5 minutes, and then 2 M ammonium acetate (pH 4.6) was added for 10 minutes. After neutralizing with 1 volume, it was recovered by ethanol precipitation.
  • Transforms transformed into competent cells BMH 71-18 mutS in the presence of GeneEditor TM Antibiotic Selection Mix Prepare plasmid DNA from recombinant Escherichia coli, and then transform the ElectroMAX.DHlOB Cells (Invitrogen No.18290-015) by the electroporation method, and then inoculate the LB plate containing GeneEditor TM Antibiotic Selection Mix did.
  • the transformant produced on the plate was cultured, the plasmid DNA was purified, and the DNA base sequence was analyzed.
  • an expression vector of the C2IgGlNS mutant into which the target amino acid mutation was introduced was obtained.
  • the obtained plasmid DNA expressing the 1 amino acid substitution mutant protein was designated as N5KG1-Val C2IgGlNS / I117N vector.
  • N5KG1-Val C2IgGlNS vector prepared in Example 6 is used as a saddle type GeneE ditor TM in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Promega Various mutant DNAs encoding amino acid substitutions were prepared by site-specific mutagenesis using the company No.Q9280)
  • the transformant produced on the plate was cultured, the plasmid DNA was purified, and the DNA base sequence was analyzed. As a result of the DNA base sequence, an expression vector of the C2IgGlNS mutant into which the target amino acid mutation was introduced was obtained.
  • the obtained plasmid DNA expressing the 1 amino acid substitution mutant protein was named N5KG1-Val C2I gGlNS / I117C vector.
  • C2IgGlNS / I117L in which light chain 117 isoleucine was substituted with leucine was prepared by the following method using the N5KG1-Val C2IgGlNS vector prepared in Example 6 as a saddle type.
  • reaction solution having a composition that also has lymer power was brought to a final volume of 50 1 with double-distilled water and subjected to PCR.
  • C2NS Lc 117IL R (5, — GGTCCCAGGG CCGAAAGTGA ATAGAGGTGA GCTAC CATAC TGCTG -3, (SEQ ID NO: 71)) was synthesized, and C2NS Lc 117IL R and C2-1 Lc Bgl II F (5,-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC -3, (SEQ ID NO: 18)), N5KG1-Val C2IgGlNS vector as a saddle, 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1 minute Repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the PCR amplification product was purified by the QIAquick gel extraction kit.
  • This PCR amplification product was named C2NSI117L-F.
  • C2NS Lc 117IL F (5,-G CAGTATGGT AGCTCACCTC TATTCACTTT CGGCCCTGGG ACC-3 '(SEQ ID NO: 72)
  • C2NS EcoRI R 5,-CCGGAATTCA ACACTCTCCC CTGTTGAAGC TC TTTGTGAC GG -3' (SEQ ID NO: 73)
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the PCR amplification product was purified by the QIAquick gel extraction kit.
  • This PCR amplification product was named C2NSI117L-R.
  • the cycle at 8 ° C for 60 seconds was repeated 3 times.
  • This reaction solution is heated at 99 ° C for 5 minutes, diluted 5 times, and 5 1 as a bowl, using C2-1 Lc Bgl II F primer and C2NS EcoRI R primer, 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 ° C60 The second cycle was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the PCR amplification product was purified by the QIAquick gel extraction kit.
  • This PCR amplified cDNA fragment was digested with BglII and EcoRI and introduced into the N5KG1-Val Lark vector containing the C2 heavy chain gene that had been cleaved with the same enzymes.
  • the DNA base sequence of the inserted portion was determined, and it was confirmed that there was no difference from the truncated gene sequence in the sequence inserted by PCR amplification.
  • the obtained plasmid DNA expressing the 1 amino acid substitution mutant protein was named N5K Gl-Val C2IgGlNS / I117L vector.
  • C2IgGlNS / I117M in which light chain 117 isoleucine was substituted with methionine was prepared by the following method using the N5KG1-Val C2IgGlNS vector prepared in Example 6 as a cage.
  • Toyobo KOD-Plus was used for the amplification of DNA.
  • reaction solution having a composition that also has lymer power was brought to a final volume of 50 1 with double-distilled water and subjected to PCR.
  • C2NS Lc 117IM R (5, — GGTCCCAGGG CCGAAAGTGA ACATAGGTGA GCTA CCATAC TGCTG -3 '(SEQ ID NO: 74)) was synthesized, and C2NS Lc 117IM R and C2-1 Lc Bgl II F (5,-AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC T TC TCT TC -3 '(SEQ ID NO: 18)), N5KG1-Val C2IgGlNS vector as a saddle, 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 1 minute cycle was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the PCR amplification product was purified by QIAquick gel extraction kit.
  • This PCR amplification product was named C2NSI117M-F.
  • C2NS Lc 117IM F (5 '-GCAGTATGGT AGCTCACCTA TGTTCACTTT CGGCCCTGGG ACC-3' (sequence number 75)
  • C2NS EcoRI R (5,-CCGGAATTCA ACACTCTCCC CTGTTGAAG C TCTTTGTGAC GG -3, (SEQ ID NO: 76)
  • N5KG1-Val C2IgGlNS vector was a saddle, a cycle of 94 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 1 minute was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the PCR amplification product was purified by QIAquick gel extraction kit.
  • This PCR amplification product was named C2NSI117M-R. Then C2NSI117M F and C2NSI117M—R were diluted in 5 ⁇ l each, and the cycle of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 60 seconds was repeated three times without primer.
  • This reaction solution is heated at 99 ° C for 5 minutes, then diluted 5 times, and 5 ⁇ l is used as a cage, using C2-1 Lc Bgl II F primer and C2NS EcoRI R primer, 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 The cycle at 60 ° C was repeated 25 times.
  • This reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the PCR amplification product was purified by QIAquick gel extraction kit. This PCR amplified cDNA fragment was digested with BglII and EcoRI and introduced into the N5KG1-Val Lark vector containing the C2 heavy chain gene that had been cleaved with the same enzymes.
  • the DNA base sequence of the inserted portion was determined, and it was confirmed that there was no difference from the gene sequence in the truncated form after the PCR amplification.
  • the obtained plasmid DNA expressing the single amino acid substitution mutant protein was named N5KG1-Val C2IgGlNS / I117M vector.
  • C2IgGlNS / I117L vector, C2IgGlNS / I117M vector 1, C2IgGlNS / I117N, C2IgGlNS / I117C vector were introduced into FreeStyle293 cells (Invitrogen) to express recombinant antibodies. I let you. The antibody was purified by partially improving the method shown in Example 8. The culture supernatant on day 6 was collected and filtered with Sterifli p-GP (MILLIPORE, SCGP00525) to remove extraneous waste such as cells.
  • MILLIPORE Sterifli p-GP
  • the culture supernatant containing the antibody was affinity purified using Protein A (Amersham) and PBS as the adsorption buffer and 20 mM sodium quenate buffer (pH 3.4) as the elution buffer.
  • the elution fraction was adjusted to around pH 5.5 by adding 200 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0).
  • the prepared antibody solution was concentrated (3000 rpm) using vivaspin 6 (10 KMW cut VIVASCIENCE, VS0601), and further purified PBS substituted with PBS was obtained by adding PBS and centrifuging.
  • the concentration of the purified antibody was calculated by measuring the absorbance at 280 nm and lmg / ml as 1.450 ptimal density.
  • the aggregate content of the antibody solution was determined using a high performance liquid chromatograph (Shimadzu) and a TSK-G3000 SW column (Tosohichi), 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl pH Analysis was performed using 7.0. By comparing the elution position with the molecular weight marker for gel filtration HPLC (Oriental Yeast Co., Ltd.) (Cat No. 40403701), the peaks of antibody protein monomers and higher aggregates were identified, and the peak areas of each were identified. The force was also calculated as the content of aggregates.
  • FIGS. 16A and 16B The results are shown in FIGS. 16A and 16B.
  • the above-mentioned amino acid-modified antibodies particularly C2IgGlNS / Ill 7L, bound to L929 cells in which human CD98 and LAT1 were forcibly expressed, but did not bind to untreated L929 (FIG. 16A).
  • these amino acid-modified antibodies did not bind to HAEC and showed binding properties to various cancer cells such as colo205, Ramos, and DLD-1 (FIG. 16B).
  • the above-mentioned amino acid-modified antibody is a cancer cell with a low aggregate content.
  • the antibody has the same binding specificity as C2IgGl and can be expected to have the same antitumor activity as C2IgGl.

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Abstract

　癌細胞の細胞膜由来のＣＤ９８でありかつアミノ酸輸送活性を有するタンパク質（例えば、ＬＡＴ１）と複合体を形成しているＣＤ９８に特異的結合能を有するヒト抗体およびその機能的断片が開示される。この抗体は、LAT1と癌細胞表面で二量体を形成しているＣＤ９８に結合し、ＣＤ９８を発現する癌細胞をADCCやCDCによる免疫システムを用いて特異的に攻撃し、さらにLAT1を介した癌細胞のアミノ酸取り込みを阻害することにより、その増殖を抑制する。よって、この抗体またはその抗体断片を含んでなる、多種の癌に作用し、また癌に特異的で副作用のない癌の予防および治療剤が提供される。

Description

明 細 書
新規抗 CD98抗体
関連出願の参照
[0001] 本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願 2006— 105 013号（出願日： 2006年 4月 6日）に基づく優先権の主張を伴うものである。特願 200 6— 105013号における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる 発明の背景
[0002] 本発明は、独立行政法人科学技術振興機構の「アミノ酸輸送蛋白抗体抗癌薬」に 関する新技術開発委託に係る開発の成果に係る発明である。
[0003] 発明の分野
本発明は、癌細胞の細胞膜に由来し、かつアミノ酸輸送活性を有するタンパク質と 複合体を形成している CD98に対し、特異的結合能を有するモノクローナル抗体、お よびそれを用いた腫瘍増殖抑制または癌治療の医薬用途に関する。
[0004] 背景 術
