TW202043261A - 包含去免疫化志賀毒素a 亞單元效應子之cd38 結合蛋白 - Google Patents

包含去免疫化志賀毒素a 亞單元效應子之cd38 結合蛋白 Download PDF

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Abstract

本發明提供結合蛋白(「CD38結合蛋白」)，其各自包含(1)用於靶向細胞之CD38結合區及(2)志賀毒素(Shiga toxin) A亞單元效應多肽(「志賀毒素效應多肽」)。該等CD38結合蛋白之該等志賀毒素效應多肽組分可包含相對於野生型志賀毒素序列之突變組合，此提供(1)去免疫化及/或(2)蛋白酶敏感性之降低；其中每一志賀毒素效應多肽保持一或多種志賀毒素功能，諸如刺激細胞內化、引導細胞內按路線發送(intracellular routing)、催化活性及/或強效細胞毒性。該等CD38結合蛋白可具有一或多種用途，例如選擇性殺死特定類型之表現CD38之細胞；且更通常，用於診斷及治療涉及CD38表現細胞之癌症及病症，例如CD38陽性造血系統癌症，諸如多發性骨髓瘤。

Description

包含去免疫化志賀毒素A亞單元效應子之CD38結合蛋白
本發明係關於結合蛋白(每一結合蛋白係「CD38結合蛋白」)，其各自包含(1) CD38結合區或結構域及(2) 志賀毒素(Shiga toxin) A亞單元效應多肽(「志賀毒素效應多肽」)。
以下包括可用於理解本發明之資訊。不承認本文所提供之任何資訊係先前技術或與本發明相關，或不承認本文中所明確或含蓄地引用之任何出版物或文件係先前技術。
CD38在患有多發性骨髓瘤個體之惡性漿細胞上高度表現。多發性骨髓瘤係漿細胞之血液惡性病，其涉及漿細胞之過度增殖，導致終末器官損害。在多發性骨髓瘤中，惡性漿細胞可藉由產生稱為M蛋白(亦稱為骨髓瘤蛋白或單株蛋白)之異常免疫球蛋白，從而導致單株丙種球蛋白病變或血漿中M蛋白之水準異常高而促成該疾病。另外，惡性漿細胞可在骨髓中累積，從而將健康細胞擠出。
將期望具有用作治療性分子之CD38結合蛋白以治療可藉由選擇性殺死CD38表現細胞或將有益劑選擇性遞送至CD38表現細胞中來進行治療之多種疾病，諸如造血系統癌症。將期望具有展現低抗原性及/或免疫原性、低脫靶毒性及強效中靶(on-target)細胞毒性之具細胞毒性的結合CD38之細胞靶向蛋白質。舉例而言，將期望具有包含細胞毒性志賀毒素A亞單元衍生組分之CD38結合蛋白，其具有1) 降低之不期望抗原性及/或免疫原性可能性(例如經由突變)及/或2) 降低之非特異性毒性可能性(例如經由改良穩定性)，同時維持對CD38表現細胞之強效細胞毒性。此外，將期望具有展現低抗原性及/或免疫原性、低脫靶毒性、高穩定性及/或能夠向表現CD38之靶細胞遞送貨物之治療性及/或診斷性CD38結合蛋白。
如本文所闡述，本發明提供CD38結合融合蛋白，其包含至少一個志賀毒素A亞單元效應多肽及至少一個CD38結合結構域以及視情況存在的連接體。
因此，在一些態樣中，本發明提供CD38結合融合蛋白，其包含：a) 志賀毒素A亞單元效應多肽；b) 重鏈可變結構域(VH)，其包含：1) 包含SEQ ID NO: 34之序列之vHCDR1；2) 包含SEQ ID NO: 35之序列之vHCDR2；及3) 包含SEQ ID NO: 36之序列之vHCDR3；及c) 輕鏈可變結構域(VL)，其包含：1) 包含SEQ ID NO: 31之序列之vLCDR1；2) 包含SEQ ID NO: 32之序列之vLCDR2；及3) 包含SEQ ID NO: 33之序列之vLCDR3。
在其他實施例中，CD38結合融合蛋白包含SEQ ID NO: 79之序列。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有包含SEQ ID NO: 43之序列之VL及包含SEQ ID NO: 44之序列之VH。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有a) VL，其包含SEQ ID NO: 43之序列，或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸一致性之序列，及b) VH，其包含SEQ ID NO:44之序列，或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有包含SEQ ID NO: 41之序列之VL及包含SEQ ID NO: 44之序列之VH。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有VL，該VL包含SEQ ID NO: 41之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，且具有VH，該VH包含SEQ ID NO: 44之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白包含：a) 志賀毒素A亞單元效應多肽；b) 重鏈可變結構域(VH)，其包含：1) 包含SEQ ID NO: 22之序列之vHCDR1；2) 包含SEQ ID NO: 23之序列之vHCDR2；及3) 包含SEQ ID NO: 24之序列之vHCDR3；及c) 輕鏈可變結構域(VL)，其包含：1) 包含SEQ ID NO: 19之序列之vLCDR1；2) 包含SEQ ID NO: 20之序列之vLCDR2；及3) 包含SEQ ID NO: 21之序列之vLCDR3。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有包含SEQ ID NO: 37之序列之VL及包含SEQ ID NO: 38之序列之VH。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有VL，該VL包含SEQ ID NO: 37之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，及VH，該VH包含SEQ ID NO: 37之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白包含：a) 志賀毒素A亞單元效應多肽；b) 重鏈可變結構域(VH)，其包含：1) 包含SEQ ID NO: 28之序列之vHCDR1；2) 包含SEQ ID NO: 29之序列之vHCDR2；及3) 包含SEQ ID NO: 30之序列之vHCDR3；及c) 輕鏈可變結構域(VL)，其包含：1) 包含SEQ ID NO: 25之序列之vLCDR1；2) 包含SEQ ID NO: 26之序列之vLCDR2；及3) 包含SEQ ID NO: 27之序列之vLCDR3。
在另一態樣中，CD38結合融合蛋白具有包含SEQ ID NO: 39之序列之VL及包含SEQ ID NO: 40之序列之VH。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有VL，該VL包含SEQ ID NO: 39之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，且具有VH，該VH包含SEQ ID NO: 40之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白在志賀毒素A亞單元效應多肽與CD38結合結構域之間包含第一連接體。在一些實施例中，該第一連接體係蛋白質性連接體，且可為約1至約40個胺基酸。在一些實施例中，該第一連接體包含SEQ ID NO: 70之序列。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有第一連接體，其包含SEQ ID NO: 70-75中任一者之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白在VH與VL之間包含第二連接體。在一些實施例中，此第二連接體包含序列(Gly4Ser)n (SEQ ID NO: 195)，其中n等於1、2、3、4或5，在一些實施例中n = 1。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白自其N末端至C末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽-第一連接體-VH-第二連接體-VL。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白自其N末端至C末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽-第一連接體-VL-第二連接體-VH。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有包含SEQ ID NO: 46之序列之志賀毒素A亞單元效應多肽。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白具有包含SEQ ID NO:45-69中任一者之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少95%、至少99%胺基酸序列一致性之序列的志賀毒素A亞單元效應多肽。
在其他態樣中，技術方案1之CD38結合融合蛋白，其中志賀毒素A亞單元效應多肽包含SEQ ID NO: 46之序列，VL包含SEQ ID NO: 43之序列，且VH包含SEQ ID NO: 44之序列。
在其他態樣中，CD38結合融合蛋白與SEQ ID NO: 79之序列具有至少95%胺基酸序列一致性。
在其他態樣中，本發明之CD38結合融合蛋白係同二聚體。在一些實施例中，同二聚體包含兩個一致多肽，每一多肽包含SEQ ID NO: 79之序列。在一些實施例中，同二聚體包含兩個一致多肽，每一多肽包含與SEQ ID NO: 79至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%胺基酸序列一致之序列。在一些實施例中，至少約90%、95%或98%之CD38結合融合蛋白係呈同二聚體形式。
在一些態樣中，本發明提供本發明之CD38結合融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之組合物。
在其他態樣中，本發明提供編碼CD38結合融合蛋白之核酸，以及包含該等核酸之表現載體，及包含本文之該等核酸及/或表現載體之宿主細胞。類似地，本發明提供，其包含在表現CD38結合融合蛋白之條件下培養含有該等核酸及/或表現載體之宿主細胞，及回收該蛋白質。在一些實施例中，藉由使CD38結合融合蛋白與細菌蛋白質L接觸來純化該蛋白質。在一些情形中，蛋白質L係自大消化鏈球菌(P. magnus )分離或源自大消化鏈球菌，其可偶聯至樹脂。
在其他態樣中，本發明提供治療多發性骨髓瘤之方法，其包含向有需要之個體投與本發明之CD38結合融合蛋白。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2019年12月6日提出申請之美國臨時申請案第62/945,107號、於2019年12月6日提出申請之美國臨時申請案第62/945,106號及於2019年1月23日提出申請之美國臨時申請案第62/795,633號之權益，該等臨時申請案各自係以全文引用的方式併入本文中。 以電子方式提交之文本檔案之說明
以電子方式隨同提交之文本檔案之內容係以全文引用的方式併入：序列表之電腦可讀格式拷貝(檔案名稱：sequencelisting.TXT，記錄日期2020年1月23日，檔案大小238千位元組)。
本發明提供CD38結合蛋白及其組合物之各種實施例，其中每一CD38結合蛋白包含(1) 至少一個源自志賀毒素家族之至少一個成員之A亞單元的志賀毒素A亞單元效應多肽及(2) 至少一個能夠特異性結合CD38分子之細胞外部分之CD38結合區，如下文所闡述，視情況具有連接體。對於本發明之每一CD38結合蛋白，該至少一個結合區與志賀毒素A亞單元效應多肽係異源的，諸如免疫球蛋白型結合區。 A.   定義
鑒於以下說明、隨附申請專利範圍及附圖，將更佳地理解本發明之該等及其他特徵、態樣及優點。上文所提及之本發明要素可個別地組合或自由地移除以形成本發明之其他實施例，在下文中沒有反對此組合或移除之任何聲明。
為使本發明可更容易地理解，下文定義一些術語。其他定義可參見本發明之詳細說明。
如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指示，否則術語「一(a、an)」及「該(the)」包括單數及複數個指示物二者。
如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，術語「及/或」在提及兩種物質A及B時意指A及B中之至少一者。如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，術語「及/或」在提及兩種以上物質時，諸如A、B及C，意指A、B或C中之至少一者，或A、B或C之任一組合中之至少一者(每一物質具有單一或多種可能性)。
術語「胺基酸殘基」或「胺基酸」包括對納入至蛋白質、多肽或肽中的胺基酸之提及。術語「多肽」包括胺基酸或胺基酸殘基之任一聚合物。術語「多肽序列」係指物理上構成多肽之一系列胺基酸或胺基酸殘基。
「蛋白質」係包含一或多個多肽或多肽「鏈」之巨分子。舉例而言，蛋白質可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個多肽。在其中蛋白質包含一個以上多肽之實施例中，該蛋白質之多肽可彼此相同或不同。蛋白質可係單體或多聚體，諸如二聚體、三聚體、四聚體等。
「肽」係大小小於總計約15至20個胺基酸殘基之小的多肽。術語「胺基酸序列」係指一系列胺基酸或胺基酸殘基，其端視於長度在物理上構成肽或多肽。如本文所用之「殘基」有時意欲指示蛋白質中之位置及其相關之胺基酸一致性。除非另有指示，否則本文所揭示之多肽及蛋白質序列係自左至右書寫，此代表其自胺基末端至羧基末端之順序。
術語「胺基酸」、「胺基酸殘基」、「胺基酸序列」或多肽序列包括天然胺基酸(包括L及D立體異構物)，且除非另外限制，否則亦包括可以與天然胺基酸類似之方式起作用的天然胺基酸之已知類似物，諸如硒基半胱胺酸、吡咯離胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、γ-羧基麩胺酸、羥脯胺酸羥腐胺離胺酸、焦麩胺酸及硒基甲硫胺酸。
本文中之「修飾」意指多肽序列中之胺基酸取代、插入及/或缺失或對與蛋白質化學連接部分之改變。舉例而言，修飾可係連接至蛋白質之碳水化合物或PEG結構之改變。本文中之「胺基酸修飾」意指多肽序列中之胺基酸取代、插入及/或缺失。為清晰起見，除非另有註明，否則胺基酸修飾總是針對由DNA編碼之胺基酸，例如具有DNA及RNA密碼子之該20種胺基酸。
本文中之「胺基酸取代」或「取代」意指親代多肽序列中特定位置處之胺基酸經不同胺基酸替代。特定而言，在一些實施例中，取代係針對在特定位置處不為天然(無論在該生物體內抑或在任一生物體內非天然)之胺基酸。舉例而言，取代N297A係指位置297處之天冬醯胺經丙胺酸替代之變異體多肽，在此情形中為Fc變異體。為清晰起見，經改造以改變核酸編碼序列但不改變起始胺基酸(例如將CGG (編碼精胺酸)換成CGA (仍編碼精胺酸)以增加宿主生物體表現水準)之蛋白質不係「胺基酸取代」；亦即，儘管產生編碼相同蛋白質之新的基因，但若蛋白質在其起始之特定位置處具有相同胺基酸，則其不係胺基酸取代。
關於肽、肽區、多肽區、蛋白質或分子之胺基酸殘基之片語「保守取代」係指實質上不改變整體肽、肽區、多肽區、蛋白質或分子之功能及結構的肽、肽區、多肽區、蛋白質或分子之胺基酸組合物中之變化(參見Creighton，Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, New York (第2版, 1992)))。
如本文所用之「胺基酸插入」或「插入」意指在親代多肽序列中之特定位置處添加胺基酸序列。舉例而言，-233E或233E指示麩胺酸在位置233之後且在位置234之前插入。另外，233ADE或A233ADE指示AlaAspGlu在位置233之後且在位置234之前插入。
如本文所用之「胺基酸缺失」或「缺失」意指在親代多肽序列中之特定位置處去除胺基酸序列。舉例而言，E233-或E233#、E233()或E233del指示在位置233處缺失麩胺酸。另外，EDA233-或EDA233#指示在位置233處開始缺失序列GluAspAla。
如本文所用，「蛋白質」意指至少兩個共價連接之胺基酸，其包括蛋白質、多肽、寡肽及肽。肽基包含天然胺基酸及肽鍵，或合成肽模擬物結構，亦即「類似物」，諸如類肽(參見Simon等人，PNAS USA 89(20):9367 (1992)，其係以引用的方式全文併入)。如熟習此項技術者應瞭解，胺基酸可係天然或合成的(例如不係由DNA編碼之胺基酸)。舉例而言，出於本發明之目的，高苯丙胺酸、瓜胺酸、鳥胺酸及正白胺酸視為合成胺基酸，且可利用D及L (R或S)二者構形之胺基酸。本發明之變異體可包含包括使用合成胺基酸之修飾，該等合成胺基酸係使用(例如)由Schultz及同事開發之技術納入，該等技術包括(但不限於) Cropp及Shultz，2004, Trends Genet. 20(12):625-30、Anderson等人，2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2):7566-71、Zhang等人，2003, 303(5656):371-3及Chin等人，2003, Science 301(5635):964-7所闡述之方法，所有該等文獻均係以引用的方式全文併入。另外，多肽可包括一或多個側鏈或末端之合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、環形排列、環化、與其他分子之連接體、融合至蛋白質或蛋白質結構域及添加肽標籤或標記。
本文中之「野生型或WT」意指在自然界中所發現之胺基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因變異。WT蛋白質具有未經有意修飾之胺基酸序列或核苷酸序列。
如本文所用之「變異體蛋白質」或「蛋白質變異體」或「變異體」意指由於至少一個胺基酸修飾而與親代蛋白質不同之蛋白質。蛋白質變異體可指蛋白質自身、包含該蛋白質之組合物或編碼其之胺基序列。在一些實施例中，蛋白質變異體與親代蛋白質相比具有至少一個胺基酸修飾，例如約1至約70個胺基酸修飾，且在一些實施例中，與親代相比具有約1至約5個胺基酸修飾。如下文所闡述，在一些實施例中，親代多肽(例如Fc親代多肽)係人類野生型序列，諸如來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc區，但具有變異體之人類序列亦可用作「親代多肽」。在一些實施例中，本文之蛋白質變異體序列與親代蛋白質序列將具有至少約80%一致性，且在一些實施例中與親代蛋白質序列將具有至少約90%一致性、至少約95%、至少約95%或至少約99%一致性。變異體蛋白質可指變異體蛋白質自身、包含該蛋白質變異體之組合物或編碼其之DNA序列。
本文中之「抗原結合結構域」或「ABD」意指六個互補決定區(CDR)之集合，其在作為多肽序列之一部分存在時，特異性結合如本文所闡述之靶抗原。因此，「抗CD38抗原結合結構域」結合如本文所概述之CD38抗原。如此項技術中所已知，該等CDR通常以第一組可變重鏈CDR (vhCDR或VHCDR)及第二組可變輕鏈CDR (vlCDR或VLCDR)之形式存在，其各自包含三個CDR：於重鏈而言為vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3且於輕鏈而言為vlCDR1、vlCDR2及vlCDR3。如此項技術中所理解，CDR在每一重鏈可變區及輕鏈可變區中由框架區隔開：對於輕鏈可變區，該等區為(VL)FR1-vlCDR1-(VL)FR2-vlCDR2-(VL)FR3-vlCDR3-(VL)FR4，且對於重鏈可變區，該等區為(VH)FR1-vhCDR1-(VH)FR2-vhCDR2-(VH)FR3-vhCDR3-(VH)FR4。
本發明之抗原結合結構域可以多種格式來體現，例如呈Fab、Fv及scFv形式。在「Fab」格式中，該6個CDR之集合由兩種不同多肽序列貢獻，亦即重鏈可變區(vh或VH；含有vhCDR1、vhCDR2及vhCDR3)及輕鏈可變區(vl或VL；含有vlCDR1、vlCDR2及vlCDR3)，其中VH之C末端連接至重鏈之CH1結構域之N末端且VL之C末端連接至恆定輕鏈結構域之N末端(且由此形成輕鏈)。重鏈可變區及輕鏈可變區一起形成Fv，其可係如本文所概述之scFv或Fab。因此，在一些情形中，抗原結合結構域之該6個CDR由VH及VL貢獻。在scFv形式中，VH及VL通常經由使用如本文所概述之連接體共價連接成單一多肽序列，其可係(自N末端起始) VH-連接體-VL或VL-連接體-VH。
如本文所用之「Fab」或「Fab區」意指包含VH、CH1、VL及CL免疫球蛋白結構域之多肽。Fab可指獨立之此區域，或在全長抗體或抗體片段背景中之此區域。
如本文所用之「Fv」或「Fv片段」或「Fv區」意指包含單一抗體之VL及VH結構域之多肽。如熟習此項技術者應瞭解，該等多肽係由兩個結構域(可變重鏈結構域及可變輕鏈結構域)構成。
本文中之「單鏈Fv」或「scFv」意指通常使用如本文所闡述之scFv連接體共價連接至可變輕鏈結構域，以形成scFv或scFv結構域之可變重鏈結構域。scFv結構域自N末端至C末端可呈任一定向(vh-連接體-vl或vl-連接體-vh)。一般而言，連接體係此項技術中通常已知且在上文中闡述之scFv連接體。
術語「抗體」係以最廣泛意義使用，且包括例如完整免疫球蛋白或免疫球蛋白之抗原結合部分或與免疫球蛋白相關或源自免疫球蛋白之抗原結合蛋白。完整抗體結構單元通常包含四聚體四聚體蛋白質。每一四聚體通常係由兩對一致之多肽鏈構成，每對具有一條「輕」鏈(分子量通常為約25 kDa)及一條「重」鏈(分子量通常為約50 kDa至70 kDa)。人類免疫球蛋白輕鏈可分類為具有κ或λ輕鏈。在一些實施例中，本發明提供抗體結構，其包含通常基於IgG類之抗原結合結構域(例如抗體重鏈及/或輕鏈)，該IgG類具有若干亞類，包括(但不限於) IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。一般而言，IgG1具有不同同種異型，其中在356 (D或E)、IgG2及358 (L或M)具有多型性。本文所繪示之序列使用356D/358M同種異型，但另一同種異型亦包括在本文中。亦即，包括本文所包括之IgG1 Fc結構域之任一序列可具有356E/358L替代356D/358M同種異型。IgG4較IgG3更常使用。
應注意，IgG1具有不同同種異型，其中在356 (D或E)及358 (L或M)具有多型性。本文所繪示之序列使用356D/358M同種異型，但另一同種異型亦包括在本文中。亦即，包括本文所包括之IgG1 Fc結構域之任一序列可具有356E/358L替代356D/358M同種異型。
因此，如本文所用之「同型」意指免疫球蛋白由其恆定區之化學及抗原性特徵所定義之亞類中之任一者。如本文所用之「IgG亞類修飾」或「同型修飾」意指將一種IgG同型之一個胺基酸轉化為不同、經比對的IgG同型之相應胺基酸之胺基酸修飾。舉例而言，由於在EU位置296處IgG1包含酪胺酸且IgG2包含苯丙胺酸，因此IgG2中之F296Y取代視為IgG亞類修飾。類似地，由於IgG1在位置241處具有脯胺酸且IgG4在此處具有絲胺酸，因此具有S241P之IgG4分子視為IgG亞類修飾。注意，亞類修飾在本文中視為胺基酸取代。
如本文所用之「Fc」或「Fc區」或「Fc結構域」意指包含抗體中除第一恆定區免疫球蛋白結構域(例如CH1)以外之恆定區以及在一些情形中一部分鉸鏈之多肽。對於IgG而言，Fc結構域包含免疫球蛋白結構域CH2及CH3 (Cγ2及Cγ3)以及CH1 (Cγ1)與CH2 (Cγ2)之間的下鉸鏈區。儘管Fc區之邊界可有所變化，但通常將人類IgG重鏈Fc區界定為包括殘基C226或P230至其羧基末端，其中編號係根據如Kabat中之EU索引。因此，在IgG之背景中，「CH」結構域為如下：根據如Kabat中之EU索引，「CH1」係指位置118-215。根據如Kabat中之EU索引，「鉸鏈」係指位置216-230。根據如Kabat中之EU索引，「CH2」係指位置231-340，且根據如Kabat中之EU索引，「CH3」係指位置341-447。因此，「Fc結構域」包括-CH2-CH3結構域及視情況鉸鏈結構域(鉸鏈-CH2-CH3)。在一些實施例中，如下文更充分地闡述，對Fc區進行胺基酸修飾，例如以改變與一或多種FcγR受體或與FcRn受體之結合。
本文中之「重鏈恆定區」意指人類IgG抗體之CH1-鉸鏈-CH2-CH3部分。
「輕鏈恆定區」意指κ或λ之CL結構域。
如本文所用之「可變結構域」意指免疫球蛋白中包含一或多個Ig結構域之區域，該一或多個Ig結構域實質上由分別構成κ、λ及重鏈免疫球蛋白遺傳基因座之Vκ (V.κ)、Vλ (V.λ)及/或VH基因中之任一者編碼。因此，「可變重鏈結構域」包含(VH)FR1-vhCDR1-(VH)FR2-vhCDR2-(VH)FR3-vhCDR3-(VH)FR4，且「可變輕鏈結構域」包含(VL)FR1-vlCDR1-(VL)FR2-vlCDR2-(VL)FR3-vlCDR3-(VL)FR4。
每一鏈之胺基末端部分包含主要負責抗原識別之約100個至110個或更多個胺基酸之可變區，其在此項技術中及本文中通常稱為「Fv結構域」或「Fv區」。在可變區中，重鏈及輕鏈之每一V結構域聚集三個環以形成抗原結合位點。每一環稱為互補決定區(下文中稱為「CDR」)，其中胺基酸序列之變化最為顯著。「可變」係指抗體之間可變區之某些區段的序列差異極大之事實。可變區內可變性之分佈並不均勻。而是，V區係由15-30個胺基酸之相對不變之片段(稱為框架區(FR))組成，其由各自長9-15個胺基酸或更長之較短極端可變性區域(稱為「超變區」)隔開。
每一VH及VL係由三個超變區(「互補決定區」、「CDR」)及四個FR構成，其自胺基末端至羧基末端之排列順序如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
超變區通常涵蓋來自輕鏈可變區中約胺基酸殘基24-34 (LCDR1；「L」表示輕鏈)、50-56 (LCDR2)及89-97 (LCDR3)及重鏈可變區中約31-35B (HCDR1；「H」表示重鏈)、50-65 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)之胺基酸殘基；Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)及/或形成超變環之彼等殘基(例如輕鏈可變區中之殘基26-32 (LCDR1)、50-52 (LCDR2)及91-96 (LCDR3)及重鏈可變區中之26-32 (HCDR1)、53-55 (HCDR2)及96-101 (HCDR3)；Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)。本發明之特定CDR闡述於下文中。
如熟習此項技術者應瞭解，不同編號系統之間CDR之確切編號及佈置可不同。然而，應理解，可變重鏈及/或可變輕鏈序列之發明內容包括相關(固有) CDR之發明內容。因此，每一可變重鏈區之發明內容係vhCDR之發明內容(例如vhCDR1、vhCDR2及vhCDR3)，且每一可變輕鏈區之發明內容係vlCDR之發明內容(例如vlCDR1、vlCDR2及vlCDR3)。
CDR編號之有用比較如下(表4)，參見Lafranc等人，Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003)： 表1. 抗體CDR命名法
   Kabat+Chothia IMGT Kabat AbM Chothia Contact
vhCDR1 26-35 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
vhCDR2 50-65 56-65 50-65 50-58 52-56 47-58
vhCDR3 95-102 105-117 95-102 95-102 95-102 93-101
vlCDR1 24-34 27-38 24-34 24-34 24-34 30-36
vlCDR2 50-56 56-65 50-56 50-56 50-56 46-55
vlCDR3 89-97 105-117 89-97 89-97 89-97 89-96
在本說明書中，Kabat編號系統通常在提及可變結構域中之殘基(大約輕鏈可變區之殘基1-107及重鏈可變區之殘基1-113)時使用，且EU編號系統用於Fc區(例如Kabat等人，上文文獻(1991))。
本發明提供大量不同的CDR集合。在此情形中，「全CDR集合」包含三個可變輕鏈及三個可變重鏈CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2及vhCDR3。該等CDR可分別係較大可變輕鏈或可變重鏈結構域之一部分。另外，如本文更充分地概述，當使用重鏈及輕鏈時(例如當使用Fab時)，可變重鏈及可變輕鏈結構域可在分開的多肽鏈上，或在scFv序列之情形下則在單一多肽鏈上。
CDR有助於抗體之抗原結合位點或更具體而言抗原決定基結合位點之形成。
「抗原決定基」係指與抗體分子之可變區中稱為互補位之特定抗原結合位點相互作用之決定子。抗原決定基係諸如胺基酸或糖側鏈之分子組群，且通常具有特定結構特徵以及特定電荷特徵。單一抗原可具有一個以上抗原決定基。抗原決定基可包含直接參與結合之胺基酸殘基(亦稱為抗原決定基之免疫顯性組分)及不直接參與結合之其他胺基酸殘基，諸如由特異性抗原結合肽有效阻斷之胺基酸殘基；換言之，該等胺基酸殘基係在特異性抗原結合肽之覆蓋區內。抗原決定基可具有構形或係線性的。構形抗原決定基係由來自線性多肽鏈之不同區段之空間並置胺基酸產生。線性抗原決定基係由多肽鏈中之毗鄰胺基酸殘基產生之抗原決定基。構形及非構形抗原決定基之不同之處可在於，在變性溶劑存在下不與前者結合但與後者結合。
「特異性結合」或「特異性結合至」或「特異性針對」特定抗原或抗原決定基意指與非特異性相互作用明顯不同之結合。特異性結合可(例如)藉由測定與對照分子之結合相比分子之結合來量測，該對照分子通常係具有類似結構但不具有結合活性之分子。舉例而言，特異性結合可藉由與類似於靶標之對照分子競爭來測定。
如本文所用之術語「Kassoc」或「Ka」意欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所用之術語「Kdis」或「Kd」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文所用之術語「KD 」意欲指解離常數，其係自KD 對Ka之比率(亦即，KD /Ka)獲得，且表示為莫耳濃度(M)。抗體之KD 值可使用此項技術中公認之方法來測定。在一些實施例中，測定抗體KD 之方法係藉由使用表面電漿子共振，例如藉由使用生物感測器系統(諸如BIACORE®系統)。在一些實施例中，藉由生物層干涉術來測定抗體之KD 。在一些實施例中，使用流式細胞術利用抗原表現細胞來量測KD 。在一些實施例中，在固定抗原之情形下量測KD 值。在其他實施例中，在固定抗體(例如，親代小鼠抗體、嵌合抗體或人類化抗體變異體)之情形下量測KD 值。在一些實施例中，以二價結合模式量測KD 值。在其他實施例中，以單價結合模式量測KD 值。針對特定抗原或抗原決定基之特異性結合可(例如)藉由抗體對抗原或抗原決定基之KD 為至少約10-7 M、至少約10-8 M、至少約10-9 M、至少約10-10 M、至少約10-11 M、至少約10-12 M、至少約10-13 M、至少約10-14 M來展現。通常，特異性結合抗原之抗體之KD 將為對照分子相對於該抗原或抗原決定基之KD 的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
關於蛋白質序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為在將序列比對且引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比後，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與特定(親代)序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。一個特定程式係美國預授權公開案第20160244525號之段落[0279]至[0280]所概述之ALIGN-2程式，該公開案在此係以引用的方式併入。Smith及Waterman，Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981)之局部同源性算法提供針對核酸序列之另一近似比對。此算法可藉由使用由Dayhoff開發(Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O. Dayhoff編輯，增刊5，3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA)且由Gribskov正規化(Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986))之評分矩陣而應用於胺基酸序列。
Genetics Computer Group (Madison, WI)在「BestFit」實用應用中提供執行此算法以確定序列一致性百分比之實例。此方法之預設參數闡述於Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual，第8版(1995)中(可自Genetics Computer Group, Madison, WI獲得)。在本發明之背景中確立一致性百分比之另一方法係使用版權由愛丁堡大學(University of Edinburgh)所有之MPSRCH程式包，該程式包係由John F. Collins及Shane S. Sturrok開發，且由IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)發行。在此套包中，可採用Smith-Waterman算法，其中評分表使用預設參數(舉例而言，空位開放罰分為12，空位延伸罰分為1，且空位為6)。根據所產生之數據，「匹配」值反映「序列一致性」。用於計算序列間一致性或相似性百分比之其他適宜程式通常為此項技術中所已知，例如，另一比對程式係使用預設參數之BLAST。舉例而言，可使用以下預設參數來使用BLASTN及BLASTP：遺傳密碼=標準；過濾器=無；股=兩條；截止值= 60；預計值= 10；矩陣= BLOSUM62；說明= 50個序列；分類依據=高評分；資料庫=非冗餘， GenBank+ EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS轉譯+ Swiss protein + Spupdate + PIR。該等程式之細節可藉由在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi前面輸入http://定址之網際網路地址找到。
本發明之胺基酸序列(「本發明序列」)與親代胺基酸序列之間的一致性程度計算為兩個序列在比對中之精確匹配數除以「本發明序列」之長度或親代序列之長度，以最短者為準。結果以一致性百分比表示。
術語「核酸」包括呈任一形式之具有一種以上核苷酸之RNA或DNA分子，包括單股、雙股、寡核苷酸或多核苷酸。術語「核苷酸序列」包括呈單股核酸形式之寡核苷酸或多核苷酸中核苷酸之排序。
如本文所用之術語「啟動子」包括可操作地連接至欲轉錄核酸序列(諸如編碼期望分子之核酸序列)之DNA序列。啟動子通常位於欲轉錄核酸序列之上游，且為RNA聚合酶及其他轉錄因子提供特異性結合之位點。
「載體」能夠將基因序列轉移至靶細胞。通常，「載體構築體」、「表現載體」及「基因轉移載體」意指能夠引導目標基因之表現且可將基因序列轉移至靶細胞之任一核酸構築體，此可藉由將該載體之全部或一部分進行基因體整合，或短暫或可遺傳地將該載體維持為染色體外元件來完成。因此，該術語包括選殖及表現媒介，以及整合載體。
如本文所用之術語「調控元件」包括控制核酸序列表現之一些態樣之核苷酸序列。調控元件之實例說明性地包括增強子、內部核糖體進入位點(IRES)、內含子、複製起點、多聚腺苷酸化信號(pA)、啟動子、增強子、轉錄終止序列及上游調控結構域，其有助於核酸序列之複製、轉錄及/或轉錄後處理。在情形中，調控元件亦可包括順式調控DNA元件以及轉位元件(TE)。熟習此項技術者能夠僅利用常規實驗在表現構築體中選擇且使用該等及其他調控元件。表現構築體可使用基因重組方法或使用眾所周知之方法合成產生。
「控制元件」或「控制序列」係參與有助於多核苷酸之功能性調控之分子相互作用之核苷酸序列，該功能性調控包括多核苷酸之複製(replication、duplication)、轉錄、剪接、轉譯或降解。該調控可影響該過程之頻率、速度或特異性，且在本質上可係增強或抑制性的。此項技術中已知之控制元件包括例如轉錄調控序列，諸如啟動子及增強子。啟動子係在某些條件下能夠結合RNA聚合酶且起始通常位於啟動子下游(3’方向)之編碼區的轉錄之DNA區。
出於本發明之目的，片語「源自」在提及多肽或多肽區時意指該多肽或多肽區包含最初在「親代」蛋白質中發現之胺基酸序列且其現可包含一些胺基酸殘基添加、缺失、截短、重排或相對於原始多肽或多肽區之其他改變，只要「親代」分子之一些功能及結構實質上保守即可。熟習此項技術者使用此項技術中已知之技術(例如，蛋白質序列比對軟體)將能夠鑑別多肽或多肽區所源自之親代分子。
出於本發明之目的且關於志賀毒素多肽序列或志賀毒素衍生多肽，術語「野生型」通常係指在活的物種(諸如致病菌)中發現的天然志賀毒素蛋白質序列，其中該(等)志賀毒素蛋白質序列係最常出現變異體者。此與包含至少一種志賀毒素蛋白質變異體之很少出現的志賀毒素蛋白質序列形成對比，其雖然仍係天然的，但當對給定物種之統計學上大量的天然個別生物體進行取樣時，其僅在該物種之少於1%的個別生物體中發現。天然分離物在其天然環境以外之純系擴增(不管該分離物係包含生物序列資訊之生物體抑或分子)不會改變天然需求，只要該純系擴增不引入在該物種之天然群體中不存在之新的序列變種及/或不改變序列變異體彼此之間的相對比例即可。
如本文所用之術語「締合(associated、associating)」或「連接(linked、linking)」係指分子之兩種或更多種組分經接合、連接、連結或以其他方式偶合以形成單一分子之狀態或藉由在兩個分子之間產生締合、鍵聯、連接及/或任何其他連結而使該兩個分子彼此締合以形成單一分子之動作。舉例而言，術語「連接」可指兩種或更多種組分由一或多種原子相互作用締合使得形成單一分子，且其中原子相互作用可係共價及/或非共價的。兩種組分之間的共價締合之非限制性實例包括肽鍵及半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵。兩種分子組分之間的非共價締合之非限制性實例包括離子鍵及氫鍵。
出於本發明之目的，術語「連接」係指兩種或更多種分子組分由一或多種原子相互作用締合使得形成單一分子，且其中原子相互作用包括至少一個共價鍵。出於本發明之目的，術語「連接」係指如上文所闡述產生連接分子之動作。
出於本發明之目的，術語「融合」係指兩種或更多種蛋白質性組分由至少一個為肽鍵之共價鍵締合，而不管該肽鍵是否涉及羧酸基團之碳原子之參與或涉及另一碳原子，諸如?-碳、?-碳、?-碳、?-碳等。融合在一起的兩種蛋白質性組分之非限制性實例包括例如胺基酸、肽或多肽經由肽鍵融合至多肽以使得所得分子為單一連續多肽。出於本發明之目的，術語「融合」係指如上文所闡述產生融合分子之動作，諸如自遺傳區域之重組融合產生的融合蛋白，其在轉譯時產生單一蛋白質性分子。
符號「::」意指在其之前及之後的多肽區物理連接在一起以形成連續多肽。
如本文所用，術語「表現(expressed、expressing或expresses)」及其文法變體係指多核苷酸或核酸轉譯成蛋白質。所表現之蛋白質可保留在細胞內、成為細胞表面膜之組分或分泌至細胞外空間中。
如本文所用，在至少一個細胞表面表現大量細胞外靶標生物分子之細胞係「靶標陽性細胞」或「靶標+細胞」，且係物理偶合至指定細胞外靶標生物分子之細胞。
如本文所用，符號「?」係能夠與該符號後的生物分子結合之免疫球蛋白型結合區之簡寫。符號「?」用於指免疫球蛋白型結合區基於其與該符號後的生物分子結合之能力之功能特性，其中結合親和力係藉由10-5 或更小之解離常數(KD )描述。
如本文所用，術語「重鏈可變(VH)結構域」或「輕鏈可變(VL)結構域」分別係指任何抗體VH或VL結構域(例如人類VH或VL結構域)以及其保留相應天然抗體之至少定性抗原結合能力之任何衍生物(例如源自天然鼠類VH或VL結構域之人類化VH或VL結構域)。VH或VL結構域包含間雜有三個CDR或抗原結合區(ABR)之「框架」區。框架區用於將CDR或ABR排列以特異性結合至抗原之抗原決定基。自胺基末端至羧基末端，VH及VL結構域二者均包含以下框架(FR)及CDR區或ABR區：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4；或類似地FR1、ABR1、FR2、ABR2、FR3、ABR3及FR4。如本文所用，術語「HCDR1」、「HCDR2」或「HCDR3」分別用於指VH結構域中之CDR 1、2或3，且術語「LCDR1」、「LCDR2」及「LCDR3」分別用於指VL結構域中之CDR 1、2或3。如本文所用，術語「HABR1」、「HABR2」或「HABR3」分別用於指VH結構域中之ABR 1、2或3，且術語「LABR1」、「LABR2」或「LABR3」分別用於指VL結構域中之CDR 1、2或3。對於駱駝科動物VHH片段、軟骨魚類之IgNAR、VNAR片段、一些單一結構域抗體及其衍生物，存在包含以下相同基本排列之單一重鏈可變結構域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。如本文所用，術語「HCDR1」、「HCDR2」或「HCDR3」可分別用於指單一重鏈可變結構域中之CDR 1、2或3。
出於本發明之目的，術語「效應子」意指提供生物學活性，諸如細胞毒性、生物信號傳導、酶催化、亞細胞按路線發送及/或產生別位效應之分子間結合及/或募集一或多種因子。
出於本發明之目的，片語「志賀毒素效應多肽」、「志賀毒素效應多肽區」及「志賀毒素效應區」係指源自志賀毒素家族成員之至少一個志賀毒素A亞單元之多肽或多肽區，其中該多肽或多肽區能夠展現至少一種志賀毒素功能。舉例而言，SEQ ID NO: 45-69係源自StxA及SLT-1A。
出於本發明之目的，志賀毒素效應功能係由源自志賀毒素A亞單元之多肽區賦予之生物學活性。志賀毒素效應功能之非限制性實例包括促進細胞進入；脂質膜變形；促進細胞內化；刺激格形蛋白介導之胞吞作用；引導至各種細胞內區室(諸如高爾基氏體、內質網及胞質液)之細胞內按路線發送；引導貨物之細胞內按路線發送；抑制核糖體功能；抑制蛋白質合成、催化活性(諸如N-糖苷酶活性)及催化性地抑制核糖體；降低蛋白質合成、誘導半胱天冬酶活性、使效應半胱天冬酶活化、實現細胞生長抑制效應及細胞毒性。志賀毒素催化活性包括例如核糖體失活、蛋白質合成抑制、N-糖苷酶活性、多核苷酸:腺苷糖苷酶活性、RNA酶活性及DNA酶活性。志賀毒素係核糖體失活蛋白(RIP)。RIP可使核酸、多核苷、多核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA (及聚A)及病毒核酸去嘌呤(例如，參見Barbieri L等人，Biochem J 286:1-4 (1992)；Barbieri L等人，Nature 372: 624 (1994)；Ling J等人，FEBS Lett 345: 143-6 (1994)；Barbieri L等人，Biochem J 319: 507-13 (1996)；Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996)；Stirpe F等人，FEBS Lett 382: 309-12 (1996)；Barbieri L等人，Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997)；Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res 27: 1900-5 (1999)；Barbieri L等人，Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000)；Barbieri L等人，J Biochem 128: 883-9 (2000)；Brigotti M等人，Toxicon 39: 341-8 (2001)；Brigotti M等人，FASEB J 16: 365-72 (2002)；Bagga S等人，J Biol Chem 278: 4813-20 (2003)；Picard D等人，J Biol Chem 280: 20069-75 (2005))。一些RIP顯示抗病毒活性及超氧化物歧化酶活性(Erice A等人，Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993)；Au T等人，FEBS Lett 471: 169-72 (2000)；Parikh B, Tumer N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004)；Sharma N等人，Plant Physiol 134: 171-81 (2004))。在活體外及活體內均已觀察到志賀毒素催化活性。志賀毒素效應活性分析之非限制性實例量測各種活性，諸如蛋白質合成抑制活性、去嘌呤活性、抑制細胞生長、細胞毒性、超螺旋DNA鬆弛活性及核酸酶活性。
如本文所用，志賀毒素效應功能之保留係指如藉由具有再現性之適當定量分析所量測，在相同條件下與野生型志賀毒素效應多肽對照(例如志賀毒素A1片段)或包含野生型志賀毒素效應多肽(例如志賀毒素A1片段)之CD38結合蛋白相比，能夠展現一定水準之志賀毒素功能活性。對於核糖體失活或核糖體抑制之志賀毒素效應功能，諸如藉由使用熟習此項技術者已知及/或本文所闡述之分析，保留之志賀毒素效應功能在活體外環境中展現10,000 pM或更小之IC50。對於靶標陽性細胞殺死分析中細胞毒性之志賀毒素效應功能，例如藉由使用熟習此項技術者已知及/或本文所闡述之分析，保留之志賀毒素效應功能展現1,000 nM或更小之CD50 ，如所示此取決於細胞類型及其對適當細胞外靶標生物分子之表現。
出於本發明之目的，關於核糖體抑制之術語「等效」意指憑經驗量測之核糖體抑制活性水準，如藉由具有再現性之適當定量分析所量測，該定量分析在相同條件下在參考分子(例如第二CD38結合蛋白或第三CD38結合蛋白) 10%或更小之活性內可再現。
出於本發明之目的，關於細胞毒性之術語「等效」意指如藉由具有再現性之適當定量分析所量測之憑經驗量測的細胞毒性水準，其在相同條件下在參考分子(例如第二CD38結合蛋白或第三結合蛋白) 10%或更小之活性內可再現。
如本文所用，關於細胞毒性之術語「減毒」意指在相同條件下，分子所展現的CD50 係在參考分子所展現的CD50 之10倍至100倍之間。
在確定志賀毒素效應功能活性水準時，不應考慮不準確之IC50 及CD50 值。對於一些樣品，由於無法收集準確曲線擬合所需之數據點，故可能無法獲得IC50 或CD50 之準確值。舉例而言，理論上，若在給定樣品之濃度系列中未分別出現大於50%之核糖體抑制或細胞死亡，則無法測定IC50 及CD50 。如在對來自說明性志賀毒素效應功能分析(諸如下文實例中所闡述之分析)的數據之分析中所闡述，不足以準確擬合曲線之數據不應視為代表實際志賀毒素效應功能。
無法偵測志賀毒素效應功能之活性可能歸因於不適當之表現、多肽摺疊及/或蛋白質穩定性，而非缺乏細胞進入、亞細胞按路線發送及/或酶活性。志賀毒素效應功能之分析可能不需要極多的本發明之多肽來量測大量志賀毒素效應功能活性。就憑經驗地將低或無效應功能之潛在原因確定為與蛋白質表現或穩定性相關而言，熟習此項技術者可能夠使用此項技術中已知之蛋白質化學及分子改造技術來補償此等因素，使得可恢復且量測志賀毒素功能效應活性。作為實例，不適當的基於細胞之表現可藉由使用不同表現控制序列來補償；且不適當的多肽摺疊及/或穩定性可受益於使末端序列穩定或非效應區中使分子三維結構穩定之補償性突變。
一些志賀毒素效應功能不容易量測，例如亞細胞按路線發送功能。舉例而言，沒有常規定量分析來區分志賀毒素效應多肽不能具有細胞毒性及/或遞送異源抗原決定基是否係由於不適當的亞細胞按路線發送所致，但在可進行測試時，則可分析志賀毒素效應多肽與適當野生型志賀毒素效應多肽相比的任何顯著水準之亞細胞按路線發送。然而，若本發明之結合蛋白的志賀毒素效應多肽組分展現與野生型志賀毒素A亞單元構築體相當或等效之細胞毒性，則推斷至少在所測試之條件下，亞細胞按路線發送活性水準分別與野生型志賀毒素A亞單元構築體之亞細胞按路線發送活性水準相當或等效。
當可獲得用於個別志賀毒素功能之新的分析時，可分析志賀毒素效應多肽及/或包含志賀毒素效應多肽之結合蛋白的任何水準之彼等志賀毒素效應功能，諸如與功能性剔除之志賀毒素效應多肽相比，其活性在野生型志賀毒素效應多肽1000倍或100倍或更小內或展現3倍至30倍或更大的活性。
僅藉由在細胞毒性分析中觀察分子之細胞毒性活性水準即可推斷出足夠的亞細胞按路線發送，該等細胞毒性分析諸如基於T細胞抗原決定基呈遞或基於涉及胞質及/或內質網定位之靶標受質的毒素效應功能之細胞毒性分析。
如本文所用，「顯著」志賀毒素效應功能之保留係指如藉由具有再現性之適當定量分析所量測，志賀毒素功能活性之水準與野生型志賀毒素效應多肽對照(例如志賀毒素A1片段)相當。對於活體外核糖體抑制，顯著志賀毒素效應功能展現300 pM或更小之IC50，此取決於分析中所用的核糖體之來源(例如細菌、古細菌或真核(藻類、真菌、植物或動物)來源)。與催化破壞的SLT-1A 1-251雙重突變體(Y77S/E167D)所展現之大約100,000 pM之IC50 相比，此係顯著更大之抑制。對於實驗室細胞培養物中之靶標陽性細胞殺死分析中之細胞毒性，顯著志賀毒素效應功能展現100 nM、50 nM、30 nM或更小之CD50 ，此取決於結合區之靶標生物分子及細胞類型，特定而言該細胞類型對所評估分子靶向之適當細胞外靶標生物分子及/或細胞外抗原決定基之表現及/或細胞表面呈現。與單獨的沒有細胞靶向結合區之志賀毒素A亞單元(或野生型志賀毒素A1片段) (其CD50 為100-10,000 nM，取決於細胞株)相比，此對適當的靶標陽性細胞群體具有顯著更大之細胞毒性。
出於本發明之目的且關於本發明分子之志賀毒素效應功能，術語「合理活性」係指相對於包含天然(或野生型)志賀毒素之分子，展現至少中等水準(例如在11倍至1,000倍內)的如本文所定義之志賀毒素效應活性，其中志賀毒素效應活性係選自：內化效率、至胞質液之亞細胞按路線發送效率、靶細胞遞送抗原決定基呈遞、核糖體抑制及細胞毒性。對於細胞毒性，合理水準之志賀毒素效應活性包括在野生型志賀毒素構築體之1,000倍內，諸如當野生型志賀毒素構築體展現0.5 nM之CD50 時(例如包含野生型志賀毒素A1片段之結合蛋白)，其展現500 nM或更小之CD50 。
出於本發明之目的且關於本發明分子之細胞毒性，術語「最佳」係指志賀毒素催化結構域介導之細胞毒性水準係在包含野生型志賀毒素A1片段(例如志賀毒素A亞單元或其一些截短之變異體)及/或天然(或野生型)志賀毒素之分子的細胞毒性之2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍內。
應注意，即使志賀毒素效應多肽之細胞毒性相對於野生型志賀毒素A亞單元或其片段降低，但實際上，使用減毒之志賀毒素效應多肽之應用可能與使用野生型志賀毒素效應多肽相同或較其更有效，此乃因最高功效之變異體可能展現不期望之效應，該等不期望之效應在細胞毒性功效降低的變異體中係最小化或降低。野生型志賀毒素極強效，其能夠在僅1個毒素分子到達中毒細胞之胞質液之後或也許在僅40個毒素分子已內化至中毒細胞中之後殺死中毒細胞。與野生型志賀毒素效應多肽相比，志賀毒素效應功能(諸如亞細胞按路線發送或細胞毒性)即便顯著降低之志賀毒素效應多肽對於實際應用(諸如涉及靶細胞殺死、貨物分子遞送及/或偵測特定細胞及其亞細胞區室之應用)可能仍然足夠強效。另外，一些活性降低之志賀毒素效應多肽尤其可用於將分子貨物(例如額外外源性材料)遞送至CD38陽性靶細胞之一些細胞內位置或亞細胞區室。
關於分子之細胞毒性活性之術語「選擇性細胞毒性」係指CD38靶標陽性細胞群體(例如所靶向細胞類型)與非靶向旁觀者細胞群體(例如CD38靶標陰性細胞類型)之間的相對細胞毒性水準，其可表示為所靶向細胞類型之半最大細胞毒性濃度(CD50 )相對於非靶向細胞類型之CD50 之比率，以提供細胞毒性選擇性之量度或對靶向細胞相對於非靶向細胞之殺死選擇性之指示。
給定細胞外靶標生物分子(或給定靶標生物分子之細胞外抗原決定基)之細胞表面呈現及/或密度可能影響一些結合蛋白可最適宜使用之應用。細胞之間給定靶標生物分子之細胞表面呈現及/或密度的差異可在數量上及性質上改變給定結合蛋白之細胞內化效率及/或細胞毒性功效。給定靶標生物分子之細胞表面呈現及/或密度可在靶標生物分子陽性細胞之間或甚至在處於細胞週期或細胞分化不同點之同一細胞上具有極大變化。給定靶標生物分子及/或給定靶標生物分子之一些細胞外抗原決定基在特定細胞或細胞群體上之總細胞表面呈現可使用熟習此項技術者已知之方法(諸如涉及螢光活化細胞分選(FACS)流式細胞術之方法)來測定。
如本文所用，關於多肽內之多肽區或特徵，術語「破壞(disrupted、disruption或disrupting)」及其文法變體係指該區域內或構成所破壞特徵之至少一個胺基酸之改變。胺基酸改變包括各種突變，諸如改變多肽之胺基酸序列之缺失、倒位、插入或取代。胺基酸改變亦包括化學變化，諸如改變胺基酸官能基中之一或多個原子或向胺基酸官能基添加一或多個原子。
如本文所用，「去免疫化」意指在投與個體(例如人類個體)之後，與參考分子(諸如野生型肽區、多肽區或多肽)相比，抗原性及/或免疫原性潛能降低。此包括總體抗原性及/或免疫原性潛能之降低，即使與參考分子相比引入一或多個從頭合成之抗原性及/或免疫原性抗原決定基。對於一些實施例，「去免疫化」意指分子在投與哺乳動物之後，與其所源自之「親代」分子(諸如野生型志賀毒素A1片段或包含前述所提及者之結合蛋白)相比展現降低之抗原性及/或免疫原性。在一些實施例中，去免疫化的志賀毒素效應多肽能夠展現與參考「親代」分子相比降低約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%之相對抗原性，或該相對抗原性大於在相同條件下藉由相同分析(諸如熟習此項技術者已知及/或本文所闡述之分析，如定量ELISA或西方墨點(Western blot)分析)量測的參考分子之抗原性。在一些實施例中，去免疫化的志賀毒素效應多肽能夠展現與參考「親代」分子相比降低約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約97%、約99%之相對免疫原性，或該相對免疫原性大於在相同條件下藉由相同分析(諸如熟習此項技術者已知及/或本文所闡述之分析，如在給定時間點接受分子之非經腸投與之後，對哺乳動物中所產生的抗分子抗體之定量量測)量測的參考分子之免疫原性。
