KR20210119421A - 탈면역화된 시가 독소 a 서브유닛 이펙터를 포함하는 cd38-결합 단백질(cd38-binding proteins comprising de-immunized shiga toxin a subunit effectors) - Google Patents

탈면역화된 시가 독소 a 서브유닛 이펙터를 포함하는 cd38-결합 단백질(cd38-binding proteins comprising de-immunized shiga toxin a subunit effectors) Download PDF

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KR20210119421A
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KR
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seq
sequence
shiga toxin
amino acid
binding
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KR1020217024877A
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Inventor
니베디타 차토파디아야
에릭 포마
에린 윌렛
Original Assignee
밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드
몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션.
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Abstract

본 발명은 (1) 세포-표적화를 위한 CD38-결합 영역 및 (2) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드("시가 독소 이펙터 폴리펩티드")를 각각 포함하는 결합 단백질("CD38-결합 단백질")을 제공한다. CD38-결합 단백질의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 성분은 (1) 탈-면역화 및/또는 (2) 프로테아제 민감성의 감소를 제공하는 야생-형 시가 독소 서열에 대한 돌연변이의 조합을 포함할 수 있고; 상기 각각의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는, 예를 들어 세포 내재화 자극, 세포 내 경로 지정, 촉매 활성, 및/또는 강력한 세포독성과 같은, 하나 이상의 시가 독소 기능을 보유한다. CD38-결합 단백질은, 보다 일반적으로, 예를 들어 다발성 골수종과 같은 CD38-양성 조혈암에서 암 및 CD38-발현 세포와 관련된 장애의 진단 및 치료를 위해, 하나 또는 다수의 용도, 예를 들어 특정 CD38-발현 세포-유형의 선택적 사멸을 가질 수 있다.

Description

탈면역화된 시가 독소 A 서브유닛 이펙터를 포함하는 CD38-결합 단백질(CD38-BINDING PROTEINS COMPRISING DE-IMMUNIZED SHIGA TOXIN A SUBUNIT EFFECTORS)
I. 관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 본 출원은 2019년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/945,107, 2019년 12월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/945,106 및 2019년 1월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/795,633의 우선권 이익을 주장하며, 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
II. 전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
[0002] 여기에 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 전체가 참조로 통합된다: 컴퓨터 판독 가능 형식의 서열 목록 사본(파일 이름: MTEM_009_01WO_SeqList_ST25 UPDATED 23 JAN 2020.txt, 기록 날짜 2020년 1월 23일, 파일 크기 238킬로바이트).
III. 기술 분야
[0003] 본 발명은 각각이 (1) CD38-결합 영역(binding region) 또는 도메인(domain) 및 (2) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드(Shiga toxin A Subunit effector polypeptide)("시가 독소 이펙터 폴리펩티드(Shiga toxin effector polypeptide")를 포함하는 결합 단백질(binding protein)(각 결합 단백질은 "CD38-결합 단백질"임))에 관한 것이다.
IV. 발명의 배경
[0004] 다음은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 여기에 제공된 정보가 선행 기술이거나 본 발명과 관련이 있다는 것, 또는 여기에 구체적으로 또는 묵시적으로 언급된 출판물이나 문서가 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.
[0005] CD38은 다발성 골수종(multiple myeloma) 환자의 악성 형질 세포(malignant plasma cell)에서 고도로 발현(express)된다. 다발성 골수종은 말단 기관 손상을 유발하는 형질 세포의 과증식(over-proliferation)을 수반하는 형질 세포의 혈액 악성 종양(hematologic malignancy)이다. 다발성 골수종에서 악성 형질 세포는 M 단백질(골수종 단백질(myeloma protein) 또는 단클론성 단백질이라고도 함)이라고 하는 비정상적인 면역글로불린(immunoglobulin)을 생성하여 단클론성 감마병증 또는 비정상적으로 높은 혈장 내 M 단백질 수치를 초래할 수 있다. 또한 악성 형질 세포가 골수(bone marrow)에 축적되어 건강한 세포를 밀어낼 수 있다(crowding-out).
[0006] CD38-발현 세포의 선택적 사멸 또는 유익한 제제의 CD38-발현 세포 내로의 선택적 전달에 의해 치료될 수 있는 다양한 질병, 예를 들어 조혈암을 치료하기 위한 치료 분자로서 사용하기 위한 CD38-결합 단백질을 갖는 것이 바람직할 것이다. 낮은 항원성(antigenicity) 및/또는 면역원성(immunogenicity), 낮은 표적 외 독성(off-target toxicity) 및 강력한 표적상 세포독성(on-target cytotoxicity)을 나타내는 세포독성, CD38-결합, 세포 표적화(cell-targeting) 단백질을 갖는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 1) 원치 않는 항원성(antigenicities) 및/또는 면역원성(immunogenicities)에 대한 잠재성이 감소하고(예: 돌연변이를 통해), 및/또는 2) CD38-발현 세포에 대한 강력한(potent) 세포독성을 유지하면서 비특이적 독성에 대한 감소된 잠재성을 가지는(예를 들어 개선된 안정성을 통해) 세포독성의 시가 독소 A 서브유닛 유도 성분을 포함하는 CD38-결합 단백질을 가지는 것은 바람직할 것이다. 더욱이, 낮은 항원성 및/또는 면역원성, 낮은 표적 외 독성(off-target toxicity), 높은 안정성 및/또는 화물(cargo)을 CD38-발현 표적 세포에 전달하는 능력을 나타내는 CD38-결합 치료 및/또는 진단 단백질을 갖는 것이 바람직할 것이다.
V. 발명의 간단한 요약
[0007] 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명은 선택적인 링커와 함께 하나 이상의 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및 하나 이상의 CD38-결합 도메인을 포함하는 CD38-결합 융합 단백질(CD38-binding fusion protein)을 제공한다.
[0008] 따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 CD38-결합 융합 단백질을 제공한다 - a) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드; b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH): 1) SEQ ID NO:34의 서열을 포함하는 vHCDR1; 2) SEQ ID NO:35의 서열을 포함하는 vHCDR2; 및 3) SEQ ID NO:36의 서열을 포함하는 vHCDR3; 및 c) 다음을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL): 1) SEQ ID NO:31의 서열을 포함하는 vLCDR1; 2) SEQ ID NO:32의 서열을 포함하는 vLCDR2; 및 3) SEQ ID NO:33의 서열을 포함하는 vLCDR3.
[0009] 또 다른 구체예들에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:79의 서열을 포함한다.
[0010] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:43의 서열을 포함하는 VL, 및 SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 VH를 갖는다.
[0011] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 a) SEQ ID NO:43의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 동일성(amino acid identity)을 갖는 서열을 포함하는 VL, 및 b) SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 에서을 갖는 서열을 포함하는 VH를 가진다.
[0012] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:41의 서열을 포함하는 VL, 및 SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 VH를 갖는다.
[0013] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:41의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 VL, 및 SEQ ID NO:44의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 가진다.
[0014] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 다음을 포함한다 - a) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드; b) 다음을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH): 1) SEQ ID NO:22의 서열을 포함하는 vHCDR1; 2) SEQ ID NO:23의 서열을 포함하는 vHCDR2; 및 3) 서열 번호 24의 서열을 포함하는 vHCDR3; 및 c) 다음을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL): 1) SEQ ID NO:19의 서열을 포함하는 vLCDR1; 2) SEQ ID NO:20의 서열을 포함하는 vLCDR2; 및 3) SEQ ID NO:21의 서열을 포함하는 vLCDR3.
[0015] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:37의 서열을 포함하는 VL, 및 SEQ ID NO:38의 서열을 포함하는 VH를 갖는다.
[0016] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:37의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL, 및 SEQ ID NO:37의 서열 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 갖는다.
[0017] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 다음을 포함한다 - a) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드; b) 하기를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH): 1) SEQ ID NO:28의 서열을 포함하는 vHCDR1; 2) SEQ ID NO:29의 서열을 포함하는 vHCDR2; 및 3) SEQ ID NO:30의 서열을 포함하는 vHCDR3; 및 c) 하기를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL): 1) SEQ ID NO:25의 서열을 포함하는 vLCDR1; 2) SEQ ID NO:26의 서열을 포함하는 vLCDR2; 및 3) SEQ ID NO:27의 서열을 포함하는 vLCDR3.
[0018] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:39의 서열을 포함하는 VL, 및 SEQ ID NO:40의 서열을 포함하는 VH를 갖는다.
[0019] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:39의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 VL, 및 SEQ ID NO:40의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 VH를 갖는다.
[0020] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드와 CD38-결합 도메인 사이의 제1 링커(linker)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 제1 링커는 단백질성(proteinaceous) 링커이고, 약 1 내지 약 40개의 아미노산일 수 있다. 일부 구체예들에서, 제1 링커는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함한다.
[0021] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:70-75 중 어느 하나의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제1 링커를 갖는다.
[0022] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 VH와 VL 사이에 제2 링커를 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 제2 링커는 서열 (Gly4Ser)n(SEQ ID NO:195)을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고, 일부 구체예들에서 n은 1이다.
[0023] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 그의 N-말단에서 C-말단으로 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드-제1 링커-VH-제2 링커-VL을 포함한다.
[0024] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 그의 N-말단에서 C-말단으로 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드-제1 링커-VL-제2 링커-VH를 포함한다.
[0025] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드를 갖는다.
[0026] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:45-69 중 어느 하나의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드를 갖는다.
[0027] 추가적 측면에서, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드가 SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는, 청구범위 제1항의 CD38-결합 융합 단백질에 있어서, VL이 SEQ ID NO:43의 서열을 포함하고, VH가 SEQ ID NO:44의 서열을 포함한다.
[0028] 추가적 측면에서, CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:79의 서열에 대해 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
[0029] 추가적 측면에서, 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질은 동종이량체(homodimer)이다. 일부 구체예들에서, 동종이량체는 2개의 동일한 폴리펩티드를 포함하고, 각각의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:79의 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 동종이량체는 2개의 동일한 폴리펩티드를 포함하고, 각각의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:79에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, CD38-결합 융합 단백질의 적어도 약 90%, 95%, 또는 98%는 동종이량체의 형태이다.
[0030] 일부 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질 및 제약상 허용되는 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)의 조성물(composition)을 제공한다.
[0031] 추가적 측면에서, 본 발명은 CD38-결합 융합 단백질을 코딩하는 핵산(nucleic acid), 뿐만 아니라 핵산을 포함하는 발현 벡터(expression vector), 및 본 명세서의 핵산 및/또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포(host cell)를 제공한다. 유사하게, 본 발명은 CD38-결합 융합 단백질이 발현되는 조건하에서 핵산 및/또는 발현 벡터로 숙주 세포를 배양하고 단백질을 회수하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 단백질은 CD38-결합 융합 단백질을 박테리아 단백질 L과 접촉시킴으로써 정제된다. 일부 경우에, 단백질 L은 수지(resin)에 접합될 수 있는 P. 마그누스(P. magnus)로부터 단리(isolated)되거나 유래(derived)된다.
[0032] 추가적 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질을 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 것을 포함하는, 다발성 골수종을 치료하는 방법을 제공한다.
VI. 도면의 간단한 설명
[0033] 도 1a-1b: 각각 하나 이상의 CD38 결합 영역 및 하나 이상의 시가 독소 A 서브유닛 이펙터를 포함하는 예시적인 CD38-표적화 분자의 개략도가 도 1a 및 도 1b에 제공된다. 도 1a에서, CD38 결합 영역은 일반적으로 링커에 의해 분리된 항-CD38 VH 및 VL 도메인을 포함하는 scFv이고, scFv는 시가 독소 성분에 대한 N- 또는 C-말단이다. 하나의 예시적인 CD38-표적화 분자에서, CD38 결합 영역은 scFv이고, scFv는 이웃하는 scFv와의 분자간 가변 도메인 교환에 참여하는 것으로 나타난다(도 1b, 왼쪽 하단). 도 1a-1b의 예시적인 분자의 묘사는 본 발명의 제한된 세트의 구체예들의 구조적 특징의 특정한 일반적인 배열을 예시하기 위한 것이다. 이들 예시적인 분자는 본 발명의 분자의 임의의 구조적 특징 및/또는 구성요소의 배열에 대해 완전히 결정적인 것으로 의도되지 않으며 그렇게 해석되어서도 안 된다는 것을 이해해야 한다. 도 1a-1b의 개략도에 도시된 상대적인 크기, 위치 또는 특징의 수는 단순화되었다. 도 1a-1b는 본 발명의 임의의 구체예에서 분자 구조의 상대적 크기에 관한 정보를 정확하게 묘사하도록 의도되지 않는다.
[0034] 도 2: 도 2는 51개의 CD38-표적화 분자의 풀에서 다양한 분자에 대하여 CD38 양성 H929 인간 골수종 세포에 대한 대표적인 CD50 값을 보여준다. CD38-표적 분자는 표시된 바와 같이 VH-VL 또는 VL-VH 방향 중 하나일 수 있다. 회색 사각형은 풀의 추가 구성원을 나타낸다. 1x103pM의 스크리닝 컷오프는 수직 파선으로 표시되며 왼쪽으로의 CD50 값은 컷오프보다 더 강력하고 오른쪽으로의 CD50 값은 컷오프보다 덜 강력하다. 이 분석에서 20,000pM 이하의 CD50을 나타내지 않은 시험된 52개의 분자 중 어느 하나도 도 2에 포함되지 않았다. 시험된 가장 강력한 분자 중 일부는 CD38 표적 분자 패밀리 #6 및 #7에 있었다.
[0035] 도 3a-3c: 도 3a-3c는 다양한 농도의 CD38-표적화 분자 #3 및 #4를 사용한 대표적인 세포독성 분석(cytotoxicity assays)을 보여준다. CD38-표적화 참조 분자(reference molecule) #1 및 표적화 도메인이 없는 시가 이펙터 폴리펩티드를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. CTM#3 및 CTM#4는 CD38 양성 H929 세포(도 3a) 및 MOLP-8 세포(도 3b)에 대해 농도 의존적 세포독성을 나타낸다. CD38-발현 세포에 대한 세포독성의 특이성(specificity)은 CD38 양성 H929 및 MOLP-8 세포에 대한 세포독성 활성(도 3a-3b)을 CD38 음성 U266 세포에 대한 세포독성 활성(도 3c)과 비교함으로써 조사되었다. CTM#3 및 CTM#4 모두 시험된 조건하에서 U266 세포에 대해 유의한(significant) 세포독성 활성을 나타내지 않았다(도 3c).
[0036] 도 4a-4b: 도 4a-4b는 인간 세포(도 4a) 또는 비인간 영장류(도 4b) 세포를 사용하여 시험한 CD38-표적화 분자 #1, #2, 및 #4에 대한 대표적인 세포독성 분석을 보여준다. BLCL-C162는 레서스(Rhesus) CD38을 발현하는 레서스 세포주이다. CD38-표적화 참조 분자 #1 및 표적화 도메인이 없는 시가 이펙터 폴리펩티드를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. CTM#1, CTM#2, 및 CTM#4는 CD38 양성 MOLP-8 세포(도 4a) 및 CD38 양성 BLCL-C162 세포(도 4b)에 대해 농도 의존적 세포 독성(concentration-dependent cytotoxicity)을 나타냈다. 레서스 및 사이노(cyno)에서 CD38의 서열은 동일하다.
[0037] 도 5: 도 5는 무세포 시험관내(in vitro) 단백질 번역 분석(protein translation assay)에서 CD38-표적화 분자 #4의 농도 의존적 단백질 합성 억제 활성을 나타낸다. 단백질 합성 억제는 본 명세서에 기술된 바와 같은 시가 독소의 한 활성이다. CD38-표적화 참조 분자 #1 및 표적화 도메인이 없는 시가 이펙터 폴리펩티드를 양성 대조군(positive control)으로 사용하였다. 상대 발광 단위(RLU)에 의해 측정된 루시페라제(Luciferase) 단백질 합성은 양성 대조군 참조 분자에 필적하는 CTM#4에 의해 농도 의존적 방식으로 감소되었다.
[0038] 도 6a-6b: 도 6a-6b에서, 재조합 인간 CD38 단백질(도 6a) 또는 재조합 시노몰구스(cynomolgus) CD38 단백질(도 6b)에 대한 CD38-표적화 분자(CTM#2, CTM#3, 및 CTM#4)의 결합 특성은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 결정되었다. 분자들 CD38-표적화 분자 #2(SEQ ID NO:77), CD38-표적화 분자 #3(SEQ ID NO:78), 및 CD38-표적화 분자 #4(SEQ ID NO:79)는 각각 인간 및 시노몰구스 CD38인 반면, CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)은 인간 CD38(도 6a)에 결합했지만 시노몰구스 CD38에는 결합하지 않았다(도 6b).
[0039] 도 7: 도 7은 CD38에 대한 3차원 단백질 구조 다이어그램, 및 인간 CD38 세포 외 도메인(human CD38 extracellular domain)을 사용한 에피토프 맵핑 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 결정된 CD38-표적화 분자 #4에 의한 결합을 위한 CD38의 중요한 잔기(residue)의 위치를 나타낸다. 도 7에서, 임계 표면 접근 가능한 접촉 잔기(critical surface accessible contact residues) F216 및 L262는 빨간색으로 표시되고, 임계 구조 잔기(critical structural residue) L124 및 L230은 보라색으로 표시되고, 디설파이드 쌍 C119/C201 및 C254/C275에 참여하는 임계 구조 잔기는 회색으로 표시된다.
[0040] 도 8a-8h: 도 8a-8h는 다라투무맙(daratumumab)의 존재하에 CD38-발현 세포에 대한 다양한 예시적 CD38-표적화 분자(CTM#1, CTM#2, CTM#4, CTM#7, 및 패밀리 #5의 CTM)의 세포독성 활성을 나타낸다. 인간 골수종 H929 세포(도 8a), 인간 림프종 ST486 세포(도 8b), 및 인간 다발성 골수종 MOLP-8 세포(도 8c)를 사용하여 0.5μg/mL의 CTM#1, CTM#7 또는 패밀리 #5의 CD38-표적화 분자의 희석 시리즈 다라투무맙으로 전처리된 CD38 양성 세포에 대한 세포독성 활성을 측정하였다. CD38 양성 인간 림프종 ST486 세포(도 8d), 인간 다발성 골수종 MOLP-8 세포(도 8e)를 이용하여 10㎍/mL의 다라투무맙을 전처리한 세포에 투여된 CTM#1, CTM#7 또는 패밀리 #5의 CTM 희석 시리즈의 세포독성 활성을 측정하였다. 인간 골수종 H929 세포 또는 인간 다발성 골수종 MOLP-8 세포를 사용하여 50㎍/mL 다라투무맙에 노출된 인간 CD38-발현 세포에 투여된 CTM#4 희석 시리즈의 세포독성 활성을 측정하였다(도 8f). 도 8g는 다라투무맙의 농도 시리즈에 노출되고 CTM#4 투여 48시간 후에 측정된 인간 골수종 MOLP-8 세포에 대한 CTM#4의 대표적인 CD50 값(nM)을 나타낸다. 도 8h는 CTM#4에 노출된 후 48시간에 다라투무맙의 농도 시리즈로 처리된 인간 다발성 골수종 MOLP-8 세포에 투여된 CTM#4의 희석 시리즈의 세포독성 활성 및 CD50 값(nM)을 보여준다. 도 8h에서, CTM#4에 대한 CD50 값(nM)은 하단 표에 특정 다라투무맙 농도(nM)에서 표시된다. CTM#4의 세포독성 활성은 다라투무맙의 존재하에 유지되었으며, 약 10,000nM 부근의 다라투무맙 농도에서 CD50 값의 약간의 이동이 있었다.
[0041] 도 9: 도 9는 12일에 걸쳐 6회 용량 동안 CD38-표적화 분자 #3 또는 CD38-표적화 분자 #4의 1mg/kg 체중(milligram per kilogram body weight)이 투여된 BALB/c 쥐의 시간 경과에 따른 체중 변화를 보여준다. CTM#3를 투여받은 쥐의 절반이 12일에 마지막 예정된 투여 전에 사망했기 때문에 CTM#3 그룹에 대한 투여는 12일 이전에 중단되었다.
[0042] 도 10: 도 10은 CTM#1, CTM#2 또는 CD38-표적화 참조 분자 #1이 투여된 쥐로부터 채취한 혈청 샘플에 적용된 용액내 ELISA 분석을 사용하여 측정한 혈청 항-약물 면역글로불린 G의 양을 탈면역화가 덜 이루어진 CD38-표적화 대조군 분자(SEQ ID NO:84)와 비교하여 보여준다. 쥐들에 각각 0.25mg/kg의 각각의 CD38-표적화 분자를 2주 동안 주 3회 투여한 다음 4주 및 5주차에 주 3회 추가로 5주 동안 총 12회 투여했다. 연구의 투여 단계 동안 및 투여가 종료된 후 상이한 시점에서 쥐 혈청을 수집하였다.
[0043] 도 11a-11d: 도 11a-11d는 인간 암의 생체 내 이종이식(xenograft) 쥐 모델에서 시간 경과에 따른 인간 종양 성장을 보여준다. 쥐들에 소량 및 다량의 CD38을 발현하는 인간 골수종 종양 세포(LP1 세포, 도 11a; H929 세포, 도 11b; MM1.S 세포, 도 11c; MOLP-8 세포, 도 11d)를 주사하고, CD38 표적 분자 #4 또는 비히클-전용(vehicle-only) 음성 대조군을 투여했다. 파란색은 비히클 전용 제어에 대한 측정값을 나타낸다. 다른 모든 데이터는 다양한 용량(예: 1.5, 3, 4.5, 5, 6, 9, 10, 또는 12mg/kg) 및 투여 일정(예: 주 2회, BIW; 주 1회, QW; 또는 격주, Q2W).
[0044] 도 12: 도 12a는 예시적인 CD38-표적화 분자로 치료를 받는 암의 파종 이종이식(disseminated xenograft) 쥐 모델에서 평균 생물발광 신호(mean bioluminescence signal)를 보여준다. 도 12a는 MM1.S-luc 파종(disseminated) 다발성 골수종 쥐 모델에서 평균 생물발광 신호를 보여준다. 도 12b는 이종이식 종양 세포에서 루시페라제 활성의 생물발광 영상을 사용하여 수집된 쥐의 이미지를 보여준다. 쥐 투여된 비히클은 전신 전체에 걸쳐 강한 신호만을 나타내는 반면, CD38-표적화 분자 #4(CTM #4)가 투여된 쥐는 이 방법으로는 검출 가능한 MM1.S-luc 종양 세포가 없는 것 같이 보인다. 10마리 중 10마리에서 완전한 종양 제거가 관찰되었다. 도 12c는 Daudi-luc 파종 이종이식 쥐 모델에서 평균 생물발광 신호를 나타낸다. 도 12c는 이종이식편 종양 세포에서 루시페라제 활성의 생물발광 영상을 사용하여 수집한 쥐의 이미지를 보여준다. 비히클만 투여된 쥐는 신체 전체에 광범위하게 강한 신호만을 나타내는 반면, CD38-표적화 참조 분자 #1이 투여된 쥐는 관련 연구일에 감소된 신호를 나타냈다.
[0045] 도 13: 도 13은 비변성 조건(non-denaturing conditions)하에 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC)에 의해 분석된 CTM#4의 샘플 제제에 존재하는 단백질 종의 크기 및 비율을 그래프로 나타낸다. SEC 분석을 위해 SEC 컬럼을 통과한 후 용출된 물질의 파장 280 나노미터(nm)에서 자외선(uv) 광의 흡광도를 용출시간(min) 대 밀리-흡수 단위(mAU) 플롯으로 나타내었다. 소프트웨어를 사용하여 280nm 트레이스의 개별 피크와 280nm에서 각 피크의 최대 자외선 흡광도의 용출 시간을 식별했다. 18.81분에 중심을 둔 피크(#2)는 1014개의 아미노산 잔기를 포함하고 이론 분자량이 약 110kDa인 CTM#4의 비공유 동종이량체 형태를 나타내고, 17.38분에 중심에 있는 피크(#1)는 하나 이상의 고분자량 종(예: CTM#4의 다량체(multimer)(들) 및/또는 집합체(aggregate)(들))을 나타낸다. 개별 피크의 순도는 해당 피크의 면적을 샘플의 총 피크 면적으로 나누어 계산할 수 있다. 약 25분 주위의 피크는 버퍼 용출로 인한 자외선 흡광도의 예상 신호를 나타낸다.
[0046] 도 14a-14b: 도 14a는 예를 들어, CTM #4와 같은 예시적인 CD38-표적화 분자의 개략도이다. CTM#4는 단백질성 링커를 통해 융합된 조작된 탈면역(DI) 시가 독소 서브유닛 A 이펙터 폴리펩티드(SLT-1A) 및 항-CD38 단일사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 연속 폴리펩티드를 포함한다. 도 14b는 예를 들어 CTM #4와 같은 예시적인 CD38-표적화 분자의 잠재적인 작용 기전을 보여주는 개략도로서, 세포-표면 CD38을 통한 CD38-발현 세포에 대한 특이적 결합, 이들 표적 세포 내로의 내재화; 엔도솜에서 골지체, 그리고 소포체, 그리고 세포질로의 역행 경로에서의 세포 내 샐프-라우팅; 그리고 일단 세포질에 들어오면 리보솜의 비가역적이며 효소적 불활성화가 표적 세포 사멸을 초래하는 것을 포함한다. CTM#4에 대한 이 추정되는 작용 기전은 환자의 면역 기능 상태와 무관하다.
[0047] 도 15: 도 15는 CTM #4가 1차 세포 배양에서 환자-유래 다발성 골수종 세포를 사멸시킨다는 것을 보여준다. 도 15는 6명의 다른 환자(010 , 011, 012, 013, 014 및 015)들로부터 BMA(bone marrow aspirate)로 얻은 다발성 골수종 세포 샘플(다라투무맙 내성 환자(#13)의 한 샘플을 포함)에 CTM #4의 농도(Conc) 시리즈 및 CTM #4의 CD50 값(nM)을 투여한 후 총 다발성 골수종 세포 생존율(%)을 보여준다. 도 15에서, 표의 중간 열은 환자 샘플에서 MM 세포에 대한 CD38 수용체 밀도를 보고한다. CTM #4 투여 후 48시간에 원발성 다발성 골수종(primary multiple myeloma) 세포에 대한 강력한 CTM #4 세포독성(예: CD50 값 3.5~8.5nM)이 광범위한 CD38 발현 수준(예: CD38 세포 표면 밀도 1.4~67.5 x 105 세포당 CD38 분자)에 걸쳐 관찰되었다.
[0048] 도 16: 도 16은 시험관내에서 CTM#4를 인간 다발성 골수종 세포에 투여한 후 Real Time Glo 분석을 사용하여 측정된 세포 생존력(cell viability)의 시간 경과 연구 결과를 보여준다. 도 16은 시간 경과에 따른 다발성 골수종 세포 패널(ANBL-6, NCI-H929, RMPI-8226, 및 MOLP-8) 및 비다발성 골수종 대조군 세포주(HCT116)에서 서로 다른 세포 유형에 걸친 CTM# 4 CD50 값(ng/mL)을 보여준다. 도 16에서, 표는 하단 2개 라인(CTM#4 또는 CD38TM4)의 CD50 값(pM)을 보고한다. 도 16에서, 표는 세포 표면 CD38의 발현 수준을 보고하고 CD38 발현 라인에서 값을 높음 또는 중간으로 특성화한다.
[0049] 도 17: 도 17은 쥐에 인간 다발성 골수종 MM1.S 세포를 접종하여 파종성 이종이식편을 형성하고 CTM#4로 처리한 후 종양 부피의 시간 경과를 나타낸다. 쥐를 CTM#4로 일주일에 한 번(QW) 또는 격주로(Q2W) 치료하고, 선택적으로 미국에서 다발성 골수종에 대한 현재 표준 치료(SOC)와 함께 공동 치료하였다.
[0050] 도 18a-18b: 도 18a-18b는 CTM#4의 희석 시리즈를 투여한 후 인간 전혈(좌측 패널) 및 시노몰구스 원숭이 전혈에서 총 자연 살해(NK) 세포 수의 유세포 분석을 사용한 생체 외 분석을 보여준다. 이 분석에서 NK 집단(CD50)의 절반을 제거하도록 계산된 CTM#4의 농도가 표시된다.
[0051] 도 19: 도 19는 CTM#4 투여에 대한 인간 다발성 골수종 ANBL-6 세포의 용량-반응 곡선 및 결과의 표 요약을 나타낸다. ANBL-6 세포를 48시간 또는 72시간 동안 CTM#4와 함께 연속적으로 배양하거나 CTM#4에 2시간 동안 노출시키고 세척하고 48시간 또는 72시간 시점까지 CTM#4가 없는 배지에 보관했다. 도 19는 시험된 4가지 조건에 대한 CTM#4 내지 ANBL-6 세포에 대한 CD50 값을 나타낸다: 48시간 시점에서 - 세척이 없는 0.03nM 및 2시간 세척의 경우에 대한 0.16nM; 72시간 시점에서 0.01nM(세척 없음) 및 0.1nM(2시간 세척).
[0052] 도 20: 도 20은 재발성 및/또는 불응성 다발성 골수종(RRMM)을 갖는 것으로 분류된 환자에 대한 CTM#4 단일요법 임상 연구의 제1 단계의 설계를 보여주는 개략도이다. 연구 설계는 용량 증량 단계(파트 1)와 확장 단계(파트 2)로 구성된다. 두 부분 모두에서 환자는 진행성 질환(PD), 허용할 수 없는 독성 또는 중단이 될 때까지 치료된다.
[0053] 도 21: 도 21은 CTM#4 단일요법 임상 연구를 위한 투여 계획을 예시하는 개략도이다. 용량 증량은 50㎍/kg CTM#4에서 시작한 다음 도 21에 도시된 바와 같이 진행될 것인데, 치료 주기 1에서 관찰된 용량-제한 독성(DLT)의 수에 따른 것이다. 50μg/kg 용량의 평가 후, 후속 용량 증량 및 최대 허용 용량(MTD) 결정은 사용 가능한 다른 비-DLT-안전성, 임상 효능, 약동학(PK) 및 약력학(PD) 데이터의 고려와 함께 과다 용량 제어가 포함된 베이지안 로지스틱 회귀 모델(BLRM)에 의해 알려질 것이다.
[0054] 도 22a-22b: 도 22a는 CTM#4 단일요법 임상 연구의 1차 및 2차 목표를 나열하고, 도 22b는 그 탐색적 목적을 나열한다.
[0055] 도 23a-23d: 도 23a 및 23b는 항-CD38 항체 다라투무맙, HB-7, AT13-5 및 OKT-10의 존재하에 CD38-발현 MOLP-8 세포에 대한 CD38 결합 단백질(CD38 표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83) 포함)의 결합을 나타낸다. 도 23c는 CD38-발현 MOLP-8 세포에 대한 CD38 결합 단백질(CD38 표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83) 포함)의 경쟁적 결합을 나타낸다. 모든 신호는 유세포 분석에 의해 검출되었다. 도 23d는 항-CD38 항체 다라투무맙, HB-7, AT13-5, OKT-10, 및 항-CD38 결합 scFv(첫 번째 왼쪽 열)의 존재하에 CD38 결합 단백질(상단 행)의 결합을 요약한 표이다. 도 23a-d에 사용된 바와 같이, CD38TM1-융합 단백질은 SEQ ID NO:228의 아미노산 서열을 포함하는 CD38-결합 융합 단백질을 의미하고; CD38TM2-융합 단백질은 SEQ ID NO:229의 서열을 포함하는 CD38-결합 융합 단백질을 의미하고; CD38TM3-융합 단백질은 SEQ ID NO:230의 서열을 포함하는 CD38-결합 융합 단백질을 의미한다.
[0056] 도 24a 및 24b는 각각 IMAC 컬럼 및 단백질 L(Pro-L) 컬럼에 의한 CTM #3 및 CTM #4의 정제를 나타낸다. MW 마커는 분자량 마커의 위치를 나타낸다. CD38TM3의 VH 및 VL은 표준 단클론항체 정제 수지(단백질 A 또는 단백질 L)에 결합하지 않으며, His-tag 및 IMAC 컬럼을 이용하여 정제하였다(도 24a). 정제를 용이하게 하기 위해 람다(Lambda) 경쇄인 CD38TM3의 경쇄를 프레임워크 돌연변이로 변형하여 Protein L에 결합할 수 있도록 하여 추가적인 태그(tag) 없이 친화성 정제가 가능하도록 하였다. 결과적으로 생성된 CD38TM4는 단백질 L에 결합할 수 있으므로 단백질 L 친화도에 의해 정제될 수 있다.
[0057] 도 25a-25d: 도 25a-25d는 CD38-표적화 분자의 성분으로서 사용하기에 적합한 다양한 예시적인 CD38-표적화 모이어티의 서열을 보여준다. 도 25a는 CD38-결합 영역 패밀리 #1 및 CD38-결합 단백질 #1(CD38TM1)에 대한 서열을 제공한다. 도 25b는 CD38-결합 영역 패밀리 #2 및 CD38-결합 단백질 #2(CD38TM2)에 대한 서열을 제공한다. 도 25c는 CD38-결합 영역 패밀리 #3 및 CD38-표적화 모이어티 #3(CD38TM3)에 대한 서열을 제공한다. 도 25d는 CD38-결합 영역 패밀리 #3 및 CD38-표적화 모이어티 #4(CD38TM4)에 대한 서열을 제공한다. 도 25d에 도시된 바와 같이. CD38TM3 VL 도메인의 처음 21개 아미노산은 CD38TM4의 VL 도메인을 유도하기 위한 카파 경쇄인 CD38TR1의 VL 도메인의 처음 22개 아미노산으로 대체되었다. CDR 서열에 밑줄이 그어져 있다.
[0058] 도 26: 도 26은 각각 N-말단에서 C-말단까지 VH-GGGGS-VL을 포함하는 2개의 동일한 scFv에 의해 형성된 디아바디(diabody)의 X-선 구조의 예시를 나타내며, 여기서 VH 및 VL은 CD38TM4에서 유래한다. 한 scFv 사슬(사슬 A)의 VH는 다른 scFv 사슬(사슬 B)의 VL과 복합체를 형성하여 CD38 결합 도메인을 형성한다.
VII. 발명의 상세한 설명
[0059] 본 발명은 CD38-결합 단백질, 및 이의 조성물의 다양한 구체예를 제공하며, 여기서 각각의 CD38-결합 단백질은 다음을 포함한다: (1) 시가 독소 패밀리의 하나 이상의 구성원의 A 서브유닛으로부터 유래된 하나 이상의 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및 (2) 하기 기재된 바와 같이, 선택적으로 링커와 함께, CD38 분자의 세포 외 부분(extracellular part)에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 CD38-결합 영역. 본 발명의 각각의 CD38-결합 단백질에 대해, 적어도 하나의 결합 영역은 예를 들어 면역글로불린-유형 결합 영역과 같은 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드에 대해 이종성(heterologous)이다.
[0060] A. 정의
[0061] 본 발명의 이들 및 다른 특징, 측면 및 이점은 다음의 설명, 첨부된 청구범위 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 전술한 요소들은 본 발명의 다른 실시예를 만들기 위해 이하에서 그러한 결합 또는 제거에 반대하는 어떠한 언급 없이 개별적으로 결합되거나 자유롭게 제거될 수 있다.
[0062] 본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해 일부 용어를 아래에 정의한다. 추가 정의는 본 발명의 상세한 설명에서 찾을 수 있다.
[0063] 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 용어 "a", "an", 및 "the"는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수 지시 대상을 모두 포함한다.
[0064] 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 A 및 B의 두 종을 언급할 때 A 및 B 중 적어도 하나를 의미한다. 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 용어 "및/또는"은 A, B, 및 C와 같은 2종 초과를 언급할 때 A, B, 또는 C 중 적어도 하나, 또는 그 임의의 조합 중 적어도 하나를 의미한다(각 종은 단일 또는 다중의 가능성).
[0065] "아미노산 잔기(amino acid residue)" 또는 "아미노산(amino acid)"이라는 용어는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 통합되는 아미노산에 대한 언급을 포함한다. 용어 "폴리펩티드(polypeptide)"는 아미노산 또는 아미노산 잔기의 임의의 중합체(polymer)를 포함한다. "폴리펩티드 서열(polypeptide sequence)"이라는 용어는 폴리펩티드를 물리적으로 포함하는 일련의 아미노산 또는 아미노산 잔기를 지칭한다.
[0066] "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 "사슬(chain)"을 포함하는 거대분자이다. 예를 들어, 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 단백질이 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 구체예에서, 단백질의 폴리펩티드는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 단백질은 단량체 또는 이량체, 삼량체, 사량체 등과 같은 다량체일 수 있다.
[0067] "펩티드(peptide)"는 총 약 15 내지 20개의 아미노산 잔기보다 작은 크기의 작은 폴리펩티드이다. "아미노산 서열(amino acid sequence)"이라는 용어는 길이에 따라 펩티드 또는 폴리펩티드를 물리적으로 포함하는 일련의 아미노산 또는 아미노산 잔기를 의미한다. 때때로 본 명세서에서 사용된 "잔기(residue)"는 단백질 내의 위치 및 그의 관련 아미노산 동일성(identity)을 나타내는 것을 의미한다. 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 및 단백질 서열은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로의 순서를 나타내는 왼쪽에서 오른쪽으로 작성된다.
[0068] 용어 "아미노산", "아미노산 잔기", "아미노산 서열" 또는 폴리펩티드 서열은 천연발생 아미노산(L 및 D 이성질체(isosteriomer) 포함)을 포함하고, 달리 제한되지 않는 한 셀레노시스테인, 피롤리신, N-포르밀메티오닌, 감마-카르복시글루타메이트, 히드록시프롤린히푸신, 피로글루탐산 및 셀레노메티오닌과 같은 천연발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능할 수 있는 천연적 아미노산의 알려진 아날로그(analog)들을 또한 포함한다.
[0069] 본 명세서에서 "변형(modification)"은 폴리펩티드 서열의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실(substitution, insertion, and/or deletion) 또는 단백질에 화학적으로 연결된 모이어티(moiety)에 대한 변경(alteration)을 의미한다. 예를 들어, 변형은 단백질에 부착된 변경된 탄수화물 또는 PEG 구조일 수 있다. 본 명세서에서 "아미노산 변형(amino acid modification)"은 폴리펩티드 서열에서 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 의미한다. 명확성을 위해, 달리 언급되지 않는 한, 아미노산 변형은, 예를 들어, DNA와 RNA에 코돈이 있는 20개의 아미노산과 같이 항상 DNA에 의해 암호화된 아미노산에 대한 것이다.
[0070] 본 명세서에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩티드 서열(parent polypeptide sequence)의 특정 위치에 있는 아미노산을 상이한 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 특히, 일부 구체예들에서, 치환은 특정 위치에서 자연적으로 발생하지 않거나 유기체 내에서 또는 임의의 유기체에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산으로의 치환이다. 예를 들어, 치환 N297A는 위치 297의 아스파라긴이 알라닌으로 대체된 변이체 폴리펩티드, 이 경우 Fc 변이체를 의미한다. 명확성을 위해, 핵산 코딩 서열을 변경하지만 시작 아미노산은 변경하지 않도록 조작된 단백질(예를 들어, 숙주 유기체 발현 수준을 증가시키기 위해 CGG(아르기닌 인코딩)를 CGA(역시 아르기닌 인코딩)로 교환하는 것)은 "아미노산 치환"이 아니다. 즉, 동일한 단백질을 코딩하는 새로운 유전자가 생성되었음에도 불구하고 단백질이 시작된 특정 위치에 동일한 아미노산이 있으면 아미노산 치환이 아니다.
[0071] 펩티드, 펩티드 영역, 폴리펩티드 영역, 단백질 또는 분자의 아미노산 잔기에 관한 "보존적 치환(conservative substitution)"이라는 어구는 펩티드, 펩티드 영역, 폴리펩티드 영역, 단백질 또는 분자의 전체 펩티드, 펩티드 영역, 폴리펩티드 영역, 단백질 또는 분자의 기능 및 구조를 실질적으로 변경하지 않는 아미노산 조성의 변화를 의미한다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (WH Freeman and Company, New York (2nd ed., 1992)).
