JPWO2007114496A1 - 新規抗cd98抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、癌細胞の細胞膜に由来し、かつアミノ酸輸送活性を有するタンパク質と複合体を形成しているCD98に対し、特異的結合能を有するモノクローナル抗体、およびそれを用いた腫瘍増殖抑制または癌治療の医薬用途に関する。
癌(悪性腫瘍)は、わが国における死亡原因の第一位を占める。その患者数は年々増加してきており、有効性および安全性の高い薬剤や治療法の開発が強く望まれている。これまでの抗癌剤は、しばしば、癌細胞を特異的に殺す能力が低く、正常な細胞にも作用し、多くの薬物有害反応が起きていた。近年、癌細胞に高発現している分子(癌関連抗原)を標的とした抗癌剤の開発が進んでおり、白血病、乳癌、肺癌などにおいて有効な治療手段となってきている。
本発明により提供されるヒト抗体の可変領域をコードする核酸配列を含むプラスミドベクターC2IgG1/pCR4およびK3/pCR4は、平成18年3月14日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国 茨城県つくば市東1丁目1番1中央第6)にそれぞれFERM BP−10551(識別のための表示:C2IgG1/pCR4)および、FERM BP−10552(識別のための表示:K3/pCR4)として寄託されている。
本明細書または図面においてアミノ酸を表記するために用いられるアルファベットの一文字は、各々次に示すアミノ酸を意味する。(G)グリシン、(A)アラニン、(V)バリン、(L)ロイシン、(I)イソロイシン、(S)セリン、(T)スレオニン、(D)アスパラギン酸、(E)グルタミン酸、(N)アスパラギン、(Q)グルタミン、(K)リジン、(R)アルギニン、(C)システイン、(M)メチオニン、(F)フェニルアラニン、(Y)チロシン、(W)トリプトファン、(H)ヒスチジン、(P)プロリン。またDNAを表記するために用いられるアルファベットの一文字の意味は、各々次に示す。(A)アデニン、(C)シトシン、(G)グアニン、(T)チミン。
本発明によるヒトモノクローナル抗体およびその機能的断片(以下、特にことわらない限り、本明細書において「本発明による抗体」と略す)が特異的結合能を有するCD98は、上述のとおり、529アミノ酸残基からなるtype II膜貫通糖タンパク鎖であり、アミノ酸輸送活性を有するタンパク質と細胞膜上でヘテロ二量体を形成しているものである。ここで、アミノ酸輸送活性を有するタンパク質の好ましい具体例としては、LAT1が挙げられる。また、本発明の好ましい態様によれば、CD98はヒトCD98である。なお、ヒトCD98のタンパク質の一次構造は公知であり(配列番号66;GenBank/EMBL/DDBJ accession No. AB018010)、また、ヒトLAT1のタンパク質も公知である(配列番号68;GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018009)。
本発明による抗体は、例えば、以下に述べる方法によって製造することができる。
ヒトCD98/ヒトLAT1若しくはその一部、または抗原の抗原性を高めるための適当な物質(例えば、bovine serum albumin等)との結合物、またはヒトCD98/ヒトLAT1を細胞表面に多量に発現している細胞を、必要に応じて免疫賦活剤(Freund’s Adjuvant等)とともに、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する、またはヒトCD98/ヒトLAT1を組み込んだ発現ベクターを非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫感作を行う。本発明による抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞(ミエローマ細胞)からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、任意の方法(例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等)が挙げられる。
本発明による抗体は、まず、その癌細胞の細胞膜由来のCD98でありかつアミノ酸輸送活性を有するタンパク質と複合体を形成しているCD98への特異的結合能ゆえ、治療用薬剤とコンジュゲートすることによって、癌細胞への薬物の送達またはミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体を形成できる。
ヒトCD98(hCD98, GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018010;配列番号65)およびヒトLAT1(hLAT1, GenBank/EMBL/DDBJ accession no. AB018009;配列番号67)のDNAを保持するプラスミドベクターpcDNA3.1-hCD98およびpcDNA3.1-hLAT1を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行った。完全長ヒトCD98 cDNAの5’末端にEcoRI配列を、その3’末端にNotI配列と終止コドンを付加する為、プライマー5’-CCG GAA TTC CCA CCA TGA GCC AGG ACA CCG AGG TGG ATA TGA -3’(配列番号59)および5’-AAG GAA AAA AGC GGC CGC TCA TCA GGC CGC GTA GGG GAA GCG GAG CAG CAG-3’(配列番号60)を使用し、KOD-PlusDNAポリメラーゼ(東洋紡社製)およびhCD98cDNA(約20ng)を鋳型として、94℃15秒、55℃30秒および68℃1分30秒間、30サイクルのPCR反応を行った。