說明性結合蛋白之相對免疫原性係在一段時間內重複非經腸投與之後，使用針對結合蛋白之活體內抗體反應之分析來測定。
出於本發明之目的，片語「B細胞及/或CD4+ T細胞去免疫化」意指分子在投與哺乳動物之後，具有降低的關於B細胞抗原性或免疫原性及/或CD4+ T細胞抗原性或免疫原性之抗原性及/或免疫原性潛能。對於一些實施例，「B細胞去免疫化」意指分子在投與哺乳動物之後，與其所源自之「親代」分子(諸如野生型志賀毒素A1片段)相比，展現降低之B細胞抗原性及/或免疫原性。對於一些實施例，「CD4+ T細胞去免疫化」意指分子在投與哺乳動物之後，與其所源自之「親代」分子(諸如野生型志賀毒素A1片段)相比，展現降低之CD4 T細胞抗原性及/或免疫原性。
關於志賀毒素效應多肽中之B細胞抗原決定基、CD4+ T細胞抗原決定基、B細胞抗原決定基區域或CD4+ T細胞抗原決定基區域之術語「內源性」係指存在於野生型志賀毒素A亞單元中之抗原決定基。
出於本發明之目的，片語「CD8+ T細胞超免疫化」意指當分子存在於活個體(例如人類個體)內之有核細胞內部時，具有增加的關於CD8+ T細胞抗原性或免疫原性之抗原性及/或免疫原性潛能。通常，由於固有特徵或作為本發明之CD38結合蛋白之組分，CD8+ T細胞免疫化分子能夠細胞內化至有核細胞之早期胞內體區室。
出於本發明之目的，術語「異源性」例如與內源性相反，意指具有不同來源，例如異源性志賀A亞單元多肽並非作為天然志賀毒素之任一A亞單元之一部分天然地存在。本發明之融合蛋白包含非異源性組分，例如志賀毒素及抗CD38抗原結合結構域。
關於本發明之結合蛋白的多肽組分之術語「嵌入」及其文法變體係指用不同胺基酸內部替代多肽區內之一或多個胺基酸，以產生與起始多肽區共有相同胺基酸殘基總數之新的多肽序列。因此，術語「嵌入」不包括任何額外胺基酸、肽或多肽組分與起始多肽之任何外部末端融合，亦不包括任何額外胺基酸殘基之任何額外內部插入，而是僅包括對現有胺基酸之取代。內部替代可僅藉由胺基酸殘基取代或藉由一系列之取代、缺失、插入及/或倒位來完成。若使用一或多個胺基酸之插入，則必須在插入旁邊缺失相等數量之近端胺基酸以產生嵌入肽。此與關於本發明之結合蛋白之多肽組分使用的術語「插入」相反，其係指在多肽內部插入一或多個胺基酸，從而產生與起始多肽相比胺基酸殘基數量增加之新的多肽。
關於本發明之結合蛋白的多肽組分之術語「插入」及其文法變體係指在多肽內插入一或多個胺基酸，從而產生與起始多肽相比胺基酸殘基數量增加之新的多肽序列。關於本發明之結合蛋白的多肽組分之片語「部分地插入」、「嵌入及插入」及其文法變體係指所產生多肽之長度增加，但增加量少於等於整個插入多肽之長度的胺基酸殘基數量之情形。無論插入係「純的」抑或「部分的」，其均包括先前所闡述插入中之任一者，即使多肽中不鄰近多肽內插入位點之其他區域缺失而導致最終多肽之總長度減少亦如此，此乃因最終多肽在多肽區內仍包含T細胞抗原決定基-肽之一或多個胺基酸之內部插入。
出於本發明之目的，關於本發明之結合蛋白的志賀毒素效應多肽區之位置的片語「鄰近胺基末端」係指如下距離：其中志賀毒素效應多肽區之至少一個胺基酸殘基係在結合蛋白之胺基末端之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個(例如至多18-20個)胺基酸殘基內，只要結合蛋白能夠展現本文所述之適當水準之志賀毒素效應功能活性(例如一定水準之細胞毒性功效)即可。因此，對於本發明之一些實施例，在胺基末端融合至志賀毒素效應多肽之任何胺基酸殘基不應降低任何志賀毒素效應功能(例如，藉由空間阻礙志賀毒素效應多肽區胺基末端附近之結構)，使得志賀毒素效應多肽之功能活性降低至低於本文所需之適當活性水準。
出於本發明之目的，關於本發明之結合蛋白內的志賀毒素效應多肽區與另一組分(例如靶向細胞之結合區、分子部分及/或額外外源性材料)相比之位置之片語「更鄰近胺基末端」係指志賀毒素效應多肽之胺基末端之至少一個胺基酸殘基與另一參考組分相比更靠近本發明之結合蛋白的線性多肽組分之胺基末端之位置。
出於本發明之目的，片語「源自志賀毒素家族成員之一個A亞單元之活性酶結構域」係指具有經由催化核糖體失活機制抑制蛋白質合成之能力。天然志賀毒素之酶活性可由抑制蛋白質轉譯之能力來定義，該抑制蛋白質轉譯之能力係使用熟習此項技術者已知之分析來測定，該等分析係諸如涉及活細胞不存在下RNA轉譯之活體外分析或涉及活細胞中RNA轉譯之活體內分析。使用熟習此項技術者已知及/或本文所闡述之分析，志賀毒素酶活性之功效可藉由觀察針對核糖體RNA (rRNA)之N-糖苷酶活性(諸如核糖體切口形成(nicking)分析)來直接評價，及/或藉由觀察核糖體功能及/或蛋白質合成之抑制來間接評價。
出於本發明之目的，術語「志賀毒素A1片段區域」係指基本上由志賀毒素A1片段組成及/或源自志賀毒素之志賀毒素A1片段之多肽區。
出於本發明之目的，關於結合蛋白之術語「末端」、「胺基末端」或「羧基末端」通常係指該結合蛋白之多肽鏈(例如單一連續多肽鏈)之最後一個胺基酸殘基。結合蛋白可包含一種以上多肽或蛋白質，且因此本發明之結合蛋白可包含多個胺基末端及羧基末端。舉例而言，結合蛋白之「胺基末端」可由多肽鏈中代表多肽胺基末端之第一胺基酸殘基來界定，該第一胺基酸殘基之特徵通常以起始胺基酸殘基來描述，該起始胺基酸殘基不與涉及該起始胺基酸殘基之一級胺基或涉及作為N-烷基化α胺基酸殘基類成員之起始胺基酸殘基之等效氮的任何胺基酸殘基具有肽鍵。類似地，結合蛋白之「羧基末端」可由多肽鏈中代表多肽羧基末端之最後一個胺基酸殘基來界定，該最後一個胺基酸殘基之特徵通常以最終胺基酸殘基來描述，該最終胺基酸殘基不具有藉由肽鍵連接至其一級羧基之α-碳的任何胺基酸殘基。
出於本發明之目的，關於多肽區之術語「末端」、「胺基末端」或「羧基末端」係指該區之區域邊界，而不管該區以外是否藉由肽鍵連接其他胺基酸殘基。換言之，其係指多肽區之末端，而不管該區是否與其他肽或多肽融合。舉例而言，包含兩個蛋白質性區之融合蛋白(例如包含肽或多肽及志賀毒素效應多肽之結合區)可具有如下志賀毒素效應多肽區：其中羧基末端在該志賀毒素效應多肽區之胺基酸殘基251處終止，儘管存在涉及殘基251至位置252處代表另一蛋白質性區(例如結合區)開始之胺基酸殘基之肽鍵。在此實例中，志賀毒素效應多肽區之羧基末端係指殘基251，其不係融合蛋白之末端，而是代表內部區域邊界。因此，對於多肽區而言，術語「末端」、「胺基末端」及「羧基末端」用於指多肽區之邊界，無論該邊界係物理性末端抑或嵌入較大多肽鏈內之內部位置。
出於本發明之目的，片語「志賀毒素A1片段之羧基末端區」係指源自天然志賀毒素A1片段之多肽區，該區以疏水性殘基(例如StxA-A1及SLT-1A1之V236及SLT-2A1之V235)開始，之後為疏水性殘基，且該區以在志賀毒素A1片段多肽之間保守的弗林蛋白酶(furin)裂解位點終止且在天然志賀毒素A亞單元中A1片段與A2片段之間的接合處終止。出於本發明之目的，志賀毒素A1片段之羧基末端區包括源自志賀毒素A1片段多肽之羧基末端之肽區，諸如包含志賀毒素A1片段之羧基末端或基本上由其組成之肽區。源自志賀毒素A1片段之羧基末端之肽區的非限制性實例包括如下天然定位之胺基酸殘基序列：自Stx1A (SEQ ID NO:2)或SLT-1A (SEQ ID NO:1)中之位置236至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250或251；及自SLT-2A (SEQ ID NO:3)中之位置235至位置239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250。
出於本發明之目的，關於連接分子部分及/或結合區之片語「鄰近A1片段多肽之羧基末端」係指在距界定志賀毒素A1片段多肽之最後一個殘基的胺基酸殘基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸殘基內。
出於本發明之目的，片語「在空間上覆蓋A1片段衍生區域之羧基末端」包括連接及/或融合至A1片段衍生區域之羧基末端中之胺基酸殘基的大小為4.5 kDa或更大之任何分子部分(例如免疫球蛋白型結合區)，該胺基酸殘基諸如源自天然定位在Stx1A (SEQ ID NO:2)或SLT-1A (SEQ ID NO:1)中之位置236至251或SLT-2A (SEQ ID NO:3)中之235至250中之任一者處的胺基酸殘基之胺基酸殘基。出於本發明之目的，片語「在空間上覆蓋A1片段衍生區域之羧基末端」亦包括連接及/或融合至A1片段衍生區域之羧基末端中之胺基酸殘基的大小為4.5 kDa或更大之任何分子部分(例如免疫球蛋白型結合區)，該胺基酸殘基諸如A1片段衍生區域及/或志賀毒素效應多肽中最後一個胺基酸羧基末端之胺基酸殘基。出於本發明之目的，片語「在空間上覆蓋A1片段衍生區域之羧基末端」亦包括大小為4.5 kDa或更大之任何分子部分(例如免疫球蛋白型結合區)，其在物理上防止A1片段衍生區域之羧基末端之細胞識別，諸如藉由真核細胞之ERAD機構之識別。
出於本發明之目的，包含含有至少40個胺基酸之多肽且連接(例如融合)至包含A1片段衍生區域之志賀毒素效應多肽區之羧基末端的結合區(諸如免疫球蛋白型結合區)係「在空間上覆蓋A1片段衍生區域之羧基末端」之分子部分。
出於本發明之目的，包含含有至少40個胺基酸之多肽且連接(例如融合)至包含A1片段衍生區域之志賀毒素效應多肽區之羧基末端的結合區(諸如免疫球蛋白型結合區)係「阻礙A1片段衍生區域之羧基末端」之分子部分。
出於本發明之目的，術語「志賀毒素家族成員之A1片段」係指在弗林蛋白酶裂解位點處由弗林蛋白酶進行蛋白分解後，志賀毒素A亞單元之其餘胺基末端片段，該弗林蛋白酶裂解位點在志賀毒素A亞單元之間係保守的且定位在野生型志賀毒素A亞單元中之A1片段與A2片段之間。
出於本發明之目的，片語「A1片段區域羧基末端處之弗林蛋白酶裂解基元」係指在志賀毒素A亞單元之間保守且橋接天然志賀毒素A亞單元中A1片段與A2片段之間的接合處之特定弗林蛋白酶裂解基元。
出於本發明之目的，片語「鄰近A1片段區域羧基末端之弗林蛋白酶裂解位點」係指在距A1片段區域或A1片段衍生區域中界定最後一個胺基酸殘基之胺基酸殘基少於1、2、3、4、5、6、7或更多個胺基酸殘基之距離內具有胺基酸殘基的任何可鑑別之弗林蛋白酶裂解位點，其包括位於A1片段區域或A1片段衍生區域羧基末端之弗林蛋白酶裂解基元，諸如在鄰近A1片段衍生區域與分子之另一組分(諸如本發明之結合蛋白之分子部分)之鍵聯的位置。
如本文所用，術語「額外CD38靶向治療劑」意指靶向CD38以產生治療效應或益處之額外治療劑(例如分子)。此額外CD38靶向治療劑與結合蛋白互補，且在其CD38靶向活性上不與結合蛋白直接競爭。該額外CD38靶向治療劑可包含干擾CD38信號傳導之抗CD38抗體或小分子抑制劑、基本上由其組成或由其組成。舉例而言，額外CD38靶向治療劑可包含抗CD38抗體療法、基本上由其組成或由其組成，該抗CD38抗體療法所結合之抗原性決定子不與結合蛋白所結合之抗原性決定子重疊，或其結合CD38分子之方式使得在結合時，額外CD38靶向治療劑不會阻止本發明之結合蛋白對該CD38分子之結合。舉例而言，額外CD38靶向治療劑可包含抗CD38單株抗體療法(諸如達雷木單抗)、基本上由其組成或由其組成。
出於本發明之目的，片語「受破壞的弗林蛋白酶裂解基元」係指(i) 如本文在部分I-B中所闡述之特定弗林蛋白酶裂解基元及(ii) 其包含突變及/或截短，該突變及/或截短可賦予分子與參考分子相比降低之弗林蛋白酶裂解，諸如可再現地觀察到弗林蛋白酶裂解較在相同條件下之相同分析中所觀察到的參考分子之弗林蛋白酶裂解降低30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或更低(包括無裂解情況下之100%)。與參考分子相比之弗林蛋白酶裂解百分比可表示為相關分子之裂解:未裂解材料除以參考分子之裂解:未裂解材料之比率(例如，參見WO 2015/191764；WO 2016/196344)。適宜參考分子之非限制性實例包括包含如本文所闡述之野生型志賀毒素弗林蛋白酶裂解基元及/或弗林蛋白酶裂解位點之一些分子。
出於本發明之目的，片語「抗弗林蛋白酶裂解」意指分子或其特定多肽區可再現地展現少於以下的弗林蛋白酶裂解：(i) 野生型志賀毒素A亞單元中志賀毒素A1片段之羧基末端或(ii) 構築體之志賀毒素A1片段衍生區域之羧基末端，其中天然定位在A1與A2片段之間接合處的天然弗林蛋白酶裂解位點未受破壞；如藉由熟習此項技術者可獲得之任何方式所分析，包括藉由使用本文所闡述之方法。
出於本發明之目的，片語「源自志賀毒素家族成員之A亞單元之活性酶結構域」係指能夠經由基於志賀毒素酶活性核糖體之催化失活來抑制蛋白質合成之多肽結構。分子結構展現蛋白質合成之抑制活性及/或核糖體之催化失活的能力可使用熟習此項技術者已知之各種分析來觀察，諸如涉及活細胞不存在下之RNA轉譯分析之活體外分析或涉及活細胞核糖體之活體內分析。舉例而言，使用熟習此項技術者已知之分析，分子基於志賀毒素酶活性之酶活性可藉由觀察針對核糖體RNA (rRNA)之N-糖苷酶活性(諸如核糖體切口形成分析)來直接評價，及/或藉由觀察核糖體功能、RNA轉譯及/或蛋白質合成之抑制來間接評價。
如本文關於志賀毒素效應多肽所用，「組合」闡述包含兩個或更多個亞區之志賀毒素效應多肽，其中每一亞區包含例如以下中之至少一者：(1) 內源性抗原決定基或抗原決定基區域中之破壞；及(2) 在A1片段區域之羧基末端處之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元。
如本文關於本發明之分子所用，「結合蛋白」可與「CD38結合蛋白」或「CD38結合分子」或「CD38結合融合蛋白」互換使用。所有以上所提及之分子類型均包括各種「CD38結合蛋白」。通常，本發明之蛋白質在本文中稱為「CD38結合融合蛋白」，其包含CD38結合結構域(在本文中亦稱為「抗CD38抗原結合結構域」(ABD))及如本文更充分闡述之視情況存在的連接體以及「志賀毒素A亞單元效應多肽」，其中視情況存在的連接體如本文更充分地闡述。 B.    導論
本發明提供一類結合CD38且包含志賀毒素A亞單元效應多肽之結合蛋白(視情況存在連接體；在本文中稱為「CD38結合融合蛋白」)。本發明之CD38結合融合蛋白係有用的，例如(1) 作為抑制CD38表現細胞生長之分子，(2) 作為殺死CD38表現細胞之細胞毒性分子，(3) 用於在其他細胞中選擇性地殺死特定CD38陽性細胞類型，(4) 作為將貨物分子遞送至CD38表現細胞內部之無毒遞送媒劑，(5) 作為診斷分子，用於涉及CD38表現細胞之疾病及疾患之診斷、預後或表徵，及(6) 作為治療分子，用於治療涉及CD38表現細胞之多種疾病、病症及病狀，諸如一些血液癌症，包括造血系統癌症(如多發性骨髓瘤)及CD38陽性細胞生長病症。在一些實施例中，CD38結合蛋白可用於治療有需要個體之非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、柏基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma，BL)、B慢性淋巴球性白血病(B-CLL)、B及T急性淋巴球性白血病(ALL)、T細胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓性白血病(AML)、毛細胞白血病(HCL)、霍奇金氏淋巴瘤(HL)及慢性骨髓性白血病(CML)。在一些實施例中，本發明之CD38結合蛋白可用於治療有需要個體之復發性或難治性多發性骨髓瘤。在一些實施例中，本發明之CD-38結合蛋白可用於治療有需要個體之黑色素瘤。
志賀毒素A亞單元效應多肽為改造新穎結合蛋白提供強勁且有力之骨架(例如，參見WO 2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO 2015/191764、WO 2016/196344、WO 2017/019623、WO 2018/106895及WO 2018/140427)。CD38結合免疫球蛋白衍生片段作為細胞靶向部分與志賀毒素A亞單元效應多肽之締合使得能夠改造靶向CD38表現細胞之治療及診斷分子。 C.    CD38結合融合蛋白之一般結構
本發明之CD38結合融合蛋白可包含(1) 結合區，其能夠特異性結合與細胞表面締合之CD38之細胞外部分；及(2) 志賀毒素效應多肽區，其包含志賀毒素A亞單元效應多肽(在本文中稱為「志賀毒素效應多肽」)。在一些實施例中，本發明之結合蛋白包含兩個或更多個相同的CD38結合區及兩個或更多個志賀毒素效應多肽區(無論相同抑或不同)。本發明之CD38結合融合蛋白之一個非限制性實例係融合至免疫球蛋白型結合區之志賀毒素效應多肽，該免疫球蛋白型結合區包含在與細胞表面締合時特異性結合至CD38之細胞外部分之單鏈可變片段；或如下文更充分闡述之以上所提及者之同二聚體。
在一些實施例中，本發明結合蛋白之志賀毒素A亞單元效應多肽將產生兩種或更多種性質之結構元件組合在單一分子中，諸如具有以下能力：1) 與缺少該特定元件組合之分子變異體相比，展現降低之抗原性及/或免疫原性，2) 與缺少該特定元件組合之分子變異體相比，展現降低之蛋白酶裂解，3) 與缺少該特定元件組合之分子變異體相比，在一定劑量下展現降低之針對多細胞生物體之非特異性毒性及/或4) 展現強效細胞毒性。
在一些實施例中，本發明之CD38結合融合蛋白係單體。在一些實施例中，CD38結合融合蛋白係同二聚體。在一些實施例中，CD38結合融合蛋白係包含兩個一致多肽之同二聚體。在一些實施例中，單體CD38結合融合蛋白包含SEQ ID NO: 233之序列，或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致之序列。 1.    CD38結合區
在一些實施例中，本發明之CD38結合蛋白包含結合區(亦稱為「結合結構域」或「抗原結合結構域(ABD)」)，該結合區包含免疫球蛋白型多肽(例如VH及VL)，該多肽能夠展現與CD38及/或存在於諸如哺乳動物(例如人類、非人類靈長類動物、小鼠等)中之CD38表現細胞或CD38陽性細胞等細胞之細胞表面上的CD38之特異性及高親和性結合。
本發明提供多個CD38結合結構域。下文闡述CD38結合結構域之特異性CDR。如上文所闡述，不同編號系統之間CDR之確切編號及佈置可不同。然而，應理解，重鏈可變區及/或輕鏈可變區之發明內容包括其中所存在的CDR之發明內容。因此，每一重鏈可變區之發明內容係vhCDR (例如vhCDR1、vhCDR2及vhCDR3)之發明內容，且每一輕鏈可變區之發明內容係vlCDR (例如vlCDR1、vlCDR2及vlCDR3)之發明內容。
本發明提供包含新穎CD38結合結構域之結合蛋白。此等抗原結合結構域(ABD)可結合人類及食蟹猴CD38蛋白。圖25A至25D繪示四種不同的結合蛋白，其包含可結合至人類及食蟹猴CD38二者之四種不同的抗CD38 ABD。在一些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區例如在兩條不同多肽鏈上以Fab格式排列。在一些實施例中，重鏈可變區及輕鏈可變區融合在一起以形成如本文所概述之scFv。或者，如圖1中所示及下文更充分地闡述，來自兩個CD-38結合融合蛋白單體之CD-38結合結構域二聚化，接著彼此締合，亦即來自一條單體多肽鏈之一個VH與來自另一條單體多肽鏈之VL締合，且反之亦然，使得在非共價締合之同二聚體中形成兩個抗CD38結合結構域，其亦含有兩種志賀組分。
本文亦包括在一或多個CDR及/或框架區中具有胺基酸修飾之抗CD38 ABD。如本文所概述，在一些實施例中，6個CDR之集合可具有0、1、2、3、4、5或6個胺基酸修飾(其中胺基酸取代尤其有用)。CDR可具有胺基酸修飾(例如在CDR之集合中1、2、3、4、5或6個胺基酸修飾(亦即，只要該6個CDR之集合中的變化總數小於6個胺基酸修飾，則CDR可經修飾，其中CDR之任一組合發生變化；例如在vlCDR1中可有一個變化，在vhCDR2中可有兩個變化，在vhCDR3中無變化等)。在一些實施例中，每一CDR具有不超過一個胺基酸取代。在一些實施例中，避免vhCDR3中之胺基酸取代。在一些情形中，對人類及食蟹猴CD38中之一或兩者之結合親和力可能增加，而在其他實施中，結合親和力可能降低。在該等實施例中，與人類及食蟹猴CD38之結合得以保持。用於測試抗CD38抗原結合結構域與本文所概述之VH及VL序列相比是否含有突變之適宜分析為此項技術中所已知，諸如Biacore分析或實例1、2或3中所概述之結合分析。
在一些實施例中，本文所概述之抗CD38 ABD亦可在可變重鏈及可變輕鏈框架區中之一或兩者之框架區中具有胺基酸修飾(同樣，胺基酸取代尤其有用)，只要該等框架(不包括CDR)與人類生殖系序列保持至少約80%、約85%或約90%一致性即可。因此，舉例而言，如本文所闡述之一致CDR可與來自人類生殖系序列之不同框架序列組合，只要該等框架區與人類生殖系序列保持至少80%、至少85%或至少90%一致性即可。
在另一態樣中，本發明提供包括上文所列示之重鏈可變區及輕鏈可變區之變異體的CD38結合結構域。重鏈可變區與本文之「VH」序列可至少80% (例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致，且/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個胺基酸變化。輕鏈可變區與本文之「VL」序列可至少80% (例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致，且/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個胺基酸變化。在該等實施例中，只要抗原結合結構域仍結合至人類及食蟹猴CD38，則本發明包括該等變異體。用於測試抗CD38抗原結合結構域與本文所概述之VH及VL序列相比是否含有突變之適宜分析為此項技術中所已知，諸如Biacore分析及實例1、2及3之彼等分析。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM1 (圖25A)，且包括具有與SEQ ID NO:109至少80% (例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列之重鏈可變區及具有與SEQ ID NO:113至少80% (例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM1 (圖25A)，且包括包含SEQ ID NO:110之vhCDR1、包含SEQ ID NO:111之vhCDR2、包含SEQ ID NO:112之vhCDR3、包含SEQ ID NO:114之vlCDR1、包含SEQ ID NO:115之vlCDR2及包含SEQ ID NO:116之vlCDR3。在一些實施例中，此6個CDR中之一或多者具有1、2、3、4或5個胺基酸修飾。在實施例中，任何單一CDR含有不超過1或2個胺基酸取代，且經修飾之抗CD38抗原結合結構域保持與人類CD38之結合。
在一些實施例中，CD38TM1之CD38結合結構域(圖25A)具有在SEQ ID NO:109中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VH結構域。
在一些實施例中，CD38TM1之CD38結合結構域(圖25A)具有在SEQ ID NO:113中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VL結構域。
在一些實施例中，CD38TM1之CD38結合結構域(圖25A)具有在SEQ ID NO:109中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VH結構域及在SEQ ID NO:113中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VL結構域。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM1 (圖25A)，且具有含有SEQ ID NO:109之VH及含有SEQ ID NO:113之VL。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM2 (圖25B)，且包括具有與SEQ ID NO:117至少80% (例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列之重鏈可變區及具有與SEQ ID NO:121至少80% (例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM2 (圖25B)，且包括包含SEQ ID NO:118之vhCDR1、包含SEQ ID NO:119之vhCDR2、包含SEQ ID NO:120之vhCDR3、包含SEQ ID NO:122之vlCDR1、包含SEQ ID NO:23之vlCDR2及包含SEQ ID NO:124之vlCDR3。在一些實施例中，此6個CDR中之一或多者具有1、2、3、4或5個胺基酸修飾。在實施例中，單一CDR含有不超過1或2個胺基酸取代，且經修飾之抗CD38抗原結合結構域保持與人類及/或食蟹猴CD38之結合。
在一些實施例中，CD38TM2之CD38結合結構域(圖25B)具有在SEQ ID NO:117中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VH結構域。
在一些實施例中，CD38TM1之CD38結合結構域(圖25A)具有在SEQ ID NO:121中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VL結構域。
在一些實施例中，CD38TM2之CD38結合結構域(圖25B)具有在SEQ ID NO:117中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VH結構域及在SEQ ID NO:121中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VL結構域。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM2 (圖25B)，且具有含有SEQ ID NO:117之VH及含有SEQ ID NO:121之VL。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM3 (圖25C)，且包括具有與SEQ ID NO:101至少80% (例如、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列之重鏈可變區及具有與SEQ ID NO:105至少80% (例如、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM3 (圖25C)，且包括包含SEQ ID NO:102之vhCDR1、包含SEQ ID NO:103之vhCDR2、包含SEQ ID NO:104之vhCDR3、包含SEQ ID NO:106之vlCDR1、包含SEQ ID NO:7之vlCDR2及包含SEQ ID NO:108之vlCDR3。在一些實施例中，此6個CDR中之一或多者具有1、2、3、4或5個胺基酸修飾。在實施例中，單一CDR含有1或2個胺基酸取代，且經修飾之抗CD38抗原結合結構域保持與人類及/或食蟹猴CD38之結合。
在一些實施例中，CD38TM3之CD38結合結構域(圖25C)具有在SEQ ID NO:101中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VH結構域。
在一些實施例中，CD38TM3之CD38結合結構域(圖25C)具有在SEQ ID NO:105中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VL結構域。
在一些實施例中，CD38TM3之CD38結合結構域(圖25C)具有在SEQ ID NO:101中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VH結構域及在SEQ ID NO:105中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VL結構域。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM3 (圖25C)，且具有含有SEQ ID NO:101之VH及含有SEQ ID NO:105之VL。
在一些實施例中，本發明中CD38結合結構域係CD38TM4 (圖25D)，其包括具有與SEQ ID NO:101至少80% (例如、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列之重鏈可變區及具有與SEQ ID NO:125至少80% (例如、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM4 (圖25D)，且包括包含SEQ ID NO:102之vhCDR1、包含SEQ ID NO:3之vhCDR2、包含SEQ ID NO:104之vhCDR3、包含SEQ ID NO:106之vlCDR1、包含SEQ ID NO:107之vlCDR2及包含SEQ ID NO:108之vlCDR3。在一些實施例中，此6個CDR中之一或多者具有1、2、3、4或5個胺基酸修飾。在實施例中，單一CDR含有1或2個胺基酸取代，且經修飾之抗CD38抗原結合結構域保持與人類及/或食蟹猴CD38之結合。
在一些實施例中，CD38TM4之CD38結合結構域(圖25D)具有在SEQ ID NO:101中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VH結構域。
在一些實施例中，CD38TM1之CD38結合結構域(圖25A)具有在SEQ ID NO:125中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VL結構域。
在一些實施例中，CD38TM4之CD38結合結構域(圖25D)具有在SEQ ID NO:101中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VH結構域及在SEQ ID NO:125中含有不超過1、2、3、4或5個胺基酸變化之VL結構域。
在一些實施例中，CD38結合結構域係CD38TM4 (圖25D)，且具有含有SEQ ID NO:101之VH及含有SEQ ID NO:125之VL。
除本文中針對每一CD38結合結構域之重鏈及輕鏈可變區及/或CDR中所闡述之序列變異體以外，亦可改變重鏈及/或輕鏈可變區之框架區。在一些實施例中，在與表4中所闡述之框架區序列保持至少80%、85%、90%或95%一致性之框架區中進行變化，同時使6個CDR保持不變且保持與人類及/或食蟹猴CD38之結合。
在一些實施例中，在框架區及6個CDR二者中進行變化，同時保持CD38結合結構域與人類及/或食蟹猴CD38之結合。在該等實施例中，CDR可具有胺基酸修飾(例如在6個CDR之集合中1、2、3、4或5個胺基酸修飾，亦即，只要該6個CDR之集合中的變化總數小於6個胺基酸修飾，則CDR可經修飾，其中CDR之任一組合發生變化；例如在vlCDR1中可有一個變化，在vhCDR2中可有兩個變化，在vhCDR3中無變化等)。 a.     CD38結合結構域之格式
如圖1中所示及本文中所闡述，本發明之CD38結合結構域包含可駐留在不同多肽鏈上或駐留在單一多肽鏈上之VH及VL結構域。應注意，在一些實施例中，VH及VL可形成scFv，其中CD38結合融合蛋白係(例如)單體。在如本文所闡述及圖1中所示之一些情形中，VH及VL係在單一多肽鏈上，但其間之連接體過短而不能容許分子內締合，且因此形成含有兩個抗CD38結合區及2種志賀組分之同二聚體。在其他實施例中，VH與VL之間連接體之長度足以容許形成scFv，且因此蛋白質融合物係單體。
在一些實施例中，組合物包含含有本文所闡述之CD38結合結構域之scFv。該等scFv結合至人類及食蟹猴CD38，且包含由scFv連接體連接之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，CD38結合結構域自其N末端至C末端包含VH-連接體-VL。在一些實施例中，CD38結合結構域自其N末端至C末端包含VL-連接體-VH。 2.    志賀毒素效應多肽組分
本發明之結合蛋白包含至少一個源自志賀毒素A亞單元之志賀毒素效應多肽。志賀毒素效應多肽係源自能夠展現一或多種志賀毒素功能之志賀毒素家族之志賀毒素A亞單元成員之多肽(例如，參見Cheung M等人，Mol Cancer 9: 28 (2010)；WO 2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO 2015/191764、WO 2016/196344、WO 2017/019623、WO 2018/106895及WO 2018/140427)。志賀毒素功能包括例如增加細胞內化、引導自胞內體區室至胞質液之亞細胞按路線發送、避免細胞內降解、使核糖體催化失活(防止蛋白質合成)及實現細胞生長抑制及/或細胞毒性效應。
蛋白質毒素之志賀毒素家族係由在結構上及功能上相關的各種天然毒素構成，例如志賀毒素、志賀樣毒素1及志賀樣毒素2 (Johannes L, Römer W,Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010))。志賀毒素家族之全毒素成員含有選擇性地結合一些宿主細胞表面上存在之特定鞘醣脂之靶向結構域及一旦在細胞內部即能夠使核糖體永久失活之酶結構域(Johannes L, Römer W,Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010))。志賀毒素家族之成員共有相同的總體結構及作用機制(Engedal N等人，Microbial Biotech 4: 32-46 (2011))。舉例而言，Stx、SLT-1及SLT-2在無細胞系統中展示難以區分之酶活性(Head S等人，J Biol Chem 266: 3617-21 (1991)；Tesh V等人，Infect Immun 61: 3392-402 (1993)；Brigotti M等人，Toxicon 35:1431-1437 (1997))。
志賀毒素家族涵蓋自痢疾志賀氏菌(S. dysenteriae )血清型1分離出之真正志賀毒素(Stx)、自腸出血性大腸桿菌(E. coli )血清型分離出之志賀樣毒素1變異體(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)及自腸出血性大腸桿菌血清型分離出之志賀樣毒素2變異體(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1與Stx之不同之處僅在於一個胺基酸殘基，且二者均稱為維羅細胞毒素(Verocytotoxin)或維羅毒素(Verotoxin，VT) (O’Brien A,Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992))。儘管SLT1及SLT2變異體在一級胺基酸序列層面上彼此僅約53-60%相似，但其共有志賀毒素家族成員所共有之酶活性及細胞毒性機制(Johannes L, Römer W,Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010))。已闡述超過39種不同的志賀毒素，諸如已界定之亞型Stx1a、Stx1c、Stx1d及Stx2a-g (Scheutz F等人，J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012))。志賀毒素家族之成員並非天然地侷限於任何細菌物種，此乃因志賀毒素編碼基因可經由水平基因轉移在細菌物種之間傳播(Strauch E等人，Infect Immun 69: 7588-95 (2001)；Bielaszewska M等人，Appl Environ Micrbiol 73: 3144-50 (2007)；Zhaxybayeva O, Doolittle W,Curr Biol 21: R242-6 (2011))。作為種間轉移之實例，在自人類個體分離之溶血性不動桿菌(A. haemolyticus )菌株中發現了志賀毒素(Grotiuz G等人，J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006))。一旦編碼志賀毒素之多核苷酸進入新的亞種或種，則由於遺傳漂變及/或選擇壓力，推測志賀毒素胺基酸序列能夠產生輕微之序列變異，同時仍維持志賀毒素家族成員所共有之細胞毒性機制(參見Scheutz F等人，J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012))。
在如下文更充分闡述的本發明之CD38結合蛋白之一些實施例中，志賀毒素A亞單元效應多肽組分包含至少以下志賀毒素效應多肽亞區之組合：(1) 去免疫化亞區及(2) 靠近志賀毒素A1片段區域羧基末端之抗蛋白酶裂解亞區。
在一些實施例中，CD38結合蛋白包含志賀毒素A亞單元效應多肽，其包含SEQ ID NO: 45-69中任一者之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少95%、至少99%胺基酸序列一致性之序列。在一些實施例中，志賀毒素A亞單元效應多肽包含SEQ ID NO: 46之序列。 a.     在特定實施例中有用之志賀毒素組分
如此項技術中已闡述，存在多種可用於與如下文所概述之本發明之CD38結合區組合之志賀毒素組分。具體而言，來自2019年1月23日提出申請之美國臨時申請案第62/795,633號之1號至11號實施例係以全文引用的方式明確地併入。 (i)    野生型志賀毒素組分
在一些實施例中，可使用野生型志賀毒素效應多肽，諸如表20之SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所示(例如，參見WO 2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2017/019623，其全部均係以全文引用的方式併入，且尤其對於野生型序列之序列及片段，諸如WO2017/019623之段落[21]中所提及者)。 (ii)   具有受破壞的弗林蛋白酶裂解基元之志賀毒素組分
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽在其志賀毒素A1片段區域之羧基末端包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元(例如，參見WO 2015/191764，其在此以全文引用的方式明確地併入，且具體而言段落[8]、[9]及受破壞基元及包括該等受破壞基元之毒素多肽之序列)。就此而言尤其有用之實施例係SEQ ID NO:46。
志賀毒素家族成員之志賀毒素A亞單元在其A1片段區域之羧基末端包含對於志賀毒素功能重要之保守弗林蛋白酶裂解位點。熟習此項技術者使用標準技術及/或藉由使用本文資訊可鑑別弗林蛋白酶裂解位點基元及弗林蛋白酶裂解位點。
志賀毒素細胞毒性之模型在於弗林蛋白酶在中毒細胞中對志賀毒素A亞單元之細胞內蛋白水解處理對於以下至關重要：1) 自志賀全毒素之剩餘部分釋放A1片段，2) 藉由暴露A1片段羧基末端中之疏水性結構域使A1片段自內質網逃脫，及3) 酶促活化A1片段(參見Johannes L, Römer W,Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010))。志賀毒素A1片段自中毒細胞內質網中A2片段及志賀全毒素之其餘組分之有效釋放對於至胞質液之有效細胞內按路線發送、最大酶活性、有效核糖體失活及達成最佳細胞毒性至關重要，亦即與野生型志賀毒素相當(例如，參見WO 2015/191764及其中之參考文獻)。
在志賀毒素中毒期間，A亞單元在保守精胺酸殘基(例如StxA及SLT-1A中位置251處之精胺酸殘基及Stx2A及SLT-2A中位置250處之精胺酸殘基)之羧基鍵處由弗林蛋白酶以蛋白水解方式裂解。志賀毒素A亞單元之弗林蛋白酶裂解發生在胞內體及/或高爾基氏體區室中。弗林蛋白酶係一種特殊的絲胺酸內切蛋白酶，其在所檢查的所有人類組織中由眾多種細胞類型表現，且由大多數動物細胞表現。弗林蛋白酶裂解包含通常集中在最小二元共有基元R-x-(R/K/x)-R (SEQ ID NO: 181)上之可及基元之多肽。志賀毒素家族成員之A亞單元包含保守的表面暴露之延伸環結構(例如StxA及SLT-1A中之242-261，及SLT-2中之241-260)，其具有由弗林蛋白酶裂解之保守S-R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 182)基元。弗林蛋白酶誘導的StxA之裂解需要定位在StxA中胺基酸殘基242-261處之表面暴露之延伸環結構，包括側接最小弗林蛋白酶裂解基元R-x-x-R (SEQ ID NO: 183)之特徵。
熟習此項技術者使用標準方法及/或藉由使用本文資訊可鑑別志賀毒素A亞單元及志賀毒素效應多肽中之弗林蛋白酶裂解基元及弗林蛋白酶裂解位點。弗林蛋白酶裂解最小共有基元R-x-x-R (SEQ ID NO: 183) (Schalken J等人，J Clin Invest 80: 1545-9 (1987)；Bresnahan P等人，J Cell Biol 111: 2851-9 (1990)；Hatsuzawa K等人，J Biol Chem 265: 22075-8 (1990)；Wise R等人，Proc Natl Acad Sci USA 87: 9378-82 (1990)；Molloy S等人，J Biol Chem 267: 16396-402 (1992))。與此一致，許多弗林蛋白酶抑制劑包含含有基元R-x-x-R (SEQ ID NO: 183)之肽。弗林蛋白酶之合成抑制劑之實例係包含肽R-V-K-R (SEQ ID NO: 190)之分子(Henrich S等人，Nat Struct Biol 10: 520-6 (2003))。一般而言，可預測包含表面可及之二元胺基酸基元(其中兩個帶正電之胺基酸由兩個胺基酸殘基隔開)之肽或蛋白質對弗林蛋白酶裂解敏感，其中裂解發生在基元中最後一個鹼性胺基酸之羧基鍵處。
受質中由弗林蛋白酶裂解之共有基元已鑑別為具有一定程度之特異性。已闡述包含20個連續胺基酸殘基之區的弗林蛋白酶裂解位點基元，其可使用Schechter I, Berger, A,Biochem Biophys Res Commun 32: 898-902 (1968)中所闡述之命名法標記為P14至P6’ (Tian S等人，Int J Mol Sci 12: 1060-5 (2011))。根據此命名法，弗林蛋白酶裂解位點係在指定為P1之胺基酸殘基之羧基鍵處，且弗林蛋白酶裂解基元之胺基酸殘基在自此參考P1殘基朝向胺基末端之方向上編號為P2、P3、P4等。利用’符號P2’、P3’、P4’等對基元中自P1參考殘基朝向羧基末端之胺基酸殘基進行編號。使用此命名法，P6至P2’區描繪弗林蛋白酶裂解基元之由弗林蛋白酶之酶結構域結合之核心受質。該兩個側接區P14至P7及P3’至P6’通常富含極性胺基酸殘基，以增加至位於其間的核心弗林蛋白酶裂解位點之可及性。
一般弗林蛋白酶裂解位點通常由共有基元R-x-x-R (SEQ ID NO: 183)描述，該共有基元對應於P4-P3-P2-P1 (SEQ ID NO: 192)；其中「R」代表精胺酸殘基(參見上表1)，短劃線「-」代表肽鍵，且小寫字母「x」代表任一胺基酸殘基。然而，其他殘基及位置可有助於進一步界定弗林蛋白酶裂解基元。略微更精細之弗林蛋白酶裂解位點共有基元通常報告為共有基元R-x-[K/R]-R (SEQ ID NO: 191) (其中正斜杠「/」意指「或」，且將同一位置之替代胺基酸殘基劃分開)，該共有基元對應於P4-P3-P2-P1 (SEQ ID NO: 192)，此乃因觀察到弗林蛋白酶對含有此基元之裂解受質具有強的偏好性。
除最小弗林蛋白酶裂解位點R-x-x-R (SEQ ID NO:183)以外，亦已闡述較大之弗林蛋白酶裂解基元，其在某些位置處具有某些胺基酸殘基偏好。藉由比較各種已知之弗林蛋白酶受質，已對20個胺基酸殘基長的弗林蛋白酶裂解位點基元中之胺基酸殘基之某些物理化學性質進行表徵。弗林蛋白酶裂解基元之P6至P2’區描繪與弗林蛋白酶之酶結構域物理相互作用之核心弗林蛋白酶裂解位點。兩個側接區P14至P7及P3’至P6’通常係親水的，其富含極性胺基酸殘基以增加位於其間的核心弗林蛋白酶裂解位點之表面可及性。
一般而言，自位置P5至P1之弗林蛋白酶裂解基元區傾向於包含具有正電荷及/或高等電點之胺基酸殘基。特定而言，標誌弗林蛋白酶蛋白分解位置之P1位置通常由精胺酸佔據，但其他帶正電之胺基酸殘基亦可在此位置中出現。位置P2及P3傾向於由撓性胺基酸殘基佔據，且特定而言，P2傾向於由精胺酸、離胺酸或有時由極小且具撓性之胺基酸殘基(如甘胺酸)佔據。P4位置傾向於由弗林蛋白酶受質中帶正電之胺基酸殘基佔據。然而，若P4位置由脂肪族胺基酸殘基佔據，則帶正電之官能基之缺乏可由位於位置P5及/或P6的帶正電之殘基來補償。位置P1’及P2’通常由脂肪族及/或疏水性胺基酸殘基佔據，其中P1’位置最通常由絲胺酸佔據。
兩個親水性側接區傾向於由極性、親水性且具有較小胺基酸官能基之胺基酸殘基佔據；然而，在某些經驗證之弗林蛋白酶受質中，側接區不含任何親水性胺基酸殘基(參見Tian S,Biochem Insights 2: 9-20 (2009))。
天然志賀毒素A亞單元中發現的在志賀毒素A1片段與A2片段之間接合處之20個胺基酸殘基之弗林蛋白酶裂解基元及弗林蛋白酶裂解位點在某些志賀毒素中得到充分表徵。舉例而言，在StxA (SEQ ID NO:2)及SLT-1A (SEQ ID NO:1)中，此弗林蛋白酶裂解基元天然定位於L238至F257，且在SLT-2A (SEQ ID NO:3)中，此弗林蛋白酶裂解基元天然定位於V237至Q256。基於本文所闡述之胺基酸同源性、實驗及/或弗林蛋白酶裂解分析，熟習此項技術者可鑑別其他天然志賀毒素A亞單元或志賀毒素效應多肽中之弗林蛋白酶裂解基元，其中該等基元係實際弗林蛋白酶裂解基元或預計在弗林蛋白酶裂解真核細胞內之彼等分子後會產生A1及A2片段。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含(1) 具有羧基末端之志賀毒素A1片段衍生多肽及(2) 在志賀毒素A1片段衍生多肽羧基末端處之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元。熟習此項技術者藉由使用此項技術中已知之技術可鑑別志賀毒素A1片段衍生多肽之羧基末端，諸如藉由使用蛋白質序列比對軟體鑑別(i) 與天然志賀毒素保守之弗林蛋白酶裂解基元、(ii) 與天然志賀毒素保守之表面暴露之延伸環及/或(iii) 可由ERAD系統識別之一段主要為疏水性之胺基酸殘基(亦即疏水性「區片(patch)」)。
本發明之結合蛋白之抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽(1) 可在其志賀毒素A1片段區域之羧基末端完全缺乏任何弗林蛋白酶裂解基元及/或(2) 在其志賀毒素A1片段區域之羧基末端及/或源自志賀毒素A1片段羧基末端之區包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元。弗林蛋白酶裂解基元之破壞包括弗林蛋白酶裂解基元中胺基酸殘基之各種改變，諸如轉譯後修飾、胺基酸官能基中一或多個原子之改變、向胺基酸官能基添加一或多個原子、與非蛋白質性部分之締合及/或與胺基酸殘基、肽、多肽之鍵聯以諸如產生分支之蛋白質性結構。
使用本文所闡述、WO 2015/191764中所闡述及/或熟習此項技術者已知之方法，可自天然或非天然的志賀毒素效應多肽及/或志賀毒素A亞單元多肽產生抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽，其中所得分子仍保持一或多種志賀毒素A亞單元功能。
出於本發明之目的，關於弗林蛋白酶裂解位點或弗林蛋白酶裂解基元之術語「破壞」或「受破壞」係指與野生型志賀毒素A亞單元或源自僅包含野生型多肽序列之野生型志賀毒素A亞單元之多肽的弗林蛋白酶裂解相比，天然弗林蛋白酶裂解位點及/或弗林蛋白酶裂解基元之改變(諸如突變)，其導致志賀毒素A1片段區域或其所衍生之可鑑別區之羧基末端附近的弗林蛋白酶裂解減少。弗林蛋白酶裂解基元中胺基酸殘基之改變包括弗林蛋白酶裂解基元中之突變，諸如弗林蛋白酶裂解基元中之缺失、插入、倒位、取代及/或羧基末端截短，以及轉譯後修飾，其諸如源自涉及將分子偶聯或連接至胺基酸殘基之官能基之糖基化、白蛋白化及諸如此類。由於弗林蛋白酶裂解基元包含約20個胺基酸殘基，因此在理論上，涉及該20個位置中之任一者之一或多個胺基酸殘基之改變、修飾、突變、缺失、插入及/或截短可導致弗林蛋白酶裂解敏感性之降低(Tian S等人，Sci Rep 2: 261 (2012))。弗林蛋白酶裂解位點及/或弗林蛋白酶裂解基元之破壞可能增加或可能不會增加對其他蛋白酶(諸如胰蛋白酶及哺乳動物血管系統中常見之細胞外蛋白酶)裂解之抗性。給定破壞對給定蛋白酶之裂解敏感性之效應可由熟習此項技術者使用此項技術中已知之技術來測試。
出於本發明之目的，「受破壞的弗林蛋白酶裂解基元」係包含源自20個胺基酸殘基區之一或多個胺基酸殘基之改變之弗林蛋白酶裂解基元，該20個胺基酸殘基區代表在天然志賀毒素A亞單元中所發現的在志賀毒素A1片段與A2片段區域之間接合處且經定位使得志賀毒素A亞單元之弗林蛋白酶裂解會產生A1及A2片段的保守的弗林蛋白酶裂解基元；其中與參考分子相比，該受破壞的弗林蛋白酶裂解基元以實驗上可再現之方式展現降低之弗林蛋白酶裂解，該參考分子包含融合至羧基末端多肽之野生型志賀毒素A1片段區域，該羧基末端多肽之大小足夠大以能使用熟習此項技術者已知及/或本文所闡述之適當分析監測弗林蛋白酶裂解。
可破壞弗林蛋白酶裂解位點及弗林蛋白酶裂解基元之突變類型之實例係胺基酸殘基缺失、插入、截短、倒位及/或取代，包括經非標準胺基酸及/或非天然胺基酸之取代。另外，弗林蛋白酶裂解位點及弗林蛋白酶裂解基元可由突變破壞，該等突變包含藉由添加共價連接之結構對胺基酸之修飾，該共價連接之結構掩蓋該位點或基元中之至少一個胺基酸，諸如由於聚乙二醇化、小分子佐劑之偶合及/或位點特異性白蛋白化所致。
若弗林蛋白酶裂解基元已由突變及/或非天然胺基酸殘基之存在破壞，則某些受破壞的弗林蛋白酶裂解基元可能不容易被識別為與任何弗林蛋白酶裂解基元相關；然而，志賀毒素A1片段衍生區域之羧基末端將係可識別的，且將界定弗林蛋白酶裂解基元未受破壞之情況下該弗林蛋白酶裂解基元所處之位置。舉例而言，與志賀毒素A亞單元及/或志賀毒素A1片段相比，由於羧基末端截短，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元可包含弗林蛋白酶裂解基元之少於20個胺基酸殘基。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含(1) 具有羧基末端之志賀毒素A1片段衍生多肽及(2) 在志賀毒素A1片段多肽區羧基末端處之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元；其中與參考分子(諸如包含A1片段之羧基末端及/或A1與A2片段之間的保守弗林蛋白酶裂解基元之野生型志賀毒素多肽)相比，該志賀毒素效應多肽(及包含其之任何結合蛋白)對弗林蛋白酶裂解更具抗性。舉例而言，一個分子與參考分子相比的弗林蛋白酶裂解之降低可藉由以下來測定：使用WO 2015/191764中所闡述之活體外弗林蛋白酶裂解分析，該分析係使用相同條件進行，且接著對自裂解產生之任何片段之帶密度實施定量，以定量地量測弗林蛋白酶裂解之變化。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，志賀毒素效應多肽在活體外及/或活體內對弗林蛋白酶裂解更具抗性。
一般而言，藉由將本發明之結合蛋白與使其抗弗林蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽經包含志賀毒素A1片段之野生型志賀毒素效應多肽替代之相同分子進行比較來測試本發明結合蛋白之蛋白酶裂解敏感性。在一些實施例中，與包含在羧基末端融合至肽或多肽之野生型志賀毒素A1片段之參考分子相比，包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元之本發明之CD38結合融合蛋白展現活體外弗林蛋白酶裂解降低至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或更大。
已闡述若干種弗林蛋白酶裂解基元破壞。舉例而言，在最小R-x-x-R基元(SEQ ID NOL: 183)中使兩個保守精胺酸突變為丙胺酸完全阻斷弗林蛋白酶及/或弗林蛋白酶樣蛋白酶之處理(例如，參見Duda A等人，J Virology 78: 13865-70 (2004))。由於弗林蛋白酶裂解位點基元包含約20個胺基酸殘基，因此在理論上，涉及一或多個該20個胺基酸殘基位置中之任一者之某些突變可消除弗林蛋白酶裂解或降低弗林蛋白酶裂解效率(例如，參見Tian S等人，Sci Rep 2: 261 (2012))。
在一些實施例中，本發明之CD38結合融合蛋白包含源自志賀毒素家族成員之至少一個A亞單元之志賀毒素效應多肽，其中該志賀毒素效應多肽在源自志賀毒素A亞單元之保守、高度可及之蛋白酶裂解敏感環之一或多個胺基酸中包含破壞。舉例而言，在StxA及SLT-1A中，此高度可及之蛋白酶敏感環天然定位在胺基酸殘基242至261，且在SLT-2A中，此保守環天然定位在胺基酸殘基241至260。基於多肽序列同源性，熟習此項技術者可鑑別其他志賀毒素A亞單元中之此保守、高度可及之環結構。此環中胺基酸殘基之某些突變可降低環內某些胺基酸殘基對蛋白水解裂解之可及性，且此可降低弗林蛋白酶裂解敏感性。