[0072] 본 명세서에 사용된 "아미노산 삽입(amino acid insertion)" 또는 "삽입(insertion)"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 아미노산 서열을 추가하는 것을 의미한다. 예를 들어, -233E 또는 233E는 위치 233 뒤와 위치 234 이전에 글루탐산 삽입을 지정한다. 또한 233ADE 또는 A233ADE는 위치 233 뒤와 위치 234 이전에 AlaAspGlu 삽입을 지정한다.
[0073] 본 명세서에 사용된 "아미노산 결실(amino acid deletion)" 또는 "결실(deletion)"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산 서열의 제거를 의미한다. 예를 들어, E233- 또는 E233#, E233() 또는 E233del은 위치 233에서 글루탐산의 결실을 지정한다. 추가로, EDA233- 또는 EDA233#은 위치 233에서 시작하는 서열 GluAspAla의 결실을 지정한다.
[0074] 본 명세서에 사용된 "단백질"은 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드를 포함하는 적어도 2개의 공유적으로 부착된 아미노산을 의미한다. 펩티딜 기(peptidyl group)는 천연 발생 아미노산 및 펩티드 결합, 또는 합성 펩티드 모방 구조, 즉 펩토이드와 같은 아날로그(analog)를 포함한다(Simon et al., PNAS USA 89(20):9367(1992), 전체가 참고로 포함됨). 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 아미노산은 자연 발생 또는 합성일 수 있다(예: DNA에 의해 인코딩되는 아미노산이 아님). 예를 들어, 호모-페닐알라닌, 시트룰린, 오르니틴 및 노르류신은 본 발명의 목적상 합성 아미노산으로 간주되며, D- 및 L-(R 또는 S) 구성 아미노산이 모두 사용될 수 있다. 본 발명의 변이체는 예를 들어 Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet에 의해 기술된 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 Schultz 및 동료에 의해 개발된 기술을 사용하여 통합된 합성 아미노산의 사용을 포함하는 변형을 포함할 수 있다(20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3, 및 Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7, 모두 전체가 참고로 포함됨.) 또한, 폴리펩티드는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글리코실화, PEG화(PEGylation), 원형 순열, 고리화, 다른 분자에 대한 링커, 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 융합, 및 펩티드 태그 또는 표지의 추가를 포함할 수 있다.
[0075] 본 명세서에서 "야생형(wild type) 또는 WT"는 대립형질 변이를 포함하여 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. WT 단백질은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
[0076] 본 명세서에 사용된 "변이체 단백질(variant protein)" 또는 "단백질 변이체", 또는 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 모 단백질의 것과 상이한 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 단백질 자체, 단백질을 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 아미노 서열을 지칭할 수 있다. 일부 구체예들에서, 단백질 변이체는 모 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는다. 예로서, 모체와 비교하여 약 1 내지 약 70개의 아미노산 변형, 및 일부 구체예에서 약 1 내지 약 5개의 아미노산 변형과 같은 변형을 들 수 있다. 하기에 기재된 바와 같이, 일부 구체예에서 모 폴리펩티드, 예를 들어 Fc 모 폴리펩티드는 인간 야생형 서열, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터의 Fc 영역이지만, 변이체를 갖는 인간 서열은 또한 "모 폴리펩티드(parent polypeptide)"로서 작용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 단백질 변이체 서열은 모 단백질 서열과 적어도 약 80%의 동일성을 가질 것이고, 일부 구체예에서 모 단백질 서열과 적어도 약 90%의 동일성, 적어도 약 95%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 가질 것이다. 변이체 단백질은 변이체 단백질 자체, 단백질 변이체를 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 DNA 서열을 지칭할 수 있다.
[0077] 본 명세서에서 "항원 결합 도메인(antigen binding domain)" 또는 "ABD"는 폴리펩티드 서열의 일부로서 존재할 때 본 명세서에 기재된 바와 같이 표적 항원에 특이적으로 결합하는 6개의 상보적 결정 영역(CDR)의 세트를 의미한다. 따라서, "항-CD38 항원 결합 도메인(anti-CD38 antigen binding domain)"은 본 명세서에 개괄된 바와 같이 CD38 항원에 결합한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이들 CDR은 일반적으로 제1 세트의 가변 중쇄 CDR(vhCDR 또는 VHCDR) 및 제2 세트의 가변 경쇄 CDR(vlCDR 또는 VLCDR)로서 존재하며, 각각은 3개의 CDR을 포함한다: 중쇄에 대한 vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 및 경쇄에 대한 vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3. 당업계에서 이해되는 바와 같이, CDR은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 각각에서 프레임워크 영역에 의해 분리된다: 경가변 영역(light variable region )의 경우, 이들은 (VL)FR1-vlCDR1-(VL)FR2-vlCDR2-(VL) FR3-vlCDR3-(VL)FR4, 및 중가변 영역(heavy variable region)의 경우, 이들은 (VH)FR1-vhCDR1-(VH)FR2-vhCDR2-(VH)FR3-vhCDR3-(VH)FR4이다.
[0078] 본 발명의 항원 결합 도메인은 다수의 형식, 예를 들어 Fab, Fv 및 scFv로 구현될 수 있다. "Fab" 형식에서 6개의 CDR 세트는 2개의 상이한 폴리펩티드 서열, 즉 중가변 영역(vh 또는 VH; vhCDR1, vhCDR2, 및 vhCDR3 포함) 및 경가변 영역(vl 또는 VL; vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3 포함)에 의해 기여되며, VH의 C-말단은 중쇄의 CH1 도메인의 N-말단에 부착되고 VL의 C-말단은 불변 경쇄 도메인의 N-말단에 부착된다(따라서 경쇄를 형성함). 중가변 영역 및 경가변 영역은 함께 Fv를 형성하며, 이는 본 명세서에 개략된 바와 같이 scFv 또는 Fab일 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 항원 결합 도메인의 6개의 CDR은 VH 및 VL에 의해 기여된다. scFv 형식에서, VH 및 VL은 (N-말단에서 시작하여) VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH일 수 있는 단일 폴리펩티드 서열에 일반적으로 본 명세서에 개략된 링커의 사용을 통해 공유적으로 부착된다.
[0079] 본 명세서에 사용된 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 VH, CH1, VL, 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Fab는 이 영역을 분리하여 지칭하거나 전장 항체(full-length antibody) 또는 항체 단편(antibody fragment)과 관련하여 이 영역을 지칭할 수 있다.
[0080] 본 명세서에 사용된 "Fv" 또는 "Fv 단편" 또는 "Fv 영역"은 단일 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이들은 2개의 도메인, 가변 중 도메인(variable heavy domain) 및 가변 경 도메인(variable light domain)으로 구성된다.
[0081] 본 명세서에서 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 일반적으로 본 명세서에 기재된 scFv 링커를 사용하여 가변 경 도메인에 공유 부착되어 scFv 또는 scFv 도메인을 형성하는 가변 중 도메인을 의미한다. scFv 도메인은 N-말단에서 C-말단으로(vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh) 어느 방향 중 하나일 수 있다. 일반적으로, 링커는 당업계에 일반적으로 알려져 있고 위에서 설명된 scFv 링커이다.
[0082] 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 예를 들어 온전한(intact) 면역글로불린 또는 면역글로불린의 항원 결합 부분 또는 면역글로불린과 관련되거나 면역글로불린으로부터 유래된 항원 결합 단백질을 포함한다. 온전한 항체 구조 단위는 종종 사량체(tetramer) 단백질을 포함한다. 각 사량체는 일반적으로 두 개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(일반적으로 약 25kDa의 분자량을 가짐)와 하나의 "중쇄"(일반적으로 약 50-70kDa의 분자량을 가짐)를 가지고 있다. 인간 면역글로불린 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄를 갖는 것으로 분류될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명은 일반적으로 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 하위 클래스들을 갖는 IgG 클래스에 일반적으로 바탕을 둔 항원결합 도메인(예: 항체 중쇄 및/또는 경쇄)을 포함하는 항체 구조를 제공한다. 일반적으로, IgG1은 356(D 또는 E), IgG2 및 358(L 또는 M)에서 다형성(polymorphism)을 갖는 서로 다른 알로타입(allotype)을 가지고 있다. 여기에 묘사된 서열은 356D/358M 알로타입을 사용하지만, 다른 알로타입이 여기에 포함된다. 즉, 본 명세서에 포함된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 임의의 서열은 356D/358M 알로타입을 대체하는 356E/358L을 가질 수 있다. IgG4는 IgG3보다 더 자주 사용된다.
[0083] IgG1은 356(D 또는 E) 및 358(L 또는 M)에서 다형성을 갖는 서로 다른 알로타입을 갖는다는 점에 유의해야 한다. 여기에 묘사된 서열은 356D/358M 알로타입을 사용하지만, 다른 알로타입이 여기에 포함된다. 즉, 본 명세서에 포함된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 임의의 서열은 356D/358M 알로타입을 대체하는 356E/358L을 가질 수 있다.
[0084] 따라서, 본 명세서에 사용된 "아이소타입(isotype)"은 그 불변 영역의 화학적 및 항원 특성에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 하위 클래스를 의미한다. 본 명세서에 사용된 "IgG 하위클래스 변형" 또는 "아이소타입 변형"은 하나의 IgG 아이소타입의 하나의 아미노산을 상이한 정렬된 IgG 아이소타입의 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG1은 EU 위치 296에서 티로신을 포함하고 IgG2는 페닐알라닌을 포함하기 때문에 IgG2의 F296Y 치환은 IgG 하위클래스 변형으로 간주된다. 유사하게, IgG1은 위치 241에 프롤린이 있고 IgG4에는 세린이 있기 때문에 S241P가 있는 IgG4 분자는 IgG 하위클래스 변형으로 간주된다. 하위클래스 변형은 여기에서 아미노산 치환으로 간주된다는 점에 유의해야 한다.
[0085] 본 명세서에 사용된 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인(예를 들어, CH1) 및 일부 경우에 힌지의 일부를 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. IgG의 경우, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3(Cγ2 및 Cγ3) 및 CH1(Cγ1)과 CH2(Cγ2) 사이의 하부 힌지 영역을 포함한다. Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 카르복실 말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 따라서, IgG의 맥락에서 "CH" 도메인은 다음과 같다: "CH1"은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른 위치 118-215를 나타낸다. "힌지"는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른 위치 216-230을 나타낸다. "CH2"는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른 위치 231-340을 나타내고, "CH3"은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따라 위치 341-447을 나타낸다. 따라서, "Fc 도메인"은 -CH2-CH3 도메인, 및 선택적으로 힌지 도메인(힌지-CH2-CH3)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 하기에 보다 완전하게 기재된 바와 같이, 예를 들어 하나 이상의 Fc?R 수용체 또는 FcRn 수용체에 대한 결합을 변경시키기 위해 Fc 영역에 아미노산 변형이 이루어진다.
[0086] 본 명세서에서 "중불변 영역(heavy constant region)"은 인간 IgG 항체의 CH1-힌지-CH2-CH3 부분을 의미한다.
[0087] "경불변 영역(light constant region)"은 카파 또는 람다의 CL 도메인을 의미한다.
[0088] 본 명세서에 사용된 "가변 도메인(variable domain)"은 Vκ(V.카파), Vλ(V.람다), 및/또는 각각 카파, 람다 및 중쇄 면역글로불린 유전자 좌(genetic loci)를 구성하는 VH 유전자의 임의의 것에 의해 실질적으로 인코딩되는 하나 이상의 Ig 도메인을 포함한다. 따라서 "가변 중 도메인"은 (VH)FR1-vhCDR1-(VH)FR2-vhCDR2-(VH)FR3-vhCDR3-(VH)FR4를 포함하고 "가변경 도메인"은 (VL)FR1-vlCDR1-(VL)FR2-vlCDR2-(VL)FR3-vlCDR3-(VL)FR4를 포함한다.
[0089] 각 사슬의 아미노-말단 부분은 일반적으로 당업계 및 본 명세서에서 "Fv 도메인" 또는 "Fv 영역"으로 지칭되는 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 가변영역에서는 중쇄 및 경쇄의 V 도메인 각각에 대해 3개의 루프가 모여 항원 결합 부위를 형성한다. 각각의 루프는 아미노산 서열의 변이가 가장 중요한 상보성 결정 영역(이하 "CDR"이라 함)으로 지칭된다. "가변(variable)"은 가변 영역의 일부 세그먼트(segment)가 항체들 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 의미한다. 가변 영역 내의 변동성은 고르게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 각각 9-15개 아미노산 길이 또는 더 긴 "초가변 영역(hypervariable region)"이라고 하는 극도의 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 상대적 불변 스트레치(invariant stretch)로 구성된다.
[0090] 각각의 VH 및 VL은 3개의 초가변 영역("상보적 결정 영역", "CDR")과 4개의 FR로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 다음 순서로 배열된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3 -FR4.
[0091] 초가변 영역은 일반적으로 경쇄 가변 영역의 약 아미노산 잔기 23-24(LCDR1; "L"은 경쇄를 나타냄), 50-56번(LCDR2) 및 89-97번(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역에서 약 31-35B(HCDR1; "H"는 중쇄를 나타냄), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)(Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); 및/또는 초가변 루프를 형성하는 잔기(예: 경쇄 가변 영역에서 잔기 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) 및 91-96 (LCDR3), 및 중쇄 가변 영역에서 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) 및 96-101 (HCDR3) (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)를 포괄한다. 본 발명의 특정 CDR은 하기에 기재되어 있다.
[0092] 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템 사이에서 상이할 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 서열의 발명은 관련(고유) CDR의 발명을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 각각의 가변 중 영역의 발명은 vhCDR(예: vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)의 발명이고, 각 가변 경 영역의 발명은 vlCDR(예: vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)의 발명이다.
[0093] CDR 넘버링의 유용한 비교는 아래와 같다(참조: Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003))
[0094]
표 1. 항체 CDR 명명법
Kabat +
Chothia		 IMGT Kabat AbM Chothia Contact
vhCDR1 26-35 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
vhCDR2 50-65 56-65 50-65 50-58 52-56 47-58
vhCDR3 95-102 105-117 95-102 95-102 95-102 93-101
vlCDR1 24-34 27-38 24-34 24-34 24-34 30-36
vlCDR2 50-56 56-65 50-56 50-56 50-56 46-55
vlCDR3 89-97 105-117 89-97 89-97 89-97 89-96
[0095] 본 명세서에서 가변 도메인 내의 잔기(대략적으로, 경쇄 가변영역의 잔기 1-107 및 중쇄 가변영역의 잔기 1-113) 및 Fc 영역에 대한 EU 넘버링을 언급할 때 Kabat 넘버링 시스템이 일반적으로 사용된다(예를 들어, Kabat et al., supra (1991)).
[0096] 본 발명은 다수의 상이한 CDR 세트를 제공한다. 이 경우, "전체 CDR 세트"는 3개의 가변 경 및 3개의 가변 중 CDR, 예를 들어 vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2, 및 vhCDR3을 포함한다. 이들은 각각 더 큰 가변 경 또는 가변 중 도메인의 일부일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 보다 완전하게 개괄된 바와 같이, 가변 중 및 가변 경 도메인은 중쇄 및 경쇄가 사용되는 경우(예를 들어 Fab가 사용되는 경우) 별도의 폴리펩티드 사슬상에 있을 수 있고, 또는 scFv 서열의 경우 단일 폴리펩티드 사슬상에 있을 수 있다.
[0097] CDR은 항원 결합, 또는 보다 구체적으로 항체의 에피토프 결합 부위의 형성에 기여한다.
[0098] "에피토프(epitope)"는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특정 항원 결합 부위와 상호작용하는 결정인자(determinant)를 지칭한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 그룹이며 일반적으로 특정 구조적 특성과 특정 전하 특성을 가지고 있다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 에피토프는 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기(에피토프의 면역우성 성분이라고도 함) 및 특이적으로 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기와 같이 결합에 직접적으로 관여하지 않는 기타 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 다시 말해서, 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트(footprint) 내에 있다. 에피토프는 형태적(conformational)이거나 선형(linear)일 수 있다. 형태적 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 다른 부분에서 공간적으로 병치된(juxtaposed) 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬의 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성되는 에피토프이다. 형태적 및 비형태적 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매(denaturing solvent)의 존재하에 손실되지 않고 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별될 수 있다.
[0099] 특정 항원 또는 에피토프에 "특이적 결합(specific binding)" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "…에 대해 특이적이다"는 비-특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.
[00100] 본 명세서에서 사용된 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호 작용의 결합 속도(association rate)를 의미하는 반면, 본 명세서에서 사용되는 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도(dissociation rate)를 의미하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용된 용어 "KD"는 KD 대 Ka의 비(즉, KD/Ka)로부터 수득되고 몰 농도(molar concentration; M)로 표현되는 해리 상수를 지칭하도록 의도된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용함으로써, 예를 들어 BIACORE® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용함으로써이다. 일부 구체예들에서, 항체의 KD는 "Bio-Layer Interferometry"에 의해 결정된다. 일부 구체예들에서, KD는 항원-발현 세포를 이용한 유세포 분석(cytometry)을 사용하여 측정된다. 일부 구체예들에서, KD 값은 고정된(immobilized) 항원으로 측정된다. 다른 구체예에서, KD 값은 고정된 항체(예를 들어, 모 쥐 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체 변이체)로 측정된다. 일부 구체예들에서, KD 값은 2가 결합 방식(bivalent binding mode)에서 측정된다. 다른 구체예에서, KD 값은 1가 결합 방식(monovalent binding mode)에서 측정된다. 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어 항원 또는 에피토프에 대한 KD가 적어도 약 10-7M, 적어도 약 10-8M, 적어도 약 10-9M, 적어도 약 10-10M, 적어도 약 10-11M, 적어도 약 10-12M, 적어도 약 10-13M, 적어도 약 10-14M인 항체에 의해 시현될 수 있다. 전형적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프에 비해 상대적으로 대조군 분자에 대해 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000- 또는 그 이상 더 큰 KD를 가질 것이다.
[00101] 단백질 서열에 대한 "퍼센트 아미노산 서열 동일성(Percent (%) amino acid sequence identity)"은, 필요하면 최대 퍼센트 서열 동일성을 획득하기 위해 그리고 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환을 고려하지 않고 서열을 정렬하고 간격(gap)을 도입한 후 특정 (모) 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬(Alignment)은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 하나의 특정 프로그램은 "US Pre-Grant Pub. No. 20160244525"의 단락 [0279]에서 [0280]에 요약된 ALIGN-2 프로그램이며, 참조로 본 명세서에 포함된다. 핵산 서열에 대한 또 다른 대략적인 정렬은 "Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981)"의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 "Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA"에 의해 개발되고 "Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)"에 의해 정규화된 스코어링 매트릭스를 사용하여 아미노산 서열에 적용할 수 있다.
[00102] 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 이 알고리즘의 구현예는 "BestFit" 유틸리티 애플리케이션의 Genetics Computer Group(Madison, WI)에 의해 제공된다. 이 방법에 대한 기본 매개변수는 "Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8(1995)"(Genetics Computer Group, Madison, WI로부터 입수 가능)에 기술되어 있다. 본 발명의 맥락에서 퍼센트 동일성을 설정하는 또 다른 방법은 "John F. Collins and Shane S. Sturrok, and distributed by IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)"에 의해 개발되고 에딘버러 대학이 저작권을 가지고 있는 MPSRCH 프로그램 패키지를 사용하는 것이다. 이 패키지 모음에서 기본 매개변수가 스코어링 테이블에 사용되는 경우 Smith-Waterman 알고리즘을 사용할 수 있다(예: 갭 개방 패널티 12, 갭 확장 패널티 1, 갭 6). 생성된 데이터에서 "일치(match)" 값은 "서열 동일성(sequence identity)"을 반영한다. 서열 간의 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 다른 정렬 프로그램은 기본 매개변수와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 다음 기본 매개변수를 사용하여 사용할 수 있다: genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. 이 프로그램에 대한 자세한 내용은 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 앞에 http://를 입력하면 인터넷 주소에서 찾을 수 있다.
[00103] 본 발명의 아미노산 서열("발명 서열")과 모 아미노산 서열 사이의 동일성 정도는 두 서열의 정렬에서 정확히 일치하는 수를 "발명 서열"의 길이로 나눈 값, 또는 모 상위 서열의 길이 중 가장 짧은 것으로 나누어 계산된다. 결과는 퍼센트 동일성으로 표시된다.
[00104] 용어 "핵산(nucleic acid)"은 단일 가닥, 이중 가닥, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 형태로 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 포함한다. "뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)"이라는 용어는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 또는 단일 가닥 형태의 핵산의 폴리뉴클레오티드의 순서를 포함한다.
[00105] 본 명세서에 사용된 용어 "프로모터(promoter)"는 원하는 분자를 인코딩하는 핵산 서열과 같이 전사될(transcribed) 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 포함한다. 프로모터는 일반적으로 전사될 핵산 서열의 업스트림(upstream)에 위치하며 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 인자에 의한 특이적 결합 부위를 제공한다.
[00106] "벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 컨스트럭트(vector construct)", "발현 벡터(expression vector)" 및 "유전자 전달 벡터(gene transfer vector)"는 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 컨스트럭트를 의미하며, 이는 벡터의 전체 또는 일부의 게놈 통합 또는 염색체외 요소로서 벡터의 일시적 또는 유전 가능한 유지에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 이 용어는 클로닝(cloning), 발현 비히클(expression vehicles), 통합 벡터(integrating vectors)를 포함한다.
[00107] 본 명세서에 사용된 용어 "조절 요소(regulatory element)"는 핵산 서열의 발현의 일부 측면을 제어하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 조절 요소의 예는 예시적으로 인핸서(enhancer), 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 인트론(intron), 복제 기점(origin of replication), 폴리아데닐화 신호(pA), 프로모터, 인핸서, 전사 종결 서열(transcription termination sequence), 및 업스트림 조절 도메인을 포함하고, 이는 핵산 서열의 복제, 전사 및/또는 전사후 처리에 기여한다. 경우에 따라 조절 요소에는 시스-조절 DNA 요소와 전이 요소(transposable element; TE)도 포함될 수 있다. 당업자는 일상적인 실험만으로 발현 구성에서 이들 및 다른 조절 요소를 선택하고 사용할 수 있다. 발현 컨스트럭트는 유전자 재조합 접근법을 사용하거나 잘 알려진 방법론을 사용하여 합성적으로 생성될 수 있다.
[00108] "제어 요소(control element)" 또는 "제어 서열"은 폴리뉴클레오티드의 복제(replication), 복제(duplication), 전사, 스플라이싱, 번역 또는 분해(degradation)를 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 기능적 조절에 기여하는 분자의 상호작용에 관여하는 뉴클레오티드 서열이다. 조절은 프로세스의 빈도, 속도 또는 특이성에 영향을 미칠 수 있으며 본질적으로 향상되거나 억제될 수 있다. 당업계에 공지된 제어 요소는 예를 들어 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열을 포함한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제에 결합하고 일반적으로 프로모터의 다운(3' 방향)에 위치한 코딩 영역의 전사를 개시하는 일부 조건 하에서 가능한 DNA 영역이다.
[00109] 본 발명의 목적을 위해, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역을 언급할 때 "~로부터 유래된(derived from)"이라는 어구는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역이 "모(parental)" 단백질에서 원래 발견되고 "모" 분자의 일부 기능(들) 및 구조(들)가 실질적으로 보존되는 한, 원래의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역에 대하여 상대적으로 이제 일부 아미노산 잔기 부가 결실, 절단, 재배열 또는 기타 변경(additions, deletions, truncations, rearrangements, or other alterations)을 포함할 수 있는 아미노산 서열을 포함함을 의미한다. 당업자는 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 단백질 서열 정렬 소프트웨어를 사용하여 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역이 유래된 모 분자를 확인할 수 있을 것이다.
[00110] 본 발명의 목적을 위해, 그리고 시가 독소 폴리펩티드 서열 또는 시가 독소 유래 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "야생형(wild-type)"은 일반적으로 예를 들어, 시가 독소 단백질 서열(들)이 가장 빈번하게 발생하는 변이체 중 하나인 병원성 박테리아와 같이 살아있는 종에서 발견되는 자연 발생 시가 독소 단백질 서열(들)을 지칭한다. 이것은 여전히 자연적으로 발생하지만, 적어도 하나의 시가 독소 단백질 변이체를 포함하는 해당 종의 자연 발생 개별 유기체의 통계적으로 강력한 수를 샘플링할 때 주어진 종의 개별 유기체의 1% 미만에서 발견되는 드물게 발생하는 시가 독소 단백질 서열과 대조적이다. 자연 환경 외부에서 분리된 천연 분리물(isolate)의 클론 확장(분리물이 생물 서열 정보를 포함하는 유기체 또는 분자인지 여부에 관계없이)은 클론 확장이 자연적으로 존재하지 않는 새로운 서열 다양성을 도입하지 않는 한 및/또는 서로에 대한 서열 변이체의 상대적 비율을 변경하지 않는 한 자연 발생 요구 사항을 변경하지 않는다.
[00111] 본 명세서에 사용된 용어 "연관된(associated)", "연관되는(associating)", "연결된(linked)", 또는 "연결하는(linking)"은 결합, 부착, 연결 또는 달리 결합되어(joined, attached, connected, or otherwise coupled) 있는 한 분자의 2 이상의 성분의 상태, 또는 2개의 분자 사이에 연관, 연결, 부착 및/또는 기타 연결을 만들어 서로 연관된 2분자가 하나의 분자를 형성하도록 하는 작용을 가리킨다. 예를 들어, 용어 "연결된(linked)"은 단일 분자가 형성되고 원자 상호작용이 공유 및/또는 비공유일 수 있도록 하나 이상의 원자 상호작용에 의해 연관된 둘 이상의 구성요소를 가리킬 수 있다. 2개의 성분 사이의 공유 결합의 비제한적 예는 펩티드 결합 및 시스테인-시스테인 디설파이드 결합을 포함한다. 2개의 분자 성분 사이의 비공유 결합의 비제한적인 예에는 이온 결합 및 수소 결합이 포함된다.
[00112] 본 발명의 목적을 위해, 용어 "연결된(linked)"은 단일 분자가 형성되고 원자 상호작용이 적어도 하나의 공유 결합을 포함하도록 하나 이상의 원자 상호작용에 의해 연관된 둘 이상의 분자 성분을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "연결(linking)"은 상기 기재된 바와 같이 연결된 분자를 생성하는 작용을 지칭한다.
[00113] 본 발명의 목적을 위해, 용어 "융합된(fused)"은 펩티드 결합이 카르복실산 기의 탄소 원자의 참여를 포함하는지 또는 예를 들어 ?-탄소, ?-탄소, ?-탄소, ?-탄소 등과 같은 다른 탄소 원자를 포함하는지 여부에 관계없이 펩티드 결합인 적어도 하나의 공유 결합에 의해 연관된 둘 이상의 단백질성 성분을 지칭한다. 함께 융합된 2개의 단백질성 성분의 비제한적인 예는, 예를 들어 생성된 분자가 단일의 연속적인 폴리펩티드가 되도록 펩티드 결합을 통해 폴리펩티드에 융합된 아미노산, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "융합(fusing)"은 예를 들어 번역될 때 단일 단백질성 분자를 생성하는 유전자 영역의 재조합 융합으로부터 생성된 융합 단백질과 같은 상기 기술된 바와 같은 융합된 분자를 생성하는 작용을 지칭한다.
[00114] 기호 "::"는 그것의 전과 후의 폴리펩티드 영역이 연속적인 폴리펩티드를 형성하기 위해 물리적으로 함께 연결되었음을 의미한다.
[00115] 본 명세서에 사용된 용어 "발현된(expressed)", "발현하는(expressing)", 또는 "발현하다(expresses)" 및 그의 문법적 변형들은 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 단백질로의 번역을 지칭한다. 발현된 단백질은 세포 내에 남아 있거나, 세포 표면막의 성분이 되거나, 세포 외 공간으로 분비될 수 있다.
[00116] 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 적어도 하나의 세포 표면에 상당한 양의 세포 외 표적 생체분자(extracellular target biomolecule)를 발현하는 세포는 "표적 양성 세포" 또는 "표적+ 세포"이고 특정 세포 외 표적 생체분자에 물리적으로 커플링된 세포이다.
[00117] 여기에서 사용된 기호 "?"는 기호 다음의 생체 분자에 결합할 수 있는 면역글로불린 유형 결합 영역의 약어이다. 기호 "?" 는 10-5 이하의 해리 상수(KD)로 기술되는 결합 친화도로 기호 다음의 생체 분자에 결합하는 능력을 기반으로 면역글로불린 유형 결합 영역의 기능적 특성을 나타내는 데 사용된다.
[00118] 본 명세서에 사용된 용어 "중쇄 가변(VH) 도메인" 또는 "경쇄 가변(VL) 도메인"은 각각 임의의 항체 VH 또는 VL 도메인(예: 인간 VH 또는 VL 도메인) 뿐만 아니라 상응하는 천연 항체(예를 들어, 천연 뮤린(murine) VH 또는 VL 도메인으로부터 유래된 인간화 VH 또는 VL 도메인)의 적어도 정성적 항원 결합 능력을 유지하는 이의 임의의 유도체를 지칭한다. VH 또는 VL 도메인은 3개의 CDR 또는 항원 결합 영역(ABR)에 의해 중단된(interrupted) "프레임워크(framework)" 영역을 포함한다. 프레임워크 영역은 항원의 에피토프에 대한 특이적 결합을 위해 CDR 또는 ABR을 정렬하는 역할을 한다. 아미노 말단에서 카르복시 말단까지, VH 및 VL 도메인은 모두 하기 프레임워크(FR) 및 CDR 영역 또는 ABR 영역을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4; 또는 유사하게 FR1, ABR1, FR2, ABR2, FR3, ABR3, 및 FR4. 본 명세서에서 "HCDR1", "HCDR2", 또는 "HCDR3"이라는 용어는 VH 도메인에서 각각 CDR 1, 2, 또는 3을 지칭하는 것으로 사용되며, 용어 "LCDR1", "LCDR2", 및 "LCDR3"은 VL 도메인에서 각각 CDR 1, 2, 또는 3을 나타내는 데 사용된다. 본 명세서에 사용된 용어 "HABR1", "HABR2", 또는 "HABR3"은 VH 도메인에서 각각 ABR 1, 2, 또는 3을 지칭하는 데 사용되며 용어 "LABR1", "LABR2", 또는 "LABR3"은 VL 도메인에서 각각 CDR 1, 2, 또는 3을 나타내는 데 사용된다. 카멜리드(camelid) VHH 단편, 연골 어류의 IgNAR, VNAR 단편, 일부 단일 도메인 항체, 및 이들의 유도체의 경우 동일한 기본 배열을 포함하는 단일 중쇄 가변 도메인이 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 본 명세서에 사용된 용어 "HCDR1", "HCDR2", 또는 "HCDR3"은 단일 중쇄 가변 도메인에서 각각 CDR 1, 2, 또는 3을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
[00119] 본 발명의 목적을 위해, "이펙터(effector)"라는 용어는 세포독성, 생물학적 신호전달, 효소 촉매작용, 하위세포 라우팅(subcellular routing), 및/또는 분자간 결합과 같은 생물학적 활성을 제공하는 것을 의미하며 알로스테릭(allosteric) 효과(들) 및/또는 하나 이상의 요인의 채택을 초래한다.
[00120] 본 발명의 목적을 위해, "시가 독소 이펙터 폴리펩티드(Shiga toxin effector polypeptide)", "시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역" 및 "시가 독소 이펙터 영역"은 시가 독소 패밀리의 한 구성원의 적어도 하나의 시가 독소 A 서브유닛으로부터 유래된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역을 지칭하는데, 여기서 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역이 적어도 하나의 시가 독소 기능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NOs:45-69는 StxA 및 SLT-1A에서 유래된다.
[00121] 본 발명의 목적을 위해, 시가 독소 이펙터 기능은 시가 독소 A 서브유닛으로부터 유래된 폴리펩티드 영역에 의해 부여되는 생물학적 활성이다. 시가 독소 이펙터 기능의 비제한적 예에는 세포 진입 촉진; 지질막 변형; 세포 내재화 촉진; 클라트린 매개 세포 내이입 자극; 예를 들어, 골지체, 소포체 및 세포질과 같은 다양한 세포 내 구획으로의 세포 내 라우팅 지시; 화물로서 세포 내 라우팅 지시; 리보솜 기능(들) 억제; 단백질 합성 억제, 예를 들어 N-글리코시다제 활성 및 촉매적 억제 리보솜과 같은 촉매 활성 억제; 단백질 합성 감소, 카스파제(caspase) 활성 유도, 이펙터 카스파제 활성화, 세포 증식 억제 효과, 및 세포 독성 등을 포함한다. 시가 독소 촉매 활성은 예를 들어 리보솜 불활성화, 단백질 합성 억제, N-글리코시다제 활성, 폴리뉴클레오티드:아데노신 글리코시다제 활성, RNAase 활성, 및 DNAase 활성을 포함한다. 시가 독소는 리보솜 비활성화 단백질(RIP)이다. RIP는 핵산, 폴리뉴클레오사이드, 폴리뉴클레오티드, rRNA, ssDNA, dsDNA, mRNA(및 polyA) 및 바이러스 핵산을 탈퓨린화(depurinate)할 수 있다(예시적 참조: Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4 (1992); Barbieri L et al., Nature 372: 624 (1994); Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994); Barbieri L et al., Biochem J 319: 507-13 (1996); Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996); Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996); Barbieri L et al., Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997); Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res 27: 1900-5 (1999); Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000); Barbieri L et al., J Biochem 128: 883-9 (2000); Brigotti M et al., Toxicon 39: 341-8 (2001); Brigotti M et al., FASEB J 16: 365-72 (2002); Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); Picard D et al., J Biol Chem 280: 20069-75 (2005)). 일부 RIP는 항바이러스 활성 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 활성을 나타낸다(Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993); Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000); Parikh B, Tumer N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004); Sharma N et al., Plant Physiol 134: 171-81 (2004)). 시가 독소 촉매 활성은 시험관내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 모두 관찰되었다. 시가 독소 이펙터 활성에 대한 분석의 비제한적 예는 다양한 활성, 예를 들어 단백질 합성 억제 활성, 탈퓨린화 활성, 세포 성장 억제, 세포독성, 초나선(supercoiled) DNA 이완 활성 및 뉴클레아제 활성 등을 측정한다.
[00122] 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 시가 독소 이펙터 기능의 보유는 재현성을 갖는 적절한 정량 분석에 의해 측정된 시가 독소 기능 활성 수준을 야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 대조군(예를 들어, 동일한 조건하에서 시가 독소 A1 단편) 또는 야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드(예를 들어, 시가 독소 A1 단편)를 포함하는 CD38-결합 단백질에 비교될 수 있는 수준으로 시현할 수 있다는 것을 가리킨다. 리보솜 불활성화 또는 리보솜 억제의 시가 독소 이펙터 기능의 경우, 보유된 시가 독소 이펙터 기능은 예를 들어 숙련된 작업자에게 알려진 분석을 사용하여 시험관내 세팅에서 10,000pM 이하의 IC50을 나타낸다. 표적 양성 세포 사멸 분석에서 세포독성의 시가 독소 이펙터 기능의 경우 유지된 시가 독소 이펙터 기능은, 제시된 바와 같이, 예를 들어, 숙련된 작업자에게 알려져 있고/있거나 여기에 설명된 분석법을 사용하여, 세포 유형 및 적절한 세포 외 표적 생체분자의 발현에 따라 1,000nM 이하의 CD50을 나타낸다.
[00123] 본 발명의 목적을 위해, 리보솜 억제와 관련하여 "동등한(equivalent)"이라는 용어는 재현성이 있는 적절한 정량 분석에 의해 측정된 리보솜 억제 활성의 경험적으로 측정된 수준을 의미하며, 이는 동일한 조건하에 재현 가능하게 참조 분자(예: 제2 CD38-결합 단백질 또는 제3 CD38-결합 단백질)의 활성의 10% 이내이다.
[00124] 본 발명의 목적을 위해, 세포독성과 관련하여 "동등한(equivalent)"이라는 용어는 재현성이 있는 적절한 정량적 분석에 의해 측정된 바와 같이 경험적으로 측정된 세포독성 수준을 의미하며, 이는 동일한 조건하에 재현 가능하게 참조 분자(예를 들어, 제2 CD38-결합 단백질 또는 제3 결합 단백질)의 활성의 10% 이내이다.
[00125] 본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포독성과 관련하여 "약독화된(attenuated)"이라는 용어는 동일한 조건하에 참조 분자가 나타내는 CD50의 10배 내지 100배 사이의 CD50을 나타내거나 나타내었던 분자를 의미한다.
[00126] 시가 독소 이펙터 기능 활성 수준을 결정할 때 부정확한 IC50 및 CD50 값을 고려해서는 안 된다. 일부 샘플의 경우 정확한 곡선 피팅(fitting)에 필요한 데이터 포인트를 수집할 수 없기 때문에 IC50 또는 CD50에 대한 정확한 값을 얻지 못할 수 있다. 예를 들어, 이론적으로 IC50과 CD50은 각각 50% 이상의 리보솜 억제 또는 세포 사멸이 주어진 샘플에 대한 농도 시리즈에서 발생하지 않는 경우 결정할 수 없다. 예를 들어 아래 실시예에 설명된 분석과 같은 예시적인 시가 독소 이펙터 기능 분석의 데이터 분석에 설명된 대로 곡선에 정확하게 피팅하기에 데이터가 충분하지 않은 경우 실제 시가 독소 이펙터 기능을 나타내는 것으로 간주해서는 안 된다.
[00127] 시가 독소 이펙터 기능의 활성을 감지하지 못하는 것은 세포 진입, 하위세포 라우팅, 및/또는 효소 활성의 부족이라기보다는 부적절한 발현, 폴리펩티드 폴딩(folding), 및/또는 단백질 안정성 때문일 수 있다. 시가 독소 이펙터 기능에 대한 분석은 상당한 양의 시가 독소 이펙터 기능 활성을 측정하기 위해 많은 본 발명의 폴리펩티드를 필요로 하지 않을 수 있다. 이펙터 기능이 낮거나 전혀 없는 근본적인 원인이 단백질 발현 또는 안정성과 관련하여 경험적으로 결정되는 정도까지, 당업자는 당업계에 공지된 단백질 화학 및 분자 공학 기술을 사용하여 시가 독소 기능 이펙터 활성이 회복되고 측정될 수 있도록 이러한 요인을 보상할 수 있다. 예로서, 부적절한 세포 기반 발현은 상이한 발현 제어 서열을 사용함으로써 보상될 수 있으며; 부적절한 폴리펩티드 폴딩 및/또는 안정성은 안정화 말단 서열, 또는 분자의 3차원 구조를 안정화시키는 비-이펙터 영역의 보상 돌연변이로부터 도움을 받을 수 있다.
[00128] 하위세포 라우팅 기능과 같은 일부 시가 독소 이펙터 기능은 쉽게 측정할 수 없다. 예를 들어, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 세포독성 및/또는 이종 에피토프 전달의 실패가 부적절한 하위세포 라우팅으로 인한 것인지 구별하기 위한 일상적인 정량적 분석은 없지만 시험이 가능한 시점에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 적절한 야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드와 비교하여 임의의 유의미한 수준의 하위세포 라우팅에 대해 분석될 수 있다. 그러나, 본 발명의 결합 단백질의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 성분이 야생형 시가 독소 A 서브유닛 컨스트럭트에 필적하거나 동등한 세포독성을 나타내는 경우, 하위세포 라우팅 활성 수준은 최소한 시험된 조건하에서 야생형 시가 독소 A 서브유닛 컨스트럭트의 하위세포 라우팅 활성 수준에 각각 필적하거나 동등한 것으로 추론된다.