修飾されたhCD98配列をEcoRI−NotI断片として単離し、そして同一酵素で開裂されたpTracer-EF/Bsdベクター(インビトロジェン社製)にライゲートした。得られたプラスミドを鋳型としてCD98 v2 U(5’-AGT CTC TTG CAA TCG GCT AAG AAG AAG AGC ATC CGT GTC ATT CTG -3’(配列番号61))プライマーとCD98 v2 L(5’- CAG AAT GAC ACG GAT GCT CTT CTT CTT AGC CGA TTG CAA GAG ACT -3’ (配列番号62))プライマーを用いて、hCD98DNAの591と594番目(配列番号65における702番目および705番目)のAをGに変えた。得られたプラスミドからEcoRI−hCD98-NotI断片を調製し、同一酵素で開裂されていたpEF6myc-His/Bsd(インビトロジェン社製)ベクターに連結した。得られたプラスミドをpEF6/hCD98と命名した。
hCD98/hLAT1発現細胞の作製は、実施例1で作製された発現ベクターpEF6/hCD98およびpEF1/hLAT1-EGFP(hLAT1-E)をインビトロジェン社製LipofectamineとPlus試薬を用いて、Colon26(CT26)細胞とL929細胞(American Type Culture Collection No.CCL-1)に導入した。遺伝子導入はマニュアルの方法に従い行った。遺伝子導入された細胞を細胞培養用プレート(6ウェルプレート、ベクトンディッキンソン社製)を用い、37℃、5%炭酸ガス下で24時間培養した後、CT26細胞株の場合、ブラストサイジン(5μg/mL)とG418(500μg/mL)入り培地で、L929細胞株の場合、ブラストサイジン(5μg/mL)とG418(1mg/mL)入り培地で、さらに3日間培養した。次に、RPE蛍光標識マウス抗ヒトCD98抗体(ベクトンディッキンソン社製、Ca.No.556076)を用いたFACS VantageでhLAT1-EとCD98陽性細胞を分離した。同様な方法で、hCD98発現L929細胞あるいはhLAT1-E発現L929細胞を調製した。
免疫に用いたマウスは、内因性Ig重鎖およびκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒトIg重鎖遺伝子座を含む14番染色体断片(SC20)およびヒトIgκ鎖トランスジーン(KCo5)を同時に保持する。このマウスはヒトIg重鎖遺伝子座を持つ系統Aのマウスと、ヒトIgκ鎖トランスジーンを持つ系統Bのマウスとの交配により作製した。系統Aは、内因性Ig重鎖およびκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な14番染色体断片 (SC20)を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告(Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol97:722)に記載されている。また、系統Bは内因性Ig重鎖およびκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトIgκ鎖トランスジーン(KCo5)を保持するマウス系統(トランスジェニックマウス)であり、例えばFishwildらの報告(Nat Biotechnol., 1996 Vol14:845)に記載されている。
モノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門(安東民衛ら著作、講談社発行1991)等に記載されるような一般的方法に従って行った。
実施例4で取得した各モノクローナル抗体のサブクラスの同定をFACS解析で行った。2×106/mlのColo205細胞を、1mM EDTA、0.1%NaN3、5%FCS含有PBSのSB(staining buffer)に浮遊させた。細胞浮遊液を96ウェル丸底プレート(ベクトンディッキンソン社製)に分注した(50μl/ウェル)。さらに、実施例4で培養したハイブリドーマの培養上清(50μl)を加えて撹拌し、氷温下30分間反応させてから、遠心分離(2000rpm、4℃、2分)して上清を除去した。ペレットを100μl/ウェルのSBで1回洗浄した後、FITC蛍光標識ウサギ抗ヒトIgμ F(ab')2抗体(ダコサイトメーション社製)をSBで50倍、あるいはRPE蛍光標識ヤギ抗ヒトIgγ F(ab')2抗体(SuthernBiotech社製)をSBで200倍、あるいはRPE蛍光標識ウサギ抗ヒトIgκ F(ab')2抗体(ダコサイトメーション社製)をSBで200倍希釈して加え、氷温下30分間反応させた。SBで1回洗浄した後、300μlのSBに懸濁し、FACS(FACSCan、ベクトンディッキンソン社製)で抗体の結合を示す蛍光強度を測定した。得られた抗体の一部の結果を表1に示す。C2は重鎖がμ鎖で軽鎖がκ鎖で、K3, 3-69-6, 7-95-8, 10-60-7, 1-40-1、および5-80-1は何れも重鎖がγ鎖で軽鎖がκ鎖であった。
C2, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6または1-40-1の各抗体遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築を以下の方法で実施した。