在一些實施例中，本發明之分子包含含有受破壞的弗林蛋白酶裂解基元之志賀毒素效應多肽，該受破壞的弗林蛋白酶裂解基元在志賀毒素A亞單元之間保守的表面暴露之蛋白酶敏感環中包含突變。在一些實施例中，本發明之分子包含含有受破壞的弗林蛋白酶裂解基元之志賀毒素效應多肽，該受破壞的弗林蛋白酶裂解基元在志賀毒素A亞單元之此蛋白酶敏感環中包含突變，該突變降低環內某些胺基酸殘基之表面可及性，使得弗林蛋白酶裂解敏感性降低。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含就共有胺基酸殘基P1及P4 (諸如最小弗林蛋白酶裂解基元R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)之位置1及4中之胺基酸殘基)之一者或兩者之存在、位置或官能基而言之破壞。舉例而言，將最小弗林蛋白酶共有位點R-x-x-R (SEQ ID NO: 183)中之兩個精胺酸殘基中之一者或兩者突變為丙胺酸將破壞弗林蛋白酶裂解基元且防止該位點之弗林蛋白酶裂解。類似地，將最小弗林蛋白酶裂解基元R-x-x-R (SEQ ID NO: 183)中之一個或兩個精胺酸殘基胺基酸殘基取代為熟習此項技術者已知之任一非保守胺基酸殘基將降低該基元之弗林蛋白酶裂解敏感性。特定而言，將精胺酸胺基酸殘基取代為缺少正電荷之任一非鹼性胺基酸殘基(諸如A、G、P、S、T、D、E、Q、N、C、I、L、M、V、F、W及Y)將產生受破壞的弗林蛋白酶裂解基元。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含共有胺基酸殘基P4與P1之間間隔中的破壞(就中間胺基酸殘基數不為2而言)，且因此將P4及/或P1變為不同位置且消除P4及/或P1命名。舉例而言，弗林蛋白酶裂解基元內最小弗林蛋白酶裂解位點或核心弗林蛋白酶裂解基元之缺失將降低弗林蛋白酶裂解基元之弗林蛋白酶裂解敏感性。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含一或多個胺基酸殘基取代。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)內之一或多個胺基酸殘基取代，諸如對於StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽，天然定位之胺基酸殘基R248經任一非帶正電之胺基酸殘基取代及/或R251經任一非帶正電之胺基酸殘基取代；且對於SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽，天然定位之胺基酸殘基Y247經任一非帶正電之胺基酸殘基取代及/或R250經任一非帶正電之胺基酸殘基取代。
在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含未受破壞之最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)，而是包含受破壞的側接區，諸如天然定位在例如241-247及/或252-259之弗林蛋白酶裂解基元側接區中之一或多個胺基酸殘基中之胺基酸殘基取代。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含對位於弗林蛋白酶裂解基元P1-P6區中之一或多個胺基酸殘基之取代；將P1’突變為巨大胺基酸，諸如R、W、Y、F及H；及將P2’突變為極性及親水性胺基酸殘基；及用一或多個巨大及疏水性胺基酸殘基取代位於弗林蛋白酶裂解基元P1’-P6’區中之一或多個胺基酸殘基。
在一些實施例中，弗林蛋白酶裂解基元之破壞包含弗林蛋白酶裂解基元內至少一個胺基酸殘基之缺失、插入、倒位及/或突變。在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽包含天然定位在志賀樣毒素1 (SEQ ID NO:1)或志賀毒素(SEQ ID NO:2)之A亞單元之胺基酸249-251處或志賀樣毒素2 (SEQ ID NO:3)之A亞單元之胺基酸247-250處或保守志賀毒素效應多肽及/或非天然志賀毒素效應多肽序列中之等效位置處的胺基酸序列之破壞。在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽包含含有弗林蛋白酶裂解基元內之至少一個胺基酸之缺失之破壞。在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽包含含有蛋白酶裂解基元區內之至少一個胺基酸之插入之破壞。在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽包含含有胺基酸倒位之破壞，其中至少一個倒位胺基酸係在蛋白酶基元區內。在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽包含含有突變之破壞，諸如胺基酸取代為非標準胺基酸或具有化學修飾側鏈之胺基酸。
在本發明之CD38結合融合蛋白之一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含弗林蛋白酶裂解基元內9個、10個、11個或更多個羧基末端胺基酸殘基之缺失。在該等實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元將不包含弗林蛋白酶裂解位點或最小弗林蛋白酶裂解基元。換言之，一些實施例在A1片段區域之羧基末端缺少弗林蛋白酶裂解位點。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含胺基酸殘基缺失及胺基酸殘基取代二者。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)內之一或多個胺基酸殘基缺失及取代，諸如對於StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽，天然定位之胺基酸殘基R248經任一非帶正電之胺基酸殘基取代及/或R251經任一非帶正電之胺基酸殘基取代；且對於SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽，天然定位之胺基酸殘基Y247經任一非帶正電之胺基酸殘基取代及/或R250經任一非帶正電之胺基酸殘基取代。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含胺基酸殘基缺失及胺基酸殘基取代以及羧基末端截短。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)內之一或多個胺基酸殘基缺失及取代，諸如對於StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽，天然定位之胺基酸殘基R248經任一非帶正電之胺基酸殘基取代及/或R251經任一非帶正電之胺基酸殘基取代；且對於SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽，天然定位之胺基酸殘基Y247經任一非帶正電之胺基酸殘基取代及/或R250經任一非帶正電之胺基酸殘基取代。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)內之胺基酸取代以及羧基末端截短二者，諸如對於StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽，截短終止於天然胺基酸位置249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大，且若適當，包含經任一非帶正電之胺基酸殘基取代之天然定位之胺基酸殘基R248及/或R251；且對於SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽，截短終止於天然胺基酸位置248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大，且若適當，包含經任一非帶正電之胺基酸殘基取代之天然定位之胺基酸殘基Y247及/或R250。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含一或多個胺基酸殘基之插入，只要所插入之胺基殘基不產生新的弗林蛋白酶裂解位點即可。在一些實施例中，一或多個胺基酸殘基之插入破壞最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)中精胺酸殘基之間的天然間隔，諸如在249或250且由此在R248與R251之間包含一或多個胺基酸殘基之插入之StxA及SLT-1A衍生多肽；或在248或249且由此在Y247與R250之間包含一或多個胺基酸殘基之插入之SLT-2A衍生多肽。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含胺基酸殘基插入及羧基末端截短二者。在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含胺基酸殘基插入及胺基酸殘基取代二者。在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含胺基酸殘基插入及胺基酸殘基缺失二者。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含胺基酸殘基缺失、胺基酸殘基插入及胺基酸殘基取代。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含胺基酸殘基缺失、插入、取代及羧基末端截短。
在一些實施例中，包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元之志賀毒素效應多肽係藉由肽鍵直接融合至包含胺基酸、肽及/或多肽之分子部分，其中融合結構涉及單一之連續多肽。在該等融合實施例中，在受破壞的弗林蛋白酶裂解基元之後的胺基酸序列不應在融合接合處產生新的弗林蛋白酶裂解位點。
上述抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽亞區及/或受破壞的弗林蛋白酶裂解基元中之任一者可單獨使用或與本發明之每一個別實施例(包括本發明之方法)組合使用。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽可在志賀毒素A1片段衍生區域之羧基末端包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元及/或弗林蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，志賀毒素效應多肽不包含任何已知之可在志賀毒素A1片段衍生區域之羧基末端附近提供弗林蛋白酶裂解之補償性結構。適用於本發明之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元及弗林蛋白酶裂解位點之非限制性實例闡述於WO 2015/191764中。
某些弗林蛋白酶裂解基元破壞在本文中藉由參考序列表中所提供之天然志賀毒素A亞單元之特定胺基酸位置來指示，應注意，天然志賀毒素A亞單元包括在其胺基末端含有約22個胺基酸之信號序列之前體形式，該等信號序列經去除以產生成熟志賀毒素A亞單元且可為熟習此項技術者所識別。此外，包含突變之某些弗林蛋白酶裂解基元破壞在本文中藉由參考天然存在於天然志賀毒素A亞單元內特定位置處之特定胺基酸(例如R代表精胺酸殘基) (例如R251代表在自胺基末端起位置251處之精胺酸殘基)，之後為在所討論之特定突變中取代該殘基之胺基酸(例如R251A代表在自胺基末端起胺基酸殘基251處丙胺酸對精胺酸之胺基酸取代)來指示。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽在志賀毒素A1片段衍生區域之羧基末端包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元，且此等實施例在本文中稱為「抗弗林蛋白酶裂解」或「抗蛋白酶裂解」之志賀毒素效應多肽以闡述其相對於野生型志賀毒素A亞單元及/或野生型志賀毒素A1片段融合蛋白之性質。
在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽基本上由具有兩個或更多個突變之截短的志賀毒素A亞單元組成。
在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元，該基元包含最小弗林蛋白酶裂解位點共有基元中之一個或兩個精胺酸殘基經A、G或H之胺基酸殘基取代(相對於野生型志賀毒素多肽)。在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽包含破壞，該破壞包含弗林蛋白酶裂解基元區內之胺基酸取代，其中該取代發生在選自由以下組成之群的天然定位胺基酸處：SEQ ID NO:3之胺基酸247、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸248、SEQ ID NO:3之胺基酸250、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸251或保守志賀毒素效應多肽及/或非天然志賀毒素效應多肽序列中之等效位置。在一些實施例中，取代係針對任一非保守之胺基酸，且取代發生在天然定位之胺基酸殘基位置處。在一些實施例中，突變包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：R247A、R248A、R250A R251A或保守志賀毒素效應多肽及/或非天然志賀毒素效應多肽序列中之等效位置。
在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元，該基元包含缺失突變。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含突變，該突變係天然定位在StxA (SEQ ID NO:2)及SLT-1A (SEQ ID NO:3)中之247-252之區域或天然定位在SLT-2A (SEQ ID NO:3)中之246-251之區域的缺失；天然定位在StxA (SEQ ID NO:2)及SLT-1A (SEQ ID NO:3)中之244-246之區域或天然定位在SLT-2A (SEQ ID NO:3)中之243-245之區域的缺失；或天然定位在StxA (SEQ ID NO:2)及SLT-1A (SEQ ID NO:3)中之253-259之區域或天然定位在SLT-2A (SEQ ID NO:3)中之252-258之區域的缺失。
在一些實施例中，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元，該基元包含與野生型志賀毒素A亞單元相比羧基末端截短之突變，該截短導致弗林蛋白酶裂解基元內一或多個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含羧基末端截短，該截短缺失最小裂解位點Y/R-x-x-R (SEQ ID NO: 180)內之一或多個胺基酸殘基，諸如對於StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽，截短終止於天然胺基酸殘基位置250、249、248、247、246、245、244、243、242、241、240或更小；且對於SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽，截短終止於天然胺基酸殘基位置249、248、247、246、245、244、243、242、241或更小。在可能的情形下，一些實施例包含含有任一上文所提及突變之組合之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元。
在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含弗林蛋白酶裂解基元之部分羧基末端截短之突變；然而，本發明之一些CD38結合融合蛋白不包含作為整個20個胺基酸殘基弗林蛋白酶裂解基元之完全羧基末端截短之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元。舉例而言，一些志賀毒素效應多肽包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元，該基元包含在StxA (SEQ ID NO:2)或SLT-1A (SEQ ID NO:1)中多至天然位置240處之志賀毒素A1片段區域之部分羧基末端截短，但在位置239或更小處沒有羧基末端截短。類似地，某些志賀毒素效應多肽包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元，該基元包含在SLT-2A (SEQ ID NO:3)中多至天然位置239之志賀毒素A1片段區域之部分羧基末端截短，但在位置238或更小處沒有羧基末端截短。在抗弗林蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽之最大羧基末端截短中，仍然存在包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元(弗林蛋白酶裂解基元之位置P14及P13)之突變。
在一些其他實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含弗林蛋白酶裂解基元之完全或部分羧基末端截短之突變。舉例而言，某些志賀毒素效應多肽包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元，該基元包含在StxA (SEQ ID NO:2)或SLT-1A (SEQ ID NO:1)中多至天然位置236或在SLT-2A (SEQ ID NO:3)中多至235處之志賀毒素A1片段區域之完全羧基末端截短。舉例而言，某些細胞毒性降低之志賀毒素效應多肽包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元，該基元包含在StxA (SEQ ID NO:2)或SLT-1A (SEQ ID NO:1)中天然位置240或SLT-2A (SEQ ID NO:3)中239以外之志賀毒素A1片段區域之完全羧基末端截短。細胞毒性降低之志賀毒素效應多肽可用於將外源性材料遞送至細胞及/或特定亞細胞區室中。
在一些實施例中，與野生型志賀毒素A亞單元相比，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)內之胺基酸殘基取代以及羧基末端截短二者，諸如對於StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽，截短終止於天然胺基酸殘基位置249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大，且若適當，包含經任一非帶正電之胺基酸殘基取代之天然定位胺基酸殘基R248及/或R251；且對於SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽，截短終止於天然胺基酸殘基位置248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大，且若適當，包含經任一非帶正電之胺基酸殘基取代之天然定位胺基酸殘基Y247及/或R250。在一些實施例中，包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元之截短之志賀毒素效應多肽亦包含位置P9、P8及/或P7處之弗林蛋白酶裂解基元胺基酸殘基以維持最佳細胞毒性。
在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含與野生型志賀毒素A亞單元相比一或多個內部胺基酸殘基缺失之突變。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含在最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)內具有一或多個胺基酸殘基缺失之突變。舉例而言，StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽包含天然定位胺基酸殘基R248及/或R251之內部缺失，其可與周圍殘基(諸如249、250、247、252等)之缺失組合；且SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽包含天然定位胺基酸殘基Y247及/或R250之內部缺失，其可與周圍殘基(諸如248、249、246、251等)之缺失組合。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含四個連續胺基酸殘基之缺失之突變，該突變使最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)缺失，諸如缺少R248-R251之StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽及缺少Y247-R250之SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含在側接核心弗林蛋白酶裂解基元之胺基酸殘基中具有一或多個胺基酸殘基缺失之突變，諸如SLT-1A或StxA中胺基酸244-247及/或胺基酸252-255之缺失。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含與野生型志賀毒素A亞單元相比整個表面暴露之蛋白酶裂解敏感環之內部缺失之突變，諸如對於StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽，天然定位胺基酸殘基241-262之缺失；且對於SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽，天然定位胺基酸殘基240-261之缺失。
在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含弗林蛋白酶裂解基元內之內部胺基酸殘基缺失之突變及與野生型志賀毒素A亞單元相比羧基末端截短之突變二者。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)內之胺基酸殘基缺失之突變及與野生型志賀毒素A亞單元相比羧基末端截短之突變二者。舉例而言，抗蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽可包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元，該基元包含仍具有胺基酸殘基247及/或252之截短的StxA或SLT-1A多肽中天然定位胺基酸殘基248-249及/或250-251或仍具有胺基酸殘基246及/或251之截短的SLT-2A中胺基酸殘基247-248及/或249-250之缺失之突變。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元包含具有使最小弗林蛋白酶裂解位點R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)缺失之四個連續胺基酸殘基缺失及與野生型志賀毒素A亞單元相比羧基末端截短之突變，諸如對於StxA及SLT-1A衍生之志賀毒素效應多肽，截短終止於天然胺基酸殘基位置252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大且缺少R248-R251；且對於SLT-2A衍生之志賀毒素效應多肽，截短終止於天然胺基酸殘基位置251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291或更大且缺少Y247-R250。
在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元相對於野生型志賀毒素A亞單元包含一個多個突變，該一或多個突變改變天然定位在志賀毒素A亞單元(SEQ ID NO: 1-2及4-6)之胺基酸248-251或志賀樣毒素2 A亞單元(SEQ ID NO: 3及7-18)之胺基酸247-250之區域或志賀毒素A亞單元或其衍生物之等效區域中之至少一個胺基酸殘基。在一些實施例中，受破壞的弗林蛋白酶裂解基元相對於野生型志賀毒素A亞單元在弗林蛋白酶裂解基元之最小弗林蛋白酶裂解位點中包含一或多個突變。在一些實施例中，最小弗林蛋白酶裂解位點由共有胺基酸序列R/Y-x-x-R (SEQ ID NO: 180)及/或R-x-x-R (SEQ ID NO: 183)表示。 (iii)  具有羧基末端內質網滯留/回收信號基元之志賀毒素組分
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含KDEL家族成員之羧基末端內質網滯留/回收信號基元，諸如WO2018/140427之段落[52]及WO2015/138435之段落[28]、[107]至[113]中所列舉，其全部均係以引用的方式明確地併入。 (iv) 去免疫化的志賀毒素A亞單元效應多肽
在一些實施例中，結合蛋白之志賀毒素效應多肽係去免疫化的，諸如與野生型志賀毒素、野生型志賀毒素多肽及/或僅包含野生型多肽序列之志賀毒素效應多肽相比而言。志賀毒素效應多肽及/或志賀毒素A亞單元多肽無論天然與否，均可藉由本文所闡述、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO 2016/196344及WO 2018/140427中所闡述及/或熟習此項技術者已知之方法去免疫化，其中所得分子保持一或多種志賀毒素A亞單元功能。去免疫化的志賀毒素效應多肽可包含至少一個假定內源性抗原決定基區域之破壞，以降低在向個體(諸如人類個體)投與志賀毒素效應多肽後，該多肽之抗原性及/或免疫原性潛能。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含內源性抗原決定基或抗原決定基區域(諸如B細胞及/或CD4+ T細胞抗原決定基)之破壞。在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含本文所闡述之至少一個內源性抗原決定基區域之破壞，其中該破壞降低在向個體投與志賀毒素效應多肽後該多肽之抗原性及/或免疫原性潛能，且其中該志賀毒素效應多肽能夠展現一或多種志賀毒素A亞單元功能，諸如顯著水準之志賀毒素細胞毒性。
如本文所用關於抗原決定基區域之術語「受破壞的」或「破壞」係指抗原決定基區域中至少一個胺基酸殘基之缺失；兩個或更多個胺基酸殘基之倒位，其中該等倒位胺基酸殘基中之至少一者係在抗原決定基區域；抗原決定基區域中至少一個胺基酸之插入；及抗原決定基區域中至少一個胺基酸殘基之取代。抗原決定基區域突變破壞包括經非標準胺基酸及/或非天然胺基酸之胺基酸取代。或者，抗原決定基區域可藉由突變而破壞，該等突變包含藉由添加掩蓋抗原決定基區域中至少一個胺基酸之共價連接的化學結構對胺基酸之修飾，參見(例如)聚乙二醇化(參見Zhang C等人，BioDrugs 26: 209-15 (2012)、小分子佐劑(Flower D，Expert Opin Drug Discov 7: 807-17 (2012)及位點特異性白蛋白化(Lim S等人，J Control Release 207-93 (2015))。
一些抗原決定基區域及破壞在本文中藉由參考序列表中所提供之天然志賀毒素A亞單元之特定胺基酸位置來指示，應注意，天然志賀毒素A亞單元可包含在其胺基末端含有約22個胺基酸之信號序列之前體形式，該等信號序列經去除以產生成熟志賀毒素A亞單元且可為熟習此項技術者所識別。此外，一些抗原決定基區域破壞在本文中藉由參考天然存在於天然志賀毒素A亞單元內特定位置處之特定胺基酸(例如S代表絲胺酸殘基) (例如S33代表在自胺基末端位置33處之絲胺酸殘基)，之後為在所討論之特定突變中取代該殘基之胺基酸(例如S33I代表在自胺基末端起胺基酸殘基33處異白胺酸對絲胺酸之胺基酸取代)來指示。
在一些實施例中，去免疫化的志賀毒素效應多肽包含本文所提供之至少一個抗原決定基區域之破壞。在一些實施例中，去免疫化的志賀毒素效應多肽包含WO 2015/113005或WO 2015/113007中所闡述之至少一個抗原決定基區域之破壞。
在一些實施例中，去免疫化的志賀毒素效應多肽包含全長志賀毒素A亞單元(例如SLT-1A (SEQ ID NO:1)、StxA (SEQ ID NO:2)或SLT-2A (SEQ ID NO:3))，其包含對選自由以下天然定位胺基酸組成之群的胺基酸序列之至少一個破壞：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸1-15；SEQ ID NO:3之胺基酸3-14；SEQ ID NO:3之胺基酸26-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸27-37；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸39-48；SEQ ID NO:3之胺基酸42-48；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之胺基酸53-66；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之胺基酸94-115；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸141-153；SEQ ID NO:3之胺基酸140-156；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸179-190；SEQ ID NO:3之胺基酸179-191；SEQ ID NO:3之胺基酸204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸205；SEQ ID NO:3之胺基酸210-218；SEQ ID NO:3之胺基酸240-258；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸243-257；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸254-268；SEQ ID NO:3之胺基酸262-278；SEQ ID NO:3之胺基酸281-297；及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸285-293或志賀毒素A亞單元多肽、保守志賀毒素效應多肽亞區及/或非天然志賀毒素效應多肽序列中之等效位置。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含截短之志賀毒素A亞單元。志賀毒素A亞單元之截短可導致整個抗原決定基區域之缺失，而不會影響志賀毒素效應功能。顯示展現顯著酶活性之最小志賀毒素A亞單元片段係由StxA之殘基75-247構成之多肽(Al-Jaufy A等人，Infect Immun 62: 956-60 (1994))。將SLT-1A、StxA或SLT-2A之羧基末端截短至胺基酸1-251去除兩個預測之B細胞抗原決定基區域、兩個預測之CD4陽性(CD4+) T細胞抗原決定基及一個預測之不連續的B細胞抗原決定基。將SLT-1A、StxA或SLT-2A之胺基末端截短至75-293去除至少三個預測之B細胞抗原決定基區域及三個預測之CD4+ T細胞抗原決定基。將SLT-1A、StxA或SLT-2A之胺基末端及羧基末端二者截短至75-251缺失至少五個預測之B細胞抗原決定基區域；四個假定之CD4+ T細胞抗原決定基；及一個預測之不連續的B細胞抗原決定基。
在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽包含在B細胞或T細胞抗原決定基區域中具有至少一個突變(例如缺失、插入、倒位或取代)之全長或截短的志賀毒素A亞單元。在一些實施例中，多肽包含含有抗原決定基區域內至少一個胺基酸之缺失之破壞。在一些實施例中，多肽包含含有抗原決定基區域內至少一個胺基酸之插入之破壞。在一些實施例中，多肽包含含有胺基酸之倒位之破壞，其中至少一個倒位胺基酸係在抗原決定基區域內。在一些實施例中，多肽包含含有突變之破壞，諸如胺基酸取代為非標準胺基酸或具有化學修飾側鏈之胺基酸。
在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽包含與天然序列相比具有一或多個突變之全長或截短的志賀毒素A亞單元，或基本上由其組成，該亞單元包含至少一個選自由以下組成之群之胺基酸取代：A、G、V、L、I、P、C、M、F、S、D、N、Q、H及K。在一些實施例中，該多肽包含與天然序列相比具有單一突變之全長或截短的志賀毒素A亞單元，其中取代係選自：D取代為A、D取代為G、D取代為V、D取代為L、D取代為I、D取代為F、D取代為S、D取代為Q、E取代為A、E取代為G、E取代為V、E取代為L、E取代為I、E取代為F、E取代為S、E取代為Q、E取代為N、E取代為D、E取代為M、E取代為R、G取代為A、H取代為A、H取代為G、H取代為V、H取代為L、H取代為I、H取代為F、H取代為M、K取代為A、K取代為G、K取代為V、K取代為L、K取代為I、K取代為M、K取代為H、L取代為A、L取代為G、N取代為A、N取代為G、N取代為V、N取代為L、N取代為I、N取代為F、P取代為A、P取代為G、P取代為F、R取代為A、R取代為G、R取代為V、R取代為L、R取代為I、R取代為F、R取代為M、R取代為Q、R取代為S、R取代為K、R取代為H、S取代為A、S取代為G、S取代為V、S取代為L、S取代為I、S取代為F、S取代為M、T取代為A、T取代為G、T取代為V、T取代為L、T取代為I、T取代為F、T取代為M、T取代為S、Y取代為A、Y取代為G、Y取代為V、Y取代為L、Y取代為I、Y取代為F及Y取代為M。
在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽包含與天然胺基酸殘基序列相比具有一或多個突變之全長或截短的志賀毒素A亞單元，或基本上由其組成，該亞單元包含免疫原性殘基及/或抗原決定基區域內之至少一個胺基酸取代，其中至少一個取代發生在選自以下之天然定位胺基酸群：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之11；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之46；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之51；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之53；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之55；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之56；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之84；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之105；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之111；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之112；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之141；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之154；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之181；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之189；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之198；SEQ ID NO:3之204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之205；SEQ ID NO:3之241；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之247；SEQ ID NO:3之247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之248；SEQ ID NO:3之250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之251；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之265；及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之286。
在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽包含具有免疫原性殘基及/或抗原決定基區域內之至少一個取代之全長或截短的志賀毒素A亞單元，或基本上由其組成，其中相對於定位在以下天然位置中之一者處的天然胺基酸，至少一個胺基酸取代為非保守胺基酸(例如，參見下表3)：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之11；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之46；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之51；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之53；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之55；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之56；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之84；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之105；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之111；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之112；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之141；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之154；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之181；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之189；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之198；SEQ ID NO:3之204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之205；SEQ ID NO:3之241；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之247；SEQ ID NO:3之247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之248；SEQ ID NO:3之250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之251；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之265；及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之286。
在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽包含全長或截短的志賀毒素A亞單元或基本上由其組成，該亞單元具有至少一個選自以下之胺基酸取代：K1取代為A、G、V、L、I、F、M或H；T4取代為A、G、V、L、I、F、M或S；D6取代為A、G、V、L、I、F、S、Q或R；S8取代為A、G、V、I、L、F或M；T8取代為A、G、V、I、L、F或M；T9取代為A、G、V、I、L、F、M或S；S9取代為A、G、V、L、I、F或M；K11取代為A、G、V、L、I、F、M或H；T12取代為A、G、V、I、L、F、M、S或K；S12取代為A、G、V、I、L、F或M；S33取代為A、G、V、L、I、F、M或C；S43取代為A、G、V、L、I、F或M；G44取代為A或L；S45取代為A、G、V、L、I、F或M；T45取代為A、G、V、L、I、F或M；G46取代為A或P；D47取代為A、G、V、L、I、F、S、M或Q；N48取代為A、G、V、L、M或F；L49取代為A、V、C或G；Y49取代為A、G、V、L、I、F、M或T；F50取代為A、G、V、L、I或T；A51取代為V；D53取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；V54取代為A、G、I或L；R55取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；G56取代為A或P；I57取代為A、G、V或M；L57取代為A、V、C、G、M或F；D58取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；P59取代為A、G或F；E60取代為A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T或R；E61取代為A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M或R；G62取代為A；R84取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；V88取代為A或G；I88取代為A、V、C或G；D94取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；S96取代為A、G、V、I、L、F或M；T104取代為A、G、V、L、I、F、M；或N；A105取代為L；T107取代為A、G、V、L、I、F、M或P；S107取代為A、G、V、L、I、F、M或P；L108取代為A、V、C或G；S109取代為A、G、V、I、L、F或M；T109取代為A、G、V、I、L、F、M或S；G110取代為A；S112取代為A、G、V、L、I、F或M；D111取代為A、G、V、L、I、F、S、Q或T；S112取代為A、G、V、L、I、F或M；D141取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；G147取代為A；V154取代為A或G；R179取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；T180取代為A、G、V、L、I、F、M或S；T181取代為A、G、V、L、I、F、M或S；D183取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；D184取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；L185取代為A、G、V或C；S186取代為A、G、V、I、L、F或M；G187取代為A；R188取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；S189取代為A、G、V、I、L、F及M；D197取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；D198取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；R204取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；R205取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；C242取代為A、G或V；R247取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；S247取代為A、G、V、I、L、F或M；Y247取代為A、G、V、L、I、F或M；R248取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；R250取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；R251取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；D264取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；G264取代為A；及T286取代為A、G、V、L、I、F、M或S。
在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽包含全長或截短的志賀毒素A亞單元或基本上由其組成，該亞單元具有以下胺基酸取代中之至少一者：K1A、K1M、T4I、D6R、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、T12K、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、D47G、N48V、N48F、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、D53G、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185V、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A或D264A、G264A、T286A及/或T286I。可將該等抗原決定基破壞性取代組合以形成每個抗原決定基區域具有多個取代及/或多個抗原決定基區域受破壞同時仍保持志賀毒素效應功能之去免疫化的志賀毒素效應多肽。舉例而言，在可能的情形下，可將天然定位之K1A、K1M、T4I、D6R、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、T12K、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、D47G、N48V、N48F、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、D53G、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185V、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A或D264A、G264A、T286A及/或T286I之取代與天然定位之殘基K1A、K1M、T4I、D6R、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、T12K、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、D47G、N48V、N48F、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、D53G、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185V、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A或D264A、G264A、T286A及/或T286I之取代組合以產生本發明之去免疫化的志賀毒素效應多肽。
本文所闡述去免疫化的志賀毒素效應多肽亞區及/或抗原決定基破壞性突變中之任一者可單獨或組合使用，且進一步與本發明之CD38結合蛋白之每一個別實施例(包括其在本發明方法中之用途)組合使用。
在一些實施例中，本發明之CD38結合蛋白之去免疫化的志賀毒素效應多肽可基本上由具有兩個或更多個突變之截短的志賀毒素A亞單元組成。志賀毒素A亞單元之截短可導致整個抗原決定基及/或抗原決定基區域、B細胞抗原決定基、CD4+ T細胞抗原決定基及/或弗林蛋白酶裂解位點之缺失，而不會影響志賀毒素效應功能，諸如催化活性及細胞毒性。將SLT-1A、StxA或SLT-2A之羧基末端截短至胺基酸1-251去除兩個預測之B細胞抗原決定基區域、兩個預測之CD4陽性(CD4+) T細胞抗原決定基及一個預測之不連續的B細胞抗原決定基。將SLT-1A、StxA或SLT-2A之胺基末端截短至75-293去除至少三個預測之B細胞抗原決定基區域及三個預測之CD4+ T細胞抗原決定基。將SLT-1A、StxA或SLT-2A之胺基末端及羧基末端二者截短至75-251缺失至少五個預測之B細胞抗原決定基區域、四個假定之CD4+ T細胞抗原決定基及一個預測之不連續的B細胞抗原決定基。
在一些實施例中，去免疫化的志賀毒素效應多肽可包含全長或截短的志賀毒素A亞單元或基本上由其組成，該亞單元在所提供之內源性B細胞及/或CD4+ T細胞抗原決定基區域中具有至少一個突變(相對於野生型志賀毒素多肽)，例如缺失、插入、倒位或取代。在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含含有突變(相對於野生型志賀毒素多肽)之破壞，該突變包括內源性B細胞及/或CD4+ T細胞抗原決定基區域內至少一個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含含有在內源性B細胞及/或CD4+ T細胞抗原決定基區域內至少一個胺基酸殘基之插入之破壞。在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含含有胺基酸殘基倒位之破壞，其中至少一個倒位胺基酸殘基係在內源性B細胞及/或CD4+ T細胞抗原決定基區域內。在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含含有突變(相對於野生型志賀毒素多肽)之破壞，該突變諸如胺基酸取代、胺基酸取代為非標準胺基酸及/或具有化學修飾側鏈之胺基酸殘基。如本文所闡述適於使用之去免疫化的志賀毒素效應亞區之非限制性實例闡述於WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO 2015/191764、WO 2016/196344及WO 2018/140427中。
在其他實施例中，去免疫化的志賀毒素效應多肽包含短於全長志賀毒素A亞單元之截短的志賀毒素A亞單元，其中在天然定位之B細胞及/或CD4+ T細胞抗原決定基區域中至少一個胺基酸殘基受破壞。
為產生去免疫化的志賀毒素效應多肽，原則上，藉由各種方式修飾所提供抗原決定基區域中之任一胺基酸殘基可導致抗原決定基之破壞，諸如相對於野生型志賀毒素多肽，代表缺失、插入、倒位、重排、取代及側鏈之化學修飾之修飾。然而，修飾某些胺基酸殘基及使用某些胺基酸修飾更有可能在維持一定水準之志賀毒素效應功能的同時成功地降低抗原性及/或免疫原性。舉例而言，末端截短及內部胺基酸取代較佳，此乃因該等類型之修飾維持志賀毒素效應多肽中胺基酸殘基之總體間隔，且因此更有可能維持志賀毒素效應多肽結構及功能。
在本發明之一些實施例中，去免疫化的志賀毒素效應多肽包含SLT-1A (SEQ ID NO:1)、StxA (SEQ ID NO:2)及/或SLT-2A (SEQ ID NO:3)之胺基酸75至251或基本上由其組成，其中在天然定位之抗原決定基區域中至少一個胺基酸殘基受破壞。在一些其他實施例中，去免疫化的志賀毒素效應多肽包含SLT-1A (SEQ ID NO:1)、StxA (SEQ ID NO:2)及/或SLT-2A (SEQ ID NO:3)之胺基酸1至241或基本上由其組成，其中在天然定位之抗原決定基區域中至少一個胺基酸殘基受破壞。實施例係包含SLT-1A (SEQ ID NO:1)、StxA (SEQ ID NO:2)及/或SLT-2A (SEQ ID NO:3)之胺基酸1至251或基本上由其組成之去免疫化的志賀毒素效應多肽，其中在所提供之天然定位的抗原決定基區域中至少一個胺基酸殘基受破壞。實施例係包含SLT-1A (SEQ ID NO:1)、StxA (SEQ ID NO:2)及/或SLT-2A (SEQ ID NO:3)之胺基酸1至261之志賀毒素效應多肽，其中在天然定位之抗原決定基區域中至少一個胺基酸殘基受破壞。
可使用多種不同之內部胺基酸取代來產生本發明之去免疫化的志賀毒素效應多肽。在抗原決定基區域內使用的可能取代胺基酸中，預計以下取代胺基酸殘基最有可能降低抗原決定基之抗原性及/或免疫原性：G、D、E、S、T、R、K及H。除了甘胺酸，該等胺基酸殘基全部均可分類為極性及/或帶電殘基。在用於取代之可能胺基酸中，預測以下胺基酸A、G、V、L、I、P、C、M、F、S、D、N、Q、H及K最有可能在保持顯著水準之志賀毒素效應功能的同時降低抗原性及/或免疫原性，此取決於所取代之胺基酸。通常，取代應將極性及/或帶電胺基酸殘基變為非極性及不帶電之殘基(例如，參見WO 2015/113007)。另外，降低胺基酸殘基之R基功能性側鏈之總體大小及/或長度可能對抗原決定基破壞有益(例如，參見WO 2015/113007)。然而，儘管該等取代通用性最有可能賦予抗原決定基破壞，但由於目標係保留顯著之志賀毒素效應功能，因此若取代胺基酸與所取代胺基酸相似，則該取代胺基酸可更有可能保留志賀毒素效應功能，諸如類似大小之非極性及/或不帶電殘基取代極性及/或帶電殘基。
在WO 2015/113007中，憑經驗測試許多突變對各種志賀毒素效應多肽及結合蛋白之志賀毒素效應功能之效應。表2彙總WO 2015/113007及WO 2016/196344中所闡述之結果，其中單獨或與一或多個其他取代組合之胺基酸取代並不阻止強效水準之志賀毒素效應功能之展現。表2使用WO 2016/196344中所闡述之抗原決定基區域編號方案。 表2. 志賀毒素效應多肽中之胺基酸取代
受破壞的抗原決定基區域 天然定位之胺基酸位置
取代 B細胞抗原決定基區域 T細胞抗原決定基
1 K1A 1-15   
1 K1M 1-15   
1 T4I 1-15 4-33
1 D6R 1-15 4-33
1 S8I 1-15 4-33
1 T9V 1-15 4-33
1 T9I 1-15 4-33
1 K11A 1-15 4-33
1 K11H 1-15 4-33
1 T12K 1-15 4-33
2 S33I 27-37 4-33
2 S33C 27-37 4-33
3 S43N 39-48 34-78
3 G44L 39-48 34-78
3 T45V 39-48 34-78
3 T45I 39-48 34-78
3 S45V 39-48 34-78
3 S45I 39-48 34-78
3 G46P 39-48 34-78
3 D47G 39-48 34-78
3 D47M 39-48 34-78
3 N48V 39-48 34-78
3 N48F 39-48 34-78
- L49A 免疫原性殘基 34-78
- F50T    34-78
- A51V    34-78
4 D53A 53-66 34-78
4 D53G 53-66 34-78
4 D53N 53-66 34-78
4 V54L 53-66 34-78