[00129] 개별 시가 독소 기능에 대한 새로운 분석이 가능해지면 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함하는 결합 단백질은 야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 활성의 1000배 또는 100배 또는 그 이하인 것으로, 또는 기능적 녹아웃, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드와 비교하여 3배 또는 30배 또는 그보다 더 큰 활성을 보이는 것으로와 같이 시가 독소 이펙터 기능의 모든 수준에 대해 분석될 수 있다.
[00130] 충분한 하위세포 라우팅은 예를 들어, T-세포 에피토프 표현 또는 세포질 및/또는 소포체 국지화된 표적 기질(substrate)에 기반한 세포독성 분석과 같은 세포독성 분석에서 분자의 세포독성 활성 수준을 관찰함으로써 간단히 추론될 수 있다.
[00131] 본 명세서에 사용된 "유의한(significant)" 시가 독소 이펙터 기능의 유지는 야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 대조군(예: 시가 독소 A1 단편)에 비교할 수 있는 재현성 있는 적절한 양적 분석에 의하여 측정된 것과 같은 시가 독소 기능 활성의 수준을 가리킨다. 시험관내 리보솜 억제의 경우 유의한 시가 독소 이펙터 기능은 분석에 사용된 리보솜의 원천(예: 박테리아, 고세균, 또는 진핵생물(조류, 진균, 식물 또는 동물))에 따라 300pM 이하의 IC50을 나타낸다. 이것은 촉매적으로 파괴된 SLT-1A 1-251 이중 돌연변이체(Y77S/E167D)에 의해 나타난 100,000pM의 대략적인 IC50과 비교하여 상당히 더 큰 억제이다. 실험실 세포 배양에서 표적 양성 세포 사멸 분석에서 세포독성의 경우, 유의한 시가 독소 이펙터 기능은 결합 영역의 표적 생체분자(들) 및 세포 유형, 특히 그 세포 유형의 발현 및/또는 적절한 세포 외 표적 생체분자(들)의 세포 표면 표현(representation) 및/또는 평가되는 분자에 의해 표적화 되는 세포 외 에피토프(들)에 따라 100, 50, 30nM 또는 그 이하의 CD50을 나타낸다. 이는 세포주에 따라 100-10,000nM 의 CD50을 갖는 세포 표적화 결합 영역이 없는 시가 독소 A 서브유닛 단독(또는 야생형 시가 독소 A1 단편)과 비교하여 적절한 표적 양성 세포 집단에 대해 상당히 더 큰 세포독성이다.
[00132] 본 발명의 목적을 위해 그리고 본 발명의 분자의 시가 독소 이펙터 기능과 관련하여, 용어 "합리적인 활성(reasonable activity)"은 자연발생적(또는 야생형) 시가 독소를 포함하는 분자와 관련하여 본 명세서에 정의된 것과 같이 시가 독소 이펙터 활성의 적어도 중간 수준(예를 들어, 11-배 내지 1,000-배 이내)을 나타내는 것을 지칭하며, 여기서 시가 독소 이펙터 활성은 다음으로부터 선택된다: 내재화 효율, 세포질로의 하위세포 라우팅 효율, 표적 세포(들)에 의해 전달된 에피토프 제시(presentation), 리보솜 억제 및 세포독성. 세포독성의 경우, 합리적인 수준의 시가 독소 이펙터 활성은 야생형 시가 독소 컨스트럭트의 1,000배 이내, 예를 들어 야생형 시가 독소 컨스트럭트가 0.5nM의 CD50을 나타낼 때 500nM의 CD50 또는 그 이하를 나타낸다(예: 야생형 시가 독소 A1 단편을 포함하는 결합 단백질).
[00133] 본 발명의 목적을 위해 그리고 본 발명의 분자의 세포독성과 관련하여, 용어 "최적(optimal)"은 야생형 시가 독소 A1 단편(예: 시가 독소 A 서브유닛 또는 이의 일부 절단된 변이체) 및/또는 자연 발생(또는 야생형) 시가 독소를 포함하는 분자의 세포독성의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10-배 이내의 시가 독소 촉매 도메인 매개 세포독성 수준을 가리킨다.
[00134] 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 세포독성이 야생형 시가 독소 A 서브유닛 또는 이의 단편에 비해 감소하더라도 실제로는 약독화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 사용하는 적용이 야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 사용하는 것보다 동등하게 또는 더욱 효과적일 수 있는데, 가장 높은 효능 변이체가 감소된 세포독성 효능 변이체에서 최소화되거나 감소되는 바람직하지 않은 효과를 나타낼 수 있기 때문이다. 야생형 시가 독소는 매우 강력하여 단 하나의 독소 분자가 중독(intoxicatred)된 세포의 세포질에 도달한 후 또는 아마도 40개의 독소 분자가 중독된 세포에 내재화 된 후에 중독된 세포를 죽일 수 있다.
야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드와 비교하여 하위세포 라우팅 또는 세포독성과 같은 시가 독소 이펙터 기능이 상당히 감소된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드라 해도 예를 들어 표적 세포 사멸, 화물 분자 전달 및/또는 특정 세포 및 세포 내 구획의 검출 등을 포함하는 응용과 같은 실제적인 적용을 위해 여전히 충분히 강력할 수 있다. 또한, 일부 감소된 활성의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 분자 화물(예: 추가 외인성 물질)을 CD38-양성 표적 세포의 일부 세포 내 위치 또는 하위세포 구획으로 전달하는데 특히 유용할 수 있다.
[00135] 분자의 세포독성 활성과 관련된 "선택적 세포독성(selective cytotoxicity)"이라는 용어는 CD38 표적 양성 세포 집단(예: CD38 표적 세포 유형)과 비표적 방관자 세포 집단(예: CD38 표적 음성 세포 유형) 사이의 상대적인 수준을 지칭하는데, 그것은 표적 세로 유형에 대한 CD50(half-maximal cytotoxic concentration)을 표적화되지 않은 세포 유형에 대한 CD50으로 나눈 비율로 표현되어 표적 세포 대 비표적 세포의 사멸의 선택성의 세포독성 선택성 또는 표시의 측정치를 제공할 수 있다.
[00136] 주어진 세포 외 표적 생체분자(또는 주어진 표적 생체분자의 세포 외 에피토프)의 세포 표면 표현(representation) 및/또는 밀도는 일부 결합 단백질이 가장 적합하게 사용될 수 있는 응용 분야에 영향을 미칠 수 있다. 세포 사이의 주어진 표적 생체분자의 세포 표면 표현 및/또는 밀도의 차이는 세포 내재화의 효율성 및/또는 주어진 결합 단백질의 세포독성 효능을 양적 및 질적으로 모두 변경할 수 있다. 주어진 표적 생체분자의 세포 표면 표현 및/또는 밀도는 표적 생체분자 양성 세포 간에 또는 심지어 세포 주기 또는 세포 분화의 상이한 지점에서 동일한 세포에서도 크게 달라질 수 있다. 특정 세포 또는 세포 집단에 대한 주어진 표적 생체분자 및/또는 주어진 표적 생체분자의 일부 세포 외 에피토프의 전체 세포 표면 표현은 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 유세포 분석과 같은 숙련된 작업자에게 알려진 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
[00137] 본 명세서에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 영역 또는 폴리펩티드 내의 특징과 관련하여 "파괴된(disrupted)", "파괴(disruption)", 또는 "파괴하는(disrupting)"이라는 용어 및 이들의 문법적 변형은 그 영역 내의 적어도 하나의 아미노산의 변경 또는 파괴된 특징을 구성하는 것을 지칭한다. 아미노산 변경은 다양한 돌연변이, 예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경하는 결실(deletion), 역위(inversion), 삽입(insertion), 또는 치환(substitution)을 포함한다. 아미노산 변경은 또한 화학적 변화, 예를 들어 아미노산 작용기의 하나 이상의 원자 변경 또는 아미노산 작용기에 대한 하나 이상의 원자의 추가를 포함한다.
[00138] 본 명세서에 사용된 "탈면역화된(immunized)"은 참조 분자, 예를 들어, 야생형 펩티드 영역, 폴리펩티드 영역, 또는 폴리펩티드와 비교하여 대상(예를 들어, 인간 대상)에 투여 후 항원성 및/또는 면역원성 잠재력이 감소된 것을 의미한다. 이것은 참조 분자와 비교하여 하나 이상의 새로운, 항원 및/또는 면역원성 에피토프의 도입에도 불구하고 전반적인 항원성 및/또는 면역원성 잠재력의 감소를 포함한다. 일부 구체예들에서, "탈면역화된"은 예를 들어 야생형 시가 독소 A1 단편 또는 전술한 것을 포함하는 결합 단백질과 같은 그것이 유래된 "모" 분자와 비교하여 포유동물에 투여한 후 감소된 항원성 및/또는 면역원성을 나타내는 분자를 의미한다. 일부 구체예들에서, 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 기준 "모" 분자와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 감소된 또는 정량적 ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석과 같이 숙련자에게 공지된 분석 및/또는 본 명세서에 기술된 동일한 분석에 의해 측정된 동일한 조건하의 기준 분자의 항원성 보다 더 큰 상대적 항원성을 나타낼 수 있다. 일부 구체예들에서, 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 기준 "모" 분자와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99% 감소된 또는 예를 들어 주어진 시점에서 분자의 비경구 투여를 받은 후 포유동물(들)에서 생성된 항-분자 항체의 정량적 측정과 같이 숙련된 작업자에게 알려진 및/또는 본 명세서에 기술된 분석과 같이 동일한 분석에 의해 측정된 동일한 조건하의 참조분자의 면역원성보더 더 큰 상대적 면역원성을 나타낼 수 있다.
[00139] 예시적인 결합 단백질의 상대적인 면역원성은 일정 기간 동안 반복 비경구 투여 후 결합 단백질에 대한 생체 내 항체 반응에 대한 분석을 사용하여 결정하였다.
[00140] 본 발명의 목적을 위해, "탈면역화 된 B-세포 및/또는 CD4+ T-세포"라는 어구는 분자가 B-세포 항원성 또는 면역원성 및/또는 CD4+ T-세포 항원성 또는 면역원성과 관련하여 포유동물에 투여된 후 감소된 항원성 및/또는 면역원성 잠재력을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 구체예들에서, "탈면역화된 B-세포"는 분자가 예를 들어, 야생형 시가 독소 A1 단편과 같이 그것이 유래된 "모" 분자와 비교하여 포유동물에 투여한 후 감소된 B-세포 항원성 및/또는 면역원성을 나타내었다는 것을 의미한다. 일부 구체예의 경우, "탈면역화 된 CD4+ T-세포"는 예를 들어 야생형 시가 독소 A1 단편과 같이 그것이 유래된 "모" 분자와 비교하여 포유동물에 투여 후 감소된 CD4 T-세포 항원성 및/또는 면역원성을 나타내었다는 것을 의미한다.
[00141] 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에서 B-세포 에피토프, CD4+ T-세포 에피토프, B-세포 에피토프 영역 또는 CD4+ T-세포 에피토프 영역과 관련된 용어 "내인성(endogenous)"은 야생형 시가 독소 A 서브유닛에 존재하는 에피토프를 의미한다.
[00142] 본 발명의 목적을 위해, "과면역화된(hyper-immunized) CD8+ T-세포"라는 어구는 분자가 살아있는 대상(예를 들어, 인간 대상) 내의 유핵 세포 내부에 존재할 때 CD8+ T 세포 항원성 또는 면역원성에 관하여 증가된 항원성 및/또는 면역원성 잠재력을 갖는다는 것을 의미한다. 일반적으로, CD8+ T-세포 면역화된 분자는 고유의 특징(들) 또는 본 발명의 CD38-결합 단백질의 성분으로 인해 유핵 세포의 조기 엔도솜 구획(early endosomal compartment)으로 세포 내재화될 수 있다.
[00143] 본 발명의 목적을 위해, 용어 "이종성(heterologous)"은 상이한 공급원, 예를 들어 이종성 시가 A 서브유닛 폴리펩티드는 예를 들어 내인성(endogenous)과는 대조적으로 천연 시가 독소의 어떤 A 서브유닛의 일부로서 자연적으로 발견되지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 융합 단백질은 비-이종 성분, 예를 들어, 시가 독소 및 항-CD38 항원 결합 도메인을 포함한다.
[00144] 본 발명의 결합 단백질의 폴리펩티드 성분과 관련하여 용어 "임베드된(embedded)" 및 이의 문법적 변형은 출발 폴리펩티드 영역과 동일한 총 아미노산 잔기 수를 공유하는 새로운 폴리펩티드 서열을 생성하기 위해 폴리펩티드 영역 내의 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산으로 내부 대체하는 것을 지칭한다. 따라서, "임베드된"이라는 용어는 출발 폴리펩티드에 대한 임의의 추가 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드 성분의 임의의 외부 말단 융합 또는 임의의 추가 아미노산 잔기의 임의의 추가 내부 삽입을 포함하지 않으며, 오히려 기존 아미노산에 대한 치환만을 포함한다. 내부 대체(internal replacement)는 단순히 아미노산 잔기 치환에 의해 또는 일련의 치환, 결실, 삽입 및/또는 역위(inversion)에 의해 달성될 수 있다. 하나 이상의 아미노산 삽입이 사용되는 경우 임베드된 펩티드를 생성하기 위해 동일한 수의 근위 아미노산이 삽입 옆에서 결실되어야 한다. 이는 본 발명의 결합 단백질의 폴리펩티드 성분과 관련하여 "삽입된(inserted)"이라는 용어를 사용하여 폴리펩티드 내부에 하나 이상의 아미노산을 삽입하여 출발 폴리펩티드(starting polypeptide)에 비해 증가된 수의 아미노산 잔기를 갖는 새로운 폴리펩티드를 생성하는 것과 대조된다.
[00145] 본 발명의 결합 단백질의 폴리펩티드 성분과 관련하여 "삽입된(inserted)"이라는 용어 및 이의 문법적 변형은 출발 폴리펩티드와 비교하여 증가된 수의 아미노산 잔기를 갖는 새로운 폴리펩티드 서열을 생성하는 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 가리킨다. 본 발명의 결합 단백질의 폴리펩티드 성분과 관련하여 "부분적으로 삽입된(partially inserted)", "임베드된 및 삽입된(embedded and inserted)"이라는 어구 및 이들의 문법적 변형은 생성된 폴리펩티드의 길이가 증가하지만 전체 삽입된 폴리펩티드의 길이와 동일한 아미노산 잔기의 수보다는 적게 증가한 경우를 가리킨다. "순수한(pure)"이든 "부분적인(partial)"이든, 삽입은 최종 폴리펩티드가 여전히 폴리펩티드 영역 내에 T-세포 에피토프-펩티드의 하나 이상의 아미노산의 내부 삽입을 포함하기 때문에 폴리펩티드 내의 삽입 부위에 인접하지 않은 폴리펩티드의 다른 영역이 결실되어 최종 폴리펩티드의 총 길이가 감소하더라도 이전에 기재된 임의의 삽입을 포함한다.
[00146] 본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 결합 단백질의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 위치와 관련하여 "아미노 말단에 근접한(proximal to an amino-terminus)"이라는 어구는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결합 단백질이 본 명세서에 지적된 시가 독소 이펙터 기능 활성의 적절한 수준(예: 어떤 수준의 세포독성 효능)을 보일 수 있는 한 결합 단백질의 아미노-말단의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 이상으로 18-20개까지의 아미노산 잔기 이내인 거리를 가리킨다. 따라서, 본 발명의 일부 구체예들에 대해, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 아미노 말단이 융합된 임의의 아미노산 잔기는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 기능적 활성이 본 명세서에서 요구되는 적절한 활성 수준 이하로 감소되도록 (예를 들어, 아미노 말단 근처의 구조(들)을 입체적으로 방해함으로써) 어떤 시가 독소 이펙터 기능도 감소시키지 않아야 한다.
[00147] 본 발명의 목적을 위해 다른 성분(예: 세포-표적화, 결합 영역, 분자 모이어티, 및/또는 추가적 외인성 물질)과 비교하여 본 발명의 결합 단백질 내의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 위치와 관련하여 "아미노 말단에 더욱 근위의(more proximal to an amino-terminus)"라는 어구는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 아미노-말단의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 다른 참조 성분에 비해 본 발명의 결합 단백질의 선형 폴리펩티드 성분의 아미노-말단에 더욱 가까운 위치를 가리킨다.
[00148] 본 발명의 목적을 위해, "시가 독소 패밀리의 구성원의 하나의 A 서브유닛으로부터 유래된 활성 효소 도메인(active enzymatic domain derived from one A Subunit of a member of the Shiga toxin family)"이라는 어구는 촉매적 리보솜 불활성화 메카니즘을 통해 단백질 합성을 억제하는 능력을 갖는 것을 의미한다. 자연 발생 시가 독소의 효소 활성은 예를 들어 살아있는 세포가 없는 상태에서 RNA 번역을 포함하는 시험관내 분석 또는 살아있는 세포에서 RNA 분석을 포함하는 생체 내 분석과 같이 숙련된 작업자에게 알려진 분석법을 사용하여 단백질 번역을 억제하는 능력으로 정의될 수 있다. 숙련된 작업자에게 알려져 있고 그리고/또는 본 명세서에 설명된 분석법을 사용하여, 시가 독소 효소 활성의 효능은 예를 들어 리보솜 닉킹(nicking) 분석법과 같은 리보솜 RNA(rRNA)에 대한 N-글리코시다제 활성을 관찰함으로써 직접적으로 및/또는 리보솜 기능 및/또는 단백질 합성의 억제를 관찰함으로써 간접적으로 평가될 수 있다.
[00149] 본 발명의 목적을 위해, 용어 "시가 독소 A1 단편 영역(Shiga toxin A1 fragment region)"은 필수적으로 시가 독소 A1 단편만으로 구성되거나 그리고/또는 시가 독소의 시가 독소 A1 단편으로부터 유래된 폴리펩티드 영역을 지칭한다.
[00150] 본 발명의 목적을 위해, 결합 단백질과 관련하여 용어 "말단", "아미노-말단", 또는 "카르복시-말단"은 일반적으로 결합 단백질의 폴리펩티드 사슬의 마지막 아미노산 잔기(예를 들어, 단일 연속 폴리펩티드 사슬)를 가리킨다. 결합 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있고, 따라서 본 발명의 결합 단백질은 다중 아미노-말단 및 카르복시-말단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 결합 단백질의 "아미노-말단"은 폴리펩티드의 아미노-말단 쪽을 나타내는 폴리펩티드 사슬의 첫 번째 아미노산 잔기에 의해 정의될 수 있으며, 이는 일반적으로 출발 아미노산 잔기의 1차 아미노기를 포함하거나 또는 N-알킬화 알파 아미노산 잔기 부류의 구성원인 출발 아미노산 잔기에 대한 등가의 질소를 포함하는 임의의 아미노산 잔기와 펩티드 결합을 갖지 않는 출발 아미노산 잔기에 의해 특징지워진다. 유사하게, 결합 단백질의 "카르복시-말단"은 폴리펩티드의 카르복시-말단 쪽을 나타내는 폴리펩티드 사슬의 마지막 아미노산 잔기에 의해 정의될 수 있으며, 이는 일반적으로 1차 카르복실기의 알파-탄소에 펩티드 결합으로 연결된 임의의 아미노산 잔기를 갖지 않는 최종 아미노산 잔기를 특징으로 한다.
[00151] 본 발명의 목적을 위해, 폴리펩티드 영역과 관련하여 "말단(terminus)", "아미노-말단(amino-terminus)", 또는 "카르복시-말단(carboxy-terminus)"이라는 용어는 추가적 아미노산 잔기가 그 영역 외부의 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 여부와 무관하게 그 영역의 영역 경계를 가리킨다. 다른 말로 하면 폴리펩티드 영역의 말단은 그 영역이 다른 펩티드 또는 폴리펩티드와 융합되어 있는지 여부에 무관하다. 예를 들어, 2개의 단백질성 영역을 포함하는 융합 단백질, 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드 및 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함하는 결합 영역은 예를 들어 결합 영역과 같은 다른 단백질성 영역의 시작을 나타내는 위치 252에서 잔기 251을 포함하는 아미노산 잔기에 대한 펩티드 결합에도 불구하고 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 아미노산 잔기 251에서 끝나는 카르복시-말단을 갖는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역을 가질 수 있다. 이 예에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 카르복시-말단은 융합 단백질의 말단이 아니라 내부, 영역 경계를 나타내는 잔기 251을 나타낸다. 따라서, 폴리펩티드 영역의 경우, "말단", "아미노-말단", 및 "카르복시-말단"이라는 용어는 경계가 물리적 말단이든 더 큰 폴리펩티드 사슬 내에 임베드된 내부 위치이든 간에 폴리펩티드 영역의 경계를 나타내는 데 사용된다.
[00152] 본 발명의 목적을 위해, "시가 독소 A1 단편의 카르복시-말단 영역(carboxy-terminus region of a Shiga toxin A1 fragment)"이라는 어구는 자연 발생 시가 독소 A1 단편으로부터 유래한 폴리펩티드 영역, 소수성 잔기(예를 들어, StxA- A1 및 SLT-1A1의 V236, 및 SLT-2A1의 V235)로 시작하고 소수성 잔기로 이어지는 영역 및 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드 중에 보존된 퓨린-절단 부위로 끝나고 천연 시가 독소 A 서브유닛의 A1 단편 및 A2 단편 사이의 접합부(junction)에서 끝나는 영역을 가리킨다. 본 발명의 목적을 위해, 시가 독소 A1 단편의 카르복시-말단 영역은 예를 들어 필수적으로 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단으로만 구성되는 펩티드 영역과 같이 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드의 카르복시-말단으로부터 유래된 펩티드 영역을 포함한다. 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단으로부터 유래된 펩티드 영역의 비제한적인 예는 Stx1A (SEQ ID NO:2) 또는 SLT-1A (SEQ ID NO:1)에서 위치 236에서 위치 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 또는 251; 및 SLT-2A (SEQ ID NO:3)에서 위치 235에서 위치 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 또는 250에 본래 위치한 아미노산 잔기 서열을 포함한다.
[00153] 본 발명의 목적을 위해, 연결된 분자 모이어티 및/또는 결합 영역과 관련하여 "A1 단편 폴리펩티드의 카르복시 말단에 근접한(proximal)"이라는 어구는 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드의 마지막 잔기를 정의하는 아미노산 잔기로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 아미노산 잔기 이내에 있다는 것을 가리킨다.
[00154] 본 발명의 목적을 위해, "A1 단편-유래 영역의 카르복시 말단을 입체적으로(sterically) 커버한다(cover)"라는 어구는 예를 들어 Stx1A (SEQ ID NO:2)에서 236 내지 251, 또는 SLT-1A (SEQ ID NO:1) 또는 SLT-2A (SEQ ID NO:3)에서 235 내지 250의 임의의 위치에 본래 위치한 아미노산 잔기로부터 유래된 아미노산 잔기와 같이 A1 단편-유래 영역의 카르복시-말단에 있는 아미노산 잔기에 연결 또는 융합된 4.5kDa 이상의 크기의 임의의 분자 모이어티(예를 들어, 면역글로불린-유형 결합 영역)를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, "A1 단편-유래 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다(sterically covers the carboxy-terminus of the A1 fragment-derived region)"라는 어구는 A1 단편 유래 영역의 카르복시-말단에서 아미노산 잔기에 연결 및/또는 융합된 4.5kDa 이상의 크기(예를 들어, 면역글로불린-유형 결합 영역)의 임의의 분자 모이어티를 포함하며, 예를 들어, 예를 들어, 마지막 아미노산 A1 단편-유도된 영역 및/또는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대한 카르복시-말단의 아미노산 잔기와 같은 것이다. 본 발명의 목적을 위해서 "A1 단편-유래 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 커버한다(sterically covers the carboxy-terminus of the A1 fragment-derived region)"라는 어구는 또한 예를 들어, 진핵세포의 ERAD 기제(ERAD machinery)에 의한 인식과 같은 A1 단편 유래 영역의 카르복시-말단의 세포 인식을 물리적으로 방지하는 4.5kDa 이상의 크기의 임의의 분자 모이어티(예: 면역글로불린 유형 결합 영역)를 포함한다.
[00155] 본 발명의 목적을 위해, 적어도 40개의 아미노산을 포함하고 A1 단편-유래 영역을 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 카르복시-말단에 연결(예를 들어, 융합)된 폴리펩티드를 포함하는 결합 영역, 예를 들어, 면역글로불린-유형 결합 영역은 "A1 단편-유래 영역의 카르복시 말단을 입체적으로 덮는" 분자 모이어티이다.
[00156] 본 발명의 목적을 위해, 적어도 40개의 아미노산을 포함하고 A1 단편-유래 영역을 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 카르복시-말단에 연결(예를 들어, 융합)된 폴리펩티드를 포함하는 결합 영역, 예를 들어, 면역글로불린-유형 결합 영역은 "A1 단편-유래 영역의 카르복시 말단을 방해하는(encumbering)" 분자 모이어티이다.
[00157] 본 발명의 목적을 위해, 용어 "시가 독소 패밀리 구성원의 A1 단편"은 시가 독소 A 중 보존된 퓨린-절단 부위에서 퓨린에 의한 단백질 분해 후의 및 야생형 시가 독소 A 서브유닛에서 A1 단편과 A2 단편 사이에 위치하는 시가 독소 A 서브유닛의 남은 아미노-말단 단편을 가리킨다.
[00158] 본 발명의 목적을 위해, "A1 단편 영역의 카르복시 말단의 퓨린-절단 모티프"라는 어구는 자연발생 시가 독소 A 서브유닛에서 A1 단편과 A2 단편 사이의 접합부를 연결하고 시가 독소 A 서브유닛 사이에 보존된 특정 퓨린-절단 모티프를 가리킨다.
[00159] 본 발명의 목적을 위해, "A1 단편 영역의 카르복시 말단에 근접한 퓨린-절단 부위"라는 어구는 예를 들어 본 발명의 결합 단백질의 분자 모이어티와 같은 다른 분자의 성분에 대한 A1 단편-유래 영역의 연결에 근접한 위치와 같은 A1 단편 영역 또는 A1 단편 유래 영역의 카르복시-말단에 위치한 퓨린-절단 모티프를 포함하는 A1 단편 영역 또는 A1 단편 유래 영역의 마지막 아미노산 잔기를 정의하는 아미노산 잔기의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이상의 아미노산 잔기 보다 작은 거리 내의 아미노산 잔기를 가지는 임의의 파악 가능한 퓨린-절단 부위를 가리킨다.
[00160] 본 명세서에 사용된 용어 "추가적인 CD38-표적화 치료제"는 치료 효과 또는 이익을 생성하기 위해 CD38을 표적화하는 추가 치료제(예를 들어, 분자)를 의미한다. 이 추가적인 CD38-표적화 치료제는 결합 단백질에 상보적(complementary)이며 그의 CD38-표적화 활성에서 결합 단백질과 직접적으로 경쟁하지 않는다. 추가의 CD38-표적화 치료제는 CD38 신호전달을 방해하는 항-CD38 항체 또는 소분자 억제제를 포함하거나, 필수적으로 이것만을 포함하거나, 또는 이로 구성될 수 있다. 예를 들어, 추가의 CD38-표적화 치료제는 결합 영역에 의하여 결합된 항원 결정기(determinant)와 중첩되지 않는 항원 결정기에 결합되거나 또는 결합되었을 때 추가의 CD38-표적화 치료제가 본 발명의 결합 단백질에 의해 그 CE38 분자의 결합을 방해하지 않는 항-CD38 항체를 포함하거나, 필수적으로 이로만 이루어지거나, 이로 구성된다. 예를 들어, 추가의 CD38-표적화 치료제는 예를 들어 다라투무맙과 같은 항-CD38 단클론 항체 요법을 포함하거나, 필수적으로 이로만 이루어지거나, 또는 이로 구성된다.
[00161] 본 발명의 목적을 위해, "파괴된 퓨린-절단 모티프(furin-cleavage motif)"라는 어구는 (i) 섹션 I-B에 기재된 바와 같은 특정 퓨린-절단 모티프 및 (ii) 예를 들어 동일한 조건에서 동일한 분석에서 관찰된 참조 분자의 퓨린-절단보다 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 이하(절단되지 않은 경우 100% 포함)인 것으로 재현가능하게 관찰된 퓨린-절단의 감소와 같이 참조분자에 비교하여 퓨린-절단의 감소가 있는 분자를 부여할 수 있는 돌연변이 및/또는 절단을 포함하는 것을 가리킨다. 참조 분자와 비교한 퓨린-절단의 백분율은 관심 분자의 절단:비절단 물질을 참조 분자의 절단:비절단 물질로 나눈 비율로 나타낼 수 있다(예: WO 2015/191764; WO 2016/ 196344). 적합한 참조 분자의 비제한적인 예는 본 명세서에 기재된 야생형 시가 독소 퓨린-절단 모티프 및/또는 퓨린-절단 부위를 포함하는 일부 분자를 포함한다.
[00162] 본 발명의 목적을 위해, "퓨린-절단 저항성(furin-cleavage resistant)"이라는 어구는, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하는 것을 포함하여 숙련된 작업자가 이용할 수 있는 수단에 의해 분석된 것과 같이, (i) 야생형 시가 독소 A 서브유닛에서 시가 독소 A1 단편의 카르복시-말단 또는 (ii) A1 단편과 A2 단편 사이의 접합부에 자연적으로 위치하는 자연 발생 퓨린-절단 부위가 파괴되지 않은 컨스트럭트의 시가 독소 A1 단편 유래 영역의 카르복시 말단보다 적은 퓨린-절단을 재현가능하게 나타내는 분자 또는 그의 특정 폴리펩티드 영역을 의미한다.
[00163] 본 발명의 목적을 위해, "시가 독소 패밀리의 구성원의 A 서브유닛으로부터 유래된 활성 효소 도메인(active enzymatic domain derived form an A Subunit of a member of the Shiga toxin family)"이라는 어구는 시가 독소 효소 활성에 기반한 리보솜의 촉매적 불활성화에 의하여 단백질 합성을 방해할 수 있는 능력을 가진 폴리펩티드 구조를 가리킨다. 단백질 합성의 억제 활성 및/또는 리보솜의 촉매적 불활성화를 나타내는 분자 구조의 능력은 숙련된 작업자에게 공지된 다양한 분석법, 예를 들어 살아있는 세포가 없는 상태에서 RNA 번역 분석법을 포함하는 시험관 내 분석법을 사용하여, 또는 살아있는 세포의 리보솜을 포함하는 세포 또는 생체 내 분석을 사용하여 관찰될 수 있다. 예를 들어, 숙련된 작업자에게 알려진 분석법을 사용하여, 시가 독소 효소 활성에 기초한 분자의 효소 활성은 예를 들어 리보솜 닉킹 분석과 같은 리보솜 RNA(rRNA)에 대한 N-글리코시다제 활성을 관찰함으로써 직접적으로, 및/또는 간접적으로 리보솜 기능, RNA 번역 및/또는 단백질 합성의 억제를 관찰함으로써 분석될 수 있다.
[00164] 시가 독소 이펙터 폴리펩티드와 관련하여 본 명세서에 사용된 "조합(combination)"은 2개 이상의 하위 영역을 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 설명하며, 여기서 각 하위 영역은 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 예를 들어, (1) 내인성 에피토프 또는 에피토프 영역에서의 파괴; 및 (2) A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 파괴된 퓨린-절단 모티프.
[00165] 본 발명의 분자와 관련하여 본 명세서에 사용된 "결합 단백질(binding protein)"은 "CD38-결합 단백질" 또는 "CD38-결합 분자" 또는 "CD38-결합 융합 단백질"과 상호교환적으로 사용된다. 앞서 언급한 모든 분자 유형에는 다양한 "CD38-결합 단백질"이 포함된다. 일반적으로, 본 발명의 단백질은 본 명세서에서 CD38-결합 도메인(또한 본 명세서에서 "항-CD38 항원 결합 도메인"(ABD) 및 본 명세서에서 보다 완전하게 기재된 선택적 링커들로 지칭됨) 및 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드"를 포함하는 "CD38-결합 융합 단백질"로 지칭되며, 선택적 링커들은 본 명세서에서 보다 완전하게 기재된다.
B. 도입
[00166] 본 발명은 CD38에 결합하고 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드(임의의 링커를 가짐; 본 명세서에서 "CD38-결합 융합 단백질"로 지칭됨)를 포함하는 결합 단백질의 속(genus)을 제공한다. 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질은 예를 들어 (1) CD38-발현 세포의 성장을 억제하기 위한 분자로서, (2) CD38-발현 세포를 사멸시키기 위한 세포독성 분자로서, (3) 다른 세포 중에서 특정 CD38-양성 세포 유형(들)을 선택적으로 사멸시키기 위한 분자로서, (4) CD38 발현 세포의 내부로 화물 분자를 전달하기 위한 무독성 전달 비히클로서, (5) CD38-발현 세포를 포함하는 질병 및 상태의 진단, 예후 또는 특성화를 위한 진단 분자로서 및 (6) 다발성 골수종 및 CD38-양성 세포 성장과 같은 조혈암을 비롯한 일부 혈액암과 같은 CD38-발현 세포를 포함하는 다양한 질병, 장애 및 상태를 치료하기 위한 치료 분자로서 유용하다. 일부 구체예들에서, CD38-결합 단백질은 비호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종(BL), B 만성 림프구성 백혈병(B-CLL), B 및 T 급성 림프구성 백혈병(ALL), T-세포 림프종(TCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 모세포 백혈병(HCL: hairy cell leukemia), 호지킨 림프종(HL), 및 만성 골수성 백혈병(CML)을 필요로 하는 대상에서 치료할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 CD38-결합 단백질은 이를 필요로 하는 대상에서 재발성 또는 불응성 다발성 골수종을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 CD-38 결합 단백질은 흑색종을 필요로 하는 대상에서 흑색종을 치료하는 데 사용될 수 있다.
[00167] Shiga toxin A Subunit 이펙터 폴리펩티드는 새로운 결합 단백질을 조작하기 위한 탄탄하고 강력한 스캐폴드를 제공한다(WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, WO 2016/196344, WO 2017/019623, WO 2018/106895, 및 WO 2018/140427). 세포-표적화 모이어티로서 CD38 결합 면역글로불린 유래 단편과 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드의 연관(association)은 CD38 발현 세포를 표적으로 하는 치료 및 진단 분자의 조작을 가능하게 한다.
[00168] C. CD38 결합 융합 단백질의 일반 구조
[00169] 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질은 다음을 포함할 수 있다: (1) 세포 표면과 연관된 CD38의 세포 외 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 영역; 및 (2) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드(본 명세서에서 "시가 독소 이펙터 폴리펩티드"로 지칭됨)를 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역. 일부 구체예들에서, 본 발명의 결합 단백질은 동일하거나 상이한 2개 이상의 동일한 CD38-결합 영역, 및 2개 이상의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역을 포함한다. 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질의 하나의 비제한적인 예는 세포 표면, 또는 상기 언급된 동종이량체(하기에서 보다 완전하게 설명됨)와 연관될 때 CD38의 세포 외 부분에 특이적으로 결합하는 단일쇄 가변 단편을 포함하는 면역글로불린-유형 결합 영역에 융합된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드이다.
[00170] 일부 구체예들에서, 본 발명의 결합 단백질의 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드는 단일 분자에서 2개 이상의 특성, 예를 들어 다음의 능력과 같은 2 이상의 성질을 초래하는 구조적 요소들을 결합한다: 1) 요소의 그 특정 조합이 결여된 분자 변이체와 비교하여 감소된 항원성 및/또는 면역원성을 나타냄, 2) 요소의 그 특정 조합이 결여된 분자 변이체와 비교하여 감소된 프로테아제-절단을 나타냄, 3) 요소의 그 특정 조합이 결여된 분자의 특정 변이체와 비교하여 일부 투여량에서 다세포 유기체에 대해 감소된 비특이적 독성을 나타냄, 및/또는 강력한 세포독성을 나타냄.
[00171] 일부 구체예들에서, 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질은 단량체이다. 일부 구체예들에서, CD38-결합 융합 단백질은 동종이량체이다. 일부 구체예들에서, CD38-결합 융합 단백질은 2개의 동일한 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체이다. 일부 구체예들에서, 단량체성 CD38-결합 융합 단백질은 SEQ ID NO:233의 서열, 또는 그에 대해 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 동일한 서열을 포함한다.
1. CD38 결합 영역들
[00172] 일부 구체예들에서, 본 발명의 CD38-결합 단백질은 CD38 및/또는 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 쥐 등)에서 CD38 발현 세포 또는 CD38 양성 세포와 같은 세포의 세포 표면 상에 존재하는 CD38에 대한 특이적 및 고친화성 결합을 나타낼 수 있는 면역글로불린-유형 폴리펩티드(예: VH 및 VL)를 포함하는 결합 영역("결합 도메인" 또는 "항원 결합 도메인(ABD)으로도 지칭됨)"을 포함한다
[00173] 본 발명은 다수의 CD38-결합 도메인을 제공한다. CD38-결합 도메인의 특정 CDR은 아래에 설명되어 있다. 전술한 바와 같이, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템에서 상이할 수 있다. 그러나, 중가변(heavy variable) 및/또는 경가변(light variable) 영역의 발명은 그 안에 존재하는 CDR의 발명을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 각 중가변 영역의 발명은 vhCDR(예: vhCDR1, vhCDR2, 및 vhCDR3)의 발명이고, 각 경가변 영역의 발명은 vlCDR(예: vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 발명이다.
[00174] 본 발명은 신규한 CD38-결합 도메인을 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 이러한 항원 결합 도메인(ABD)은 인간 및 시노몰구스 CD38 단백질에 결합할 수 있다. 도 25a-d는 인간 및 시노몰구스 CD38 둘 다에 결합할 수 있는 4개의 상이한 항-CD38 ABD를 포함하는 4개의 상이한 결합 단백질을 도시한다. 일부 구체예들에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 Fab 형식, 예를 들어 2개의 상이한 폴리펩티드 사슬 상에서 배열된다. 일부 구체예들에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 함께 융합되어 본 명세서에 일반적으로 개략된 바와 같이 scFv를 형성한다. 대안적으로, 도 1에 도시되고 하기에 보다 충분히 설명된 바와 같이, 이량체화된 후 서로 연관(association)된 2개의 CD-38 결합 융합 단백질 단량체로부터의 CD-38 결합 도메인; 즉, 하나의 단량체 폴리펩티드 사슬의 하나의 VH가 다른 단량체 폴리펩티드 사슬의 VL과 연관되고 그 반대의 경우도 마찬가지이므로 2개의 항-CD38 결합 도메인이 2개의 시가 성분을 포함하는 비공유 결합 동종이량체에 형성된다.
[00175] 또한 CDR 및/또는 프레임워크 영역 중 하나 이상에서 아미노산 변형을 갖는 항-CD38 ABD가 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 개략된 바와 같이, 일부 구체예들에서 6개의 CDR 세트는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 변형을 가질 수 있다(특정 용도를 찾는 아미노산 치환 포함). CDR은 아미노산 변형(예: CDR 세트에서 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산 변형을 가질 수 있음)을 가질 수 있다(즉, CDR은 6개의 CDR 세트에서 총변화가 CDR의 임의의 조합으로 6개 미만의 아미노산 변형인 한에 있어서. 예를 들어 vlCDR1에는 1개, vhCDR2에는 2개, vhCDR3에는 변경 없음 등의 경우가 가능). 일부 구체예들에서, 각각의 CDR은 단일 아미노산 치환 이하를 갖는다. 일부 구체예들에서, vhCDR3에서의 아미노산 치환은 회피된다. 일부 경우에, 인간 및 사이노 CD38 중 하나 또는 둘 모두에 대한 결합 친화도가 증가될 수 있는 반면, 다른 구체예에서는 결합 친화도가 감소될 수 있다. 이들 구체예들에서, 인간 및 사이노 CD38에 대한 결합은 유지된다. 본 명세서에 개략된 VH 및 VL 서열과 비교하여 돌연변이를 함유하는 항-CD38 항원 결합 도메인을 시험하기 위한 예를 들어 Biacore 분석법 또는 실시예 1, 2, 또는 3에 개괄된 결합 분석과 같은 적합한 분석이 당업계에 공지되어 있다.