癌 (悪性腫瘍）は、わが国における死亡原因の第一位を占める。その患者数は年々 増力!]してきており、有効性および安全性の高い薬剤や治療法の開発が強く望まれて いる。これまでの抗癌剤は、しばしば、癌細胞を特異的に殺す能力が低ぐ正常な細 胞にも作用し、多くの薬物有害反応が起きていた。近年、癌細胞に高発現している分 子 (癌関連抗原)を標的とした抗癌剤の開発が進んでおり、白血病、乳癌、肺癌など にお 、て有効な治療手段となってきて！/、る。
[0005] 細胞の細胞膜上に発現している癌関連抗原に対して特異的に結合する抗体は、 抗体依存'性細胞'性細胞傷害活'性 (antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC) )や ネ ΐ体依存'性細胞傷害活'性 (complement— dependent cell-mediated cytotoxicity (CDC ))等の免疫反応を介して癌細胞を攻撃し、あるいは、癌細胞の増殖に必要な細胞増 殖シグナル伝達を抑え癌治療に有用であることが示されてきた。
[0006] し力しながら、抗体が治療に使われて!/、る癌種は、乳癌、難治性慢性リンパ腫、非 ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病等限られた癌種であり、また、一つの抗体で多 様な癌種の治療に用いることができる抗体は未だにない。そのため、多種の癌細胞 に強く結合し抗癌活性を持つ抗体の取得が求められていた。
[0007] CD98 (4F2)は、多種の癌細胞で高発現して 、ることが知られて!/、る 529アミノ酸残 基力もなる約 80kDaの type II膜貫通糖タンパク鎖である。これは、アミノ酸輸送活性を もつ約 40kDaのタンパク質とジスルフイド結合によりへテロ二量体を形成し、細胞膜上 に発現している。 CD98に結合すると考えられているアミノ酸輸送タンパクとしては 6 種が知られている。 CD98は、リンパ球の活性ィ匕抗原として同定された力 細胞増殖 シグナル伝達、インテグリンの活性化、細胞融合など多くの生物学的機能に関与す ると考えられている（Haynes B. F et al" J. Immunol, (1981), 126, 1409-1414、 Lindst en T. et al., Mol. Cell Biol, (1988), 8, 3820—3826、 Teixeira S. et al., Eur. J. Bioche m" (1991), 202, 819—826、 L.A.Diaz Jr. et al., J Biol Regul Homeost Agents., (1998) 12, 25-32) o
[0008] 癌細胞は増殖の優位性を確保する為に様々な仕組みを有して 、る。例えば、癌細 胞カ 増殖に必要な必須アミノ酸を周辺細胞に対して優先的に取り込むために中性 アミノ酸トランスポーターを過剰発現しているのもその一つと考えられる。近年、癌細 胞に特異的に高く発現しているアミノ酸トランスポーター L-type amino acid transport er 1(LAT1)がクロー-ングされた（Kanai et al., J. Biol. Chem. (1998), 273, 23629-23 632) o LAT1は、 CD98と複合体を形成し、ロイシン、ノ リン、フエ-ルァラニン、チロシ ン、トリブトファン、メチォニン、ヒスチジン等の大型の側鎖を持つ中性アミノ酸をナトリ ゥムイオン非依存的に輸送する。また LAT1は、脳、胎盤、骨髄、精巣を除く殆どの正 常組織では発現が低いか認められないが、大腸癌、胃癌、乳癌、膝癌、腎癌、喉頭 癌、食道癌、肺癌等のヒト悪性腫瘍組織で CD98と共に発現が亢進していることが知 られている（Yanagida et al" Biochem. Biophys. Acta, (2001), 1514, 291—302)。 LAT 1の発現を低下させ、アミノ酸取り込みを抑制すると、腫瘍の増殖が抑えられることが 癌移植マウスモデルで報告されており（特開 2000— 157286号公報）、 LAT1の活性 を抑えることは癌の治療法に有望であると考えられる。
[0009] ヒト CD98に対する抗体については、ヒト CD98発現細胞株をマウス等の非ヒト哺乳 動物に免疫することにより作製されたマウスモノクローナル抗体が報告されている（前 掲 Haynes et al、 Masuko T. et al., Cancer Res., (1986), 46, 1478—1484、および Freid man AW. et al., Cell. Immunol., (1994), 154, 253-263)。し力し、これら抗 CD98抗体 が LAT1のアミノ酸取り込みを抑制するかどうかについては知られていない。さらに、 L ATIの細胞内領域の抗体は取得されて 、るが、生細胞膜上の LAT1に結合できる抗 体は報告されていない。したがって、癌細胞膜上に発現している CD98あるいは LAT 1に結合し、 LAT1のアミノ酸取り込みを抑制する抗体が取得されれば、広範囲にわた る癌の優れた治療薬になると考えられる。
発明の概要
[0010] 本発明者らは今般、癌細胞の細胞膜由来の CD98でありかつアミノ酸輸送活性を 有するタンパク質と複合体を形成している CD98に特異的結合能を有する抗体を得 ることに成功し、当該抗体が、癌細胞の増殖を抑制する作用を有することから、この 性質を用い医薬組成物の有効成分、より具体的には腫瘍の予防または治療剤の有 効成分として有用であるとの知見を得た。本発明は係る知見にもとづくものである。
[0011] よって、本発明は、癌細胞の細胞膜由来の CD98でありかつアミノ酸輸送活性を有 するタンパク質と複合体を形成して!/ヽる CD98に特異的結合能を有するヒト抗体およ びその機能的断片の提供をその目的としている。
[0012] さらに本発明は、上記の本発明によるヒト抗体およびその機能的断片を有効成分と する医薬組成物または腫瘍の予防または治療剤の提供をその目的としている。
[0013] そして本発明によるヒト抗体およびその機能的断片は、癌細胞の細胞膜由来の CD 98でありかつアミノ酸輸送活性を有するタンパク質と複合体を形成している CD98に 特異的結合能を有することを特徴とするものである。
[0014] さらに、本発明による医薬組成物または腫瘍の予防または治療剤は、上記本発明 によるヒト抗体またはその機能断片を有効成分として含んでなるものである。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体のヒト CD98Zヒト LAT1発現 CT26細胞株に 対する結合性を示す図である。
[図 2A]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体のヒト CD98発現 L929細胞株に対する結合 性を示す図である。
[図 2B]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体のヒト CD98発現 L929細胞株に対する結合 性を示す図である。
[図 3]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体のッ-カマイシン処理 K562ヒト細胞株に対す る結合性を示す図である。
[図 4A]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体の各種マウス ·ヒトキメラ CD98発現 L929細胞 株に対する結合性を示す図である。
[図 4B]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体の各種マウス ·ヒトキメラ CD98発現 L929細胞 株に対する結合性を示す図である。
[図 5]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体の T24ヒト膀胱癌細胞株のアミノ酸取り込み抑 制活性を示す図である。
[図 6A]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体のヒト末梢血 T細胞、 B細胞、単球細胞に対す る結合性を示す図である。
[図 6B]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体のヒト末梢血 T細胞、 B細胞、単球細胞に対す る結合性を示す図である。
[図 7]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体の PHA活性化ヒト末梢血 T細胞、 B細胞に対す る結合性を示す図である。
[図 8]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体のヒト大動脈内皮細胞 (HAEC)とヒト大腸癌細 胞株 (DLD- 1)に対する結合性を示す図である。
[図 9A]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体の各種がん細胞株に対する結合性を示す図 である。
[図 9B]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体の各種がん細胞株に対する結合性を示す図 である。
[図 10A]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体の各種がん細胞株に対する結合性を示す図 である。
[図 10B]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体の各種がん細胞株に対する結合性を示す図 である。
[図 11]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体 K3、 3-69-6、 C2IgGlを、腫瘍細胞を移植した ヌードマウスに投与したときの、個々のマウスでの腫瘍塊の大きさを示す図である。
[図 12]90mm3に成長した腫瘍を有する担癌マウスに対し、ヒト抗 CD98モノクローナル 抗体 C2IgGlを 100 μ g/マウス個体で 3回隔日投与したときの腫瘍の大きさを測定した 結果を示す図である。
[図 13]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体 K3、 C2IgGlのサル細胞株 COS-7に対する交 叉反応性を示す図である。
[図 14]バーキットリンパ腫細胞株 Ramosを移植した担癌マウスにおいて、腫瘍が 30〜 140mm3に成長してからヒト抗 CD98モノクローナル抗体 C2IgGlおよび Rituximabを 100 mg/マウス個体でそれぞれ 3回/週投与したときの腫瘍の大きさを測定した結果を示 す図である。
[図 15]HPLCで測定した、ヒト抗 CD98モノクローナル抗体 C2IgGlNSアミノ酸改変抗体 の精製後の凝集体含有率を示す図である。
[図 16A]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体 K3と C2IgGl、および C2IgGlの各アミノ酸改変 抗体の、ヒト CD98あるいはヒト LAT1強制発現 L929細胞に対する結合性を示す図で ある。
[図 16B]ヒト抗 CD98モノクローナル抗体 K3と C2IgGl、 C2IgGlの各アミノ酸改変抗体 の、ヒト大腸癌細胞株 (DLD-1)、バーキットリンパ腫細胞株 (Ramos)、ヒト大腸癌細胞 株 (Colo205)、およびヒト大動脈内皮細胞 (HAEC)、に対する結合性を示す図である 発明の具体的説明
[0016] 微生物の害託
本発明により提供されるヒト抗体の可変領域をコードする核酸配列を含むプラスミド ベクター C2IgGl/pCR4および K3/pCR4は、平成 18年 3月 14日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば巿東 1丁目 1 番 1中央第 6)にそれぞれ FERM BP— 10551 (識別のための表示： C2IgGl/pCR4) および、 FERM BP— 10552 (識別のための表示： K3/pCR4)として寄託されている
[0017] m 本明細書または図面においてアミノ酸を表記するために用いられるアルファベット の一文字は、各々次に示すアミノ酸を意味する。 （G)グリシン、（A)ァラニン、（V)バ リン、 （L)ロイシン、 （I)イソロイシン、 （S)セリン、 （T)スレオニン、 （D)ァスパラギン酸、 (E)グルタミン酸、（N)ァスパラギン、（Q)グルタミン、（K)リジン、（R)アルギニン、（C )システィン、 （M)メチォニン、 （F)フエ-ルァラニン、 （Y)チロシン、 （W)トリプトファン 、（H)ヒスチジン、（P)プロリン。また DNAを表記するために用いられるアルファベット の一文字の意味は、各々次に示す。 （A)アデニン、（C)シトシン、（G)グァニン、（T) チミン。
[0018] CD98およびそのモノクローナル抗体
本発明によるヒトモノクローナル抗体およびその機能的断片（以下、特にことわらな い限り、本明細書にぉ 、て「本発明による抗体」と略す)が特異的結合能を有する CD 98は、上述のとおり、 529アミノ酸残基からなる type II膜貫通糖タンパク鎖であり、アミ ノ酸輸送活性を有するタンパク質と細胞膜上でヘテロ二量体を形成しているものであ る。ここで、アミノ酸輸送活性を有するタンパク質の好ましい具体例としては、 LAT1 が挙げられる。また、本発明の好ましい態様によれば、 CD98はヒト CD98である。な お、ヒト CD98のタンパク質の一次構造は公知であり（配列番号 66 ;GenBank/EMBL /DDBJ accession No. AB018010)、また、ヒト LAT1のタンパク質も公知である（配列番 号 68 ;GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018009)。
[0019] 本発明による抗体は、癌細胞の細胞膜由来の CD98でありかつアミノ酸輸送活性 を有するタンパク質と複合体を形成している CD98に特異的結合能を有し、他方、ヒ ト正常細胞、例えば正常ヒト血管内皮細胞、正常ヒト末梢血単球、およびリンパ球に 結合しない。結合能を有する癌細胞の例としては、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌 、前立腺癌、黒色腫、脳腫瘍、リンパ腫、膀胱癌、脾臓癌、多発性骨髄腫、腎細胞癌 、白血病、 T細胞リンパ腫、胃癌、脾臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌 、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭 癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポ ジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、 稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平 滑筋肉腫、甲状肉腫またはウィルムス腫瘍等を構成する癌細胞が挙げられ、より具体 的には、大腸癌細胞株 (DLD- 1、 Colo205、 SW480、 SW620、 LOVO、 LS180、および H T29)、肺癌細胞株 (H226)、前立腺癌細胞株 (DU145)、メラノーマ細胞株 (G361、 SK MEL28、 CRL1579)、非ホジキンリンパ腫株 (Ramos)、膀胱癌細胞株 (T24)、乳癌細 胞株 (MCF、 MDA-MB-231)、脾臓癌細胞株 (HS766T)、多発性骨髄腫細胞株 (IM9 )、赤芽球系白血病株 (K562)が挙げられる。本発明による抗体は、このような多様多 種な癌細胞に結合能を有する点で有利である。
[0020] 本発明による抗体の、癌細胞への特異的な結合能は、本発明による抗体の有用性 を高いものとする。すなわち、後記するように、本発明の好ましい態様の抗体は、 LAT 1を介した細胞内へのアミノ酸取り込みを有意に阻害するため、癌細胞にのみ結合す ることは有利であり、さらに本発明による抗体を、他の薬剤と結合させてそれを癌細胞 へ送達するためのターゲテイング剤として有利に用いることが出来る。
[0021] また、本発明による抗体は抗腫瘍活性を有する。本発明の好ま ヽ態様による抗体 は、 LAT1を介した細胞内へのアミノ酸取り込みを有意に阻害する性質を有する。従 つて、本発明による抗体の抗腫瘍活性は、 ADCCおよび CDCによる免疫システムを 用いて特異的に傷害することに加え、このようなアミノ酸取り込み阻害によってもたら されるものと考えられる。本発明のより具体的な態様によれば、本発明による抗体は、 膀胱癌細胞株 T24細胞のアミノ酸取り込みを有意に阻害する。
[0022] 本発明の好ま 、態様によれば、本発明による抗体は、後記する（a)配列番号 29 および 31、（b)配列番号 41および 47、および（c)配列番号 43および 47のいずれかの 二配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域として有する。さらに、別の態様によれ ば、本発明による抗体は、プラスミドベクター K3/pCR4 (FERM BP— 10552)ま たは C2IgGl/pCR4 (FERM BP— 10551)に含まれる、ベクター pCR4に由来す る配列以外の配列によってコードされる配列を可変領域として有する。この態様によ る抗体の可変領域のアミノ酸配列は、上記の 、ずれかのプラスミドベクター力 得ら れる、ベクター pCR4に由来する配列を含まない Bglll— BsiWI断片 (軽鎖可変領域 )および Sail— Nhel断片（重鎖可変領域）によってコードされるものである。
[0023] 本発明による抗体の機能的断片とは、本発明による抗体が特異的に結合する抗原 に対して、特異的に結合する抗体の断片を意味し、より具体的には F (ab' ) 2、 Fab' 、 Fab、 Fv、 disulphide— linked FV、 Single— Chain FV (scFV)およびこれら の重合体等が挙げられる（D. J. King. , Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies. , 1998 T. J. International Ltd)。このような抗体 断片は慣用法、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化 、あるいは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
[0024] 本発明において、「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を 意味する。ヒト抗体は、後述のようにヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生 する能力を有するトランスジエニック動物に抗原を投与することにより得ることができる 。該トランスジエニック動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作 出方法は、例えば、国際公開 WO02/43478号公報に記載されている。
[0025] 本発明による抗体には、抗体を構成する重鎖および/または軽鎖の各々のアミノ酸 配列にお ヽて一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配 列を有する重鎖および/または軽鎖力 なるモノクローナル抗体も包含される。本発 明による抗体のアミノ酸配列中への、このようなアミノ酸の部分的改変 (欠失、置換、 挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することによ り導入することができる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導 入法（Site specific mutagenesis)を用いて常法により導入することができる（Pro c Natl Acsd Sci USA. , 1984 Vol815662； Sambrook et al. , Molecul ar Cloning A Laboratory Manual (1989) Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
[0026] 本発明の好ましい態様によれば、本発明による抗体は、軽鎖 117番目におけるイソ ロイシンが他のアミノ酸残基、例えば、メチォニン、ァスパラギン、ロイシンまたはシス ティンに置換されたものとされる。このような抗体の好ましい例としては、（d)配列番号 43および 77、（e)配列番号 43および 79、（f)配列番号 43および 81、ならびに（g)配 列番号 43および 83の 、ずれかの二配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域とし て有するものがある。
[0027] 本発明による抗体には、 V、ずれのィムノグロブリンクラスおよびサブクラスを有する 抗体も包含されるが、本発明の好ましい態様によれば、ヒトイムノグロブリンクラスおよ びサブクラスを有する抗体であり、好ましいクラス、サブクラスはィムノグロブリン G (Ig G)、特に IgGlであり、好ましい軽鎖は κである。