ハイブリドーマを10%FCS含有DMEM培地(ギブコ社製)で培養し、遠心分離により細胞を集めた後、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を添加し、取扱説明書にしたがってTotal RNAを抽出した。抗体cDNAの可変領域のクローニングは、SMART RACE cDNA amplification Kit(クローンテック社製)を用い、添付の説明書にしたがって行った。
5μgのtotal RNAを鋳型として、1st strand cDNAを作製した。
(a) 1st strand cDNA の合成
Total RNA 5μg/3μl、5’CDS 1μl、およびSMART oligo 1μlからなる組成の反応液を70℃で2分間インキュベートした後、5×Buffer 2μl、DTT 1μl、DNTP mix 1μl、そしてSuperscript II 1μlを加え42℃で15時間インキュベートした。さらに、100μlのTricine Bufferを加えた後、72℃で7分間インキュベートし、1st strand cDNAを取得した。
(b) PCRによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅および組換え抗体発現ベクターの構築
cDNAの増幅には、東洋紡社のKOD-Plusを用いた。
cDNA 15μl、10xKOD-Plus Buffer 5μl、dNTP mix 5μl、KOD-Plus 1μl、25mM MgSO4 3μl、プライマー1、およびプライマー2からなる組成の反応液を再蒸留水にて最終容量50μlとし、PCRに供した。
軽鎖の増幅のために、UMPとhk-2(5’- GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC -3’(配列番号1) )プライマーを用い、94℃5秒、72℃3分のサイクルを5回繰り返し、続いて、94℃5秒、70℃10秒、72℃3分のサイクルを5回繰り返し、さらに、94℃5秒:68℃10秒:72℃3分のサイクルを25回繰り返した。さらに、この反応液の5倍希釈液1μlを鋳型とし、NUMPとhk5(5’- AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA GAT TTC -3’ (配列番号2)) プライマーを用いて、94℃15秒、60℃30秒、68℃1分のサイクルを30回繰り返した。この反応液を2%アガロースゲル電気泳動に供し、増幅されたPCR産物をQIAquick gel extraction kit(キアゲン社製)により精製した。精製されたPCR産物をpCR4Blunt-TOPOベクター(インビトロジェン社製)に連結し、添付説明書に従いサブクローニングした。次にT3(5’-ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA-3’ (配列番号3))とhk5をプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報を基に、DNPL15Bglp(5’- AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAG CCC CAG CTC AGC TTC TCT -3’ (配列番号4))を合成し、pCR4Blunt-TOPOベクターでサブクローニングされた軽鎖遺伝子を鋳型としてDNPL15Bglp と202LR(5’- AGA GAG AGA GCG TAC GTT TAA TCT CCA GTC GTG TCC CTT GGC -3’ (配列番号5)) プライマーを用い、94℃15秒、55℃30秒、68℃1分のサイクルを30回繰り返した。この反応液を2%アガロースゲル電気泳動に供し、約400bpの断片をQIAquick gel extraction kit(キアゲン社製)により精製した。軽鎖増幅cDNA断片をBglII、BsiWIで消化し、同一酵素で解裂されていたN5KG1-Val Larkベクター(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1(US patent 6001358)の改変ベクター)に導入した。得られたベクターをN5KG1-Val K3Lと命名した。
重鎖の増幅のために、UMPとIgG1pプライマーを用い、94℃5秒、72℃3分のサイクルを5回繰り返し、続いて、94℃5秒、70℃10秒、72℃3分のサイクルを5回繰り返し、さらに、94℃5秒、68℃10秒、72℃3分のサイクルを25回繰り返した。さらに、この反応液の5倍希釈液1μlを鋳型とし、NUMPとIgG2pプライマーを用いて、94℃15秒、60℃30秒、68℃1分のサイクルを30回繰り返した。この反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、増幅されたPCR産物をQIAquick gel extraction kitにより精製した。精製されたPCR産物をpCR4Blunt-TOPOベクターに連結しサブクローニングした。次にT3とhh2をプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報を基に、205HP5SalI(5’- AGA GAG AGA GGT CGA CCA CCA TGG AGT TTG GGC TGA GCT GGG TTT -3’(配列番号11))を合成し、pCR4Blunt-TOPOベクターでサブクローニングされた重鎖遺伝子を鋳型として205HP5SalIとF24Hnheプライマーを用い、94℃15秒、55℃30秒、68℃1分のサイクルを25回繰り返した。この反応液を2%アガロースゲル電気泳動に供し、約450bpの断片をQIAquick gel extraction kitにより精製した。重鎖増幅cDNA断片をSalI、NheIで消化し、同一酵素で解裂されていたN5KG1-Val Larkベクターに導入した。得られたベクターをN5KG1-Val 1-40-1Hと命名した。