4 V54I 53-66 34-78
4 R55A 53-66 34-78
4 R55V 53-66 34-78
4 R55L 53-66 34-78
4 G56P 53-66 34-78
4 I57M 53-66 34-78
4 I57F 53-66 34-78
4 D58A 53-66 34-78
4 D58V 53-66 34-78
4 D58F 53-66 34-78
4 P59A 53-66 34-78
4 P59F 53-66 34-78
4 E60I 53-66 34-78
4 E60T 53-66 34-78
4 E60R 53-66 34-78
4 E61A 53-66 34-78
4 E61V 53-66 34-78
4 E61L 53-66 34-78
4 G62A 53-66 34-78
- R84A    77-103
- V88A    77-103
5 D94A 94-115 77-103
5 S96I 94-115 77-103
5 T104N 94-115   
5 A105L 94-115   
5 T107P 94-115   
5 L108M 94-115   
5 S109V 94-115   
5 G110A 94-115   
5 D111T 94-115   
5 S112V 94-115   
6 D141A 141-153 128-168
6 G147A 141-153 128-168
- V154A    128-168
7 R179A 179-190 160-183
7 T180G 179-190 160-183
7 T181I 179-190 160-183
7 D183A 179-190 160-183
7 D183G 179-190 160-183
7 D184A 179-190   
7 D184F 179-190   
7 L185V 179-190   
7 S186A 179-190   
7 S186F 179-190   
7 G187A 179-190   
7 G187T 179-190   
7 R188A 179-190   
7 R188L 179-190   
7 S189A 179-190   
- D198A 免疫原性殘基   
- R205A 免疫原性殘基   
- C242S    236-258
8 R248A 243-257 236-258
8 R251A 243-257 236-258
基於WO 2015/113007及WO 2016/196344中之經驗證據，預計志賀毒素A亞單元中之某些胺基酸位置耐受抗原決定基破壞，同時仍保持顯著之志賀毒素效應功能。舉例而言，以下天然位置無論單獨抑或組合均耐受胺基酸取代，同時保持志賀毒素效應功能(諸如細胞毒性)：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之胺基酸1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之4；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之11；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之46；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之51；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之53；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之55；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之56；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之84；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之105；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之111；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之112；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之141；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之154；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之181；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之189；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之198；SEQ ID NO:3之204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之205；SEQ ID NO:3之241；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之247；SEQ ID NO:3之247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之248；SEQ ID NO:3之250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之251；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之265；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之及286。
WO 2015/113007及WO 2016/196344中之經驗資料指出其他抗原決定基破壞性取代及抗原決定基破壞性取代之組合，其可在保持志賀毒素效應多肽能夠展現顯著志賀毒素效應功能的同時降低志賀毒素效應多肽之抗原性及/或免疫原性，諸如上文所提及之截短及耐受取代之位置的新組合以及相關志賀毒素A亞單元中一致位置或保守位置之新取代。
可預計，針對本文所測試取代之保守官能基的胺基酸殘基之其他胺基酸取代可在保留顯著志賀毒素效應功能的同時降低抗原性及/或免疫原性。舉例而言，與以下中之任一者類似的熟習此項技術者已知之其他取代可破壞內源性抗原決定基，同時維持至少一種志賀毒素效應功能：K1A、K1M、T4I、D6R、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、T12K、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、D47G、N48V、N48F、L49A、F50T、A51V、D53A、D53N、D53G、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、P59F、E60I、E60T、E60R、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、A105L、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184A、D184F、L185V、L185D、S186A、S186F、G187A、G187T、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A、或D264A、G264A、T286A及/或T286I。特定而言，與以下類似之針對保守胺基酸殘基之胺基酸取代可具有相同或類似效應：K1A、K1M、T4I、S8I、T8V、T9I、S9I、K11A、K11H、S33I、S33C、S43N、G44L、S45V、S45I、T45V、T45I、G46P、D47M、N48V、N48F、L49A、A51V、D53A、D53N、V54L、V54I、R55A、R55V、R55L、G56P、I57F、I57M、D58A、D58V、D58F、P59A、E60I、E60T、E61A、E61V、E61L、G62A、R84A、V88A、D94A、S96I、T104N、T107P、L108M、S109V、T109V、G110A、D111T、S112V、D141A、G147A、V154A、R179A、T180G、T181I、D183A、D183G、D184A、D184F、L185V、S186A、S186F、G187A、R188A、R188L、S189A、D198A、R204A、R205A、C242S、S247I、Y247A、R248A、R250A、R251A、D264A、G264A、T286A及T286I。在某些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽可包含與憑經驗測試者類似之保守胺基酸取代，諸如K1取代為G、V、L、I、F及H；T4取代為A、G、V、L、F、M及S；S8取代為A、G、V、L、F及M；T9取代為A、G、L、F、M及S；S9取代為A、G、L、I、F及M；K11取代為G、V、L、I、F及M；S33取代為A、G、V、L、F及M；S43取代為A、G、V、L、I、F及M；S45取代為A、G、L、F及M；T45取代為A、G、L、F及M；D47取代為A、V、L、I、F、S及Q；N48取代為A、G、L及M；L49取代為G；Y49取代為A；D53取代為V、L、I、F、S及Q；R55取代為G、I、F、M、Q、S、K及H；D58取代為G、L、I、S及Q；P59取代為G；E60取代為A、G、V、L、F、S、Q、N、D及M；E61取代為G、I、F、S、Q、N、D、M及R；R84取代為G、V、L、I、F、M、Q、S、K及H；V88取代為G；I88取代為G；D94取代為G、V、L、I、F、S及Q；S96取代為A、G、V、L、F及M；T107取代為A、G、V、L、I、F、M及S；S107取代為A、G、V、L、I、F及M；S109取代為A、G、I、L、F及M；T109取代為A、G、I、L、F、M及S；S112取代為A、G、L、I、F及M；D141取代為V、L、I、F、S及Q；V154取代為G；R179取代為G、V、L、I、F、M、Q、S、K及H；T180取代為A、V、L、I、F、M及S；T181取代為A、G、V、L、F、M及S；D183取代為V、L、I、F、S及Q；D184取代為G、V、L、I、S及Q；S186取代為G、V、I、L及M；R188取代為G、V、I、F、M、Q、S、K及H；S189取代為G、V、I、L、F及M；D197取代為V、L、I、F、S及Q；D198取代為A、V、L、I、F、S及Q；R204取代為G、V、L、I、F、M、Q、S、K及H；R205取代為G、V、L、I、F、M、Q、S、K及H；S247取代為A、G、V、I、L、F及M；Y247取代為A、G、V、L、I、F及M；R248取代為G、V、L、I、F、M、Q、S、K及H；R250取代為G、V、L、I、F、M、Q、S、K及H；R251取代為G、V、L、I、F、M、Q、S、K及H；D264取代為A、G、V、L、I、F、S及Q；及T286取代為A、G、V、L、I、F、M及S。
類似地，去除電荷、極性及/或降低側鏈長度之胺基酸取代可破壞抗原決定基，同時維持至少一種志賀毒素效應功能。在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽可包含一或多個由使得側鏈電荷去除、極性去除及/或側鏈長度降低之取代破壞的抗原決定基，諸如用選自以下A、G、V、L、I、P、C、M、F、S、D、N、Q、H或K之群的適當胺基酸取代以下位置之胺基酸殘基：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之1；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之4；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之6；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之8；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之9；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之11；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之12；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之33；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之43；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之44；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之45；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之46；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之47；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之48；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之49；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之50；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之51；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之53；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之54；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之55；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之56；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之57；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之58；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之59；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之60；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之61；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之62；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之84；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之88；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之94；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之96；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之104；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之105；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之107；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之108；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之109；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之110；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之111；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之112；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之141；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之147；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之154；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之179；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之180；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之181；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之183；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之184；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之185；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之186；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之187；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之188；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之189；SEQ ID NO:3之197；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之198；SEQ ID NO:3之204；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之205；SEQ ID NO:3之241；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之242；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之247；SEQ ID NO:3之247；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之248；SEQ ID NO:3之250；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之251；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之264；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之265；及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之286。在一些實施例中，志賀毒素效應多肽可包含以下胺基酸取代中之一或多者：K1取代為A、G、V、L、I、F、M或H；T4取代為A、G、V、L、I、F、M或S；D6取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；S8取代為A、G、V、I、L、F或M；T8取代為A、G、V、I、L、F、M或S；T9取代為A、G、V、I、L、F、M或S；S9取代為A、G、V、L、I、F或M；K11取代為A、G、V、L、I、F、M或H；T12取代為A、G、V、I、L、F、M或S；S33取代為A、G、V、L、I、F或M；S43取代為A、G、V、L、I、F或M；G44取代為A或L；S45取代為A、G、V、L、I、F或M；T45取代為A、G、V、L、I、F或M；G46取代為A或P；D47取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；N48取代為A、G、V、L或M；L49取代為A或G；F50；A51取代為V；D53取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；V54取代為A、G或L；R55取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；G56取代為A或P；I57取代為A、G、M或F；L57取代為A、G、M或F；D58取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；P59取代為A、G或F；E60取代為A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M或R；E61取代為A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M或R；G62取代為A；D94取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；R84取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；V88取代為A或G；I88取代為A、G或V；D94；S96取代為A、G、V、I、L、F或M；T104取代為A、G、V、I、L、F、M或S；A105取代為L；T107取代為A、G、V、I、L、F、M或S；S107取代為A、G、V、L、I、F或M；L108取代為A、G或M；S109取代為A、G、V、I、L、F或M；T109取代為A、G、V、I、L、F、M或S；G110取代為A；D111取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；S112取代為A、G、V、L、I、F或M；D141取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；G147取代為A；V154取代為A或G；R179取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；T180取代為A、G、V、L、I、F、M或S；T181取代為A、G、V、L、I、F、M或S；D183取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；D184取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；L185取代為A、G或V；S186取代為A、G、V、I、L、F或M；G187取代為A；R188取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；S189取代為A、G、V、I、L、F或M；D197取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；D198取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；R204取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；R205取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；C242取代為A、G、V或S；S247取代為A、G、V、I、L、F或M；Y247取代為A、G、V、L、I、F或M；R248取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；R250取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；R251取代為A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K或H；C262取代為A、G、V或S；D264取代為A、G、V、L、I、F、S或Q；G264取代為A；或T286取代為A、G、V、L、I、F、M或S。
另外，志賀毒素效應多肽之一個抗原決定基區域中破壞抗原決定基同時保持顯著志賀毒素效應功能之任一胺基酸取代可與相同或不同抗原決定基區域中破壞抗原決定基同時保持顯著志賀毒素效應功能之任何其他胺基酸取代組合，以形成多個抗原決定基區域受破壞同時仍保持顯著水準之志賀毒素效應功能之去免疫化的志賀毒素效應多肽。在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽可包含上文所提及取代中之兩者或更多者之組合及/或WO 2015/113007、WO 2016/196344及/或WO 2018/140427中所闡述取代之組合。
基於WO 2015/113007、WO 2016/196344及WO 2018/140427中所闡述之工作，預計志賀毒素A亞單元中之某些胺基酸區域耐受抗原決定基破壞，同時仍保持顯著之志賀毒素效應功能。舉例而言，天然定位在1-15、39-48、53-66、55-66、94-115、180-190、179-190及243-257之抗原決定基區域耐受多種胺基酸取代組合，同時不會損害志賀毒素酶活性及細胞毒性。 (v)   具有受破壞的弗林蛋白酶裂解基元之去免疫化志賀毒素
組合志賀毒素效應多肽包含兩個或更多個亞區(亦即非重疊亞區)，其中每一亞區包含以下中之至少一者：(1) 內源性抗原決定基或抗原決定基區域中之破壞，及(2) 在A1片段衍生區域之羧基末端處之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元。
組合志賀毒素效應多肽之一些實施例包含以下兩者：(1) 內源性抗原決定基或抗原決定基區域中之破壞及(2) 在A1片段衍生區域之羧基末端處之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元。預計WO 2015/113007、WO 2016/196344及WO 2018/140427中所闡述之個別去免疫化志賀毒素效應亞區中之任一者(例如，參見上表2)通常可與本文所闡述、WO 2015/191764中所闡述及/或此項技術中已知之包含受破壞的弗林蛋白酶裂解基元之任何志賀毒素效應亞區組合，以產生用作結合蛋白組分之志賀毒素效應多肽。
在組合中，志賀毒素效應多肽可將其各別亞區之特徵組合，該等特徵係諸如弗林蛋白酶裂解基元破壞、一或多個個別抗原決定基破壞及/或異源分子貨物，且該等組合有時產生免疫原性與志賀毒素效應多肽之部分地去免疫化之亞區的總和相比協同降低之志賀毒素效應多肽。
在某些濃度下不展現細胞毒性或展現降低的細胞毒性之去免疫化的志賀毒素效應多肽(例如包含Y77S、R179A及/或E167D或在天然位置240以外之羧基末端處截短之志賀毒素效應多肽)仍可用作用於將外源性材料遞送至細胞中之去免疫化的志賀毒素效應多肽。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含：(i) 在其志賀毒素A1片段區域之羧基末端處之受破壞的弗林蛋白酶裂解基元(例如，參見WO 2015/191764，其在此以全文引用的方式明確地併入，且具體而言參加段落[8]、[9]以及受破壞基元及包括該等受破壞基元之毒素多肽之序列)，及(ii) 去免疫化；例如，參見WO2018/140427，段落[80]及以後之「5號實施例集合」，以及段落[81]及[82]，其係以引用的方式明確地併入本文中。 b.    其他結構變異
熟習此項技術者將認識到，可對本發明之志賀毒素效應多肽及結合蛋白以及編碼前述中任一者之多核苷酸進行改變，而不減弱其生物活性，例如藉由維持志賀毒素效應多肽之總體結構及功能，諸如連同一或多個1) 降低抗原性及/或免疫原性潛能之內源性抗原決定基破壞及/或2) 降低蛋白水解裂解之弗林蛋白酶裂解基元破壞。舉例而言，一些修飾可促進表現、促進純化、改良藥物動力學性質及/或改良免疫原性。此等修飾為熟習此項技術者所熟知，且包括例如在胺基末端添加甲硫胺酸以提供起始位點、將額外胺基酸置於任一末端上以產生便捷定位之限制性位點或終止密碼子，及將生物化學親和標籤融合至任一末端以提供便捷偵測及/或純化。為改良使用微生物系統(例如原核細胞)所產生多肽之免疫原性的常見修飾係在多肽產生後去除起始甲硫胺酸殘基(其可在諸如細菌宿主系統中之產生期間甲醯化)，此乃因例如N-甲醯基甲硫胺酸(fMet)之存在可誘導個體(諸如人類個體)中之不期望之免疫反應。
本文亦提供在本發明之結合蛋白或本發明之結合蛋白之蛋白質性組分的胺基及/或羧基末端納入額外胺基酸殘基，諸如抗原決定基標籤或其他部分之序列。該等額外胺基酸殘基可用於各種目的，包括例如促進選殖、促進表現、轉譯後修飾、促進合成、純化、促進偵測及投與。抗原決定基標籤及部分之非限制性實例係幾丁質結合蛋白結構域、腸肽酶裂解位點、Xa因子裂解位點、FIAsH標籤、FLAG標籤、綠色螢光蛋白(GFP)、麩胱甘肽-S-轉移酶部分、HA標籤、麥芽糖結合蛋白結構域、myc標籤、多組胺酸標籤、ReAsH標籤、strep標籤、strep標籤II、TEV蛋白酶位點、硫氧還蛋白結構域、凝血酶裂解位點及V5抗原決定基標籤。
在一些上述實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽及/或結合蛋白之多肽序列因引入至多肽區中之一或多個保守胺基酸取代而變化，只要所有需要之結構特徵仍存在且志賀毒素效應多肽單獨或作為結合蛋白之組分能夠展現任何需要之功能即可。如本文所用，術語「保守取代」表示一或多個胺基酸由另一在生物上類似之胺基酸殘基替代。實例包括具有類似特徵之胺基酸殘基之取代，例如小胺基酸、酸性胺基酸、極性胺基酸、鹼性胺基酸、疏水性胺基酸及芳香族胺基酸(例如，參見表3)。利用通常不存在於內源性哺乳動物肽及蛋白質中之殘基進行保守取代之實例係利用例如鳥胺酸、刀豆胺酸、胺基乙基半胱胺酸或另一鹼性胺基酸對精胺酸或離胺酸殘基之保守取代。關於肽及蛋白質中之表型沈默取代之進一步資訊，參見例如Bowie J等人，Science 247: 1306-10 (1990)。
在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽及結合蛋白可包含本文所闡述本發明多肽區之功能片段或變異體，其與本文所列舉之多肽序列相比具有至多20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代，只要其包含(1) 在志賀毒素A1片段衍生區域之羧基末端處的受破壞的弗林蛋白酶裂解基元及(2) 在內源性B細胞及/或CD4+ T細胞抗原決定基區域中受破壞的至少一個胺基酸即可，其中該受破壞的胺基酸不與受破壞的弗林蛋白酶裂解基元重疊。由於本發明之志賀毒素效應多肽及結合蛋白之變異體係藉由改變一或多個胺基酸殘基或缺失或插入一或多個胺基酸殘基(諸如在結合區或志賀毒素效應多肽區內)來改變本文所闡述多肽從而達成期望性質(諸如改變之細胞毒性、改變之細胞生長抑制效應、改變之免疫原性及/或改變之血清半衰期)，因此該等本發明之志賀毒素效應多肽及結合蛋白之變異體係在本發明之範圍內。本發明之志賀毒素效應多肽及CD38結合蛋白可進一步具有或不具有信號序列。
因此，在一些實施例中，志賀毒素效應多肽包含與天然志賀毒素A亞單元或其片段(諸如志賀毒素A亞單元，諸如SLT-1A (SEQ ID NO:1)、StxA (SEQ ID NO:2)及/或SLT-2A (SEQ ID NO:3))具有至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%總體序列一致性之胺基酸序列或基本上由其組成，其中該志賀毒素效應多肽具有一或多種與天然SLT-1A亞單元相關之活性，例如靶標介導之內化、催化活性及/或細胞毒性活性。
在一些實施例中，志賀毒素效應多肽具有一或多個經突變、插入或缺失以增加志賀毒素效應多肽之酶活性之胺基酸殘基。在一些實施例中，志賀毒素效應多肽具有一或多個經突變或缺失以降低或消除志賀毒素效應多肽之催化及/或細胞毒性活性之胺基酸殘基。舉例而言，志賀毒素家族成員之A亞單元之催化及/或細胞毒性活性可因突變或截短而減弱或消除。
志賀毒素家族成員之A亞單元之細胞毒性可因突變及/或截短而改變、降低或消除。已顯示標記為酪胺酸-77、麩胺酸-167、精胺酸-170、酪胺酸-114及色胺酸-203之位置對於Stx、Stx1及Stx2之催化活性係重要的(Hovde C等人，Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988)；Deresiewicz R等人，Biochemistry 31: 3272-80 (1992)；Deresiewicz R等人，Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993)；Ohmura M等人，Microb Pathog 15: 169-76 (1993)；Cao C等人，Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994)；Suhan M, Hovde C,Infect Immun 66: 5252-9 (1998))。使麩胺酸-167及精胺酸-170二者突變消除無細胞核糖體失活分析中Slt-I A1之酶活性(LaPointe P等人，J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。在使用內質網中Slt-I A1之從頭表現之另一方法中，使麩胺酸-167及精胺酸-170二者突變消除在該表現水準下之Slt-I A1片段細胞毒性(LaPointe P等人，J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。截短分析表明，殘基75至268之StxA片段仍保持顯著之活體外酶活性(Haddad J等人，J Bacteriol 175: 4970-8 (1993))。含有殘基1-239之Slt-I A1之截短片段藉由胞質液中之從頭表現展示顯著之活體外酶活性及細胞毒性(LaPointe P等人，J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。截短至殘基1-239之Slt-I A1片段在內質網中之表現無細胞毒性，此乃因其不能逆移位至胞質液(LaPointe P等人，J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。
志賀毒素A亞單元中對於酶活性及/或細胞毒性最關鍵之殘基定位至以下殘基位置：天冬醯胺-75、酪胺酸-77、酪胺酸-114、麩胺酸-167、精胺酸-170、精胺酸-176及色胺酸-203等(Di R等人，Toxicon 57: 525-39 (2011))。特定而言，含有麩胺酸E167至離胺酸及精胺酸176至離胺酸突變之Stx2A之雙突變構築體完全失活；而Stx1及Stx2中之許多單一突變顯示細胞毒性降低10倍。此外，將Stx1A截短至1-239或1-240降低其細胞毒性，且類似地，將Stx2A截短至保守疏水性殘基降低其細胞毒性。志賀毒素A亞單元中用於結合真核核糖體及/或真核核糖體抑制之最關鍵殘基已定位至以下殘基位置：精胺酸-172、精胺酸-176、精胺酸-179、精胺酸-188、酪胺酸-189、纈胺酸-191及白胺酸-233等(McCluskey A等人，PLoS One 7: e31191 (2012)。然而，某些修飾可增加由志賀毒素效應多肽展現之志賀毒素功能活性。舉例而言，使Stx1A中之殘基位置丙胺酸231突變為麩胺酸增加Stx1A之活體外酶活性(Suhan M, Hovde C,Infect Immun 66: 5252-9 (1998))。
在一些實施例中，源自SLT-1A (SEQ ID NO:1)或StxA (SEQ ID NO:2)之志賀毒素效應多肽之一或多個胺基酸殘基發生突變，包括位置75之天冬醯胺、位置77之酪胺酸、位置114之酪胺酸、位置167之麩胺酸、位置170之精胺酸、位置176之精胺酸之取代及/或位置203之色胺酸之取代。熟習此項技術者基於先前技術將知曉此等取代之實例，諸如位置75之天冬醯胺取代為丙胺酸、位置77之酪胺酸取代為絲胺酸、位置114之酪胺酸取代為絲胺酸、位置167之麩胺酸取代為麩胺酸、位置170之精胺酸取代為丙胺酸、位置176之精胺酸取代為離胺酸、位置203之色胺酸取代為丙胺酸及/或231之丙胺酸取代為麩胺酸。增強或降低志賀毒素酶活性及/或細胞毒性之其他突變係在本發明之範圍內，且可使用本文所揭示之熟知技術及分析來測定。 3.  連結組分及/或其亞組分之連接體
個別CD38結合區、志賀毒素效應多肽及/或結合蛋白之組分可適宜地經由一或多種此項技術中熟知及/或本文所闡述之連接體彼此連接。結合區之個別多肽亞組分(例如重鏈可變區(VH )、輕鏈可變區(VL )、CDR及/或ABR區)可適宜地經由一或多種此項技術中熟知及/或本文所闡述之連接體彼此連接。本發明之蛋白質性組分(例如多鏈結合區)可適宜地經由一或多種此項技術中熟知之連接體彼此連接或連接至其他多肽組分。肽組分(例如KDEL家族內質網滯留/回收信號基元)可適宜地經由一或多種為業內所熟知之連接體(諸如蛋白質性連接體)連接至本發明之另一組分。
本文中之「連接體」意指將兩個蛋白質結構域接合在一起之結構域連接體，諸如scFv及/或其他蛋白質及蛋白質融合結構中所使用。通常，可使用多個適宜連接體，包括藉由重組技術產生之傳統肽鍵，該等連接體之長度及撓性足以容許將兩個結構域進行重組連接以使每一結構域保持其生物學功能。連接體肽可主要包括以下胺基酸殘基：Gly、Ser、Ala或Thr。連接體肽之長度應足以連接兩個分子，以使該兩個分子相對於彼此具有正確構形，從而使得其保持期望活性。在一些實施例中，連接體之長度為約1至約50個胺基酸。在一些實施例中，連接體之長度為約1至約30個胺基酸。在一個實施例中，可使用長度為1至20個胺基酸之連接體，其中在一些實施例中使用約5至約10個胺基酸或8至15個胺基酸。可用連接體包括甘胺酸-絲胺酸聚合物，包括例如(GS)n (SEQ ID NO: 193)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 194)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 195)及(GGGS)n (SEQ IDNO: 196)，其中n為至少1之整數(且通常為3至4)；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及其他撓性連接體。或者，可使用多種非蛋白質性聚合物作為連接體，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇及聚丙二醇之共聚物。其他連接體序列可包括CL/CH1結構域之任一長度之任一序列，但不包括CL/CH1結構域之所有殘基；舉例而言，CL/CH1結構域的前5至12個胺基酸殘基。連接體亦可源自免疫球蛋白輕鏈，例如Cκ或Cλ。連接體可源自任一同型之免疫球蛋白重鏈，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε及Cµ。連接體序列亦可源自其他蛋白質，諸如Ig樣蛋白質(例如TCR、FcR、KIR)、鉸鏈區源序列及來自其他蛋白質之其他天然序列。儘管可使用任一適宜連接體，但許多實施例利用甘胺酸-絲胺酸聚合物，包括例如(GS)n (SEQ ID NO: 193)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 194)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 195)及(GGGS)n (SEQ ID NO: 196)，其中n為至少1之整數(且通常為2至3至4至5)。「scFv連接體」通常包括該等甘胺酸-絲胺酸聚合物。
適宜連接體通常係容許本發明之每一多肽組分以極類似於沒有任何連接體或其他組分情況下所個別產生之多肽組分的三維結構摺疊之彼等連接體。適宜連接體包括單一胺基酸、肽、多肽及不含以上所提及任一者之連接體，諸如各種非蛋白質性碳鏈，無論其為具支鏈抑或係環狀的。
適宜連接體可為非蛋白質性的，諸如化學連接體。可使用此項技術中已知之各種非蛋白質性連接體將靶向細胞之結合區連接至本發明之結合蛋白之志賀毒素效應多肽組分，諸如通常用於將免疫球蛋白多肽偶聯至異源多肽之連接體。舉例而言，多肽區可使用其胺基酸殘基及碳水化合物部分之功能性側鏈連接，諸如羧基、胺、硫氫基、羧酸、羰基、羥基及/或環基。舉例而言，可使用二硫鍵及硫醚鍵來連接兩種或更多種多肽。另外，非天然胺基酸殘基可與其他功能性側鏈(諸如酮基)一起使用。非蛋白質性化學連接體之實例包括(但不限於) (4-碘乙醯基)-胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯、硫代乙酸S -(N -琥珀醯亞胺基)酯(SATA)、N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)、4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC或MCC)、(4-碘乙醯基)-胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯、4-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯、6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯醯胺基)己酸磺基琥珀醯亞胺基酯、3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPDP)、6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙醯胺基)己酸琥珀醯亞胺基酯、6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙醯胺基)己酸磺基琥珀醯亞胺基酯、馬來醯亞胺基己醯基(MC)、馬來醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄基氧基羰基(MC-vc-PAB)、3-馬來醯亞胺基苯甲酸N -羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、α-烷基衍生物、磺基NHS-ATMBA (磺基琥珀醯亞胺基N-[3-(乙醯基硫基)-3-甲基丁醯基-β-丙胺酸])、磺基二氯酚、2-亞胺基四氫噻吩、3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼、埃爾曼試劑(Ellman’s reagent)、二氯三嗪酸及S-(2-硫基吡啶基)-L-半胱胺酸。
可選擇蛋白質性連接體以納入本發明之重組融合結合蛋白中。對於本發明之重組融合細胞靶向蛋白，連接體通常包含約1至約50個胺基酸殘基。在一些實施例中，連接體可包含約5至30個胺基酸殘基。通常，蛋白質性連接體包含具有極性、不帶電及/或帶電殘基之大多數胺基酸殘基，諸如蘇胺酸、脯胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸及丙胺酸。蛋白質性連接體之非限制性實例包括丙胺酸-絲胺酸-甘胺酸-甘胺酸-脯胺酸-麩胺酸(ASGGPE，SEQ ID NO: 197)、纈胺酸-甲硫胺酸(VM)、丙胺酸-甲硫胺酸(AM)、AM(G2 至 4 S)x AM，其中G係甘胺酸，S係絲胺酸，且x係1至10之整數(SEQ ID NO: 198)。
可基於期望性質選擇蛋白質性連接體。熟習此項技術者可慮及特定特徵來選擇蛋白質性連接體，諸如與相同結構域自身之活性相比，最佳化融合分子之摺疊、穩定性、表現、溶解性、藥物動力學性質、藥效學性質中之一或多者及/或在融合構築體之背景下融合結構域之活性。舉例而言，可基於撓性、剛性及/或可裂解性來選擇蛋白質性連接體。熟習此項技術者在選擇連接體時可使用資料庫及連接體設計軟體工具。在一些情況中，可選擇某些連接體來使表現最佳化。可選擇某些連接體來促進一致多肽或蛋白質之間的分子間相互作用以形成同多聚體(諸如同二聚體)。
撓性蛋白質性連接體通常大於12個胺基酸殘基長，且富含小的非極性胺基酸殘基、極性胺基酸殘基及/或親水性胺基酸殘基，諸如甘胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。可選擇撓性蛋白質性連接體以增加組分之間的空間分離及/或容許組分之間的分子內相互作用。舉例而言，各種「GS」連接體為熟習此項技術者所已知且係由多個甘胺酸及/或一或多個絲胺酸構成，有時呈重複單元，諸如(Gx S)n (SEQ ID NO:199)、(Sx G)n (SEQ ID NO:200)、(GGGGS)n (SEQ ID NO:195)及(G)n (SEQ ID NO:201)，其中x係1至6且n係1至30。撓性蛋白質性連接體之非限制性實例包括GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO: 202)、EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO: 203)、GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 204)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 205)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 206)、SRSSG (SEQ ID NO: 207)及SGSSC (SEQ ID NO: 208)。
剛性蛋白質性連接體通常係硬性α-螺旋結構且富含脯胺酸殘基及/或一或多個策略性放置之脯胺酸。可選擇剛性連接體以防止連接組分之間的分子內相互作用。
在本發明之CD38結合蛋白之一些實施例中，可使用包含一或多個蛋白酶敏感位點之連接體以提供由靶細胞內存在之蛋白酶之裂解。在本發明之結合蛋白之一些實施例中，可使用在投與脊椎動物生物體後不可裂解以降低不希望毒性之連接體。
在本發明之CD38結合蛋白之一些實施例中，使用熟習此項技術者已知之多種方式(包括共價及非共價鍵聯二者)將CD38結合區連接至志賀毒素效應多肽。
在本發明之CD38結合蛋白之一些實施例中，分子包含結合區，該結合區係具有連結重鏈可變(VH )結構域及輕鏈可變(VL )結構域之連接體之scFv。此項技術中已知之多種連接體均適於此目的，諸如15殘基(Gly4 Ser)3 肽(SEQ ID NO: 183)。可用於形成非共價同二聚體結構之適宜scFv連接體包括GGGS (SEQ ID NO: 185)、GGGGS (SEQ ID NO: 186)、GGGGSGGG (SEQ ID NO: 187)、GGSGGGG (SEQ ID NO: 188)、GSTSGGGSGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 189)及GSTSGSGKPGSSEGSTKG (SEQ ID NO: 190)。
用於連接CD38結合蛋白之組分之適宜方法可係此項技術中目前已知之實現此目的之任何方法，只要連接不會實質上阻礙結合區之結合能力、志賀毒素效應多肽組分之細胞內化及/或在適當時如藉由適當分析(包括本文所闡述之分析)所量測之期望志賀毒素效應功能即可。
結合蛋白之組分(例如志賀毒素A亞單元效應多肽及/或免疫球蛋白型CD38結合區)可經改造以提供用於連接額外組分(例如額外外源性材料)之適宜連接部分(參見WO 2018/106895)。
在一些實施例中，CD38結合蛋白包含志賀毒素A亞單元效應多肽、連接體及CD38結合結構域或由其組成。連接體可係蛋白質性連接體，且可包含約1至約50個胺基酸殘基。在一些實施例中，蛋白質性連接體由1至50個胺基酸殘基組成。在一些實施例中，連接體包含SEQ ID NO: 70-75中任一者之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，或由其組成。在一些實施例中，連接體包含SEQ ID NO: 70之序列或由其組成。 D.    出於本發明之CD38結合蛋白之目的，組分之具體順序或定向不固定：除非明確註明，否則志賀毒素效應多肽、結合區及任何視情況存在的連接體可相對於彼此或整個結合蛋白變化(例如，參見圖1)。本發明之結合蛋白之組分可以任何順序排列，條件係結合區及志賀毒素效應多肽之期望活性不會消除。在一些實施例中，CD38結合蛋白自其N末端至C末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽-第一連接體-VH-第二連接體-VL。在一些實施例中，CD38結合蛋白自其N末端至C末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽-第一連接體-VL-第二連接體-VH。CD-38結合融合蛋白之有用實施例
如熟習此項技術者應瞭解，如圖1中所大體繪示，本發明之CD38結合融合蛋白可呈多種形式。
在一些實施例中，如圖13中所繪示，可使用連接體將野生型志賀毒素效應多肽組分(諸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所示)連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38靶向部分(在本文中亦稱為CD38結合區或結構域)中之任一者。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-D1-1 (SEQ ID NO:47)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-D1 (SEQ ID NO:45)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-D1-2 (SEQ ID NO:47)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-D1-3 (SEQ ID NO:48)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-D1-4 (SEQ ID NO:49)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體1 (SEQ ID NO:55)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體2 (SEQ ID NO:56)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體3 (SEQ ID NO:57)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體4 (SEQ ID NO:58)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體5 (SEQ ID NO:59)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體6 (SEQ ID NO:60)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體7 (SEQ ID NO:61)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體8 (SEQ ID NO:62)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體9 (SEQ ID NO:63)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體10 (SEQ ID NO:64)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體11 (SEQ ID NO:65)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體12 (SEQ ID NO:66)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體13 (SEQ ID NO:67)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體14 (SEQ ID NO:68)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
在某些實施例中，如圖13中所繪示，志賀毒素效應多肽組分係SLT-1A-組合變異體15 (SEQ ID NO:69)，其連接至選自CD38TM1、CD38TM2、CD38TM3及CD38TM4之CD38結合結構域。
以下實施例更詳細地闡述說明性CD38結合蛋白(包括CD38結合融合蛋白)之某些結構，該等CD38結合蛋白靶向在細胞表面物理偶合至CD38之細胞、包括表現CD38之細胞。
如此項技術中應瞭解，本發明之CD38結合融合蛋白最少包含志賀毒素A亞單元效應多肽及CD38結合結構域，以及視需要適當連接體。CD38結合結構域通常包含VH及VL，其在正確締合時將結合人類CD38。
本發明之尤其有用之CD38結合蛋白包括(但不限於) 1號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:76)、2號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:77)、3號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:78)、4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)、5號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:80)、6號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:81)及7號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:82)。
在尤其有用之實施例中，本發明之CD38結合蛋白自N末端至C末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽-連接體-VH-連接體-VL。在此實施例中，志賀毒素多肽具有SEQ ID NO:46，且VH及VL係選自以下各對：SEQ ID NO:101及105；SEQ ID NO:101及125；SEQ ID NO:109及113以及SEQ ID NO:117及121。