[0028] また、本発明による抗体には、当業者に周知である遺伝子工学的改変 (例えば、 E P 0 314 161公報）により異なるサブクラスのものに変換されたものも包含される。 すなわち、本発明による抗体の可変領域をコードする DNAを用いて、遺伝子工学的 手法により元のサブクラスとは異なるサブクラスの抗体を得ることができる。
[0029] ADCCは、 Macrophage, NK細胞、好中球などの表面に発現して!/、る Fc Receptorを 介して、抗体の定常領域と結合することにより細胞を認識し、認識した細胞が活性ィ匕 することにより誘導される、細胞障害活性を意味し、一方、 CDCは抗体が抗原と結合 することによって、活性化された補体系によって引き起こされる細胞障害活性を意味 し、これらの活性は、抗体のサブクラスによってその活性の強弱が異なること、そして それは抗体の定常領域の構造の違いに起因することが明らかにされている（Charles A. Janeway et. al. Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/ uarland Publishing In
C.) o
[0030] 従って、例えば、本発明による抗体のサブクラスを、 IgG2または IgG4に変換すること により、 Fcレセプターに対する結合度の低い抗体を取得することができる。逆に、本 件発明の抗体のサブクラスを IgGlまたは IgG3に変換することにより、 Fcレセプターに 対する結合度の高 、抗体を取得することができる。上記 ADCCおよび CDC活性を期 待する場合は抗体サブクラスが IgGlであることが望ましい。
[0031] 異なるサブクラスの抗体を IgGlに変換する場合、例えば抗体産生ハイプリドーマか ら可変領域だけを単離し、ヒト IgGlの定常領域を含むベクター、例えば N5KG1-Val L arkベクター（IDEC Pharmaceuticals, N5KG1 (US patent 6001358)に導入することに より作製することができる。
[0032] さらに、本発明による抗体の定常領域のアミノ酸配列を遺伝子工学的に改変するこ と、あるいはそのような配列を有する定常領域配列と結合することにより、 Fcレセプタ 一に対する結合度を変化させること（Janeway CA. Jr. and Travers P.(1997),Immunob iology, Third Edition, Current Biology Ltd. /Garland Phulishing Inc.参照)、あるいは 補体に対する結合度を変化させること（MH"Iua Tao, et al. 1993. J.Exp.Med参照）は 可能である。例えば、重鎖定常部分の EUナンバリングシステム（Sequences of protein s of immunological interest, NIH Publication No.91-3242を参照）における 331番目 のプロリン（p)をコードする配列 CCCをセリン（S)をコードする TCCに変異させプロリン をセリンに置換することにより補体に対する結合度を変化させることができる。
[0033] 例えば、仮に、本発明による抗体が、単独では細胞死誘導活性がな 、場合、 Fcレ セプターを介した抗体依存性細胞障害活性 (ADCC)や補体依存性細胞傷害活性 ( CDC)による抗腫瘍活性を有する抗体が望ましいが、抗体単独で細胞死誘導活性が ある場合は Fcレセプターとの結合度が低 、抗体がより望ま 、場合もある。
[0034] また免疫抑制剤について考えた場合、 T細胞と抗原提示細胞の結合のみを立体的 に阻害する場合など ADCC活性或いは CDC活性を有さない抗体が望ましい。また、 A DCC活性或 ヽは CDC活性が毒性の原因となりうる場合、毒性の原因となる活性を Fc 部分の変異あるいはサブクラスを変更することにより回避した抗体が望ましい場合も ある。
[0035] 以上を考慮し、必要であれば異なるサブクラスに遺伝子工学的に改変することによ り、本発明による抗体を、 ADCCまたは CDCにより癌細胞を特異的に傷害させうるもの とすることができる。
[0036] 本発明の別の好ましい態様によれば、本発明による抗体は、ヒト CD98のアミノ酸配 列（配列番号 66)中の連続または不連続の少なくとも 8個のアミノ酸残基によって構 成されるェピトープを認識するものであることが好ま 、。本発明のより好ま ヽ態様 によれば、本発明による抗体は、ヒト CD98のアミノ酸配列中の 371〜529アミノ酸の 領域の一部分に結合性を有するか、または 1〜371アミノ酸の領域の一部分に結合 性を有するものであることが好まし 、。
[0037] 本発明の別の態様によれば、本発明による抗体として、ヒト CD98およびサル CD9 8に対して交叉反応を示す性質を有する抗体が提供される。このような抗体は、ヒト C D98とサル CD98において、同一または極めて類似したェピトープ構造を認識するも のと想定され、ヒトに対する臨床試験に先立ちサルを実験動物とした種々の試験が 可能であると 、う利点を有する。 [0038] CD98抗体の作製
本発明による抗体は、例えば、以下に述べる方法によって製造することができる。 ヒト CD98/ヒト LAT1若しくはその一部、または抗原の抗原性を高めるための適当な 物質（例えば、 bovine serum albumin等）との結合物、またはヒト CD98/ヒト LAT1 を細胞表面に多量に発現している細胞を、必要に応じて免疫賦活剤 (Freund' s A djuvant等）とともに、マウス、ゥサギ、ャギ、ゥマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する、また はヒト CD98/ヒト LAT1を組み込んだ発現ベクターを非ヒト哺乳動物に投与することに より免疫感作を行う。本発明による抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と 自己抗体産生能のな!、骨髄腫系細胞 (ミエローマ細胞)からハイプリドーマを調製し
、ノ、イブリドーマをクローンィ匕し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモ ノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。
[0039] 以下にさらに具体的に本発明による抗体の作製法について詳述するが、抗体の作 製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使 用することちでさる。
[0040] 抗原としては、 CD98をコードする DNAを動物細胞用発現ベクターに組み込み、該 発現ベクターを動物細胞に導入し、取得した形質転換株そのものを使用できる。
[0041] CD98は多くの癌細胞表面で LAT1とへテロ二量体を形成しているため、 LAT1をコ ードする DNAを同様に発現ベクターに組み込み、 CD98と LAT1が共発現している形 質転 ^ttを抗原として用いることで LAT1のアミノ酸取り込みを阻害する抗体の取得 が期待できる。
[0042] 動物細胞用発現ベクターとしては例えば pEGF-Nl (ベタトン'ディキンソン'バイオサ ィエンス'クロンテック社製)などのベクターを用いることができ、適当な制限酵素で挿 入部位を開裂し、同一酵素で開裂されたヒト CD98あるいはヒト LAT1を連結すること により、目的遺伝子導入用ベクターが調製できる。そして、調製した発現ベクターを 例えば L929細胞（American Type Culture Collection No.CCL- 1)といった細胞を宿 主として導入することにより、ヒト CD98およびヒト LAT1を高発現した細胞を作製でき る。
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、任意の方法 (例えばカルシウムイオンを 用いる方法、エレクト口ポレーシヨン法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸力 ルシゥム法、リポフエクシヨン法等）が挙げられる。
[0043] こうして作製した形質転換細胞は CD98抗体を作製するための免疫原とすることが できる。さらに、発現ベクターそのものを免疫原とすることもできる。
[0044] ヒト CD98は、公知の塩基配列またはアミノ酸配列に基づ!/、て、遺伝子組換え技術 のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような技術的分野において知られる方法 を適宜用いることにより製造することができる。そしてこのようにして得られたヒト CD98 タンパクを抗原として CD98抗体を作製することも可能である。ヒト CD98の部分配列 は、後述する技術的分野において知られる方法に従って、遺伝子組換え技術または 化学的合成法により製造することもできるし、またヒト CD98をタンパク分解酵素等を 用いて適切に切断することにより製造することができる。
[0045] 上述のようにして得た抗原を、以下のように免疫する。すなわち、作製した抗原を、 抗原性を高めるための適当な物質（例えば、 bovine serum albumin等）、および 必要に応じて免疫賦活剤 (Freundの完全若しくは不完全 adjuvant等）とともに混合 し、マウス、ゥサギ、ャギ、ゥマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する。また好ましくは、再配 列されていないヒト抗体遺伝子を保持し、免疫感作により当該免疫原に特異的なヒト 抗体を産生する非ヒト動物を用いることにより、本発明の抗体はヒト抗体であってもよ い。この場合、ヒト抗体産生動物としては、例えば富塚らの文献 [Tomizuka et al, Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 2000 Vol 97:722]に記載されているヒト抗体産生トランスジェ ニックマウスが挙げられる。
[0046] モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラーおよびミルシユタ インらの方法（Nature. , 1975 Vol. 256 :495— 497)およびそれに準じて行うこ とができる。即ち、前述の如く免疫感作された動物力 取得される脾臓、リンパ節、骨 髄または扁桃等、好ましくはリンパ節または脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましく はマウス、ラット、モルモット、ノ、ムスター、ゥサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する 自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを、細胞融合させることにより調製される。細 胞融合は例えば、ポリエチレングリコール (例えば分子量 1500〜6000)等の高濃度ポ リマー溶液中、通常約 30〜40°C、約 1〜10分間、抗体産生細胞とミエローマ細胞を混 合することによって行うことができる。モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマク ローンのスクリーニングは、ハイプリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培 養し、増殖の見られたゥエル中の培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えば E LISA等の酵素免疫測定法、ラジオィムノアツセィ、蛍光抗体法などの免疫学的方法 を用いて測定することにより行なうことができる。
[0047] ハイプリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイプリドーマをインビトロで培 養して培養上清から単離することができる。また、マウス、ラット、モルモット、ノ、ムスタ 一またはゥサギ等の腹水中等でのインビボで培養し、腹水力 単離することもできる。 また、ハイプリドーマ等の抗体産生細胞力 モノクローナル抗体をコードする遺伝子 をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主 (例えばチャイニーズノヽ ムスター卵巣 (CHO)細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物 細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換型抗体を調製することができる (P. J. Delves. , ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQU ES. , 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean. , Monoclonal Antibodi es. , 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J. W. Goding. , Monoclona 1 Antibodies： principles and practice. , 1993 ACADEMIC PRESS；)。さら に、トランスジヱニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に 組み込まれたトランスジエニックなゥシ、ャギ、ヒッジまたはブタを作製し、そのトランス ジェニック動物のミルク中力 その抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量 に取得することも可能である。ノ、イブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養 する細胞種の特性、試験研究の目的および培養方法等の種々条件に合わせて、ハ イブリドーマを増殖、維持および保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生 させるために用いられるような既知栄養培地または既知の基本培地力 誘導調製さ れるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
[0048] 産生されたモノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法、例えばプロティ ン Aカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフ ィー、硫安塩析法、ゲル濾過、ァフィ-ティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせる こと〖こより精製することができる。 [0049] 抗体の医薬用涂
本発明による抗体は、まず、その癌細胞の細胞膜由来の CD98でありかつアミノ酸 輸送活性を有するタンパク質と複合体を形成している CD98への特異的結合能ゆえ 、治療用薬剤とコンジュゲートすることによって、癌細胞への薬物の送達またはミサイ ル療法等の治療目的に使用可能な複合体を形成できる。
[0050] 抗体へ結合させる治療用薬剤の例としては、特に限定されな 、が、例えば、ョード（ 131Iodine : 131I, 125Iodine 12¾、イットリウム (9。Yttrium: 9。Y)、インジウム (^Ιη ιι π ^Ιη)、テクネチウム (99mTechnetium: 99mTC)等の放射核種 Ci. W. Goding. , Monoclonal Antibodies： principles and practice. , 1993 ACADEMIC P RESS)、緑膿菌毒素（Pseudomonas exotoxin)、ジフテリアトキシン（diphtheria toxin)、リシン（Ricin)のような細菌毒素、およびメトトレキセート（Methotrexate) 、マイトマイシン（mitomycin)、カリキアマイシン（Calicheamicin)などの化学療法 剤 (D. J. King. , Applications and Engineering of Monoclonal Antibod ies. , 1998 T. J. International Ltd、 M. L. Grossbard. , Monoclonal Anti body- Based Therapy of Cancer. , 1998 Marcel Dekker Inc)等力 S挙げ られ、より好ましくは、ラジカル生成を誘導するセレン化合物が挙げられる。
[0051] 抗体と治療用薬剤の結合は共有または非共有結合 (例えばイオン結合)の!、ずれ でもよい。例えば、抗体分子中の反応性基 (例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸 基等)または配位性基を利用し、必要に応じてより反応性の基を結合する力または反 応性の基に変換した後、該反応性基と反応して結合を形成しうる官能基 (細菌毒素、 化学療法剤の場合)または該配位性基との間で錯体を形成しうるイオン性基 (放射性 核種の場合)をもつ治療用薬剤と抗体とを接触させることによって、本発明の複合体 を得ることができる。あるいは複合体の形成に際してピオチン一アビジン系の利用も 可能であろう。
[0052] また、治療用薬剤がタンパク質またはペプチドである場合は、遺伝子工学的手法に より抗体と前記タンパク質またはペプチドとの融合タンパク質として生産することも可 能である。
[0053] また、本発明による抗体は抗腫瘍活性を有することから、それ自体を抗腫瘍剤とし て用いることが出来る。さらに、医薬組成物、とりわけ腫瘍の予防または治療剤の有 効成分として用いることが出来る。
[0054] 従って、本発明による抗体または医薬組成物は、ヒト CD98/ヒト LAT1を発現して V、る細胞に起因する可能性を有する種々の疾患または症状の治療または予防への 適用が可能である。その疾患または症状としては、各種悪性腫瘍が挙げられ、腫瘍 の例としては、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、脳腫瘍、リン パ腫、膀胱癌、脾臓癌、多発性骨髄腫、腎細胞癌、白血病、 T細胞リンパ腫、胃癌、 脾臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮 膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内 膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、力ポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、 血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、 神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫またはウィル ムス腫瘍等であり、本発明の抗体を適用する際の腫瘍は 1種類に限られず、複数種 類の腫瘍が併発したものでもよい。また、本発明のヒトモノクローナル抗体は、原発性 の局所癌に罹患している患者の延命にも適用可能である。また、 CD98が発現して いる免疫担当細胞に対して本発明の医薬組成物を選択的に作用させることができる
[0055] 本発明による抗体、または治療用薬剤と結合した抗体を含有する医薬は、医薬組 成物として提供されることが好まし 、。
[0056] このような医薬組成物には、治療上有効量の治療用薬剤が含まれ、経口、非経口 投与用の種々の形態に製剤化される。ここで、治療上有効量とは、所与の症状ゃ投 与計画にっ 、て治療効果を与える量を！、う。
[0057] 本発明の組成物は、抗体にカ卩えて、生理学的に許容され得る製剤上の添加物、例 えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、付 形剤および担体のうち 1種または複数を含むことができる。また、他の抗体または抗 生物質のような他の薬剤との混合物とすることもできる。
[0058] 適切な担体には、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれる力 これらに限定されるものではな い。さらに当該分野において周知であるアミノ酸、糖類、界面活性剤等の安定化剤、 表面への吸着防止剤を含んで 、てもよ 、。
[0059] 製剤の形態としては、凍結乾燥製剤 (この場合上記のような緩衝水溶液を添加する ことにより再構成して使用可能である。）、徐放製剤、腸溶性製剤、注射剤または点 滴剤などを含む製剤を、治療目的、治療計画に応じて選択可能である。
[0060] 投与経路は、適宜決定されてよいが、例えば経口経路、並びに静脈内、筋肉内、 皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的経路が考えられる。あるいは、 患者の患部に直接本発明の組成物を接触させる方法も可能である。