軽鎖の増幅のために、UMPとhk-2プライマーを用い、94℃15秒、72℃3分のサイクルを5回繰り返し、続いて、94℃15秒、70℃10秒、72℃3分のサイクルを5回繰り返し、さらに、94℃15秒、68℃15秒、72℃3分のサイクルを25回繰り返した。さらに、この反応液の5倍希釈液2μlを鋳型とし、NUMPとhk5を用いて、94℃15秒、60℃30秒、68℃1分のサイクルを30回繰り返した。この反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、増幅されたPCR産物をQIAquick gel extraction kitにより精製した。精製されたPCR産物をpCR4Blunt-TOPOベクターに連結しサブクローニングした。次にM13Foward(-20) primer (5’-GTA AAA CGA CGG CCA G -3’(配列番号13))、M13 Reverse primer(5’- CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’ (配列番号14))とhk5(5’- AGG CACACA ACA GAG GCAG TTCCAGA TTT C -3’(配列番号2))をプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報を基に、A27_F (5’- AGA GAG AGA GAT CTC TCA CCA TGG AAA CCC CAG CGCAGC TTC TCT TC-3’(配列番号15))と39_20_L3Bsi (5’- AGA GAG AGA GCG TAC GTT TGA TCT CCA GCT TGG TCC CCT G-3’ (配列番号16))を合成し、pCR4Blunt-TOPOベクターでサブクローニングされた軽鎖遺伝子を鋳型としてA27_Fと39_20_L3Bsiを用い、94℃30秒、55℃30秒、68℃1分のサイクルを25回繰り返した。この反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約400bpの断片をQIAquick gel extraction kitにより精製した。軽鎖増幅cDNA断片をBglII、BsiWIで消化し、同一酵素で解裂されていたN5KG1-Val Larkベクターに導入した。得られたベクターをN5KG1-Val 3-69-6Lと命名した。
ハイブリドーマ産生C2のサブクラスはIgMであるため、同じgerm line由来のIgGから想定される可変領域を含むように設計したプライマーを用いたPCRによりC2抗体可変領域を単離した(C2 IgG1)。
上述のようにクローニングしたC2IgG1遺伝子において重鎖のフレーム領域に本来のgerm lineでは認められない変異が入っていた。そこで、本来のgerm lineの配列を持つC2の可変領域配列を以下の方法により単離した。
上述のC2IgG1に用いた方法であると、重鎖と軽鎖の結合部位の形が本来のIgMと異なる可能性があるため、以下の配列転換を行なった。すなわち、IgGのγ鎖とIgMのμ鎖のCH1定常領域にある共通な配列(GCL配列)から可変領域側方向に隣接する26アミノ酸をμ鎖配列とし、GCL配列から定常領域側全てをγ鎖にコンバートした(C2 IgμG1)。以上の配列転換を以下の方法により行なった。
AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGGTTTACCGACTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCTTCTATCCTGGTGACTCTGATGCCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAACACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTATTGTGCGAGACGGCGAGATATAGTGGGAGGTACTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
MGSTAILALLLAVLQGVCAEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYRFTDYWIGWVRQMPGKGLEWMGIFYPGDSDARYSPSFQGQVTISADKSINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRRDIVGGTDYWGQGTLVTVSS
AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
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(配列番号44)
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(配列番号45)