在尤其有用之實施例中，本發明之CD38結合蛋白自N末端至C末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽-連接體-VH-連接體-VL。在此實施例中，志賀毒素多肽具有SEQ ID NO:46，且VH及VL係選自以下各對：SEQ ID NO:101及105；SEQ ID NO:101及125；SEQ ID NO:109及113以及SEQ ID NO:117及121。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白自N末端至C末端或自C末端至N末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽及CD38結合結構域。該CD38結合融合蛋白可進一步包含連接志賀毒素A亞單元效應多肽與CD38結合結構域之第一連接體。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白自N末端至C末端或自C末端至N末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽、重鏈可變結構域(VH)及輕鏈可變結構域(VL)。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白自N末端至C末端或自C末端至N末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽、第一連接體、VH及VL。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白自N末端至C末端或自C末端至N末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽、第一連接體、VH、第二連接體及VL。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白自N末端至C末端或自C末端至N末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽、VL及VH。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白自N末端至C末端或自C末端至N末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽、第一連接體、VL及VH。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白自N末端至C末端或自C末端至N末端包含志賀毒素A亞單元效應多肽、第一連接體、VL、第二連接體及VH。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白包含(i) 志賀毒素A亞單元效應多肽；(ii) VH，其包含含有SEQ ID NO: 34之序列之vHCDR1、含有SEQ ID NO: 35之序列之vHCDR2及含有SEQ ID NO: 36之序列之vHCDR3；及(iii) VL，其包含含有SEQ ID NO: 31之序列之vLCDR1、含有SEQ ID NO: 32之序列之vLCDR2及含有SEQ ID NO: 33之序列之vLCDR3。在一些實施例中，該CD38結合融合蛋白進一步包含連接(i) 志賀毒素亞單元效應多肽及(ii) VH或(iii) VL之第一連接體。在一些實施例中，該CD38結合蛋白進一步包含連接(ii) VH及(iii) VL之第二連接體。在一些實施例中，第一連接體包含SEQ ID NO: 70之序列。在一些實施例中，第二連接體包含SEQ ID NO: 75之序列。
在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 43之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸一致性之序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 44之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸一致性之序列。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 43之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸一致性之序列，且VH包含SEQ ID NO: 44之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 43之序列，且VL包含SEQ ID NO: 44之序列。
在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 41之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 44之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 41之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，或由其組成，且VH包含SEQ ID NO: 44之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 41之序列，且VH包含SEQ ID NO: 44之序列或由其組成。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白包含(i) 志賀毒素A亞單元效應多肽；(ii) VH，其包含含有SEQ ID NO: 22之序列之vHCDR1、含有SEQ ID NO: 23之序列之vHCDR2及含有SEQ ID NO: 24之序列之vHCDR3；及(iii) VL，其包含含有SEQ ID NO: 19之序列之vLCDR1、含有SEQ ID NO: 20之序列之vLCDR2及含有SEQ ID NO: 21之序列之vLCDR3。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 37之序列或由其組成，且VH包含SEQ ID NO: 38之序列。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 37之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，且VH包含SEQ ID NO: 37之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。在一些實施例中，該CD38結合融合蛋白進一步包含連接(i) 志賀毒素亞單元效應多肽及(ii) VH或(iii) VL之第一連接體。在一些實施例中，該CD38結合融合蛋白進一步包含連接(ii) VH及(iii) VL之第二連接體。
在一些實施例中，CD38結合融合蛋白包含(i) CD38結合蛋白，其包含(i) 志賀毒素A亞單元效應多肽；(ii) VH，其包含含有SEQ ID NO: 28之序列之vHCDR1、含有SEQ ID NO: 29之序列之vHCDR2及含有SEQ ID NO: 30之序列之vHCDR3；及(iii) VL，其包含含有SEQ ID NO: 25之序列之vLCDR1、含有SEQ ID NO: 26之序列之vLCDR2及含有SEQ ID NO: 27之序列之vLCDR3。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 39之序列，且VH包含SEQ ID NO: 40之序列。在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO: 39之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，且VH包含SEQ ID NO: 40之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。在一些實施例中，該CD38結合融合蛋白進一步包含連接(i) 志賀毒素亞單元效應多肽及(ii) VH或(iii) VL之第一連接體。在一些實施例中，該CD38結合蛋白進一步包含連接(ii) VH及(iii) VL之第二連接體。
在一些實施例中，本發明之CD38結合融合蛋白包含SEQ ID NO: 76-82及228-232中之任一者中所示之多肽。視情況，該CD38結合融合蛋白包含胺基末端甲硫胺酸殘基。在一些實施例中，該CD38結合融合蛋白與SEQ ID NO: 79-82中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，該CD38結合融合蛋白包含SEQ ID NO: 79之序列。在一些實施例中，該CD38結合融合蛋白包含兩個一致多肽，每一多肽包含胺基酸序列與SEQ ID NO: 79至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%一致之序列。在一些實施例中，該CD38結合融合蛋白包含兩個一致多肽，每一多肽包含SEQ ID NO: 79之序列。在一些實施例中，該CD38結合融合蛋白係由兩個一致多肽組成，每一多肽係由SEQ ID NO: 79之序列組成。 CD38結合融合蛋白之一般功能
本發明之CD38結合蛋白可用於涉及例如以下之不同應用中：細胞殺死；細胞生長抑制；細胞內貨物遞送；生物資訊收集；免疫反應刺激及/或健康狀況之補救。在一些實施例中，本發明之CD38結合蛋白靶向CD38 (亦即係CD38靶向分子)。本發明之CD38結合蛋白可用作治療及/或診斷分子，諸如作為靶向細胞之細胞毒性治療分子；靶向細胞之無毒遞送媒劑；及/或靶向細胞之診斷分子；例如在涉及活體內靶向特定類型之CD38表現細胞以用於診斷或治療多種疾病(包括與CD38表現相關之癌症及免疫病症)之應用中。
在一些實施例中，本發明之CD38結合蛋白能夠結合與特定類型細胞之細胞表面締合的CD38分子之細胞外部分且進入彼等細胞中。一旦內化在所靶向細胞類型內，本發明之結合蛋白之一些實施例能夠將具酶活性之細胞毒性志賀毒素效應多肽片段按路線發送至靶細胞之胞質液中且最終殺死該細胞。或者，本發明結合蛋白之無毒或毒性降低變異體可用於將額外外源性材料遞送至CD38陽性靶細胞中。此系統係模塊化的，此乃因多種不同志賀毒素效應多肽可與CD38結合區締合以產生具有不同功能特徵之本發明結合蛋白之變異體，諸如用於涉及向個體(諸如人類個體)投與CD38結合蛋白之應用的去免疫化效應子及特定而言改良活體內穩定性之蛋白酶裂解敏感性降低之效應子。 E.    經由志賀毒素A亞單元細胞毒性之CD38陽性細胞殺死
本發明之志賀毒素效應多肽及結合蛋白之一些實施例具有細胞毒性。本發明之CD38結合蛋白之一些實施例具有細胞毒性僅係由於存在一或多種志賀毒素效應多肽組分所致。志賀毒素家族成員之A亞單元各自包含一旦在真核細胞之胞質液中即能殺死該細胞之具酶活性的多肽區。由於志賀毒素家族成員適於殺死真核細胞，故源自志賀毒素之分子(諸如包含志賀毒素效應多肽之一些實施例之CD38結合蛋白)可展現強效細胞殺死活性。
對於本發明之結合蛋白之一些實施例，在接觸與由結合蛋白之結合區所結合的CD38物理偶合之細胞(例如CD38陽性細胞)時，結合蛋白能夠引起細胞死亡。對於一些實施例，結合蛋白之CD50 值小於5、小於2.5、小於1、小於0.5或小於0.25 nM，其較非靶向野生型志賀毒素效應多肽(例如SEQ ID NO: 1-18)顯著更強效。舉例而言，包含SEQ ID NO: 76、78-81及228-232中之任一者、基本上由其組成或由其組成之CD38結合蛋白強效地殺死CD38表現細胞、包括表現減毒水準之CD38之細胞(參見下文實例、表7至表9及圖3)，諸如以CD50 值為約0.1 nM至約0.2 nM為特徵之彼等CD38結合蛋白。
對於一些實施例，結合蛋白之CD50 值小於50 ng/mL、小於30 ng/mL、小於20 ng/mL、小於15 ng/mL、小於10 ng/mL、小於5 ng/mL、小於1 ng/mL、小於0.5 ng/mL、小於0.4 ng/mL、小於0.3 ng/mL、小於0.2 ng/mL、小於0.1 ng/mL。舉例而言，包含SEQ ID NO: 76、78-81及228-232中之任一者、基本上由其組成或由其組成之CD38結合蛋白強效地殺死CD38表現細胞、包括表現減毒水準之CD38之細胞(參見下文實例、表7至表9及圖3)，諸如以CD50 值為約0.05 ng/mL或0.1 ng/mL為特徵之彼等CD38結合蛋白。
可使用本發明之分子在靶細胞之各種條件下實現細胞殺死，諸如離體操縱之靶細胞、活體外培養之靶細胞、活體外培養之組織樣品內之靶細胞或活體內環境中(如在多細胞生物體內)之靶細胞。
在一些實施例中，本發明之志賀毒素效應多肽及結合蛋白包含(1) 去免疫化之志賀毒素效應亞區、(2) 靠近志賀毒素A1片段衍生區域羧基末端之抗蛋白酶裂解區、(3) 羧基末端內質網滯留/回收信號基元；及/或(4) 異源分子貨物；然而，對於一些實施例，與包含野生型志賀毒素A亞單元多肽(諸如野生型志賀毒素A1片段)之參考分子相比，該等結構修飾不會顯著地改變志賀毒素細胞毒性之功效。因此，本發明之去免疫化、抗蛋白酶裂解及/或攜帶分子貨物之志賀毒素效應多肽及CD38結合蛋白可在提供一或多種各種其他功能或性質的同時維持強效細胞毒性。
結合蛋白組分可選自先前技術或使用熟習此項技術者已知之常規方法產生(例如，參見WO 2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO 2015/191764、WO 2016/196344、PCT/US2017/065074及WO 2018/106895)。舉例而言，去免疫化且抗弗林蛋白酶裂解之志賀毒素效應多肽先前已在WO 2015/113007、WO 2015/191764及WO 2016/196344中予以闡述。包含位點特異性偶聯位點之志賀毒素效應多肽及志賀毒素效應子骨架先前已在WO 2018/106895中予以闡述。 F.     細胞類型間之選擇性細胞毒性
本發明之一些CD38結合蛋白可用於在非靶向旁觀者細胞存在下選擇性殺死特定靶細胞。藉由經由細胞靶向結合區來靶向志賀毒素效應多肽至特定CD38陽性細胞之遞送，本發明之結合蛋白可展現細胞類型特異性、限制性之細胞殺死活性，從而在非靶向細胞存在下排他性地或選擇性地殺死所選類型細胞。另外，使用本發明之CD38結合蛋白對細胞毒性志賀毒素效應多肽區之細胞靶向遞送將細胞毒性組分在未靶向細胞存在下排他性地或選擇性地限於遞送至CD38陽性靶細胞。
對於一些實施例，本發明之結合蛋白在某些濃度下具有細胞毒性。在一些實施例中，在將本發明之結合蛋白投與各類細胞之混合物時，與不與任何細胞外CD38物理偶合的細胞類型相比，細胞毒性結合蛋白能夠選擇性地殺死彼等與結合區所結合之細胞外CD38物理偶合的細胞。對於一些實施例，本發明之細胞毒性結合蛋白能夠選擇性地或優先地引起兩種或更多種不同類型細胞之混合物內特定類型細胞之死亡。此使得能夠將細胞毒性活性靶向至相對於不表現靶標生物分子之「旁觀者」類型細胞具有高優先性(諸如3倍細胞毒性效應)之特定類型細胞。或者，若靶標生物分子以足夠低之量表現及/或以較低量與不被靶向之細胞類型物理偶合，則結合區之靶標生物分子之表現可不僅限於一種細胞類型。此使得對特定類型細胞之靶向細胞殺死能夠相對於不表現大量之靶標生物分子或不與大量靶標生物分子物理偶合的「旁觀者」類型細胞具有高優先性，諸如3倍細胞毒性效應。
對於一些實施例，在將細胞毒性結合蛋白投與兩種不同的細胞類型群體時，細胞毒性結合蛋白能夠引起細胞死亡(如藉由半最大細胞毒性濃度(CD50 )所定義)，對於其成員表現細胞毒性結合蛋白結合區之細胞外靶標生物分子之靶細胞群體，引起細胞死亡之劑量較相同細胞毒性結合蛋白對其成員不表現細胞毒性結合蛋白結合區之細胞外靶標生物分子之細胞群體之CD50 劑量低至少三倍。
對於一些實施例，本發明之結合蛋白對與結合區所結合之細胞外CD38物理偶合的細胞類型群體之細胞毒性活性為對不與結合區所結合之任何細胞外CD38物理偶合的細胞類型群體之細胞毒性活性的至少3倍。根據本發明，選擇性細胞毒性可按照(a)對與結合區所結合之細胞外CD38物理偶合的特定細胞類型之細胞群體的細胞毒性對(b)對不與結合區所結合之任何細胞外CD38物理偶合的細胞類型之細胞群體的細胞毒性之比率(a/b)來定量。在一些實施例中，細胞毒性比率指示與結合區之靶標生物分子物理偶合的細胞或細胞類型群體之選擇性細胞毒性為不與結合區之靶標生物分子物理偶合的細胞或細胞類型群體之至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少250倍、至少500倍、至少750倍或至少1000倍。
此優先之細胞殺死功能容許本發明之某些細胞毒性結合蛋白在各種條件下及在非靶向旁觀者細胞存在下將靶細胞殺死，該等條件諸如離體操縱之各類細胞混合物、含有各類細胞混合物之活體外培養組織或在活體內在多種類型之細胞存在下(例如原位或在多細胞生物體內之天然位置)。 G.    志賀毒素效應多肽及CD38結合蛋白之產生、製造及純化
本文所揭示之志賀毒素效應多肽及CD38結合蛋白可使用熟習此項技術者所熟知之技術來產生。舉例而言，本發明之志賀毒素效應多肽及CD38結合蛋白可藉由標準合成方法、藉由使用重組表現系統或藉由任何其他適宜方法來製造。因此，本發明之志賀毒素效應多肽及結合蛋白可以多種方式來合成，包括(例如)包含以下之方法：(1) 使用標準固相或液相方法逐步或藉由片段組裝合成結合蛋白之多肽或多肽組分，且分離並純化最終多肽複合產物；(2) 在宿主細胞中表現編碼本發明結合蛋白之蛋白質或蛋白質組分之多核苷酸且自宿主細胞或宿主細胞培養物回收表現產物；或(3) 無細胞活體外表現編碼本發明結合蛋白之多肽或多肽組分之多核苷酸，且回收表現產物；或藉由(1)、(2)或(3)之方法的任一組合來獲得蛋白質組分之片段，隨後將肽或多肽片段接合(例如連接)以獲得多肽組分，且回收該多肽組分。
在一些實施例中，本發明之CD38結合蛋白或本發明之結合蛋白之蛋白質組分可藉助固相或液相肽合成來合成。本發明之多肽及結合蛋白可適宜地藉由標準合成方法來製造。因此，可藉由(例如)包含以下之方法來合成肽：藉由標準固相或液相方法逐步或藉由片段組裝來合成肽，且分離並純化最終肽產物。在此背景中，可參考WO 1998/011125或尤其Fields G等人，Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis (Synthetic Peptides, Grant G編輯，Oxford University Press, U.K.，第2版，2002)及其中之合成實例。
本發明之志賀毒素效應多肽及CD38結合蛋白可使用此項技術中熟知之重組技術來製備(產生及純化)。一般而言，藉由培養經包含編碼多核苷酸之載體轉型或轉染之宿主細胞且自細胞培養物純化或回收蛋白質來製備蛋白質之方法闡述於(例如) Sambrook J等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989)；Dieffenbach C等人，PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995)中。任何適宜宿主細胞均可用於產生本發明之多肽及/或結合蛋白。宿主細胞可係經一或多種驅動本發明之多肽之表現的表現載體穩定或瞬時轉染、轉型、轉導或感染之細胞。另外，本發明之志賀毒素效應多肽及/或結合蛋白可藉由修飾編碼本發明之多肽或結合蛋白之多核苷酸來產生，該修飾使得一或多個胺基酸改變或一或多個胺基酸缺失或插入以達成期望性質，諸如改變之細胞毒性、改變之細胞生長抑制效應及/或改變之血清半衰期。
存在眾多種表現系統，其可經選擇以產生本發明之多肽或CD38結合蛋白。舉例而言，用於表現本發明之結合蛋白之宿主生物體包括原核生物，諸如大腸桿菌及枯草芽孢桿菌(B. subtilis )；真核細胞，諸如酵母及絲狀真菌(如啤酒酵母(S. cerevisiae )、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris )、泡盛麴黴(A. awamori )及乳酸克魯維酵母菌(K. lactis ))；藻類(如萊茵衣藻(C. reinhardtii ))；昆蟲細胞株；哺乳動物細胞(如CHO細胞)；植物細胞株；及真核生物體，諸如基因轉殖植物(如擬南芥(A. thaliana )及本賽姆氏菸草(N. benthamiana ))。
因此，本發明亦提供根據上文所列舉之方法且使用以下來產生本發明之志賀毒素效應多肽及/或結合蛋白之方法：編碼部分或全部的本發明多肽或本發明結合蛋白之蛋白質組分之多核苷酸、在引入至宿主細胞中時能夠編碼部分或全部的本發明之多肽或結合蛋白之包含本發明之至少一種多核苷酸之表現載體，及/或包含本發明之多核苷酸或表現載體之宿主細胞。
在一些實施例中，製備編碼CD38結合蛋白之核酸，以用於製備本發明之CD38結合蛋白之方法中。在一些實施例中，製備本發明之CD38結合蛋白之方法包含使宿主細胞與編碼該CD38結合蛋白之核酸接觸。CD38結合蛋白可藉由在表現該CD38結合蛋白之條件下培養宿主細胞且回收該蛋白質來產生。使用各種宿主細胞產生重組蛋白質之培養條件為熟習此項技術者所已知。舉例而言，在一些實施例中，可將宿主細胞在95℃及5% CO2 氣氛下在培養基中維持足以表現該蛋白質之時間。
當使用重組技術在宿主細胞或無細胞系統中表現蛋白質時，有利地將期望之蛋白質與其他組分(諸如宿主細胞因子)分離(或純化)，以獲得具有高純度或實質上均質之製劑。純化可藉由此項技術中熟知之方法來完成，諸如離心技術、提取技術、層析及分餾技術(例如藉由凝膠過濾之粒析、藉由離子交換管柱之電荷分離、疏水相互作用層析、反相層析、二氧化矽或陽離子交換樹脂(諸如DEAE及諸如此類)上之層析、層析聚焦及蛋白質A Sepharose層析以去除污染物)及沈澱技術(例如乙醇沈澱或硫酸銨沈澱)。可使用多種生物化學純化技術來提高本發明之多肽及/或結合蛋白之純度。在一些實施例中，本發明之多肽及結合蛋白可視情況以同多聚體形式(例如包含兩種或更多種本發明之多肽或結合蛋白之分子複合物)純化。
在實施例中，本文提供製備如本文所闡述之CD38結合蛋白之方法，該方法包含在表現CD38結合蛋白之條件下培養如本文所闡述之宿主細胞，及回收該蛋白質。在一些實施例中，該方法包含使CD38結合蛋白與蛋白質L接觸。在一些實施例中，蛋白質L係大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus )蛋白質L。在一些實施例中，蛋白質L係以重組方式產生。在一些實施例中，可使用蛋白質L片段或變異體，其中該片段或變異體維持蛋白質L與κ輕鏈可變結構域(例如人類VκI、VκIII及VκIV亞型)之結合。在一些實施例中，蛋白質L偶聯至樹脂。在一些實施例中，蛋白質L係基質。蛋白質L純化抗體片段之實例闡述於Royce, BioProcess International 2015; 13:6中。
下文實例闡述產生本發明之說明性志賀毒素效應多肽及CD38結合蛋白之方法之非限制性實例，以及產生方法之具體但非限制性態樣。
包含CD38結合融合蛋白之醫藥及/或診斷組合物之產生或製造。
本文提供包含本發明之CD38結合蛋白之組合物。在一些實施例中，CD38結合蛋白可呈二聚體(例如同二聚體)之形式。在一些實施例中，CD-38結合蛋白係CD38結合蛋白群體之成員，其中該群體中至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%之CD38結合蛋白係呈同二聚體形式。在一些實施例中，該群體中至少約90%之CD38結合蛋白係呈同二聚體形式。在一些實施例中，該群體中至少約95%之CD38結合蛋白係呈同二聚體形式。
在一些實施例中，CD38結合蛋白係呈二聚體(例如同二聚體)之形式。在一些實施例中，CD38結合蛋白係CD38結合蛋白群體之成員，其中該群體實質上不含單體及較二聚體更高級別之多聚體(例如三聚體、四聚體等)。在一些實施例中，「實質上不含」單體及較二聚體更高級別之多聚體(例如三聚體、四聚體等)之群體的二聚體對單體或對較二聚體更高級別之多聚體之比率不超過約2:1至約9:1。在一些實施例中，該比率為約2:1、約3:1、約4:1、約5:1、約6:1、約7:1、約8:1或約9:1。
本發明之任一志賀毒素效應多肽及CD38結合蛋白之醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物係在本發明之範圍內。
本發明背景中之術語「溶劑合物」係指在溶質(尤其根據本發明之蛋白質性化合物或其醫藥學上可接受之鹽)與溶劑之間形成的具有界定化學計量比之複合物。當所討論之溶劑為水時，此一溶劑合物通常稱為水合物。
可將本發明之多肽及蛋白質或其鹽調配為製備用於儲存或投與之醫藥組合物，其通常在醫藥學上可接受之載劑中包含有效量之本發明之分子或其鹽。術語「醫藥學上可接受之載劑」包括任一標準醫藥載劑。用於治療分子之醫藥學上可接受之載劑為醫藥技術中所熟知，且闡述於(例如)Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro編輯，1985)中。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有生理學上可接受(亦即相容)之溶劑、分散介質、包衣劑、抗微生物劑、等滲劑及吸收延遲劑及諸如此類。 VIII.  多核苷酸、表現載體及宿主細胞
除本發明之多肽及結合蛋白以外，編碼本發明之多肽組分及結合蛋白或其功能性部分之多核苷酸亦涵蓋在本發明之範圍內。術語「多核苷酸」等同於術語「核酸」，其各自包括以下中之一或多者：去氧核糖核酸(DNA)之聚合物、核糖核酸(RNA)之聚合物、使用核苷酸類似物產生的該等DNA或RNA之類似物以及其衍生物、片段及同系物。本發明之多核苷酸可為單股、雙股或三股。此等多核苷酸經明確地揭示以包括能夠編碼說明性蛋白質之所有多核苷酸，例如，慮及已知在RNA密碼子之第三位置中耐受之搖擺鹼基(wobble)，但作為不同RNA密碼子編碼相同胺基酸(參見Stothard P,Biotechniques 28: 1102-4 (2000))。
在一態樣中，本發明提供多核苷酸，其編碼本發明之志賀毒素效應多肽及/或結合蛋白或其片段或衍生物。該等多核苷酸可包括例如編碼多肽之核酸序列，該多肽與包含本發明之多肽或結合蛋白之胺基酸序列中之一者之多肽至少50%、至少55%、至少60% 、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%一致或更多一致。本發明亦包括多核苷酸，其包含在嚴格條件下雜交至編碼本發明之志賀毒素效應多肽組分及/或結合蛋白或其片段或衍生物之多核苷酸之核苷酸序列或任何此序列之反義或互補序列。
本發明分子(例如CD38結合蛋白)之衍生物或類似物尤其包括具有與多核苷酸(或本發明之結合蛋白)實質上同源之區域之多核苷酸(或多肽)分子，例如相對於相同大小之多核苷酸(或多肽)序列或在與比對序列(其中比對係藉由此項技術中已知之電腦同源性程式進行)相比時具有至少約45%、約50%、約70%、約80%、約95%、約98%或甚至約99%一致性(例如80%-99%之一致性)。說明性程式係使用預設設置之GAP程式(Wisconsin Sequence Analysis Package，用於UNIX之第8版，Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, U.S.)，其使用Smith T, Waterman M,Adv Appl Math 2: 482-9 (1981)之算法。亦包括能夠在嚴格條件下雜交至編碼本發明結合蛋白之序列的互補序列之多核苷酸(例如，參見Ausubel F等人，Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993))及下文。嚴格條件為熟習此項技術者所已知且可參見(例如)Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, U.S.，章節6.3.1-6.3.6 (1989))。
本發明另外提供表現載體，其包含在本發明範圍內之多核苷酸。使用此項技術中熟知之材料及方法，可將能夠編碼本發明之志賀毒素效應多肽組分及/或結合蛋白之多核苷酸插入至已知載體(包括細菌質體、病毒載體及噬菌體載體)中，以產生表現載體。此等表現載體將包括支持在所選任何宿主細胞或無細胞表現系統(例如pTxb1及pIVEX2.3)內產生本發明之志賀毒素效應多肽及/或結合蛋白所必需之多核苷酸。用於與特定類型之宿主細胞或無細胞表現系統一起使用之含有特定多核苷酸之表現載體為熟習此項技術者所熟知，可使用常規實驗來確定及/或可購買。
如本文所用之術語「表現載體」係指包含一或多個表現單元之線性或環狀多核苷酸。術語「表現單元」表示編碼相關多肽且能夠在宿主細胞中提供核酸區段之表現之多核苷酸區段。表現單元通常包含轉錄啟動子、編碼相關多肽之開放閱讀框及轉錄終止子，所有均呈可操作之構形。表現載體含有一或多個表現單元。因此，在本發明之背景中，編碼包含單一多肽鏈之本發明之志賀毒素效應多肽及/或結合蛋白之表現載體包括至少一個針對單一多肽鏈之表現單元，而包含例如兩條或更多條多肽鏈(例如一條鏈包含VL 結構域且第二條鏈包含連接至毒素效應多肽之VH 結構域)之蛋白質包括至少兩個表現單元，每一表現單元針對該蛋白質之該兩條多肽鏈中之每一者。為表現本發明之多鏈結合蛋白，亦可將每一多肽鏈之表現單元單獨含在不同表現載體上(例如表現可利用其中已引入每一多肽鏈之表現載體之單一宿主細胞來達成)。
能夠引導多肽及蛋白質之瞬時或穩定表現之表現載體為業內所熟知。該等表現載體通常包括(但不限於)以下中之一或多者：異源信號序列或肽、複製起點、一或多個標誌基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列，其每一者均為此項技術中所熟知。視情況存在的調控序列、整合序列及可採用之可用標誌為此項技術中所已知。
術語「宿主細胞」係指可支持表現載體之複製或表現之細胞。宿主細胞可係原核細胞，諸如大腸桿菌，或真核細胞(例如酵母、昆蟲、兩棲動物、鳥或哺乳動物細胞)。包含本發明之多核苷酸或能夠產生本發明之多肽及/或結合蛋白的宿主細胞株之產生及分離可使用此項技術中已知之標準技術來完成。
本發明範圍內之志賀毒素效應多肽及/或蛋白質可係本文所闡述多肽及分子之變異體或衍生物，其係藉由以下方式來產生：改變一或多個胺基酸或缺失或插入一或多個胺基酸來修飾編碼結合蛋白之多肽及/或蛋白質性組分之多核苷酸，從而可使得該多核苷酸更適於達成期望性質，諸如宿主細胞中更優之表現。 IX.    固定在固體基材上之分子
本發明之一些實施例包括固定在固體基材上之本發明之分子(例如本發明之結合蛋白、融合蛋白或多核苷酸)或其任何效應片段。本文所揭示之固體基材包括(但不限於)微型珠粒、奈米顆粒、聚合物、基質材料、微陣列、微量滴定板或此項技術中已知之任何固體表面(例如，參見US 7,771,955)。根據該等實施例，使用熟習此項技術者已知之技術，本發明之分子可共價或非共價地連接至固體基材，諸如珠粒、顆粒或板(例如，參見Jung Y等人，Analyst 133: 697-701 (2008))。使用此項技術中已知之技術，本發明之經固定分子可用於篩選應用(例如，參見Bradbury A等人，Nat Biotechnol 29: 245-54 (2011)；Sutton C，Br J Pharmacol 166: 457-75 (2012)；Diamante L等人，Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013)；Houlihan G等人，J Immunol Methods 405: 47-56 (2014))。
本發明之CD38結合融合蛋白可固定在其上之固體基材之非限制性實例包括：微型珠粒、奈米顆粒、聚合物、奈米聚合物、奈米管、磁性珠粒、順磁性珠粒、超順磁性珠粒、鏈黴抗生物素蛋白包覆珠粒、反相磁性珠粒、羧基封端珠粒、肼封端珠粒、二氧化矽(二氧化矽鈉)珠粒及亞胺基二乙酸(IDA)改質珠粒、醛改質珠粒、環氧活化珠粒、二胺基二丙胺(DADPA)改質珠粒(具有一級胺表面基團之珠粒)、生物可降解之聚合珠粒、聚苯乙烯基材、胺基-聚苯乙烯顆粒、羧基-聚苯乙烯顆粒、環氧-聚苯乙烯顆粒、二甲基胺基-聚苯乙烯顆粒、羥基-聚苯乙烯顆粒、有色顆粒、流式細胞術顆粒、磺酸酯-聚苯乙烯顆粒、硝化纖維素表面、強化硝化纖維素膜、耐綸膜、玻璃表面、經活化玻璃表面、經活化石英表面、聚二氟亞乙烯(PVDF)膜、基於聚丙烯醯胺之基材、聚氯乙烯基材、聚甲基丙烯酸甲酯基材、聚(二甲基矽氧烷)基材及含有能夠形成共價鍵聯之光反應性物質(諸如氮烯、碳烯及羰自由基)之光聚合物。本發明之CD38結合融合蛋白可固定在其上之固體基材之其他實例常用於分子展示系統中，諸如細胞表面、噬菌體及病毒顆粒。 X.      遞送裝置及套組
在一些實施例中，本發明係關於包含一或多種本發明之物質組合物(諸如醫藥組合物或診斷組合物)之裝置，以供遞送至有需要之個體。因此，包含一或多種本發明組合物之遞送裝置可用於向個體投與本發明之物質組合物，其係藉由包括以下之各種遞送方法來實施：靜脈內、皮下、肌內或腹膜內注射；或藉由熟習此項技術者所公認之其他適宜方式。
套組亦在本發明之範圍內，其包含至少一種本發明之物質組合物及視情況包裝以及使用說明書。對於藥物投與及/或診斷資訊收集，套組可係有用的。本發明之套組可視情況包含至少一種額外試劑(例如標準品、標記物及諸如此類)。套組通常包括指示套組內容物之預期用途之標籤。套組可進一步包含試劑及其他工具，以用於偵測樣品中或個體中之細胞類型(例如腫瘤細胞)，或用於診斷個體是否屬於對利用本發明之化合物、組合物或相關方法(例如本文所闡述之方法)之治療策略有反應之群。 XI.    使用CD38結合蛋白及/或其醫藥及/或診斷組合物之方法
通常，本發明之目標係提供藥理學活性劑以及包含其之組合物，其可用於預防及/或治療與CD38過表現相關之疾病或疾患，諸如某些造血系統癌症(例如多發性骨髓瘤)及與CD38陽性細胞生長控制喪失相關之其他疾患。因此，本發明提供使用本發明之多肽、CD38結合蛋白及醫藥組合物用於靶向殺死CD38表現細胞、用於將額外外源性材料遞送至此等CD38靶細胞中、用於標記靶細胞之內部、用於收集診斷資訊之方法。
特定而言，本發明之目標係提供與此項技術中目前已知之劑、組合物及/或方法相比具有某些優點之此等藥理學活性劑、組合物及/或方法。因此，本發明提供使用具有指定蛋白質序列之志賀毒素效應多肽及結合蛋白以及其醫藥組合物之方法。舉例而言，本文所闡述之任一胺基酸序列均可特定地用作結合蛋白之組分，該結合蛋白用於以下方法中或熟習此項技術者已知之使用結合蛋白之任一方法中，諸如WO 2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO 2015/191764、US20150259428、WO 2016/196344、WO 2017/019623、WO 2018/106895及WO 2018/140427中所闡述之各種方法。
本發明提供抑制CD38陽性細胞或CD38陽性細胞群體之生長之方法，其包含使該細胞或該群體在活體外、離體或活體內與包含細胞毒性志賀毒素效應多肽之CD38結合蛋白或包含本發明之CD38細胞結合蛋白之醫藥組合物接觸之步驟。本發明亦提供殺死CD38陽性細胞之方法，其包含使該細胞在活體外、離體或活體內與包含細胞毒性志賀毒素效應多肽之CD38結合蛋白或包含本發明之CD38細胞結合蛋白之醫藥組合物接觸之步驟。本發明之志賀CD38結合蛋白及醫藥組合物可用於在一或多個細胞與所主張物質組合物中之一者接觸時殺死表現CD38之細胞類型。在一些實施例中，本發明之CD38結合蛋白或醫藥組合物可用於殺死不同類型之細胞混合物中之過表現CD38之類型的細胞。在一些實施例中，本發明之CD38結合蛋白或醫藥組合物可用於殺死不同類型之細胞混合物中之CD38陽性造血癌細胞，諸如骨髓瘤細胞。熟習此項技術者使用此項技術中熟知之多種方法中之一或多者可確定CD38結合蛋白之治療濃度或劑量量。
在一些實施例中，本發明之某些CD38結合蛋白及醫藥組合物在活體外、離體或活體內投與個體(諸如需要此治療之人類個體)之細胞群體時可顯示強效之細胞殺死活性。藉由使用高親和力結合區靶向具酶活性之志賀毒素A亞單元效應多肽至表現CD38之特定細胞類型之遞送，可將細胞殺死活性限於特異性且選擇性地殺死生物體內之彼等CD38表現細胞。
本發明提供殺死有需要個體之CD38陽性血液癌細胞之方法，該方法包含向該個體投與至少一種本發明之CD38結合蛋白或其醫藥組合物之步驟。在一些實施例中，個體先前未接受基於CD38之療法，諸如抗CD38抗體(例如達雷木單抗)。在一些實施例中，個體具有免疫能力。在一些實施例中，個體之免疫功能不全。在一些實施例中，個體先前未接受自體幹細胞移植物。
在一些實施例中，個體在投與4號CTM之前已先前接受一或多種基於CD38之療法，諸如抗CD38抗體(例如達雷木單抗)。在一些實施例中，除4號CTM以外，該等方法進一步包含投與基於CD38之療法，諸如抗CD38抗體(例如達雷木單抗)。
在一些實施例中，個體患有多發性骨髓瘤，且CD38結合蛋白係投與該個體之第一治療。在一些實施例中，個體患有多發性骨髓瘤，且CD38結合蛋白係在另一治療之後或與其同時投與。
在一些實施例中，本發明之CD38結合蛋白或其醫藥組合物可藉由靶向與癌細胞物理偶合之細胞外CD38而用於殺死個體中之癌細胞。術語「癌細胞(cancer cell或cancerous cell)」係指以異常加速及/或不受調控之方式生長及分裂之各種贅瘤細胞，且其對於熟習此項技術者將係明顯的。可受益於本發明之方法及組合物之CD38陽性造血系統癌症(惡性或非惡性)對於熟習此項技術者將係明顯的。贅瘤細胞通常與以下中之一或多者相關：不受調控之生長、缺乏分化、局部組織侵襲、血管生成及轉移。
利用本發明之CD38結合蛋白或其醫藥組合物用於在自個體移除之經分離細胞群體中離體消耗CD38陽性血細胞(例如T細胞及/或B細胞)係在本發明之範圍內。
投與「有效劑量」之本發明組合物可降低疾病症狀之嚴重程度、增加無疾病症狀時期之頻率及持續時間或預防由於疾病折磨所致之損傷或失能。本發明組合物之有效量將取決於投與途徑、所治療生物體之類型及所考慮特定個體之身體特徵。該等因素及其與確定此量之關係對於醫學領域中之熟練從業者係眾所周知的。此量及投與方法可經調整以達成最佳效能，且可取決於諸如體重、飲食、並行用藥等因素及熟習醫學領域技術者所眾所周知之其他因素。最適合人類使用之劑量大小及投藥方案可由本發明獲得之結果進行指導，且可在經適當設計之臨床試驗中予以確認。有效劑量及治療方案可藉由習用方式來確定，在實驗室動物中以低劑量開始且接著在監測效應的同時增加劑量，以及系統地改變劑量方案。臨床醫師在確定用於給定個體之最佳劑量時可慮及多種因素。可由熟習健康照護之專業人員視需要選擇且再調整劑量，以使對特定個體之治療益處最大化。此等考慮因素為熟習此項技術者所已知。
在一些實施例中，本發明提供治療血液癌症之方法，其包含向有需要之個體投與CD38結合蛋白或包含其之組合物。在一些實施例中，本發明提供治療血液癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之CD38結合蛋白或包含其之組合物。血液癌症可係例如多發性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、柏基特淋巴瘤(BL)、B慢性淋巴球性白血病(B-CLL)、B及T急性淋巴球性白血病(ALL)、T細胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓性白血病(AML)、毛細胞白血病(HCL)、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、慢性骨髓性白血病(CML)。在一些實施例中，血液癌症係多發性骨髓瘤。在一些實施例中，骨髓瘤係復發性或難治性的。
在一些實施例中，本發明提供治療與多發性骨髓瘤相關之疾患之方法，其包含向有需要之個體投與CD38結合蛋白或包含其之組合物。在一些實施例中，本發明提供治療與多發性骨髓瘤相關之疾患之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之CD38結合蛋白或包含其之組合物。
在一些實施例中，本發明提供治療黑色素瘤之方法，其包含向有需要之個體投與CD38結合蛋白或包含其之組合物。在一些實施例中，本發明提供治療黑色素瘤之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之CD38結合蛋白或包含其之組合物。
在一些實施例中，本發明方法不包含向個體中移植自體幹細胞。
可使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者，經由一或多種適宜投與途徑來投與本發明之醫藥組合物。如熟習此項技術者應瞭解，投與途徑及/或模式將端視於期望結果而變化。可接受之投與途徑可指此項技術中已知之任一投與路徑，其可由臨床醫師結合預期治療或診斷用途加以考慮，諸如藉由非經腸投與，該非經腸投與通常與在預期作用部位處之注射或與預期作用部位之連通相關(例如靜脈內投與)。
本發明之醫藥組合物通常將多次投與同一個體。基於調控個體之血液水準或其他標記物，單次劑量之間的間隔可變化且可以規律或不規律之週期進行。
在一些實施例中，本發明提供用於治療哺乳動物個體(諸如人類個體)中與CD38過表現相關之血細胞癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之本發明之細胞毒性CD38結合蛋白或醫藥組合物之步驟。在一些實施例中，該血細胞癌症係多發性骨髓瘤(MM)。 H.    CD38結合融合蛋白之調配物
本發明提供用於醫藥組合物中之CD38結合蛋白，其用於治療或預防癌症及/或下文進一步詳細闡述的與CD38過表現相關之疾患、疾病或症狀(例如包括CD38陽性細胞之造血系統癌症之血液癌症，諸如多發性骨髓瘤)。本發明提供醫藥組合物，根據本發明，其包含本發明之CD38結合蛋白或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物，以及至少一種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或媒劑。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物可包含本發明結合蛋白之同二聚體形式。關於本發明之醫藥組合物之用途，設想每一此疾病、疾患、病症或症狀係單獨實施例。如下文更詳細地闡述，本發明亦提供用於本發明之至少一種治療方法中之醫藥組合物。
如本文所用，術語「個體」係指任何生物體，通常係指哺乳動物個體，諸如人類及動物。術語「個體」及「患者」可互換使用。在一些實施例中，個體可係哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類或非人類靈長類動物)、家畜動物(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、伴侶動物(例如貓、狗等)及實驗室動物(例如小鼠、兔、大鼠等)。在一些實施例中，個體可呈現出與CD38細胞過表現相關之至少一種疾患之症狀、徵象及/或適應症。
如本文所用，術語「治療(treat、treating或treatment)」及其文法變體具有與熟習此項技術者通常所理解相同之含義。在一些實施例中，該等術語可指用於獲得有益或期望臨床結果之方法。該等術語可指減緩疾患、病症或疾病之發作或發展速率、減輕或緩和與其相關之症狀、使病狀完全或部分消退或上述任一者之一些組合。出於本發明之目的，有益或期望臨床結果包括(但不限於)減輕或緩和症狀、減弱疾病程度、使疾病狀態穩定(例如不惡化)、延遲或減緩疾病進展、改善或減輕疾病狀態及緩解(無論部分抑或全部)，無論其係可偵測的抑或不可偵測的。「治療(Treat、treating或treatment)」亦可意指相對於不接受治療之情形下的預期存活時間延長存活。因此，需要治療之個體(例如人類)可係已患有所討論疾病或病症之個體。術語「治療(treat、treating或treatment)」包括相對於不存在治療之情形，抑制或降低病理狀態或症狀之嚴重程度之增加，且未必意欲暗示相關疾病或疾患之完全終止。
如本文所用，術語「預防(prevent、preventing、prevention)」及其文法變體係指用於預防疾患或疾病之發生或改變其病理學之方法。因此，「預防」可指預防性(prophylactic或preventive)措施。出於本發明之目的，有益或期望臨床結果包括(但不限於)預防或減緩疾病之症狀、進展或發展，無論其係可偵測的抑或不可偵測的。因此，需要預防之個體(例如人類)可係尚未患有所討論疾病或病症之個體。術語「預防」包括相對於不存在治療之情形減緩疾病之發作，且未必意欲暗示相關疾病、病症或疾患之永久預防。因此，在某些背景中，「預防(preventing或prevention)」疾患可指降低發生該疾患之風險或預防或延遲與該疾患相關之症狀之發展。
如本文所用，「有效量」係有效用於治療及/或預防如本文所揭示之疾病、病症或疾患之量。在一些實施例中，有效量係組合物(例如治療組合物、化合物或劑)在個體中產生至少一種期望治療效應之量或劑量，諸如預防或治療目標疾患或有益地緩和與該疾患相關之症狀。最合意之有效量係熟習此項技術者為有需要之給定個體所選擇的將產生特定治療之期望效能之量。此量將端視於熟習此項技術者所瞭解之多種因素而變化，包括(但不限於)治療組合物之特徵(包括活性、藥物動力學、藥效學及生物利用度)、個體之生理狀況(包括年齡、性別、疾病類型、疾病階段、一般身體狀況、對給定劑量之反應性及藥劑類型)、調配物中一或多種醫藥學上可接受載劑之性質及投與途徑。熟習臨床及藥理學技術者將能夠經由常規實驗來確定有效量，亦即藉由監測個體對投與組合物之反應且相應地調整劑量來進行(例如，參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A編輯，Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S.，19版，1995))。
在一些實施例中，本文所闡述之CD38結合蛋白意欲用於靜脈內輸注。在一些實施例中，將CD38結合蛋白調配於含有低溫保護劑及表面活性劑之緩衝水溶液中。在一些實施例中，將本文所闡述之CD38結合蛋白調配於含有蔗糖作為低溫保護劑及聚山梨醇酯80作為表面活性劑且pH在4.8-5.2範圍內之檸檬酸鈉緩衝水溶液中。在一些實施例中，將CD38結合蛋白調配於包含約1 mM至約100 mM檸檬酸鈉之溶液中。在一些實施例中，將CD38結合蛋白調配於包含約1 mM至約300 mM蔗糖之溶液中。在一些實施例中，將CD38結合蛋白調配於包含約0.01%至約0.15%聚山梨醇酯80水溶液之溶液中。在一些實施例中，水溶液之pH係在約4.3至約5.5範圍內。在一些實施例中，組合物包含約20 mM檸檬酸鈉、約200 mM蔗糖及約0.02%聚山梨醇酯80之水溶液，其中該水溶液之pH係在約4.8至約5範圍內。在一些實施例中，將本文所闡述之CD38結合蛋白調配於含有200 mM蔗糖及0.02% (體積/體積)聚山梨醇酯80之20 mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 5.0)中。例示性調配物列示如下：
成分 每 ml 之量 功能
4號CTM 0.50 mg 活性成分
檸檬酸鈉二水合物 3.82 mg 緩衝劑， 共軛鹼
檸檬酸一水合物 1.47 mg 緩衝劑，酸
蔗糖 68.4 mg 低溫保護劑
聚山梨醇酯80 0.2 mg 表面活性劑穩定劑
注射用水(WFI) 補足至1 mL 溶劑
氫氧化鈉 視需要調整至pH 4.8至5.2 鹼，調整pH
鹽酸 視需要調整至pH 4.8至5.2 酸，調整pH
本發明醫藥組合物之調配物可便捷地以單位劑型呈現，且可藉由藥學技術中熟知之任一方法來製備。以此形式，將組合物分成含有適量活性組分之單位劑量。組合物可經調配用於任何適宜投與途徑及方式。
在一些實施例中，醫藥組合物包含：(i) CD38結合蛋白，其包含：(A) 細胞毒性志賀毒素A亞單元效應多肽；及(B) 能夠特異性結合人類CD38之細胞外部分之結合區，其中該結合區包含：(a) 免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含含有SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之CDR3；及(b) 免疫球蛋白重鏈可變區，其包含：含有SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之CDR3；及(ii) 醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或緩衝劑。
本發明之診斷組合物包含本發明之CD38結合蛋白及一或多種偵測促進劑。在生產或製造本發明之診斷組合物時，可將本發明之結合蛋白直接或間接地連接至一或多種偵測促進劑。熟習此項技術者已知有多種標準技術用於將各種偵測促進劑納入、附著及/或偶聯至分子之蛋白質或蛋白質性組分，尤其至免疫球蛋白及免疫球蛋白衍生之結構域。
熟習此項技術者已知有多種偵測促進劑，諸如同位素、染料、比色劑、對比增強劑、螢光劑、生物發光劑及磁化劑，其可可操作地連接至本發明之多肽或結合蛋白以用於資訊收集方法，諸如用於生物體疾病或疾患之診斷及/或預後應用(例如，參見Cai W等人，J Nucl Med 48: 304-10 (2007)；Nayak T, Brechbiel M,Bioconjug Chem 20: 825-41 (2009)；Paudyal P等人，Oncol Rep 22: 115-9 (2009)；Qiao J等人，PLoS ONE 6: e18103 (2011)；Sano K等人，Breast Cancer Res 14: R61 (2012))。劑之納入方式使得能夠在篩選、分析、診斷程序及/或成像技術中偵測診斷組合物之存在。
類似地，熟習此項技術者已知有多種成像方法，諸如醫學領域中常用之非侵入性活體內成像技術，例如：電腦斷層攝影成像(CT掃描)、光學成像(包括直接、螢光及生物發光成像)、磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)、超音波及x射線電腦斷層攝影成像。 1.    4號CTM之投用
在一些實施例中，有效量係第一有效量，且本發明之方法進一步包含向個體投與第二有效量。在一些實施例中，該第二有效量係後續劑量。在一些實施例中，4號CTM之起始劑量為約665 μg/kg體重，且後續劑量為約831 μg/kg體重。在一些實施例中，起始劑量為約831 μg/kg體重，且後續劑量為約1039 μg/kg體重。在一些實施例中，起始劑量為約1039 μg/kg體重，且後續劑量為約1299 μg/kg體重。在一些實施例中，起始劑量為約1299 μg/kg體重，且後續劑量為約1624 μg/kg體重。
在一些實施例中，每週一次向個體投與50 μg/kg之4號CTM CD38結合融合蛋白。舉例而言，可向個體投與4號CTM CD38結合蛋白達1週、2週、3週、4週或更長時間。在一些實施例中，在第1天、第8天、第15天及/或第22天向個體投與CD38分子。
在一些實施例中，每週一次向個體投與100 μg/kg之4號CTM CD38靶向分子。舉例而言，可向個體投與CD38結合蛋白達1週、2週、3週、4週或更長時間。在一些實施例中，在第1天、第8天、第15天及/或第22天向個體投與CD38分子。
在一些實施例中，每週一次向個體投與200 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。舉例而言，可向個體投與CD38結合蛋白達1週、2週、3週、4週或更長時間。在一些實施例中，在第1天、第8天、第15天及/或第22天向個體投與CD38分子。
在一些實施例中，每週一次向個體投與335 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。舉例而言，可向個體投與CD38結合蛋白達1週、2週、3週、4週或更長時間。在一些實施例中，在第1天、第8天、第15天及/或第22天向個體投與CD38分子。
在一些實施例中，每週一次向患者投與500 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。舉例而言，可向個體投與CD38結合蛋白達1週、2週、3週、4週或更長時間。在一些實施例中，在第1天、第8天、第15天及/或第22天向個體投與CD38分子。
在一些實施例中，每週一次向患者投與550 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。舉例而言，可向個體投與4號CTM CD38結合蛋白達1週、2週、3週、4週或更長時間。在一些實施例中，在第1天、第8天、第15天及/或第22天向個體投與CD38分子。
在一些實施例中，每週一次向個體投與665 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。舉例而言，可向個體投與CD38結合蛋白達1週、2週、3週、4週或更長時間。在一些實施例中，在第1天、第8天、第15天及/或第22天向個體投與CD38分子。
在一些實施例中，每隔一週向個體投與50 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。在一些實施例中，在第1天及第15天向個體投與4號CTM CD38分子。
在一些實施例中，每隔一週向個體投與100 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。在一些實施例中，在第1天及第15天向個體投與CD38分子。
在一些實施例中，每隔一週向個體投與200 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。在一些實施例中，在第1天及第15天向個體投與4號CTM CD38分子。
在一些實施例中，每隔一週向個體投與335 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。在一些實施例中，在第1天及第15天向個體投與4號CTM CD38分子。
在一些實施例中，每隔一週向個體投與500 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。在一些實施例中，在第1天及第15天向個體投與4號CTM CD38分子。
在一些實施例中，每隔一週向個體投與550 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。在一些實施例中，在第1天及第15天向個體投與4號CTM CD38分子。
在一些實施例中，每隔一週向個體投與665 μg/kg之4號CTM CD38結合蛋白。在一些實施例中，在第1天及第15天向個體投與4號CTM CD38分子。 2.    治療血液癌症(包括多發性骨髓瘤)之方法
在一些實施例中，治療血液癌症(例如多發性骨髓瘤)之方法包含以50 μg/kg個體體重、100 μg/kg個體體重、200 μg/kg個體體重、335 μg/kg個體體重、500 μg/kg個體體重或665 μg/kg個體體重之量向有需要之個體投與4號CTM CD38結合蛋白。