[0061] 投与量は、動物を用いた試験、臨床試験の実施により適宜決定されるが、一般に 患者の状態若しくは重篤度、年齢、体重、性別などが考慮されるべきである。通常、 経口投与では、成人に対して、 1日約 0.01mg〜1000mgであり、これらを 1回、または数 回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、 1回約 0.01mg〜1000mgを 皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
[0062] 本発明は、本発明による抗体または医薬組成物を用いた上記疾患の予防または治 療法をも包含し、さらに本発明は本発明の抗体の上記疾患の予防または治療剤の 製造への使用をも包含する。
[0063] 本発明の好ましい態様によれば、本発明による抗体は、水またはそれ以外の薬理 学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液または懸濁液のアンプルとして使用に 供される。また、無菌粉末製剤 (本発明の分子を凍結乾燥するのが好ましい)をアン プルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈してもよい。
実施例
[0064] 以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に 記載される態様に限定されるものではな 、。
[0065] 実施例 1 :ヒト CD98またはヒト LAT1発現ベクターの調製
ヒト CD98 (hCD98, GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018010 ;配列番号 6 5)およびヒト LATl (hLATl, GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018009 ;配列 番号 67)の DNAを保持するプラスミドベクター pcDNA3.1- hCD98および pcDNA3.1- h LAT1を铸型としてポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を行った。完全長ヒト CD98 cDNAの 5 ，末端に EcoRI配列を、その 3'末端に Notl配列と終止コドンを付加する為、プライマー 5， - CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG A TA TGA - 3，（配列番号 59)ぉょび5，-^〇 GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAG CAG- 3' (配列番号 60 )を使用し、 KOD- PlusDNAポリメラーゼ（東洋紡社製）および hCD98cDNA (約 20ng) を铸型として、 94°C15秒、 55°C30秒および 68°C1分 30秒間、 30サイクルの PCR反応 を行った。修飾された hCD98配列を EcoRI— Notl断片として単離し、そして同一酵素 で開裂された pTracer- EF/Bsdベクター (インビトロジェン社製）にライゲートした。得ら れたプラスミドを铸型として CD98 v2 U (5' -AGT CTC TTG CAA TCG GCT AAG AAG AAG AGC ATC CGT GTC ATT CTG -3，（配列番号 61) )プライマーと CD98 v2 L (5，- CAG AAT GAC ACG GAT GCT CTT CTT CTT AGC CGA TTG CAA GAG ACT -3， （配列番号 62) )プライマーを用いて、 hCD98DNAの 591と 594番目（ 配列番号 65における 702番目および 705番目 )の Aを Gに変えた。得られたプラスミ ドから EcoRI— hCD98- Notl断片を調製し、同一酵素で開裂されて 、た pEF6myc- His /Bsd (インビトロジェン社製）ベクターに連結した。得られたプラスミドを pEF6/hCD98 と命名した。
[0066] 同様に、完全長ヒト LAT1 cDNAの 5 '末端に EcoRI配列を、その 3 '末端に Kpnl配列 を付カ卩するためにプライマー 5，- CCG GAA TTC CCA CCA TGG CGG GTG CGG GCC CGA AGC GGC- 3' (配列番号 63)および 5， - CGG GGT ACC G TC TCC TGG GGG ACC ACC TGC ATG AGC TTC- 3' (配列番号 64)を 使用し、 KOD-Plus DNAポリメラーゼおよび hLATlcDNA (約 20ng)を铸型として、 94 °C15秒； 55°C、 30秒；および 68°C、 1分 30秒間、 30サイクルの PCR反応を行った。修 飾された hLATl配列を EcoRI— Kpnl断片として単離し、そして同一酵素で開裂された pEGFP- N1 (クローンテック社製)ベクターにライゲートした。さらに、得られたプラスミド を EcoRI— Notl断片として単離し、そして同一酵素で開裂された pEFlV5His/Neo (ィ ンビトロジェン社製)ベクターにライゲートした。得られたプラスミドを pEFl/hLATl-EG FPと命名した。
[0067] 実施例 2： hCD98ZhLATl発現細胞の調製 hCD98ZhLATl発現細胞の作製は、実施例 1で作製された発現ベクター pEF6/ hCD98および pEFl/hLATl— EGFP(hLATl— E)をインビトロジェン社製 Lipofectamineと Plus試薬を用いて、 Colon26(CT26)細胞と L929細胞（American Type Culture Collecti on No.CCL-1)に導入した。遺伝子導入はマニュアルの方法に従い行った。遺伝子 導入された細胞を細胞培養用プレート（6ゥエルプレート、ベタトンディッキンソン社製） を用い、 37°C、 5%炭酸ガス下で 24時間培養した後、 CT26細胞株の場合、ブラスト サイジン (5 μ g/mL)と G418(500 μ g/mL)入り培地で、 L929細胞株の場合、ブラストサ ィジン g/mL)と G418(lmg/mL)入り培地で、さらに 3日間培養した。次に、 RPE蛍 光標識マウス抗ヒト CD98抗体（ベタトンディッキンソン社製、 Ca.No. 556076)を用い た FACS Vantageで hLATl- Eと CD98陽性細胞を分離した。同様な方法で、 hCD98 発現 L929細胞あるいは hLATl-E発現 L929細胞を調製した。
[0068] 実施例 3：ヒト杭体産牛.マウスの作製
免疫に用いたマウスは、内因性 Ig重鎖および κ軽鎖破壊の両者についてホモ接合 体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒ Hg重鎖遺伝子座を含む 14番染色体断片 (SC 20)およびヒト Ig κ鎖トランスジーン（KCo5)を同時に保持する。このマウスはヒ Hg重鎖 遺伝子座を持つ系統 Aのマウスと、ヒト Ig κ鎖トランスジーンを持つ系統 Bのマウスとの 交配により作製した。系統 Aは、内因性 Ig重鎖および κ軽鎖破壊の両者についてホ モ接合体であり、子孫伝達可能な 14番染色体断片（SC20)を保持するマウス系統で あり、例えば富塚らの報告（Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol97: 722)に記載されている。また、系統 Bは内因性 Ig重鎖および κ軽鎖破壊の両者につ いてホモ接合体であり、ヒ Hg K鎖トランスジーン (KCo5)を保持するマウス系統（トラン スジエニックマウス）であり、例えば Fishwildらの報告（Nat BiotechnoL , 1996 Voll4:84 5)に記載されている。
[0069] 系統 Aの雄マウスと系統 Bの雌マウス、あるいは系統 Aの雌マウスと系統 Bの雄マウス の交配により得られる子マウスを富塚らの報告（Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA. , 2000 Vol97:722)に記載された方法で解析し、血清中にヒ Hg重鎖および κ軽 鎖が同時に検出される個体（ヒト抗体産生マウス）を選抜し (Ishida&Lonberg, IBC&ap os;s丄丄 th Antibody Engineering, Abstract 2000 ; Ishida, I. et al. , Cloning & Stem Cell s 4, 85-96 (2002))、以下の免疫実験に用いた。免疫実験には、上記マウスの遺伝的 背景を改変したマウスなど (石田功（2002)実験医学 20, 6846851)も用いた。
[0070] 実施例 4：ヒトモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門 (安東民衛ら著作、講 談社発行 1991)等に記載されるような一般的方法に従って行った。
[0071] 免疫原である hCD98/hLATlとして、実施例 2で調製した hCD98/hLATl— E発 現 CT26細胞、および hCD98発現が確認されたヒト大腸癌細胞株 Colo205細胞を用 いた。
[0072] 被免疫動物は、実施例 3で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウ スを用いた。
[0073] hCD98/hLATl— E発現 CT26細胞を用いた場合、 5 X 106細胞を RIBIアジュバン ト (コリクサ社製)と混合し腹腔内に初回免疫した。初回免疫力 7、 24日目に 5 X 106 細胞/マウスを腹腔内に追加免疫した。さらに以下に述べる脾臓細胞の取得 3日前に 細胞を同様にして免疫した。
[0074] Colo205細胞を用いた場合、 5 X 106細胞を腹腔内に初回免疫した。初回免疫から 1 4日目に 5 X 106細胞/マウスを腹腔内に追加免疫し、 3日後に以下に述べる脾臓細胞 を取得した。
[0075] 免疫されたマウス力 脾臓を外科的に取得し、回収した脾臓細胞をマウスミエロー マ SP2/0 (ATCC No.CRL1581)と 5 : 1で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール 1 500 (Roche社製)を用いて細胞融合させて、多数のノ、イブリドーマを作製した。ハイ ブリドーマの選択は、 10%のゥシ胎児血清（Fetal Calf Serum, FCS)とヒポキサンチ ン（H)、アミノプテリン (A)、チミジン (T)を含有する HAT含有 DMEM培地（ギブコ 社製）中で培養することにより行った。さらに、 HT含有 DMEM培地を用いて限界希 釈法によりシングルクローンにした。培養は、 96ウェルマイクロタイタ一プレート（ベタト ンディッキンソン社製）中で行った。 目的ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリド 一マクローンの選択 (スクリーニング）および各々のハイブリドーマが産生するヒトモノ クローナル抗体の特徴付けは、後述する蛍光活性ィ匕セルソーター（FACS)により測 定することにより行った。 [0076] ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは以下のように行なった 。すなわち、以下に述べる FACS解析により、ヒト免疫グロブリン 鎖 (hlg ）、 鎖（ hlg γ )およびヒト免疫グロブリン軽鎖 κ (hlg κ )を有し、かつ hCD98/hLATl— E発 現 CT26細胞に特異的な反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマを 200個以上得た。
[0077] なお、本明細書における実施例にあっては、結果として示した表または図中におい て、ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを、記号を用いて命名し た。以下のハイプリドーマクローンはシングルクローンを表わす： 4-35-14(C2)、 4-32- 9(K3)、 7-95-8、 10-60-7、 3-69-6、 5-80-1 (以上 hCD98/hLATl- Ε発現 CT26細胞を 免疫原とするクローン）、 1-40- 以上 Colo205細胞を免疫原とするクローン)。
[0078] 実施例 5：各モノクローナノレ杭体のサブクラス同定
実施例 4で取得した各モノクローナル抗体のサブクラスの同定を FACS解析で行つ た。 2 X 106/mlの Colo205細胞を、 ImM EDTA、 0.1 %NaN、 5%FCS含有 PBSの SB (st
3
aining buffer)に浮遊させた。細胞浮遊液を 96ゥエル丸底プレート（ベタトンディツキン ソン社製）に分注した (50 1/ゥエル)。さら〖こ、実施例 4で培養したノヽイブリドーマの培 養上清 (50 1)を加えて撹拌し、氷温下 30分間反応させてから、遠心分離 (2000rpm、 4°C、 2分)して上清を除去した。ペレットを 100 1/ゥエルの SBで 1回洗浄した後、 FITC 蛍光標識ゥサギ抗ヒ Hg F(ab')抗体 (ダコサイトメーシヨン社製)を SBで 50倍、ある
2
いは RPE蛍光標識ャギ抗ヒト Ig y F(ab，）抗体（SuthernBiotech社製）を SBで 200倍、あ
2
るいは RPE蛍光標識ゥサギ抗ヒ Hg κ F(ab')抗体 (ダコサイトメーシヨン社製)を SBで 2
2
00倍希釈して加え、氷温下 30分間反応させた。 SBで 1回洗浄した後、 300 1の SBに 懸濁し、 FACS (FACSCan、ベタトンディッキンソン社製)で抗体の結合を示す蛍光強 度を測定した。得られた抗体の一部の結果を表 1に示す。 C2は重鎖が 鎖で軽鎖が κ鎖で、 K3, 3-69-6, 7-95-8, 10-60-7, 1-40-1、および 5-80-1は何れも重鎖が γ鎖 で軽鎖が κ鎖であった。
[0079] [表 1] 各抗体のサブクラス
O C D C
クローンD I 軽鎖 重鎖
K3 ヒ卜 A: ヒ卜
C2 ヒ卜 Λ: ヒ卜//
1 -40- 1 ヒ卜 Λ: ヒ卜？^
ヒ卜 A: ヒ卜？^
Figure imgf000023_0001
ヒ卜 ί ヒ卜 y
ヒ卜 Λ: ヒ卜 y
Figure imgf000023_0002
ヒ卜 Λ: ヒ卜
実施例 6：モノクローナル抗体をコードする遣伝子の調製および組換え抗体発現べク ターの構築
C2, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6または 1-40-1の各抗体遺伝子のクローユングと 発現ベクターの構築を以下の方法で実施した。 [0081] (1)抗体遺伝子の cDNAクローユングと発現ベクターの作製
ノ、イブリドーマを 10%FCS含有 DMEM培地（ギブコ社製)で培養し、遠心分離により 細胞を集めた後、 ISOGEN (二ツボンジーン社製)を添加し、取扱説明書にしたがって Total RNAを抽出した。抗体 cDNAの可変領域のクロー-ングは、 SMART RACE cD NA amplification Kit (クローンテック社製）を用い、添付の説明書にしたがって行った
5 μ gの total RNAを铸型として、 1st strand cDNAを作製した。
(a) 1st strand cDNAの合成
Total RNA 5 g/3 1、 5， CDS 1 μ 1、および SMART oligo 1 μ 1からなる組成の反応 液を 70°Cで 2分間インキュベートした後、 5 X Buffer 2 1、 DTT 1 μ 1、 DNTP mix 1 1 、そして Superscript II 1 μ 1をカ卩ぇ 42°Cで 15時間インキュベートした。さらに、 100 μ 1の Tricine Bufferをカ卩えた後、 72°Cで 7分間インキュベートし、 1st strand cDNAを取得し た。
(b) PCRによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅および組換え抗体発現ベクターの 構築
cDNAの増幅には、東洋紡社の KOD- Plusを用いた。
cDNA 15 1、 lOxKOD— Plus Buffer 5 1、 dNTP mix 5 1、 KOD— Plus 1 μ 1、 25mM MgSO 3 /z l、プライマー 1、およびプライマー 2からなる組成の反応液を再蒸留水にて
4
最終容量 50 1とし、 PCRに供した。
[0082] K3、 1-40-1, 3-69-6, C2に関し、具体的に実験例を示せば、以下のとおりである。
[0083] Κ3
軽鎖の増幅のために、 UMPと hk- 2 (5，- GTT GAA GCT CTT TGT GAC GG G CGA GC - 3' (配列番号 1) )プライマーを用い、 94°C5秒、 72°C3分のサイクルを 5回繰り返し、続いて、 94°C5秒、 70°C10秒、 72°C3分のサイクルを 5回繰り返し、さら に、 94°C5秒: 68°C10秒： 72°C3分のサイクルを 25回繰り返した。さらに、この反応液の 5倍希釈液 1 1を铸型とし、 NUMPと hk5 (5，- AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC - 3， （配列番号 2) )プライマーを用いて、 94°C15秒、 60°C30 秒、 68°C1分のサイクルを 30回繰り返した。この反応液を 2%ァガロースゲル電気泳動 に供し、増幅された PCR産物を QIAquick gel extraction kit (キアゲン社製）により精 製した。精製された PCR産物を pCR4Blunt- TOPOベクター（インビトロジェン社製）に 連結し、添付説明書に従いサブクローユングした。次に T3 (5' -ATT AAC CCT CAC
TAA AGG GA-3' (配列番号 3) )と hk5をプライマーとして、塩基配列の決定を行つ た。配列情報を基に、 DNPL15Bglp (5，- AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TG G AAG CCC CAG CTC AGC TTC TCT -3， （配列番号 4) )を合成し、 pCR4Blunt- TOPOベクターでサブクロー-ングされた軽鎖遺伝子を铸型として DNPL15Bglpと 20 2LR(5' - AGA GAG AGA GCG TAC GTT TAA TCT CCA GTC GTG TCC CTT G GC -3' (配列番号 5) )プライマーを用い、 94°C15秒、 55°C30秒、 68°C1分のサイク ルを 30回繰り返した。この反応液を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、約 400bpの断 片を QIAquick gel extraction kit (キアゲン社製）により精製した。軽鎖増幅 cDNA断片 を BglII、 BsiWIで消化し、同一酵素で解裂されていた N5KG1- Val Larkベクター（IDE C Pharmaceuticals, N5KG1 (US patent 6001358)の改変ベクター）に導入した。得ら れたベクターを N5KG1-Val K3Lと命名した。
重鎖の増幅のために、 UMPと IgGlp (5， - TCT TGT CCA CCT TGG TGT TGC T GG GCT TGT G -3' (配列番号 6) )プライマーを用い、 94°C5秒、 72°C3分のサイクル を 5回繰り返し、続いて、 94°C5秒、 70°C10秒、 72°C3分のサイクルを 5回繰り返し、さら に、 94°C5秒、 68°C10秒、 72°C3分のサイクルを 25回繰り返した。さらに、この反応液 の 5倍希釈液 1 μ 1を铸型とし、 NUMPと IgG2p (5，- TGC ACG CCG CTG GTC AGG GCG CCT GAG TTC C -3，（配列番号 7) )を用いて、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1 分のサイクルを 30回繰り返した。この反応液を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、増 幅された PCR産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。精製された PCR産物 を pCR4Blunt-TOPOベクターに連結しサブクローユングした。次に T3と hh2 (5，- GCT
GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G—3' (酉己歹 lj番号 8) )をプライマーとして、塩 基配列の決定を行った。配列情報を基に、 K3HcSalI (5' - AGA GAG AGA GGT CG A CCA CCA TGG GGT CAA CCG CCA TCC TCG CCC TCC TC - 3' (配列番号 9) )を合成し、 pCR4Blunt-TOPOベクターでサブクローユングされた重鎖遺伝子を铸 型として K3HcSalIと F24HNhe (5，一 AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CG G TGA CCA GGG TTC -3， （配列番号 10) )を用い、 94°C15秒、 55°C30秒、 68°C1 分のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、約 450bpの断片を QIAquick gel extraction kitにより精製した。重鎖増幅 cDNA断片を Sa II、 Nhelで消化し、同一酵素で解裂されていた N5KG1-Val K3Lに導入した。揷入部 分の DNA塩基配列を決定して、 PCR増幅して挿入された配列に铸型とした遺伝子配 列と相違がないことを確認した。得られたベクターを N5KG1-Val K3IgGlと命名した 。 N5KG1-Val K3IgGlを後述する FreeStyle293細胞に遺伝子導入することにより得ら れた組み換え体 K3抗体が K3ハイプリドーマ由来の抗体と同じであるかの確認は、 hC D98/hLATl発現細胞株への結合活性を調べることにより行った。
[0085] 1-40-1
重鎖の増幅のために、 UMPと IgGlpプライマーを用い、 94°C5秒、 72°C3分のサイク ルを 5回繰り返し、続いて、 94°C5秒、 70°C10秒、 72°C3分のサイクルを 5回繰り返し、 さらに、 94°C5秒、 68°C10秒、 72°C3分のサイクルを 25回繰り返した。さらに、この反応 液の 5倍希釈液 1 μ 1を铸型とし、 NUMPと IgG2pプライマーを用いて、 94°C15秒、 60°C 30秒、 68°C1分のサイクルを 30回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気 泳動に供し、増幅された PCR産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。精製 された PCR産物を pCR4Blunt- TOPOベクターに連結しサブクローユングした。次に T3 と hh2をプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報を基に、 205HP5SalI ( 5， - AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT GGG TTT -3，（配列番号 11) )を合成し、 pCR4Blunt- TOPOベクターでサブクローユングさ れた重鎖遺伝子を铸型として 205HP5SalIと F24Hnheプライマーを用い、 94°C15秒、 55 °C30秒、 68°C1分のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 2%ァガロースゲル電気 泳動に供し、約 450bpの断片を QIAquick gel extraction kitにより精製した。重鎖増幅 cDNA断片を Sall、 Nhelで消化し、同一酵素で解裂されていた N5KG1-Val Larkベクタ 一に導入した。得られたベクターを N5KG1-Val 1-40-1Hと命名した。
[0086] 軽鎖の増幅のために、 UMPと hk-2プライマーを用い、 94°C5秒、 72°C3分のサイクル を 5回繰り返し、続いて、 94°C5秒、 70°C10秒、 72°C3分のサイクルを 5回繰り返し、さら に、 94°C5秒、 68°C10秒、 72°C3分のサイクルを 25回繰り返した。さらに、この反応液 の 5倍希釈液 1 μ 1を铸型とし、 NUMPと hk5を用いて、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分 のサイクルを 30回繰り返した。この反応液を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、増幅 された PCR産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。精製された PCR産物を pCR4Blunt-TOPOベクターに連結しサブクローユングした。次に T3と hk5をプライマー として、塩基配列の決定を行った。配列情報を基に、 A27RN202 (5' - AGA GAG AG A GCG TAC GTT TGA TTT CCA CCT TGG TCC CTT GGC -3， （配列番号 12) ) を合成し、 pCR4Blunt-TOPOベクターでサブクローユングされた軽鎖遺伝子を铸型と して DNPL15Bglpと A27RN202を用い、 94°C15秒、 55°C30秒、 68°C1分のサイクルを 2 5回繰り返した。この反応液を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、約 400bpの断片を QIAquick gel extraction kitにより精製した。軽鎖増幅 cDNA断片を BglII、 BsiWIで消 化し、同一酵素で解裂されていた N5KG1-Val 1-40-1Hベクターに導入した。挿入部 分の DNA塩基配列を決定して、 PCR増幅して挿入された配列に铸型とした遺伝子配 列と相違がないことを確認した。得られたベクターを N5KG1-Val 1-40-lIgGlと命名 した。 N5KG1-Val 1-40-lIgGlを後述する FreeStyle293細胞に遺伝子導入すること により得られた組み換え体 1-40-1抗体力^- 40-1ノヽイブリドーマ由来の抗体と同じで あるかの確認は、 hCD98/hLATl発現細胞株への結合活性を調べることにより行つ た。
3-69-6
軽鎖の増幅のために、 UMPと hk-2プライマーを用い、 94°C15秒、 72°C3分のサイク ルを 5回繰り返し、続いて、 94°C15秒、 70°C10秒、 72°C3分のサイクルを 5回繰り返し、 さらに、 94°C15秒、 68°C15秒、 72°C3分のサイクルを 25回繰り返した。さらに、この反 応液の 5倍希釈液 2 μ 1を铸型とし、 NUMPと hk5を用いて、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C 1分のサイクルを 30回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 増幅された PCR産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。精製された PCR産 物を pCR4Blunt- TOPOベクターに連結しサブクローユングした。次に M13Foward(- 20 ) primer (5， - GTA AAA CGA CGG CCA G -3，（配列番号 13) )、 M13 Reverse prim er (5， - CAG GAA ACA GCT ATG AC- 3 ' (配列番号 14) )と hk5 (5 ' - AGG CACAC A ACA GAG GCAG TTCCAGA TTT C -3' (配列番号 2) )をプライマーとして、塩基 配列の決定を行った。配列情報を基に、 A27_F (5' - AGA GAG AGA GAT CTC T CA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3' (配列番号 15) )と 39— 20 丄 3Bsi (5' - AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TCT CCA GCT TGG TCC CC T G-3， （配列番号 16) )を合成し、 pCR4Blunt- TOPOベクターでサブクローユングさ れた軽鎖遺伝子を铸型として A27_Fと 39_20丄 3Bsiを用い、 94°C30秒、 55°C30秒、 68 °C1分のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供 し、約 400bpの断片を QIAquick gel extraction kitにより精製した。軽鎖増幅 cDNA断 片を BglII、 BsiWIで消化し、同一酵素で解裂されていた N5KG1-Val Larkベクターに 導入した。得られたベクターを N5KG1-Val 3-69-6Lと命名した。
重鎖の増幅のために、 UMPと IgGlp (5， - TCT TGT CCA CCT TGG TGT TGC T GG GCT TGT G-3' (配列番号 6) )プライマーを用い、 94°C15秒、 72°C3分のサイク ルを 5回繰り返し、続いて、 94°C15秒： 70°C10秒： 72°C3分のサイクルを 5回繰り返し、 さらに、 94°C15秒、 68°C15秒、 72°C3分のサイクルを 30回繰り返した。さらに、この反 応液の 5倍希釈液 2 μ 1を铸型とし、 NUMPと IgG2p (IgGl.3.4) (5，- TGC ACG CCG CTG GTCAGG GCG CCT GAG TTC C- 3， （配列番号 7) )を用いて、 94°C30秒、 55 °C30秒、 68°C1分のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電 気泳動に供し、増幅された PCR産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。精 製された PCR産物を pCR4 Blunt- TOPOベクターに連結しサブクローユングした。次 に M13F, M13Rと IgG2pをプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報 を基に、 Z3HP5Sal (5， - AGA GAG AGA GGT CGA CCCACCATG GAC TGG AGC ATC CTT TT- 3，（配列番号 17) )と F24HNhe (5， - AGA GAG AGA GGC TAG CTG AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC -3，（配列番号 10) )を合成し、 pCR4Blunt- T ΟΡΟベクターでサブクロー-ングされた重鎖遺伝子を铸型として Z3HP5SalFと F24HN heを用い、 94°C30秒、 55°C30秒、 68°C1分秒のサイクルを 25回繰り返した。この反応 液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、約 450bpの断片を QIAquick gel extraction kitにより精製した。重鎖増幅 cDNA断片を Sall、 Nhelで消化し、同一酵素で解裂され ていた N5KG1-Val 3-69-6Lベクターに導入した。挿入部分の DNA塩基配列を決定 して、 PCR増幅して挿入された配列に铸型とした遺伝子配列と相違がな ヽことを確認 した。得られたベクターを N5KG1-Val 3-69-6IgGlと命名した。 N5KG1-Val 3-69-6Ig G1を後述する FreeStyle293細胞に遺伝子導入することにより得られた組み換え体 3-6 9-6抗体が 3-69-6ハイプリドーマ由来の抗体と同じであるかの確認は、 hCD98/hL ATI発現細胞株への結合活性を調べることにより行った。
[0089] C2kGl
ハイプリドーマ産生 C2のサブクラスは IgMであるため、同じ germ line由来の IgGから 想定される可変領域を含むように設計したプライマーを用いた PCRにより C2抗体可 変領域を単離した (C2 IgGDo
[0090] 軽鎖の増幅のために、 UMPと hk-2プライマーを用い、 94°C5秒、 72°C3分のサイクル を 5回繰り返し、続いて、 94°C5秒、 70°C10秒、 72°C3分のサイクルを 5回繰り返し、さら に、 94°C5秒、 68°C10秒、 72°C3分のサイクルを 25回繰り返した。さらに、この反応液 の 5倍希釈液 1 μ 1を铸型とし、 NUMPと hk5を用いて、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分 のサイクルを 30回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、増 幅された PCR産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。精製された PCR産物 を pCR4Blunt-TOPOベクターに連結しサブクローユングした。次に M13F, M13Rと hk5をプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報を基に、 C2-1 Lc Bgl II F (5， - AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TT C TCT TC -3，（配列番号 18) )と C2- 1 Lc BsiWI R (5' -AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TAT CCA CTT TGG TCC CAG GG -3' (配列番号 19) )を合成し、 pCR4 Blunt-TOPOベクターでサブクローユングされた軽鎖遺伝子を铸型として C2-1 Lc Bg 1 II Fと C2- 1 Lc BsiWI Rを用い、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分のサイクルを 25回繰 り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、約 400bpの断片を QIAq uick gel extraction kitにより精製した。軽鎖増幅 cDNA断片を BglII、 BsiWIで消化し、 同一酵素で解裂されていた N5KG1-Val Larkベクターに導入した。得られたベクター を N5KG1- Val C2Lと命名した。
[0091] 重鎖の増幅のために、 UMPと M655R (5， - GGC GAA GAC CCG GAT GGC TAT GTC-3' (配列番号 20) )プライマーを用い、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分のサイク ルを 30回繰り返した。さらに、この反応液の 5倍希釈液 1 μ 1を铸型とし、 NUMPと Μ393 R (5，- AAA CCC GTG GCC TGG CAG ATG AGC -3，（配列番号 21) )を用いて、 94 °C15秒、 60°C30秒、 68°C1分のサイクルを 30回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロ ースゲル電気泳動に供し、増幅された PCR産物を QIAquick gel extraction kitにより 精製した。精製された PCR産物を pCR4Blunt- TOPOベクターに連結しサブクローニン グした。次に M13Foward (- 20)primer (5， - GTA AAA CGA CGG CCA G -3，（配列番 号 13) )、 M13 Reverse primer (5，- CAG GAA ACA GCT ATG AC- 3，（配列番号 14) )と M393Rをプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報を基に、 C2hcSalI F (5， - AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGA AGCACC TGT GGT TCT TC C TCC TGC T—3，（配列番号 22) )と C2hcNheI (5，— AGA GAG AGA GGC TAG CT G AGG AGA CGG TGA CCA GGG TTC CCT GG -3，（配列番号 58) )を合成し、 p CR4Blunt- TOPOベクターでサブクローユングされた重鎖遺伝子を铸型として C2hcSa 1IFと C2hcNheIを用い、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C30秒のサイクルを 25回繰り返した 。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、約 450bpの断片を QIAquick gel extraction kitにより精製した。重鎖増幅 cDNA断片を Sall、 Nhelで消化し、同一酵素 で解裂されていた N5KG1-Val C2Lベクターに導入した。挿入部分の DNA塩基配列 を決定して、 PCR増幅して挿入された配列に铸型とした遺伝子配列と相違がないこと を確認した。得られたベクターを N5KG1-Val C2IgGlと命名した。
[0092] C2IgGlNS
上述のようにクローユングした C2IgGl遺伝子にお!、て重鎖のフレーム領域に本来 の germ lineでは認められない変異が入っていた。そこで、本来の germ lineの配列を 持つ C2の可変領域配列を以下の方法により単離した。
[0093] 上で得られたベクター N5KG1-Val C2IgGlを铸型として C2hc NS F (5' - CGT CCA AGA ACC AGT TCT CCC TGA AGC TGA- 3，（配列番号 23) )プライマーと C2hc N S R(5，- TCA GCT TCA GGG AGA ACT GGT TCT TGG ACG- 3，（配列番号 24) ) プライマーを用いて、 C2抗体重鎖の 290と 299番目の Gと Tを其々 Aと Cに変え、 N5KG 1-Val C2IgGlNSを作製した。 N5KG1- Val C2IgGlと N5KG1- Val C2IgGlNSを後述 する FreeStyle293細胞に遺伝子導入することにより得られた組み換え体 C2IgGlと C2I gGlNS抗体が C2ハイプリドーマ由来の IgM抗体と特異性が同じであるかの確認は、 h CD98/hLATl発現細胞株への結合活性を調べることにより行った。 C2IgGlと C2Ig GINSの結合活性は、ほぼ同じであった。
[0094] C2k u Gl
上述の C2IgGlに用いた方法であると、重鎖と軽鎖の結合部位の形が本来の IgMと 異なる可能性があるため、以下の配列転換を行なった。すなわち、 IgGの γ鎖と IgM の μ鎖の CHI定常領域にある共通な配列 (GCL配列)から可変領域側方向に隣接 する 26アミノ酸を 鎖配列とし、 GCL配列力も定常領域側全てを γ鎖にコンバートし た (C2 Ig iu Gl)。以上の配列転換を以下の方法により行なった。