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実施例6で構築した組換え型抗体発現ベクターを宿主細胞に導入し、組換え型抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞としてCHO細胞の dhfr欠損株(ATCC CRL-9096)を用いた。宿主細胞へのベクターの導入はエレクトロポレーションにより実施した。抗体発現ベクター約2μgを制限酵素で線状化し、Bio-Rad electrophoreterをもちいて350V、500μFの条件で、4x106個のCHO細胞に遺伝子を導入し、96well culture plateに播種した。発現ベクターの選択マーカーに対応した薬剤を添加して培養を継続した。コロニーを確認した後、実施例4に示した方法によって、抗体発現株を選別した。選別した細胞からの抗体精製は、実施例8にしたがって行った。また、組換え型抗体発現ベクターを添付説明書に従いFreeStyle293細胞(インビトロジェン社製)へ導入し、組み換え型抗体を発現させた。
ヒトIgG抗体を含むハイブリドーマ培養上清の調製は、以下の方法にて行った。抗体産生ハイブリドーマをウシインシュリン(5μg/ml、ギブコ社製)、ヒトトランスフェリン(5μg/ml、ギブコ社製)、エタノールアミン(0.01 mM、シグマ社製)、亜セレン酸ナトリウム(2.5x10-5mM、シグマ社製)含有eRDF培地(極東製薬社製)に馴化した。組織培養フラスコで培養し、ハイブリドーマの生細胞率が90%になった時点で培養上清を回収した。回収した上清は、10μmと0.2μmのフィルター(ゲルマンサイエンス社製)に供し、ハイブリドーマ等の雑排物を除去した。抗体を含む培養上清をProtein A(アマシャム)を用い、吸着緩衝液としてPBS、溶出緩衝液として20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH3.0)を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)を添加してpH6.0付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜(10,000カット、Spectrum Laboratories社製)を用いてPBSに置換し、孔径0.22μmのメンブランフィルターMILLEX-GV(ミリポア社製)でろ過滅菌し、精製抗体を得た。精製抗体の濃度は、280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.45 Optimal densityとして算出した。
実施例4で取得した各モノクローナル抗体の反応性の検討を実施例5に明記してあるFACS解析と同法で行った。実施例2で調製した細胞株をStaining Buffer(SB)で2x106/ml に調製し、その細胞浮遊液を96ウェル丸底プレート(ベクトンディッキンソン社製)に分注した(50μl/ウェル)。実施例4から実施例8で調製した各組み換え体抗体をSBで5μg/mlに調製し、50μlを各ウェルに加え撹拌した。陰性コントロールは、KMマウスで作製した抗dinitrophenyl(DNP)ヒトIgG1抗体を使用した。氷温下30分間反応させてから、遠心分離(2000rpm、4℃、2分)して上清を除去した。ペレットを100μl/ウェルのSBで1回洗浄した後、200倍希釈したRPE蛍光標識ウサギ抗ヒトIgκ F(ab‘)2抗体(ダコサイトメーション社製)を50μl/ウェル加え、氷温下30分間反応させた。SBで1回洗浄した後、300μlのSBに懸濁し、FACSで抗体の結合を示す蛍光強度を測定した。
各モノクローナル抗体の結合に重要なhCD98分子の領域を検討した。
各抗体はマウスCD98(mCD98)に交叉反応性を示さないため、mCD98とhCD98を人工的に結合したキメラCD98を利用し、各抗体の結合反応に重要なヒトCD98タンパクの領域を検討した。
各モノクローナル抗体がヒト膀胱癌細胞株T24細胞のアミノ酸の取り込みに影響するかを基質としてロイシンを用い、基質の取り込み実験を金井らの方法(Kim et al., Biochim. Biophys. Acta 1565: 112-122, 2002)に準じて、以下のように行った。1x105のT24細胞株を24−穴培養プレートに播種し、10%FCS入りMEM培地(SIGMA ALDRICH社製)で37℃、5%CO2下で2日間培養した。培養後培地を除き、200μg/mLの抗体を含むHBSS(-)(Na+-free)を0.25mL/穴加え、37℃、5%CO2下でさらに10分間培養した。C2, K3, 7-95-8, 10-60-7, 3-69-6、1-40-1, 抗DNPヒト抗体は、組み換え体抗体を、5-80-1はハイブリドーマ由来の抗体を使用した。その後、上清を除き、1μMの14C-Leu (MORAVEK BIOCHEMICALS社製)を含むHBSS(-)(Na+-free)を0.5mL/穴加え1分間培養した。氷冷HBSS(-)(Na+-free)溶液で3回洗浄後、0.1N水酸化ナトリウムを0.5mL/穴添加し細胞を回収した。回収された溶液中の14C-Leu量は、Liquid scintillation counter model LSC-5100 (ALOKA社製)で測定した。各細胞の14C-Leu取込み量は、回収した溶液中のタンパク質濃度をBCA法で測定し、タンパク質量で標準化した。その結果(図5)、1-40-1, K3, C2IgG1、10-60-7, 3-69-6は、コントロール抗体(DNPヒト抗体)より有意にロイシンの取り込みを抑制した。以下の実験は、有意にロイシンの取り込みを抑制した1-40-1、K3、C2IgG1、10-60-7、および 3-69-6を用いて実施した。