[00176] 일부 구체예들에서, 본 명세서에 개괄된 항-CD38 ABD는 프레임워크(CDR 제외)가 인간 생식계열 서열에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 동일성을 유지하는 한 또한 가변 중 및 가변 경 프레임워크 영역 중 하나 또는 둘 모두의 프레임워크 영역에서 아미노산 변형(다시, 특정 용도를 찾는 아미노산 치환으로)을 또한 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역이 인간 생식계열 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90% 동일성을 유지하는 한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 동일한 CDR은 인간 생식계열 서열로부터 상이한 프레임워크 서열과 조합될 수 있다.
[00177] 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 열거된 중쇄 가변 및 경쇄 가변 영역의 변이체를 포함하는 CD38-결합 도메인을 제공한다. 중쇄 가변 영역은 본 명세서의 "VH" 서열과 적어도 80%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일하거나, 그리고/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 경쇄 가변 영역은 본 명세서의 "VL" 서열과 적어도 80%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일하거나, 그리고/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 이들 구체예에서, 본 발명은 항원 결합 도메인이 여전히 인간 및 시노몰구스 CD38에 결합하는 한 이러한 변이체를 포함한다. 본 명세서에 개괄된 VH 및 VL 서열과 비교하여 돌연변이를 함유하는 항-CD38 항원 결합 도메인을 시험하기 위한 Biacore 검정 및 실시예 1, 2, 및 3의 것과 같은 적합한 분석법이 당업계에 공지되어 있다.
[00178] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM1(도 25a)이고 아미노산 서열이 적어도 80%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 이상 SEQ ID NO:109와 동일한 중쇄 가변 영역 및 80%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 이상 SEQ ID NO:113과 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[00179] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM1(도 25a)이고 SEQ ID NO:110을 포함하는 vhCDR1, SEQ ID NO:111을 포함하는 vhCDR2, SEQ ID NO:112를 포함하는 vhCDR3, SEQ ID NO:114를 포함하는 vlCDR1, SEQ ID NO:115를 포함하는 vlCDR2, 및 SEQ ID NO:116을 포함하는 vlCDR3를 포함한다. 일부 구체예들에서, 이러한 6개의 CDR 중 하나 이상은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형을 갖는다. 구체예들에서, 임의의 단일 CDR은 1 또는 2개 이하의 아미노산 치환을 함유하고, 변형된 항-CD38 항원 결합 도메인은 인간 CD38에 대한 결합을 유지한다.
[00180] 일부 구체예들에서 CD38TM1의 CD38-결합 도메인(도 25a)은 SEQ ID NO:109에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VH 도메인을 갖는다.
[00181] 일부 구체예들에서, CD38TM1의 CD38-결합 도메인(도 25a)은 SEQ ID NO:113에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VL 도메인을 갖는다.
[00182] 일부 구체예들에서, CD38TM1의 CD38-결합 도메인(도 25a)은 SEQ ID NO:109에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VH 도메인 및 SEQ ID NO:113에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VL 도메인을 갖는다.
[00183] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM1(도 25a)이고 SEQ ID NO:109를 갖는 VH 및 SEQ ID NO:113을 갖는 VL을 갖는다.
[00184] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM2(도 25b)이고 적어도 80%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) SEQ ID NO:117과 동일한 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 적어도 80%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) SEQ ID NO:121과 아미노산 서열이 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[00185] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM2(도 25b)이고, SEQ ID NO:118을 포함하는 vhCDR1, SEQ ID NO:119를 포함하는 vhCDR2, SEQ ID NO:120을 포함하는 vhCDR3, SEQ ID NO:122를 포함하는 vlCDR1, SEQ ID NO:23을 포함하는 vlCDR2, 및 SEQ ID NO:124를 포함하는 vlCDR3을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이러한 6개의 CDR 중 하나 이상은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형을 갖는다. 구체예들에서, 단일 CDR은 1 또는 2개 이하의 아미노산 치환을 함유하고, 변형된 항-CD38 항원 결합 도메인은 인간 및/또는 시노몰구스 CD38에 대한 결합을 유지한다.
[00186] 일부 구체예들에서, CD38TM2의 CD38-결합 도메인(도 25b)은 SEQ ID NO:117에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VH 도메인을 갖는다.
[00187] 일부 구체예들에서 CD38TM1의 CD38-결합 도메인(도 25a)은 SEQ ID NO:121에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VL 도메인을 갖는다.
[00188] 일부 구체예들에서, CD38TM2의 CD38-결합 도메인(도 25b)은 SEQ ID NO:117에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VH 도메인 및 SEQ ID NO:121에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VL 도메인을 갖는다.
[00189] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM2(도 25b)이고 SEQ ID NO:117을 갖는 VH 및 SEQ ID NO:121을 갖는 VL을 갖는다.
[00190] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM3(도 25c)이고, 아미노산 서열이 SEQ ID NO:101과 80% 이상(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:105과 아미노산 서열이 80% 이상(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[00191] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM3(도 25c)이고 SEQ ID NO:102를 포함하는 vhCDR1, SEQ ID NO:103을 포함하는 vhCDR2, SEQ ID NO:104를 포함하는 vhCDR3, SEQ ID NO:106를 포함하는 vlCDR1, SEQ ID NO:7을 포함하는 vlCDR2, 및 SEQ ID NO:108을 포함하는 vlCDR3을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이러한 6개의 CDR 중 하나 이상은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형을 갖는다. 구체예들에서, 단일 CDR은 1 또는 2개의 아미노산 치환을 함유하고, 변형된 항-CD38 항원 결합 도메인은 인간 및/또는 시노몰구스 CD38에 대한 결합을 유지한다.
[00192] 일부 구체예들에서, CD38TM3의 CD38-결합 도메인(도 25c)은 SEQ ID NO:101에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VH 도메인을 갖는다.
[00193] 일부 구체예들에서, CD38TM3의 CD38-결합 도메인(도 25c)은 SEQ ID NO:105에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VL 도메인을 갖는다.
[00194] 일부 구체예들에서, CD38TM3의 CD38-결합 도메인(도 25c)은 SEQ ID NO:101에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VH 도메인 및 SEQ ID NO:105에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VL 도메인을 갖는다.
[00195] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM3(도 25c)이고 SEQ ID NO:101을 갖는 VH 및 SEQ ID NO:105를 갖는 VL을 갖는다.
[00196] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 본 발명에서 CD38TM4(도 25d)이고 아미노산 서열이 SEQ ID NO:101과 적어도 80%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 중쇄 가변 영역 및 아미노산 서열이 SEQ ID NO:125와 적어도 80%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
[00197] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM4(도 25d)이고 SEQ ID NO:102를 포함하는 vhCDR1, SEQ ID NO:3을 포함하는 vhCDR2, SEQ ID NO:104를 포함하는 vhCDR3, SEQ ID NO:106을 포함하는 vlCDR1, SEQ ID NO:107을 포함하는 vlCDR2, 및 SEQ ID NO:108을 포함하는 vlCDR3를 포함한다. 일부 구체예들에서, 이러한 6개의 CDR 중 하나 이상은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형을 갖는다. 구체예에서, 단일 CDR은 1 또는 2개의 아미노산 치환을 함유하고, 변형된 항-CD38 항원 결합 도메인은 인간 및/또는 시노몰구스 CD38에 대한 결합을 유지한다.
[00198] 일부 구체예들에서, CD38TM4의 CD38-결합 도메인(도 25d)은 SEQ ID NO:101에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VH 도메인을 갖는다.
[00199] 일부 구체예들에서, CD38TM1의 CD38-결합 도메인(도 25a)은 SEQ ID NO:125에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VL 도메인을 갖는다.
[00200] 일부 구체예들에서, CD38TM4의 CD38-결합 도메인(도 25d)은 SEQ ID NO:101에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VH 도메인 및 SEQ ID NO:125에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는 VL 도메인을 갖는다.
[00201] 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 CD38TM4(도 25d)이고 SEQ ID NO:101을 갖는 VH 및 SEQ ID NO:125를 갖는 VL을 갖는다.
[00202] 각각의 CD38-결합 도메인에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및/또는 CDR에서 본 명세서에 기재된 서열 변이체에 추가하여, 중가변 및/또는 경가변 영역(들)의 프레임워크 영역(들)의 변화가 만들어질 수 있다. 일부 구체예들에서, 표 4에 기재된 프레임워크 영역 서열에 대해 적어도 80, 85, 90, 또는 95% 동일성을 유지하면서 6개의 CDR을 변경하지 않도록 유지하고 인간 및/또는 시노몰구스 CD38에 대한 결합을 유지하는 프레임워크 영역에서 변이가 이루어진다.
[00203] 일부 구체예들에서, 인간 및/또는 시노몰구스 CD38에 대한 CD38-결합 도메인의 결합을 유지하면서 프레임워크 영역 및 6개의 CDR 모두에서 변이가 이루어진다. 이들 구체예에서, CDR은 아미노산 변형을 가질 수 있다(예를 들어, 6개의 CDR 세트에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형으로부터, 즉 변화되는 CDR의 임의의 조합에 대해 6개의 CDR 세트에서 총 변화의 수가 6개 아미노산 변형보다 작은 한 CDR은 변형될 수 있다; 예를 들어, vlCDR1에서 1개, vhCDR2에서 2개, vhCDR3에서 변경 없음 등의 경우가 가능하다).
a. CD38 결합 도메인의 형식
[00204] 도 1에 도시되고 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 CD38 결합 도메인은 상이한 폴리펩티드 사슬 또는 단일 폴리펩티드 사슬에 상주할 수 있는 VH 및 VL 도메인을 포함한다. VH 및 VL은 예를 들어 CD38-결합 융합 단백질이 단량체인 일부 구체예들에서 scFv를 형성할 수 있음을 주목해야 한다. 본 명세서에 기술되고 도 1에 도시된 바와 같은 일부 경우에, VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 사슬 상에 있지만 이들 사이의 링커는 분자 내 연관을 허용하기에는 너무 짧아서 2개의 항-CD38 결합 영역 및 2개의 시가 성분을 함유하는 동종이량체가 형성된다. 다른 구체예들에서, VH와 VL 사이의 링커는 scFv 형성을 허용하기에 충분히 길며, 따라서 단백질 융합은 단량체이다.
[00205] 일부 구체예들에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 CD38-결합 도메인을 포함하는 scFv를 포함한다. scFv는 인간 및 시노몰구스 CD38에 결합하고, scFv 링커에 의해 연결된 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 그의 N-말단에서 C-말단으로 VH-링커-VL을 포함한다. 일부 구체예들에서, CD38-결합 도메인은 그의 N-말단에서 C-말단으로 VL-링커-VH를 포함한다.
2. 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 성분
본 발명의 결합 단백질은 시가 독소 A 서브유닛으로부터 유래된 하나 이상의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함한다. 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 하나 이상의 시가 독소 기능을 시현할 수 있는 시가 독소 패밀리의 시가 독소 A 서브유닛 구성원으로부터 유래된 폴리펩티드이다(Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010); WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, WO 2016/196344, WO 2017/019623, WO 2018/106895, 및 WO 2018/140427). 시가 독소 기능에는 예를 들어 세포 내재화 증가, 엔도솜 구획에서 세포질로의 하위세포 경로 지정, 세포 내 분해 방지, 촉매적 리보솜 불활성화(단백질 합성 방지) 및 세포 증식 억제 및/또는 세포독성 효과가 포함된다.
[00206] 단백질 독소의 시가 독소 패밀리는 구조적 및 기능적으로 관련된 다양한 자연 발생 독소, 예를 들어 시가 독소, 시가 유사 독소 1 및 시가 유사 독소 2 등으로 구성된다(Johannes L, Rφmer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16(2010)). 시가 독소 패밀리의 홀로톡신 구성원은 일부 숙주 세포의 표면에 존재하는 특정 글리코스핑고리피드(glycosphingolipid)에 선택적으로 결합하는 표적화 도메인과 일단 세포 내부에서는 리보솜을 영구적으로 비활성화할 수 있는 효소 도메인을 포함한다(Johannes L, Rφmer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Members of the Shiga toxin family share the same overall structure and mechanism of action (Engedal N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). 예를 들어, Stx, SLT-1 및 SLT-2는 무세포 시스템에서 분명하지 않은 효소 활성을 나타낸다(Head S et al., J Biol Chem 266: 3617-21 (1991); Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392-402 (1993); Brigotti M et al., Toxicon 35:1431-1437 (1997)).
[00207] 시가 독소 패밀리는 S. dysenteriae 혈청형(serotype) 1에서 분리된 진정한 시가 독소(Stx), 장출혈성 대장균(enterohemorrhagic E. coli)의 스테레오타입에서 분리된 시가 유사 독소 1 변이체(SLT1 또는 Stx1 또는 SLT-1 또는 Slt-I) 및 장출혈성 대장균의 혈청형에서 분리된 시가-유사 독소 2 변이체(SLT2 또는 Stx2 또는 SLT-2) 등을 포괄한다. SLT1은 Stx와 단 하나의 아미노산 잔기가 다르며 둘 다 베로세포독소(Verocytotoxin) 또는 베로독소(Verotoxins(VT))로 불린다(O'Brien A, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). SLT1 및 SLT2 변이체는 1차 아미노산 서열 수준에서 서로 약 53-60%만 유사하지만 시가 독소 패밀리 구성원에게 공통적인 효소 활성 및 세포독성 메커니즘을 공유한다(Johannes L, Rφmer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). 정의된 하위 유형 Stx1a, Stx1c, Stx1d 및 Stx2a-g와 같은 39개 이상의 상이한 시가 독소가 설명되었다(Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)). 시가 독소 패밀리의 구성원은 시가 독소 인코딩 유전자가 수평 유전자 전달을 통해 세균 종 사이에 퍼질 수 있기 때문에 자연적으로 어떤 세균 종에도 제한되지 않는다(Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Bielaszewska M et al., Appl Environ Micrbiol 73: 3144-50 (2007); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol 21: R242-6 (2011)). 종간 이동의 예로서, 시가 독소가 인간 대상으로부터 분리된 A. haemolyticus 균주에서 발견되었다(Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006)). 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 시가 독소가 새로운 아종 또는 종에 진입하면 시가 독소 아미노산 서열은 시가 독소 패밀리의 구성원에 공통적인 세포독성의 메커니즘을 유지하면서 유전적 드리프트 및/또는 선택 압력으로 인해 약간의 서열 변이를 일으킬 수 있는 것으로 생각된다(Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012) 참조).
[00208] 하기에 보다 충분하게 기재된 바와 같이 본 발명의 CD38-결합 단백질의 일부 구체예들에서, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 성분은 적어도 하기 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 서브영역들의 조합을 포함한다: (1) 탈면역화된 하위 영역 및 (2) 시가 독소 A1 단편 영역의 카르복시 말단 근처의 프로테아제-절단 저항성 하위 영역.
[00209] 일부 구체예들에서, CD38-결합 단백질은 SEQ ID NO:45-69 중 어느 하나의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드는 SEQ ID NO:46의 서열을 포함한다.
a. 특정 구체예에서 유용한 시가 독소 성분
[00210] 당업계에서 설명된 바와 같이, 하기에 일반적으로 기술되는 바와 같이 본 발명의 CD38 결합 영역과의 조합에 사용되는 다수의 시가 독소 성분이 있다. 구체적으로, 2019년 1월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/795,633의 구체예 #1 내지 #11은 그 전체가 참고로 구체적으로 포함된다.
(i) 야생형 시가 독소 성분
[00211] 일부 구체예들에서, 표 20의 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3에 나타낸 것과 같은 야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드가 사용될 수 있다(예를 들어 WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2017/019623 등 참조, 및 특히 WO2017/019623의 단락 [21]에 언급된 것과 같은 야생형 서열의 서열 및 단편에 대해, 그 전체가 참고로 포함된다.).
(ii) 파괴된 퓨린-절단 모티프(furin-cleavage motif)를 갖는 시가 독소 성분
[00212] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 그의 시가 독소 A1 단편 영역의 카르복시-말단에서 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다(예를 들어, WO 2015/191764 참조, 그 전문이 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함됨, 특히 단락 [8], [9] 및 파괴된 모티프 및 파괴된 모티프를 포함하는 독소 폴리펩티드의 서열). 이와 관련하여 특히 유용한 구체예는 SEQ ID NO:46이다.
[00213] 시가 독소 패밀리 구성원의 시가 독소 A 서브유닛은 시가 독소 기능에 중요한 A1 단편 영역의 카르복시 말단에 보존된 퓨린-절단 부위를 포함한다. 퓨린-절단 부위 모티프 및 퓨린-절단 부위는 표준 기술 및/또는 본 명세서의 정보를 사용하여 숙련된 작업자에 의해 확인될 수 있다.
[00214] 시가 독소 세포독성 모델은 중독된 세포에서 퓨린에 의한 시가 독소 A 서브유닛의 세포 내 단백질 분해 처리가 다음을 위해 필수적이라는 것이다: 1) 나머지 시가 홀로톡신으로부터 A1 단편의 유리(liberation), 2) A1 단편의 카르복시-말단에 소수성 도메인을 노출시키는 것에 의한 소포체로부터 A1 단편의 탈출, 및 3) A1 단편의 효소적 활성화(Johannes L, Rφmer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010) 참조). 중독된 세포의 소포체에서 A2 단편 및 시가 홀로톡신 성분의 나머지로부터 시가 독소 A1 단편의 효율적인 유리는 세포질로의 효율적인 세포 내 라우팅, 최대 효소 활성, 효율적인 리보솜 불활성화 및 최적 즉 야생형 시가 독소에 필적하는 세포독성 달성을 위해 필수적이다(예를 들어 WO 2015/191764 및 그 안의 참고문헌 참조).
[00215] 시가 독소 중독 동안, A 서브유닛은 보존된 아르기닌 잔기(예: StxA 및 SLT-1A에서 위치 251에 있는 아르기닌 잔기 및 Stx2A 및 SLT-2A에서 위치 250에 있는 아르기닌 잔기)의 카르복시 결합에서 퓨린에 의해 단백질 분해적으로 절단된다. 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린-절단은 엔도솜 및/또는 골지 구획에서 발생한다. 퓨린은 검사된 모든 인간 조직 및 대부분의 동물 세포에서 다양한 세포 유형에 의해 발현되는 특수화된 세린 엔도프로테아제(specialized serine endoprotease)이다. 퓨린은 종종 최소의 이염기성 공통 모티프(dibasic, consensus motif) R-x-(R/K/x)-R(SEQ ID NO:181)에 중심을 둔 접근 가능한 모티프를 포함하는 폴리펩티드를 절단한다. 시가 독소 패밀리 구성원의 A 서브유닛은 퓨린에 의해 절단되는 보존된 S-R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:182) 모티프로 보존되고 표면노출된, 확장된 루프 구조(예: StxA 및 SLT-1A에서 242-261 및 SLT-2에서 241-260)를 포함한다. StxA의 아미노산 잔기 242-261에 위치한 표면 노출된 확장 루프 구조는 최소 퓨린-절단 모티프 R-x-x-R(SEQ ID NO:183)에 인접한 특징을 포함하여 StxA의 퓨린-유도 절단에 필요하다.
[00216] 시가 독소 A 서브유닛 및 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 퓨린-절단 모티프 및 퓨린-절단 부위는 표준 방법 및/또는 본 명세서의 정보를 사용하여 숙련된 작업자가 확인할 수 있다. 퓨린은 최소의 공통 모티프 R-x-x-R(SEQ ID NO:183)을 절단한다(Schalken J et al., J Clin Invest 80: 1545-9 (1987); Bresnahan P et al., J Cell Biol 111: 2851-9 (1990); Hatsuzawa K et al., J Biol Chem 265: 22075-8 (1990); Wise R et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 9378-82 (1990); Molloy S et al., J Biol Chem 267: 16396-402 (1992)). 이와 일관되게, 많은 퓨린 억제제는 모티프 R-x-x-R(SEQ ID NO:183)을 포함하는 펩티드를 포함한다. 퓨린의 합성 억제제의 예는 펩티드 R-V-K-R(SEQ ID NO:190)을 포함하는 분자이다(Henrich S et al., Nat Struct Biol 10: 520-6 (2003)). 일반적으로, 두 개의 아미노산 잔기에 의해 분리된 두 개의 양전하를 띤 아미노산이 있는 표면 접근 가능한 이염기성 아미노산 모티프를 포함하는 펩티드 또는 단백질은 모티프에서 마지막 염기성 아미노산의 카르복시 결합에서 절단이 일어나는 퓨린-절단에 민감할 것으로 예측할 수 있다.
[00217] 퓨린에 의해 절단된 기질(substrate)의 컨센서스 모티프는 어느 정도의 특이성으로 확인되었다. 퓨린-절단 부위 모티프는 P14에서 P6'으로 표지될 수 있는 20개의 연속 아미노산 잔기의 영역을 포함하는 것으로 설명되었다(Tian S et al., Int J Mol Sci 12: 1060-5 (2011)) - "Schechter I, Berger, A, Biochem Biophys Res Commun 32: 898-902 (1968)"의 명명법 사용). 이 명명법에 따르면 퓨린-절단 부위는 P1으로 지정된 아미노산 잔기의 카르복시 결합에 있으며 퓨린-절단 모티브의 아미노산 잔기는 이 참조 P1 잔기로부터 아미노-말단 쪽 방향으로 가면서 P2, P3, P4 등으로 번호가 매겨진다. P1 참조 잔기(reference residue)에서 카르복시 말단으로 향하는 모티프의 아미노산 잔기는 프라임 표기법 P2', P3', P4' 등으로 번호가 매겨진다. 이 명명법을 사용하여 P6에서 P2' 영역은 퓨린의 효소 도메인에 의해 결합되는 퓨린-절단 모티프의 코어 기질(substrate)을 나타낸다. 두 측면 영역 P14에서 P7 및 P3'에서 P6'에는 극성 아미노산 잔기가 풍부하여 그 사이에 위치한 코어 퓨린-절단 부위에 대한 접근성을 증가시킨다.
[00218] 일반적인 퓨린-절단 부위는 종종 P4-P3-P2-P1(SEQ ID NO:192)에 해당하는 컨센서스 모티프 R-x-x-R(SEQ ID NO:183)에 의해 기술되며; 여기서 "R"은 아르기닌 잔기를 나타내고(위의 표 1 참조), 대시 "-"는 펩티드 결합을 나타내고, 소문자 "x"는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다. 그러나 다른 잔기 및 위치는 퓨린-절단 모티프를 추가로 정의하는 데 도움이 될 수 있다. 약간 더 세련된 퓨린-절단 부위인 컨센서스 모티프는 컨센서스 모티프 Rx-[K/R]-R(SEQ ID NO:191)로 종종 보고되고(여기서 "/"는 "또는"을 의미하고 동일한 위치에서 대안적인 아미노산을 구분함), 이는 P4-P3-P2-P1 (SEQ ID NO:192)에 대응되는데, 퓨린이 이 모티프를 포함하는 기질을 절단하는데 강한 선호가 있다는 것이 관찰되었기 때문이다.
[00219] 최소의 퓨린-절단 부위 R-x-x-R(SEQ ID NO:183)에 더하여 더 큰 퓨린-절단 모티프가 특정 위치에서 특정 아미노산 잔기 선호도와 함께 설명되었다. 다양한 알려진 퓨린 기질을 비교함으로써, 20개 아미노산 잔기 길이의 퓨린-절단 부위 모티프의 아미노산 잔기에 대한 특정 물리화학적 성질들이 특성화되었다. 퓨린-절단 모티프의 P6에서 P2' 영역은 퓨린의 효소 도메인과 물리적으로 상호작용하는 코어 퓨린-절단 부위를 나타낸다. 두 개의 측면 영역 P14~P7 및 P3'~P6'은 종종 친수성으로 극성 아미노산 잔기가 풍부하여 이들 사이에 위치한 코어 퓨린-절단 부위의 표면 접근성을 증가시킨다.
[00220] 일반적으로 위치 P5에서 P1까지의 퓨린-절단 모티프 영역은 양전하 및/또는 높은 등전점(isoelectric point)을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 경향이 있다. 특히, 퓨린 단백질 분해의 위치를 표시하는 P1 위치는 일반적으로 아르기닌에 의해 점유되지만 다른 양으로 하전된 아미노산 잔기가 이 위치에서 발생할 수 있다. 위치 P2 및 P3은 유연한 아미노산 잔기가 차지하는 경향이 있고, 특히 P2는 아르기닌, 라이신, 또는 때때로 글리신과 같은 매우 작고 유연한 아미노산 잔기가 차지하는 경향이 있다. P4 위치는 퓨린 기질에서 양전하를 띤 아미노산 잔기가 차지하는 경향이 있다. 그러나, P4 위치가 지방족 아미노산 잔기에 의해 점유된다면, 양전하 작용기의 결여는 위치 P5 및/또는 P6에 위치한 양전하 잔기에 의해 보상될 수 있다. 위치 P1' 및 P2'는 일반적으로 지방족 및/또는 소수성 아미노산 잔기가 차지하며, P1' 위치는 가장 일반적으로 세린이 차지한다.
[00221] 2개의 친수성 측면 영역은 극성이고 친수성이며 더 작은 아미노산 작용기를 갖는 아미노산 잔기가 차지하는 경향이 있다. 그러나 확인된 특정 퓨린 기질에서 측면 영역은 친수성 아미노산 잔기를 포함하지 않는다(Tian S, Biochem Insights 2: 9-20 (2009) 참조).
[00222] 시가 독소 A1 단편과 A2 단편 사이의 접합부에 있는 천연 시가 독소 A 서브유닛에서 발견되는 20개의 아미노산 잔기, 퓨린-절단 모티프 및 퓨린-절단 부위는 특정 시가 독소에서 잘 특징지어진다. 예를 들어, StxA(SEQ ID NO:2) 및 SLT-1A(SEQ ID NO:1)에서, 이 퓨린-절단 모티프는 자연적으로 L238에서 F257에 위치하며, SLT-2A(SEQ ID NO:3)에서 이 퓨린-절단 모티프는 자연적으로 V237에서 Q256으로 위치한다. 본 명세서에 기술된 아미노산 상동성, 실험 및/또는 퓨린-절단 분석에 기초하여, 숙련된 작업자는 다른 천연 시가 독소 A 서브유닛 또는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에서 퓨린-절단 모티프를 확인할 수 있는데, 여기서 모티프가 실제 퓨린-절단 모티프인 또는 진핵 세포 내에서 이들 분자의 퓨린-절단 후 A1 및 A2 단편의 생성을 초래할 것으로 예상된다.
[00223] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 (1) 카르복시-말단을 갖는 시가 독소 A1 단편 유래 폴리펩티드 및 (2) 시가 독소 A1 단편 유래 폴리펩티드의 카르복시-말단에서 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다. 시가 독소 A1 단편 유래 폴리펩티드의 카르복시-말단은 당업계에 공지된 기술을 사용함으로써, 예를 들어 (i) 자연 발생 시가 독소로 보존된 퓨린-절단 모티프, (ii) 자연발생 시가 독소로 보존된 표면 노출, 확장 루프 및/또는 (iii) ERAD 시스템에 의해 인식될 수 있는 주로 소수성일 수 있는 아미노산 잔기의 스트레치(즉, 소수성 "패치")를 파악하기 위해 단백질 서열 정렬 소프트웨어를 사용함으로써 파악될 수 있다.
[00224] 본 발명의 결합 단백질의 프로테아제-절단 저항성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 (1) 그의 시가 독소 A1 단편 영역의 카르복시-말단에 임의의 퓨린-절단 모티프가 완전히 결여될 수 있거나, 및/또는 (2) 시가 독소 A1 단편 영역 및/또는 시가 독소 A1 단편의 카르복시 말단에서 유래된 영역의 카르복시 말단에서 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함할 수 있다. 퓨린-절단 모티프의 파괴는 퓨린-절단 모티프의 아미노산 잔기에 대한 다양한 변경, 예를 들어 번역 후 변형(들), 아미노산 작용기의 하나 이상의 원자 변경, 아미노산 작용기에 대한 하나 이상의 원자의 추가, 비-단백질성 모이어티(들)에 대한 연관, 및/또는 분지된 단백질성 구조를 초래하는 것과 같은 아미노산 잔기, 펩티드, 폴리펩티드에 대한 연결을 포함한다.
[00225] 프로테아제-절단 저항성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 천연 발생 여부에 상관없이, WO 2015/191764에 기술된 및/또는 숙련된 작업자에게 공지된 방법을 사용하여 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 시가 독소 A 서브유닛 폴리펩티드로부터 생성될 수 있는데, 생성된 분자는 여전히 하나 이상의 시가 독소 A 서브유닛 기능을 보유한다.
[00226] 퓨린-절단 부위 또는 퓨린-절단 모티프와 관련하여 본 발명의 목적을 위해, 용어 "파괴(disruption)" 또는 "파괴된(disrupted)"은 야생형 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린-절단 또는 야생형 폴리펩티드 서열만을 포함하는 야생형 시가독소 A 서브유닛으로부터 유래된 폴리펩티드에 비교하여 시가 독소 A1 단편 영역의 카르복시-말단에 근접한 퓨린-절단의 감소 또는 그로부터 유래된 식별가능한 영역을 초래하는 돌연변이와 같은 자연 발생 퓨린-절단 부위 및/또는 퓨린-절단 모티프로부터의 변경을 지칭한다. 퓨린-절단 모티프의 아미노산 잔기에 대한 변경은 예를 들어, 퓨린-절단 모티프의 결실, 삽입, 역위, 치환, 및/또는 카르복시-말단 절단과 같은 퓨린-절단 모티프의 돌연변이 뿐만 아니라 예를 들어, 아미노산 잔기의 작용기에 분자를 접합 또는 연결하는 것을 수반하는 글리코실화, 알부민화 등의 결과와 같은 번역후 변형도 포함한다. 퓨린-절단 모티프는 약 20개의 아미노산 잔기로 구성되어 있기 때문에 이론상 이러한 20개 위치 중 어느 하나의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 변경(alterations), 변형(modifications), 돌연변이, 결실, 삽입, 및/또는 절단은 퓨린-절단 민감도의 감소를 초래할 수 있다(Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012)). 퓨린-절단 부위 및/또는 퓨린-절단 모티프의 파괴는 포유동물의 혈관계에서 흔히 볼 수 있는 트립신 및 세포 외 프로테아제와 같은 다른 프로테아제에 의한 절단에 대한 내성을 증가시키거나 증가시키지 않을 수 있다. 주어진 프로테아제의 절단 감수성에 대한 주어진 파괴의 효과는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 숙련된 작업자에 의해 시험될 수 있다.
[00227] 본 발명의 목적을 위해, "파괴된 퓨린-절단 모티프(disrupted furin-cleavage motif)"는 시가 독소 A1 단편과 A2 단편 영역 사이의 접합부에 있고 시가 독소 A 서브유닛의 퓨린-절단으로 인해 A1 및 A2 단편이 생성되도록 위치한 천연의 시가 독소 A 서브유닛에서 발견되는 보존된 퓨린-절단 모티프를 나타내는 20개 아미노산 잔기 영역으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 변경을 포함하는 퓨린-절단 모티프이며, 여기서 파괴된 퓨린-절단 모티프는 숙련된 작업자에게 알려진 및/또는 본 명세서에 기술된 적절한 분석을 사용하여 퓨린-절단을 모니터링하기에 충분히 큰 사이즈의 카르복시-말단 폴리펩티드에 융합된 야생형, 시가 독소 A1 단편 영역을 포함하는 기준분자에 비교하여 실험적으로 재현가능한 방법으로 감소딘 퓨린-절단을 나타낸다.
[00228] 퓨린-절단 부위 및 퓨린-절단 모티프를 파괴할 수 있는 돌연변이 유형의 예는 아미노산 잔기 결실, 삽입, 절단, 역위, 및/또는 비표준 아미노산 및/또는 비천연 아미노산으로의 치환을 포함한 치환 등이다. 또한, 퓨린-절단 부위(site) 및 퓨린-절단 모티프는 예를 들어, PEG화, 소분자 보조제의 커플링 및/또는 부위 특이적 알부민화의 결과로 발생하는 것과 같이 부위 또는 모티프에서 적어도 하나의 아미노산을 마스킹(masking)하는 공유적으로 결합된 구조의 첨가에 의한 아미노산의 변형을 포함하는 돌연변이에 의해 파괴될 수 있다.
[00229] 퓨린-절단 모티프가 돌연변이 및/또는 비천연 아미노산 잔기의 존재에 의해 파괴된 경우, 특정 파괴된 퓨린-절단 모티프는 어떤 퓨린-절단 모티프와 관련된 것으로 쉽게 인식되지 않을 수 있다. 그러나, 시가 독소 A1 단편 유래 영역의 카르복시 말단은 인식가능할 것이고 그것이 파괴되지 않은 경우 퓨린-절단 모티프가 어디에 위치할 것인가를 정의할 것이다. 예를 들어, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 시가 독소 A 서브유닛 및/또는 시가 독소 A1 단편과 비교하여 카르복시-말단 절단으로 인해 퓨린-절단 모티프의 20개 미만의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
[00230] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 (1) 카르복시-말단을 갖는 시가 독소 A1 단편 유래 폴리펩티드 및 (2) 시가 독소 A1 단편 폴리펩티드 영역의 카르복시-말단에 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하며, 여기서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드(및 이를 포함하는 임의의 결합 단백질)는, 예를 들어 A1 단편의 카르복시 말단을 포함하는 야생형 시가 독소 폴리펩티드 및/또는 또는 A1과 A2 단편 사이의 보존된 퓨린-절단 모티프와 같은 참조 분자에 비교하여 더욱 퓨린-절단 저항성이다. 예를 들어, 참조 분자와 비교하여 한 분자의 퓨린-절단 감소는 WO 2015/191764에 기술된 시험관내 퓨린-절단 분석을 사용하여 결정할 수 있으며, 동일한 조건을 사용하여 수행한 다음 퓨린-절단의 변화를 정량적으로 측정하기 위해 절단으로 인한 임의의 단편들의 밴드 밀도의 정량화(quantitation)를 수행한다.
[00231] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 야생형, 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 시험관내 및/또는 생체내 퓨린-절단에 대해 더 내성이다.
[00232] 일반적으로, 본 발명의 결합 단백질의 프로테아제-절단 민감성은 그것의 퓨린-절단 저항성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 시가 독소 A1 단편을 포함하는 야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드로 대체하게 한 동일한 분자에 그것을 비교함으로써 시험된다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질은 그 카르복시-말단에서 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 야생형 시가 독소 A1 단편을 포함하는 참조 분자와 비교하여 시험관내 퓨린-절단의 감소가 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 그 이상을 나타낸다.
[00233] 여러 퓨린-절단 모티프 파괴가 설명되었다. 예를 들어, 최소 R-x-x-R 모티프(SEQ ID NOL: 183)에서 두 개의 보존된 아르기닌을 알라닌으로 돌연변이 시키는 것은 퓨린 및/또는 퓨린-유사 프로테아제에 의한 프로세싱을 완전히 차단했다(예: Duda A et al., J Virology 78: 13865-70 (2004)). 퓨린-절단 부위 모티프는 약 20개의 아미노산 잔기로 구성되어 있기 때문에 이론적으로 이들 20개 아미노산 잔기 위치 중 하나 이상을 포함하는 특정 돌연변이는 퓨린-절단을 폐지하거나 퓨린-절단 효율을 감소시킬 수 있다(예: Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012)).
[00234] 일부 구체예들에서, 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질은 시가 독소 패밀리의 구성원의 하나 이상의 A 서브유닛으로부터 유래된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 시가 독소 A 서브유닛의 보존된 접근성이 높은 프로테아제-절단 민감성 루프로부터 유래된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, StxA 및 SLT-1A에서 이 고도로 접근 가능한 프로테아제-민감성 루프는 본래 아미노산 잔기 242에서 261에, 및 SLT-2A에 위치하며, 이 보존된 루프는 본래 아미노산 잔기 241에서 260에 위치한다. 폴리펩티드 서열 상동성에서 숙련된 작업자는 다른 시가 독소 A 서브유닛에서 이 보존되고 접근성이 높은 루프 구조를 확인할 수 있다. 이 루프의 아미노산 잔기에 대한 특정 돌연변이는 루프 내의 특정 아미노산 잔기의 단백질 분해 절단에 대한 접근성을 감소시킬 수 있으며 이는 퓨린-절단 민감도를 감소시킬 수 있다.
[00235] 일부 구체예들에서, 본 발명의 분자는 시가 독소 A 서브유닛 사이에 보존된 표면-노출된 프로테아제 민감성 루프의 돌연변이를 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 분자는 시가 독소 A 서브유닛의 프로테아제-민감성 루프에서의 돌연변이를 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함하며, 돌연변이는 퓨린-절단 민감도가 감소하도록 루프 내에서 특정 아미노산 잔기의 표면 접근성을 감소시키는 것이다.
[00236] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 파괴된 퓨린-절단 모티프는 예를 들어 최소 퓨린-절단 모티프 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)의 위치 1 및 4에 있는 아미노산 잔기와 같은 컨센서스 아미노산 잔기 P1 및 P4 중 하나 또는 둘 모두의 존재, 위치 또는 작용기 측면에서 파괴를 포함한다. 예를 들어, 최소 퓨린 컨센서스 부위 R-x-x-R(SEQ ID NO:183)에서 2개의 아르기닌 잔기 중 하나 또는 둘 모두를 알라닌으로 돌연변이시키는 것은 퓨린-절단 모티프를 파괴하고 그 부위에서 퓨린-절단을 방지할 것이다. 유사하게, 최소 퓨린-절단 모티프 R-x-x-R(SEQ ID NO:183)에서 아르기닌 잔기 중 하나 또는 둘 모두의 숙련된 작업자에게 알려진 임의의 비보존적 아미노산 잔기로 치환시키는 것은 그 모티프의 퓨린-절단 민감도를 감소시킬 것이다. 특히, A, G, P, S, T, D, E, Q, N, C, I, L, M, V, F, W, 및 Y와 같이 양전하가 없는 임의의 비염기성(non-basic) 아미노산 잔기로의 아르기닌의 아미노산 잔기 치환은 파괴된 퓨린-절단 모티프를 초래할 것이다.
[00237] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 파괴된 퓨린-절단 모티프는 2개가 아닌 개재(intervening) 아미노산 잔기의 수의 관점에서 컨센서스 아미노산 잔기 P4 및 P1 사이의 간격에서의 파괴를 포함하고, 따라서, P4 및/또는 P1을 다른 위치로 변경하고 P4 및/또는 P1 지정을 제거한다. 예를 들어, 최소 퓨린-절단 부위 또는 코어 퓨린-절단 모티프의 퓨린-절단 모티프 내의 결실은 퓨린-절단 모티프의 퓨린-절단 감도를 감소시킬 것이다.
[00238] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 예를 들어 다음과 같은 최소 퓨린-절단 부위 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함한다: StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해, 천연 위치의 아미노산 잔기 R248이 양전하를 띠지 않는 아미노산 잔기로 치환되거나 및/또는 R251이 양전하를 띠지 않는 아미노산 잔기로 치환됨; SLT-2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해, 천연 위치의 아미노산 잔기 Y247이 양전하를 띠지 않는 아미노산 잔기로 치환되거나 및/또는 R250이 양전하를 띠지 않는 아미노산 잔기로 치환됨.
[00239] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 비-파괴된 최소 퓨린-절단 부위(SEQ ID NO:180)를 포함하지만, 대신 예를 들어 천연 위치가, 예를 들어 241-247 및/또는 252-259에 고유하게 위치한 퓨린-절단 모티프 측면영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환과 같은 파괴된 측면 영역을 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 다음을 포함한다: 퓨린-절단 모티프의 P1-P6 영역에 위치한 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환; P1'을 부피가 큰 아미노산, 예를 들어 R, W, Y, F, 및 H로 돌연변이시키는 것; 및 P2'를 극성 및 친수성 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것; 및 퓨린-절단 모티프의 P1'-P6' 영역에 위치한 하나 이상의 아미노산 잔기를 하나 이상의 부피가 크고 소수성인 아미노산 잔기로 치환하는 것.