[0095] C2 cDNAの重鎖の増幅のために、 UMPと M655Rプライマーを用い、 94°C15秒、 60 °C30秒、 68°C1分のサイクルを 30回繰り返した。さらに、この反応液の 5倍希釈液 1 1 を铸型とし、 NUMPと M393Rを用いて、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分のサイクルを 30 回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、増幅された PCR産 物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。精製された PCR産物を pCR4 Blunt- TOPOベクターに連結しサブクローユングした。次に M13Foward(- 20)primer (5，- GTA AAA CGA CGG CCA G -3，（配列番号 13) )、 M13 Reverse primer (5，- CAG GAA ACA GCT ATG AC- 3' (配列番号 14) )と M393Rをプライマーとして、塩基配列の決 定を行った。配列情報を基に、 C2hcSalIF(5，- AGA GAG AGA GGT CGA CCA CC A TGA AGCACC TGT GGT TCT TCC TCC TGC T -3，（配列番号 22) )と Mu- GC L-Gamma L (5， - CAC CGG TTC GGG GAA GTA GTC CTT GAC GAG GCA GC A AAC GGC CAC GCT GCT CGT- 3，（配列番号 25) )を合成し、 pCR4Blunt- TOPO ベクターでサブクローユングされた重鎖遺伝子を铸型として C2hcSalIFと Mu-GCL-Ga mma Lを用い、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分のサイクルを 25回繰り返した。この反 応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 PCR増幅産物を QIAquick gel extractio n kitにより精製した。この PCR増幅産物を C2V と命名した。次に N5KG1-Val Lark ベクターを铸型として Mu— GCL— Gamma U (5，— ACG AGCAGC GTG GCC GTT GG C TGC CTC GTCAAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG - 3' (配列番号 26) ) と hlgGl BamHI L (5， - CGC GGA TCC TCA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GCT-3' (配列番号 27) )を用い、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C90秒のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 PCR増幅産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。この PCR増幅産物を C γ 1と命名した。 C2 V と C γ 1の 3倍希釈液を各 5 μ 1入れ、プライマー無しで 94°C15秒、 55°C30秒、 68°C 2分のサイクルを 3回繰り返した。この反応液を 99°C5分間加熱後 10倍希釈し、 5 1を 铸型として C2hcSalIFと hlgGl BamHI Lを用い、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C2分のサイ クルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 PCR増幅 産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。この PCR増幅 cDNA断片を Sall、 S malで消化し、同一酵素で解裂されて!、た前記 C2軽鎖遺伝子が入った N5KG1-Val Larkベクターに導入した。挿入部分の DNA塩基配列を決定して、 PCR増幅して挿入 された配列に铸型とした遺伝子配列と相違がな ヽことを確認した。得られたベクター を N5KG1- Val C2Ig iu G1と命名した。 C2Ig G1抗体の結合活性は、 N5KG1- Val C2I g μ G1を後述する FreeStyle293細胞に遺伝子導入することにより得られた組み換え体 の hCD98/hLATl発現細胞株への結合活性を調べることにより行った。
[0096] K3、 1-40-1、 3-69-6の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む DNA配列、並び に重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列は、それぞれ以下の配列 番号の配列であった。
[0097] < K3重鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 28)
Figure imgf000032_0001
AGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
[0098] < K3重鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 29) AMYYCARRRDIVGGTDYWGQGTLVTVSS
< K3軽鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 30)
Figure imgf000033_0001
[0100] < K3軽鎖可変領域 > (配列番号 31)
Figure imgf000033_0002
WITFGQGTRLEIK
[0101] < 1-40-1重鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 32)
Figure imgf000033_0003
CCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
[0102] < 1-40-1重鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 33) DTALYYCAGYCIITGCYADYWGQGTLVTVSS
< 1-40-1軽鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 34)
Figure imgf000034_0001
[0104] < 1-40-1軽鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 35)
Figure imgf000034_0002
WWTFGQGTKVEIK
[0105] < 3-69-6重鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 36)
Figure imgf000034_0003
GAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
[0106] < 3-69-6重鎖可変領域 > (配列番号 37)
Figure imgf000034_0004
SLRSDDTAVYYCARDRGSNWYGWFDPWGQGTLVTVSS [0107] < 3-69-6の軽鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 38)
Figure imgf000035_0001
ACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
[0108] < 3-69-6の軽鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 39)
Figure imgf000035_0002
Q QYGSSYTFGQGTKLEIK
[0109] C2重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む DNA、並びに重鎖可変領域および軽 鎖可変領域を含むアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
[0110] < C2IgGl重鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 40)
Figure imgf000035_0003
CCTGGTCACCGTCTCCTCA
< C2IgGl重鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 41) TAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSS
< C2IgGlNS重鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 42)
Figure imgf000036_0001
CCTGGTCACCGTCTCCTCA
[0113] < C2IgGlNS重鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 43)
Figure imgf000036_0002
TAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSS
< C2Ig μ G1重鎖可変領域力 ヒト IgGlとの結合部位核酸配列 >
(配列番号 44)
Figure imgf000036_0003
[0115] < C2Ig iu G1重鎖可変領域力 ヒト IgGlとの結合部位アミノ酸配列 > (配列番号 45)
Figure imgf000037_0001
[0116] < C2IgGlと C2Ig iu G1の軽鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 46)
Figure imgf000037_0002
[0117] < C2IgGlと C2Ig iu G1の軽鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 47)
Figure imgf000037_0003
QQYGSSPIFTFGPGTKVDIK
[0118] 上記各抗体配列の内、 K3および C2IgGlの軽鎖可変領域と重鎖可変領域 (すなわ ち、配列番号 28および 30並びに配列番号 40および 46の配列の核酸）を pCR4Blunt -TOPOベクターに導入したものを、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物 寄託センターに寄託し、それぞれ FERM ？ー10552 (識別のための表示：! 3 じ R4)および FERM BP— 10551 (識別のための表示： C2IgGl/pCR4)の寄託番号が 付されている。
[0119] 上記各抗体可変領域は重鎖および軽鎖部分に加え結合および単離に用いる制限 酵素認識配列を含んでおり、各抗体の軽鎖可変領域を単離する場合は Bglllと BsiWI を、重鎖可変領域を単離する場合は Sailと Nhelのそれぞれの制限酵素を用いること により、単離できる。以下に pCR4Blunt-TOPOベクターに挿入した各抗体可変領域と 制限酵素認識部位などを含んだ遺伝子配列を示す。
Figure imgf000038_0001
[0121] <C2IgGl/pCR4> (配列番号 49)
TCTCTCTCT
[0122] 実施例 7：組椽ぇ型杭体の作製
実施例 6で構築した組換え型抗体発現ベクターを宿主細胞に導入し、組換え型抗 体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞として CHO細胞の dhfr欠損株 (ATC C CRL-9096)を用いた。宿主細胞へのベクターの導入はエレクト口ポレーシヨンによ り実施した。抗体発現ベクター約 2 gを制限酵素で線状化し、 Bio-Rad electrophore terをもちいて 350V、 500 Fの条件で、 4x10°個の CHO細胞に遺伝子を導入し、 96we 11 culture plateに播種した。発現ベクターの選択マーカーに対応した薬剤を添加して 培養を継続した。コロニーを確認した後、実施例 4に示した方法によって、抗体発現 株を選別した。選別した細胞力ゝらの抗体精製は、実施例 8にしたがって行った。また、 組換え型抗体発現ベクターを添付説明書に従!ヽ FreeStyle293細胞 (インビトロジェン 社製)へ導入し、組み換え型抗体を発現させた。
[0123] 実施例 8 :抗体の精製
ヒ HgG抗体を含むハイプリドーマ培養上清の調製は、以下の方法にて行った。抗 体産生ハイブリドーマをゥシインシュリン (5 μ g/ml、ギブコネ土製）、ヒトトランスフェリン（ 5 μ g/ml、ギブコネ土製）、エタノールァミン（0.01 mM、シグマ社製）、亜セレン酸ナトリ ゥム (2.5x10— 5mM、シグマ社製)含有 eRDF培地 (極東製薬社製）に馴化した。組織 培養フラスコで培養し、ハイプリドーマの生細胞率が 90%になった時点で培養上清を 回収した。回収した上清は、 10 μ mと 0.2 μ mのフィルター（ゲルマンサイエンス社製） に供し、ハイプリドーマ等の雑排物を除去した。抗体を含む培養上清を Protein A (ァ マシャム）を用い、吸着緩衝液として PBS、溶出緩衝液として 20mMクェン酸ナトリウム 緩衝液 (PH3.0)を用いてァフィユティー精製した。溶出画分は 50mMリン酸ナトリウム 緩衝液 (pHLO)を添加して pH6.0付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（ 10,000カット、 Spectrum Laboratories社製）を用いて PBSに置換し、孔径 0.22 μ mのメ ンブランフィルター MILLEX- GV (ミリポア社製)でろ過滅菌し、精製抗体を得た。精製 抗体の濃度は、 280nmの吸光度を測定し、 lmg/mlを 1.45 Optimal densityとして算出 した。
[0124] 実施例 9：各モノクローナル抗体の特異性
実施例 4で取得した各モノクローナル抗体の反応性の検討を実施例 5に明記してあ る FACS解析と同法で行った。実施例 2で調製した細胞株を Staining Buffer(SB)で 2x1 oVmlに調製し、その細胞浮遊液を 96ゥエル丸底プレート（ベタトンディッキンソン社 製）に分注した (50 1/ゥエル)。実施例 4から実施例 8で調製した各組み換え体抗体 を SBで 5 /z g/mlに調製し、 50 1を各ゥエルに加え撹拌した。陰性コントロールは、 KM マウスで作製した抗 dinitrophenyl (DNP)ヒト IgGl抗体を使用した。氷温下 30分間反 応させてから、遠心分離 (2000rpm、 4°C、 2分)して上清を除去した。ペレットを 100 μ 1/ ゥエルの SBで 1回洗浄した後、 200倍希釈した RPE蛍光標識ゥサギ抗ヒ Hg κ F(ab ')
2 抗体 (ダコサイトメーシヨン社製)を 50 1/ゥヱル加え、氷温下 30分間反応させた。 SB で 1回洗浄した後、 300 1の SBに懸濁し、 FACSで抗体の結合を示す蛍光強度を測 し 7こ。
[0125] その結果、いずれの抗体も hCD98/hLATl— E発現 CT26細胞（図 1)または hC D98/hLATl— E発現 L929細胞 (図 2)に対し強い結合活性を有し、一方、 CT26細 胞および L929細胞への結合活性は観察されな力つた。さらに、いずれの抗体も hLAT 1-E発現 L929細胞には結合せず、 hCD98発現 L929細胞には結合することから、 C2 、 K3、 7-95-8、 10-60-7、 3-69-6、 1-40-1抗体の結合部位は hCD98に位置すること が判った (図 2)。
[0126] 実施例 10 :各モノクローナル抗体の抗原結合に関係する hCD98タンパクの領城
各モノクローナル抗体の結合に重要な hCD98分子の領域を検討した。
[0127] まず、ッ-カマイシン処置 K562細胞株への反応性で調べた。 2xl05の K562細胞を 6 ゥエルプレートに播種し (4ml/ゥエル）、 5 μ g/mlのッ-カマイシン（シグマ社製）存在 下、非存在下で 72時間 37°C、 5%CO下で培養した。この条件で約 80Kdaである hCD9
2
8の分子量が、 N-link糖鎖がとれた場合の理論値約 60kDaになることをウェスタンブロ ットで確認した。培養後、細胞を回収し 2xl06/mlの細胞株を Staining Buffer (SB)に浮 遊させた。細胞浮遊液を 96— well丸底プレート（ベタトンディッキンソン社製）に分注 した（50 μ 1/ゥエル)。 SBで 5 μ g/mLに調製された各組み換え体抗体を 50 μ 1/ゥエル 加え、氷温下 30分間反応させた。陰性コントロールは抗 DNPヒト IgGl抗体を用いた。 S Bで 1回洗浄した後、 RPE蛍光標識ャギ抗ヒト ¾ γ F(ab ')抗体 (SuthernBiotech社製）
2
を SBで 200倍希釈して加え、氷温下 30分間インキュベートした。 SBで 1回洗浄した後、 300 /z 1の FACS緩衝液に懸濁し、 FACSで抗体の結合を示す蛍光強度を測定した。
[0128] その結果、何れの抗体もツユ力マイシン非処置の K562より、処置細胞の結合活性 が低下することは観察されな力つた（図 3)。以上の結果より、各抗体の結合部位は N- link糖鎖でな!、ことが判り、これらモノクローナル抗体は hCD98の抗体であることが強 く示唆された。さらに、各モノクローナル抗体の結合に重要な hCD98の領域を実施 例 11で検討した。
[0129] 実施例 11 :各杭体の結合反 に重要なヒト CD98タンパクの領城
各抗体はマウス CD98(mCD98)に交叉反応性を示さないため、 mCD98と hCD98 を人工的に結合したキメラ CD98を利用し、各抗体の結合反応に重要なヒト CD98タ ンパクの領域を検討した。
[0130] キメラ CD98は以下の様に作製した。 mCD98と hCD98の配列情報より、 EcoRIhC D98U (5' -CCG GAA TTC cCa cCa TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA-3 ' (配列番号 50) )、 NotIhCD98 (5 ' - AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAG CAG- 3' (配列番号 51) )、 EcoRI mCD98 (5，- CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AAG TGG ACA TGA AA-3 ' (配列番号 52) )、 NotImCD98L (5 ' -AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CAC AAA GGG GAA CTG TAA CAG CA- 3， （配列番号 53 ) )、 cCD98D2-F (5， - TCA TTC TGG ACC TTA CTC CCA ACT ACC— 3， （配列 番号 54) )、 cCD98D2- R(5，- GGT AGT TGG GAG TAA GGT CCA GAA TGA-3' (配列番号 55) )、 cCD98 D3- F (5，- TGC TCT TCA CCC TGC CAG GGA CCC CTG TTT T-3' (配列番号 56) )、 cCD98 D3- R(5， - AAA ACA GGG GTC CCT G GC AGG GTG AAG AGC A- 3 ' (配列番号 57) )を合成した。 PCRを行うにあたり铸 型として用いたのは、 mCD98(GenBank/EMBL/DDBJ accession no.U25708)および ヒト CD98をコードする cDNAを保持するプラスミドベクター pcDNA3.1- mCD98および 実施例 1で作製した pEF6/hCD98である。
[0131] cDNAの増幅には、東洋紡社の KOD- Plusを用いた。 cDNA 15 μ 1、 lOxKOD- Plus B uffer 5 1、 dNTP mix 5 1、 KOD— Plus 1 μ 1、 25mM MgSO 3 1、 Fプライマーおよび
4
Rプライマーからなる組成の反応液を再蒸留水にて最終容量 50 1とし、 PCRに供した
[0132] cDNAlと Fプライマー 1と Rプライマー 1、または、 cDNA2と Fプライマー 2と Rプライマ 一 2、を用い、 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C90秒（94°C15秒、 55°C30秒、 68°C50秒）の サイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 PCR 増幅産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。この PCR増幅産物を其々 PI 、 P2と命名した。次に P1と P2の 2〜3倍希釈液を各 5 1入れ、プライマー無しで 94°C15 秒、 55°C30秒、 68°C2分のサイクルを 3回繰り返した。この反応液を 99°C5分間加熱後 5〜10倍希釈し、 5 1を铸型として Fプライマー 1と Rプライマー 2を用い、 94°C15秒、 60 (55°C) °C30秒、 68°C2分のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロース ゲル電気泳動に供し、 PCR増幅産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。
[0133] キメラ CD98-1,キメラ CD98-2,キメラ CD98-3は、それぞれ、 (cDNAl ： Fプライ マー 1 ： Rプライマー 1; cDNA2と Fプライマー 2： Rプライマー 2)の以下の組み合わ せ（pEF6/hCD98： EcoRIhCD98U： cCD98D2— R; pcDNA3.1— mCD98： cCD98 D2-F： NotImCD98L)、 (pEF6/hCD98： EcoRIhCD98U:cCD98D3-R; pcDNA3.1 -mCD98： cCD98D3-F： NotImCD98L) , (pcDNA3.1- mCD98： EcoRImCD98U ： cCD98D2-R; pEF6/hCD98： cCD98D2- F： NotIhCD98L)で作製した。各 PCR 増幅 cDNA断片を EcoRI、 Notlで消化し、同一酵素で解裂されていた pEF6myc- His/B sdベクター (インビトロジェン社製）に連結した。挿入部分の DNA塩基配列を決定し、 PCR増幅して挿入された配列が、铸型とした遺伝子配列と相違がな ヽことを確認した 。実施例 2と同法で各ベクターを実施例 1で作製した pEFl/hLATl-EGFPベクターと 共に L929細胞に発現し、実施例 10と同法の FACS解析で各 FITC標識抗体の結合を 調べた。その結果（図 4)、 K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6,抗体は、市販の FITC標識 抗ヒト CD98抗体（クローン UM7F8、ベタトンディッキンソン社製 Ca.No.556076)と同 様キメラ CD98-3を発現した L929細胞にのみ結合し hCD98の 372アミノ酸残基から 5 30アミノ酸残基の領域力これら抗体の結合に重要であることが示唆された。一方、 C2 抗体と 1-40-1中和抗体は、キメラ CD98-2にのみ強く結合し、 hCD98の 104アミノ酸 残基- 371アミノ酸残基がこれら抗体の結合に重要であることが判った。