在一些實施例中，治療血液癌症(例如多發性骨髓瘤)之方法包含在第1天、第8天、第15天及第22天中之每一天以50 μg/kg個體體重之量向有需要之個體投與4號CTM CD38結合蛋白，其中第8天較第1天晚一週；第15天較第8天晚一週；且第22天較第15天晚一週。
在一些實施例中，治療血液癌症(例如多發性骨髓瘤)之方法包含在第1天、第8天、第15天及第22天中之每一天以100 μg/kg個體體重之量向有需要之個體投與4號CTM CD38結合蛋白，其中第8天較第1天晚一週；第15天較第8天晚一週；且第22天較第15天晚一週。
在一些實施例中，治療血液癌症(例如多發性骨髓瘤)之方法包含在第1天、第8天、第15天及第22天中之每一天以200 μg/kg個體體重之量向有需要之個體投與4號CTM CD38結合蛋白，其中第8天較第1天晚一週；第15天較第8天晚一週；且第22天較第15天晚一週。
在一些實施例中，治療血液癌症(例如多發性骨髓瘤)之方法包含在第1天、第8天、第15天及第22天中之每一天以335 μg/kg個體體重之量向有需要之個體投與4號CTM CD38結合蛋白，其中第8天較第1天晚一週；第15天較第8天晚一週；且第22天較第15天晚一週。
在一些實施例中，治療血液癌症(例如多發性骨髓瘤)之方法包含在第1天、第8天、第15天及第22天中之每一天以500 μg/kg個體體重之量向有需要之個體投與4號CTM CD38結合蛋白，其中第8天較第1天晚一週；第15天較第8天晚一週；且第22天較第15天晚一週。
在一些實施例中，治療血液癌症(例如多發性骨髓瘤)之方法包含在第1天、第8天、第15天及第22天中之每一天以550 μg/kg個體體重之量向有需要之個體投與4號CTM CD38結合蛋白，其中第8天較第1天晚一週；第15天較第8天晚一週；且第22天較第15天晚一週。
在一些實施例中，治療血液癌症(例如多發性骨髓瘤)之方法包含在第1天、第8天、第15天及第22天中之每一天以665 μg/kg個體體重之量向有需要之個體投與4號CTM CD38結合蛋白，其中第8天較第1天晚一週；第15天較第8天晚一週；且第22天較第15天晚一週。
在一些實施例中，本發明提供治療人類個體(通常確診為MM)之4號CTM方法，其係藉由投與4號CTM細胞毒性CD38結合蛋白或包含本文所闡述之4號CTM細胞毒性CD38結合融合蛋白之醫藥組合物來實施。
在一些實施例中，個體係成年人類患者(例如大於或等於18歲)。在一些實施例中，個體係青少年個體(例如小於18歲)。在一些實施例中，個體係男性。在一些實施例中，個體係女性。在一些實施例中，個體確診為多發性骨髓瘤。
在一些實施例中，個體患有復發性或難治性多發性骨髓瘤(RRMM)。在一些實施例中，RRMM人類個體用已知賦予RRMM患者臨床益處之可用療法治療失敗、對該等可用療法不耐受或不係其候選者。
在一些實施例中，RRMM個體已接受至少三種先前系列之MM療法，且對至少一種基於蛋白酶體抑制劑(PI)之療法、至少一種基於免疫調節藥物(IMiD)之療法及視情況至少一種基於類固醇之療法具有難治性或不耐受。先前系列之MM療法可包括一或多種抗CD38療法，包括(但不限於)達雷木單抗。
在一些實施例中，RRMM個體已接受至少三種先前系列之MM療法(包括達雷木單抗)，且對達雷木單抗、至少一種基於蛋白酶體抑制劑(PI)之療法、至少一種基於免疫調節藥物(IMiD)之療法及視情況至少一種基於類固醇之療法具有復發性或難治性。
在一些實施例中，RRMM個體已接受至少三種先前系列之MM療法，且對至少一種基於蛋白酶體抑制劑(PI)之療法、至少一種基於免疫調節藥物(IMiD)之療法及視情況至少一種基於類固醇之療法具有難治性。先前系列之MM療法不包括任何抗CD38療法。
在一些實施例中，RRMM個體已接受至少兩種先前系列之MM療法(若該兩種系列中之一者包括基於PI之療法與基於IMiD之療法之組合)，且該個體對至少一種基於PI之療法、至少一種基於IMiD之療法及視情況至少一種基於類固醇之療法具有難治性。先前系列之MM療法中之一或多者可包括抗CD38療法，包括(但不限於)達雷木單抗。
在一些實施例中，RRMM個體已接受至少兩種先前系列之MM療法，其中該兩種系列中之一者包括基於PI之療法與基於IMiD之療法之組合，且另一系列包括達雷木單抗，且該個體對達雷木單抗、至少一種基於PI之療法、至少一種基於IMiD之療法及視情況至少一種基於類固醇之療法具有復發性或難治性。
在一些實施例中，RRMM個體已接受至少兩種先前系列之MM療法(若該兩種系列中之一者包括基於PI之療法與基於IMiD之療法之組合)，且該個體對至少一種基於PI之療法、至少一種基於IMiD之療法及視情況至少一種基於類固醇之療法具有難治性。先前系列之MM療法不包括任何抗CD38療法。
在一些實施例中，RRMM個體已接受先前系列之抗CD38療法，包括(但不限於)達雷木單抗，且該個體在用本文所闡述之4號CTM CD38結合蛋白治療期間之任何時間均對抗CD38療法具有復發性或難治性。
在一些實施例中，個體尚未接受任何先前系列之MM療法。在一些實施例中，個體尚未接受任何先前之基於抗CD38之療法。
在一些實施例中，RRMM個體含有以下準則中之至少一者，包括在血清蛋白電泳(SPEP)上之血清中M蛋白濃度＞=500 mg/dL (＞=5 g/L)；在尿蛋白電泳(UPEP)上之尿中M蛋白濃度＞=200 mg/24 h；及倘若血清FLC比率異常，則藉由血清FLC分析量測之所累及游離輕鏈(FLC)水準＞=10 mg/dL (＞=100毫克/公升[mg/L])。
在一些實施例中，RRMM個體之美國東岸癌症臨床研究合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體能狀態評分為0或1。
在一些實施例中，RRMM個體在篩選心電圖(ECG)上具有由弗雷德里克(Fridericia)方法校正之正常QT間隔(QTcF)，其限定為在男性中QTcF ＜=450毫秒(ms)或在女性中＜=470 ms。
在一些實施例中，RRMM個體符合或實質上符合以下臨床實驗室準則，包括總膽紅素＜=1.5*正常範圍上限(ULN)，患有吉伯特氏症候群(Gilbert's syndrome)之參與者除外，在該參與者中直接膽紅素必須＜2.0*ULN；血清丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST) ＜=2.5*ULN；使用腎臟疾病飲食調整研究(modification of diet in renal disease，MDRD)方程式，估計腎小球濾過率(eGFR) ＞=30毫升/分鐘(mL/min/1.73平方米[m^2])；絕對嗜中性球計數(ANC) ＞=750個/立方毫米(/mm^3) (＞=1.0*10^ 9/公升[/L])；血小板計數＞=50,000/ mm^3 (＞=75*10^ 9/L)；血紅素＞=7.5 g/dL。
在一些實施例中，RRMM個體不患有以下疾患中之一或多者，包括(1) 多神經病變、器官巨大症、內分泌病變、單株丙種球蛋白病變及皮膚變化(POEMS)症候群、意義不明的單株丙種球蛋白病變、燜燃型骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、類澱粉變性、華氏巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)或免疫球蛋白M (IgM)骨髓瘤；(2) NCI CTCAE等級＞=3之感覺或運動神經病變；(3) 以下治療/程序(包括骨髓瘤特異性療法)中之任一者之最終劑量：包括在14天內之PI及IMiD、在7天內之對骨髓瘤之皮質類固醇療法、在14天內之對局部骨病變之放射療法、在30天內之大手術、在90天內之自體幹細胞移植；(4) 已接受同種異體幹細胞移植或器官移植；(5) 尚未自先前骨髓瘤治療或程序(化學療法、免疫療法、放射療法)之不良反應(不包括脫髪)恢復至NCI CTCAE V5等級＜=1或基線；(6) MM累及中樞神經系統(CNS)之臨床徵象；(7) 已知或疑似之任何器官之輕鏈類澱粉變性(骨髓生檢上存在類澱粉但無類澱粉變性之其他證據係可接受的)；(8) (紐約心臟學會(New York Heart Association))類別＞=II或左心室射血分數(LVEF) ＜40%之鬱血性心臟衰竭、心肌病變、活動性缺血或任何其他不受控之心臟疾患(諸如過去6個月內之心絞痛或心肌梗塞)、需要療法(包括抗凝劑)之臨床上顯著之心律不整或臨床上顯著之不受控高血壓；(9) 需要全身性療法之慢性或活動性感染，以及尚未完全治癒之症狀性病毒感染病史(例如，人類免疫缺失病毒(HIV)或B型或C型病毒性肝炎)；(10) 任何單株抗體或嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法輸注後之全身發炎反應症候群(SIRS)/細胞介素釋放症候群(CRS)反應病史；及(11) 需要使用＞10毫克/天(mg/天)之普賴松(prednisone)或等效物之劑量之全身性皮質類固醇的慢性疾患。在一些實施例中，個體不具有顯著胸膜或心包滲出液病史。在一些實施例中，個體不具有對康黴素(kanamycin)或其他胺基糖苷之過敏性或嚴重毒性反應病史。
在一些實施例中，本文所闡述之個體每週一次或兩次每公斤體重靜脈內輸注1 µg至1500 µg之CD38結合蛋白達連續3週或更多週，諸如達4週、5週或6週。說明性劑量包括每公斤體重50 µg、100 µg、200 µg、335 µg、500 µg、550 µg及665 µg之CD38結合蛋白。說明性投與方案包括每週投與一次達4週，在第1天、第8天、第15天及第28天進行；或每兩週投與一次達4週，在第1天及第15天進行。
在本發明方法之一些實施例中，所治療之癌症係多發性骨髓瘤(MM)。 VIII.  實例
以下實例闡述本發明之說明性CD38結合蛋白，其包含(1) 免疫球蛋白型CD38結合區；及(2) 去免疫化且抗弗林蛋白酶裂解之志賀毒素A亞單元效應多肽。說明性結合蛋白之每一CD38結合區展現與人類CD38靶分子之細胞外部分之高親和力結合，該人類CD38靶分子物理偶合至一或多種特定細胞類型之表面。說明性結合蛋白之每一志賀毒素A亞單元效應多肽展現導致真核核糖體抑制之催化活性。本發明之該等說明性結合蛋白結合至由靶細胞表現且與細胞表面締合之CD38，且隨後藉由內化進入靶細胞。接著，內化之結合蛋白有效地將志賀毒素A亞單元效應多肽組分按路線發送至胞質液且由於志賀毒素效應子之催化活性而直接經由核糖體抑制殺死靶細胞。說明性CD38結合蛋白能夠在抗CD38抗體達雷木單抗存在下殺死CD38表現細胞。 A.    實例1. 包含去免疫化且抗弗林蛋白酶裂解之志賀毒素A亞單元衍生多肽之CD38結合蛋白
產生且測試結合蛋白：該等結合蛋白各自包含1) 結合人類CD38之靶向細胞之結合區，及2) 抗弗林蛋白酶裂解之去免疫化的志賀毒素效應多肽。先前已構築志賀毒素A亞單元衍生之結合蛋白且其顯示促進細胞內化以及其志賀毒素效應多肽組分至胞質液之直接細胞內按路線發送(例如，參見WO 2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO 2015/191764、WO 2016/196344、PCT/US2017/065074及WO 2018/106895)。在此實例中，產生靶向細胞表面CD38之結合蛋白。如下文所展示，該等CD38結合蛋白能夠在外源性投與時特異性結合且殺死表現CD38之人類癌細胞。 1.    說明性CD38結合蛋白之構築
使用此項技術中已知之技術，產生說明性CD38結合蛋白，其包含1) 去免疫化且抗弗林蛋白酶裂解之志賀毒素A亞單元效應多肽，及2) 由蛋白質性連接體隔開之CD38結合免疫球蛋白衍生多肽(例如，參見圖1A至圖1B)。構築所產生之靶向細胞之融合蛋白，使得各自包含連續多肽，該連續多肽包含融合至去免疫化且抗弗林蛋白酶裂解之志賀毒素A亞單元效應多肽之CD38結合免疫球蛋白衍生多肽。
在此實例中，結合蛋白之所有志賀毒素效應多肽組分均係源自SLT-1A (SEQ ID NO:1)或StxA (SEQ ID NO:2)之胺基酸1-251，且其中某些相對於野生型志賀毒素A亞單元含有兩個或更多個胺基酸殘基取代，諸如去免疫化取代及/或弗林蛋白酶裂解基元破壞性取代(例如，參見WO 2015/113007、WO 2015/191764及WO 2016/196344)或插入三個胺基酸殘基以幫助純化。結合蛋白之說明性志賀毒素效應多肽組分提供於SEQ ID NO: 45-69中。對於每一說明性CD38結合蛋白，使用蛋白質性連接體將志賀毒素效應多肽連接至CD38結合區。
在多種效能及安全性模型中篩選融合至去免疫化志賀毒素效應子之CD38靶向抗體文庫以鑑別候選者。首先，構築超過50種不同的CD38結合蛋白且針對對活體外CD38陽性骨髓瘤及淋巴瘤細胞之靶向細胞毒性進行篩選。在此實例之實驗中所測試之所有結合蛋白均係在細菌系統中產生且藉由管柱層析使用熟習此項技術者已知之技術進行純化，諸如經由幾丁質結合標籤之內含肽介導之純化(例如，參見實例1之WO 2016/126950)、在結合蛋白中使用多組胺酸標籤及/或使用由結合蛋白中免疫球蛋白結構域結合之細菌蛋白質，例如使用細菌蛋白質，諸如蛋白質A或蛋白質L。
在此實例中產生及測試之說明性結合蛋白包括1號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:76，圖25A)、2號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:77，圖25B)、3號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:78，圖25C)、4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79，圖25D)、5號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:80)及6號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:81)。
最初，產生源自25組抗CD38抗體可變結構域序列之50種CD38結合蛋白。對於每一抗CD38抗體，均產生單鏈可變片段(scFv)，其中抗體之CD38結合結構域可變區係以兩種定向中之一者排列，亦即輕鏈(VL)更靠近胺基末端(VL-VH)或重鏈(VH)更靠近胺基末端(VH-VL)。使該等scFv融合至去免疫化之志賀毒素A亞單元效應多肽以產生超過50種不同的CD38結合蛋白以供篩選、分析及比較。每一CD38結合蛋白包含至少一個單鏈可變片段作為潛在之CD38結合區。
在大腸桿菌中產生帶有內含肽-幾丁質結合結構域(CBD)標籤之該50種CD38結合蛋白，且接著利用幾丁質親和力及二硫蘇糖醇(DTT)溶析進行純化(如先前在WO 2016/126950中所闡述)。針對對CD38陽性細胞之細胞毒性篩選所得CD38結合蛋白。亦使用在本文中稱為1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之參考分子來評估篩選結果，例如藉由設定細胞毒性功效基準進行。 2.    II. 針對對CD38陽性細胞之細胞毒性篩選CD38結合蛋白
使用基於組織培養細胞之毒性分析量測說明性結合蛋白之細胞毒性活性。對於某些結合蛋白，測定殺死同質細胞群體中一半細胞之外源性投與結合蛋白之濃度(半最大細胞毒性濃度)。使用細胞殺死分析測試說明性結合蛋白之細胞毒性，該等分析涉及關於每一結合蛋白結合區之靶標生物分子之靶標生物分子陽性或靶標生物分子陰性細胞。
此實例中所使用之某些表現CD38之靶細胞(MOLP-8、H929、ST486、Daudi、ANBL6、MM.1S、LP-1及RPMI8226)係可自ATCC (Manassas VA, U.S.)或DSMZ (The Leibniz Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture) (Braunschweig, DE))獲得之永生化腫瘤細胞。
如下實施細胞殺死分析。於384孔板中將人類腫瘤細胞株細胞平鋪(通常以2 × 103個細胞/孔)在20 μL細胞培養基中。在適當緩衝液中製備一系列(通常10倍稀釋度)欲測試之蛋白質，且將5 μL稀釋液或僅緩衝液作為陰性對照添加至細胞。僅含有細胞培養基之對照孔用於基線校正。將細胞樣品與該等蛋白質或僅緩衝液在37℃及5%二氧化碳(CO2)氣氛下一起培育2至3天。使用CellTiter-Glo®發光細胞存活率分析2.0 (G924A Promega Madison, WI, U.S.)，根據製造商之說明以相對光單位(RLU)進行量測，使用發光讀數測定總細胞存活或存活率百分比。
使用以下方程式計算實驗孔之存活率百分比：(測試RLU -平均培養基RLU) ÷ (平均細胞RLU -平均培養基RLU) × 100。在Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)中對對數蛋白質濃度對存活率百分比進行繪圖，且使用對數(抑制劑)對反應(3參數)分析來測定所測試蛋白質之半最大細胞毒性濃度(CD50 )值。在可能之情形下，計算所測試之每一說明性細胞靶向蛋白質之CD50 值。當CD50 值不能基於關於所測試濃度之曲線之形狀計算時，則將最大CD50 值記錄為超出最大測試值。在一些實驗中，與僅緩衝液對照相比，利用最大濃度之結合蛋白處理的生物分子靶標陰性細胞未顯示出存活率之任何變化。
給定CD38結合蛋白之細胞毒性活性特異性係藉由比較對表現大量CD38之細胞(靶標陽性細胞)之細胞殺死活性與對不展現任何大量的與任何細胞表面物理偶合之CD38的細胞(靶標陰性細胞)之細胞殺死活性來確定。此係藉由以下來完成：確定給定結合蛋白對所分析結合蛋白之靶標生物分子之細胞表面表現呈陽性的細胞群體之半最大細胞毒性濃度，且接著使用相同結合蛋白濃度範圍來嘗試確定對CD38結合蛋白之靶標生物分子之細胞表面表現呈陰性的細胞群體之半最大細胞毒性濃度。在一些實驗中，與「僅緩衝液」陰性對照相比，經最大量之含有志賀毒素之分子處理的靶標陰性細胞未顯示出存活率之任何變化。另外，使用經分離之志賀毒素效應區多肽作為非靶向陰性對照。
表5中之數據顯示使用上文所闡述之細胞殺死分析，源自25種抗CD38抗體可變結構域序列之50種CD38結合蛋白對CD38陽性腫瘤細胞之細胞毒性結果。與1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之細胞毒性相比，每一者之細胞毒性示於右側行中。對於所測試之每一細胞類型，在六個不同實驗中分析1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:80)之細胞毒性且計算平均值並用於比較(例如表5中所示之倍數變化計算)。圖2顯示如使用Cell Titer-Glo存活率分析所測定，該51種CD38結合蛋白對CD38陽性H929骨髓瘤細胞之細胞毒性活性之篩選結果。其他細胞毒性數據報告於表7至表9及表13至表14以及圖3A至圖3C、圖4A至圖4B及圖8A至圖8E中。此分析中1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之代表性CD50 值為對於ST486細胞37 pM且對於Daudi細胞44 pM。表 5. CD38 結合蛋白之細胞毒性活性
CD50 (ng/mL) 相對於1 號CD38 靶向參考分子之CD50 之倍數變化
蛋白質 MOLP-8 H929 ST486 Daudi MOLP-8 H929 ST486 Daudi
1 32.4 2.53 14.03 22.88 3.6 3.0 8.6 8.8
2 25.7 4.2 9.1 6.9 2.9 5.1 5.6 2.7
3 ＞20,000 1,918 1,661 ＞20,000 N/A 2310.8 1019.0 N/A
4 19.9 6.7 1.9 6.8 2.2 8.1 1.2 2.6
5 8.9 0.7 1.1 5.3 1.0 0.8 0.7 2.0
6 232.7 63.4 302.6 253.3 26.0 76.4 185.6 97.4
7 3023 914.1 1126 ＞20,000 337.4 1101.3 690.8 N/A
8 165 23.7 18.2 267.3 18.4 28.6 11.2 102.8
9 8090 2476 1768 13052 902.9 2983.1 1084.7 5020.0
10 35 17 3.9 41 3.9 20.5 2.4 15.8
11 8.54 0.55 4.13 0.88 1.0 0.7 2.5 0.3
12 8.26 0.84 0.25 5.47 0.9 1.0 0.2 2.1
13 91.8 53.6 9.5 93.2 10.2 64.6 5.8 35.8
14 ＞20,000 1,156 498 ＞20,000 N/A 1392.8 305.5 N/A
15 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 N/A N/A N/A N/A
16 57 40 13 66 6.4 48.2 8.0 25.4
17 1436 217.6 507.7 2593 160.3 262.2 311.5 997.3
18 55.57 21.14 3.34 56.16 6.2 25.5 2.0 21.6
19 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 N/A N/A N/A N/A
20 772 356 248 2,719 86.2 428.9 152.1 1045.8
21 30.66 3.03 9.86 2.18 3.4 3.7 6.0 0.8
22 2.26 0.54 約0.014 約0.2 0.3 0.7 NC NC
23 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 N/A N/A N/A N/A
24 73.76 63.48 7.94 119.5 8.2 76.5 4.9 46.0
25 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 N/A N/A N/A N/A
26 ＞20,000 10,635 6,056 ＞20,000 N/A 12813 3715.3 N/A
27 10,300 1,661 1,782 ＞20,000 1149.6 2001.2 1093.3 N/A
28 ＞20,000 6,411.0 ＞20,000 ＞20,000 N/A 7724.1 N/A N/A
29 6072 1270 1366 9346 677.7 1530.1 838.0 3594.6
30 160 119 28 208 17.9 143.4 17.2 80.0
31 266.8 93.22 110.1 120.3 29.8 112.3 67.5 46.3
32 730.2 88.2 238.8 602.1 81.5 106.3 146.5 231.6
33 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 dnt N/A N/A N/A N/A
34 249.3 244.8 34.4 137.2 27.8 294.9 21.1 52.8
35 ＞20,000 ＞20,000 8,856 ＞20,000 N/A N/A 5433.1 N/A
36 4,395 1,189 3,516 ＞20,000 490.5 1432.5 2157.1 N/A
37 148.7 406.6 89.7 566.6 16.6 489.9 55.0 217.9
38 12,585.0 707.4 2,752.0 9,111.0 1404.6 852.3 1688.3 3504.2
39 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 N/A N/A N/A N/A
40 ＞20,000 5,846.0 7,902.0 ＞20,000 N/A 7043.4 4847.9 N/A
41 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 ＞20,000 N/A N/A N/A N/A
42 2,528 421 551 4,741 282.1 507.2 338.0 1823.5
43 6,029.0 445.5 2,414.0 7,613.0 672.9 536.7 1481.0 2928.1
44 188.8 26.4 16.4 751.6 21.1 31.8 10.1 289.1
45 6.18 0.16 0.62 1.72 0.7 0.2 0.4 0.7
46 8.49 0.37 2.95 1.52 0.9 0.4 1.8 0.6
47 ＞20,000 7,925 12,282 ＞20,000 N/A 9548.2 7535.0 N/A
48 151 663 621 ＞20,000 16.9 798.8 381.0 N/A
49 844.7 452 286.35 698.25 94.3 544.6 175.7 268.6
50 12.4 8.4 1.3 5.5 1.4 10.1 0.8 2.1
參考分子 8.96 0.83 1.63 2.6 1.0 1.0 1.0 1.0
*「dnt」(未測試)表示未收集該細胞類型之數據 「N/A」表示當未獲得精確CD50 值(例如＞20,000)時，與參考相比之相對變化不適用。
使用此細胞殺死分析，將最初之50種CD38結合蛋白庫按細胞毒性功效縮小至18種分子。接著，選擇該18種分子之子集用於進一步測試。在表6中，將來自篩選文庫中共有相同CDR序列之蛋白質集合分成家族，例如1號家族包括蛋白質3及4，2號家族包括蛋白質49及50，3號家族包括蛋白質45及46，5號家族包括蛋白質1及2，且6號家族包括蛋白質7及8 (參見表2)。對於該等家族中之每一者，CD38結合區在結構上類似，其具有一致之CDR序列。每一家族可由其CDR集合來定義：1號家族包含由SEQ ID NO: 19-24表示之6個CDR之集合，2號家族包含由SEQ ID NO:25-30表示之6個CDR之集合，3號家族包含由SEQ ID NO:31-36表示之6個CDR之集合等。表 6. 包含相同 CDR 集合之分子形成家族
CD38結合區家族 重鏈CDR1 重鏈CDR2 重鏈CDR3 輕鏈CDR1 輕鏈CDR2 輕鏈CDR3
1號 GFTFSDYY (SEQ ID NO: 110) ISGSGGST (SEQ ID NO: 111) AREHSNYFYGMDV (SEQ ID NO: 112) SSNIGSNY (SEQ ID NO: 114) GNS (SEQ ID NO: 115) QSYDSSLSGSG (SEQ ID NO: 116)
2號 GFTFSSYW (SEQ ID NO: 118) ISGSGGGT (SEQ ID NO: 119) AREGETSFGLDV (SEQ ID NO: 120) SSNIGGNY (SEQ ID NO: 122) RNN (SEQ ID NO: 123) QSYDSSLSVS (SEQ ID NO: 124)
3號 GYSFTSYW (SEQ ID NO: 102) IYPGDSDT (SEQ ID NO: 103) ARGPSTGFWSGNYFDY (SEQ ID NO: 104) TGAVTSGFY (SEQ ID NO: 106) ATN (SEQ ID NO: 107) LVYYDGAW (SEQ ID NO: 108)
5號 GFTFNNYD (SEQ ID NO: 210) ISYDGSDK (SEQ ID NO: 211) ARVYYYGFSGPSMDV (SEQ ID NO: 212) NSNIGSNT (SEQ ID NO: 213) SDS (SEQ ID NO: 214) QSYDSSLSGSR (SEQ ID NO: 215)
6號 GFTFSDYY (SEQ ID NO: 216) ISSSSSYI (SEQ ID NO: 217) ATEGPYYLYGFDI (SEQ ID NO: 218) SSNIGSNY (SEQ ID NO: 219) GNS (SEQ ID NO: 220) QSYDNTLSGV (SEQ ID NO: 221)
7號 GFTFDDYG (SEQ ID NO: 222) INWNGGST (SEQ ID NO: 223) ARGGLFHDSSGYYFGH (SEQ ID NO: 224) SSNIGNSY (SEQ ID NO: 225) RNN (SEQ ID NO: 226) SAWDDNLSV (SEQ ID NO: 227)
圖2顯示庫中各種分子對CD38陽性H929骨髓瘤細胞之代表性CD50 值，其中某些分子標記為：1 nM之篩選截止值由垂直虛線表示，其中左側之CD50 值較截止值更強效且右側之CD50 值不如截止值強效。沒有展現出20,000 ng/mL或更小之CD50 之任何分子不包括在圖2中。
圖2顯示來自家族1至3及5至6之蛋白質展現強效之對活體外CD38陽性骨髓瘤細胞之細胞毒性，且該等蛋白質較庫中之許多其他分子更強效。下文進一表徵來自家族1至3及5至6之CD38結合蛋白。 3.    選擇候選者且自篩選進一步測試最佳命中
藉由尤其考慮對活體外CD38陽性細胞之細胞毒性功效、與人類及食蟹猴CD38二者之結合親和力、與單株CD38抗體之競爭及可製造性來縮小50種候選者之文庫。隨著篩選庫藉由各種準則縮小，使用以下分子更詳細地研究家族1至3及5至6中之CD38結合區：1號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:76)、2號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:77)、3號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:78)、4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)、5號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:80)及6號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:81)。表7顯示源自篩選之該五種說明性CD38結合蛋白之初始CD50 值。1號家族包括1號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:76)，2號家族包括2號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:77)，3號家族包括3號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:78)及4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)，5號家族包括5號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:80)，且6號家族包括6號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:81)。表 7. 所選 CD38 結合蛋白對各種 CD38 陽性細胞類型之細胞毒性功效
CD38 結合蛋白 細胞毒性 CD50 (ng/mL)
MOLP-8 H929 ST486 Daudi U266
1號CD38結合蛋白 4.7 12.6 3.4 10.3 ＞20,000
2號CD38結合蛋白 7.3 13.8 2.4 8 ＞20,000
3號CD38結合蛋白 2.2 0.2 ＜ 0.1 0.8 ＞20,000
5號CD38結合蛋白 16.8 17.9 3.9 26.8 ＞20,000
6號CD38結合蛋白 17.1 42.6 7.2 109 ＞20,000
1號CD38靶向參考分子 3.5 0.8 2.3 2.2 ＞20,000
在最佳化蛋白質產生且自篩選純化出某些候選者之後，實施額外細胞殺死分析以進一步評估及比較候選CD38結合蛋白。經由不同方法純化CD38結合蛋白，諸如使用蛋白質A或蛋白質L層析進行。一些CD38結合蛋白係藉由在志賀毒素效應多肽中引入額外胺基酸殘基或在結合CD38之scFv區之輕鏈中引入胺基酸取代來改變。
使用如上文所闡述之各種CD38結合蛋白實施細胞毒性分析且報告於表8及圖3A至圖3C中。另外，藉由用來自CD38陰性細胞株U266之細胞實施細胞毒性分析來顯示對CD38表現細胞之細胞毒性特異性。在所測試之條件下，對CD38陰性細胞不展現顯著之細胞毒性活性(例如，參見圖3C及表7至表8最後一行)。表 8. 所選 CD38 結合蛋白對人類骨髓瘤細胞株之細胞毒性
細胞毒性 CD50 (ng/mL)
CD38 結合蛋白 MOLP-8 H929 U266
3號CD38結合蛋白 0.27 0.015 ＞ 2,000
4號CD38結合蛋白 0.17 0.005 ＞ 2,000
1號CD38靶向參考分子 6.97 0.19 ＞ 2,000
僅志賀毒素效應多肽對照 ＞ 2,000 ＞ 2,000 ＞ 2,000
儘管6號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:81)顯示出CD38特異性及高細胞毒性功效，但6號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:81)之相對細胞毒性活性不如許多其他候選者高。
在靈長類動物細胞(人類或非人類靈長類動物細胞)中測試CD38結合蛋白之細胞毒性活性。BLCL-C162係表現CD38之恆河猴細胞株。結果示於表9A至表9B、圖4A (人類)及圖4B (猴)中。表 9A. 所選 CD38 結合蛋白對 CD38 陽性靈長類動物細胞株之細胞毒性
細胞毒性 CD50 (ng/mL)
CD38 靶向分子 人類 MOLP-8 恆河猴 BLCL-C162
1號CD38結合蛋白 18.3 4,619
2號CD38結合蛋白 10.5 1,126
4號CD38結合蛋白 0.23 26
1號CD38靶向參考分子 1.4 ＞ 2,000
僅志賀毒素效應多肽對照 ＞ 2,000 ＞ 2,000
表 9B. 4 號 CD38 結合蛋白對 CD38 陽性人類細胞株之細胞毒性
細胞毒性 CD50 (pM)
CD38 靶向分子 MOLP8 RPMI8226 ANBL6 NCI-H929
4號CD38結合蛋白 0.7 1.2 17.7 ＜ 0.34
量測4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)對ANBL6細胞之2小時暴露，得到以約0.1 nM及0.16 nM之CD50 值為特徵之細胞毒性。
量測4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)對ANBL6細胞之2小時暴露，得到以約0.1 nM及0.16 nM之CD50 值為特徵之細胞毒性。
4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)在活體外對全血及PBMC中之CD38陽性靶細胞具有細胞毒性，此指示在此分析中紅血球之存在不會抑制細胞毒性。
4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)在活體外對多發性骨髓瘤個體源樣品具有細胞毒性。
測試某些CD38結合蛋白之催化(核糖體抑制)及細胞毒性活性以研究該等細胞毒性分子之作用機制。使用無細胞之活體外蛋白質轉譯分析，使用TNT®快速偶合轉錄/轉譯套組(L1170 Promega Madison, WI, U.S.)測定CD38結合蛋白之核糖體失活能力。該套組包括螢光素酶T7對照DNA (L4821 Promega Madison, WI, U.S.)及TNT®快速混合母液。根據製造商說明書製備核糖體活性反應物。於適當緩衝液中製備一系列(通常10倍)稀釋液，且為每一稀釋液產生一系列一致之TNT反應混合物組分。將欲測試之分子與TNT反應混合物中之每一者以及螢光素酶T7對照DNA合併。將測試樣品在30℃下培育1.5小時。培育後，將螢光素酶分析試劑(E1483 Promega, Madison, WI, U.S.)添加至所有測試樣品，且藉由發光根據製造商說明書量測螢光素酶蛋白轉譯之量。藉由總蛋白質之對數轉換濃度對相對發光單位之非線性回歸分析來確定轉譯抑制水準。使用軟體(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)，使用標題劑量-反應-抑制下之log(抑制劑)對反應(三參數)之Prism軟體函數[Y =底值+ ((頂值-底值) / (1+10^(X - LogIC50)))]計算每一樣品之半最大抑制濃度(IC50)值。結果示於表10及圖5中。表 10. 所選 CD38 結合蛋白之核糖體抑制活性
CD38 結合蛋白 蛋白質合成抑制 IC50 (ng/mL)
4號CD38結合蛋白 1.45
1號CD38靶向參考分子 1.16
僅志賀毒素效應多肽對照 1.97
4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)之催化活性與單獨之SLTA效應多肽以及1號CD38靶向參考對照分子相當(表10)。 4.    使用細胞結合及純化之CD38結合分析測試結合蛋白之CD38靶向
實施細胞結合親和力分析以對某些CD38結合蛋白對CD38表現細胞之結合親和力進行定量。
利用酶聯免疫吸附分析(ELISA)結合分析測定CD38結合蛋白對重組人類CD38蛋白或重組食蟹猴CD38蛋白(Sino Biological, Wayne, Pennsylvania, U.S.)之結合。利用於PBS中之重組人類或食蟹猴CD38將Nunc® Maxisorp™板在4℃下包被隔夜。洗滌各孔並封閉，且接著與所測試CD38結合蛋白之稀釋系列一起培育。以兩步法利用偵測去免疫化毒素結構域之鼠類單株抗體、接著抗小鼠辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之二級抗體來偵測所結合之CD38結合蛋白。在利用TMB Ulttra偵測HRP信號且利用酸終止反應之後，利用讀板儀讀取ELISA信號(在450奈米(nm)下之吸光度(「Ab 450」))。在此分析中(表11)，分子2號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:77)、3號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:78)及4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)各自結合至人類及猴CD38二者，而1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)結合至人類CD38 (圖6A)，但不結合至食蟹猴CD38 (圖6B)。在其他實驗中，1號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:76)亦顯示結合至人類及食蟹猴CD38蛋白。表 11. 所選 CD38 結合蛋白之 CD38 結合親和力
CD38 結合之 KD (ng/mL)
CD38 結合蛋白 人類 CD38 食蟹猴 CD38
2號CD38結合蛋白 10.6 644
3號CD38結合蛋白 13.3 247
4號CD38結合蛋白 16.4 670
1號CD38靶向參考分子 7.7 無結合
此實驗中測試之所有CD38結合蛋白均以類似結合親和力結合至人類CD38；然而，與食蟹猴CD38之結合在分子間有所不同。分子1號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:76)、2號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:77)、3號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:78)及4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)各自結合至食蟹猴CD38。與人類及食蟹猴CD38二者之結合係有用的，此乃因食蟹猴動物可用作人類個體之模型以幫助測定、估計及理解CD38結合蛋白之活體內效應及性質，諸如關於藥物動力學、藥效學及毒理學；其中該模型可藉由可在相關物種(諸如人類)中轉譯之結合蛋白而具有靶向結合及靶向細胞殺死。
在另一實驗中，使用基於螢光之流式細胞術分析來分析1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之結合特徵。將含有CD38陽性(CD38+)細胞(細胞株A或F)之樣品懸浮於含有1%牛血清白蛋白(BSA) (Calbiochem, San Diego, CA, U.S.)之1× PBS (在下文中稱為「1× PBS+1%BSA」)中，且與100 µL之1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之各個稀釋液一起在4℃下培育1小時。1小時培育後，將細胞樣品用1× PBS+1%BSA洗滌兩次。使細胞樣品與100 µL含有α-SLT-1A pAb1之1× PBS+1%BSA一起在4℃下培育1小時，接著再次洗滌且與100 µL含有偶聯至異硫氰酸螢光黃(FITC)之抗兔二級抗體之1× PBS+1%BSA溶液一起在4℃下培育1小時。將細胞樣品用1× PBS+1%BSA洗滌兩次，重新懸浮於200 µL 1× PBS中且進行基於螢光之流式細胞術以分析由足夠的二級抗體結合之細胞百分比，該細胞百分比指示1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)與每一樣品中之細胞之結合水準。以平均螢光強度單位(MFI)計、以相對螢光單位計之所有樣品之數據係藉由門控使用陰性對照細胞樣品之數據獲得的，該陰性對照細胞樣品未經任何細胞靶向分子處理，但與兔多株抗體α-SLT-1A (pAb1) (Harlan Laboratories, Inc. Indianapolis, IN, U.S.)且接著與抗兔二級抗體一起培育。藉由將陽性細胞百分比乘以MFI來計算積分MFI (iMFI)。使用標題結合-飽和下之單位點結合之Prism軟體函數[Y = Bmax*X / (KD + X)]，使用基線校正數據計算Bmax及KD。對與兩種類型之CD38+細胞結合之1號CD38靶向參考分子量測之Bmax經量測為大約100,000 iMFI，且結合彼等CD38+細胞之1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之KD值經量測為大約2-7 nM。在所闡述之條件下，1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)在此分析中不展現與CD38陰性之結合。 5.    對結合蛋白之CD38結合抗原決定基進行定位
為有助於自庫表徵CD38結合蛋白候選者，進行進一步CD38結合研究。由Integral Molecular, Inc. (Philadelphia, Pennsylvania, U.S.)實施抗原決定基定位服務(藉由霰彈槍誘變) (具有丙胺酸掃描及額外突變以將來自人類之胺基酸變為食蟹猴殘基(若適當)之標準分析設置)以鑑別結合至CD38細胞外結構域(ECD)之接觸殘基。
如下實施該分析。使野生型或突變CD38 ECD在HEK293細胞之細胞表面上表現，且接著藉由流式細胞術對相關CD38結合蛋白在某些胺基酸突變時結合至CD38 ECD之能力與相同的相關CD38結合蛋白與野生型CD38 ECD之結合進行比較。利用一系列亦靶向CD38之對照分子控制該分析之影響分子表現或一般摺疊之突變。表12中將與具有特定突變之表面表現的CD38 ECD蛋白質之結合顯示為該CD38結合蛋白與野生型CD38結合之百分比。粗體標記之值指示對於結合蛋白之結合及表面可及性(基於公開之CD38結構細節)至關重要之胺基酸。表 12. 抗原決定基定位： CD38 突變對所選 CD38 結合蛋白結合之效應
CD38 ECD CD38結合蛋白 1號CD38靶向參考分子 達雷木單抗
1號 2號 4號
位置 突變 野生型% 野生型% 野生型% 野生型% 野生型%
78 R78A 2% 3% 106% 80% 52%
81 D81A 8% 9% 109% 128% 292%
119 C119A 108% 108% 12% 83% 85%
124 L124A 84% 92% 23% 259% 169%
201 C201A 90% 58% 4% 130% 109%
216 F216A 89% 74% 18% 25% 140%
230 L230A 72% 111% 7% 17% 64%
254 C254A 48% 81% 7% 46% 67%
262 L262A 68% 97% 12% 33% 83%
272 Q272A 145% 135% 68% 191% 167%
272 Q272R 105% 101% 71% 14% 162%
273 F273A 157% 117% 89% 10% 197%
274 S274F 93% 134% 101% 155% 27%
274 S274F 150% 124% 80% 74% 14%
275 C275A 18% 37% 0.3% 14% 18%
圖7顯示CD38中由4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)結合之關鍵殘基之位置。在圖7中，關鍵表面可及接觸殘基F216及L262以紅色顯示，關鍵結構殘基L124及L230以紫色顯示，且參與二硫鍵對之關鍵結構殘基C119/C201及C254/C275以灰色顯示。
如上文針對1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)所闡述實施抗原決定基定位分析。CD38中由1號CD38靶向參考分子結合之關鍵殘基係F216、L262、Q272及F273。 6.    在達雷木單抗存在下之細胞毒性活性
如上文所闡述但在抗CD38單株抗體達雷木單抗存在下實施細胞殺死分析以評價達雷木單抗是否干擾所測試CD38結合蛋白之活性。達雷木單抗係用於治療多發性骨髓瘤之經批准單株抗體。實施細胞毒性分析以區分在達雷木單抗存在下哪些CD38結合蛋白殺死CD38表現細胞。
測試相關CD38結合蛋白在達雷木單抗存在下之細胞毒性活性。在此實驗中，類似於上文所闡述來實施細胞存活率分析。在將CD38陽性細胞平鋪後，以500 μg/mL開始之稀釋系列(4倍稀釋度至2 ng/mL)將達雷木單抗添加至細胞。在添加CD38結合蛋白之前1.5小時將達雷木單抗添加至細胞，且在整個實驗中達雷木單抗留在孔中。將CD38結合蛋白以500 ng/mL之恆定濃度添加至孔中(在添加達雷木單抗之後1.5小時，且在整個實驗中留在孔中)，故在達雷木單抗之最高濃度下，達雷木單抗為CD38結合蛋白之一千倍。在72小時後進行細胞存活率讀出(CellTiter Glo2.0)。此分析之一些結果示於圖8A至圖8E中。圖8A至圖8E顯示達雷木單抗可完全阻斷1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之細胞毒性活性，但對1號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:76)及2號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:77)之細胞毒性活性具有極低效應。就H929及ST486細胞株而言，在達雷木單抗存在下，用500 ng/mL 4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)進行處理，CD38結合蛋白之細胞毒性活性沒有變化(所有細胞均被殺死)。對於4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)，在高濃度之達雷木單抗存在下，該CD38結合蛋白之細胞毒性活性降低；然而，儘管功效有所變化，但4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)仍能夠將細胞存活率影響至在達雷木單抗存在下其他CD38結合蛋白(例如1號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:76)及2號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:77))所見之水準。表13關注所選CD38結合蛋白在單株抗體存在下之細胞毒性活性，該等CD38結合蛋白為單一濃度(0.5 μg/mL)且達雷木單抗為單一濃度(500 μg/mL)，單株抗體係CD38結合蛋白之1000倍。
圖8A至圖8E顯示在達雷木單抗存在下，4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)在活體外在一定達雷木單抗濃度範圍內對CD38表現細胞具有強效細胞毒性。表 13. 所選 CD38 結合蛋白在過量抗 CD38 單株抗體達雷木單抗存在下之細胞毒性
蛋白質 經 0.5 μg/mL CD38 結合蛋白處理後之 H929 細胞存活率 經 0.5 μg/mL CD38 結合蛋白處理後之 MOLP-8 細胞存活率 經 0.5 μg/mL CD38 結合蛋白處理後之 ST486 細胞存活率
無達雷木單抗 500 μg/mL達雷木單抗 無達雷木單抗 500 μg/mL達雷木單抗 無達雷木單抗 500 μg/mL達雷木單抗
1號CD38結合蛋白 13.7% 45.6% 40.2% 86.5% 1.0% 2.3%
2號CD38結合蛋白 16.7% 57.5% 45.4% 90.6% 0.8% 0.9%
4號CD38結合蛋白 0.1% 3.7% 3.2% 59.4% 0.3% 0.7%
1號CD38靶向參考分子 1.4% 118.5% 13.7% 121.7% 3.5% 114.0%
無CD38結合蛋白 118.6% 121.8% 115.5% 112.9% 118.0% 112.9%
表 14. 所選 CD38 結合蛋白在過量抗 CD38 單株抗體達雷木單抗存在下之細胞毒性
MOLP-8 CD50 (ng/mL) ST486 CD50 (ng/mL)
蛋白質 無達雷木單抗 10 µg/mL達雷木單抗 倍數變化 無達雷木單抗 10 µg/mL達雷木單抗 倍數變化
5號家族之CD38結合蛋白 34.7 293.20 8.44 2.04 9.30 4.56
7號CD38結合蛋白 6.4 ＞20,000 ＞3,000 0.64 約20,000 ＞30,000
1號CD38靶向參考分子 14.4 ＞20,000 ＞1,000 0.42 約20,000 ＞30,000
5號及7號家族之CD38結合蛋白以及1號CD38靶向參考分子全部均顯示對CD38陽性MOLP-8骨髓瘤細胞及ST486淋巴瘤細胞之高功效(參見表14；圖8C)。
5號家族之CD38結合蛋白在達雷木單抗存在下展現細胞毒性(參見表14；圖8D)，其中CD50 值在沒有達雷木單抗存在之平行樣品之10倍內。相比之下，當靶細胞經10 μg/mL達雷木單抗預處理時(達雷木單抗係在添加CD38結合蛋白之前30分鐘以稀釋系列(自0.2 ng/mL至20,000 ng/mL)添加且在整個實驗中保留)，7號CD38結合蛋白及1號CD38靶向參考分子之細胞毒性活性被完全抑制。
4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)在活體外對多發性骨髓瘤個體源樣品(包括來自先前暴露於達雷木單抗之個體)具有細胞毒性(參見表15)。自6名多發性骨髓瘤個體收集骨髓樣品且使用常用技術進行離體培養。使用熟習此項技術者已知之常用技術評估該6名個體樣品中基線時細胞上之細胞表面CD38水準，且發現其CD38密度自137,000至6,750,000個抗體結合能力單位變化(參見表15：第2行)。將4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)以一定濃度範圍投與給細胞，接著將該等細胞培養48小時或72小時。如上文所闡述計算CD50 值，且將代表性結果報告於表15中。表 15. 4 號 CD38 結合蛋白對多發性骨髓瘤個體源骨髓腫瘤細胞之細胞毒性
個體編號 細胞表面 CD38 密度 CD50 (nM) 48小時 CD50 (nM) 72小時
1 22.9 × 105 3.5 ＜ 2.5
2 1.4 × 105 3.9 2.2
3 6.2 × 105 6.6 NA
4 19.7 × 105 8.5 3.0
5 44.0 × 105 6.5 3.3
6 67.5 × 105 5.0 4.6
4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)消耗此離體個體細胞培養物群組中表現寬範圍之CD38水準之各種多發性骨髓瘤腫瘤細胞。4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)在處理48小時後以0.38-0.85 μg/mL之CD50 濃度消耗腫瘤細胞，且在處理72小時後以0.23-0.51 μg/mL之CD50 濃度消耗腫瘤細胞(一個個體樣品在72小時時間點無法在技術上評價)。
亦測試說明性CD38靶向分子與CD38之競爭性結合(參見圖23)。測試1號CTM (SEQ ID NO:228)、2號CTM (SEQ ID NO:229)、3號CTM (SEQ ID NO:230)是否能夠在抗CD38抗體達雷木單抗(Dara)、HB-7、AT13-5或OKT-10存在下結合至CD38。如圖23A及23B中所示，1號CTM (SEQ ID NO:228)及2號CTM (SEQ ID NO:229)能夠在達雷木單抗、HB-7、AT13-5及OKT-10存在下結合至CD38，此指示該等分子可結合至CD38上與達雷木單抗、HB-7、AT13-5及OKT-10所結合之抗原決定基不同之抗原決定基。3號CTM (SEQ ID NO:230)能夠在OKT-10存在下但不能在達雷木單抗、HB-7及AT13-5存在下結合至CD38，此指示3號CTM (SEQ ID NO:230)可結合至CD38上與OKT-10所結合之抗原決定基不同之抗原決定基。該等結果表明，3號CTM (SEQ ID NO:230)與達雷木單抗、HB-7及AT13-5共有或部分共有CD38上之抗原決定基(例如部分重疊抗原決定基)。
亦測試說明性CD38靶向分子與CD38表現細胞之競爭性結合(參見圖23C)。使MOLP-8細胞與20 µg/mL之CD38靶向分子(約400 nM)或對照分子(單獨之志賀毒素A亞單元效應多肽)一起培育70分鐘。接著添加0.5 µg/mL之抗CD38，且與細胞一起培育48小時。藉由識別志賀毒素A亞單元效應多肽組分之一級抗體及FITC偶聯之抗IgG二級抗體、之後進行流式細胞術來偵測CD38結合。在減去來自僅二級抗體對照之信號後計算CD38靶向分子之平均螢光強度(MFI)，且繪製為自單獨之志賀毒素A亞單元效應多肽作為對照量測之MFI百分比。如圖23C及23D中所示，1號CTM (SEQ ID NO:228)及2號CTM (SEQ ID NO:229)以競爭性方式結合至CD38，此與其結合至CD38上之相同抗原決定基之事實一致。3號CTM (SEQ ID NO:230)以與1號CTM (SEQ ID NO:228)及2號CTM (SEQ ID NO:229)半競爭性方式結合至CD38。 7.    測試人類骨髓抽出物中之結合蛋白