[00240] 일부 구체예들에서, 퓨린-절단 모티프의 파괴는 퓨린-절단 모티프 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 역위, 및/또는 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 시가-유사 독소 1(SEQ ID NO:1) 또는 시가 독소(SEQ ID NO:2)의 A 서브유닛의 아미노산 249-251, 또는 시가-유사 독소 2(SEQ ID NO:3)의 A 서브유닛의 아미노산 잔기 247-250 또는 보존된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 비천연 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 서열의 동등한 위치에 천연적으로 위치한 아미노산 서열의 파괴를 포함한다: 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 퓨린-절단 모티프 내의 적어도 하나의 아미노산의 결실을 포함하는 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 프로테아제-절단 모티프 영역 내에 적어도 하나의 아미노산의 삽입을 포함하는 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 아미노산의 역전을 포함하는 파괴를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 역전된 아미노산은 프로테아제 모티프 영역 내에 있다. 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 비표준 아미노산 또는 화학적으로 변형된 측쇄를 갖는 아미노산으로의 아미노산 치환과 같은 돌연변이를 포함하는 파괴를 포함한다.
[00241] 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질의 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 퓨린-절단 모티프 내의 카르복시-말단 아미노산 잔기의 9개, 10개, 11개, 또는 그 이상의 결실을 포함한다. 이들 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 퓨린-절단 부위 또는 최소 퓨린-절단 모티프를 포함하지 않을 것이다. 다시 말해서, 일부 구체예는 A1 단편 영역의 카르복시 말단에서 퓨린-절단 부위가 결여되어 있다.
[00242] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 아미노산 잔기 결실 및 아미노산 잔기 치환을 모두 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 예를 들어 StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 R248 및/또는 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 R251; SLT-2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해, 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 Y247 및/또는 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 R250; 과 같은 최소 퓨린-절단 부위R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기 결실 및 치환을 포함한다.
[00243] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 아미노산 잔기 결실 및 아미노산 잔기 치환 뿐만 아니라 카르복시-말단 절단을 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 예를 들어 StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 R248 및/또는 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 R251; 및 SLT-2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해, 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 Y247 및/또는 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 R250; 과 같은 최소 퓨린-절단 부위 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기 결실 및 치환을 포함한다.
[00244] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 최소 퓨린-절단 부위 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180) 내의 아미노산 치환 및 카르복시-말단 절단 둘 다를 포함한다. 예를 들어 StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 경우, 천연 아미노산 위치 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나는 절단이고, 적절한 경우 임의의 비양전하를 띤 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치의 아미노산 잔기 R248 및/또는 R251을 포함하고; 및 SLT-2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 경우, 천연 아미노산 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나는 절단이고, 적절한 경우 임의의 비양전하를 띤 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치의 아미노산 잔기 Y247 및/또는 R250을 포함하는; 것과 같은 것들이다.
[00245] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 삽입된 아미노 잔기(들)가 새로운 퓨린-절단을 생성하지 않는 한 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 포함한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입은 예를 들어 249 또는 250의, 그래서 R248 및 R251 사이의 하나 이상의 아미노산 전기의 삽입을 포함하는 StxA 및 SLT-1A 유래 폴리펩티드에 대해; 또는 248 또는 249의, 그래서 Y247 및 R250 사이의 하나 이상의 아미노산 전기의 삽입을 포함하는 SLT-2A 유래 폴리펩티드와 같이 최소 퓨린-절단 부위 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)에서 아르기닌 잔기들 사이의 자연적 간격을 파괴한다.
[00246] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 아미노산 잔기 삽입 및 카르복시-말단 절단 둘 다를 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 아미노산 잔기 삽입 및 아미노산 잔기 치환을 모두 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 아미노산 잔기 삽입 및 아미노산 잔기 결실 둘 다를 포함한다.
[00247] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 아미노산 잔기 결실, 아미노산 잔기 삽입, 및 아미노산 잔기 치환을 포함한다.
[00248] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 아미노산 잔기 결실, 삽입, 치환, 및 카르복시-말단 절단을 포함한다.
[00249] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 아미노산, 펩티드, 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 분자 모이어티에 직접 융합되며, 여기서 융합된 구조는 단일 연속 폴리펩티드를 포함한다. 이들 융합 구체예에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프 다음의 아미노산 서열은 융합 접합부에 새로운 퓨린-절단 부위를 생성하지 않아야 한다.
[00250] 임의의 상기 프로테아제-절단 저항성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 하위영역 및/또는 파괴된 퓨린-절단 모티프는 단독으로 또는 본 발명의 방법을 포함하는 본 발명의 각각의 개별 구체예와 조합하여 사용될 수 있다.
[00251] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 시가 독소 A1 단편 유래 영역의 카르복시-말단에 파괴된 퓨린-절단 모티프 및/또는 퓨린-절단 부위를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 시가 독소 A1 단편 유래 영역의 카르복시 말단에 근접한 퓨린-절단을 제공할 수 있는 임의의 공지된 보상 구조를 포함하지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합한 파괴된 퓨린-절단 모티프 및 퓨린-절단 부위의 비제한적 예는 WO 2015/191764에 기재되어 있다.
[00252] 특정 퓨린-절단 모티프 파괴는 서열 목록에 제공된 천연 시가 독소 A 서브유닛의 특정 아미노산 위치를 참조하여 본 명세서에 표시되며, 천연 발생 시가 독소 A 서브유닛은 성숙한 시가 독소 A 서브유닛체을 생산하기 위해 제거되고 숙련된 작업자가 인식할 수 있는 그들의 아미노-말단에서 약 22개 아미노산의 신호 서열을 함유하는 전구체 형태를 포함한다는 점에 유의해야 한다. 또한, 돌연변이를 포함하는 특정 퓨린-절단 모티프 파괴는 본 명세서에서 천연 시가 독소 A 서브유닛(아미노-말단으로부터 위치 251의 아르기닌 잔기에 대해 R251) 내의 특정 위치에 천연적으로 존재하는 특정 아미노산(예: 아르기닌 잔기의 경우 R)을 참조하여 표시되고 이어서 논의되고 있는 특정 돌연변이에서 그 잔기가 그것으로 치환된 아미노산으로 표시된다(예: R251A는 아미노-말단의 아미노산 잔기 251에서 아르기닌에 대한 알라닌의 아미노산 치환을 나타냄).
[00253] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 시가 독소 A1 단편 유래 영역의 카르복시-말단에 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하고, 이러한 구체예는 본 명세서에서 "퓨린-절단 저항성" 또는 "프로테아제-절단 저항성" 시가 독소 이펙터 폴리펩티드로 지칭되는데, 야생형 시가 독소 A 서브유닛 및/또는 시가 독소 A1 단편 융합 단백질에 대해 그들의 성질(들)을 기술하기 위해서이다.
[00254] 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 필수적으로 2개 이상의 돌연변이를 갖는 절단된 시가 독소 A 서브유닛만으로 구성된다.
[00255] 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 A, G 또는 H가 있는 퓨린-절단 부위 컨센서스 모티프에서 아르기닌 잔기의 하나 또는 둘 모두의 아미노산 잔기 치환(야생형 시가 독소 폴리펩티드에 대해 상대적으로)을 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다. 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 퓨린-절단 모티프 영역 내에 아미노산 치환을 포함하는 파괴를 포함하고, 여기서 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 위치의 아미노산에서 발생한다: SEQ ID NO:3의 아미노산 247, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 248, SEQ ID NO:3의 아미노산 250, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 251, 또는 보존된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 비천연 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 서열의 등가 위치. 일부 구체예들에서, 치환은 임의의 비보존적 아미노산으로의 치환이고 천연 위치의 아미노산 잔기 위치에서 치환이 일어난다. 일부 구체예들에서, 돌연변이는 R247A, R248A, R250A R251A, 또는 보존된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 비천연 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 서열 내의 등가 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다.
[00256] 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 결실인 돌연변이를 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 다음과 같은 돌연변이를 포함한다: StxA(SEQ ID NO:2) 및 SLT-1A(SEQ ID NO:3)에서 247-252에, 및 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 246-251에 자연적으로 위치하는 영역의 결실; StxA(SEQ ID NO:2) 및 SLT-1A(SEQ ID NO:3)에서 244-246에, 및 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 243-245에 자연적으로 위치한 영역의 결실; 또는StxA(SEQ ID NO:2) 및 SLT-1A(SEQ ID NO:3)에서 253-259에, SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 252-258에 자연적으로 위치한 영역의 결실.
[00257] 일부 구체예들에서, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 카르복시 말단 절단인 돌연변이를 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하며, 절단은 퓨린-절단 모티프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 초래한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 예를 들어 StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해 천연 아미노산 잔기 위치 250, 249, 248, 247, 246, 245, 244, 243, 242, 241, 240, 또는 그 이하에서 끝나는 절단; SLT-2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해 천연 아미노산 잔기 위치 249, 248, 247, 246, 245, 244, 243, 242, 241, 또는 그 이하에서 끝나는 절단과 같은 최소 절단 부위Y/R-x-x-R(SEQ ID NO:180) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실시키는 카르복시-말단 절단을 포함한다. 일부 구체예는 가능한 경우 전술한 돌연변이 중 임의의 것의 조합을 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다.
[00258] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 퓨린-절단 모티프의 부분적인 카르복시-말단 절단인 돌연변이(들)를 포함한다. 그러나, 본 발명의 일부 CD38-결합 융합 단백질은 전체 20개 아미노산 잔기, 퓨린-절단 모티프의 완전한 카르복시-말단 절단인 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하지 않는다. 예를 들어, 일부 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 StxA(SEQ ID NO:2) 또는 SLT-1A(SEQ ID NO:1)에서 천연 위치 240까지 시가 독소 A1 단편의 부분적인 카르복시-말단 절단이지만 그러나 위치 239 이하에서 카르복시-말단 절단이 아닌 부분적인 카르복시-말단 절단을 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다. 유사하게, 특정 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)에서 천연 위치 239까지 시가 독소 A1 단편 영역의 부분적인 카르복시 말단 절단을 포함하지만 위치 238 이하에서는 카르복시-절단 모티프를 포함하지 않는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다. 퓨린-절단 저항성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 가장 큰 카르복시 말단 절단에서, 퓨린-절단 모티프의 파괴된 퓨린-절단 모티프의 위치 P14 및 P13을 포함하는 돌연변이가 여전히 존재한다.
[00259] 일부 다른 구체예에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 퓨린-절단 모티프의 완전한 또는 부분적인 카르복시-말단 절단인 돌연변이(들)를 포함한다. 예를 들어, 특정 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 StxA(SEQ ID NO:2) 또는 SLT-1A(SEQ ID NO:1)의 천연 위치 236까지, 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 235(SEQ ID NO:3)의 시가 독소 A1 단편의 완전한 카르복시-말단 절단을 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다. 예를 들어, 특정 감소된 세포독성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 StxA(SEQ ID NO:2) 또는 SLT-1A(SEQ ID NO:1)에서 천연 위치 240을 넘어서, 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)에서 239의 시가 독소 A1 단편 영역의 완전한 카르복시 말단 절단을 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함한다. 감소된 세포독성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 외인성 물질을 세포 및/또는 특정 세포하위 구획으로 전달하는 데 유용한다.
[00260] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 예를 들어 StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해, 천연 아미노산 위치 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고 적절한 곳에서 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 R248 및/또는 R251을 포함하는 절단; 및 SLT-2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해, 천연 아미노산 위치 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고 적절한 곳에서 임의의 비-양전하 아미노산 잔기로 치환된 천연 위치 아미노산 잔기 Y247 및/또는 R250을 포함하는 절단과 같은 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 최소 퓨린-절단 부위 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180) 내의 아미노산 잔기 치환 및 카르복시-말단 절단 둘 다를 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 절단된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 또한 최적의 세포독성을 유지하기 위해 퓨린-절단 모티프, 위치 P9, P8, 및/또는 P7에 아미노산 잔기를 포함한다.
[00261] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 하나 이상의 내부 아미노산 잔기 결실인 돌연변이(들)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 최소 퓨린-절단 부위 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180) 내에 하나 이상의 아미노산 잔기 결실을 갖는 돌연변이(들)를 포함한다. 예를 들어, 249, 250, 247, 252 등과 같은 주변 잔기의 결실과 조합될 수 있는 천연 위치의 아미노산 잔기 R248 및/또는 R251의 내부 결실을 포함하는 StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드; 및 예를 들어, 248, 249, 246, 251 등과 같은 주변 잔기의 결실과 조합될 수 있는 천연 위치의 아미노산 잔기 Y247 및/또는 R250의 내부 결실을 포함하는 SLT-2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드가 있다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 최소 퓨린-절단 부위 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)을 결실시키는 4개의 연속적인 아미노산 잔기의 결실인 돌연변이, 예를 들어 R248-R251이 결여된 StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 Y247-R250이 결여된 SLT-2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드와 같은 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 예를 들어, SLT-1A 또는 StxA의 아미노산 244-247 및/또는 아미노산 252-255의 결실과 같은 코어 퓨린-절단 모티프에 인접하는 아미노산 잔기에서 하나 이상의 아미노산 잔기 결실을 갖는 돌연변이(들)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 전체 표면-노출된, 프로테아제-절단 민감성 루프의 내부 결실인 돌연변이, 예를 들어 StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해 천연 위치 아미노산 잔기 241-262의 결실; 및 SLT2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해 천연 위치 아미노산 잔기 240-261의 결실 등을 포함한다.
[00262] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 퓨린-절단 모티프 내의 내부 아미노산 잔기 결실인 돌연변이 및 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 카르복시-말단 절단인 돌연변이 둘 다를 포함한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 최소 퓨린-절단 부위 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180) 내의 아미노산 잔기 결실인 돌연변이 및 야생형 시가 독소 A 서브유닛에 비교하여 카르복시-말단 절단인 돌연변이 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 프로테아제-절단 저항성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 여전히 아미노산 247 및/또는 252를 가지는 절단된 StxA 또는 SLT에서 천연 위치 아미노산 잔기 248-249 및/또는 250-251의 결실인, 또는 여전히 아미노산 잔기 246 및/또는 251을 가지는 절단된 SLT-2A에서 아미노산 잔기 247-248 및/또는 249-250의 결실인 돌연변이(들)를 포함하는 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛과 비교하여 최소 퓨린-절단 부위 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180)을 결실시키는 4개의 연속적인 아미노산 잔기의 결실 및 카르복시-말단 절단을 가지는 돌연변이를 포함하는데 예를 들어, StxA 및 SLT-1A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해 천연 아미노산 잔기 위치 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고 R248-R251을 결여한 절단; 및 SLT-2A 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 대해 천연 아미노산 위치 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 또는 그 이상에서 끝나고 Y247-R250을 결여한 절단과 같은 것들이다.
[00263] 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 상기 하나 이상의 돌연변이는 시가 독소의 A 서브유닛(SEQ ID NO:1-2 및 4-6)의 아미노산 잔기, 또는 시가-유사 독소 22(SEQ ID NO:3 및 7-18)의 아미노산 잔기 247-250에 천연 위치한 영역, 또는 시가 독소 A 서브유닛 및 그의 유도체의 등가 영역에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경한다. 일부 구체예들에서, 파괴된 퓨린-절단 모티프는 야생형 시가 독소 A 서브유닛에 대해 상대적으로 퓨린-절단 모티프의 최소 퓨린-절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 최소 퓨린-절단 부위는 컨센서스 아미노산 서열 R/Y-x-x-R(SEQ ID NO:180) 및/또는 R-x-x-R(SEQ ID NO:183)로 표시된다.
(iii) 카르복시 말단 소포체 보유/검색 신호 모티브를 갖는 시가 독소 성분
[00264] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 WO2018/140427의 단락 [52] 및 WO2015/138435의 단락 [28], [107]에 인용된 것과 같은 KDEL 패밀리의 구성원의 카르복시-말단 소포체 보유/검색 신호(retention/retrieval signal) 모티프를 포함하며, 이들 모두는 명시적으로 참고로 포함된다.
(iv) 탈면역화된(De-Immunized) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드
[00265] 일부 구체예들에서, 결합 단백질의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 예를 들어 야생형 시가 독소, 야생형 시가 독소 폴리펩티드 및/또는 야생형 펩티드 서열만을 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드와 비교하여 탈면역화된다. 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 시가 독소 A 서브유닛 폴리펩티드는 천연 발생 여부에 관계없이 WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2016/196344, WO 2016/196344, 및 WO 2018/140427에 기재된 본 명세서에 기재된 및/또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 탈면역화될 수 있으며, 여기서 생성된 분자는 하나 이상의 시가 독소 A 서브유닛 기능을 보유한다. 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 인간 대상과 같은 대상에게 폴리펩티드를 투여한 후 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 항원성 및/또는 면역원성 잠재력을 감소시키기 위해 적어도 하나의 추정되는 내인성 에피토프 영역의 파괴를 포함할 수 있다.
[00266] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 예를 들어 B-세포 및/또는 CD4+ T-세포 에피토프와 같은 내인성 에피토프 또는 에피토프 영역의 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 내인성 에피토프 영역의 파괴를 포함하며, 여기서 파괴(disruption)는 대상에게 폴리펩티드를 투여한 후 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 항원성 및/또는 면역원성 잠재력을 감소시키고, 및 여기서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 하나 이상의 시가 독소 A 서브유닛 기능, 예를 들어 상당한 수준의 시가 독소 세포독성을 나타낼 수 있다.
[00267] 에피토프 영역과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "파괴된(disrupted)" 또는 "파괴(disruption)"는 에피토프 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 2개 이상의 아미노산 잔기의 역전을 지칭하며, 여기서 역전된 하나 이상의 아미노산 잔기는 에피토프 영역에 있고, 에피토프 영역에 하나 이상의 아미노산이 삽입되고, 에피토프 영역에는 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환된다. 돌연변이에 의한 에피토프 영역 파괴는 비표준 아미노산 및/또는 비천연 아미노산과의 아미노산 치환을 포함한다. 에피토프 영역은 대안적으로 에피토프 영역에서 적어도 하나의 아미노산을 마스킹하는 공유-결합된 화학 구조의 추가에 의한 아미노산의 변형을 포함하는 돌연변이에 의해 파괴될 수 있다(참조: PEG화(Zhang C et al., BioDrugs 26: 209-15 (2012), 소분자 보조제(Flower D, Expert Opin Drug Discov 7: 807-17(2012), 및 부위 특이적 알부민화(Lim S et al., J Control Release 207-93(2015))).
[00268] 일부 에피토프 영역 및 파괴는 서열 목록에 제공된 천연 시가 독소 A 서브유닛의 특정 아미노산 위치를 참조하여 본 명세서에 표시되며, 천연 발생 시가 독소 A 서브유닛은 그들의 아미노-말단에서 약 22개의 신호서열을 함유하는 전구체 형태를 포함할 수 있고, 그것들은 성숙한 시가 독소 A 서브유닛을 생성하기 위하여 제거되며 숙련된 작업자에게 인식가능하다는 것에 주목할 필요가 있다. 또한, 일부 에피토프 영역 파괴는 천연 시가 독소 A 서브유닛 내의 특정 위치에 천연적으로 존재하는 특정 아미노산(예: 세린 잔기의 경우 S)(예: 아미노 말단으로부터 위치 33에 있는 세린 잔기의 경우 S33)을 참조하여 표시되며, 그 뒤에 해당 잔기가 논의 중인 특정 돌연변이에서 치환된 아미노산이 온다(예: S33I는 아미노 말단으로부터 아미노산 잔기 33에서 세린에 대한 이소류신의 아미노산 치환을 나타냄).
[00269] 일부 구체예들에서, 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 본 명세서에 제공된 적어도 하나의 에피토프 영역의 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 WO 2015/113005 또는 WO 2015/113007에 기재된 적어도 하나의 에피토프 영역의 파괴를 포함한다.
[00270] 일부 구체예들에서, 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 다음으로 이루어지는 천연 위치 아미노산의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 파괴를 포함하는 전장 시가 독소 A 서브유닛(예: SLT-1A(SEQ ID NO:1), StxA(SEQ ID NO:2), 또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3))을 포함한다: SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1-15, SEQ ID NO:3의 아미노산 3-14, SEQ ID NO:3의 아미노산 26-37, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 27-37, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 39-48, SEQ ID NO:3의 아미노산 42-48, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 53-66, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 94-115, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산141-153, SEQ ID NO:3의 아미노산 140-156, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 179-190, SEQ ID NO:3의 아미노산 179-191, SEQ ID NO:3의 아미노산 204, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 205, SEQ ID NO:3의 아미노산 210-218, SEQ ID NO:3의 아미노산 240-258, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 243-257, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 254-268, SEQ ID NO:3의 아미노산 262-278, SEQ ID NO:3의 아미노산 281-297, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 및 아미노산 285-293, 또는 시가 독소 A 서브유닛 폴리펩티드, 보존된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 하위 영역, 및/또는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 서열의 등가적 위치.
[00271] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함한다. 시가 독소 A 서브유닛의 절단은 시가 독소 이펙터 기능에 영향을 미치지 않고 전체 에피토프 영역의 결실을 초래할 수 있다. 상당한 효소 활성을 나타내는 것으로 나타난 가장 작은 시가 독소 A 서브유닛 단편은 StxA의 잔기 75-247로 구성된 폴리펩티드였다(Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994)). SLT-1A, StxA 또는 SLT-2A의 카르복시 말단을 아미노산 1-251로 절단하면 예측된 두 개의 B-세포 에피토프 영역, 두 개의 예측된 CD4 양성(CD4+) T-세포 에피토프 및 예측된 불연속적인 B-세포 에피토프가 제거된다. SLT-1A, StxA 또는 SLT-2A의 아미노 말단을 75-293으로 절단하면 적어도 3개의 예측된 B-세포 에피토프 영역 및 3개의 예측된 CD4+ T-세포 에피토프 3개를 제거한다. SLT-1A, StxA 또는 SLT-2A의 아미노 말단과 카르복시 말단을 모두 75-251로 절단하면 적어도 5개의 예측된 B-세포 에피토프 영역, 4개의 추정 CD4+ T-세포 에피토프, 및 하나의 예측된 불연속 B-세포 에피토프를 결실시킨다.
[00272] 일부 구체예들에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이, 예를 들어 B- 또는 T-세포 에피토프 영역에서 결실, 삽입, 역위, 또는 치환을 가지는 전장 또는 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 에피토프 영역 내의 적어도 하나의 아미노산의 결실을 포함하는 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 에피토프 영역 내에 적어도 하나의 아미노산의 삽입을 포함하는 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 아미노산의 역전을 포함하는 파괴를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 역전된 아미노산은 에피토프 영역 내에 있다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 비표준 아미노산 또는 화학적으로 변형된 측쇄를 갖는 아미노산으로의 아미노산 치환과 같은 돌연변이를 포함하는 파괴를 포함한다.
[00273] 일부 구체예들에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 A, G, V, L, I, P, C, M, F, S, D, N, Q, H, 및 K로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 천연 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는 전장 또는 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함하거나 필수적으로 이들로만 이루어진다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 치환이 다음으로부터 선택되는 천연서열에 비교하여 하나의 돌연변이를 갖는 전장 또는 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함한다: D에서 A, D에서 G, D에서 V, D에서 L, D에서 I, D에서 F, D에서 S, D에서 Q, E에서 A, E에서 G, E에서 V, E에서 L, E에서 I, E에서 F, E에서 S, E에서 Q, E에서 N, E에서 D, E에서 M, E에서 R, G에서 A, H에서 A, H에서 G, H에서 V, H에서 L, H에서 I, H에서 F, H에서 M, K에서 A, K에서 G, K에서 V, K에서 L, K에서 I, K에서 M, K에서 H, L에서 A, L에서 G, N에서 A, N에서 G, N에서 V, N에서 L, N에서 I, N에서 F, P에서 A, P에서 G, P에서 F, R에서 A, R에서 G, R에서 V, R에서 L, R에서 I, R에서 F, R에서 M, R에서 Q, R에서 S, R에서 K, R에서 H, S에서 A, S에서 G, S에서 V, S에서 L, S에서 I, S에서 F, S에서 M, T에서 A, T에서 G, T에서 V, T에서 L, T에서 I, T에서 F, T에서 M, T에서 S, Y에서 A, Y에서 G, Y에서 V, Y에서 L, Y에서 I, Y에서 F, 및 Y에서 M.
[00274] 일부 구체예들에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 면역원성 잔기의 및/또는 에피토프 영역 내에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 천연 아미노산 잔기 서열에 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 가지는 전장 또는 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함하거나 필수적으로 이들로만 구성이 되며, 여기서 적어도 하나의 아미노산 치환은 다음으로 이루어지는 천연 위치 아미노산의 군으로부터 선택된 곳에서 일어난다: SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 1, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 4, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 8, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 9, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 11, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 33, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 43, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 44, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 45, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 46, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 47, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 48, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 49, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 50, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 51, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 53, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 54, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 55, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 56, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 57, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 58, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 59, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 60, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 61, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 62, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 84, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 88, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 94, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 96, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 104, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 105, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 107, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 108, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 109, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 110, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 111, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 112, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 141, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 147, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 154, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 179, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 180, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 181, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 183, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 184, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 185, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 186, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 187, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 188, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 189, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 198, SEQ ID NO:3의 204, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 205, SEQ ID NO:3의 241, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 242, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 247, SEQ ID NO:3의 247, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 248, SEQ ID NO:3의 250, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 251, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 264, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 265, 및 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 286.
[00275] 일부 구체예들에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 면역원성 잔기 및/또는 에피토프 영역 내에 적어도 하나의 치환을 갖는 전장 또는 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함하거나 필수적으로 이들로만 구성되며, 여기서 적어도 하나의 아미노산 치환은 하기 천연 위치 중 하나에 위치하는 천연 발생 아미노산에 대한 비보존적 아미노산(예를 들어, 하기 표 3 참조)으로의 치환이다: SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 1, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 4, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 8, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 9, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 11, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 33, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 43, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 44, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 45, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 46, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 47, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 48, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 49, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 50, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 51, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 53, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 54, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 55, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 56, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 57, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 58, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 59, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 60, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 61, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 62, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 84, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 88, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 94, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 96, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 104, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 105, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 107, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 108, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 109, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 110, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 111, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 112, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 141, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 147, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 154, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 179, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 180, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 181, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 183, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 184, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 185, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 186, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 187, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 188, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 189, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 198, SEQ ID NO:3의 204, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 205, SEQ ID NO:3의 241, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 242, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 247, SEQ ID NO:3의 247, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 248, SEQ ID NO:3의 250, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 251, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 264, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 265, 및 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 286.
[00276] 일부 구체예들에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 가지는 전장 또는 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함하거나 필수적으로 이들로만 구성된다: K1에서 A, G, V, L, I, F, M 또는 H; T4에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 S; D6에서 A, G, V, L, I, F, S, Q 또는 R; S8에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; T8에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; T9에서 A, G, V, I, L, F, M, 또는 S; S9에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; K11에서 A, G, V, L, I, F, M 또는 H; T12에서 A, G, V, I, L, F, M, S, 또는 K; S12에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; S33에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 C; S43에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; G44에서 A 또는 L; S45에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; T45에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; G46에서 A 또는 P; D47에서 A, G, V, L, I, F, S, M, 또는 Q; N48에서 A, G, V, L, M 또는 F; L49에서 A, V, C, 또는 G; Y49에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 T; F50에서 A, G, V, L, I, 또는 T; A51에서 V; D53에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; V54에서 A, G, I, 또는 L; R55에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; G56에서 A 또는 P; I57에서 A, G, V, 또는 M; L57에서 A, V, C, G, M, 또는 F; D58에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; P59에서 A, G, 또는 F; E60에서 A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, T, 또는 R; E61에서 A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, 또는 R; G62에서 A; R84에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; V88에서 A 또는 G; I88에서 A, V, C, 또는 G; D94에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; S96에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; T104에서 A, G, V, L, I, F, M; 또는 N; A105에서 L; T107에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 P; S107에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 P; L108에서 A, V, C, 또는 G; S109에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; T109에서 A, G, V, I, L, F, M, 또는 S; G110에서 A; S112에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; D111에서 A, G, V, L, I, F, S, Q, 또는 T; S112에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; D141에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; G147에서 A; V154에서 A 또는 G. R179에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; T180에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 S; T181에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 S; D183에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; D184에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; L185에서 A, G, V 또는 C; S186에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; G187에서 A; R188에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; S189에서 A, G, V, I, L, F, 및 M; D197에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; D198에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; R204에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; R205에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K 또는 H; C242에서 A, G 또는 V; R247에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; S247에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; Y247에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; R248에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; R250에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; R251에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; D264에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; G264에서 A; 및 T286에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 S.
[00277] 일부 구체예들에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 가지는 전장 또는 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함하거나 필수적으로 이들로만 구성된다: K1A, K1M, T4I, D6R, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, T12K, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, D47G, N48V, N48F, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, D53G, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, S112V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184A, D184F, L185V, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, or D264A, G264A, T286A, 및/또는 T286I. 이러한 에피토프 파괴 치환은 조합하여 여전히 시가 독소 이펙터 기능을 보유하면서 에피토프 영역 당 또는 다중 에피토프 영역에서 파괴된 다중 치환을 가진 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 예를 들어 천연 위치의 K1A, K1M, T4I, D6R, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, T12K, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, D47G, N48V, N48F, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, D53G, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, S112V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184A, D184F, L185V, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, or D264A, G264A, T286A, 및/또는 T286I의 치환은 가능한 곳에서 천연 위치 잔기 K1A, K1M, T4I, D6R, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, T12K, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, D47G, N48V, N48F, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, D53G, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, S112V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184A, D184F, L185V, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, or D264A, G264A, T286A, 및/또는 T286I에서의 치환과 조합하여 본 발명의 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 형성할 수 있다.
[00278] 본 명세서에 기재된 임의의 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 하위영역 및/또는 에피토프 파괴 돌연변이는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있고, 추가로 본 발명의 방법에서의 용도를 포함하여 본 발명의 CD38-결합 단백질의 각각의 개별 구체예와 조합하여 사용될 수 있다.
[00279] 일부 구체예들에서, 본 발명의 CD38-결합 단백질의 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 필수적으로 2개 이상의 돌연변이를 갖는 절단된 시가 독소 A 서브유닛만으로 이루어질 수 있다. 시가 독소 A 서브유닛의 절단은 예를 들어, 촉매 활성 및 세포독성과 같은 시가 독소 이펙터 기능에 영향을 미치지 않고 전체 에피토프 및/또는 에피토프 영역(들), B-세포 에피토프, CD4+ T-세포 에피토프 및/또는 퓨린-절단 부위의 결실을 초래할 수 있다. SLT-1A, StxA 또는 SLT-2A의 카르복시 말단을 아미노산 1-251로 절단하면 예측된 두 개의 B-세포 에피토프 영역, 두 개의 예측된 CD4 양성(CD4+) T-세포 에피토프 및 예측된 불연속적인 B-세포가 제거된다. SLT-1A, StxA 또는 SLT-2A의 아미노 말단을 75-293으로 자르면 최소 3개의 예측된 B-세포 에피토프 영역과 3개의 예측된 CD4+ T-세포 에피토프가 제거된다. SLT-1A, StxA 또는 SLT-2A의 아미노 말단과 카르복시 말단을 모두 75-251로 자르면 최소 5개의 예측된 B-세포 에피토프 영역, 4개의 추정 CD4+ T-세포 에피토프 및 1개의 예측된 불연속 B-세포 에피토프가 삭제된다.
[00280] 일부 구체예들에서, 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 (야생형 시가 독소 폴리펩티드에 비해) 예를 들어, 제공된 내인성(endogenous) B-세포 및/또는 CD4+ T-세포 에피토프 영역에서 결실, 삽입, 역위, 또는 치환과 같은 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 전장 또는 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함하거나 필수적으로 이들로만 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 내인성 B-세포 및/또는 CD4+ T-세포 에피토프 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실을 포함하는 돌연변이(야생형 시가 독소 폴리펩티드에 비해)를 포함하는 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 내인성, B-세포 및/또는 CD4+ T-세포 에피토프 영역 내에 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입을 포함하는 파괴를 포함한다. 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 역전을 포함하는 파괴를 포함하며, 여기서 하나 이상의 역전된 아미노산 잔기는 내인성 B-세포 및/또는 CD4+ T-세포 에피토프 영역 내에 있다. 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 예를 들어 아미노산 치환, 비표준 아미노산으로의 아미노산 치환, 및/또는 화학적으로 변형된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기와 같은 돌연변이(야생형 시가 독소 폴리펩티드에 비해)를 포함하는 파괴를 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 사용하기에 적합한 탈면역화된 시가 독소 이펙터 하위 영역의 비제한적 예는 WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, WO 2016/196344, 및 WO 2018/140427에 기술되어 있다.
[00281] 다른 구체예들에서, 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 전장 시가 독소 A 서브유닛보다 더 짧은 절단된 시가 독소 A 서브유닛을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 천연 위치 B-세포 및 /또는 CD4+ T-세포 에피토프 영역에서 파괴된다.
[00282] 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 생성하기 위해, 원칙적으로 다양한 수단에 의해 제공된 에피토프 영역에서 임의의 아미노산 잔기를 변형시키는 것은 예를 들어 야생형 시가 독소 폴리펩티드에 비해 결실, 삽입, 역위, 재배열, 치환 및 측쇄의 화학적 변형을 나타내는 변형과 같은 에피토프의 파괴를 초래할 수 있다. 그러나 특정 아미노산 잔기의 변형 및 특정 아미노산 변형의 사용은 특정 수준의 시가 독소 이펙터 기능(들)을 유지하면서 항원성 및/또는 면역원성을 성공적으로 감소시킬 가능성이 더 높다. 예를 들어, 말단 절단 및 내부 아미노산 치환은 이러한 유형의 변형이 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 전체 간격을 유지하고 따라서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구조 및 기능을 유지할 가능성이 더 높기 때문에 바람직하다.
[00283] 본 발명의 일부 구체예 중에서, SLT-1A(SEQ ID NO:1), StxA(SEQ ID NO:2) 및/또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 아미노산 75 내지 251을 포함하거나 필수적으로 이들로만 구성된 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 천연 위치 에피토프 영역에서 파괴된다. 일부 다른 구체예들 중에는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 천연 위치 에피토프 영역에서 파괴된 SLT-1A(SEQ ID NO:1), StxA(SEQ ID NO:2), 및/또는 SLT-2A (SEQ ID NO:3)의 아미노산 1 내지 241을 포함하거나 필수적으로 이들로만 구성된 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드가 있다. 구체예들은 SLT-1A(SEQ ID NO:1), StxA(SEQ ID NO:2), 및/또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 아미노산 1 내지 251을 포함하거나 필수적으로 이들로만 구성된 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드이고, 여기서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 제공된 천연 위치 에피토프 영역에서 파괴된다. 구체예들은 SLT-1A(SEQ ID NO:1), StxA(SEQ ID NO:2), 및/또는 SLT-2A(SEQ ID NO:3)의 아미노산 1 내지 261을 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드이고, 여기서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 천연 위치 에피토프 영역에서 파괴된다.
[00284] 본 발명의 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있는 다수의 다양한 내부 아미노산 치환들이 있다. 에피토프 영역 내에서 사용할 수 있는 대체 아미노산 중 다음 대체 아미노산 잔기들이 에피토프- G, D, E, S, T, R, K, 및 H의 항원성 및/또는 면역원성을 감소시킬 가능성이 가장 높은 것으로 예측된다. 글리신을 제외하고 이들 아미노산 잔기는 모두 극성 및/또는 하전된 잔기로 분류될 수 있다. 대체할 수 있는 아미노산 중에서 다음 아미노산 A, G, V, L, I, P, C, M, F, S, D, N, Q, H 및 K가 치환된 아미노산에 따라 상당한 수준의 시가 독소 이펙터 기능(들)을 유지하면서 항원성 및/또는 면역원성을 감소시킬 가능성이 가장 높은 것으로 예측된다. 일반적으로, 치환은 극성 및/또는 하전된 아미노산 잔기를 비극성 및 비하전된 잔기로 변경해야 한다(예: WO 2015/113007 참조). 또한, 아미노산 잔기의 R-기 기능 측쇄의 전체 크기 및/또는 길이를 줄이기 위해 에피토프 파괴가 유리할 수 있다(예: WO 2015/113007 참조). 그러나 에피토프 파괴를 부여할 가능성이 가장 큰 이러한 치환의 일반성에도 불구하고, 목적이 유의미한 시가 독소 이펙터 기능(들)을 보존하는 것이기 때문에, 대체 아미노산이 예를 들어 극성 및/또는 하전된 잔기에 대해 치환된 유사한 크기의 비극성 및/또는 비하전된 잔기와 같이 친환되는 아미노산과 유사하다면 그것이 시가 독소 이펙터 기능을 보존할 가능성이 더 클 수 있다.
[00285] WO 2015/113007에서, 다양한 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 결합 단백질의 시가 독소 이펙터 기능에 대한 효과(들)에 대해 많은 돌연변이가 경험적으로 시험되었다. 표 2는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치환과 조합된 아미노산 치환이 강력한 수준의 시가 독소 이펙터 기능(들)을 방지하지 않았음이 기술된 결과를 요약한다. 표 2는 WO 2016/196344에 기술된 에피토프 영역 넘버링 방식을 사용한다.
[00286]
표 2. 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에서 아미노산 치환
파괴된 에피토프 영역 천연적으로 위치된 아미노산 위치
치환 B-세포 에피토프 영역 T-세포 에피토프
1 K1A 1-15
1 K1M 1-15
1 T4I 1-15 4-33
1 D6R 1-15 4-33
1 S8I 1-15 4-33
1 T9V 1-15 4-33
1 T9I 1-15 4-33
1 K11A 1-15 4-33
1 K11H 1-15 4-33
1 T12K 1-15 4-33
2 S33I 27-37 4-33
2 S33C 27-37 4-33
3 S43N 39-48 34-78
3 G44L 39-48 34-78
3 T45V 39-48 34-78
3 T45I 39-48 34-78
3 S45V 39-48 34-78
3 S45I 39-48 34-78
3 G46P 39-48 34-78
3 D47G 39-48 34-78
3 D47M 39-48 34-78
3 N48V 39-48 34-78
3 N48F 39-48 34-78
- L49A 면역원성 잔기 34-78
- F50T 34-78
- A51V 34-78
4 D53A 53-66 34-78
4 D53G 53-66 34-78
4 D53N 53-66 34-78
4 V54L 53-66 34-78
4 V54I 53-66 34-78
4 R55A 53-66 34-78
4 R55V 53-66 34-78
4 R55L 53-66 34-78
4 G56P 53-66 34-78
4 I57M 53-66 34-78
4 I57F 53-66 34-78
4 D58A 53-66 34-78
4 D58V 53-66 34-78
4 D58F 53-66 34-78
4 P59A 53-66 34-78
4 P59F 53-66 34-78
4 E60I 53-66 34-78
4 E60T 53-66 34-78
4 E60R 53-66 34-78
4 E61A 53-66 34-78
4 E61V 53-66 34-78
4 E61L 53-66 34-78
4 G62A 53-66 34-78
- R84A 77-103
- V88A 77-103
5 D94A 94-115 77-103
5 S96I 94-115 77-103
5 T104N 94-115
5 A105L 94-115
5 T107P 94-115
5 L108M 94-115
5 S109V 94-115
5 G110A 94-115
5 D111T 94-115
5 S112V 94-115
6 D141A 141-153 128-168
6 G147A 141-153 128-168
- V154A 128-168
7 R179A 179-190 160-183
7 T180G 179-190 160-183
7 T181I 179-190 160-183
7 D183A 179-190 160-183
7 D183G 179-190 160-183
7 D184A 179-190
7 D184F 179-190
7 L185V 179-190
7 S186A 179-190
7 S186F 179-190
7 G187A 179-190
7 G187T 179-190
7 R188A 179-190
7 R188L 179-190
7 S189A 179-190
- D198A 면역원성 잔기
- R205A 면역원성 잔기
- C242S 236-258
8 R248A 243-257 236-258
8 R251A 243-257 236-258
[00287] WO 2015/113007 및 WO 2016/196344의 경험적 증거에 기초하여, 시가 독소의 시가 독소의 A 서브유닛에 있는 특정 아미노산 위치는 여전히 상당한 시가 독소 이펙터 기능들을 유지하면서 에피토프 파괴를 허용할(tolerate) 것으로 예측된다. 예를 들어, 다음의 천연 발생 위치는 세포독성과 같은 시가 독소 이펙터 기능을 유지하면서 단독으로 또는 조합하여 아미노산 치환을 허용한다: 아미노산 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 1, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 4, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 8, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 9, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 11, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 33, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 43, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 44, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 45, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 46, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 47, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 48, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 49, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 50, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 51, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 53, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 54, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 55, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 56, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 57, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 58, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 59, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 60, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 61, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 62, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 84, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 88, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 94, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 96, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 104, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 105, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 107, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 108, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 109, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 110, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 111, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 112, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 141, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 147, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 154, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 179, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 180, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 181, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 183, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 184, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 185, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 186, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 187, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 188, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 189, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 198, SEQ ID NO:3의 204, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 205, SEQ ID NO:3의 241, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 242, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 247, SEQ ID NO:3의 247, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 248, SEQ ID NO:3의 250, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 251, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 264, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 265, 및 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 286.