[0134] 実施例 12：各モノクローナル抗体のアミノ酸取込み抑制活性
各モノクローナル抗体がヒト膀胱癌細胞株 T24細胞のアミノ酸の取り込みに影響す るかを基質としてロイシンを用い、基質の取り込み実験を金井らの方法 (Kim et al, Bi ochim. Biophys. Acta 1565: 112-122, 2002)に準じて、以下のように行った。 lxlO5の T24細胞株を 24—穴培養プレートに播種し、 10%FCS入り MEM培地（SIGMA ALDRIC H社製)で 37°C、 5%CO下で 2日間培養した。培養後培地を除き、 200 μ g/mLの抗
2
体を含む HBSS(-) (Na+-free)を 0.25mL/穴加え、 37°C、 5%C02下でさらに 10分間培 養した。 C2, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6、 1-40-1,抗 DNPヒト抗体は、組み換え体 抗体を、 5-80-1はハイプリドーマ由来の抗体を使用した。その後、上清を除き、 l ^u M の14 C- Leu (MORAVEK BIOCHEMICALS社製)を含む HBSS (-) (Na+- free)を 0.5mL/ 穴加え 1分間培養した。氷冷 HBSS (-) (Na+-free)溶液で 3回洗浄後、 0.1N水酸化ナト リウムを 0.5mL/穴添カ卩し細胞を回収した。回収された溶液中の14 C-Leu量は、 Liquid scintillation counter model LSC- 5100 (ALOKA社製)で測定した。各細胞の14 C- Leu 取込み量は、回収した溶液中のタンパク質濃度を BCA法で測定し、タンパク質量で 標準化した。その結果（図 5)、 1-40-1, K3, C2IgGl、 10-60-7, 3-69-6は、コントロー ル抗体 (DNPヒト抗体)より有意にロイシンの取り込みを抑制した。以下の実験は、有 意にロイシンの取り込みを抑制した 1-40-1、 K3、 C2IgGl、 10-60-7、および 3-69-6を 用いて実施した。
[0135] 実施例 13：各モノクローナル抗体の抗 hCD98/hLATl抗体の蛍光標識
各抗体の蛍光標識化は以下の方法で行った。蛍光物質 Fluorescein isothiocyanate (FITC,シグマ社製)を付属の説明書に従い、実施例 4から実施例 8で調製した各組 み換え体抗体に結合させた。 200mMの炭酸ナトリウム緩衝液 (pH8.3〜8.5)で l〜2mg /mlの抗体に、ジメチルフオルムアミドに溶かした FITCを抗体分子の 20〜40倍量添カロ し、撹拌しながら室温 2〜3時間反応させた。 PBSで平衡ィ匕したゲルろ過カラム (NAP5 、アマシャム'フアルマシア'バイオテック社製）に混合液を供し、抗体に未結合の FIT Cを除去した。この条件で抗体 1分子に約 3つの FITCが結合した。蛍光標識された抗 体は何れも hCD98の発現が確認されているヒト大腸癌細胞株 DLD-1細胞株に結合 した。
実施例 14 :各モノクローナル抗体のヒド末梢血由来 T細朐、 B細朐、単球細胞と正常 ヒト大動脈内皮細胞 (HAEC)への反]^件
単球細胞、活性化 T細胞、培養した正常内皮細胞では CD98が発現していることが 知られている。そこで、各抗体のヒト末梢血由来 T細胞、 B細胞、単球細胞とヒト大動 脈内皮細胞 (HAEC)への反応性を調べた。ヒト末梢血由来細胞は以下の方法で調 製した。 1mlへパリン（ノボ社製）入りヒト末梢血 10mlを PBSで 2倍に希釈し、 20mlの Fico 11-Paque PLUS液（アマシャム 'フアルマシア'バイオテック社製）上に重層し、 1500 rp mで 30分間遠心後回収した。 PBSで 2回洗浄し単核球細胞を調製した。一部の単核 球細胞は、 10 /z g/mlの Phytohaemagglutinin (シグマ社製、 PHA)、 10%FCS、 O.lmM非 必須アミノ酸溶液 (ギブコ社製）、 5.5x10— 6M 2-メルカプトエタノール (ギブコ社製）、 P enicillin/Streptomycin/Glutamine (ギブコネ土製）入り RPMI培地（ギブコネ土製）で 5%CO
2
、 37°C下 72時間培養した。 PHA刺激によりヒト末梢血由来 T細胞、 B細胞に活性ィ匕マ 一力一である CD25発現が観察された (FITC標識抗ヒト CD25抗体 (ベタトンディッキン ソン社製 Ca.555431)を用いた FACS解析）。調製された各細胞は Staining Buffer (SB) に 2xl06/mlで浮遊させ、細胞浮遊液を 96-ゥエル丸底プレート（ベタトンディツキンソ ン社製）に分注した (50 μ 1/ゥエル)。実施例 13で作製された各々の FITC標識抗体を 5 μ g/mlの濃度で抗ヒト CD3抗体（ベタトンディッキンソン社製 Ca.No.555340)あるい は抗ヒト CD14抗体（ベタトンディッキンソン社製 Ca.No.347497)あるいは抗ヒト CD19 抗体 (ィムノテック社製 Ca.No.IM1285)と共に氷温下 30分間反応させた。陽性コント口 ールとして市販の FITC標識抗ヒト CD98抗体（クローン UM7F8)、陰性コントロールは FITC標識抗 DNPヒ HgGl抗体を用いた。 SBで 1回洗浄した後、 300 1の FACS緩衝液 に懸濁し、 FACSで各抗体の反応性を調べた。
[0137] その結果、 C2IgGl以外の抗体は UM7F8と同様の結合様式を示し、単球細胞、活 性化 T細胞、活性化 B細胞に有意に結合した（図 6および図 7)。一方、 C2IgGlは、い ずれの細胞に対し有意な結合は観察されな力つた（図 6および図 7)。
[0138] HAEC (Cambrex社製）は、添付説明書に従!ヽ培養し、継代数力 回以内の細胞を 用いた。培養した HAECに対する C2IgGl、 K3、 7-95-8、 10-60-7、 3-69-6、および 1- 40-1抗体の反応性を、上記と同法にて調べた。 3.2η§/πι1〜50
Figure imgf000045_0001
体反応させた結果、 Κ3、 7-95-8、 10-60-7、 3-69-6、 1-40-1は HAECに結合したが、 C2IgGlは、 HAECに結合しなかった（図 8)。
[0139] 一方、同条件下でヒト大腸癌細胞株 DLD-1へ反応させると何れの抗体もある条件 下 (本実施例では、 3 /z gZml以下の抗体濃度)では、 UM7F8より DLD-1癌細胞特異 性が高いことが判った（図 8)。特に C2IgGlは、癌特異性の高い抗体であることが強く 示唆された。以下の実験は、 C2IgGl、 K3、 3-69-6を用いて実施した。
[0140] 実施例 15：がん細胞株に針する各モノクローナル杭体の反]^件
C2IgGl、 K3、および 3-69-6の大腸癌細胞株 (DLD-1)、肺癌細胞株（H226)、前立 腺癌細胞株（DU145)、メラノーマ細胞株（G361、 SKMEL28, CRL1579)、非ホジキン リンパ腫株 (Ramos)、膀胱癌細胞株 (T24)、乳癌細胞株（MCF、 MDA- MB- 231)、脾 臓癌細胞株 (HS766T)、多発性骨髄腫細胞株 (IM9)、赤芽球系白血病株 (K562、図 3参照）に対する各抗体の反応性の検討を実施例 9と同法の FACS解析で行った。細 胞株を Staining Buffer(SB)で 2xl06/mlに調製し、その細胞浮遊液を 96ゥエル丸底プレ ート（ベタトンディッキンソン社製）に分注した (50 μ 1/ゥエル)。 5 μ gZmlに調製され た抗体あるいは FITC標識抗体を 50 1/ゥヱルカ卩ぇ、氷温下 30分間反応させた。陰 性コントロールは抗 DNPヒト IgGl抗体あるいは FITC標識抗 DNPヒト IgGl抗体を用い た。 SBで 1回洗浄した後、 RPE蛍光標識ャギ抗ヒト ¾ γ F(ab')抗体（SuthernBiotech
2
社製）を SBで 200倍希釈したもの 50 1を加え、氷温下 30分間インキュベートした。 FI TC標識抗体の場合は、この操作は実施しなカゝつた。 SBで 1回洗浄した後、 300 1の FACS緩衝液に懸濁し、 FACSで各細胞の平均蛍光強度を測定した。 [0141] その結果、何れの抗体も各種癌細胞株に結合活性を有する抗体であることがわか つた（図 9、図 10)。また、何れの抗体も Colo205、 SW480、 SW620、 LOVO、 LS180、 および HT29のヒト大腸癌細胞株に強く結合した。
[0142] 実施例 16 :マウス癌モデルでの K3、 C2IgGl、 3-69-6の抗腫瘍効果
実施例 4から実施例 8で調製された組み換え体モノクローナル抗体 K3、 C2IgGl、お よび 3-69-6の抗腫瘍効果を、以下に記載する方法に従ってマウス癌モデルを用いて 検討した。
[0143] 5週令の Balb/cヌードマウス（日本クレア (株)社より購入)を各個体の体重をもとに 5 匹を 1群として群分けした。 100 μ 1の PBSに 5 X 106の大腸癌細胞 Colo205と 5 μ gの抗 体を混合したものを腹部皮下に移植した。移植後 2日目、 4日目、 6日目に 100 μ g/10 0 1の溶媒（1%マウス血清入り PBS)に溶解させた抗体をマウス腹腔内に投与し、腫 瘍の大きさを測定した。抗体の陰性コントロールとして溶媒を使用した。
[0144] 以上の実験の結果は、図 11に示される通りであった。図中の各折れ線は個別のマ ウスのデータを示す。コントロール群は、 5日目には総ての個体で癌細胞株の生着が 観察され、 12日目の腫瘍の平均体積 (長径 X短経 X短経 χθ.5で算出）士 SEは、 165.55 ±31.71mm3であった。一方、 C2IgGl群は、 1個体のみコントロール群と同様な腫瘍増 殖を示したが (12日目に腫瘍塊が 169.44 mm3),他の個体は C2IgGl抗体投与により強 ぃ抗腫瘍活性が観察され、 28日目のコントロール群の腫瘍塊の平均体積士 SEは 197 7.64±442.04で、 C2IgGl抗体投与群は 775.31 ±622.47であり、 C2IgGl抗体は有意 に Colo205癌細胞由来腫瘍の増殖を抑制した (p〈0.01)。 K3群と 3-69-6群は総ての 個体で 30日以上経過しても癌の生着は観察されなかった。また、各群の平均体重は 、コントロール群のみ低下した (移植 30日目には K3群より約 20%低下)。
[0145] これらの結果より、 K3、 C2IgGl、および 3_69_6は、癌細胞増殖抑制活性を有する抗 体であることが観察された。
[0146] 実施例 17 :マウス同系担癌モデルに対する C2IgGlモノクローナル抗体の抗腫瘍効 実施例 4から実施例 8で調製された組み換え体モノクローナル抗体 C2IgGlの抗腫 瘍効果を、以下に記載する方法に従ってマウス同系癌モデルを用いて検討した。 [0147] 実施例 2で調製した hCD98/hLATl— E発現 CT26細胞 5 X 106cellsを移植した Balb/c (雌)を、腫瘍の体積から 5匹ずつの 2群に分けた。腫瘍体積が約 90mm3 (長径 X短経 X短経 χθ.5で算出）に成長した時点 (0日目）と、 3日目、 5日目に 100 /z g/100 /ζ 1 の溶媒（1%マウス血清入り PBS)の C2IgGlをマウス腹腔内に投与した。 Controlは溶 媒を投与した。その結果、 C2IgGlは有意に生着腫瘍の増殖を強く抑制する活性があ ることが観察された（図 12)。
[0148] 実施例 18： C2IgGlおよび K3抗体のサル細胞への交叉反応性
C2IgGl、および K3のサル細胞 (COS-7細胞)への交叉反応性を FACS解析で調べ た。 2x106/mlの細胞を Staining Buffer (SB)に浮遊させた。細胞浮遊液を 96— well丸 底プレート（ベタトンディッキンソン社製）に分注した（50 μ 1/ゥエル)。 SBで 5 μ g/mL に調製された抗体を 50 /z lカ卩え、氷温下 30分間反応させた。陰性コントロールは DNP ヒ HgGl抗体を用いた。 SBで 1回洗浄した後、 SBで 200倍希釈した RPE蛍光標識ャギ 抗ヒト Ig γ F(ab ')抗体（SuthernBiotech社製）を 50 μ 1/ゥエルを加え、氷温下 30分間
2
反応させた。 SBで 1回洗浄した後、 300 /z lの FACS緩衝液に懸濁し、 FACSで抗体の 結合を示す蛍光強度を測定した。その結果、何れの抗体も COS-7細胞株に結合し、 C2IgGl、K3はサル細胞に交叉反応性を有する抗体であることがわかった（図 13)。
[0149] 実施例 19 :マウス担癌モデルに針する C2kGlの効果
C2IgGlの抗腫瘍活性を、以下に記載する方法に従ってマウス担癌モデルを用いて 検討した。
[0150] 6週令の Balb/c- SCIDマウス（日本クレア (株)社より購入)の背部皮下に、バーキット リンパ腫細胞株 Ramos (ATCCより購入)を 3 X 106/マウス個体で移植した。移植 13日 後に、生着した腫瘍の大きさを測定し、腫瘍の大きさが 30〜140mm3の担癌マウスを 6 匹 1群として群分けした。担癌マウスの腹腔内に、 C2IgGlを lOOmg/マウス個体（200ml の PBSに溶解したもの）をそれぞれ 3回/週で投与した。陽性コントロールとして Rituxi mab (全薬工業株式会社)、陰性コントロールとして、 PBSを使用した。腫瘍体積および 体重を週 3回測定した。腫瘍塊の長径、短径、高さを測定し、（長径） X (短径） X (高 さ） ÷ 2の値を腫瘍体積とした。
[0151] 結果を図 14に示す。 C2IgGl投与により、腫瘍移植後 16日目から有意な腫瘍増殖 抑制効果が認められた。
[0152] 実施例 20： C2IgGlNSアミノ酸改変体
C2IgGlおよび C2IgGlNSはともに組換え抗体を調製した際に凝集体含量が高い。 そこで、配列番号 47で表される C2IgGlNSの軽鎖可変領域配列において、翻訳開始 コドン ATGに相当する 5番目の M (メチォニン）を 1位アミノ酸とし、そこ力も数えて 11 7番目の I (イソロイシン)をその他のアミノ酸に置換した改変体の作製を行った。
[0153] C2IeGlNS/ II 17Nベクターの調製
軽鎖 117位イソロイシンをァスパラギンに置換した C2IgGlNS / II 17Nを調製すること を目的とし、実施例 6で調製した N5KG1-Val C2IgGlNSベクターを铸型として、 Gene Editor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis System (プロメガ社 No.Q9280)を用いた 部位特異的変異導入法により、アミノ酸置換体をコードする各種の変異 DNAを調製 した。
[0154] 変異導入用オリゴヌクレオチド (5，末端リン酸ィ匕済み）として、 C2NS Lc 117I/HYND - p : (5，- TCAGTATGGT AGCTCACCTN ATTTCACTTT CGGCCCTGGG Aces' (N=A-T-G-C) (配列番号 69) )を用いた。 目的の変異導入用オリゴヌクレオチドと 上記キット付属の Selection Oligonucleotideを铸型 DNAとアニーリングさせて変異導 入鎖を合成した後、 GeneEditor™ Antibiotic Selection Mix存在下では変異体のみが 増殖することを利用して変異体を選択した。より具体的には、 dsDNAテンプレートをァ ルカリ条件下（0.2M NaOH、 0.2mM EDTA (最終濃度））室温で 5分間インキュベートし た後、 2M酢酸アンモ-ゥム（pH4.6)を 10分の 1容量カ卩えて中和してからエタノール 沈殿により回収した。アルカリ変性処理した铸型 DNAに、変異導入用オリゴヌクレオ チドと新しい抗生物質而性獲得用 Selection Oligonucleotide (Bottom Select 01igo、 5 '末端リン酸ィ匕 5' - CCGCGAGACC CACCCTTGGA GGCTCCAGAT TTATC- 3 ' (配列番号 85) )、及び、キット添付のアニーリングバッファーをカ卩えた後、 75°Cで 5分 間保温し、 37°Cにゆっくり下げることによりアニーリングを行なった。次に、変異鎖の 合成と連結のために、キット付属の Synthesis 10 X buffer、 T4 DNA Polymerase,及び T4 DNA ligaseをカ卩えて、 37°Cで 90分反応を行なった。 GeneEditor™ Antibiotic Selec tion Mix存在下でコンビテントセル BMH 71-18 mutSに形質転換して培養した形質転 換体大腸菌よりプラスミド DNAを調製し、更にその DNAをエレクト口ポレーシヨン法に より、 ElectroMAX.DHlOB Cells (インビトロジェン社 No.18290-015)を形質転換後、 G eneEditor™ Antibiotic Selection Mixを含む LBプレートに播種した。プレートに生じた 形質転換体を培養して、プラスミド DNAを精製し DNA塩基配列を解析した。 DNA塩基 配列の結果、 目的とするアミノ酸変異が導入された C2IgGlNS変異体の発現ベクター を取得した。得られた 1アミノ酸置換変異体蛋白を発現するプラスミド DNAを N5KG1- Val C2IgGlNS/I117Nベクターと命名した。
[0155] C2IeGlNS/ II 17Cベクターの調製
軽鎖 117位イソロイシンをシスティンに置換した C2IgGlNS / II 17Cを調製することを 目的とし、実施例 6で調製した N5KG1-Val C2IgGlNSベクターを铸型として、 GeneE ditor™ in vitro Site-Directed Mutagenesis System (プロメガ社 No.Q9280)を用いた部 位特異的変異導入法により、アミノ酸置換体をコードする各種の変異 DNAを調製した
[0156] 変異導入用オリゴヌクレオチド (5，末端リン酸ィ匕済み）として、 C2NS Lc 117I/GRC- p
(5，― TCAGTATGGT AGCTCACCTB GTTTCACTTT CGGCCCTGGG ACC— 3' (B =C -G-T) (配列番号 70) )を用いた。 目的の変異導入用オリゴヌクレオチドと上記キッ ト付属の Selection Oligonucleotideを铸型 DNAとアニーリングさせて変異導入鎖を合 成した後、 GeneEditor™ Antibiotic Selection Mix存在下では変異体のみが増殖する ことを利用して変異体を選択した。より具体的には、 dsDNAテンプレートをアルカリ条 件下（0.2M NaOH、 0.2 mM EDTA (最終濃度））室温で 5分間インキュベートした後、 2M酢酸アンモ-ゥム（pH4.6)を 10分の 1容量カ卩えて中和して力 エタノール沈殿に より回収した。アルカリ変性処理した铸型 DNAに、変異導入用オリゴヌクレオチドと新 しい抗生物質而性獲得用 Selection Oligonucleotide (Bottom Select 01igo、 5，末端リ ン酸ィ匕 5' - CCGCGAGACC CACCCTTGGA GGCTCCAGAT TTATC- 3 配列 番号 85) )、及び、キット添付のアニーリングバッファーをカ卩えた後、 75°Cで 5分間保温 し、 37°Cにゆっくり下げることによりアニーリングを行なった。次に、変異鎖の合成と連 結のために、キット付属の Synthesis 10 X buffer, T4 DNA Polymerase,及び T4 DNA 1 igaseを加えて、 37°Cで 90分反応を行なった。 GeneEditor™ Antibiotic Selection Mix 存在下でコンビテントセル BMH 71-18 mutSに形質転換して培養した形質転換体大 腸菌よりプラスミド DNAを調製し、更にその DNAをエレクト口ポレーシヨン法により、 Ele ctroMAX.DHlOB Cells (インビトロジェン社 No.18290- 015)を形質転換後、 GeneEdit or™ Antibiotic Selection Mixを含む LBプレートに播種した。プレートに生じた形質転 換体を培養して、プラスミド DNAを精製し DNA塩基配列を解析した。 DNA塩基配列の 結果、 目的とするアミノ酸変異が導入された C2IgGlNS変異体の発現ベクターを取得 した。得られた 1アミノ酸置換変異体蛋白を発現するプラスミド DNAを N5KG1-Val C2I gGlNS/I117Cベクターと命名した。