為進一步評估4號CTM針對人類多發性骨髓瘤細胞之細胞毒性，自多名多發性骨髓瘤個體(標記為010、011、012、013、014及015)獲得骨髓抽出物(BMA)，包括1名對達雷木單抗具有抗性之個體(013)。利用漸增濃度之4號CTM (在約0.053 µg/mL至33.33 µg/mL範圍內)對BMA進行處理。如圖15中所示，4號CTM對BMA腫瘤細胞具有細胞毒性，且在48小時後展現約3.5 nM至8.5 nM之對該等患者源多發性骨髓瘤細胞之CD50 值且在72小時後展現約0.23 µg/mL至0.51 µg/mL之CD50 值。未觀察到CD38表現水準與4號CTM細胞毒性功效之間的嚴格相關性。 8.    藥效學模型
為測定4號CTM細胞毒性之時程，使用Real Time Glo分析在各種高CD38表現(MOLP6、RPMI-8226)及中等CD38表現(ANBL6、NCI-H929)細胞株中量測在經4號CTM處理後達大約72小時之細胞毒性。如圖16中所示，在最敏感之細胞株(例如NCI-H929)中在8小時內觀察到存活率效應。
對於所測試之大多數多發性骨髓瘤細胞類型，4號CTM CD50 值在約48小時後達到漸近線。在圖16中，表格在底部兩列中報告CD50 值(pM) (4號CTM或CD38TM4)。在圖16中，表格報告細胞表面CD38之表現水準且將該等值在CD38表現株中表徵為高或中等。4號CTM之CD38靶向部分CD38TM4之細胞毒性係在分離情形下(自志賀毒素效應多肽解離)測試的，且對於所測試之CD38TM4濃度範圍，無法測定精確之CD50 值；然而，在此分析中，對於ANBL-6、NCI-H929、MOLP-8及HCT116細胞，CD50 值經測定大於180,000 pM (圖16表格，最後一列)。未觀察到CD38表現水準與4號CTM細胞毒性功效之間的嚴格相關性。
兩種細胞株NCI-H929及MOLP 8展示最短之細胞死亡誘導，在4號CTM投與的前8小時內即觀察到細胞毒性，且其分別以CD50 值＜ 0.038及0.081 ± 0.018 ng/mL為特徵。多發性骨髓瘤細胞株ANBL-6及RPMI-8226對4號CTM之敏感性低於NCI-H929及MOLP 8 (在72小時，CD50 值分別為1.949 ± 0.0467 ng/mL及0.136 ± 0.027 ng/mL，且分別在28小時及24小時誘導細胞死亡)。在此研究中，4號CTM對CD38陰性HCT 116結腸癌細胞未展示效應。
為確定4號CTM在全血中是否具有活性，將人類及食蟹猴全血用4號CTM處理72小時。使用流式細胞術離體測定天然殺手(NK)細胞消耗。如圖18A至圖18B中所示，4號CTM降低人類及食蟹猴全血二者中之NK細胞計數。
在單獨之分析中，將ANBL-6多發性骨髓瘤細胞用4號CTM連續處理48小時或72小時，或暴露於4號CTM達2小時，洗滌且保持在無4號CTM之培養基中直至48小時或72小時時間點。使用RealTime-Glo存活率分析測定細胞存活率。如圖19中所示，2小時處理加上清洗使得在48小時時間點細胞毒性增加5倍，且在72小時時間點細胞毒性增加10倍。 9.    鼠類模型
使用其他物種哺乳動物個體之鼠類模型來評估所選CD38結合蛋白。 a.     小鼠模型中之耐受性
為評估耐受性、毒性及安全性，在12天內用各自稀釋於PBS中之媒劑(20 mM檸檬酸鈉、200 mM山梨醇，pH 5.5)或CD38結合蛋白以0.25 mg/kg至2 mg/kg治療BALB/C小鼠達6個劑量(第1天、第3天、第5天、第8天、第10天及第12天)。在整個研究中監測體重且進行臨床觀察。該等研究之一些結果示於表16、表17及圖9中。在平均體重減輕＞20%或死亡率＞10%之任何組中停止投藥，動物將不會被處以安樂死且將容許恢復。在體重減輕＞20%之組內，達到個體體重減輕終點之個體將被處以安樂死。如表16及17中所指示，在不同研究中測試CD38結合蛋白。不同濃度之多種CD38結合蛋白之數據提供於表16中。另外，在第4劑(第8天投藥後12小時)後進行顯示肝酶功能(天冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、鹼性磷酸酶(alk phos)及總膽紅素)變化之一些臨床化學測試，且彼等值報告於表17中。表 16. 說明性 CD38 結合蛋白之活體內比較：體重變化及研究期間死亡數
結合蛋白 研究 劑量(mg/kg) 給予劑量之日( 計劃6 個劑量) 體重底點 研究期間死亡
底點(%) 天 死亡/總數 平均天數
1號CD38結合蛋白 1 2 1、3、5、8、10 -33.40% 12 2/6 12
2號CD38結合蛋白 1 2 1、3、5、8、10、12 -16.20% 12 0/6 N/A
3號CD38結合蛋白 1 2 1、3、5、8、10 -18.70% 8 5/6 11
1號CD38靶向參考分子 1 2 1、3、5、8、10、12 -0.90% 2 0/6 N/A
媒劑對照 2 N/A 1、3、5、8、10、12 -2.10% 14 0/6 N/A
1號CD38結合蛋白 2 1 1、3、5、8、10、12 -18.50% 14 0/6 N/A
2號CD38結合蛋白 2 1 1、3、5、8、10、12 -13.70% 14 0/6 N/A
1號CD38靶向參考分子 2 1 1、3、5、8、10、12 -0.30% 7 0/6 N/A
媒劑對照 3 N/A 1、3、5、8、10、12 -1.50% 14 0/6 N/A
1號CD38靶向對照分子 3 0.5 1、3、5、8、10、12 -1.80% 2 0/6 N/A
1號CD38結合蛋白 3 0.5 1、3、5、8、10、12 -5.20% 9 0/6 N/A
2號CD38結合蛋白 3 0.5 1、3、5、8、10、12 -1.60% 11 0/6 N/A
3號CD38結合蛋白 3 0.5 1、3、5、8、10、12 -6.40% 7 0/6 N/A
3號CD38結合蛋白 3 1 1、3、5、8、10 -22.10% 18 3/6 11
4號CD38結合蛋白 3 0.5 1、3、5、8、10、12 0 N/A 0/6 N/A
4號CD38結合蛋白 3 1 1、3、5、8、10、12 -1.90% 10 0/6 N/A
1號CD38靶向參考分子 3 0.5 1、3、5、8、10、12 -2.50% 14 0/6 N/A
表 17. 說明性 CD38 結合蛋白之活體內比較：臨床化學測試
結合蛋白 研究 劑量(mg/kg) AST ALT Alk Phos 膽紅素
µg/µL 對照% µg/µL 對照% U/L 對照% mg/dl 對照%
媒劑對照 2 N/A 72 100% 34 100% 118.67 100% 0.25 100%
1號CD38靶向對照分子 2 0.5 127.83 178% 61.67 181% 88.33 74% 0.24 96%
1號CD38結合蛋白 2 0.5 188.17 261% 99.17 292% 77.17 65% 0.2 80%
2號CD38結合蛋白 2 0.5 94 131% 51.67 152% 79.33 67% 0.18 72%
3號CD38結合蛋白 2 0.5 244.67 340% 145.17 427% 80.67 68% 0.23 92%
3號CD38結合蛋白 2 1 251.33 349% 103.00 303% 64.83 55% 0.20 80%
4號CD38結合蛋白 2 0.5 92.17 128% 58.67 173% 105 88% 0.2 80%
4號CD38結合蛋白 2 1 156.50 217% 133.67 393% 110.33 93% 0.23 93%
1號CD38靶向參考分子 2 0.5 77.2 107% 36.67 108% 104.5 88% 0.28 112%
媒劑對照 3 N/A 81.33 100% 29.67 100% 117.33 100% 0.20 100%
1號CD38結合蛋白 3 1 454.33 559% 524.67 1769% 101.00 86% 0.33 167%
2號CD38結合蛋白 3 1 172.67 212% 276.67 933% 128.00 109% 0.20 100%
1號CD38靶向參考分子 3 1 217.33 267% 49.00 165% 110.00 94% 0.17 83%
在單一研究內比較3號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:78)及在CD38結合區中具有相同CDR之相關分子4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)，且經治療小鼠之體重變化示於表16及圖9中。儘管二者在0.5 mg/kg下均耐受，但在1 mg/kg下4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)之耐受性更佳，如體重無變化且無死亡所見，而在1 mg/kg下3號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:78)與體重減輕及3/6死亡相關聯(參見表16)。3號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:78)治療組中存活之動物未獲得第6個排定劑量。該兩個分子之間的差異在於輕鏈中為促進蛋白質L純化之胺基酸變化，令人驚訝的是其毒性更小且因此可容許較高劑量投藥以及較低頻率投藥，此為顯著益處。 b.    相對免疫原性
使用人類免疫系統之哺乳動物模型來研究某些CD38結合蛋白之免疫原性潛能。在經多週時期重複非經腸投與之後，使用對結合蛋白之活體內抗體反應之分析測定說明性結合蛋白之相對免疫原性(例如，參見WO 2015/113005)。使用溶液內ELISA來測定對不同結合蛋白具有特異性之血清鼠類抗體之相對量。
此免疫原性分析涉及使用通常指示分子在哺乳動物中之相對免疫原性之小鼠。進行小鼠研究，其中將BALB/c小鼠隨機分配至由6隻小鼠/組組成之治療組中且其中不同治療組中之小鼠投與不同結合蛋白。首先，在暴露於結合蛋白之前自每隻小鼠收集血清樣品。接下來，藉由每週三次腹膜內注射向治療組中之每隻小鼠投與每劑樣品結合蛋白0.25毫克樣品分子/公斤體重(mg/kg)達兩週。在一週沒有投與任何樣品之後，每週三次腹膜內注射投與每劑樣品結合蛋白0.25 mg/kg持續額外兩週，使得經五週間隔總計12劑結合蛋白。在五週投與間隔期間及之後，自所有小鼠收集血清以使用溶液內ELISA觀察靶向所投與結合蛋白之抗體。
如下實施偵測識別所投與結合蛋白之抗體之溶液內ELISA。對於每一CD38結合蛋白及其各別小鼠治療組，實施不同ELISA分析，但使用相同的一般溶液內ELISA分析設定。對於溶液內ELISA分析，將ELISA板孔用CD38重組人類蛋白質包被。使小鼠治療組中用於注射之相同結合蛋白與自該組之單一小鼠收集之血清一起於溶液中在4℃下培育隔夜，且接著使用經包被之ELISA板孔捕獲所形成之任何複合物(例如包含結合蛋白及存在於血清中之抗體之複合物)。使用與辣根過氧化物酶偶聯之抗小鼠IgG二級抗體偵測包含鼠類免疫球蛋白G分子(IgG)之經捕獲的免疫複合物。藉由添加顯色HRP受質且接著偵測源自化學發光之光發射來偵測孔中之HRP活性。使用讀板儀在450 nm下量測HRP活性或「ELISA信號」。在減去自「無血清」陰性對照孔量測之背景信號之後，將ELISA信號值計算為吸光度值(Ab 450 nm)。稀釋血清以使吸光度值讀數低於分析之飽和水準，且對於在給定日量測之所有治療組中之所有小鼠而言，稀釋比率均相同。作為對照，向小鼠投與1號CD38靶向對照分子(SEQ ID NO:84)，其包含與1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:80)相同的scFv但包含去免疫化較低之志賀毒素效應多肽，且其用於顯示抗藥物抗體反應。
圖10顯示經兩個週期之總計12劑相關分子之低劑量(0.25 mg/kg)投與，與包含去免疫化較低之志賀毒素效應多肽及與1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:80)相同的scFv之CD38靶向對照分子(SEQ ID NO:84)相比，以下僅包含去免疫化志賀毒素A亞單元效應多肽組分之CD38結合蛋白之相對免疫原性：1號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:76)、2號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:77)及1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)。
將1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)及另一對照CD38靶向分子以0.05 mg/kg之劑量靜脈內投與非人類靈長類動物達兩個週期，在週期之間有兩週的間歇(投藥日第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天；第29天、第31天、第33天、第36天、第38天及第40天)。與包含與1號CD38靶向對照分子(SEQ ID NO:84)相同的志賀毒素效應多肽之去免疫化較低之CD38靶向對照分子相比，在接受1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之動物中，任何發炎/免疫反應之嚴重程度均降低(如藉由球蛋白水準、IgG水準、IgA水準、嗜中性球計數、單核球計數及白蛋白降低所量測)。另外，在第6劑後可偵測到1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)，而對照CD38靶向分子低於定量限，推測係由於形成更多抗藥物抗體所致。 c.     效能
包含4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)二聚體之組合物在若干皮下及瀰漫性人類骨髓瘤異種移植物鼠類模型中係有效的。使用每週一次及每兩週一次時間表均觀察到完全腫瘤消退。另外，在免疫勝任小鼠模型中，表現人類CD38之同基因鼠類細胞株顯示對4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)治療有反應。 (i)    鼠類異種移植物模型：皮下LP-1
使用包含具LP-1人類多發性骨髓瘤異種移植物之雌性CB17嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠之鼠類異種移植物模型來評估4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)之活體內活性。向小鼠右側腹中皮下接種LP-1人類多發性骨髓瘤細胞，且每週一次(QW)用靜脈內劑量之媒劑治療、每週一次用靜脈內劑量之4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)治療21天或每隔一週一次(Q2W)用靜脈內劑量之4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)治療14天。4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)之劑量為5 mg/kg體重、6 mg/kg體重或10 mg/kg體重。
使用熟習此項技術者已知之常用技術每週量測兩次腫瘤體積及體重，且使用公式(0.5 × [長度×寬度2])計算平均腫瘤體積(MTV)。當平均腫瘤體積達到大約94 mm3時，將小鼠隨機化至治療組(n = 6隻小鼠/組)中且以QW時間表靜脈內投用媒劑(磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))或以QW時間表以5.0 mg/kg或6.0 mg/kg靜脈內投用4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)或以Q2W時間表以10.0 mg/kg靜脈內投用4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)。接受QW投與之小鼠在第0天、第7天、第14天及第21天進行治療。接受Q2W投與之小鼠在第0天及第14天進行治療。所有治療均係在第0天開始。每週量測兩次腫瘤大小及體重，且當對照腫瘤在第28天達到大約1800 mm3時終止研究。
在第28天測定生長速率抑制。藉由使用直至研究第28天且包括其之數據計算GRI % ([對照組之平均生長速率-治療組之平均生長速率] /媒劑組之平均生長速率)來測定對腫瘤生長之抑制。使用應用於每一組中動物之指數生長速率之t測試來進行治療組與媒劑之間腫瘤生長之統計比較。該等研究之一些結果示於表18 (LP-1)及圖11A至圖11D中。圖11A至圖11D以圖形方式顯示每一組隨時間(天)之平均腫瘤體積(mm3)。在提及投藥方案時，術語「BIW」在圖11A至圖11D中用於意指『每兩週一次』。術語「AUC」表示曲線下面積。表 18. 4 號 CD38 結合蛋白殺死異種移植物模型中之 CD38+ 腫瘤細胞
細胞株 CD38表現(× 103 ) 腫瘤倍增時間(天) 最高腫瘤生長抑制% (AUC治療 - AUC基線 ) ÷ (AUC媒劑 - AUC基線 ) × 100%
MM1.S 18 6.1 d 90%
H929 88 5.6 d (腫瘤消退) 126%
LP-1 202 7.4 d (腫瘤消退) 109%
MOLP8 707 4.7 d 69%
所有劑量組中均耐受治療。在治療及量測期間無動物死亡或動物移除。所有動物均納入第28天之分析中。
與媒劑治療相比，每週一次利用5 mg/kg或6 mg/kg之4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)治療具LP-1人類多發性骨髓瘤異種移植物之雌性CB17 SCID小鼠產生顯著之抗腫瘤活性。 (ii)   鼠類異種移植物模型：皮下H929
使用包含具NCI-H929人類多發性骨髓瘤異種移植物之雌性非肥胖性糖尿病(NOD)嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠之鼠類異種移植物模型來評估4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)之活體內活性。向小鼠右側腹中皮下接種NCI-H929人類多發性骨髓瘤細胞，且每週一次(QW)用靜脈內劑量之媒劑(PBS)治療21天或每隔一週一次(Q2W)用靜脈內劑量之4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)治療14天。4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)之劑量為5 mg/kg體重、6 mg/kg體重或10 mg/kg體重。
使用熟習此項技術者已知之常用技術每週量測兩次腫瘤體積及體重，且使用公式(0.5 × [長度×寬度2])計算平均腫瘤體積(MTV)。當平均腫瘤體積達到大約121 mm3時，將小鼠隨機化至治療組(n = 8隻小鼠/組)中且以QW時間表靜脈內投用媒劑(磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))或以QW時間表以5.0 mg/kg、6.0 mg/kg或10.0 mg/kg靜脈內投用4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)或以Q2W時間表以10.0 mg/kg靜脈內投用4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)。接受QW投與之小鼠在第0天、第7天、第14天及第21天進行治療。接受Q2W投與之小鼠在第0天及第14天進行治療。所有治療均係在第0天開始。每週量測兩次腫瘤大小及體重，且當對照腫瘤在第29天達到大約1700 mm3時終止研究。
在第29天測定(如上文所闡述)生長速率抑制。該等研究之一些結果示於表18 (H929)及圖11A至圖11D中。
所有劑量組中均耐受治療。在治療及量測期間無動物死亡或動物移除。所有動物均納入第29天之分析中。
與媒劑治療相比，每週一次利用5 mg/kg或6 mg/kg之4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)或每隔一週一次利用10 mg/kg之4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)治療具NCI-H929人類多發性骨髓瘤異種移植物之雌性非肥胖性糖尿病(NOD / SCID)小鼠產生顯著之抗腫瘤活性。
使用其他鼠類皮下異種移植物模型類似於如上文所闡述且使用熟習此項技術者已知之技術但使用其他細胞類型(諸如MOLP8細胞)來評估4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO:79)之活體內活性。該等研究之一些結果示於表18 (MOLP-8)及圖11D中。 (iii) 鼠類異種移植物模型：皮下MM1.S
使用包含具MM1.S人類多發性骨髓瘤異種移植物之雌性CB17嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠之鼠類異種移植物模型來評估4號CD38結合蛋白(4號CTM)之活體內活性。向小鼠右側腹中皮下接種MM1.S人類多發性骨髓瘤細胞，且每週一次(QW)用靜脈內劑量之媒劑治療、每週一次用靜脈內劑量之4號CD38結合蛋白治療21天或每隔一週一次(Q2W)用靜脈內劑量之4號CD38結合蛋白治療14天。4號CD38結合蛋白之劑量為5 mg/kg體重、6 mg/kg體重或10 mg/kg體重。
使用熟習此項技術者已知之常用技術每週量測兩次腫瘤體積及體重，且使用公式(0.5 × [長度×寬度2])計算平均腫瘤體積(MTV)。當平均腫瘤體積達到大約94 mm3時，將小鼠隨機化至治療組中且以QW時間表靜脈內投用媒劑(磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))、以QW時間表靜脈內投用4號CD38結合蛋白、以Q2W時間表靜脈內投用4號CD38結合蛋白、以BIW時間表靜脈內投用CD38靶向抗體(達雷木單抗，SOC)、以QW時間表靜脈內投用4號CD38結合蛋白與以BIW時間表靜脈內投用SOC之組合或以Q2W時間表靜脈內投用4號CD38結合蛋白與以BIW時間表靜脈內投用SOC之組合。接受QW投與之小鼠在第0天、第7天、第14天及第21天進行治療。接受Q2W投與之小鼠在第0天及第14天進行治療。所有治療均係在第0天開始。每週量測兩次腫瘤大小及體重，且當對照腫瘤在第28天達到大約1800 mm3時終止研究。
來自此研究之一些結果示於圖12A至圖12B及圖17中。在兩個組合小組(4號CTM + SOC)中均觀察到完全消退。 D.    鼠類異種移植物模型：瀰漫性
使用包含具MM1.S-Luc人類多發性骨髓瘤瀰漫性腫瘤之雌性SCID/米色小鼠之鼠類異種移植物模型來評估4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)之活體內活性。
使用熟習此項技術者已知之常用技術，藉由尾靜脈注射向SCID米色小鼠接種MM1.S-Luc腫瘤細胞(標記有螢光素酶表現之MM1.S細胞)。使用熟習此項技術者已知之常用技術，使用生物發光成像每週量測一次每隻小鼠之腫瘤負荷。在第14天、第21天、第28天、第35天及第42天以光子/秒量測腫瘤負荷，且計算每一治療組之平均生物發光信號。在第14天，當平均生物發光信號達到大約1.11 × 107個光子/秒時，將動物隨機化至治療組中(n = 8隻/組)。以2 mg/kg每隔一天一次每週三次(間斷兩天)持續兩週，之後間斷一週(每隔一天一次× 3，間斷2天；投用2週，間斷1週)腹膜內投用僅媒劑或4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)，之後開始下一投藥週期。另外，每週一次以4 mg/kg、6 mg/kg及10 mg/kg投用4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)。所有組均經28天時期進行投藥。在第14天、第16天、第18天、第21天、第23天、第25天、第35天及第37天向以每隔一天一次× 3，間斷2天；投用2週，間斷1週時間表治療之小鼠投與媒劑(PBS)或CD38結合蛋白。在第14天、第21天、第27天及第35天治療以每週一次時間表接受4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)之小鼠。
藉由計算T/C %來測定抗腫瘤活性。T/C %定義為治療組之平均生物發光信號(BLI)除以媒劑組之平均生物發光(BLI)信號× 100，且係在第42天計算，其中一些結果示於圖12A中。在圖12A中，4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)稱為「4號CTM」，且除了僅媒劑對照，此蛋白質係實驗數據中顯示之唯一蛋白質。圖12B亦顯示使用異種移植物腫瘤細胞中螢光素酶活性之生物發光成像收集之小鼠影像：僅投與媒劑之小鼠在其整個體內廣泛地展現強烈信號，而投與4號CD38結合蛋白(4號CTM) (SEQ ID NO: 79)之小鼠藉由此方法似乎未偵測到腫瘤細胞。
與媒劑治療相比，利用4 mg/kg、6 mg/kg或10 mg/kg之4號CD38結合蛋白每週一次治療具MM1.S-Luc人類多發性骨髓瘤瀰漫性腫瘤之雌性SCID/米色小鼠產生顯著之抗腫瘤活性。在4 mg/kg或更高劑量以及每週一次之投與時間表下，觀察到顯著之抗腫瘤活性。
使用包含具Daudi-Luc人類多發性骨髓瘤瀰漫性腫瘤之SCID/米色小鼠之鼠類異種移植物模型來評估1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之活體內活性。將1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)以0.5 mg/kg或0.6 mg/kg之劑量投與小鼠達兩個週期，在週期之間有一週的間歇(投藥日第1天、第3天、第5天、第8天、第10天、第12天；第22天、第24天、第26天、第29天、第31天及第33天)。與僅媒劑對照組相比，在接受1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)之小鼠中注射接種Daudi-Luc細胞後4天即觀察到腫瘤負荷降低(參見圖12-C)。 (iv) 4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)在食蟹獼猴中之毒性及藥效學
在非人類靈長類動物中測試每週一次靜脈內投與約0.2 mg/kg體重至0.75 mg/kg體重之4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79)達1至4週。在第15天及第22天觀察到抗藥物抗體。投與≤ 0.75 mg/kg之4號CD38結合蛋白(SEQ ID NO: 79) (QW)達2劑或4劑耐受性良好，且無相關之臨床徵象。在非人類靈長類動物中之測試顯示，4號CD38結合蛋白投與可使循環CD38±NK細胞、B細胞及T細胞之數量減少。 B.    實例2. 包含志賀毒素A亞單元衍生多肽之CD38靶向融合蛋白
此實例之CD38靶向融合蛋白包含含有CD38結合區之細胞靶向結合區多肽、志賀毒素A亞單元效應多肽及蛋白質性連接體(例如，參見WO 2015/113005、WO 2016/196344及/或PCT/US2016/043902)，其係使用此項技術中已知之技術製備。此實例之一些細胞靶向融合蛋白經構築使得各自包含含有細胞靶向結合區多肽及志賀毒素A亞單元效應多肽之單一連續多肽。 1.   測試CD38結合區在納入至包含志賀毒素A亞單元效應多肽之CD38靶向融合蛋白之後對結合功能性之保留
藉由基於螢光之流式細胞術測定此實例之CD38結合蛋白之CD38結合特徵。此實例之某些CD38靶向融合蛋白對CD38陽性細胞之Bmax 經量測為大約50,000-200,000 MFI，其中KD 在0.01-100 nM範圍內。 2.   測試在融合結合區之後CD38結合蛋白對志賀毒素功能之保留
測試細胞靶向蛋白質在融合異源區之後對志賀毒素A亞單元效應功能之保留。所分析之志賀毒素A亞單元效應功能係：真核核糖體之催化失活、細胞毒性及由此推斷之至胞質液之自引導亞細胞按路線發送。 3.   測試結合蛋白之核糖體抑制能力
使用核糖體抑制分析測試結合蛋白之志賀毒素A亞單元衍生的志賀毒素效應多肽區之催化活性。
使用無細胞之活體外蛋白質轉譯分析，使用TNT®快速偶合轉錄/轉譯套組(L1170 Promega Madison, WI, U.S.)測定此實例之細胞靶向蛋白質之核糖體失活能力。該套組包括螢光素酶T7對照DNA (L4821 Promega Madison, WI, U.S.)及TNT®快速混合母液。根據製造商說明書製備核糖體活性反應物。於適當緩衝液中製備欲測試之志賀毒素衍生的細胞靶向蛋白質之一系列10倍稀釋液，且為每一稀釋液產生一系列一致之TNT反應混合物組分。將稀釋系列中之每一樣品與TNT反應混合物中之每一者以及螢光素酶T7對照DNA合併。將測試樣品在30攝氏度(℃)下培育1.5小時。培育後，將螢光素酶分析試劑(E1483 Promega, Madison, WI, U.S.)添加至所有測試樣品，且藉由發光根據製造商說明書量測螢光素酶蛋白轉譯之量。
藉由總蛋白質之對數轉換濃度對相對發光單位之非線性回歸分析來確定轉譯抑制水準。使用統計軟體(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)，使用標題劑量-反應-抑制下之log(抑制劑)對反應(三參數)之Prism軟體函數[Y =底值+ ((頂值-底值) / (1+10^(X - LogIC50 )))]計算每一樣品之半最大抑制濃度(IC50 )值。計算來自一或多次實驗之每一志賀毒素衍生的細胞靶向蛋白質之IC50 值。 4.    測試CD38結合蛋白對CD38表現細胞之細胞毒性
藉由如上文在先前實例中所闡述之一般細胞殺死分析測定此實例之CD38細胞靶向融合蛋白之細胞毒性特徵。此實例之結合蛋白對黑色素瘤細胞之CD50 值端視於細胞株而定為大約0.01-100 nM。 C.    實例3：評估說明性CD38結合蛋白在患有復發性或難治性多發性骨髓瘤之參與者中之安全性、耐受性、藥物動力學(PK)及效能之研究
此研究(第1階段試驗)之目的係評估說明性CD38結合蛋白4號CD38結合蛋白(「4號CTM」，SEQ ID NO: 79)之安全性及耐受性。此研究將確立最大耐受劑量(MTD)及/或第2階段推薦劑量(RP2D)，且將為患有復發性或難治性多發性骨髓瘤(RRMM)之參與者進行CD38靶向分子單一療法提供初步評估。
該研究將以2個階段進行：劑量遞增階段(第1部分)及擴展階段(第2部分)。該研究將招募大約81至102名參與者(在第1部分中39至60名參與者且在第2部分中大約54名參與者)。
在劑量遞增階段(第1部分)中，起始劑量水準將係50微克/公斤(mcg/kg)，每週一次。在審查來自群組1之可用安全性、PK、藥效學及效能數據之後，將在後續群組中將劑量遞增至100 mcg/kg、200 mcg/kg、335 mcg/kg、500 mcg/kg及665 mcg/kg，接著在超過665 mcg/kg時視需要以1.25倍增加。亦可發生單獨之劑量遞增，其中4號CTM將每2週投與一次。
在擴展階段(第2部分)中，該研究將評估兩種類型之RRMM群組：達雷木單抗復發性或難治性(RR)群組(每週一次及每2週一次4號CTM投與)及未接受抗CD38療法之群組(每週一次4號CTM投與)。在審查來自該研究之劑量遞增階段之可用安全性、效能、PK及藥效學數據之後，每一擴展群組之起始劑量將係在第1部分中所確定之MTD/RP2D (每週一次及每2週一次)。個體投藥群組闡述於下表19中。表 19 ：小組及干預
部分 小組 干預 描述
1 50 mcg/kg，每週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在28天治療週期中之第1天、第8天、第15天及第22天每週一次靜脈內輸注50微克/公斤(mcg/kg)之劑量，直至疾病進展(PD)、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。
1 100 mcg/kg，每週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在28天治療週期中之第1天、第8天、第15天及第22天每週一次靜脈內輸注100 mcg/kg之劑量，直至PD、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。
1 200 mcg/kg，每週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在28天治療週期中之第1天、第8天、第15天及第22天每週一次靜脈內輸注200 mcg/kg之劑量，直至PD、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。
1 335 mcg/kg，每週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在28天治療週期中之第1天、第8天、第15天及第22天每週一次靜脈內輸注335 mcg/kg之劑量，直至PD、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。
1 500 mcg/kg，每週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在28天治療週期中之第1天、第8天、第15天及第22天每週一次靜脈內輸注500 mcg/kg之劑量，直至PD、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。
1 665 mcg/kg，每週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在28天治療週期中之第1天、第8天、第15天及第22天每週一次靜脈內輸注665 mcg/kg之劑量，直至PD、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。
1 待定(TBD)劑量，每兩週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在28天治療週期中之第1天及第15天每2週一次靜脈內輸注TBD劑量，直至PD、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。4號CTM之劑量遞增將基於研究者及贊助者對先前群組中之可用安全性、藥物動力學(PK)、藥效學、效能數據之審查。
2 達雷木單抗RR，TBD劑量，每週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在對達雷木單抗具有復發性或難治性(RR)之參與者中每週一次靜脈內輸注TBD劑量，直至PD、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。第2部分之劑量將基於對來自此研究之第1部分的可用安全性、效能、PK及藥效學數據之審查來確定。
2 達雷木單抗RR：TBD劑量，每兩週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在對達雷木單抗具有RR之參與者中每2週一次靜脈內輸注TBD劑量，直至PD、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。第2部分之劑量將基於對來自此研究之第1部分的可用安全性、效能、PK及藥效學數據之審查來確定。
2 未接受抗CD38療法之MM：TBD劑量，每週一次 4號CTM，藉由靜脈內輸注 在未曾接受過抗CD38療法之患有MM之參與者中每週一次靜脈內輸注TBD劑量，直至PD、毒性不可接受或出於其他原因退出研究為止。第2部分之劑量將基於對來自此研究之第1部分的可用安全性、效能、PK及藥效學數據之審查來確定。
該研究之總體持續時間為大約34個月。在最後一劑研究藥物之後，將對參與者進行30天隨訪以進行隨訪評價。
此研究之主要結果量度將包括： 1.   第1部分：總體劑量水準及每個劑量水準治療中出現不良事件(TEAE)之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。 2.   第1部分：在每一劑量水準均具有劑量限制性毒性(DLT)之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。DLT定義為研究者認為至少可能與研究藥劑之療法相關的任何事件。DLT可係血液學或非血液學DLT。血液學DLT可係在第1週期期間發生的任何≥4級之血液學TEAE，以下除外：明顯由於外部原因所致之血液學AE、4級淋巴球減少症、持續＜連續7天之4級嗜中性球減少症(ANC ＜500個細胞/mm3 )、任何等級及持續時間之發熱性嗜中性球減少症、≥3級之血小板減少症伴具臨床意義之出血、任何持續時間之4級血小板減少症、≥3級之毛細血管滲漏症候群或與潛在疾病明顯無關之≥3級之溶血(例如陰性直接庫姆斯(Coombs)測試)。非血液學DLT可係在第1週期期間發生的任何≥3級之非血液學TEAE，以下除外：明顯由於外部原因所致之非血液學AE、在72小時內成功逆轉(4級à ≤2級；3級à ≤1級或基線)之無症狀的實驗室變化(除腎臟及肝臟實驗室值及4級脂酶/澱粉酶水準以外)、可利用止吐劑管控之3級噁心/嘔吐、持續＜72小時之3級疲勞、在7天內消退至≤1級或基線之3級ALT或AST升高、對對症治療(例如抗組織胺、NSAID、麻醉藥、IV輸液)有反應而沒有3級症狀復發之3級IRR。 3.   毒性將根據國家癌症研究院常見不良事件評價準則5.0版(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events version 5.0，NCI CTCAE 5.0)進行評估。 4.   第1部分：大於或等於(＞=) 3級TEAE之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。＞=3級之TEAE將根據NCI CTCAE 5.0進行評估。 5.   第1部分：具有嚴重不良事件(SAE)之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。 6.   第1部分：由於TEAE而中斷4號CTM之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。 7.   第1部分：具有治療相關之劑量修改(包括劑量延遲、劑量中斷及劑量降低)之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。 8.   第1部分：實驗室值在臨床上顯著變化之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。 9.   第1部分：生命徵象量測值在臨床上顯著變化之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。 10.  第2部分：總體反應率(ORR) [時間範圍：最多12個月]。如由國際骨髓瘤工作組(International Myeloma Working Group，IMWG)統一反應準則所定義之在研究期間達成部分反應(PR)或更佳反應之參與者百分比。PR為血清M蛋白降低＞=50百分比(%)且24小時尿液M蛋白降低＞=90%或少於(＜) 200毫克每(mg/) 24小時(h)。若無法量測血清及尿液M蛋白，則需要累及與未累及游離輕鏈(FLC)水準之間差異減少＞=50%來代替M蛋白準則。若無法量測血清及尿液M蛋白以及血清FLC分析，則需要骨髓漿細胞降低＞=50%來代替M蛋白，前提係基線百分比＞=30%。另外，若在基線時存在，則需要軟組織漿細胞瘤之大小降低＞=50%。需要兩次連續評價；若實施放射照相研究，則沒有已知之進展性或新骨病變之證據。[1] 此研究之次要結果量度將包括： 1.   第1部分及第2部分，Cmax：4號CTM之最大觀察濃度[時間範圍：第1週期及第2週期，第1天：投藥前，及在投藥後多個時間點(直至168小時) (每一週期為28天)]。 2.   第1部分及第2部分，Tmax：4號CTM達到最大觀察濃度(Cmax)之時間[時間範圍：第1週期及第2週期，第1天：投藥前，及在投藥後多個時間點(直至168小時) (每一週期為28天)]。 3.   第1部分及第2部分，AUClast：4號CTM自時間0至最後可定量濃度時間之濃度-時間曲線下面積[時間範圍：第1週期及第2週期，第1天：投藥前，及在投藥後多個時間點(直至168小時) (每一週期為28天)]。 4.   第1部分：總體反應率(ORR) [時間範圍：最多12個月]。ORR定義為如由IMWG統一反應準則所定義之在研究期間達成PR或更佳反應之參與者百分比。PR為血清M蛋白降低＞=50%且24小時尿液M蛋白降低＞=90%或＜200 mg/24 h。若無法量測血清及尿液M蛋白，則需要累及與未累及FLC水準之間差異減少＞=50%來代替M蛋白準則。若無法量測血清及尿液M蛋白以及血清FLC分析，則需要骨髓漿細胞降低＞=50%來代替M蛋白，前提係基線百分比＞=30%。另外，若在基線時存在，則需要軟組織漿細胞瘤之大小降低＞=50%。需要兩次連續評價；若實施放射照相研究，則沒有已知之進展性或新骨病變之證據。 5.   第1部分：臨床受益率(CBR) [時間範圍：最多12個月]。CBR定義為如由IMWG統一反應準則所定義之在研究期間達成最小反應(MR)或更佳反應之參與者百分比。MR定義為血清M蛋白降低＞=25%但小於或等於(＜=) 49%且24小時尿液M蛋白降低50%至89%。另外，若在基線時存在，則亦需要軟組織漿細胞瘤之大小降低25%至49%。溶骨性病變之大小或數量無增加(壓迫性骨折之發生不排除反應)。 6.   第1部分及第2部分：無進展存活(PFS) [時間範圍：自劑量投與之日直至因任何原因所致之死亡(最多12個月)]。PFS係根據IMWG準則自第一劑之日直至疾病進展(PD)之日或因任何原因所致死亡之日之時間。PD：以下自最低反應值增加25%：血清M組分絕對增加＞=0.5克/公合(g/dL)；若起始M組分＞=5 g/dL，則血清M組分增加＞=1 g/dL以定義復發；尿液M組分(絕對增加＞=200 mg/24 h)；僅在沒有可量測之血清及尿液M蛋白水準之參與者中：累及與未累及FLC水準之間差異(絕對增加＞10毫克/公合[mg/dL])；僅在沒有可量測之血清及尿液M蛋白水準且藉由FLC水準沒有可量測疾病之參與者中，骨髓漿細胞% (絕對%＞=10%)；現有骨病變或軟組織漿細胞瘤之大小發生新的或確切的增加；高鈣血症之發生可僅歸因於漿細胞增生性病症；需要在新療法之前進行兩次連續評價。 7.   第1部分及第2部分：反應持續時間(DOR) [時間範圍：自第一次記錄反應之日至第一次記錄PD之日(最多12個月)]。DOR係自第一次記錄反應之日至第一次記錄PD之日之時間。PD係以下自最低反應值增加25%：血清M組分絕對增加＞=0.5 g/dL；若起始M組分＞=5 g/dL，則血清M組分增加＞=1g/dL以定義復發；尿液M組分(絕對增加＞=200 mg/24 h)；僅在沒有可量測之血清及尿液M蛋白水準之參與者中：累及與未累及FLC水準之間差異(絕對增加＞10 mg/dL)；僅在沒有可量測之血清及尿液M蛋白水準且藉由FLC水準沒有可量測疾病之參與者中，骨髓漿細胞% (絕對%＞=10%)；現有骨病變或軟組織漿細胞瘤之大小發生新的或確切的增加；可僅歸因於漿細胞增生性病症之高鈣血症之發生；需要在新療法之前進行兩次連續評價。 8.   第1部分及第2部分：達成MR之參與者百分比[時間範圍：最多12個月]。達成MR (定義為25%腫瘤減少)之參與者百分比。MR定義為如由IMWG統一反應準則所定義之血清M蛋白降低＞=25%但＜=49%且24小時尿液M蛋白降低50%至89%。 9.   第1部分及第2部分：在投與4號CTM後具有抗藥物抗體之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。 10.  第2部分：具有DLT及其他TEAE (包括劑量修改、治療中斷及生命徵象)之參與者人數[時間範圍：最多12個月]。DLT定義為研究者認為至少可能與研究藥劑之療法相關的任何事件。將根據NCI CTCAE 5.0評估毒性。 11.  第2部分：總體存活(OS) [時間範圍：自劑量投與之日直至因任何原因所致死亡(最多12個月)]。OS定義為自劑量投與之日直至因任何原因所致死亡之時間。 12.  第2部分：反應時間(TTR) [時間範圍：自第一劑研究治療之日至第一次記錄反應之日(最多12個月)]。自第一劑研究治療之日至第一次記錄反應(PR或更佳反應)之日之時間。PR係血清M蛋白降低＞=50%且24小時尿液M蛋白降低＞=90%或降低至＜200 mg/24小時。若血清及尿液M蛋白無法量測，則需要累及與未累及FLC水準之間差異減少＞=50%來代替M蛋白準則。若無法量測血清及尿液M蛋白以及血清FLC分析，則需要骨髓漿細胞降低＞=50%來代替M蛋白，前提係基線百分比＞=30%。另外，若在基線時存在，則需要軟組織漿細胞瘤之大小降低＞=50%。需要兩次連續評價；若實施放射照相研究，則沒有已知之進展性或新骨病變之證據。 13.  第2部分：達成完全反應(CR)或極佳之部分反應(VGPR)之參與者百分比[時間範圍：最多12個月]。CR或VGPR係由IMWG準則定義。CR定義為血清及尿液之陰性免疫固定、任何軟組織漿細胞瘤之消失及骨髓中＜5%之漿細胞；在僅可藉由血清FLC水準量測疾病之參與者中，除CR準則以外亦需要正常FLC比率為0.26至1.65；需要兩次連續評價。VGPR定義為血清及尿液M組分可藉由免疫固定偵測到但在電泳上偵測不到或血清M組分降低＞=90%加上尿液M組分＜100 mg/24 h；在僅可藉由血清FLC水準量測疾病之參與者中，除VGPR準則以外亦需要累及與未累及FLC水準之間差異減少＞90%；需要兩次連續評價。[2] 為參與該研究，個體必須為18歲或以上(成人、老人)，且可係男性或女性。該研究之第1部分之額外納入準則包括： 1.   確診為MM。 2.   患有RRMM且用已知在此參與者群體中賦予臨床益處之可用療法治療失敗、對該等可用療法不耐受或不係該等可用療法之候選者。 3.   應符合先前療法之所有以下準則： o    應對至少一種蛋白酶體抑制劑(PI)、至少一種免疫調節藥物(IMiD)及至少1種類固醇具有難治性。 o    應接受＞=3種先前系列療法或若彼等系列中之一者包括PI與IMiD之組合，則應接受至少兩種先前系列療法。 o    允許利用抗CD38療法(包括達雷木單抗)進行先前治療。 4.   患有可量測疾病，其定義為以下中之至少1者： o    在血清蛋白質電泳(SPEP)上血清M蛋白＞=500 mg/dL (＞=5 g/L)。 o    在尿蛋白質電泳(UPEP)上尿液M蛋白＞=200 mg/24 h。 o    倘若血清FLC比率異常，所累及FLC水準＞=10 mg/dL (＞=100毫克/公升[mg/L])之血清FLC分析結果。 5.   美國東岸癌症臨床研究合作組織(ECOG)體能狀態評分為0或1。 6.   在篩選心電圖(ECG)上具有由弗雷德里克方法校正之正常QT間隔(QTcF)，其限定為在男性中QTcF ＜=450毫秒(ms)或在女性中＜=470 ms。 7.   進入研究時符合以下臨床實驗室準則： o    總膽紅素＜=1.5*正常範圍上限(ULN)，患有吉伯特氏症候群之參與者除外，在該參與者中直接膽紅素必須＜2.0*ULN。 o    血清丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST)必須＜=2.5*ULN。 o    估計腎小球濾過率(eGFR) ＞=30毫升/分鐘(mL/min/1.73平方米[m2 ]，使用腎臟疾病飲食調整研究(MDRD)方程式)。 o    絕對嗜中性球計數(ANC) ＞=1000個/立方毫米(/mm3 ) (＞=1.0*109 /公升[/L])；在與贊助者討論之後，對於骨髓中具有＞50%漿細胞之參與者，＞=750/mm3 (＞=0.75*109 /L)之計數可係可接受的。 o    血小板計數＞=75,000/ mm3 (＞=75*109 /L)；在與贊助者討論之後，對於骨髓中具有＞50%漿細胞之參與者，＞=50,000/ mm3 (＞=50*109 /L)之值可係可接受的。 o    血紅素＞=7.5 g/dL (不允許藉由輸血使參與者達到此水準)。[3] 該研究之第2部分之額外納入準則包括： 1.   確診為MM。 2.   應符合先前療法之所有以下準則： o    應對至少1種PI及至少1種IMiD具有難治性或對其不耐受。 o    應接受＞=3種先前系列療法或若彼等系列中之1者包括PI與IMiD之組合，則應接受至少2種先前系列療法。 o    允許利用抗CD38療法(包括達雷木單抗)進行先前治療，入選未接受抗CD38療法之擴展群組中之參與者除外。 o    達雷木單抗-RR群組(每週一次及每兩週一次4號CTM投藥)：在治療期間之任一時間，參與者必須對達雷木單抗具有RR。應注意，參與者對其他抗CD38療法之RR不包括在內。 o    未接受抗CD38療法之群組(每週一次投藥)：參與者必須未接受任何先前抗CD38療法。 3.   患有可量測疾病，其定義為以下中之至少1者： o    在SPEP上血清M蛋白＞=500 mg/dL (＞=5 g/L)。 o    在UPEP上尿液M蛋白＞=200 mg/24小時。 o    倘若血清FLC比率異常，所累及FLC水準＞=10 mg/dL (＞=100 mg/L)之血清FLC分析結果。 4.   ECOG體能狀態評分為0或1。 5.   在篩選ECG上具有正常QTcF，其定義為在男性中QTcF ＜=450 ms或在女性中＜=470 ms。 6.   進入研究時符合以下臨床實驗室準則： o    總膽紅素＜=1.5*ULN，患有吉伯特氏症候群之參與者除外，在該參與者中直接膽紅素必須＜2.0*ULN。 o    血清ALT及AST必須＜=2.5*ULN。 o    使用MDRD方程式，eGFR ＞=30 mL/min/1.73 m2 。 o    ANC ＞=1000 mm3 (＞=1.0*109 /L)；在與贊助者討論之後，對於骨髓中具有＞50%漿細胞之參與者，＞=750/mm3 (＞=0.75*109 /L)之計數可係可接受的。 o    血小板計數＞=75,000/ mm3 (＞=75*109 /L)；在與贊助者討論之後，對於骨髓中具有＞50%漿細胞之參與者，＞=50,000/ mm3 (＞=50*109 /L)之值可係可接受的。 o    血紅素＞=7.5 g/dL (不允許藉由輸血使參與者達到此水準)。[4] 若個體符合以下準則中之一或多者，則將其自研究排除： 1.   患有多神經病變、器官巨大症、內分泌病變、單株丙種球蛋白病變及皮膚變化(POEMS)症候群、意義不明的單株丙種球蛋白病變、燜燃型骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、類澱粉變性、華氏巨球蛋白血症或免疫球蛋白M (IgM)骨髓瘤。 2.   患有NCI CTCAE等級＞=3之感覺或運動神經病變。 3.   在第一劑4號CTM之前，已在以下最小間隔內接受以下治療/程序中之任一者之最終劑量： o    骨髓瘤特異性療法(包括PI及IMiD)，14天。 o    抗CD38 (a)療法(一旦已確立MTD/RP2D，對於已接受抗CD38療法之參與者，便可在研究之擴展階段(第2部分)調整清洗期)，90天。 o    用於骨髓瘤之皮質類固醇療法，7天。 o    用於局部骨病變之放射療法，14天。 o    大手術，30天。 o    自體幹細胞移植，90天。 o    研究性療法，30天。 4.   已接受同種異體幹細胞移植或器官移植。 5.   尚未自先前骨髓瘤治療或程序(化學療法、免疫療法、放射療法)之不良反應(不包括脫髪)恢復至NCI CTCAE V5等級＜=1或基線。 6.   具有MM累及中樞神經系統(CNS)之臨床徵象。 7.   具有已知或疑似之任何器官之輕鏈類澱粉變性(骨髓生檢上存在類澱粉但無類澱粉變性之其他證據係可接受的)。 8.   患有(紐約心臟學會)類別＞=II或左心室射血分數(LVEF) ＜40%之鬱血性心臟衰竭、心肌病變、活動性缺血或任何其他不受控之心臟疾患(諸如過去6個月內之心絞痛或心肌梗塞)、需要療法(包括抗凝劑)之臨床上顯著之心律不整或臨床上顯著之不受控高血壓。 9.   具有需要全身性療法之慢性或活動性感染，以及尚未完全治癒之症狀性病毒感染病史(例如，人類免疫缺失病毒(HIV)或B型或C型病毒性肝炎)。 10.  具有任何單株抗體或嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法輸注後之全身發炎反應症候群(SIRS)/細胞介素釋放症候群(CRS)反應病史。 11.  患有需要使用＞10毫克/天(mg/天)之普賴松或等效物劑量之全身性皮質類固醇的慢性病狀。
雖然本發明之一些實施例已以闡釋方式予以闡述，但應明瞭，在不背離本發明之精神或不超出申請專利範圍之範疇之情形下，本發明可以多種修改形式、變化形式及改編形式以及使用熟習此項技術者熟知之多種等效方案或替代解決方案付諸實踐。
所有公開案、專利及專利申請案均係以全文引用的方式併入本文中，其併入程度如同明確地且個別地指示將每一個別公開案、專利或專利申請案以全文引用的方式併入一般。國際專利申請公開案WO 2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/138435、WO 2015/138452、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO 2015/191764、WO 2016/196344、WO 2017/019623、WO 2018/106895及WO 2018/140427各自係以全文引用的方式併入本文中。美國專利申請案US2015/259428、US2016/17784及US2017/143814之發明內容各自係以整體引用的方式併入本文中。來自GenBank(美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information, U.S.))之關於本文所引用胺基酸及核苷酸序列之所有可以電子方式獲得之生物序列資訊之完整發明內容各自係以整體引用的方式併入本文中。表 20 ：序列
SEQ ID No. 文字描述 生物序列
SEQ ID NO:1 志賀樣毒素1亞單元A (SLT-1A) KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVARMASDEFPSMCPADGRVRGITHNKILWDSSTLGAILMRRTISS
SEQ ID NO:2 志賀毒素亞單元A (StxA) KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVARMASDEFPSMCPADGRVRGITHNKILWDSSTLGAILMRRTISS