[00288] WO 2015/113007 및 WO 2016/196344의 경험적 데이터는 전술한 절단의 조합 및 치환을 허용하는 위치들 뿐만 아니라 동일한 위치 또는 관련된 시가 독소 A 서브유닛에서 보존된 위치들에서의 새로운 치환들과 같이 시가 독소 이펙터 기능을 나타내는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 능력을 유지하면서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 항원성 및/또는 면역원성을 감소시킬 수 있는 다른 에피토프 파괴 치환 및 에피토프 파괴 치환들의 조합을 지향한다.
[00289] 본 명세서에서 시험된 치환의 보존적 작용기의 아미노산 잔기에 대한 다른 아미노산 치환은 유의미한 시가 독소 이펙터 기능을 보존하면서 항원성 및/또는 면역원성을 감소시킬 수 있다고 예측할 수 있다. 예를 들어, K1A, K1M, T4I, D6R, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, T12K, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, D47G, N48V, N48F, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, D53G, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, S112V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184A, D184F, L185V, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, 또는 D264A, G264A, T286A, 및/또는 T286I의 임의의 것에 유사한 것으로 숙련된 작업자에게 알려진 다른 치환들은 적어도 하나의 시가 독소 이펙터 기능을 유지하면서 내인성 에피토프를 파괴할 수 있다. 특히, K1A, K1M, T4I, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, N48V, N48F, L49A, A51V, D53A, D53N, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, E60I, E60T, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, S112V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184F, L185V, S186A, S186F, G187A, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, D264A, G264A, T286A, 및 T286I와 유사한 보존적 아미노산 잔기로의 아미노산 치환은 동일한 또는 유사한 효과를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 예를 들어 다음과 같이 경험적으로 시험된 것들로의 유사한 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다: K1에서 G, V, L, I, F, 및 H; T4에서 A, G, V, L, F, M, 및 S; S8에서 A, G, V, L, F, 및 M; T9에서 A, G, L, F, M, 및 S; S9에서 A, G, L, I, F, 및 M; K11에서 G, V, L, I, F, 및 M; S33에서 A, G, V, L, F, 및 M; S43에서 A, G, V, L, I, F, 및 M; S45에서 A, G, L, F, 및 M; T45에서 A, G, L, F, 및 M; D47에서 A, V, L, I, F, S, 및 Q; N48에서 A, G, L, 및 M; L49에서 G; Y49에서 A; D53에서 V, L, I, F, S, 및 Q; R55에서 G, I, F, M, Q, S, K, 및 H; D58에서 G, L, I, S, 및 Q; P59에서 G; E60에서 A, G, V, L, F, S, Q, N, D, 및 M; E61에서 G, I, F, S, Q, N, D, M, 및 R; R84에서 G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 및 H; V88에서 G; I88에서 G; D94에서 G, V, L, I, F, S, 및 Q; S96에서 A, G, V, L, F, 및 M; T107에서 A, G, V, L, I, F, M, 및 S; S107에서 A, G, V, L, I, F, 및 M; S109에서 A, G, I, L, F, 및 M; T109에서 A, G, I, L, F, M, 및 S; S112에서 A, G, L, I, F, 및 M; D141에서 V, L, I, F, S, 및 Q; V154에서 G; R179에서 G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 및 H; T180에서 A, V, L, I, F, M, 및 S; T181에서 A, G, V, L, F, M, 및 S; D183에서 V, L, I, F, S, 및 Q; D184에서 G, V, L, I, S, 및 Q; S186에서 G, V, I, L, 및 M; R188에서 G, V, I, F, M, Q, S, K, 및 H; S189에서 G, V, I, L, F, 및 M; D197에서 V, L, I, F, S, 및 Q; D198에서 A, V, L, I, F, S, 및 Q; R204에서 G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 및 H; R205에서 G, V, L, I, F, M, Q, S, K 및 H; S247에서 A, G, V, I, L, F, 및 M; Y247에서 A, G, V, L, I, F, 및 M; R248에서 G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 및 H; R250에서 G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 및 H; R251에서 G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 및 H; D264에서 A, G, V, L, I, F, S, 및 Q; 및 T286에서 A, G, V, L, I, F, M, 및 S.
[00290] 유사하게, 전하, 극성을 제거하고/하거나 측쇄 길이를 감소시키는 아미노산 치환은 하나 이상의 시가 독소 이펙터 기능을 유지하면서 에피토프를 파괴할 수 있다. 일부 구체예들에서, 예를 들어 하기 위치에 있는 아미노산 잔기에 대해 다음의 그룹 A, G, V, L, I, P, C, M, F, S, D, N, Q, H, 또는 K로부터 선택된 적절한 아미노산 잔기를 치환하는 것과 같은 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 측쇄 전하가 제거되고, 극성이 제거되고 및/또는 측쇄 길이가 감소되도록 하는 치환에 의해 파괴된 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다: SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 1, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 4, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 6, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 8, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 9, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 11, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 12, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 33, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 43, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 44, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 45, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 46, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 47, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 48, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 49, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 50, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 51, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 53, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 54, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 55, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 56, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 57, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 58, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 59, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 60, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 61, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 62, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 84, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 88, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 94, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 96, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 104, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 105, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 107, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 108, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 109, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 110, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 111, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 112, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 141, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 147, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 154, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 179, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 180, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 181, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 183, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 184, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 185, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 186, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 187, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 188, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 189, SEQ ID NO:3의 197, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 198, SEQ ID NO:3의 204, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 205, SEQ ID NO:3의 241, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 242, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 247, SEQ ID NO:3의 247, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 248, SEQ ID NO:3의 250, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 251, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 264, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 265, 및 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 286. 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 다음의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다: K1에서 A, G, V, L, I, F, M 또는 H; T4에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 S; D6에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; S8에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; T8에서 A, G, V, I, L, F, M, 또는 S; T9에서 A, G, V, I, L, F, M, 또는 S; S9에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; K11에서 A, G, V, L, I, F, M 또는 H; T12에서 A, G, V, I, L, F, M, 또는 S; S33에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; S43에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; G44에서 A 또는 L; S45에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; T45에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; G46에서 A 또는 P; D47에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; N48에서 A, G, V, L, 또는 M; L49에서 A 또는 G; F50; A51에서 V; D53에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; V54에서 A, G, 또는 L; R55에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; G56에서 A 또는 P; I57에서 A, G, M, 또는 F; L57에서 A, G, M, 또는 F; D58에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; P59에서 A, G, 또는 F; E60에서 A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, 또는 R; E61에서 A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, 또는 R; G62에서 A; D94에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; R84에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; V88에서 A 또는 G; I88에서 A, G, 또는 V; D94; S96에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; T104에서 A, G, V, I, L, F, M, 또는 S; A105에서 L; T107에서 A, G, V, I, L, F, M, 또는 S; S107에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; L108에서 A, G, 또는 M; S109에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; T109에서 A, G, V, I, L, F, M, 또는 S; G110에서 A; D111에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; S112에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; D141에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; G147에서 A; V154에서 A 또는 G; R179에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; T180에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 S; T181에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 S; D183에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; D184에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; L185에서 A, G, 또는 V; S186에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; G187에서 A; R188에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; S189에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; D197에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; D198에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; R204에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; R205에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; C242에서 A, G, V, 또는 S; S247에서 A, G, V, I, L, F, 또는 M; Y247에서 A, G, V, L, I, F, 또는 M; R248에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; R250에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; R251에서 A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, 또는 H; C262에서 A, G, V, 또는 S; D264에서 A, G, V, L, I, F, S, 또는 Q; G264에서 A; 또는 T286에서 A, G, V, L, I, F, M, 또는 S.
[00291] 또한, 상당한 시가 독소 이펙터 기능을 유지하면서 에피토프를 파괴하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 하나의 에피토프 영역에서의 임의의 아미노산 치환은 여전히 상당한 수준의 시가 독소 이펙터 기능을 유지하면서 복수의 에피토프 영역이 파괴된 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 형성하기 위하여 상당한 시가 독소 이펙터 기능을 유지하면서 에피토프를 파괴하는 동일한 또는 상이한 에피토프 영역에서의 다른 아미노산 치환과 조합될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 WO 2015/113007, WO 2016/196344, 및/또는 WO 2018/140427에 기재된 전술한 치환 및/또는 치환의 조합 중 2개 이상의 조합을 포함할 수 있다.
[00292] WO 2015/113007, WO 2016/196344, 및 WO 2018/140427에 기술된 작업에 기초하여, 시가 독소의 A 서브유닛에 있는 특정 아미노산 영역은 여전히 상당한 시가 독소 이펙터 기능을 유지하면서 에피토프 파괴를 허용할 것으로 예측된다. 예를 들어, 1-15, 39-48, 53-66, 55-66, 94-115, 180-190, 179-190, 및 243-257에 본래 위치하는 에피토프 영역은 시가 독소 효소 활성 및 세포독성의 손상없이 동시에 복수의 아미노산 치환 조합을 허용하였다.
(v) 파괴된 퓨린-절단 모티프를 갖는 탈면역화된 시가 독소
[00293] 조합 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 2개 이상의 하위 영역(즉, 비중첩 하위 영역들)을 포함하며, 여기서 각 하위 영역은 다음 중 적어도 하나를 포함한다: (1) 내인성 에피토프 또는 에피토프 영역의 파괴, 및 (2) A1 단편 유래 영역의 카르복시 말단에서 파괴된 퓨린-절단 모티프.
[00294] 조합 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 일부 구체예들은 (1) 내인성 에피토프 또는 에피토프 영역에서의 파괴 및 (2) A1 단편 유래 영역의 카르복시 말단에서 파괴된 퓨린-절단 모티프 둘 다를 포함한다. WO 2015/113007, WO 2016/196344, 및 WO 2018/140427(예를 들어, 위의 표 2 참조)에 기재된 임의의 개별적인 탈면역화된 시가 독소 이펙터 하위 영역들은 일반적으로 본 명세서에 기술된, WO 2015/191764에 기재된, 및/또는 당업계에 공지된 파괴된 퓨린-절단 모티프를 포함하는 임의의 시가 독소 이펙터와 조합되어 결합 영역의 성분으로 사용하기 위한 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 생성할 수 있다고 예측된다.
[00295] 조합하여, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 예를 들어 퓨린-절단 모티프 파괴, 하나 이상의 개별 에피토프 파괴 및/또는 이종 분자 화물과 같은 각각의 하위 영역의 특징을 결합할 수 있으며, 이러한 조합은 때때로 부분적으로 탈면역화된 하위 영역의 합과 비교하여 면역원성이 시너지를 가지고 감소한 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 초래할 수 있다.
[00296] 특정 농도에서 세포독성을 나타내지 않거나 감소된 세포독성을 나타내는 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드, 예를 들어, Y77S, R179A, 및/또는 E167D를 포함하거나 천연 위치 240 너머의 카르복시 말단에서 절단된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 외인성 물질을 세포로 전달하기 위한 탈면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드로서 여전히 유용할 수 있다.
[00297] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 (i) 그의 시가 독소 A1 단편 영역의 카르복시-말단에서 파괴된 퓨린-절단 모티프(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조로 명시적으로 포함되는 WO 2015/191764 참조. 구체적으로 단락 [8], [9] 및 파괴된 모티프의 서열 및 파괴된 모티프를 포함하는 독소 폴리펩티드) 및 (ii) 탈면역화된 것을 포함한다(예를 들어 WO2018/140427, 단락 [80] 및 그 이하의 "구체예 세트 #5", 뿐만 아니라 단락 [81] 및 [82] 참조. 명시적으로 본 명세서에 참조로 포함).
b. 기타 구조적 변형
[00298] 숙련된 기술자는 예를 들어, 하나 이상의 1) 항원성 및/또는 면역원성 잠재력을 감소시키는 내인성 에피토프 파괴 및/또는 2) 단백질 분해 절단을 감소시키는 퓨린-절단 모티프 파괴와 함께 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 전반적인 구조와 기능을 유지함으로써 그들이 생물학적 활성을 감소시키지 않고 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 결합 단백질에 대하여, 및 앞의 임의의 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 변형이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 변형은 발현을 촉진하고, 정제를 촉진하고, 약동학적 특성을 개선하고, 및/또는 면역원성을 개선할 수 있다. 이러한 변형은 숙련된 작업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 아미노 말단에 추가되어 개시 부위(initiation site)를 제공하는 메티오닌, 편리하게 위치한 제한 부위 또는 종결 코돈을 생성하기 위해 어느 한쪽 말단에 배치된 추가 아미노산, 및 편리한 검출 및/또는 정제를 제공하기 위해 어느 쪽 말단에 융합된 생화학적 친화성 태그를 포함한다. 미생물 시스템(예: 원핵 세포)을 사용하여 생성된 폴리펩티드의 면역원성을 개선하기 위한 일반적인 변형은 폴리펩티드 생성 후, 박테리아 숙주 시스템에서 생성 동안 포르밀화될 수 있는 출발 메티오닌 잔기를 제거하는 것인데, 예를 들어, N-포르밀메티오닌(fMet)의 존재는 인간 대상과 같은 대상에서 바람직하지 않은 면역 반응을 유도할 수 있기 때문이다.
[00299] 또한 본 발명의 결합 단백질의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 추가의 아미노산 잔기, 또는 에피토프 태그 또는 다른 모이어티에 대한 서열과 같은 본 발명의 결합 단백질의 단백질성 성분의 포함이 본 명세서에 제공된다. 추가 아미노산 잔기는 예를 들어, 클로닝 촉진, 발현 촉진, 번역후 변형, 합성 촉진, 정제, 검출 촉진 및 투여를 포함하는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 에피토프 태그 및 모이어티의 비제한적인 예는 키틴 결합 단백질 도메인, 엔테로펩티다제 절단 부위, 인자 Xa 절단 부위, FIAsH 태그, FLAG 태그, 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제 모이어티, HA 태그, 말토스 결합 단백질 도메인, myc 태그, 폴리히스티딘 태그, ReAsH 태그, 스트렙(strep)-태그, 스트렙-태그(strep-tag) II, TEV 프로테아제 부위, 티오레독신 도메인, 트롬빈 절단 부위 및 V5 에피토프 태그 등이다.
[00300] 상기 구체예들 중 일부에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질의 폴리펩티드 서열은 여전히 필요한 모든 구조적 특징이 있는 한 및 시가 독소 이펙터 폴리펩티드가 단독으로 또는 결합 단백질의 성분으로서 임의의 요구되는 기능(들)을 나타낼 수 있는 한, 폴리펩티드 영역(들)에 도입된 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 변한다(varied). 여전히 존재하고 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 단독으로 또는 결합 단백질의 구성요소로서 필요한 기능(들)을 나타낼 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 하나 이상의 아미노산이 생물학적으로 유사한 또 다른 아미노산 잔기로 대체됨을 의미한다. 예는 예를 들어 작은 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 염기성 아미노산, 소수성 아미노산 및 방향족 아미노산(예를 들어, 표 3 참조)과 같은 유사한 특성을 가진 아미노산 잔기들의 치환을 포함한다. 내인성 포유동물 펩티드 및 단백질에서 일반적으로 발견되지 않는 잔기로의 보존적 치환의 예는 아르기닌 또는 라이신 잔기를 예를 들어 오르니틴, 카나바닌, 아미노에틸시스테인 또는 다른 염기성 아미노산으로의 보존적 치환이다. 펩티드 및 단백질의 표현형 침묵 치환(phenotypically silent substitutions)에 관한 추가 정보는 예를 들어, Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)을 참조할 수 있다.
[00301] 일부 구체예들에서, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 결합 단백질은 본 명세서에 인용된 폴리펩티드 서열과 비교하여, 그것이 (1) 시가 독소 A1 단편 유래 영역의 카르복시 말단에 파괴된 퓨린-절단 모티프 및 (2) 내인성, B-세포 및/또는 CD4+ T-세포 에피토프 영역에서 파괴된 적어도 하나의 아미노산을 가지며, 여기서 파괴된 아미노산은 파괴된 퓨린-절단 모티프와 중첩되지 않는한, 최대 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 치환을 가지는 본 명세서에 기술된 본 발명의 폴리펩티드 영역의 기능적 단편 또는 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 변이체 및 결합 단백질은 변화된 세포독성, 변화된 세포 증식 억제 효과, 변화된 명역원성 및/또는 변화된 혈청 반감기 등과 같은 바람직한 성질을 획득하기 위해 결합 영역 또는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역 내에서와 같이 하나 이상의 아미노산 잔기들의 변경 또는 하나 이상의 아미노산 잔기들의 결실 또는 삽입에 의해 본 명세서에 기술된 폴리펩티드의 변화의 결과로 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 CD38-결합 단백질은 추가로 신호 서열이 있거나 없을 수 있다.
[00302] 따라서, 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 예를 들어 SLT-1A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), 및/또는 SLT-2A (SEQ ID NO:3)와 같은 시가 독소 A 서브유닛과 같이 자연발생적인 시가 독소 A 서브유닛 또는 그의 단편에 대해 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 전반적인 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열들을 포함하거나 필수적으로 이들로만 구성되며, 여기서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 예를 들어 표적 매개 내재화, 촉매 활성 및/또는 세포독성 활성과 같은 자연발생적 SLT-1A 서브유닛과 연관된 하나 이상의 활성을 가진다.
[00303] 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 효소 활성을 증가시키기 위해 돌연변이, 삽입 또는 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구체예들에서, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 촉매 및/또는 세포독성 활성을 감소 또는 제거하기 위해 돌연변이되거나 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 예를 들어, 시가 독소 패밀리 구성원의 A 서브유닛의 촉매 및/또는 세포독성 활성은 돌연변이 또는 절단에 의해 감소되거나 제거될 수 있다.
[00304] 시가 독소 패밀리 구성원의 A 서브유닛의 세포독성은 돌연변이 및/또는 절단에 의해 변경, 감소 또는 제거될 수 있다. 티로신-77, 글루타메이트-167, 아르기닌-170, 티로신-114 및 트립토판-203으로 표시된 위치는 Stx, Stx1 및 Stx2의 촉매 활성에 중요한 것으로 나타났다(Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). 글루타메이트-167과 아르기닌-170을 모두 돌연변이시키면 무세포 리보솜 비활성화 분석에서 Slt-I A1의 효소 활성이 제거되었다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). 소포체에서 Slt-I A1의 새로운 발현을 사용하는 또 다른 접근법에서, 글루타메이트-167과 아르기닌-170을 모두 돌연변이시키면 해당 발현 수준에서 Slt-I A1 단편 세포독성이 제거되었다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310 -18(2005)). 절단 분석은 잔기 75 내지 268의 StxA 단편이 시험관 내에서 여전히 상당한 효소 활성을 유지함을 보여주었다(Haddad J et al., J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)). 잔기 1-239를 함유하는 Slt-I A1의 절단된 단편은 시험관 내에서 상당한 효소 활성 및 세포질에서 새로운 발현에 의한 세포독성을 나타냈다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). 소포체에서 잔기 1-239로 절단된 Slt-I A1 단편의 발현은 세포질로 역전위(retrotranslocate) 될 수 없기 때문에 세포독성이 아니었다(LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).
[00305] 시가 독소 A 서브유닛의 효소 활성 및/또는 세포독성에 대한 가장 중요한 잔기는 다음 잔기 위치에 맵핑되었다: 다른 것들 중 아스파라긴-75, 티로신-77, 티로신-114, 글루타메이트-167, 아르기는-170, 아르기닌-176, 및 트립토판-230(Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). 특히, 글루타메이트-E167에서 라이신으로의 돌연변이와 아르기닌-176에서 라이신으로의 돌연변이를 포함하는 Stx2A의 이중 돌연변이 컨스트럭트는 완전히 비활성화되었고, 반면, Stx1 및 Stx2의 다수의 단일 돌연변이들은 세포독성에서 10배 감소를 나타냈다. 또한, Stx1A를 1-239 또는 1-240으로 절단하면 세포 독성이 감소하고 유사하게 Stx2A를 보존된 소수성 잔기로 절단하면 그 세포 독성이 감소했다. 시가 독소 A 서브유닛에서 진핵생물 리보솜 결합 및/또는 진핵생물 리보솜 억제를 위한 가장 중요한 잔기는 다음 잔기 위치에 맵핑되었다: 아르기닌-172, 아르기닌-176, 아르기닌-179, 아르기닌-188, 티로신-189, 발린-191, 및 류신-233(McCluskey A et al., PLoS One 7: e31191 (2012)). 그러나, 특정 변형은 시가 독소 이펙터 폴리펩티드가 나타내는 시가 독소 기능 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, Stx1A의 잔기 위치 알라닌-231을 글루타메이트로 돌연변이시키면 시험관 내에서 Stx1A의 효소 활성이 증가했다(Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)).
[00306] 일부 구체예들에서, SLT-1A(SEQ ID NO:1) 또는 StxA(SEQ ID NO:2)로부터 유래된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 위치 75에서 아스파라긴, 위치 77에서 티로신, 위치 114에서 티로신, 위치 167에서 글루타메이트, 위치 170에서 아르기닌, 위치 176에서 아르기닌의 치환, 및/또는 위치 203에서 트립토판의 치환을 포함하는 돌연변이된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 치환의 예는 위치 75의 아스파라긴을 알라닌으로, 위치 77의 티로신을 세린으로, 위치 114의 티로신을 세린으로, 글루타메이트 위치 167에서 글루타메이트, 위치 170의 아르기닌의 알라닌으로의 치환, 위치 176의 아르기닌의 라이신으로의 치환, 위치 203의 트립토판의 알라닌으로의 치환, 및/또는 위치 231에서의 알라닌의 글루타메이트로의 치환 등과 같이 선행기술에 기반하여 숙련된 작업자들이 알 것이다. 시가 독소 효소 활성 및/또는 세포독성을 향상시키거나 감소시키는 다른 돌연변이는 본 발명의 범위 내에 있으며 본 명세서에 개시된 잘 알려진 기술 및 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
3. 성분들 및/또는 그들의 하위 구성 요소들을 연결하는 링커
[00307] 개별 CD38-결합 영역, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드, 및/또는 결합 단백질의 성분은 당업계에 잘 알려져 있고 및/또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 링커를 통해 서로 적절하게 연결될 수 있다. 결합 영역의 개별 폴리펩티드 하위 성분, 예를 들어 중쇄 가변 영역(VH), 경쇄 가변 영역(VL), CDR, 및/또는 ABR 영역은 당업계에 잘 알려져 있고/있거나 본 명세서에 기재된 하나 이상의 링커를 통해 서로 적합하게 연결될 수 있다. 본 발명의 단백질성 성분, 예를 들어, 다중-사슬 결합 영역은 당업계에 널리 공지된 하나 이상의 링커를 통해 서로 또는 다른 폴리펩티드 성분에 적합하게 연결될 수 있다. 펩티드 성분, 예를 들어, KDEL 패밀리 소포체 보유/회수(retention/retrieval) 신호 모티프는 당업계에 널리 공지된 단백질성 링커와 같은 하나 이상의 링커를 통해 본 발명의 또 다른 성분에 적합하게 연결될 수 있다.
[00308] 본 명세서에서 "링커(linker)"는 scFv 및/또는 다른 단백질 및 단백질 융합 구조에서 사용되는 것과 같이 2개의 단백질 도메인을 함께 연결하는 도메인 링커를 의미한다. 일반적으로, 각 도메인이 생물학적 기능을 유지할 수 있도록 충분한 길이와 유연성으로 두 도메인의 재조합 부착을 허용하는 재조합 기술에 의해 생성된 전통적인 펩티드 결합을 포함하여 사용할 수 있는 적합한 링커가 많이 있다. 링커 펩티드는 주로 다음 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Gly, Ser, Ala, 또는 Thr. 링커 펩티드는 원하는 활성을 유지하도록 서로에 대해 올바른 형태(conformation)를 가지는 방식으로 두 분자를 연결하기에 적절한 길이를 가져야 한다. 일부 구체예들에서, 링커는 길이가 약 1 내지 약 50개 아미노산이다. 일부 구체예들에서, 링커는 약 1 내지 약 30개의 아미노산 길이이다. 한 구체예에서, 1 내지 20개 아미노산 길이의 링커가 사용될 수 있으며, 일부 구체예들에서는 약 5 내지 약 10개 아미노산 또는 8 내지 15개 아미노산이 사용된다. 유용한 링커는 예를 들어 (GS)n(SEQ ID NO: 193), (GSGGS)n(SEQ ID NO:194), (GGGGS)n(SEQ ID NO:195), 및 (GGGS)n (SEQ IDNO: 196)을 포함하는 글리신-세린 중합체를 포함하며, 여기서 n은 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 기타 유연한 링커 중 하나 이상(일반적으로 3 내지 4)의 정수이다. 대안적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 비단백질성 중합체가 링커로서 사용될 수 있다. 다른 링커 서열은 CL/CH1 도메인의 모든 잔기가 아닌 임의의 길이의 임의의 서열을 포함할 수 있고, 예를 들어, CL/CH1 도메인의 처음 5-12개 아미노산 잔기가 있다. 링커는 또한 면역글로불린 경쇄, 예를 들어 C 또는 C로부터 유래될 수 있다. 링커는 예를 들어 C 1, C 2, C 3, C 4, C 1, C 2, C, C, 및 C를 포함하는 임의의 아이소타입의 면역글로불린 중쇄로부터 유래될 수 있다. 링커 서열은 또한 Ig-유사 단백질(예를 들어, TCR, FcR, KIR), 힌지 영역-유래 서열, 및 다른 단백질로부터의 다른 천연 서열과 같은 다른 단백질로부터 유래될 수 있다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있지만, 많은 구체예들은 예를 들어 (GS)n(SEQ ID NO:193), (GSGGS)n(SEQ ID NO:194), (GGGGS)n(SEQ ID NO:195), 및 (GGGS)n(SEQ ID NO:196)을 포함한 글리신-세린 중합체를 포함하는데, 여기서 n은 적어도 1(및 일반적으로 2 내지 3 내지 4 내지 5)의 정수이다. "scFv 링커"는 일반적으로 이러한 글리신-세린 중합체를 포함한다.
[00309] 적합한 링커는 일반적으로 본 발명의 각 폴리펩티드 성분이 어떤 링커 또는 다른 성분 없이 개별적으로 생성된 폴리펩티드 성분과 매우 유사한 3차원 구조로 접힐 수 있게 하는 것이다. 적합한 링커는 단일 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 및 분지형이든 고리형이든 다양한 비단백질성 탄소 사슬과 같은 전술한 것 중 어느 것이 결핍된 링커를 포함한다.
[00310] 적합한 링커는 예를 들어, 화학 링커와 같이 비-단백질성일 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 비-단백질성 링커는 면역글로불린 폴리펩티드를 이종 폴리펩티드에 접합(conjugate)시키기 위해 사용되는 링커와 같은 본 발명의 결합 단백질의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 성분에 세포-표적화 결합 영역을 연결하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 영역은 예를 들어 카르복시, 아민, 술프히드릴, 카르복실산, 카르보닐, 히드록실 및/또는 고리형 고리기(cyclic ring group)와 같은 탄수화물 모이어티 및 아미노산 잔기의 기능적 측쇄를 사용하여 연결될 수 있다. 예를 들어, 이황화 결합 및 티오에테르 결합을 사용하여 둘 이상의 폴리펩티드를 연결할 수 있다. 또한, 비천연 아미노산 잔기는 케톤기(ketone group)와 같은 다른 기능적 측쇄와 함께 사용될 수 있다. 비-단백질성 화학적 링커의 예는 N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)-아미노벤조에이트, S-(N-숙신이미딜) 티오아세테이트(SATA), N-숙신이미딜-옥시카보닐-cu-메틸-a-(2)피리딜디티오)톨루엔(SMPT), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)-펜타노에이트(SPP), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산 카르복실레이트(SMCC 또는 MCC), 설포숙신이미딜(4-요오도아세틸)-아미노벤조에이트, 4-숙신이미딜-옥시카르보닐-α-(2-피리딜디티오)톨루엔, 술포숙신이미딜-6-(α-메틸-α-(피리딜디티올)-톨루아미도)헥사노에이트, N-숙신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜 6(3(-(-2-피리딜디티오)-프로피온아미도)헥사노에이트, 설포숙신이미딜 6(3(-(-2-피리딜디티오)-프로피온아미도)헥사노에이트, 말레이미도카프로일(MC), 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐(MC-vc-PAB), 3-말레이미도벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS), 알파-알킬 유도체, 설포NHS-ATMBA(설포숙신이미딜 N-[3-(아세틸티오)-3-메틸부티릴-베타-알라닌]), 설포디클로로페놀, 2-이미노티올레인(iminothiolane), 3-(2-피리딜디티오)-프로피오닐 히드라지드(propionyl hydrazide), 엘만(Ellman) 시약, 디클로로트리아지닉산(dichlorotriazinic acid), 및 S-(2-티오피리딜)-L-시스테인 등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
[00311] 단백질성 링커는 본 발명의 재조합 융합 결합 단백질로의 혼입(incorporation)을 위해 선택될 수 있다. 본 발명의 재조합 융합 세포-표적화 단백질의 경우, 링커는 일반적으로 약 1 내지 약 50개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구체예들에서, 링커는 약 5 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 단백질성 링커는 예를 들어 트레오닌, 프롤린, 글루타민, 글리신 및 알라닌과 같은 극성, 비하전 및/또는 하전 잔기를 갖는 아미노산 잔기의 대다수(majority)를 포함한다. 단백질성 링커의 비제한적 예는 알라닌-세린-글리신-글리신-프롤린-글루타메이트(ASGGPE, SEQ ID NO:197), 발린-메티오닌(VM), 알라닌-메티오닌(AM), AM(G2 내지 4S)xAM을 포함하며, 여기서 G는 글리신이고, S는 세린이고, x는 1 내지 10의 정수이다(SEQ ID NO:198).
[00312] 단백질성 링커는 원하는 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 단백질성 링커는 동일한 도메인 자체의 활성에 비교한 융합 컨스트럭트의 맥락에서 융합 분자의 폴딩, 안정성, 발현, 용해도, 약동학적 특성, 약력학적 특성 및/또는 융합 도메인의 활성 중 하나 이상을 최적화하는 것과 같은 특정 특징을 염두에 두고 숙련된 작업자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 단백질성 링커는 유연성, 경질성(rigidity) 및/또는 절단성(cleavability)에 기초하여 선택될 수 있다. 숙련된 작업자는 링커를 선택할 때 데이터베이스 및 링커 설계 소프트웨어 도구를 사용할 수 있다. 어떤 경우에는 특정 링커를 선택하여 발현을 최적화할 수 있다. 특정 링커는 동종이량체와 같은 동종다량체를 형성하기 위해 동일한 폴리펩티드 또는 단백질 간의 분자간 상호작용을 촉진하도록 선택될 수 있다.
[00313] 가요성(flexible) 단백질성 링커는 종종 길이가 12개를 초과하는 아미노산 잔기이고 작은 비극성 아미노산 잔기, 극성 아미노산 잔기 및/또는 친수성 아미노산 잔기, 예를 들어 글리신, 세린 및 트레오닌이 풍부하다. 가요성 단백질성 링커는 성분들 사이의 공간적 분리를 증가시키고 및/또는 성분들 간의 분자내 상호작용을 허용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 다양한 "GS" 링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 때때로 반복 단위, 예를 들어 (GxS)n (SEQ ID NO:199), (SxG)n (SEQ ID NO:200), (GGGGS)n (SEQ ID NO:195), 및 (G)n (SEQ ID NO:201)(여기서 x는 1 내지 6이고 n은 1 내지 30이다)와 같이 복수의 글리신 및/또는 하나 이상의 세린으로 구성된다. 가요성 단백질성 링커의 비제한적 예는 GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO:202), EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:203), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:204), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO:205), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:206), SRSSG (SEQ ID NO:207), 및 SGSSC (SEQ ID NO:208)을 포함한다.
[00314] 경질(rigid) 단백질성 링커는 종종 뻣뻣한 알파-나선 구조이고 프롤린 잔기 및/또는 하나 이상의 전략적으로 배치된 프롤린이 풍부한다. 연결된 구성요소 간의 분자 내 상호작용을 방지하기 위해 경질 링커를 선택할 수 있다.
[00315] 본 발명의 CD38-결합 단백질의 일부 구체예들에서, 표적 세포 내에 존재하는 프로테아제에 의한 절단을 제공하기 위해 하나 이상의 프로테아제 민감성 부위를 포함하는 링커가 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질의 일부 구체예들에서, 척추동물 유기체에 투여한 후 원치 않는 독성을 감소시키기 위해 절단할 수 없는 링커가 사용될 수 있다.
[00316] 본 발명의 CD38-결합 단백질의 일부 구체예들에서, CD38-결합 영역은 공유 및 비공유 연결 둘 다를 포함하여 숙련된 작업자에게 공지된 임의의 수의 수단을 사용하여 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에 연결된다.
[00317] 본 발명의 CD38-결합 단백질의 일부 구체예들에서, 분자는 중쇄 가변(VH) 도메인 및 경쇄 가변(VL) 도메인을 연결하는 링커를 갖는 scFv인 결합 영역을 포함한다. 예를 들어, 15-잔기(Gly4Ser)3 펩티드(SEQ ID NO:183)와 같이 이러한 목적에 적합한 당업계에 공지된 수 많은 링커가 있다. 비공유 동종이량체 구조를 형성하는데 사용될 수 있는 적합한 scFv 링커는 GGGS (SEQ ID NO:185), GGGGS (SEQ ID NO:186), GGGGSGGG (SEQ ID NO:187), GGSGGGG (SEQ ID NO:188), GSTSGGGSGGGSGGGGSS (SEQ ID NO:189), 및 GSTSGSGKPGSSEGSTKG (SEQ ID NO:190)을 포함한다.
[00318] CD38-결합 단백질 성분의 연결에 적합한 방법은 부착이 실질적으로 결합 영역의 결합 능력을 방해하지 않는 한 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 성분의 세포 내재화 및/또는 적절한 곳에서 본 명세서에 기술된 분석을 포함하여 적절한 분석에 의하여 측정된 원하는 시가 독소 이펙터 기능(들)과 같은 것을 달성하기 위하여 현재 당업계에 공지된 임의의 방법일 수 있다.
[00319] 결합 단백질의 성분, 예를 들어, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및/또는 면역글로불린 유형 CD38-결합 영역은 추가 성분, 예를 들어, 추가적인 외인성 물질(WO 2018/106895 참조)의 연결을 위한 모이어티의 적합한 부착을 제공하기 위하여 조작될 수 있다.
[00320] 일부 구체예들에서, CD38-결합 단백질은 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드, 링커, 및 CD38-결합 도메인을 포함하거나 이로 이루어진다. 링커는 단백질성 링커일 수 있고, 약 1 내지 약 50개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 단백질성 링커는 1 내지 50개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 일부 구체예들에서, 링커는 SEQ ID NO:70-75 중 어느 하나의 서열, 또는 그에 대해 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구체예들에서, 링커는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
D. 본 발명의 CD38-결합 단백질의 목적을 위해, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드(들), 결합 영역(들), 및 임의의 선택적 링커(들)과 같은 성분들의 특정한 순서 또는 방향은 구체적으로 언급되지 않는 한, 서로 또는 전체 결합 단백질과 관련하여 다양할 수 있다(예를 들어, 도 1 참조). 본 발명의 결합 단백질들의 성분들은 결합 영역 및 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 원하는 활성(들)이 제거되지 않는 한 임의의 순서로 배열될 수 있다. 일부 구체예들에서, CD38-결합 단백질은 그의 N-말단에서 C-말단으로 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드-제1 링커-VH-제2 링커-VL을 포함한다. 일부 구체예들에서, CD38-결합 단백질은 그의 N-말단에서 C-말단으로 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드-제1 링커-VL-제2 링커-VH를 포함한다. CD-38 결합 융합 단백질의 유용한 구체예들.
[00321] 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 CD38-결합 융합 단백질은 도 1에 일반적으로 도시된 바와 같이 다양한 형식일 수 있다.
[00322] 일부 구체예들에서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3에 도시된 것과 같은 야생형 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 성분은 링커를 사용하여 또한 도 13에 도시된 바와 같이 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 임의의 CD38 표적화 모이어티(CD38-결합 영역 또는 도메인으로 본 명세서에서 지칭되기도 함)에 연결될 수 있다.
[00323] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-D1-1(SEQ ID NO:47)이다.
[00324] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-D1(SEQ ID NO:45)이다.
[00325] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-D1-2(SEQ ID NO:47)이다.
[00326] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-D1-3(SEQ ID NO:48)이다.
[00327] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-D1-4(SEQ ID NO:49)이다.
[00328] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 1(SEQ ID NO:55)이다.
[00329] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 2(SEQ ID NO:56)이다.
[00330] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 3(SEQ ID NO:57)이다.
[00331] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 4(SEQ ID NO:58)이다.
[00332] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 5(SEQ ID NO:59)이다.
[00333] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 6(SEQ ID NO:60)이다.
[00334] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 7(SEQ ID NO:61)이다.
[00335] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 8(SEQ ID NO:62)이다.
[00336] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 9(SEQ ID NO:63)이다.
[00337] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 10(SEQ ID NO:64)이다.
[00338] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 11(SEQ ID NO:65)이다.
[00339] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 12(SEQ ID NO:66)이다.
[00340] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 13(SEQ ID NO:67)이다.
[00341] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 14(SEQ ID NO:68)이다.
[00342] 도 13에 도시된 바와 같이, 특정 구체예에서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 CD38TM1, CD38TM2, CD38TM3, 및 CD38TM4로부터 선택된 CD38 결합 도메인에 연결된 SLT-1A-콤보 변종 15(SEQ ID NO:69)이다.
[00343] 다음의 구체예들은 CD38을 발현하는 세포를 포함하는, 세포 표면에서 CD38과 물리적으로 결합된 세포를 표적하는 CD38 결합 융합단백질을 포함하는 실례가 되는 CD38 결합 단백질의 특정 구조를 더 상세하게 기술한다.
[00344] 당업계에서는 인정받을 바와 같이, 본 발명의 CD38 결합 융합단백질은 최소한 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 및 CD38 결합 도메인과 함께 필요에 따라 적절한 링커를 포함한다. 상기 CD38 결합 도메인은 정확하게 연합되었을 때 인간 CD38을 결합시키는 VH 및 VL을 일반적으로 포함한다.