[0157] C2IeGlNS/ 117ILベクターの調製
軽鎖 117位イソロイシンをロイシンに置換した C2IgGlNS / I117Lを、実施例 6で調製 した N5KG1-Val C2IgGlNSベクターを铸型として以下の方法により調製した。
[0158] DNAの増幅には、東洋紡社の KOD- Plusを用いた。 cDNA 1 μ 1、 lOxKOD- Plus Buff er 5 1、 dNTP mix 5 1、 KOD— Plus 1 μ 1、 25mM MgSO 2 1、 Fプライマーおよび Rプ
4
ライマー力もなる組成の反応液を再蒸留水にて最終容量 50 1とし、 PCRに供した。
[0159] C2NS Lc 117IL R(5，— GGTCCCAGGG CCGAAAGTGA ATAGAGGTGA GCTAC CATAC TGCTG -3，（配列番号 71) )を合成し、 C2NS Lc 117IL Rと C2- 1 Lc Bgl II F (5， - AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC -3，（配列番号 18) )を用い、 N5KG1- Val C2IgGlNSベクターを铸型として 9 4°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロ ースゲル電気泳動に供し、 PCR増幅産物を QIAquick gel extraction kitにより精製し た。この PCR増幅産物を C2NSI117L— Fと命名した。次に、 C2NS Lc 117IL F (5， - G CAGTATGGT AGCTCACCTC TATTCACTTT CGGCCCTGGG ACC - 3' (配列番 号 72) )と C2NS EcoRI R (5，— CCGGAATTCA ACACTCTCCC CTGTTGAAGC TC TTTGTGAC GG -3' (配列番号 73) )を用い、 N5KG1- Val C2IgGlNSベクターを铸 型として 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 PCR増幅産物を QIAquick gel extraction kitによ り精製した。この PCR増幅産物を C2NSI117L— Rと命名した。次に C2NSI117L— Fと C 2NSI117L— Rの 2倍希釈液を各 5 μ 1入れ、プライマー無しで 94°C15秒、 55°C30秒、 6 8°C60秒のサイクルを 3回繰り返した。この反応液を 99°C5分間加熱後 5倍希釈し、 5 1を铸型として C2- 1 Lc Bgl II Fプライマーと C2NS EcoRI Rプライマーを用い、 94°C15 秒、 55°C30秒、 68°C60秒のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァガロース ゲル電気泳動に供し、 PCR増幅産物を QIAquick gel extraction kitにより精製した。こ の PCR増幅 cDNA断片を BglII、 EcoRIで消化し、同一酵素で解裂されていた前記 C2 重鎖遺伝子が入った N5KG1-Val Larkベクターに導入した。挿入部分の DNA塩基配 列を決定して、 PCR増幅して挿入された配列に铸型とした遺伝子配列と相違がない ことを確認した。得られた 1アミノ酸置換変異体蛋白を発現するプラスミド DNAを N5K Gl-Val C2IgGlNS/I117Lベクターと命名した。
[0160] C2IgGlNS/ 117IMベクターの調製
軽鎖 117位イソロイシンをメチォニンに置換した C2IgGlNS / I117Mを、実施例 6で 調製した N5KG1-Val C2IgGlNSベクターを铸型として以下の方法により調製した。
[0161] DNAの増幅には、東洋紡社の KOD- Plusを用いた。 cDNA 1 μ 1、 lOxKOD- Plus Buff er 5 1、 dNTP mix 5 1、 KOD— Plus 1 μ 1、 25mM MgSO 2 1、 Fプライマーおよび Rプ
4
ライマー力もなる組成の反応液を再蒸留水にて最終容量 50 1とし、 PCRに供した。
[0162] C2NS Lc 117IM R(5，— GGTCCCAGGG CCGAAAGTGA ACATAGGTGA GCTA CCATAC TGCTG -3' (配列番号 74) )を合成し、 C2NS Lc 117IM Rと C2- 1 Lc Bgl II F (5， - AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC T TC TCT TC -3' (配列番号 18) )を用い、 N5KG1-Val C2IgGlNSベクターを铸型とし て 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァ ガロースゲル電気泳動に供し、 PCR増幅産物を QIAquick gel extraction kitにより精 製した。この PCR増幅産物を C2NSI117M— Fと命名した。次に、 C2NS Lc 117IM F (5 ' - GCAGTATGGT AGCTCACCTA TGTTCACTTT CGGCCCTGGG ACC - 3' (配 列番号 75) )と C2NS EcoRI R (5， - CCGGAATTCA ACACTCTCCC CTGTTGAAG C TCTTTGTGAC GG -3，（配列番号 76) )を用い、 N5KG1- Val C2IgGlNSベクター を铸型として 94°C15秒、 60°C30秒、 68°C1分のサイクルを 25回繰り返した。この反応 液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 PCR増幅産物を QIAquick gel extraction k itにより精製した。この PCR増幅産物を C2NSI117M— Rと命名した。次に C2NSI117M Fと C2NSI117M— Rの 2倍希釈液を各 5 μ 1入れ、プライマー無しで 94°C15秒、 55°C 30秒、 68°C60秒のサイクルを 3回繰り返した。この反応液を 99°C5分間加熱後 5倍希 釈し、 5 μ 1を铸型として C2- 1 Lc Bgl II Fプライマーと C2NS EcoRI Rプライマーを用い 、 94°C15秒、 55°C30秒、 68°C60秒のサイクルを 25回繰り返した。この反応液を 0.8%ァ ガロースゲル電気泳動に供し、 PCR増幅産物を QIAquick gel extraction kitにより精 製した。この PCR増幅 cDNA断片を BglII、 EcoRIで消化し、同一酵素で解裂されてい た前記 C2重鎖遺伝子が入った N5KG1-Val Larkベクターに導入した。挿入部分の D NA塩基配列を決定して、 PCR増幅して挿入された配列に铸型とした遺伝子配列と相 違がないことを確認した。得られた 1アミノ酸置換変異体蛋白を発現するプラスミド DN Aを N5KG1— Val C2IgGlNS/I117Mベクターと命名した。
[0163] C2kGlNSアミノ酸己 栾体の作製
実施例 7で示した方法により、 C2IgGlNS/ I117Lベクター、 C2IgGlNS/ I117Mベクタ 一、 C2IgGlNS/ I117N、 C2IgGlNS/ I117Cベクターを添付説明書に従い FreeStyle29 3細胞 (インビトロジヱン社製)へ導入し、組み換え型抗体を発現させた。抗体の精製 は実施例 8に示した方法を一部改良して行った。 6日目の培養上清を回収し、 Sterifli p-GP(MILLIPORE,SCGP00525)で filtrationすることにより細胞等の雑排物を除去し た。抗体を含む培養上清を Protein A (アマシャム）を用い、吸着緩衝液として PBS、溶 出緩衝液として 20mMクェン酸ナトリウム緩衝液 (pH3.4)を用いてァフィユティー精製 した。溶出画分は 200mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0)を添カ卩して pH5.5付近に調 整した。調製された抗体溶液は、 vivaspin6 (10KMW cut VIVASCIENCE,VS0601)を 用 、て濃縮 (3000rpm)し、さらに PBSを添カ卩し遠心することにより PBSに置換された精 製抗体を取得した。精製抗体の濃度は、 280nmの吸光度を測定し、 lmg/mlを 1.45 0 ptimal densityとして算出した。
[0164] C2kGlNSアミノ酸己 栾体の凝暴体含有率の測定
得られたアミノ酸改変抗体 10ug (0.1mg/ml)を用いて、各精製抗体の凝集体含有率 を測定した。
[0165] 抗体溶液の凝集体含有率は、高速液体クロマトグラフ装置（島津社製)及び TSK— G3000 SWカラム（東ソ一社製）と、溶媒として 20mMリン酸ナトリウム、 500mM NaCl pH 7.0を用いて分析を行った。溶出位置をゲルろ過 HPLC用分子量マーカー (オリエンタ ル酵母社) (Cat No.40403701)と比較することで、抗体蛋白の単量体とそれ以上の凝 集体のピークを同定して、それぞれのピーク面積力も凝集体の含有率を算出した。
[0166] 結果を図 15に示す。図 15によれば、上述のアミノ酸の改変により、凝集体含有率 が減少することが明ら力となる。
[0167] C2kGlNSアミノ酸己 栾体の凝暴体含量の測定
実施例 14および 15の方法に従い、 C2IgGlNSアミノ酸改変体の腫瘍細胞株、ヒト C D98/ヒト LAT1強制発現株、および HAECに対する反応性を、 FACSにより解析した。
[0168] 結果を図 16Aおよび図 16Bに示す。上述のアミノ酸改変抗体、特に C2IgGlNS/Ill 7Lは、ヒト CD98と LAT1を強制発現させた L929細胞に結合し、無処置の L929に 対しては結合しな力つた（図 16A)。また、これらのアミノ酸改変抗体は、 HAECに結 合せず、 colo205、 Ramos,および DLD— 1といった各種癌細胞に対して結合性を 示した（図 16B)。
[0169] これらの結果は図 2Aおよび図 8に示された C2IgGlの結合特性と同様であることか ら、上述のアミノ酸改変抗体、特に C2IgGlNS/I117Lは、凝集体含有率が低ぐ癌細 胞に対して C2IgGlと同様の結合特異性を有し、かつ C2IgGlと同様の抗腫瘍活性が 期待できる抗体であると 、える。
[0170] < C2IgGlNSアミノ酸改変体の重鎖可変領域アミノ酸配列（C2IgGl重鎖可変領域 アミノ酸配列と同一） > (配列番号 43)
Figure imgf000053_0001
TAVYYCARQGTGLALFDYWGQGTLVTVSS
< C2IgGlNSアミノ酸改変体の重鎖可変領域核酸配列（C2IgGlNS重鎖可変領 域核酸配列と同一） > (配列番号 42) CCTGGTCACCGTCTCCTCA
< C2IgGlNS/l 17ILの軽鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 77)
Figure imgf000054_0001
QQYGSSPLFTFGPGTKVDIK
< C2IgGlNS/l 17ILの軽鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 78)
Figure imgf000054_0002
< C2IgGlNSZl l7IMの軽鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 79)
Figure imgf000054_0003
QQYGSSPMFTFGPGTKVDIK
< C2IgGlNS/l 17IMの軽鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 80) [0176] < C2IgGlNSZl l7INの軽鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 81)
Figure imgf000055_0001
QQYGSSPNFTFGPGTKVDIK
< C2IgGlNSZl 17INの軽鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 82)
Figure imgf000055_0002
[0178] < C2IgGlNSZl l7ICの軽鎖可変領域アミノ酸配列 > (配列番号 83)
Figure imgf000055_0003
QQYGSSPCFTFGPGTKVDIK
< C2IgGlNS/l 17ICの軽鎖可変領域核酸配列 > (配列番号 84)
W 丄 V丄 丄 OWV OVOOO丄:) 00 丄丄丄:) V 丄丄丄 0丄丄 O
089.S0/.00Zdf/X3d P9 96 動 OAV

Claims

請求の範囲
[1] 癌細胞の細胞膜由来の CD98でありかつアミノ酸輸送活性を有するタンパク質と複 合体を形成している CD98に特異的結合能を有することを特徴とする、ヒトモノクロ一 ナル抗体またはその機能的断片。
[2] 抗腫瘍活性を有する、請求項 1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的 断片。
[3] 前記 CD98が発現している細胞内へのァミノ輸送を阻害する、請求項 1に記載のヒ トモノクローナル抗体またはその機能的断片。
[4] 正常ヒト血管内皮細胞、正常ヒト末梢血単球、およびリンパ球に結合しない、請求項
1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
[5] アミノ酸輸送活性を有するタンパク質が LAT1である、請求項 1に記載のヒトモノクロ ーナル抗体またはその機能的断片。
[6] CD98がヒト CD98である、請求項 1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機 能的断片。
[7] 抗体重鎖定常領域のサブクラスが IgGである、請求項 1に記載のヒトモノクローナル 抗体またはその機能的断片。
[8] 下記 (a)〜 (c)の 、ずれかの二配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域として 有する、請求項 1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片：
(a)配列番号 29および 31、
(b)配列番号 41および 47、
(c)配列番号 43および 47。
[9] 下記 (d)〜 (g)の 、ずれかの二配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域として 有する、請求項 1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片：
(d)配列番号 43および 77、
(e)配列番号 43および 79、
(f)配列番号 43および 81、
(g)配列番号 43および 83。
[10] 可変領域のアミノ酸配列が、プラスミドベクター K3ZpCR4 (FERM BP— 10552) または C2IgGl/pCR4 (FERM BP— 10551)力も得られる、ベクター pCR4に由 来する配列を含まな 、Bg III - BsiWI断片および Sail - Nhel断片によってコードさ れるものである、請求項 1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
[11] 膀胱癌細胞 T24のロイシン取り込みに対し、有意な阻害効果を有する、請求項 1に 記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
[12] ヒト CD98の 1〜529アミノ酸配列（配列番号 66)中の連続または不連続の少なくと も 8個のアミノ酸残基によって構成されるェピトープを認識するものである、請求項 1 に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
[13] ヒト CD98の 371〜529アミノ酸の領域の一部分に結合性を有する、請求項 12に記 載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
[14] ヒト CD98の 1〜371アミノ酸の領域の一部分に結合性を有する、請求項 12に記載 のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
[15] 前記機能的断片が、抗体の重鎖および軽鎖可変領域 (Vおよび V )、 Fab, Fab'、
H L
(Fab5 ) 、 Fv、 Fd、 scFv、 sdFvおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるも
2
のである、請求項 1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
[16] 請求項 1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的 断片と、
結合タンパク質、酵素、薬物、毒素、免疫モジュレーター、検出可能部分またはタ グを含む異種ドメインとの結合物。
[17] プラスミドベクター K3ZpCR4 (FERM BP— 10552)または C2IgGlZpCR4 (F ERM BP— 10551)に含まれる、ベクター pCR4に由来する配列以外の配列を有す る核酸。
[18] 請求項 17に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
[19] 請求項 1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的 断片を発現する、細胞。
[20] 請求項 1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的 断片を有効成分として含んでなる、医薬組成物。
[21] 請求項 1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的 断片を有効成分として含んでなる、腫瘍の予防または治療剤。
[22] 前記腫瘍が、 LAT1と複合体を形成して 、る CD98を発現して 、る癌細胞を含む 腫瘍である、請求項 21に記載の予防または治療剤。
[23] 前記腫瘍が、大腸癌または結腸癌である、請求項 21に記載の腫瘍の予防または 治療剤。
[24] 請求項 18に記載のベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体 を取得することを特徴とする、抗体の製造方法。
[25] 下記 (a)〜（c)の 、ずれかの二配列またはその核酸配列縮重物を含む発現べクタ 一を宿主に導入して該宿主を培養し、培養物力 該抗体を取得することを特徴とする 、抗体の製造方法：
(a)配列番号 28および 30、
(b)配列番号 40および 46、
(c)配列番号 42および 46。
[26] 下記 (d)〜 (g)の 、ずれかの二配列またはその核酸配列縮重物を含む発現べクタ 一を宿主に導入して該宿主を培養し、培養物力 該抗体を取得することを特徴とする 、抗体の製造方法：
(d)配列番号 42および 78、
(e)配列番号 42および 80、
(D配列番号 42および 82、
(g)配列番号 42および 84。
[27] 宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、植物および哺 乳動物からなる群力も選択される、請求項 24〜26の 、ずれか一項に記載の製造方 法。
[28] CD98および LAT1をコードする核酸を導入して得られた CD98/LAT1発現細胞 を動物に免疫することを含んでなる、請求項 1〜 15の 、ずれか一項に記載のヒトモノ クローナル抗体またはその機能的断片を取得する方法。
[29] 導入する CD98および LAT1が、ヒトの CD98およびヒト LAT1である、請求項 28に 記載の方法。
[30] 腫瘍を予防または治療する方法であって、治療上有効量の請求項 1〜15のいずれ か一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片を投与することを含ん でなる、方法。
[31] 前記腫瘍が、 LAT1と複合体を形成している CD98を発現している癌細胞を含む 腫瘍である、請求項 30に記載の方法。
[32] 前記腫瘍が、大腸癌または結腸癌である、請求項 30に記載の方法。
[33] 腫瘍の予防剤または治療剤の製造のための、請求項 1〜15のいずれか一項に記 載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片の使用。
[34] 前記腫瘍が、 LAT1と複合体を形成して 、る CD98を発現して 、る癌細胞を含む 腫瘍である、請求項 33に記載の使用。
[35] 前記腫瘍が、大腸癌または結腸癌である、請求項 33に記載の使用。
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