各抗体の蛍光標識化は以下の方法で行った。蛍光物質Fluorescein isothiocyanate (FITC, シグマ社製)を付属の説明書に従い、実施例4から実施例8で調製した各組み換え体抗体に結合させた。200mMの炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.3〜8.5)で1〜2mg/mlの抗体に、ジメチルフォルムアミドに溶かしたFITCを抗体分子の20〜40倍量添加し、撹拌しながら室温2〜3時間反応させた。PBSで平衡化したゲルろ過カラム(NAP5、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製)に混合液を供し、抗体に未結合のFITCを除去した。この条件で抗体1分子に約3つのFITCが結合した。蛍光標識された抗体は何れもhCD98の発現が確認されているヒト大腸癌細胞株DLD-1細胞株に結合した。
単球細胞、活性化T細胞、培養した正常内皮細胞ではCD98が発現していることが知られている。そこで、各抗体のヒト末梢血由来T細胞、B細胞、単球細胞とヒト大動脈内皮細胞(HAEC)への反応性を調べた。ヒト末梢血由来細胞は以下の方法で調製した。1mlヘパリン(ノボ社製)入りヒト末梢血10mlをPBSで2倍に希釈し、20mlのFicoll-Paque PLUS液(アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製)上に重層し、1500 rpmで30分間遠心後回収した。PBSで2回洗浄し単核球細胞を調製した。一部の単核球細胞は、10μg/mlのPhytohaemagglutinin(シグマ社製、PHA)、10%FCS、0.1mM非必須アミノ酸溶液(ギブコ社製)、5.5x10-6M 2-メルカプトエタノール(ギブコ社製)、Penicillin/Streptomycin/Glutamine(ギブコ社製)入りRPMI培地(ギブコ社製)で5%CO2、37℃下72時間培養した。PHA刺激によりヒト末梢血由来T細胞、B細胞に活性化マーカーであるCD25発現が観察された(FITC標識抗ヒトCD25抗体(ベクトンディッキンソン社製 Ca.555431)を用いたFACS解析)。調製された各細胞はStaining Buffer(SB)に2x106/mlで浮遊させ、細胞浮遊液を96-ウェル丸底プレート(ベクトンディッキンソン社製)に分注した(50μl/ウェル)。実施例13で作製された各々のFITC標識抗体を5μg/mlの濃度で抗ヒトCD3抗体(ベクトンディッキンソン社製 Ca.No.555340)あるいは抗ヒトCD14抗体(ベクトンディッキンソン社製 Ca.No.347497)あるいは抗ヒトCD19抗体(イムノテック社製Ca.No.IM1285)と共に氷温下30分間反応させた。陽性コントロールとして市販のFITC標識抗ヒトCD98抗体(クローンUM7F8)、陰性コントロールはFITC標識抗DNPヒトIgG1抗体を用いた。SBで1回洗浄した後、300μlのFACS緩衝液に懸濁し、FACSで各抗体の反応性を調べた。
C2IgG1、K3、および3-69-6の大腸癌細胞株(DLD-1)、肺癌細胞株(H226)、前立腺癌細胞株(DU145)、メラノーマ細胞株(G361、SKMEL28、CRL1579)、非ホジキンリンパ腫株(Ramos)、膀胱癌細胞株(T24)、乳癌細胞株(MCF、MDA-MB-231)、膵臓癌細胞株(HS766T)、多発性骨髄腫細胞株(IM9)、赤芽球系白血病株(K562、図3参照)に対する各抗体の反応性の検討を実施例9と同法のFACS解析で行った。細胞株をStaining Buffer(SB)で2x106/mlに調製し、その細胞浮遊液を96ウェル丸底プレート(ベクトンディッキンソン社製)に分注した(50μl/ウェル)。5μg/mlに調製された抗体あるいはFITC標識抗体を50μl/ウェル加え、氷温下30分間反応させた。陰性コントロールは抗DNPヒトIgG1抗体あるいはFITC標識抗DNPヒトIgG1抗体を用いた。SBで1回洗浄した後、RPE蛍光標識ヤギ抗ヒトIgγ F(ab')2抗体(SuthernBiotech社製)をSBで200倍希釈したもの50μlを加え、氷温下30分間インキュベートした。FITC標識抗体の場合は、この操作は実施しなかった。SBで1回洗浄した後、300μlのFACS緩衝液に懸濁し、FACSで各細胞の平均蛍光強度を測定した。
実施例4から実施例8で調製された組み換え体モノクローナル抗体K3、C2IgG1、および3-69-6の抗腫瘍効果を、以下に記載する方法に従ってマウス癌モデルを用いて検討した。
実施例4から実施例8で調製された組み換え体モノクローナル抗体C2IgG1の抗腫瘍効果を、以下に記載する方法に従ってマウス同系癌モデルを用いて検討した。
C2IgG1、およびK3のサル細胞(COS-7細胞)への交叉反応性をFACS解析で調べた。2x106/mlの細胞をStaining Buffer(SB)に浮遊させた。細胞浮遊液を96−well丸底プレート(ベクトンディッキンソン社製)に分注した(50μl/ウェル)。SBで5μg/mLに調製された抗体を50μl加え、氷温下30分間反応させた。陰性コントロールはDNPヒトIgG1抗体を用いた。SBで1回洗浄した後、SBで200倍希釈したRPE蛍光標識ヤギ抗ヒトIgγ F(ab‘)2抗体(SuthernBiotech社製)を50μl/ウェルを加え、氷温下30分間反応させた。SBで1回洗浄した後、300μlのFACS緩衝液に懸濁し、FACSで抗体の結合を示す蛍光強度を測定した。その結果、何れの抗体もCOS-7細胞株に結合し、C2IgG1、K3はサル細胞に交叉反応性を有する抗体であることがわかった(図13)。
C2IgG1の抗腫瘍活性を、以下に記載する方法に従ってマウス担癌モデルを用いて検討した。