[00345] 본 발명의 특히 용이한 CD38 결합 단백질은 CD38 결합 단백질 #1(SEQ ID NO:76), CD38 결합 단백질 #2(SEQ ID NO:77), CD38 결합 단백질 #3(SEQ ID NO:78), CD38 결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79), CD38 결합 단백질 #5(SEQ ID NO:80), CD38 결합 단백질 #6(SEQ ID NO:81) 및 CD38 결합 단백질 #7(SEQ ID NO:82)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
[00346] 특히 유용한 구체예에서 본 발명의 CD38 결합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드-링커-VH-링커-VL을 포함한다. 이 구체예에서 시가 독소 폴리펩티드는 SEQ ID NO:46을 갖고, 그리고 VH 및 VL은 다음의 쌍(pairs)으로부터 선택된다: SEQ ID NOs:101 및 105; SEQ ID NOs:101 및 125; SEQ ID NOs:109 및 113 그리고 SEQ ID NOs:117 및 121.
[00347] 특히 유용한 구체예에서 본 발명의 CD38 결합 단백질은 N-말단에서부터 C-말단까지 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드-링커-VH-링커-VL을 포함한다. 이 구체예에서 시가 독소 폴리펩티드는 SEQ ID NO:46을 갖고, 그리고 VH 및 VL은 다음의 쌍으로부터 선택된다: SEQ ID NOs:101 및 105; SEQ ID NOs:101 및 125; SEQ ID NOs:109 및 113 그리고 SEQ ID NOs:117 및 121.
[00348] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 N-말단에서부터 C-말단까지 또는 C-말단에서부터 N-말단까지, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및 CD38 결합 도메인을 포함한다. 상기 CD38 결합 융합단백질은 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및 CD38 결합 도메인을 연결시키는 제1 링커를 더 포함할 수 있다.
[00349] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 N-말단에서부터 C-말단까지 또는 C-말단에서부터 N-말단까지, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
[00350] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 N-말단에서부터 C-말단까지 또는 C-말단에서부터 N-말단까지, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드, 제1 링커, VH 및 VL을 포함한다.
[00351] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 N-말단에서부터 C-말단까지 또는 C-말단에서부터 N-말단까지, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드, 제1 링커, VH, 제2 링커 및 VL을 포함한다.
[00352] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 N-말단에서부터 C-말단까지 또는 C-말단에서부터 N-말단까지, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드, VL 및 VH를 포함한다.
[00353] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 N-말단에서부터 C-말단까지 또는 C-말단에서부터 N-말단까지, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드, 제1 링커, VL 및 VH를 포함한다.
[00354] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 N-말단에서부터 C-말단까지 또는 C-말단에서부터 N-말단까지, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드, 제1 링커, VL, 제2 링커 및 VH를 포함한다.
[00355] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 (i) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드; (ii) SEQ ID NO:34의 서열을 포함하는 vHCDR1, SEQ ID NO:35의 서열을 포함하는 vHCDR2, 및 SEQ ID NO:36의 서열을 포함하는 vHCDR3을 포함하는 VH; 및 (iii) SEQ ID NO:31의 서열을 포함하는 vLCDR1, SEQ ID NO:32의 서열을 포함하는 vLCDR2, 및 SEQ ID NO:33의 서열을 포함하는 vLCDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 CD38 결합 융합단백질이 (i) 시가 독소 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및 (ii) VH 또는 (iii) VL을 연결시키는 제1 링커를 더 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 CD38 결합 융합단백질이 (ii) VH 및 (iii) VL을 연결시키는 제2 링커를 더 포함한다. 일부 구체예에서 상기 제1 링커는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 제2 링커는 SEQ ID NO:75의 서열을 포함한다.
[00356] 일부 구체예에서 상기 VL은 SEQ ID NO:43의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 VL은 SEQ ID NO:43의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 그리고 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 VH는 SEQ ID NO:43의 서열을 포함하고, 그리고 상기 VL은 SEQ ID NO:44의 서열을 포함한다.
[00357] 일부 구체예에서 상기 VL은 SEQ ID NO:41의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 VL은 SEQ ID NO:41의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 그리고 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 VL은 SEQ ID NO:41의 서열을 포함하고, 그리고 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열을 포함한다.
[00358] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 (i) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드; (ii) SEQ ID NO:22의 서열을 포함하는 vHCDR1, SEQ ID NO:23의 서열을 포함하는 vHCDR2, 및 SEQ ID NO:24의 서열을 포함하는 vHCDR3을 포함하는 VH; 및 (iii) SEQ ID NO:19의 서열을 포함하는 vLCDR1, SEQ ID NO:20의 서열을 포함하는 vLCDR2, 및 SEQ ID NO:21의 서열을 포함하는 vLCDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 VL이 SEQ ID NO:37의 서열을 포함하거나 그로 이루어지고, 그리고 상기 VH는 SEQ ID NO:38의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 VL은 SEQ ID NO:37의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 그리고 상기 VH는 SEQ ID NO:37의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 CD38 결합 융합단백질이 (i) 시가 독소 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및 (ii) VH 또는 (iii) VL을 연결시키는 제1 링커를 더 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 CD38 결합 융합단백질이 (ii) VH 및 (iii) VL을 연결시키는 제2 링커를 더 포함한다.
[00359] 일부 구체예에서는 CD38 결합 융합단백질이 (i) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드; (ii) SEQ ID NO:28의 서열을 포함하는 vHCDR1, SEQ ID NO:29의 서열을 포함하는 vHCDR2, 및 SEQ ID NO:30의 서열을 포함하는 vHCDR3을 포함하는 VH; 및 (iii) SEQ ID NO:25의 서열을 포함하는 vLCDR1, SEQ ID NO:26의 서열을 포함하는 vLCDR2, 및 SEQ ID NO:27의 서열을 포함하는 vLCDR3을 포함하는 VL을 포함하는 (i) CD38 결합 단백질을 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 VL이 SEQ ID NO:39의 서열을 포함하고, 그리고 상기 VH는 SEQ ID NO:40의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 VL은 SEQ ID NO:39의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 그리고 상기 VH는 SEQ ID NO:40의 서열, 또는 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 CD38 결합 융합단백질이 (i) 시가 독소 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및 (ii) VH 또는 (iii) VL을 연결시키는 제1 링커를 더 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 CD38 결합 단백질이 (ii) VH 및 (iii) VL을 연결시키는 제2 링커를 더 포함한다.
[00360] 일부 구체예에서는 본 발명의 CD38 결합 융합단백질이 SEQ ID NOs: 76-82 및 228-232 중 어느 하나에 개시된 폴리펩티드를 포함한다. 선택적으로 상기 CD38 결합 융합단백질은 아미노말단 메티오닌 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 CD38 결합 융합단백질은 SEQ ID NO:79-82 중 어느 하나에 대해 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서 상기 CD38 결합 융합단백질은 SEQ ID NO:79의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 CD38 결합 융합단백질은 두 개의 동일한 폴리펩티드를 포함하고, 각각의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:79에 대해 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 최소 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 CD38 결합 융합단백질은 두 개의 동일한 폴리펩티드를 포함하고, 각각의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:79의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 CD38 결합 융합단백질은 두 개의 동일한 폴리펩티드로 이루어지고, 각각의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:79의 서열로 이루어진다.
CD38 결합 융합단백질의 일반 기능
[00361] 본 발명의 CD38 결합 단백질은 예를 들어 세포 사멸(cell-killing), 세포 성장 억제, 세포 내(intracellular) 카고 전달(cargo delivery), 생물 정보 수집, 면역 반응 자극, 및/또는 건강 상태 개선(remediation)을 포함하는 다양한 적용에서 유용하다. 일부 구체예에서는 본 발명의 CD38 결합 단백질이 CD38을 표적한다(즉 CD38 표적 분자이다). 본 발명의 CD38 결합 단백질은 예를 들어 CD38 발현과 연관된 암 및 면역질환을 포함하는 다양한 질병의 진단 또는 치료를 위해 특정 CD38 발현 세표 유형의 생체내 표적을 수반하는 적용에서 예를 들어 세포 표적, 세포독성, 치료 분자; 세포 표적, 비독성, 전달 매개체(delivery vehicles); 및/또는 세포 표적, 진단 분자로서 유용하다.
[00362] 일부 구체예에서 본 발명의 CD38 결합 융합단백질은 특정 세포 유형의 세표 표면과 연관된 CD38 분자의 세포외 부분을 결합시키고 그리고 그 세포에 진입하는 것이 가능하다. 표적된 세포 유형 내에 내재화된 후에, 본 발명의 결합 단백질의 일부 구체예는 효소 활성, 세포독성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 단편을 표적 세포의 시토졸 내로 라우팅(routing)하고 그리고 궁극적으로 세포를 사멸시키는 것이 가능하다. 대안으로 본 발명의 결합 단백질의 비독성 또는 독성이 감소된 변종은 추가 외인성 물질을 CD38 양성 표적 세포 내로 전달하는 데에 사용될 수 있다. 이 시스템은 예를 들어 인간 피험자와 같은 대상에게 CD38 결합 단백질을 투여하는 것을 수반하는 적용을 위한 탈면역된 이펙터, 그리고 특히 생체내 안정성을 향상시키기 위한 감소된 프로테아제 절단 민간성 이펙터(reduced protease-cleavage sensitive effectors)와 같은 상이한 기능적 특징을 가진 본 발명의 결합 단백질의 변종을 생산하기 위해 다양한 시가 독소 이펙터 폴리펩티드가 몇 개든지 CD38 결합 영역(들)과 연합할 수 있다는 점에서 모듈러식이다.
E. 시가 독소 A 서브유닛 세포독성을 통한 CD38 양성 세포 사멸
[00363] 본 발명의 세포 독성 이펙터 폴리펩티드 및 결합 단백질의 일부 구체예는 세포독성이다. 본 발명의 CD38 결합 단백질의 일부 구체예는 오직 하나 이상의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소의 존재 때문에 세포독성이다. 시가 독소 군의 A 서브유닛 구성원은 각각 세포의 시토졸 내에 있을 때 진핵세포를 사멸시킬 수 있는 효소 활성 폴리펩티드 영역을 포함한다. 시가 독소 군의 구성원은 진핵세포를 사멸시키도록 적응되었기 때문에, 예를 들어 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 일부 구체예를 포함하는 CD38 결합 단백질과 같이 시가 독소로부터 유래된 분자는 강력한 세포 사멸 활성을 보일 수 있다.
[00364] 본 발명의 결합 단백질의 일부 구체예는 결합 단백질의 결합 영역에 의해 결합된 CD38과 물리적으로 결합된 세포(예: CD38 양성 세포)와 접촉했을 때, 결합 단백질은 상기 세포의 사멸을 야기하는 것이 가능하다. 일부 구체예에서 상기 결합 단백질의 CD50 값은 5 이하, 2.5 이하, 1 이하, 0.5 이하, 또는 0.25nM 이하이고, 이는 비표적, 야생형, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드(예: SEQ ID NO:1-18)보다 훨씬 더 강력하다. 예를 들어 SEQ ID NO:76, 78-81, 및 228-232 중 어느 하나를 포함하거나, 그로만 필수적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지는 CD38 결합 단백질은 예를 들어 약 0.1 내지 약 0.2nM의 CD50 값을 특징으로 하는 것들과 같이 약화된 수준의 CD38을 발현하는 세포(실시예, 하기, 표 7-9 및 도 3 참조)를 포함하는 CD38 발현 세포를 강력하게 사멸시킨다.
[00365] 일부 구체예에서 상기 결합 단백질의 CD50 값은 50 이하, 30 이하, 20 이하, 15 이하, 10 이하, 5 이하, 1 이하, 0.5 이하, 0.4 이하, 0.3 이하, 0.2 이하, 0.1ng/mL 이하이다. 예를 들어 SEQ ID NO:76, 78-81, 및 228-232 중 어느 하나를 포함하거나, 그로만 필수적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지는 CD38 결합 단백질은 예를 들어 약 0.05 또는 0.1ng/mL의 CD50 값을 특징으로 하는 것들과 같이 약화된 수준의 CD38을 발현하는 세포(실시예, 하기, 표 7-9 및 도 3 참조)를 포함하는 CD38 발현 세포를 강력하게 사멸시킨다.
[00366] 세포 사멸은 예를 들어 생체외 조작된 표적 세포, 시험관내 배양된 표적 세포, 시험관내 배양된 조직 샘플 내의 표적 세포, 또는 다세포의 유기체 내와 같은 생체내 환경에 있는 표적 세포와 같이, 표적 세포의 다양한 조건하에서 본 발명의 분자를 사용하여 달성할 수 있다.
[00367] 일부 구체예에서 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 결합 단백질은 (1) 탈면역된, 시가 독소 이펙터 하위영역(sub-region), (2) 시가 독소 A1 단편 유래 영역의 카르복시 말단 근처의 프로테아제 절단 저항 영역, (3) 카르복시 말단, 소포체 잔류/회수 신호 모티프(endoplasmic reticulum retention/retrieval signal motif), 및/또는 (4) 이종 분자 카고를 포함한다. 그러나 일부 구체예에서는 이러한 구조적 변형이 예를 들어 야생형 시가 독소 A1 단편과 같이, 야생형 시가 독소 A 서브유닛 폴리펩티드를 포함하는 비교 분자와 비교해서 시가 독소 세포독성의 역가를 유의미하게 변경하지 않는다. 따라서 탈면역된, 프로테아제 절단 저항성, 및/또는 분자 카고를 나르는 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 CD38 결합 단백질은 하나 이상의 다양한 다른 기능 또는 성질을 제공하면서도 강한 세포독성을 유지할 수 있다.
[00368] 결합 단백질 구성요소는 선행기술로부터 선택되거나 또는 당업계의 숙련자에게 알려진 통상적인 방법을 사용하여 만들어질 수 있다(예를 들어 WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, WO 2016/196344, PCT/US2017/065074, 및 WO 2018/106895 참조). 예를 들어 탈면역된 그리고 퓨린 절단 저항성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 이전에 WO 2015/113007, WO 2015/191764, 및 WO 2016/196344에 기술되었다. 부위 특이 접합 부위(site-specific conjugation sites)를 포함하는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 시가 독소 이펙터 스캐폴드는 이전에 WO 2018/106895에 기술되었다.
F. 세포 유형 사이에서 선택적 세포독성
[00369] 본 발명의 일부 CD38 결합 단백질은 비표적, 방관자(bystander) 세포가 있는 데서 특정한 표적 세포의 선택적 사멸(selective killing)에 사용된다. 세포 표적 결합 영역(들)을 통한 특정 CD38 양성 세포로의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드의 전달을 표적하는 것으로, 본 발명의 결합 단백질은 결과적으로 비표적 세포가 있는 데서 선택된 세포 유형의 배타적 또는 선택적 사멸을 야기하는 세포 유형 특이적, 제한된 세포 사멸 활성을 보일 수 있다. 또한, 본 발명의 CD38 결합 단백질을 사용하는 세포독성, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 세포 표적 전달은 비표적 세포가 있는 데서 CD38 양성 표적 세포에 배타적으로 또는 선택적으로 제한된 세포독성 구성요소를 전달한다.
[00370] 일부 구체예에서 본 발명의 결합 단백질은 특정 농도에서 세포독성이다. 일부 구체예에서 세포 유형의 혼합물에 본 발명의 결합 단백질을 투여하면, 세포독성 결합 단백질은 어느 세포외 CD38과 물리적으로 결합하지 않은 세포 유형과 비교하여 결합 영역에 의해 세포외 CD38과 물리적으로 결합된 세포들을 선택적으로 사멸시키는 것이 가능하다. 일부 구체예에서 본 발명의 세포독성 결합 단백질은 2 이상의 상이한 세포 유형의 혼합물 내에서 특정 세포 유형의 세포사를 선택적으로 또는 우선적으로 야기하는 것이 가능하다. 이는 표적 생체분자를 발현하지 않는 "방관자" 세포 유형에 비해, 3배의 세포독성 효과와 같은, 높은 선호도(preferentiality)를 갖는 특정 세포 유형에 대한 세포독성 활성을 표적할 수 있게 한다. 그렇지 않으면, 표적 생체분자가 충분히 낮은 양으로 발현되고 그리고/또는 표적되지 않을 세포 유형과 적은 양으로 물리적으로 결합되는 경우, 결합 영역의 표적 생체분자의 발현은 하나의 세포 유형에 비배타적일 수 있다. 이는 상당한 양의 표적 생체분자를 발현시키지 않거나 또는 상당한 양의 표적 생체분자에 물리적으로 결합되지 않은 "방관자" 세포 유형에 비해, 3배의 세포독성 효과와 같은, 높은 선호도 갖는 특정 세포 유형의 표적된 세포 사멸을 가능하게 한다.
[00371] 일부 구체예에서는 2개의 상이한 집단의 세포 유형에 세포독성 결합 단백질을 투여했을 때, 상기 세포독성 결합 단백질이 그의 구성원이 세포독성 결합 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자를 발현시키지 않는 세포의 집단에 대한 동일한 세포독성 결합 단백질의 CD50 투여량보다 적어도 3배 적은 투여량으로, 그의 구성원이 세포독성 결합 단백질의 결합 영역의 세포외 표적 생체분자를 발현하는 표적 세포의 집단에 대한 반 최고치 세포독성 농도(CD50)에 의해 정의된 세포사를 야기하는 것이 가능하다.
[00372] 일부 구체예에서 결합 영역에 의해 결합된 세포외 CD38과 물리적으로 결합된 세포 유형의 집단에 대한 본 발명의 결합 단백질의 세포독성 활성은 결합 영역에 의해 어느 세포외 CD38과도 물리적으로 결합하지 않은 세포 유형의 집단에 대한 세포독성 활성보다 적어도 3배 더 높다. 본 발명에 따라, 선택적 세포독성은 (a) 결합 영역에 의해 결합된 세포외 CD38과 물리적으로 결합된 특정 세포 유형의 세포 집단에 대한 세포독성 대 (b) 결합 영역에 의해 결합된 어느 세포외 CD38과도 물리적으로 결합되지 않은 세포 유형의 세포의 집단에 대한 세포독성의 비율(a/b) 면에서 정량화될 수 있다. 일부 구체예에서 세포독성 비율은 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합되지 않은 세포 또는 세포 유형의 집단과 비교하여 결합 영역의 표적 생체분자와 물리적으로 결합된 세포 또는 세포 유형의 집단에 대해 최소 3배, 최소 5배, 최소 10배, 최소 15배, 최소 20배, 최소 25배, 최소 30배, 최소 40배, 최소 50배, 최소 75배, 최소 100배, 최소 250배, 최소 500배, 최소 750배, 또는 최소 1000배 더 높은 선택적 세포독성을 나타낸다.
[00373] 이러한 우선적 세포 사멸 기능은 다양한 조건하에서 그리고 생체외 조작된 세포 유형의 혼합물, 세포 유형의 혼합물을 갖는 시험관 내에서 배양된 조직, 또는 다수 세포 유형이 있는 생체내(예: 다세포 유기체 내의 원위치(in situ) 또는 선천적인 위치에서)와 같은, 비표적된 방관자 세포가 있는 데서 표적된 세포가 본 발명의 특정 세포독성, 결합 단백질에 의해 사멸되는 것을 가능하게 한다.
G. 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 CD38 결합 단백질의 생산, 제조, 및 정제
[00374] 본 명세서에 개시된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 CD38 결합 단백질은 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 CD38 결합 단백질은 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템의 사용, 또는 그 외의 어느 적합한 방법으로도 제조될 수 있다. 따라서 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 결합 단백질은 예를 들어 다음을 포함하는 방법들을 포함하는 다양한 방법으로 합성될 수 있다: (1) 단계적 또는 단편 조립법(fragment assembly)으로 표준 고상 또는 액상 방법론을 사용한 결합 단백질의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 구성요소를 합성하고, 그리고 최종 폴리펩티드 화합물 생성물을 분리 및 정제하는 단계; (2) 숙주 세포에서 본 발명의 결합 단백질의 단백질 또는 단백질 구성요소를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키고 그리고 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양물로부터 발현 생성물을 회수하는 단계; 또는 (3) 본 발명의 결합 단백질의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 구성요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 무세포, 시험관 내 발현, 그리고 발현 생성물을 회수하는 단계; 또는 단백질 구성요소의 단편을 얻고, 이어서 폴리펩티드 구성요소를 얻기 위해 펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 결합(예를 들어 결찰(ligating))하고, 그리고 폴리펩티드 구성요소를 회수하기 위한 (1), (2), 또는 (3)의 아무 조합.
[00375] 일부 구체예에서 본 발명의 CD38 결합 단백질, 또는 본 발명의 단백질 구성요소는 고상 또는 액상 펩티드 합성 방법으로 합성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 결합 단백질은 표준 합성 방법에 의해 적합하게 제조될 수 있다. 따라서, 펩티드는 예를 들어 표준 고상 또는 액상 방법론으로 펩티드를 단계적 또는 단편 조립법으로 합성하는 단계, 그리고 최종 펩티드 생성물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 합성될 수 있다. 이러한 맥락에서, WO 1998/011125 또는 특히, Fields G et al., Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis(Synthetic Peptides, Grant G, ed., Oxford University Press, U.K, 2nd ed., 2002) 및 그의 합성 예를 참조할 수 있다.
[00376] 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 CD38 결합 단백질은 당업계에 잘 알려진 재조합 기술을 사용하여 제조(생산 및 정제)될 수 있다. 일반적으로, 인코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환 또는 형질주입된 숙주 세포를 배양하고 그리고 세포 배양물로부터 단백질을 정제 또는 회수함으로써 단백질을 제조하는 방법은 예를 들어, Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989); Dieffenbach C et al., PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995)에 기술되어 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질을 생산하기 위해 어느 적합한 숙주 세포라도 사용될 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 유도하는 하나 이상의 발현 벡터로 안정적으로 또는 일시적으로 형질주입, 형질전환, 형질도입 또는 감염된 세포일 수 있다. 그에 더하여, 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질은 변화된 세포독성, 변화된 세포분열억제 효과, 및/또는 변화된 혈청 반감기와 같은, 원하는 특성을 달성하기 위해 하나 이상의 아미노산의 변경 또는 결실 또는 삽입을 야기하는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것으로 제조될 수 있다.
[00377] 본 발명의 폴리펩티드 또는 CD38 결합 단백질을 생산하기 위해 선택될 수 있는 다양한 발현 시스템이 있다. 예를 들어 본 발명의 결합 단백질의 발현을 위한 숙주 유기체는 대장균 및 청국균(B. subtilis)과 같은 원핵생물, 효모균 및 사상균과 같은 진핵 세포(S. cerevisiae, P. pastoris, A. awamori, 및 K. lactis와 같은), 조류(algae)(C. reinhardtii와 같은), 곤충 세포주, 포유류 세포(CHO 세포와 같은), 식물 세포주, 및 형질전환 식물(A. thaliana 및 N. benthamiana와 같은)과 같은 진핵 유기체와 같은 것들을 포함한다.
[00378] 그에 따라 본 발명은 상기에 언급된 방법에 따라 그리고 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 결합 단백질의 단백질 구성요소의 일부 또는 전부를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포 내에 진입했을 때 본 발명의 폴리펩티드 또는 결합 단백질 일부 또는 전부를 인코딩할 수 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 적어도 하나 포함하는 발현 벡터, 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질을 제작하는 방법 또한 제공한다.
[00379] 일부 구체예에서는 본 발명의 CD38 결합 단백질을 만드는 방법에서 사용하기 위해 CD38 결합 단백질을 인코딩하는 핵산이 제조된다. 일부 구체예에서는 본 발명의 CD38 결합 단백질을 만드는 방법이 CD38 결합 단백질을 인코딩하는 핵산으로 숙주 세포를 접촉하는 단계를 포함한다. CD38 결합 단백질은 CD38 결합 단백질이 발현되는 조건하에 숙주 세포를 배양하고 그리고 단백질을 회수하는 것으로 제조될 수 있다. 당업계에 숙련자에게는 다양한 숙주 세포를 사용하여 재조합 단백질을 제조하는 배양 조건이 알려져 있다. 예를 들어 일부 구체예에서는 숙주 세포가 95℃에 5% CO2 분위기에서 배양 배지에 단백질을 발현하기에 충분한 기간 동안 유지될 수 있다.
[00380] 단백질이 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 재조합 기술을 사용하여 발현되는 경우, 고순도이거나 실질적으로 균질한 제제를 얻기 위해, 숙주 세포 인자와 같은 다른 구성요소로부터 원하는 단백질을 분리(또는 정제)하는 것이 이롭다. 정제는 원심분리법, 추출법, 크로마토그래피 및 분할 기술(예를 들어, 겔 여과에 의한 크기 분리, 이온-교환 컬럼에 의한 전하 분리, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 실리카 및 DEAE 등과 같은 양이온-교환 수지상 크로마토그라피, 크로마토포커싱, 및 오염물질 제거를 위한 단백질 A 세파로오스 크로마토그라피), 및 침전 기술(예를 들어, 에탄올 침전 또는 황산 암모늄 침전)과 같은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 수많은 생화학적 정제 기술이 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질의 순도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서 본 발명의 폴리펩티드 및 결합 단백질 동종-다합체(homo-multimeric) 형태(예를 들어 2 이상의 본 발명의 폴리펩티드 또는 결합 단백질을 포함하는 분자 복합체)로 선택적으로 정제될 수 있다.
[00381] 본 명세서의 구체예에서는 본 명세서에 기술된 CD38 결합 단백질을 만드는 방법이 제공되고, 상기 방법은 CD38 결합 단백질이 발현되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하고, 그리고 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 방법은 단백질 L로 CD38 결합 단백질을 접촉하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 단백질 L은 펩토스트렙토코커스 마그누스(Peptostreptococcus magnus) 단백질 L이다. 일부 구체예에서 단백질 L은 재조합으로 제조된다. 일부 구체예에서 단백질 L 단편 또는 변종이 사용될 수 있고, 상기 단편 또는 변종은 단백질 L과 카파 경쇄 가변 도메인(예: 인간 VκI, VκIII 및 VκIV 아형)의 결합을 유지시킨다. 일부 구체예에서 단백질 L은 수지에 접합된다. 일부 구체예에서 단백질 L은 매트릭스이다. 항체 단편의 단백질 L 정제의 예시는 Royce, BioProcess International 2015; 13:6에 기술되어 있다.
[00382] 하기의 실시예에는 본 발명의 모범적인, 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 CD38 결합 단백질을 생산하는 방법의 비제한적 예시의 설명뿐만 아니라, 생산 방법의 구체적이지만 비제한적인 측면을 기술한다.
[00383] CD38 결합 융합단백질을 포함하는 약학적 및/또는 진단 조성물의 생산 또는 제조
[00384] 본 명세서에는 본 발명의 CD38 결합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서는 CD38 결합 단백질이 이합체(dimer)(예: 동종이합체(homodimer))의 형태일 수 있다. 일부 구체에에서 CD38 결합 단백질은 CD38 결합 단백질 집단의 구성원이고, 상기 CD38 결합 단백질 집단의 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 약 60%, 최소 약 70%, 최소 약 75%, 최소 약 80%, 최소 약 85%, 최소 약 90%, 최소 약 95%, 최소 약 96%, 최소 약 97%, 최소 약 98%, 최소 약 99%, 또는 100%는 동종이합체의 형태이다. 일부 구체예에서는 CD38 결합 단백질 집단의 최소 약 90%가 동종이합체의 형태이다. 일부 구체예에서는 CD38 결합 단백질 집단의 최소 약 95%가 동종이합체의 형태이다.
[00385] 일부 구체예에서 CD38 결합 단백질은 이합체(예: 동종이합체)의 형태이다. 일부 구체예에서 상기 CD38 결합 단백질은 CD38 결합 단백질 집단의 구성원이고, 상기 집단은 단량체 및 이합체보다 고차의 다합체(예: 삼합체, 사합체 등)를 실질적으로 갖고 있지 않다. 일부 구체예에서 단량체 및 이합체보다 고차의 다합체(예: 삼합체, 사합체 등)를 "실질적으로 갖고 있지 않은(substantially free of)" 집단은 약 2:1 내지 약 9:1 이하의 이합체 대 단량체 또는 이합체 대 다합체 비율을 갖는다. 일부 구체예에서는 상기 비율이 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 약 7:1, 약 8:1, 또는 약 9:1이다.
[00386] 본 발명의 어느 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 CD38 결합 단백질의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 용매 화합물은 본 발명의 범위 내에 있다.
[00387] 본 발명의 맥락에서 용어 "용매 화합물"은 용질(이 경우에 있어, 본 발명에 따라 단백질성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염) 및 용매 사이에서 형성된 정의된 화학량론의 복합체를 의미한다. 당해 용매가 물일 때, 이러한 용매 화합물은 일반적으로 수화물(hydrate)로 지칭된다.
[00388] 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질, 또는 그의 염은 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 운반체 내에 치료적으로 유효량의 본 발명의 분자 또는 그의 염을 포함하는, 보관 또는 투여를 위해 제조된 약학적 조성물로서 만들어질 수 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 운반체"는 어느 표준 약학적 운반체라도 포함한다. 치료 분자로 사용하기 위한 약학적으로 허용 가능한 운반체는 약학 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.(A. Gennaro, ed., 1985))에 기술되어 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 운반체"는 어느 그리고 모든 생리학적으로 허용가능한, 즉 호환성, 용매, 분산매, 코팅, 항미생물제, 등장성, 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
VIII. 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 및 숙주 세포
[00389] 본 발명의 폴리펩티드 및 결합 단백질 외에도, 본 발명의 폴리펩티드 구성요소 및 결합 단백질, 또는 그의 기능적 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 "핵산"이라는 용어와 동일하며, 각각은 하나 이상의 데옥시리보핵산(DNA)의 중합체, 리보핵산(RNA)의 중합체, 뉴클레오티드 유사체(analogs)를 사용하여 생성된 이들 DNA 또는 RNA의 유사체, 및 이들의 유도체, 단편 및 상동체를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단일, 이중, 또는 삼중 가닥일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, RNA 코돈의 제3 위치에서 허용되는 것으로 알려진 워블(wobble)을 고려하면서, 상이한 RNA 코돈과 동일한 아미노산을 인코딩하는, 예시적인 단백질을 인코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 구체적으로 개시되어 있다(Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000) 참조).
[00390] 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 결합 단백질의 아미노산 서열 중 하나를 포함하는 폴리펩티드와 최소 50%, 최소 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 99% 또는 그 이상 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 엄격한 조건하에서 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질, 또는 그의 단편 또는 유도체, 또는 어느 그러한 서열의 안티센스(antisense) 또는 보체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또한 포함한다.
[00391] 본 발명의 분자의 유도체 또는 유사체(예: CD38 결합 단백질)는 예를 들어 동일한 크기의 폴리뉴클레오티드(또는 폴리펩티드) 서열에 대해 최소 약 45%, 약 50%, 약 70%, 약 80%, 약 95%, 약 98%, 또는 심지어 약 99%의 동일성(예: 80-99%의 동일성)을 갖는, 또는 당업계에 공지된 컴퓨터 상동 프로그램에 의해 수행되는 정렬된 서열과 비교할 때, 그 중에서도 폴리뉴클레오티드(또는 본 발명의 결합 단백질)에 대해 실질적으로 상동인 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드(또는 폴리펩티드) 분자를 포함한다. 모범적인 프로그램은 Smith T, Waterman M, Adv Appl Math 2:482-9 (1981)의 알고리즘을 사용하는 기본 설정을 사용하는 GAP 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, U.S.)이다. 엄격한 조건, 그리고 하기에서 본 발명의 결합 단백질을 인코딩하는 서열의 보체에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 또한 포함된다(예를 들어, Ausubel F et al., Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993) 참조). 엄격한 조건은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있고, 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, NY, U.S., Ch.Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989))에서 찾을 수 있다.
[00392] 본 발명은 본 발명의 범위 내에 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 더 제공한다. 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터를 생산하기 위해 당업계에 잘 알려진 물질 및 방법을 사용하여, 박테리아 플라스미드, 바이러스 벡터 및 파지 벡터를 포함하는 공지된 벡터에 삽입될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 어느 선택된 것의 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템(예: pTxb1 및 pIVEX2.3) 내에서 본 발명의 의도된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질의 생산을 지원하는 데에 필요한 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 특정한 유형의 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템과 함께 사용하기 위한 발현 벡터를 포함하는 특정한 폴리뉴클레오티드는 당업계의 통상적인 기술자에게 잘 알려져 있고, 통상적인 실험을 사용하여 결정될 수 있거나, 그리고/또는 구매될 수 있다.
[00393] 본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 유닛을 포함하는 선형 또는 원형 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "발현 유닛"이란 용어는 관심 폴리펩티드를 인코딩하고 그리고 숙주 세포에서 핵산 세그먼트(segment)의 발현을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 의미한다. 발현 벡터는 하나 이상의 발현 유닛을 함유한다. 따라서 본 발명의 맥락에서 단일 폴리펩티드 사슬을 포함하는 본 발명의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터는 단일 폴리펩티드 사슬에 대한 적어도 하나의 발현 유닛을 포함하는 반면, 예를 들어 2 이상의 폴리펩티드 사슬(예: VL 도메인을 포함하는 하나의 사슬 및 독소 이펙터 폴리펩티드에 연결된 VH 도메인을 포함하는 제2 사슬)을 포함하는 단백질은 상기 단백질의 2개의 폴리펩티드 사슬 각각에 하나씩, 적어도 2개의 발현 유닛을 포함한다. 본 발명의 다중 사슬 결합 단백질의 발현을 위해, 각 폴리펩티드 사슬에 대한 발현 유닛은 상이한 발현 벡터 상에도 개별적으로 함유될 수 있다(예: 각각의 폴리펩티드 사슬에 대한 발현 벡터가 도입된 단일 숙주 세포로 발현될 수 있다).
[00394] 폴리펩티드 및 단백질의 일시적 또는 안정적인 발현을 지시(directing)할 수 있는 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터는 일반적으로 이종 신호 서열 또는 펩티드, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 촉진자, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지는 않고, 이들 각각은 당업계에 공지되어 있다. 사용될 수 있는 선택적 조절 제어 서열, 통합 서열, 및 유용한 마커는 당업계에 공지되어 있다.
[00395] 용어 "숙주 세포"는 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지원할 수 있는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 E.coli와 같은 원핵 세포 또는 진핵 세포(예: 효모, 곤충, 양서류, 조류 또는 포유류 세포)일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 결합 단백질을 제조할 수 있는 숙주 세포주의 생성 및 분리는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
[00396] 본 발명의 범위 내의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및/또는 단백질은 숙주 세포의 더 나은 최적 발현과 같은 바람직한 특성을 달성하는데 보다 적합하게 할 수 있는, 하나 이상의 아미노산 변경 또는 하나 이상의 아미노산 결실 또는 삽입에 의해 결합 단백질의 폴리펩티드 및/또는 단백질성 구성요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변형하는 것으로 생산된, 본 명세서에 기술된 폴리펩티드 및 분자의 변종 또는 유도체일 수 있다.
IX. 고체 기질 상에 고정된 분자
[00397] 본 발명의 일부 구체예는 고체 기질 상에 고정된 본 발명의 분자(예: 본 발명의 결합 단백질, 융합단백질, 또는 폴리뉴클레오티드), 또는 그의 어느 이펙터 단편이라도 포함한다. 본 명세서에 개시된 고체 기질은 마이크로비드, 나노입자, 중합체, 매트릭스 물질, 마이크로어레이, 마이크로타이터 플레이트, 또는 당업계에 공지된 어느 고체 표면(예: US 7,771,955 참조)이라도 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 구체예에 따라, 본 발명의 분자는 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여, 예를 들어 비드, 입자, 또는 플레이트와 같은 고체 기질에 공유결합 또는 비공유결합될 수 있다(예: Jung Y et al., Analyst 133: 697-701 (2008) 참조). 본 발명의 고정된 분자는 당업계에 공지된 기술을 사용하는 스크리닝에 사용될 수 있다(예: Bradbury A et al., Nat Biotechnol 29: 245-54 (2011); Sutton C, Br J Pharmacol 166: 457-75 (2012); Diamante L et al., Protein Eng Des Sel 26: 713-24(2013); Houlihan G et al., J Immunol Methods 405: 47-56 (2014) 참조).
[00398] 본 발명의 CD38 결합 융합단백질이 고정될 수 있는 고체 기질의 비-제한적인 예시는 다음을 포함한다: 마이크로비드, 나노입자, 중합체, 나노중합체, 나노튜브, 자성비드, 상자성비드, 초상자성비드, 스트렙타비딘으로 코팅된 비드, 역상(reverse-phase) 자성 비드, 카르복시 말단 비드, 하이드라진 말단 비드, 실리카(나트륨 실리카) 비드 및 이미노디아세트산(IDA)-변형 비드, 알데하이드-변형 비드, 에폭시-활성화된 비드, 디아미노디프로필아민(DADPA)-변형 비드(1차 아민 표면 그룹을 갖는 비드), 생분해성 중합체 비드, 폴리스티렌 기질, 아미노-폴리스티렌 입자, 카르복시-폴리스티렌 입자, 에폭시-폴리스티렌 입자, 다이메틸아미노-폴리스티렌 입자, 하이드록시-폴리스티렌 입자, 착색 입자, 유동세포 분석 입자, 설포네이트-폴리스티렌 입자, 니트로셀룰로오스 표면, 강화된 니트로셀룰로오스 막(membrane), 나일론 막, 유리 표면, 활성화된 유리 표면, 활성화된 석영 표면, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 막, 폴리아크릴아마이드-기반 기질, 폴리-비닐 클로라이드 기질, 폴리-메틸 메타크릴레이트 기질, 폴리(디메틸 실록세인) 기질, 및 공유 결합을 형성할 수 있는 광반응성 종(예를 들어, 나이트렌, 카르빈, 및 케틸 라디칼과 같은)을 포함하는 광중합체. 본 발명의 CD38 결합 융합단백질이 고정될 수 있는 고체 기질의 다른 예시는, 예를 들어 세포 표면, 파지, 및 바이러스 입자와 같은 분자 표시 시스템에 일반적으로 사용되는 것이다.
X. 전달 장치 및 키트
[00399] 일부 구체예에서 본 발명은 이를 필요로 하는 대상에게 전달하기 위한, 본 발명의 하나 이상의 물질의 조성물, 예를 들어 약학적 조성물 또는 진단 조성물을 포함하는 장치에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 하나 이상의 조성물을 포함하는 전달 장치는 정맥 내, 피하, 근육 내 또는 복강 내 주입, 또는 당업계의 숙련자가 인정하는 다른 적합한 수단을 포함하는 다양한 전달 방법으로 본 발명의 물질의 조성물을 환자에게 투여하는 데에 사용될 수 있다.
[00400] 또한 본 발명의 범위 내에는 적어도 하나의 본 발명의 물질의 조성물을 포함하는 키트, 그리고 선택적으로 포장 및 사용을 위한 사용설명서가 있다. 키트는 약물 투여 및/또는 진단 정보 수집에 유용할 수 있다. 본 발명의 키트는 선택적으로 적어도 하나의 추가 시약(예: 표준(standards), 마커 등)을 포함할 수 있다. 키트는 일반적으로 키트의 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 키트는 샘플 또는 대상으로부터 세포 유형(예: 종양 세포)을 검출하거나, 또는 대상이 본 발명의 화합물, 조성물, 또는 본 명세서에서 기술된 방법과 같이 본 발명의 관련 방법을 사용하는 치료 전략에 반응하는 군에 속하는지 여부를 진단하기 위한 시약 및 기타 도구를 더 포함할 수 있다.