SEQ ID NO:3 志賀樣毒素2亞單元A (SLT-2A) DEFTVDFSSQKSYVDSLNSIRSAISTPLGNISQGGVSVSVINHVLGGNYISLNVRGLDPYSERFNHLRLIMERNNLYVAGFINTETNIFYRFSDFSHISVPDVITVSMTTDSSYSSLQRIADLERTGMQIGRHSLVGSYLDLMEFRGRSMTRASSRAMLRFVTVIAEALRFRQIQRGFRPALSEASPLYTMTAQDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEEGVRIGRISFNSLSAILGSVAVILNCHSTGSYSVRSVSQKQKTECQIVGDRAAIKVNNVLWEANTIAALLNRKPQDLTEPNQ
SEQ ID NO:4 志賀毒素亞型2c亞單元A (Stx2cA)變異體1 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:5 志賀毒素亞型2c亞單元A (Stx2cA)變異體2 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFAHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:6 志賀毒素亞型2c亞單元A (Stx2cA)變異體3 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDIYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:7 志賀毒素亞型2c亞單元A (Stx2cA)變異體4 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPSVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:8 志賀毒素亞型2c亞單元A (Stx2cA)變異體5 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYMAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPSVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:9 志賀毒素亞型2c亞單元A (Stx2cA)變異體6 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQVLSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILSTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:10 志賀毒素亞型2d亞單元A (Stx2dA)變異體1 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFAHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVIPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:11 志賀毒素亞型2d亞單元A (Stx2dA)變異體2 REFMIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPEEVDLTLNWGRISNVLPEFRGEGGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:12 志賀毒素亞型2d亞單元A (Stx2dA)變異體3 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVIPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILSTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:13 志賀毒素亞型2e亞單元A (Stx2eA)變異體1 QEFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTAISTPLEHISQGATSVSVINHTPPGSYISVGIRGLDVYQERFDHLRLIIERNNLYVAGFVNTTTNTFYRFSDFAHISLPGVTTISMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRLALSETAPVYTMTPEDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEAGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:14 志賀毒素亞型2e亞單元A (Stx2eA)變異體2 QEFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTAISTPLEHISQGATSVSVINHTPPGSYISVGIRGLDVYQAHFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFAHISLPGVTTISMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTREASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPEDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:15 志賀毒素亞型2f亞單元A (Stx2fA) DEFTVDFSSQKSYVDSLNSIRSAISTPLGNISQGGVSVSVINHVPGGNYISLNVRGLDPYSERFNHLRLIMERNNLYVAGFINTETNTFYRFSDFSHISVPDVITVSMTTDSSYSSLQRIADLERTGMQIGRHSLVGSYLDLMEFRGRSMTRASSRAMLRFVTVIAEALRFRQIQRGFRPALSEASPLYTMTAQDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEEGVRIGRISFNSLSAILGSVAVILNCHSTGSYSVR
SEQ ID NO:16 志賀毒素亞型c亞單元A (Stx1cA) KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSVNAILGSVALILNCHHHASRVAR
SEQ ID NO:17 志賀毒素亞型d亞單元A (Stx1dA) KEFTLDFSTAKKYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDIMGLEPEEERFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTRAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSYSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSILPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVAR
SEQ ID NO:18 志賀毒素亞型e亞單元A (Stx1eA) QDFTVDFSTAKKYVDSLNAIRSAIGTPLHSISSGGTSLLMIDNGTGDNLFAVDIRGLDPEEERFDNLRLIIERNNLYVTGFVNRTSNIFYRFADFSHVTFPGTRAVTLSGDSSYTTLQRVAGIGRTGMQINRHSLTTSYLDLMSYSGSSLTQPVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDVSGHSYTMTVEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGGVNAILGSVALILNCHHHTSRVSR
SEQ ID NO:19 家族1 輕鏈CDR1 SSNIGSNY
SEQ ID NO:20 家族1 輕鏈CDR2 GNS
SEQ ID NO:21 家族1 輕鏈CDR3 QSYDSSLSGSG
SEQ ID NO:22 家族1 重鏈CDR1 GFTFSDYY
SEQ ID NO:23 家族1 重鏈CDR2 ISGSGGST
SEQ ID NO:24 家族1 重鏈CDR3 AREHSNYFYGMDV
SEQ ID NO:25 家族2 輕鏈CDR1 SSNIGGNY
SEQ ID NO:26 家族2 輕鏈CDR2 RNN
SEQ ID NO:27 家族2 輕鏈CDR3 QSYDSSLSVS
SEQ ID NO:28 家族2 重鏈CDR1 GFTFSSYW
SEQ ID NO:29 家族2 重鏈CDR2 ISGSGGGT
SEQ ID NO:30 家族2 重鏈CDR3 AREGETSFGLDV
SEQ ID NO:31 家族3 輕鏈CDR1 TGAVTSGFY
SEQ ID NO:32 家族3 輕鏈CDR2 ATN
SEQ ID NO:33 家族3 輕鏈CDR3 LVYYDGAW
SEQ ID NO:34 家族3 重鏈CDR1 GYSFTSYW
SEQ ID NO:35 家族3 重鏈CDR2 IYPGDSDT
SEQ ID NO:36 家族3 重鏈CDR3 ARGPSTGFWSGNYFDY
SEQ ID NO:37 輕鏈 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSGVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:38 重鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREHSNYFYGMDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:39 輕鏈 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSVSVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:40 重鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGETSFGLDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:41 輕鏈 QTVVTQEPSLTVSPGETVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:42 重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:43 輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:44 重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:45 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI AEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSATSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:46 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI-1 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:47 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI-2 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLALMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:48 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI-3 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNAFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLALMSHSGTSLTQSAARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:49 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI-4 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:50 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI，無活性 AEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSATSLTQSVARAMLRFVTVTADALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:51 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI-1，無活性 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAD ALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:52 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI-2，無活性 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLALMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTADALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:53 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI-3，無活性 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNAFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLALMSHSGTSLTQSAARAMLRFVTVTADALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:54 志賀毒素效應多肽SLT-1A-DI-4 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTADALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:55 SLT-1A-組合變異體1 KEFILRFSVAHKYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:56 SLT-1A-組合變異體2 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDNLVPMVATVVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:57 SLT-1A-組合變異體3 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSNLVPMVATVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:58 SLT-1A-組合變異體4 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGILGFVFTLDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:59 SLT-1A-組合變異體5 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVGILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:60 SLT-1A-組合變異體6 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDILGFVFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:61 SLT-1A-組合變異體7 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:62 SLT-1A-組合變異體8 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVGILGFVFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:63 SLT-1A-組合變異體9 KEFILDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDVRGIAPIEARFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSATSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLAALSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:64 SLT-1A-組合變異體10 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVGILGFVFTLEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:65 SLT-1A-組合變異體11 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVNLVPMVATVGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:66 SLT-1A-組合變異體12 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTNLVPMVATVSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:67 SLT-1A-組合變異體13 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRGILGDVFTLSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:68 SLT-1A-組合變異體14 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHILRFSVAHKASAVAA
SEQ ID NO:69 SLT-1A-組合變異體15 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHARNLVPMVATVASAVAA
SEQ ID NO:70 連接體1 EFPKPSTPPGSSGGAP
SEQ ID NO:71 連接體2 EFPKPSTPPGSSGGAPGILGFVFTL
SEQ ID NO:72 連接體3 GGGGSGG
SEQ ID NO:73 連接體4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:74 連接體5 GSTSGSGKPGSGEGS
SEQ ID NO:75 連接體6 GGGGS
SEQ ID NO:76 1號CD38結合蛋白 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSGVFGGGTKLTVLGGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREHSNYFYGMDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:77 2號CD38結合蛋白 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSVSVFGGGTKLTVLGGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGETSFGLDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:78 3號CD38結合蛋白 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGETVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:79 4號CD38結合蛋白 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:80 5號CD38結合蛋白 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSNSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSDSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSRVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYDMTWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYYYGFSGPSMDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:81 6號CD38結合蛋白 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDNTLSGVIFGGGTKLTVLGGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMNWIRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEGPYYLYGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:82 7號CD38結合蛋白 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNSYVSWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSAWDDNLSVLFGGGTKLTVLGGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMTWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGLFHDSSGYYFGHWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO:83 CD38靶向參考分子1 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSNPYTFGQGTKVEIKGGGGSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGRGLEWIGVMWRGGSTDYNAAFMSRLNITKDNSKNQVSLRLSSVTAADTAVYYCAKSMITTGFVMDSWGQGSLVTVSS
SEQ ID NO:84 1號CD38靶向對照分子 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSNPYTFGQGTKVEIKGGGGSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGRGLEWIGVMWRGGSTDYNAAFMSRLNITKDNSKNQVSLRLSSVTAADTAVYYCAKSMITTGFVMDSWGQGSLVTVSS
SEQ ID NO:85 來自智人(Homo sapiens )之CD38 MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI
SEQ ID NO:86 來自智人之CD38細胞外結構域(ECD) VPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI
SEQ ID NO:87 來自長尾獼猴(Macaca fascicularis )之CD38 MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQVCLGVCLLVLLILVVVVAVVLPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI
SEQ ID NO:88 來自長尾獼猴之CD38細胞外結構域(ECD) LPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI
SEQ ID NO:101 VH結構域 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:102 vhCDR1 GYSFTSYW
SEQ ID NO:103 vhCDR2 IYPGDSDT
SEQ ID NO:104 vhCDR3 ARGPSTGFWSGNYFDY
SEQ ID NO:105 VL結構域 QTVVTQEPSLTVSPGETVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:106 vlCDR1 TGAVTSGFY
SEQ ID NO:107 vlCDR2 ATN
SEQ ID NO:108 vlCDR3 LVYYDGAW
SEQ ID NO:109 VH結構域 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREHSNYFYGMDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:110 vhCDR1 GFTFSDYY
SEQ ID NO:111 vhCDR2 ISGSGGST
SEQ ID NO:112 vhCDR3 AREHSNYFYGMDV
SEQ ID NO:113 VL結構域 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSGVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:114 vlCDR1 SSNIGSNY
SEQ ID NO:115 vlCDR2 GNS
SEQ ID NO:116 vlCDR3 QSYDSSLSGSG
SEQ ID NO:117 VH結構域 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGETSFGLDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:118 vhCDR1 GFTFSSYW
SEQ ID NO:119 vhCDR2 ISGSGGGT
SEQ ID NO:120 vhCDR3 AREGETSFGLDV
SEQ ID NO:121 VL結構域 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSVSVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:122 vlCDR1 SSNIGGNY
SEQ ID NO:123 vlCDR2 RNN
SEQ ID NO:124 vlCDR3 QSYDSSLSVS
SEQ ID NO:125 VL結構域 QTVVTQEPSLTVSPGETVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:126 VH結構域 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGRGLEWIGVMWRGGSTDYNAAFMSRLNITKDNSKNQVSLRLSSVTAADTAVYYCAKSMITTGFVMDSWGQGSLVTVSS
SEQ ID NO:127 VL結構域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSNPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:128 CD38智人 MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI
SEQ ID NO:129 CD38智人細胞外結構域(ECD) VPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI
SEQ ID NO:130 CD38長尾獼猴 MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQVCLGVCLLVLLILVVVVAVVLPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI
SEQ ID NO:131 CD38長尾獼猴細胞外結構域(ECD) LPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI
圖1A至圖1B：圖1A及圖1B中提供說明性CD38靶向分子之示意圖，該等說明性CD38靶向分子各自包含至少一個CD38結合區及至少一個志賀毒素A亞單元效應子。在圖1A中，CD38結合區通常係scFv，其包含由連接體隔開之抗CD38 VH及VL結構域，其中scFv係在志賀毒素組分之N末端或C末端。在一個說明性CD38靶向分子中，CD38結合區係scFv，且該scFv顯示參與與鄰近scFv之分子間可變結構域交換(圖1B，左下)。圖1A至圖1B中之說明性分子之繪示係出於說明本發明之一組有限實施例之結構特徵的某些一般性排列之目的。應理解，該等說明性分子不意欲、亦不應解釋為完全限制本發明分子之任何結構特徵及/或組分之排列。圖1A至圖1B之示意圖中所示特徵之相對大小、位置或數量已經簡化。圖1A至圖1B中之示意圖不意欲準確地描繪關於本發明之任一實施例中分子結構之相對大小之任何資訊。
圖 2 ： 圖2顯示51種CD38靶向分子庫中之各種分子對CD38陽性H929人類骨髓瘤細胞之代表性CD50 值。如所示，CD38靶向分子可呈VH-VL或VL-VH之任一定向。灰色正方形代表該庫之其他成員。1 × 103 pM之篩選截止值由垂直虛線表示，其中左側之CD50 值較截止值更強效且右側之CD50 值不如截止值強效。在此分析中，52種所測試分子中未展現20,000 pM或更小之CD50 之任一者不包括在圖2中。所測試之一些最強效分子係在6號及7號家族之CD38靶向分子中。
圖 3A 至圖 3C ： 圖3A至圖3C顯示使用各種濃度之3號及4號CD38靶向分子之代表性細胞毒性分析。1號CD38靶向參考分子及無靶向結構域之志賀效應多肽分別用作陽性及陰性對照。3號CTM及4號CTM顯示對CD38陽性H929細胞(圖3A)及MOLP-8細胞(圖3B)之濃度依賴性細胞毒性。藉由將對CD38陽性H929及MOLP-8細胞(圖3A至圖3B)之細胞毒性活性與對CD38陰性U266細胞(圖3C)之細胞毒性活性進行比較來研究對CD38表現細胞之細胞毒性特異性。在所測試之條件下，3號CTM及4號CTM均未對U266細胞展現出顯著的細胞毒性活性(圖3C)。
圖 4A 至圖 4B ： 圖4A至圖4B顯示使用人類細胞(圖4A)或非人類靈長類動物(圖4B)細胞所測試之1號、2號及4號CD38靶向分子之代表性細胞毒性分析。BLCL-C162係表現恆河猴CD38之恆河猴細胞株。1號CD38靶向參考分子及無靶向結構域之志賀效應多肽分別用作陽性及陰性對照。1號CTM、2號CTM及4號CTM顯示對CD38陽性MOLP-8細胞(圖4A)及CD38陽性BLCL-C162細胞(圖4B)之濃度依賴性細胞毒性。注意，恆河猴及食蟹猴中CD38之序列係一致的。
圖 5 ： 圖5顯示無細胞活體外蛋白質轉譯分析中4號CD38靶向分子之濃度依賴性蛋白質合成抑制活性；蛋白質合成抑制係如本文所闡述之志賀毒素之一種活性。1號CD38靶向參考分子及無靶向結構域之志賀效應多肽用作陽性對照。與陽性對照參考分子相比，4號CTM以濃度依賴性方式降低如藉由相對發光單位(RLU)所量測之螢光素酶蛋白質合成。
圖 6A 至圖 6B ： 在圖6A至圖6B中，利用酶聯免疫吸附分析(ELISA)結合分析測定CD38靶向分子(2號CTM、3號CTM及4號CTM)與重組人類CD38蛋白(圖6A)或重組食蟹猴CD38蛋白(圖6B)之結合特徵。分子2號CD38靶向分子(SEQ ID NO:77)、3號CD38靶向分子(SEQ ID NO:78)及4號CD38靶向分子(SEQ ID NO:79)各自結合至人類及食蟹猴CD38二者，而1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83)結合至人類CD38 (圖6A)，但不結合至食蟹猴CD38 (圖6B)。
圖 7 ： 圖7顯示CD38之3維蛋白質結構圖，及CD38中由4號CD38靶向分子結合的關鍵殘基之位置，其係藉由抗原決定基定位誘變使用人類CD38細胞外結構域來確定。在圖7中，關鍵表面可及接觸殘基F216及L262係以紅色顯示，關鍵結構殘基L124及L230係以紫色顯示，且參與二硫鍵對C119/C201及C254/C275之關鍵結構殘基係以灰色顯示。
圖 8A 至圖 8H ： 圖8A至圖8H顯示在達雷木單抗(daratumumab)存在下，各種說明性CD38靶向分子(1號CTM、2號CTM、4號CTM、7號CTM及5號家族之CTM)對CD38表現細胞之細胞毒性活性。使用人類骨髓瘤H929細胞(圖8A)、人類淋巴瘤ST486細胞(圖8B)及人類多發性骨髓瘤MOLP-8細胞(圖8C)量測0.5 µg/mL之1號CTM、7號CTM或5號家族之CD38靶向分子對經達雷木單抗之稀釋系列預處理的CD38陽性細胞之細胞毒性活性。使用CD38陽性人類淋巴瘤ST486細胞(圖8D)、人類多發性骨髓瘤MOLP-8細胞(圖8E)量測投與1號CTM、7號CTM或5號家族CTM之稀釋系列對經10 ?g/mL達雷木單抗預處理的細胞之細胞毒性活性。使用人類骨髓瘤H929細胞或人類多發性骨髓瘤MOLP-8細胞(圖8F)量測投與4號CTM之稀釋系列對暴露於50 µg/mL達雷木單抗之人類CD38表現細胞之細胞毒性活性。圖8G顯示4號CTM針對暴露於達雷木單抗之濃度系列的人類骨髓瘤MOLP-8細胞之代表性CD50 值(nM)，且係在投與4號CTM後48小時量測。圖8H顯示在暴露於4號CTM後48小時，投與經達雷木單抗之濃度系列處理之人類多發性骨髓瘤MOLP-8細胞的4號CTM之稀釋系列之細胞毒性活性及CD50 值(nM)。在圖8H中，4號CTM之CD50 值(nM)在底部表格中顯示在具體達雷木單抗濃度(nM)處。在達雷木單抗存在下，4號CTM保留細胞毒性活性，其中在達雷木單抗濃度為約10,000 nM時，CD50 值適度變化。
圖 9 ： 圖9顯示在12天內投與1毫克/公斤體重(mg/kg)之3號CD38靶向分子或4號CD38靶向分子達6個劑量的BALB/c小鼠隨時間之體重變化。由於接受3號CTM之小鼠中有一半在第12天最後一次排定的劑量之前死亡，因此3號CTM組之投藥在第12天之前停止。
圖 10 ： 圖10顯示血清抗藥物免疫球蛋白G之量，其係使用應用於血清樣品之溶液內ELISA分析來量測，該等血清樣品係取自與去免疫化較少之CD38靶向對照分子(SEQ ID NO: 84)相比，投與1號CTM、2號CTM或1號CD38靶向參考分子之小鼠。該等小鼠每週各自投與三次0.25 mg/kg之各別CD38靶向分子達兩週，且接著在第4週及第5週每週再投與三次，在5週時期內總計12個劑量。在研究之投藥階段期間之不同時間點及投藥結束後收集小鼠血清。
圖 11A 至圖 11D ： 圖11A至圖11D顯示在人類癌症之活體內異種移植物小鼠模型中人類腫瘤隨時間之生長。向小鼠注射表現低量及高量CD38之人類骨髓瘤腫瘤細胞(LP1細胞，圖11A；H929細胞，圖11B；MM1.S細胞，圖11C；MOLP-8細胞，圖11D)，且投與4號CD38靶向分子或僅媒劑陰性對照。藍色指示僅媒劑對照之量測值；所有其他數據均係4號CTM之各種劑量(例如1.5、3、4.5、5、6、9、10或12 mg/kg)及投與時間表(例如兩週一次，BIW；每週一次，QW；或每隔一週一次，Q2W)下之數據。
圖 12 ： 圖12A顯示接受說明性CD38靶向分子治療之瀰漫性異種移植物小鼠癌症模型中之平均生物發光信號。圖12A顯示MM1.S-luc瀰漫性多發性骨髓瘤小鼠模型中之平均生物發光信號。圖12B顯示使用異種移植物腫瘤細胞中螢光素酶活性之生物發光成像收集之小鼠影像：僅投與媒劑之小鼠在其整個身體內廣泛地展現強烈信號，而投與4號CD38靶向分子(4號CTM)之小鼠藉由此方法似乎沒有可偵測到之MM1.S-luc腫瘤細胞。10隻小鼠中有10隻觀察到完全腫瘤消除。圖12C顯示Daudi-luc瀰漫性異種移植物小鼠模型中之平均生物發光信號。圖12C顯示使用異種移植物腫瘤細胞中螢光素酶活性之生物發光成像收集之小鼠影像：僅投與媒劑之小鼠在其整個身體內廣泛地展現強烈信號，而投與1號CD38靶向參考分子之小鼠在相關研究日展示降低之信號。
圖 13 ： 圖13以圖示方式顯示藉由非變性條件下之粒徑篩析層析(SEC)分析之4號CTM樣品製劑中存在的蛋白質物質之大小及比例。對於SEC分析，將流經SEC管柱後溶析出之材料在280奈米(nm)波長下的紫外(uv)光吸光度以毫吸光度單位(mAU)對以分鐘(min)計之溶析時間進行繪圖。使用軟體來鑑別280 nm跡線中之個別峰及每一峰在280 nm紫外光下最大吸收之溶析時間。以18.81分鐘為中心之峰(2號)代表4號CTM之非共價同二聚體形式，其包含1014個胺基酸殘基且理論分子量為約110 kDa，且以17.38分鐘為中心之峰(1號)代表一或多個更高分子量物質，例如4號CTM之多聚體及/或聚集體。個別峰之純度可藉由將該峰之面積除以樣品之總峰面積來計算。25分鐘左右之峰代表由緩衝液溶析引起之uv光吸收中之預期信號。
圖 14A 至圖 14B ： 圖14A係說明性CD38靶向分子(諸如4號CTM)之示意圖。4號CTM包含連續多肽，其包含經由蛋白質性連接體融合之經改造去免疫化(DI)志賀毒素亞單元A效應多肽(SLT-1A)及抗CD38單鏈可變片段(scFv)。圖14B係顯示說明性CD38靶向分子(諸如4號CTM)之潛在作用機制之示意圖，該潛在作用機制涉及經由細胞表面CD38特異性結合至CD38表現細胞，內化至該等靶細胞中；以自胞內體至高爾基氏體(Golgi)、接著至內質網且接著至胞質液之逆行路徑進行細胞內按路線自發送(self-routing)；及一旦在胞質液中，則核糖體發生不可逆及酶促失活，從而導致靶細胞死亡。4號CTM之此假定作用機制與患者之免疫功能狀態無關。
圖 15 ： 圖15顯示4號CTM在原代細胞培養物中殺死患者源多發性骨髓瘤細胞。圖15顯示投與4號CTM之濃度(Conc)系列後之總多發性骨髓瘤細胞存活百分比及4號CTM針對多發性骨髓瘤細胞樣品之CD50 值(nM)，該等樣品係藉由自6名不同患者(010、011、012、013、014及015)進行骨髓穿刺(BMA)獲得的，包括一個來自達雷木單抗抗性患者(13號)之樣品。在圖15中，表格之中間行報告患者樣品中MM細胞之CD38受體密度。在投與4號CTM後48小時，在寬CD38表現水準範圍內(例如1.4至67.5 × 105 個CD38分子/細胞之CD38細胞表面密度)觀察到4號CTM對原發性多發性骨髓瘤細胞之強效細胞毒性(例如3.5至8.5 nM之CD50 值)。
圖 16 ：圖16顯示在向人類多發性骨髓瘤細胞活體外投與4號CTM後，使用Real Time Glo分析量測之細胞存活率時程研究之結果。圖16顯示跨來自多發性骨髓瘤細胞組之不同細胞類型(ANBL-6、NCI-H929、RMPI-8226及MOLP-8)及在非多發性骨髓瘤對照細胞株(HCT116)中隨時間之4號CTM CD50值(ng/mL)。在圖16中，表格在底部兩列中報告CD50 值(pM) (4號CTM或CD38TM4)。在圖16中，表格報告細胞表面CD38之表現水準且將該等值在CD38表現列中表徵為高或中等。
圖 17 ： 圖17顯示在用人類多發性骨髓瘤MM1.S細胞接種小鼠以形成瀰漫性異種移植物且用4號CTM治療後腫瘤體積之時程。每週一次(QW)或每隔一週一次(Q2W)用4號CTM治療小鼠，且視情況與多發性骨髓瘤之美國現行照護標準(SOC)一起進行共治療。
圖 18A 至圖 18B ： 圖18A-18B顯示在投與4號CTM之稀釋系列後，使用流式細胞術對人類全血(左圖)及食蟹猴全血中之總天然殺手(NK)細胞計數進行之離體分析。顯示此分析中消除一半NK群體之4號CTM濃度計算值(CD50 )。
圖 19 ： 圖19顯示人類多發性骨髓瘤ANBL-6細胞對4號CTM投與之劑量-反應曲線及結果之表格彙總。將ANBL-6細胞與4號CTM一起連續培育48或72小時，或暴露於4號CTM達2小時，洗滌，且保持在無4號CTM之培養基中直至48或72小時時間點。圖19顯示在四種測試條件下，4號CTM對ANBL-6細胞之CD50 值：在48小時時間點，不清洗之情形下為0.03 nM且清洗2小時為0.16 nM；在72小時時間點，不清洗之情形下為0.01 nM且清洗2小時為0.1 nM。
圖 20 ： 圖20係顯示歸類為患有復發及/或難治性多發性骨髓瘤(RRMM)之患者的4號CTM單一療法臨床研究之第一階段設計之示意圖。該研究設計包含劑量遞增階段(第1部分)及擴展階段(第2部分)。在該兩個部分中，患者進行治療直至發生進展性疾病(PD)、毒性不可接受或退出為止。
圖 21 ： 圖21係圖解說明4號CTM單一療法臨床研究之投藥方案之示意圖。劑量遞增將以50 µg/kg之4號CTM開始，且接著根據療法之第1週期中所觀察到之劑量限制性毒性(DLT)數量如圖21中所示繼續進行。在評估50 µg/kg劑量後，藉由具有超劑量控制之貝葉斯邏輯回歸模型(Bayesian Logistical Regression Model，BLRM)，連同慮及其他可獲得之非DLT安全性、臨床效能、藥物動力學(PK)及藥效學(PD)資料將獲知後續劑量遞增及最大耐受劑量(MTD)決定。
圖 22A 至圖 22B ： 圖22A列示4號CTM單一療法臨床研究之主要及次要目標，且圖22B列示其探索性目標。
圖 23A 至圖 23D ： 圖23A及圖23B顯示在抗CD38抗體達雷木單抗、HB-7、AT13-5及OKT-10存在下，CD38結合蛋白(包括1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83))與表現CD38之MOLP-8細胞之結合。圖23C顯示CD38結合蛋白(包括1號CD38靶向參考分子(SEQ ID NO:83))與表現CD38之MOLP-8細胞之競爭性結合。所有信號均係藉由流式細胞術來偵測。圖23D係彙總在抗CD38抗體達雷木單抗、HB-7、AT13-5、OKT-10及抗CD38結合scFv (左側首行)存在下，CD38結合蛋白(頂列)之結合的表格。如圖23A至圖23D中所用：CD38TM1融合蛋白係指包含SEQ ID NO: 228之胺基酸序列之CD38結合融合蛋白；CD38TM2融合蛋白係指包含SEQ ID NO: 229之序列之CD38結合融合蛋白；且CD38TM3融合蛋白係指包含SEQ ID NO: 230之序列之CD38結合融合蛋白。
圖 24A 及圖 24B 顯示分別藉由IMAC管柱及蛋白質L (Pro-L)管柱對3號CTM 及4號CTM之純化。MW標誌指示分子量標誌之位置。CD38TM3之VH及VL不結合至標準單株抗體純化樹脂(蛋白質A或蛋白質L)，且其係使用His標籤及IMAC管柱進行純化(圖24A)。為使純化更容易，藉由框架突變對為λ輕鏈之CD38TM3輕鏈進行修飾，使得其能夠結合至蛋白質L，從而容許在沒有額外標籤之情形下進行親和純化。所得CD38TM4能夠結合至蛋白質L，且因此可藉由蛋白質L親和性進行純化。
圖 25A 至圖 25D ： 圖25A至圖25D顯示適於用作CD38靶向分子組分之各種說明性CD38靶向部分之序列。圖25A提供1號CD38結合區家族及1號CD38結合蛋白(CD38TM1)之序列。圖25B提供2號CD38結合區家族及2號CD38結合蛋白(CD38TM2)之序列。圖25C提供3號CD38結合區家族及3號CD38靶向部分(CD38TM3)之序列。圖25D提供3號CD38結合區家族及4號CD38靶向部分(CD38TM4)之序列。如圖25D中所示，CD38TM3 VL結構域的前21個胺基酸經CD38TR1 VL結構域的前22個胺基酸替代，其係衍生CD38TM4之VL結構域之κ輕鏈。CDR序列加下劃線。
圖 26 ： 圖26顯示由兩個一致之scFv形成的雙價抗體之X射線結構之圖解，該兩個一致之scFv各自自N末端至C末端含有VH-GGGGS-VL，其中VH及VL係來自CD38TM4。一條scFv鏈(鏈A)之VH與另一scFv鏈(鏈B)之VL複合形成CD38結合結構域。
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Claims (40)

  1. 一種CD38結合融合蛋白，其包含： a) 志賀毒素A亞單元效應多肽； b) 重鏈可變結構域(VH)，其包含： 1) 包含SEQ ID NO: 34之序列之vHCDR1； 2) 包含SEQ ID NO: 35之序列之vHCDR2；及 3) 包含SEQ ID NO: 36之序列之vHCDR3；及 c) 輕鏈可變結構域(VL)，其包含： 1) 包含SEQ ID NO: 31之序列之vLCDR1； 2) 包含SEQ ID NO: 32之序列之vLCDR2；及 3) 包含SEQ ID NO: 33之序列之vLCDR3。
  2. 如請求項1之CD38結合融合蛋白，其中該CD38結合蛋白包含SEQ ID NO: 79之序列。
  3. 如請求項1之CD38結合融合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO: 43之序列，且該VH包含SEQ ID NO: 44之序列。
  4. 如請求項1之CD38結合融合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO: 43之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸一致性之序列，且該VH包含SEQ ID NO: 44之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
  5. 如請求項1之CD38結合融合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO: 41之序列，且該VH包含SEQ ID NO: 44之序列。
  6. 如請求項1之CD38結合融合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO: 41之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，且該VH包含SEQ ID NO: 44之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
  7. 一種CD38結合融合蛋白，其包含： a) 志賀毒素A亞單元效應多肽； b) 重鏈可變結構域(VH)，其包含： 1) 包含SEQ ID NO: 22之序列之vHCDR1； 2) 包含SEQ ID NO: 23之序列之vHCDR2；及 3) 包含SEQ ID NO: 24之序列之vHCDR3；及 c) 輕鏈可變結構域(VL)，其包含： 1) 包含SEQ ID NO: 19之序列之vLCDR1； 2) 包含SEQ ID NO: 20之序列之vLCDR2；及 3) 包含SEQ ID NO: 21之序列之vLCDR3。
  8. 如請求項7之CD38結合融合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO: 37之序列，且該VH包含SEQ ID NO: 38之序列。
  9. 如請求項7之CD38結合融合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO: 37之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，且該VH包含SEQ ID NO: 37之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
  10. 一種CD38結合融合蛋白，其包含： a) 志賀毒素A亞單元效應多肽； b) 重鏈可變結構域(VH)，其包含： 1) 包含SEQ ID NO: 28之序列之vHCDR1； 2) 包含SEQ ID NO: 29之序列之vHCDR2；及 3) 包含SEQ ID NO: 30之序列之vHCDR3；及 c) 輕鏈可變結構域(VL)，其包含： 1) 包含SEQ ID NO: 25之序列之vLCDR1； 2) 包含SEQ ID NO: 26之序列之vLCDR2；及 3) 包含SEQ ID NO: 27之序列之vLCDR3。
  11. 如請求項10之CD38結合融合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO: 39之序列，且該VH包含SEQ ID NO: 40之序列。
  12. 如請求項10之CD38結合融合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO: 39之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列，且該VH包含SEQ ID NO: 40之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之CD38結合融合蛋白，其中該蛋白在該志賀毒素A亞單元效應多肽與該CD38結合結構域之間包含第一連接體。
  14. 如請求項13之CD38結合融合蛋白，其中該第一連接體係蛋白質性連接體。
  15. 如請求項14之CD38結合融合蛋白，其中該第一連接體包含約1至約50個胺基酸殘基。
  16. 如請求項14或15之CD38結合融合蛋白，其中該第一連接體包含SEQ ID NO: 70之序列。
  17. 如請求項14或15之CD38結合融合蛋白，其中該第一連接體包含SEQ ID NO: 70-75中任一者之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之序列。
  18. 如請求項1至17中任一項之CD38結合融合蛋白，其中該蛋白在該VH與該VL之間包含第二連接體。
  19. 如請求項18之CD38結合融合蛋白，其中該第二連接體包含序列(Gly4 Ser)n (SEQ ID NO: 195)，其中n等於1、2、3、4或5。
  20. 如請求項19之CD38結合融合蛋白，其中n等於1。
  21. 如請求項18至20中任一項之CD38結合融合蛋白，其中該融合蛋白自其N末端至C末端包含該志賀毒素A亞單元效應多肽-第一連接體-VH-第二連接體-VL。
  22. 如請求項18至20中任一項之CD38結合融合蛋白，其中該融合蛋白自其N末端至C末端包含該志賀毒素A亞單元效應多肽-第一連接體-VL-第二連接體-VH。
  23. 如請求項21之CD38結合融合蛋白，其中該志賀毒素A亞單元效應多肽包含SEQ ID NO: 46之序列。
  24. 如請求項1至18中任一項之CD38結合融合蛋白，其中該志賀毒素A亞單元效應多肽包含SEQ ID NO: 45-69中任一者之序列或與其具有至少95%、至少96%、至少97%、至少95%、至少99%胺基酸序列一致性之序列。
  25. 如請求項1之CD38結合融合蛋白，其中該志賀毒素A亞單元效應多肽包含SEQ ID NO: 46之序列，該VL包含SEQ ID NO: 43之序列，且該VH包含SEQ ID NO: 44之序列。
  26. 如請求項1之CD38結合融合蛋白，其中該蛋白與SEQ ID NO: 79之序列具有至少95%胺基酸序列一致性。
  27. 如請求項1至26中任一項之CD38結合融合蛋白，其中該蛋白係同二聚體。
  28. 如請求項1之CD38結合融合蛋白，其中該蛋白包含兩個一致多肽，每一多肽包含SEQ ID NO: 79之序列。
  29. 如請求項1之CD38結合融合蛋白，其中該蛋白包含兩個一致多肽，每一多肽包含與SEQ ID NO: 79至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%胺基酸序列一致之序列。
  30. 一種核酸，其編碼如請求項1至29中任一項之CD38結合融合蛋白。
  31. 一種表現載體，其包含如請求項30之核酸。
  32. 一種宿主細胞，其包含如請求項31之表現載體。
  33. 一種組合物，其包含(i) 如請求項2之CD38結合融合蛋白及(ii) 醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  34. 如請求項33之組合物，其中至少約90%之該CD38結合融合蛋白係呈同二聚體形式。
  35. 如請求項34之組合物，其中至少約95%之該CD38結合融合蛋白係呈同二聚體形式。
  36. 一種製備如請求項1至29中任一項之CD38結合融合蛋白之方法，其包含在表現該CD38結合融合蛋白之條件下培養如請求項32之宿主細胞，及回收該蛋白質。
  37. 一種純化如請求項1至29中任一項之CD38結合融合蛋白之方法，該方法包含使該CD38結合融合蛋白與細菌蛋白質L接觸。
  38. 如請求項37之方法，其中該蛋白質L係自大消化鏈球菌(P. magnus )分離或源自大消化鏈球菌。
  39. 如請求項37或38之方法，其中該蛋白質L偶聯至樹脂。
  40. 一種治療多發性骨髓瘤之方法，其包含向有需要之個體投與如請求項1至29中任一項之CD38結合融合蛋白或如請求項33至35中任一項之組合物。
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