C2IgG1およびC2IgG1NSはともに組換え抗体を調製した際に凝集体含量が高い。そこで、配列番号47で表されるC2IgG1NSの軽鎖可変領域配列において、翻訳開始コドンATGに相当する5番目のM(メチオニン)を1位アミノ酸とし、そこから数えて117番目のI(イソロイシン)をその他のアミノ酸に置換した改変体の作製を行った。
軽鎖117位イソロイシンをアスパラギンに置換したC2IgG1NS / I117Nを調製することを目的とし、実施例6で調製したN5KG1-Val C2IgG1NSベクターを鋳型として、GeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(プロメガ社 No.Q9280)を用いた部位特異的変異導入法により、アミノ酸置換体をコードする各種の変異DNAを調製した。
軽鎖117位イソロイシンをシステインに置換したC2IgG1NS / I117Cを調製することを目的とし、実施例6で調製したN5KG1-Val C2IgG1NSベクターを鋳型として、GeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(プロメガ社 No.Q9280)を用いた部位特異的変異導入法により、アミノ酸置換体をコードする各種の変異DNAを調製した。
軽鎖117位イソロイシンをロイシンに置換したC2IgG1NS / I117Lを、実施例6で調製したN5KG1-Val C2IgG1NSベクターを鋳型として以下の方法により調製した。
軽鎖117位イソロイシンをメチオニンに置換したC2IgG1NS / I117Mを、実施例6で調製したN5KG1-Val C2IgG1NSベクターを鋳型として以下の方法により調製した。
実施例7で示した方法により、C2IgG1NS/ I117Lベクター、C2IgG1NS/ I117Mベクター、C2IgG1NS/ I117N、C2IgG1NS/ I117Cベクターを添付説明書に従いFreeStyle293細胞(インビトロジェン社製)へ導入し、組み換え型抗体を発現させた。抗体の精製は実施例8に示した方法を一部改良して行った。6日目の培養上清を回収し、Steriflip-GP(MILLIPORE,SCGP00525)でfiltrationすることにより細胞等の雑排物を除去した。抗体を含む培養上清をProtein A(アマシャム)を用い、吸着緩衝液としてPBS、溶出緩衝液として20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH3.4)を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は200mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)を添加してpH5.5付近に調整した。調製された抗体溶液は、vivaspin6(10KMW cut VIVASCIENCE,VS0601)を用いて濃縮(3000rpm)し、さらにPBSを添加し遠心することによりPBSに置換された精製抗体を取得した。精製抗体の濃度は、280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.45 Optimal densityとして算出した。
得られたアミノ酸改変抗体10ug(0.1mg/ml)を用いて、各精製抗体の凝集体含有率を測定した。
実施例14および15の方法に従い、C2IgG1NSアミノ酸改変体の腫瘍細胞株、ヒトCD98/ヒトLAT1強制発現株、およびHAECに対する反応性を、FACSにより解析した。
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Claims (35)
- 癌細胞の細胞膜由来のCD98でありかつアミノ酸輸送活性を有するタンパク質と複合体を形成しているCD98に特異的結合能を有することを特徴とする、ヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- 抗腫瘍活性を有する、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- 前記CD98が発現している細胞内へのアミノ輸送を阻害する、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- 正常ヒト血管内皮細胞、正常ヒト末梢血単球、およびリンパ球に結合しない、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- アミノ酸輸送活性を有するタンパク質がLAT1である、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- CD98がヒトCD98である、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- 抗体重鎖定常領域のサブクラスがIgGである、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- 下記(a)〜(c)のいずれかの二配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域として有する、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片:
(a)配列番号29および31、
(b)配列番号41および47、
(c)配列番号43および47。 - 下記(d)〜(g)のいずれかの二配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域として有する、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片:
(d)配列番号43および77、
(e)配列番号43および79、
(f)配列番号43および81、
(g)配列番号43および83。 - 可変領域のアミノ酸配列が、プラスミドベクターK3/pCR4(FERM BP−10552)またはC2IgG1/pCR4(FERM BP−10551)から得られる、ベクターpCR4に由来する配列を含まないBg1II−BsiWI断片およびSalI−NheI断片によってコードされるものである、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- 膀胱癌細胞T24のロイシン取り込みに対し、有意な阻害効果を有する、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- ヒトCD98の1〜529アミノ酸配列(配列番号66)中の連続または不連続の少なくとも8個のアミノ酸残基によって構成されるエピトープを認識するものである、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- ヒトCD98の371〜529アミノ酸の領域の一部分に結合性を有する、請求項12に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- ヒトCD98の1〜371アミノ酸の領域の一部分に結合性を有する、請求項12に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- 前記機能的断片が、抗体の重鎖および軽鎖可変領域(VHおよびVL)、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、Fd、scFv、sdFvおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片と、
結合タンパク質、酵素、薬物、毒素、免疫モジュレーター、検出可能部分またはタグを含む異種ドメインとの結合物。 - プラスミドベクターK3/pCR4(FERM BP−10552)またはC2IgG1/pCR4(FERM BP−10551)に含まれる、ベクターpCR4に由来する配列以外の配列を有する核酸。
- 請求項17に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片を発現する、細胞。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片を有効成分として含んでなる、医薬組成物。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片を有効成分として含んでなる、腫瘍の予防または治療剤。
- 前記腫瘍が、LAT1と複合体を形成しているCD98を発現している癌細胞を含む腫瘍である、請求項21に記載の予防または治療剤。
- 前記腫瘍が、大腸癌または結腸癌である、請求項21に記載の腫瘍の予防または治療剤。
- 請求項18に記載のベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することを特徴とする、抗体の製造方法。
- 下記(a)〜(c)のいずれかの二配列またはその核酸配列縮重物を含む発現ベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することを特徴とする、抗体の製造方法:
(a) 配列番号28および30、
(b) 配列番号40および46、
(c) 配列番号42および46。 - 下記(d)〜(g)のいずれかの二配列またはその核酸配列縮重物を含む発現ベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することを特徴とする、抗体の製造方法:
(d) 配列番号42および78、
(e) 配列番号42および80、
(f) 配列番号42および82、
(g) 配列番号42および84。 - 宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、植物および哺乳動物からなる群から選択される、請求項24〜26のいずれか一項に記載の製造方法。
- CD98およびLAT1をコードする核酸を導入して得られたCD98/LAT1発現細胞を動物に免疫することを含んでなる、請求項1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片を取得する方法。
- 導入するCD98およびLAT1が、ヒトのCD98およびヒトLAT1である、請求項28に記載の方法。
- 腫瘍を予防または治療する方法であって、治療上有効量の請求項1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片を投与することを含んでなる、方法。
- 前記腫瘍が、LAT1と複合体を形成しているCD98を発現している癌細胞を含む腫瘍である、請求項30に記載の方法。
- 前記腫瘍が、大腸癌または結腸癌である、請求項30に記載の方法。
- 腫瘍の予防剤または治療剤の製造のための、請求項1〜15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体またはその機能的断片の使用。
- 前記腫瘍が、LAT1と複合体を形成しているCD98を発現している癌細胞を含む腫瘍である、請求項33に記載の使用。
- 前記腫瘍が、大腸癌または結腸癌である、請求項33に記載の使用。
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