XI. CD38 결합 단백질 및/또는 그의 약학적 및/또는 진단 조성물을 사용하는 방법
[00401] 개략적으로 본 발명의 목적은 예를 들어 다발성 골수종과 같은 특정 조혈성 암(hematopoietic cancers)과 같이 CD38 과발현과 연관된 질병 또는 질환, 그리고 CD38 양성 세포에서의 성장 제어 상실과 연관된 다른 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는 약리학적 활성제뿐만 아니라, 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 CD38 발현 세포의 표적 사멸, 그러한 CD38 표적 세포 내로의 추가적인 외인성 물질 전달, 표적 세포의 내부 표지, 진단 정보 수집을 위해 본 발명의 폴리펩티드, CD38 결합 단백질, 및 약학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
[00402] 특히, 본 발명의 목적은 당업계에 현재 공지된 제제, 조성물, 및/또는 방법과 비교하여 특정 이점을 갖는 약리학적 활성제, 조성물, 및/또는 방법을 제공하는 것이다. 그에 따라 본 발명은 특정된 단백질 서열을 갖는 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 결합 단백질 그리고 그의 약학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어 본 명세서에 기술된 어느 아미노산 서열이라도 하기의 방법 또는, 예를 들어 WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, US20150259428, WO 2016/196344, WO 2017/019623, WO 2018/106895, 및 WO 2018/140427에 기술된 다양한 방법과 같이 숙련자에게 알려진 결합 단백질을 사용하기 위한 어느 방법에서라도 구체적으로 결합 단백질의 구성요소로서 사용될 수 있다.
[00403] 본 발명은 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 세포 또는 집단에 세포독성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함하는 CD38 결합 단백질, 또는 본 발명의 CD38 세포 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 CD38 양성 세포 또는 CD38 양성 세포 집단의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 세포에 세포독성 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함하는 CD38 결합 단백질, 또는 본 발명의 CD38 세포 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 CD38 양성 세포 사멸 방법 또한 제공한다. 본 발명의 시가 CD38 결합 단백질 및 약학적 조성물은 한 세포 또는 세포들에 청구된 물질의 조성물 중 하나를 접촉시키는 것으로 CD38 발현 세포 유형을 사멸시키는 데에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서 본 발명의 CD38 결합 단백질 또는 약학적 조성물은 상이한 세포 유형의 혼합물에서 CD38 과발현 세포 유형을 사멸시키는 데에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서 본 발명의 CD38 결합 단백질, 또는 약학적 조성물은 상이한 세포 유형의 혼합물에서 골수종 세포와 같은 CD38 양성 조혈성 암세포를 사멸시키는 데에 사용될 수 있다. 당업계의 숙련자는 당업계에 잘 알려진 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 CD38 결합 단백질의 치료 농도 또는 투여량을 결정할 수 있다.
[00404] 일부 구체예에서 본 발명의 특정 CD38 결합 단백질 및 약학적 조성물은 시험관내, 생체외 또는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 피험자와 같은 대상의 생체내에서 세포 집단에 투여되었을 때 강한 세포 사멸 활성을 보일 수 있다. 특정한 CD38 발현 세포 유형에 대해 고친화력 결합 영역을 사용하는 효소 활성 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드의 전달을 표적하는 것으로 세포 사멸 활성은 유기체 내에서 그러한 CD38 발현 세포를 특이적으로 그리고 선택적으로 사멸하는 것으로 제한될 수 있다.
[00405] 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 CD38 양성 혈액암 세포를 사멸시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 대상에게 적어도 하나의 본 발명의 CD38 결합 단백질 또는 그의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 대상은 항CD38 항체(예: 다라투무맙)와 같은 CD38 기반 치료를 받은 적이 없다. 일부 구체예에서 상기 대상은 면역 생성 능력이 있다. 일부 구체예에서 상기 대상은 면역 시스템이 손상되었다. 일부 구체예에서 상기 대상은 자가혈액 줄기세포 이식을 받은 적이 없다.
[00406] 일부 구체예에서 상기 대상은 CTM#4의 투여 이전에 항CD38 항체(예: 다라투무맙)와 같은 하나 이상의 CD38 기반 치료를 받은 적이 없다. 일부 구체예에서 상기 방법은 CTM#4에 추가적으로 항CD38 항체(예: 다라투무맙)와 같은 CD38 기반 치료를 투여하는 단계를 더 포함한다.
[00407] 일부 구체예에서 상기 대상은 다발성 골수종이 있고 그리고 CD38 결합 단백질이 대상에게 투여된 첫 치료이다. 일부 구체예에서 상기 대상은 다발성 골수종이 있고 그리고 CD38 결합 단백질이 다른 치료 이후에 또는 그와 동시에 투여된다.
[00408] 일부 구체예에서 본 발명의 CD38 결합 단백질 또는 그의 약학적 조성물은 암 세포와 물리적으로 결합된 것으로 발견되는 세포외 CD38을 표적하는 것으로 대상의 암세포를 사멸시키는 데에 사용될 수 있다. "암세포" 또는 "암성(cancerous) 세포"라는 용어는 비정상적으로 촉진 및/또는 제한되지 않은 방식으로 성장하고 분화하는 다양한 종양 세포를 의미하고 당업자에게는 명백한 의미일 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물로부터 이익을 얻을 수 있는 CD38 양성 조혈성 암(악성 또는 비악성)은 숙련자에게 명백할 것이다. 신생 세포는 제한되지 않은 성장, 분화 부족, 국소 조직 침범, 혈관형성 및 전이 중 하나 이상과 흔히 관련된다.
[00409] 대상으로부터 제거된 분리된 세포 집단으로부터, 예를 들어, T-세포 및/또는 B-세포와 같은 CD38 양성 혈구의 생체외 고갈(depletion)을 목적으로, 본 발명의 CD38 결합 단백질, 또는 그의 약학적 조성물을 이용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
[00410] 본 발명의 조성물의 "유효용량(effective dosage)"의 투여는 병증의 중증도 감소, 무병증 기간의 빈도 및 지속시간의 증가, 또는 질병에 의한 손상 또는 장애의 예방을 야기할 수 있다. 본 발명의 조성물의 유효량은 투여 경로, 치료되는 유기체의 유형, 그리고 고려 중의 특정한 대상의 신체 특징에 따라 결정되게 된다. 이러한 요인들 및 유효량을 결정하는 데에 있어 그들의 관계성은 의학 분야의 숙련자에게 잘 알려져있다. 유효량 및 투여 방법은 최대 효능을 달성하기 위해 맞춤으로 조정될 수 있고, 그리고 의학 분야의 체중, 식단, 동시에 투여되는 약(concurrent medication) 및 그 외 숙련자에게 잘 알려진 요인들과 같은 요인에 따라 결정될 수 있다. 사람을 대상으로 가장 적절한 투여량 및 투여 요법(dosing regimen)은 본 발명으로 얻은 결과에 의해 유도된(guided) 것일 수 있고, 그리고 제대로 설계된 임상 시험으로 확인될 수 있다. 유효량 및 치료 프로토콜은 실험 동물에서 낮은 투여량으로 시작하여 효과를 모니터하면서 투여량을 늘리고, 그리고 그에 더하여 투여 요법에 체계적으로 변화를 주는 통상적인 수단으로 결정될 수 있다. 주어진 대상을 위한 최적의 투여량을 결정할 때 임상의는 많은 요인들을 고려할 수 있다. 투여량은 특정한 대상을 위한 치료상의 이득을 최대화시키는 데에 필요한 만큼 숙련된 의료진에 의해 선택되고 그리고 재조정될 수 있다.
[00411] 일부 구체예에서 본 발명은 혈액암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 CD38 결합 단백질 또는 그를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 본 발명은 혈액암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 CD38 결합 단백질 또는 그를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 혈액암은, 예를 들어 다발성 골수종, 비호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종(BL), B-세포 만성 림프성 백혈병(B-CLL), B 및 T 급성 림프구성 백혈병(ALL), T-세포 림프종(TCL), 급성 골수성 백혈병(AML), 털세포 백혈병(HCL), 호지킨 림프종(HL), 만성 골수성 백혈병(CML)일 수 있다. 일부 구체예에서 혈액암은 다발성 골수종이다. 일부 구체예에서 골수종은 재발 또는 불응성이다.
[00412] 일부 구체예에서 본 발명은 다발성 골수종과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 CD38 결합 단백질 또는 그를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 본 발명은 다발성 골수종과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 CD38 결합 단백질 또는 그를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
[00413] 일부 구체예에서 본 발명은 흑색종을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 CD38 결합 단백질 또는 그를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 본 발명은 흑색종을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 CD38 결합 단백질 또는 그를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
[00414] 일부 구체예에서 본 발명의 방법은 대상에게 자가혈액 줄기세포를 이식하는 단계를 포함하지 않는다.
[00415] 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 알려진 다양한 방법 중 하나 이상을 사용하여 하나 이상의 적합한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 숙련자라면 인정할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 허용 가능한 투여 경로는 일반적으로 의도된 작용 부위에 또는 그와 상호작용(communication)하는 주사와 연관된 비경구 투여와 같이, 의도된 치료 또는 진단 용도와 함께 임상의가 고려할 수 있는 당업계에 알려진 어느 투여 경로라도 의미할 수 있다.
[00416] 본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 동일한 대상에게 여러 번 투여된다. 1회분 투여량 사이의 간격은 다를 수 있고 그리고 조절하는 혈액 수준(regulating blood levels) 또는 대상에서의 다른 마커에 따라 규칙적인 또는 불규칙한 주기일 수 있다.
[00417] 일부 구체예에서 본 발명은 인간 피험자와 같은 포유류의 대상에서의 CD38 과발현과 연관된 혈액세포암을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 세포독성 CD38 결합 단백질 또는 본 발명의 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 혈액세포암은 다발성 골수종(MM)이다.
H. CD38 결합 융합단백질의 제제화(formulations)
[00418] 본 발명은 암, 및/또는 하기에 더 상세하게 기술되는 CD38 과발현과 연관된 질환, 질병, 또는 증상(예: 다발성 골수종과 같은 CD38 양성 세포의 조혈성 암을 포함하는 혈액암)의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물의 용도를 위한 CD38 결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 본 발명에 따른 본 발명의 CD38 결합 단백질, 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 용매 화합물과 함께 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 운반체, 부형제, 또는 매개체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서 본 발명의 약학적 조성물은 동종이합체 형태의 본 발명의 결합 단백질을 포함할 수 있다. 그러한 질병, 질환, 장애, 또는 증상 각각은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 용도에 관한 별개의 구체예로 계획되었다. 본 발명은 하기에 더 상세하게 기술되는 적어도 하나의 본 발명에 따른 치료 방법에서의 용도를 위한 약학적 조성물 또한 제공한다.
[00419] 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "대상(subject)"은 유기체, 보통 인간 및 동물과 같은 포유류 대상을 의미한다. 용어 "대상" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 일부 구체예에서 상기 대상은 영장류(예: 인간 또는 비인간 영장류), 가축 동물(예: 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 반려 동물(예: 고양이, 개 등) 및 실험 동물(예: 생쥐, 토끼, 쥐 등)과 같은 포유동물일 수 있다. 일부 구체예에서 상기 대상은 CD38 세포 과발현과 연관된 적어도 하나의 질환의 증상, 징후, 및/또는 징조를 보일 수 있다.
[00420] 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료" 및 이의 문법 변형은 당업계의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일부 구체예에서 이 용어들은 유익하거나 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 접근법을 의미할 수도 있다. 상기의 용어들은 질환, 장애 또는 질병의 발병 또는 진행 속도를 늦추거나, 그와 관련된 증상을 감소시키거나 완화시키는 것, 상기 질환의 완전한 또는 부분적 퇴행을 발생시키는 것, 또는 이들의 어느 조합이라도 의미할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 유익한 또는 바람직한 임상 결과는, 탐지가 가능하거나 탐지되지 않는 것에 관계없이, 증상의 감소 또는 완화, 질병 정도의 감소, 질병 상태의 안정화(예: 악화되고 있지 않음), 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 향상 또는 일시적 완화, 및 완화(remission)(일부 또는 완전한)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예상 생존 시간에 비해 생존을 연장시키는 것 또한 의미할 수 있다. 따라서 치료를 필요로 하는 대상(예: 인간)은 이미 문제의 질병 또는 장애를 앓고 있는 대상일 수 있다. 용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 치료의 부재에 비해 병리학적 상태 또는 증상의 중증도를 억제하거나 감소하는 것을 포함하며, 반드시 관련 질병, 장애, 또는 질환의 완전한 중단을 암시하는 의미는 아니다.
[00421] 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "예방하다", "예방하는", "예방" 및 이들의 문법 변형은 질환 또는 질병의 발병을 예방하거나, 또는 병리학적으로 변형시키기 위한 접근법을 의미한다. 그에 따라 "예방"은 예방 또는 예방을 위한 조치를 의미할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 유용한 또는 바람직한 임상 결과는, 탐지가 가능하거나 탐지되지 않는 것에 관계없이, 증상의 예방 또는 감속, 질병의 진행 또는 발달을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 따라서 예방이 필요한 대상(예: 인간)은 문제의 질병 또는 장애를 아직 앓고 있지 않은 대상일 수 있다. 용어 "예방"은 치료의 부재에 비해 질병의 발병을 늦추는 것을 포함하고, 반드시 관련 질병, 장애 또는 질환의 영구적인 예방을 암시하는 의미는 아니다. 따라서 어떤 상황에서 "예방하는" 또는 "예방"은 질환을 발생시키는 위험을 줄이거나, 또는 질환과 관련된 증상의 발생을 예방하거나 지연시키는 것을 의미할 수 있다.
[00422] 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "유효량(effective amount)"은 본 명세서에 개시된 질병, 장애, 또는 질환을 치료 및/또는 예방하는 데에 유효한 양이다. 일부 구체예에서 유효량은 표적 질환을 예방 또는 치료하거나 또는 상기 질환과 연관된 증상을 이롭게 완화시키는 것과 같이, 대상에서 적어도 하나의 원하는 치료 효과를 생성하는 조성물(예: 치료 조성물, 화합물, 또는 약제)의 양 또는 용량이다. 가장 바람직한 치료적 유효량은 이를 필요로 하는 주어진 대상에 대해 당업계의 숙련자에 의해 선택된 특정한 치료의 원하는 효능을 생성하는 양이다. 이 양은 치료 조성물의 특성(활성, 약동학, 약력학, 및 생체이용률을 포함), 대상의 생리학적 상태(연령, 성별, 질병 유형, 질병 단계, 전반적인 건강 상태, 주어진 투여량에 대한 반응성, 및 약물의 유형을 포함), 제제 내의 약학적으로 허용가능한 운반체 또는 운반체들의 성질, 및 투여 경로를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 숙련자가 이해하는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 임상 및 약리학 분야의 숙련자는 통상적인 실험을 통해, 즉 조성물의 투여에 대한 환자의 반응을 모니터하고 그리고 그에 따라 투여량을 조절하는 것으로 유효량을 결정할 수 있을 것이다(예: Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro A, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995) 참조).
[00423] 일부 구체예에서 본 명세서에 기술된 CD38 결합 단백질은 정맥내 주입을 위한 것이다. 일부 구체예에서 CD38 결합 단백질은 극저온 보호제(cryogenic protectant) 및 계면활성제를 함유하는 수성 완충액으로서 제제화된다(formulated). 일부 구체예에서 본 명세서에 기술된 CD38 결합 단백질은 극저온 보호제로서 수크로스 및 계면활성제로서 폴리소르베이트 80을 함유하고 그리고 4.8-5.2의 범위의 pH를 갖는 수성 구연산 나트륨으로 제제화된다. 일부 구체예에서 CD38 결합 단백질은 약 1mM 및 약 100mM 사이의 구연산 나트륨을 포함하는 용액으로 제제화된다. 일부 구체예에서 CD38 결합 단백질은 약 1mM 및 약 300mM 사이의 수크로스를 포함하는 용액으로 제제화된다. 일부 구체예에서 CD38 결합 단백질은 약 0.01% 및 약 0.15% 사이의 폴리소르베이트 80을 포함하는 용액으로 제제화된다. 일부 구체예에서 상기 수성 용액은 약 4.3 내지 약 5.5의 범위의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서 상기 조성물은 약 20mM 구연산 나트륨, 약 200mM 수크로스, 및 약 0.02% 폴리소르베이트 80의 수성 용액을 포함하고, 상기 수성 용액은 약 4.8 내지 약 5의 범위의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서 본 명세서에 기술된 CD38 결합 단백질은 200mM 수크로스 및 0.02%(volume/volume) 폴리소르베이트 80과 함께 20mM 구연산 나트륨 완충제, pH 5.0로 제제화된다. 예시적인 제제가 하기 리스트에 기재되어 있다.
Figure pct00001
[00424] 본 발명의 약학적 조성물의 제제는 편리하게 단위 투여 형태(unit dosage form)로 만들어질 수 있고 그리고 약학 분야에 잘 알려진 어느 방법으로도 조제될 수 있다. 그러한 제형에서 상기 조성물은 적절한 양의 유효성분을 함유하는 단위 투여량으로 분할된다. 조성물은 투여의 어느 적합한 경로 및 수단을 위해서 제제화될 수 있다.
[00424] 본 발명의 약학적 조성물의 제제는 편리하게 단위 투여 형태(unit dosage form)로 만들어질 수 있고 그리고 약학 분야에 잘 알려진 어느 방법으로도 조제될 수 있다. 그러한 제형에서 상기 조성물은 적절한 양의 유효성분을 함유하는 단위 투여량으로 분할된다. 조성물은 투여의 어느 적합한 경로 및 수단을 위해서 제제화될 수 있다.
[00425] 일부 구체예에서 약학적 조성물은 (A) 세포독성 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및 (B) 인간 CD38의 세포외 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 영역을 포함하는 (i) CD38 결합 단백질 및 (ii) 약학적으로 허용 가능한 운반체, 부형제 또는 완충제를 포함하고, 상기 결합 영역은 (a) SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 및 (b) SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.
[00426] 본 발명의 진단 조성물은 본 발명의 CD38 결합 단백질 및 하나 이상의 검출 촉진제를 포함한다. 본 발명의 진단 조성물을 제조 또는 생산할 때, 본 발명의 결합 단백질은 하나 이상의 검출 촉진제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 다양한 검출 촉진제를 단백질 또는 분자의 단백질성 구성요소, 특히 면역글로불린 및 면역글로불린 유래 도메인에 편입(incorporating), 부착(affixing), 및/또는 접합시키기 위한 수많은 표준 기술이 숙련자에 알려져 있다.
[00427] 동위원소, 염료, 비색제, 조영 강화제, 형광제, 생물발광제, 및 자성 제제와 같이 숙련자에게 알려진 다수의 검출 촉진제가 있으며, 이들은 유기체의 질병 또는 질환에 대한 진단 및/또는 예후 적용 용도와 같은 정보 수집 방법을 위해 본 발명의 폴리펩티드 또는 결합 단백질에 작동가능하게 연결될 수 있다(예: Cai W et al., J Nucl Med 48: 304-10 (2007); Nayak T, Brechbiel M, Bioconjug Chem 20: 825-41 (2009), Paudyal P et al., Oncol Rep 22: 115-9 (2009); Qiao J et al., PLoS ONE 6: e18103 (2011); Sano K et al., Breast Cancer Res 14: R61 (2012) 참조). 제제의 편입은 선별(screen), 분석, 진단 절차, 및/또는 영상화 기술에서 진단 조성물의 존재를 검출할 수 있게 하는 방법이다.
[00428] 유사하게, 의료 분야에서 통상적으로 사용되는 비침습적 생체내 영상화 기술, 예를 들어 컴퓨터 단층촬영 영상(CT 스캔), 광학 영상화(직접적, 형광, 및 생물발광 영상화 포함), 자기 공명 영상(MRI), 양전자 방출 단층촬영(PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), 초음파, 및 X-선 컴퓨터 단층촬영 영상화와 같이, 숙련자에게 알려진 수많은 영상화 접근법이 있다.
1. CTM#4의 투여(dosing)
[00429] 일부 구체예에서 유효량은 제1 유효량이고 그리고 본 발명의 방법은 대상에게 제2 유효량을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서 제2 유효량은 후속 투여량(subsequent dose)이다. 일부 구체예에서 CTM#4의 초회 투여량(starting dose)은 약 831μg/kg 체중(body weight)이다. 일부 구체예에서 초회 투여량은 약 831μg/kg 체중이고, 그리고 후속 투여량은 약 1039μg/kg 체중이다. 일부 구체예에서 초회 투여량은 약 1039μg/kg 체중이고, 그리고 후속 투여량은 약 1299μg/kg 체중이다. 일부 구체예에서 초회 투여량은 약 1299μg/kg 체중이고, 그리고 후속 투여량은 약 1624μg/kg 체중이다.
[00430] 일부 구체예에서는 50μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 융합단백질이 대상에게 주 1회 투여된다. 예를 들어 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 1, 2, 3, 4주 간 또는 그 이상 투여될 수 있다. 일부 구체예에서는 CD38 분자가 1, 8, 15, 및/또는 22일에 대상에게 투여된다.
[00431] 일부 구체예에서는 100μg/kg의 CTM#4 CD38 표적 분자가 대상에게 주 1회 투여된다. 예를 들어 CD38 결합 단백질이 대상에게 1, 2, 3, 4주 간 또는 그 이상 투여될 수 있다. 일부 구체예에서는 CD38 분자가 1, 8, 15, 및/또는 22일에 대상에게 투여된다.
[00432] 일부 구체예에서는 200μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 주 1회 투여된다. 예를 들어 CD38 결합 단백질이 대상에게 1, 2, 3, 4주 간 또는 그 이상 투여될 수 있다. 일부 구체예에서는 CD38 분자가 1, 8, 15, 및/또는 22일에 대상에게 투여된다.
[00433] 일부 구체예에서는 335μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 주 1회 투여된다. 예를 들어 CD38 결합 단백질이 대상에게 1, 2, 3, 4주 간 또는 그 이상 투여될 수 있다. 일부 구체예에서는 CD38 분자가 1, 8, 15, 및/또는 22일에 대상에게 투여된다.
[00434] 일부 구체예에서는 500μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 주 1회 투여된다. 예를 들어 CD38 결합 단백질이 대상에게 1, 2, 3, 4주 간 또는 그 이상 투여될 수 있다. 일부 구체예에서는 CD38 분자가 1, 8, 15, 및/또는 22일에 대상에게 투여된다.
[00435] 일부 구체예에서는 550μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 주 1회 투여된다. 예를 들어 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 1, 2, 3, 4주 간 또는 그 이상 투여될 수 있다. 일부 구체예에서는 CD38 분자가 1, 8, 15, 및/또는 22일에 대상에게 투여된다.
[00436] 일부 구체예에서는 665μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 주 1회 투여된다. 예를 들어 CD38 결합 단백질이 대상에게 1, 2, 3, 4주 간 또는 그 이상 투여될 수 있다. 일부 구체예에서는 CD38 분자가 1, 8, 15, 및/또는 22일에 대상에게 투여된다.
[00437] 일부 구체예에서는 50μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 격주로 투여된다. 일부 구체예에서는 CTM#4 CD38 분자가 1 및 15일에 대상에게 투여된다.
[00438] 일부 구체예에서는 100μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 격주로 투여된다. 일부 구체예에서는 CD38 분자가 1 및 15일에 대상에게 투여된다.
[00439] 일부 구체예에서는 200μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 격주로 투여된다. 일부 구체예에서는 CTM#4 CD38 분자가 1 및 15일에 대상에게 투여된다.
[00440] 일부 구체예에서는 335μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 격주로 투여된다. 일부 구체예에서는 CTM#4 CD38 분자가 1 및 15일에 대상에게 투여된다.
[00441] 일부 구체예에서는 500μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 격주로 투여된다. 일부 구체예에서는 CTM#4 CD38 분자가 1 및 15일에 대상에게 투여된다.
[00442] 일부 구체예에서는 550μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 격주로 투여된다. 일부 구체예에서는 CTM#4 CD38 분자가 1 및 15일에 대상에게 투여된다.
[00443] 일부 구체예에서는 665μg/kg의 CTM#4 CD38 결합 단백질이 대상에게 격주로 투여된다. 일부 구체예에서는 CTM#4 CD38 분자가 1 및 15일에 대상에게 투여된다.
2. 다발성 골수종을 포함하는 혈액암 치료 방법
[00444] 일부 구체예에서 혈액암(예: 다발성 골수종)을 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 대상의 체중 기준으로 50μg/kg, 100μg/kg, 200μg/kg, 335μg/kg, 500μg/kg, 또는 665μg/kg의 양의 CTM#4 CD38 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
[00445] 일부 구체예에서 혈액암(예: 다발성 골수종)을 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 대상의 체중 기준으로 50μg/kg의 양의 CTM#4 CD38 결합 단백질을 1, 8, 15, 및 22일에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 8일은 1일의 일주일 후이고, 15일은 8일의 일주일 후이고, 그리고 22일은 15일의 일주일 후이다.
[00446] 일부 구체예에서 혈액암(예: 다발성 골수종)을 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 대상의 체중 기준으로 100μg/kg의 양의 CTM#4 CD38 결합 단백질을 1, 8, 15, 및 22일에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 8일은 1일의 일주일 후이고, 15일은 8일의 일주일 후이고, 그리고 22일은 15일의 일주일 후이다.
[00447] 일부 구체예에서 혈액암(예: 다발성 골수종)을 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 대상의 체중 기준으로 200μg/kg의 양의 CTM#4 CD38 결합 단백질을 1, 8, 15, 및 22일에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 8일은 1일의 일주일 후이고, 15일은 8일의 일주일 후이고, 그리고 22일은 15일의 일주일 후이다.
[00448] 일부 구체예에서 혈액암(예: 다발성 골수종)을 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 대상의 체중 기준으로 335μg/kg의 양의 CTM#4 CD38 결합 단백질을 1, 8, 15, 및 22일에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 8일은 1일의 일주일 후이고, 15일은 8일의 일주일 후이고, 그리고 22일은 15일의 일주일 후이다.
[00449] 일부 구체예에서 혈액암(예: 다발성 골수종)을 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 대상의 체중 기준으로 500μg/kg의 양의 CTM#4 CD38 결합 단백질을 1, 8, 15, 및 22일에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 8일은 1일의 일주일 후이고, 15일은 8일의 일주일 후이고, 그리고 22일은 15일의 일주일 후이다.
[00450] 일부 구체예에서 혈액암(예: 다발성 골수종)을 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 대상의 체중 기준으로 550μg/kg의 양의 CTM#4 CD38 결합 단백질을 1, 8, 15, 및 22일에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 8일은 1일의 일주일 후이고, 15일은 8일의 일주일 후이고, 그리고 22일은 15일의 일주일 후이다.
[00451] 일부 구체예에서 혈액암(예: 다발성 골수종)을 치료하는 방법은 그를 필요로 하는 대상에게 대상의 체중 기준으로 665μg/kg의 양의 CTM#4 CD38 결합 단백질을 1, 8, 15, 및 22일에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 8일은 1일의 일주일 후이고, 15일은 8일의 일주일 후이고, 그리고 22일은 15일의 일주일 후이다.
[00452] 일부 구체예에서 본 발명은 CTM#4 세포독성 CD38 결합 단백질 또는 본 명세서에 기술된 CTM#4 세포독성 CD38 결합 융합단백질을 투여하는 것으로 인간 피험자(일반적으로 MM 확진 받음)를 치료하는 CTM#4 방법을 제공한다.
[00453] 일부 구체예에서 상기 대상은 성인 환자(예: 18세 또는 그 이상)이다. 일부 구체예에서 상기 대상은 미성년 환자(예: 18세 이하)이다. 일부 구체예에서 상기 대상은 남성이다. 일부 구체예에서 상기 대상은 여성이다. 일부 구체예에서 상기 대상은 다발성 골수종을 확진 받았다.
[00454] 일부 구체예에서 상기 대상은 재발성 또는 불응성 다발성 골수종(RRMM)을 앓는다. 일부 구체예에서 RRMM 인간 피험자는 RRMM 환자에게 임상적 이점을 수여하기 위해 알려진 받을 수 있는(available) 치료법으로 치료를 실패했거나, 그에 대해 불내성이거나, 또는 그를 위한 후보가 아니다.
[00455] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 이전에 적어도 3차의 MM 치료를 받았고, 그리고 적어도 하나의 프로테아좀 억제제(PI) 기반 치료, 적어도 하나의 면역조절 약물(IMiD) 기반 치료, 그리고 선택적으로 적어도 하나의 스테로이드 기반 치료에 대해 불응성 또는 불내성이다. MM 치료의 이전 차수(prior lines)는 다라투무맙을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 항CD38 치료를 포함할 수 있다.
[00456] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 이전에 적어도 3차의 다라투무맙을 포함하는 MM 치료를 받았고, 그리고 다라투무맙, 적어도 하나의 프로테아좀 억제제(PI) 기반 치료, 적어도 하나의 면역조절 약물(IMiD) 기반 치료, 그리고 선택적으로 적어도 하나의 스테로이드 기반 치료에 대해 재발성 또는 불응성이다.
[00457] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 이전에 적어도 3차의 MM 치료를 받았고, 그리고 적어도 하나의 프로테아좀 억제제(PI) 기반 치료, 적어도 하나의 면역조절 약물(IMiD) 기반 치료, 그리고 선택적으로 적어도 하나의 스테로이드 기반 치료에 대해 불응성이다. MM 치료의 이전 차수는 어느 항CD38 치료도 포함하지 않는다.
[00458] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 2차 중 하나가 PI 기반 치료 및 IMiD 기반 치료의 조합을 포함할 경우에 이전에 적어도 2차의 MM 치료를 받았고, 그리고 상기 대상은 적어도 하나의 PI 기반 치료, 적어도 하나의 IMiD 기반 치료, 그리고 선택적으로 적어도 하나의 스테로이드 기반 치료에 대해 불응성이다. MM 치료의 하나 이상의 이전 차수는 다라투무맙을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 항CD38 치료를 포함할 수 있다.
[00459] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 이전에 적어도 2차의 MM 치료를 받았고, 상기 2차 치료 중 하나는 PI 기반 치료 및 IMiD 기반 치료의 조합을 포함하고, 다른 하나는 다라투무맙을 포함하고, 그리고 상기 대상은 적어도 하나의 PI 기반 치료, 적어도 하나의 IMiD 기반 치료, 그리고 선택적으로 적어도 하나의 스테로이드 기반 치료에 대해 재발성 또는 불응성이다.
[00460] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 2차 중 하나가 PI 기반 치료 및 IMiD 기반 치료의 조합을 포함할 경우에 이전에 적어도 2차의 MM 치료를 받았고, 그리고 상기 대상은 적어도 하나의 PI 기반 치료, 적어도 하나의 IMiD 기반 치료, 그리고 선택적으로 적어도 하나의 스테로이드 기반 치료에 대해 불응성이다. MM 치료의 이전 차수는 어느 항CD38 치료도 포함하지 않는다.
[00461] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 이전 차수의 다라투무맙을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 항CD38 치료를 받았고, 그리고 상기 대상은 본 명세서에 기술된 CTM#4 CD38 결합 단백질을 사용한 치료 중 언제든 항CD38 치료에 대해 재발성 또는 불응성이다.
[00462] 일부 구체예에서 상기 대상은 이전에 어느 차수의 MM 치료도 받지 않았다. 일부 구체예에서 상기 대상은 이전에 어느 항CD38 기반 치료도 받지 않았다.
[00463] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 혈청단백질 전기영동(SPEP)에서 M-단백질>=500mg/dL(>=5g/L)의 혈청 농도, 요단백 전기영동(UPEP)에서 M-단백질>=200mg/24h의 요농도, 및 혈청 유리경쇄(FLC) 비율이 비정상이라면 혈청 FLC 분석법에 의해 측정된 관련(involved) FLC 수준>=10mg/dL(>=100mg/L)을 포함하는 기준 중 적어도 하나를 갖는다.
[00464] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 0 또는 1의 동부 종양학 협력 그룹(Eastern Cooperative Oncology Group: ECOG) 활동도(performance status) 점수를 갖는다.
[00465] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 선별 심전도(screening electrocardiogram)상에서 프리데리시아(Fridericia) 방법으로 보정된 정상 QT 간격(QTcF)을 갖고, 이는 남성에서는 <=450 millisecond(ms) 또는 여성에서는 <=470ms의 QTcF로 정의된다.
[00466] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 다음을 포함하는 임상 검사 기준을 충족시키거나 또는 실질적으로 충족시킨다: 직접적 빌리루빈이 <2.0*정상범위의 상한치(upper limit of the normal range: ULN)이어야 하는 질베르 증후군을 가진 참가자의 경우를 제외하고, 총 빌리루빈<=1.5*ULN; 혈청 알라닌아미노전달효소(ALT) 및 아스파르테이트아미노전달효소(AST)<=2.5*ULN; 신장 질환 내 식이 변형(Modification of Diet in Renal Disease: MDRD) 공식을 사용한 추정 사구체 여과율(eGFR)>=30mL/min/1.73m^2); 절대호중구수(ANC)>=750/mm^3(>=1.0*10^9/L); 혈소판 수>=50,000/mm^3(>=75*10^9/L); 헤모글로빈>=7.5g/dL.
[00467] 일부 구체예에서 상기 RRMM 대상은 다음을 포함하는 질환을 하나 이상 갖지 않는다: (1) 다발신경병증, 장기 비대, 내분비병증, 단클론 감마병증 및 피부 결함(POEMS) 증후군, 의미불명 단클론 감마병증(monoclonal gammopathy of unknown significance), 무증상 골수종(smoldering myeloma), 고립성 형질세포종, 아밀로이드증, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 또는 면역글로불린 M(IgM) 골수종; (2) NCI CTCAE 등급>=3의 감각 또는 운동 신경병증; (3) 14일 이내의 PI 및 IMiD를 포함하는 골수종 특이 치료, 7일 이내의 골수종을 위한 코르티코스테로이드 치료, 14일 이내의 국소 골 병변(localized bone lesions)을 위한 방사선 치료, 대수술 30일 이내의, 자가혈액 줄기세포 이식 90일 이내를 포함하는 어느 치료/시술의 최종 투여; (4) 동종이형 줄기세포 이식 또는 장기 이식을 받은 적이 있음; (5) 탈모증을 제외한 이전의 골수종 치료 또는 시술(화학요법, 면역요법, 방사선 치료)에 대한 부작용으로부터 NCI CTCAE V5 등급<=1 또는 기준치로 회복이 안 됨; (6) MM의 중추 신경계(CNS) 관여의 임상 증상; (7) 어느 기관의 알려진 또는 의심되는 경쇄 아밀로이드증(아밀로이드증의 다른 징후 없이 골수 생검 상의 아밀로이드의 존재도 허용 가능); (8) 울혈성 심부전(뉴욕 심장 학회) 등급>=II 또는 좌심실 박출 계수(LVEF)<40%, 심근병증, 활성 허혈(active ischemia), 또는 지난 6개월 이내의 협심증 또는 심근경색증과 같은 어느 다른 비조절 심장 질환, 항응고제를 포함하는 치료를 필요로 하는 임상적으로 유의한 부정맥, 또는 임상적으로 유의한 비조절 고혈압; (9) 전신 요법(systemic therapy)을 필요로 하는 만성 또는 활성 감염에 더하여, 완전히 치유되지 않은 증상을 보이는 바이러스 감염(예를 들어 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 B형 또는 C형 바이러스 간염)의 병력; (10) 어느 단클론 항체 또는 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 치료의 주입 후 전신 염증 반응 증후군(SIRS)/사이토카인 방출 증후군(CRS) 반응의 병력; 및 (11) 프레드니손 또는 균등물의 >10mg/day의 투여량으로 전신 코르티코스테로이드의 사용을 필요로 하는 만성 질환. 일부 구체예에서 상기 대상은 유의한 흉막 또는 심낭 삼출의 병력이 없다. 일부 구체예에서 상기 대상은 카나마이신 또는 다른 아미노글리코사이드에 대한 과민성 또는 심각한 독성 반응의 병력이 없다.
[00468] 일부 구체예에서 본 명세서에 기술된 대상에게는 킬로그램 체중 당 1 내지 1500μg의 CD38 결합 단백질이 4, 5, 또는 6주와 같이, 3주 이상 연속으로 일주일에 1회 또는 2회 정맥내 주입된다. 예시적인 투여량은 킬로그램 체중 당 50, 100, 200, 335, 500, 550, 및 665μg의 CD38 결합 단백질을 포함한다. 예시적인 투여 요법은 4주 동안 1, 8, 15, 및 28일에 일주일에 1회, 또는 4주 동안 1 및 15일에 2주에 1회를 포함한다.
[00469] 본 발명의 방법의 일부 구체예에서는 치료되는 암이 다발성 골수종(MM)이다.
VIII. 실시예
[00470] 하기의 실시예는 (1) 면역글로불린 유형, CD38 결합 영역 및 (2) 탈면역된 그리고 퓨린 절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 예시적인 CD38 결합 단백질을 기술한다. 예시적인 결합 단백질의 각 CD38 결합 영역은 하나 이상의 특정한 세포 유형(들)의 표면에 물리적으로 결합된 인간 CD38 표적 분자의 세포외 부분에 대해 고친화력 결합을 보인다. 예시적인 결합 단백질의 각 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드는 진핵의 리보솜 억제를 야기하는 촉매 활성을 보인다. 이러한 본 발명의 예시적인 결합 단백질은 표적 세포에 의해 발현되고 그리고 세포 표면과 연관된 CD38에 결합되고 그리고 그 후에 내재화로 표적 세포에 진입한다. 그런 다음에 내재화된 결합 단백질이 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 구성요소를 시토졸로 효과적으로 라우팅하고 그리고 시가 독소 이펙터의 촉매 활성의 결과로서 리보솜 억제를 통해 직접적으로 표적 세포를 사멸한다. 예시적인 CD38 결합 단백질은 항CD38 항체 다라투무맙이 있는 데서 CD38 발현 세포를 사멸하는 것이 가능하다.
A. 실시예 1. 탈면역된 그리고 퓨린 절단 저항성, 시가 독소 A 서브유닛 유래 폴리펩티드를 포함하는 CD38 결합 단백질
[00471] 결합 단백질이 만들어지고 그리고 시험되었다. 상기 결합 단백질은 각각 (1) 인간 CD38을 결합시키는 세포 표적 결합 영역, 및 (2) 퓨린 절단 저항성인 탈면역된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함한다. 이전에는 시가 독소 A 서브유닛 유래, 결합 단백질이 구성되었고 그리고 세포 내재화 및 그의 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소의 시토졸로의 직접적 세포내 라우팅을 촉진하는 것으로 나타났다(예: WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, WO 2016/196344, PCT/US2017/065074, 및 WO 2018/106895 참조). 이 실시예에서는 결합 단백질 표적 세포 표면 CD38이 만들어졌다. 하기에 설명된 바와 같이 이들 CD38 결합 단백질은 외인성으로 투여되었을 때 CD38 발현 인간 암세포를 특이적으로 결합시키고 그리고 사멸하는 것이 가능했다.
1. 예시적인 CD38 결합 단백질의 구성(construction)
[00472] 당업계에 알려진 기술을 사용하여 (1) 탈면역된 그리고 퓨린 절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드, 및 (2) 단백질성 링커에 의해 분리된 CD38 결합 면역글로불린 유래 폴리펩티드를 포함하는 예시적인 CD38 결합 단백질이 만들어졌다(예: 도 1a-1b 참조). 결과로서 만들어진 세포 표적 융합단백질은 각각이 탈면역된 그리고 퓨린 절단 저항성 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드에 융합된 CD38 결합 면역글로불린 유래 폴리펩티드를 포함하는 연속적인(continuous) 폴리펩티드를 포함하도록 구성되었다.
[00473] 이 실시예에서 결합 단백질의 모든 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 SLT-1A(SEQ ID NO:1) 또는 StxA(SEQ ID NO:2)의 아미노산 1-251로부터 유래되고, 그리고 그 중 몇은 예를 들어 탈면역 치환 및/또는 치환을 방해하는 퓨린 절단 모티프(예: WO 2015/113007, WO 2015/191764, 및 WO 2016/196344) 또는 정제를 돕기위한 아미노산 잔기 3개 삽입과 같은, 야생형 시가 독소 A 서브유닛에 관한 2 이상의 아미노산 잔기 치환을 함유했다. 결합 단백질의 예시적인 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 구성요소는 SEQ ID NO:45-69에 제공된다. 각각의 예시적인 CD38 결합 단백질에 있어서 시가 독소 이펙터 폴리펩티드는 단백질성 링커를 사용하여 CD38 결합 영역에 연결되었다.
[00474] 후보를 가려내기 위해 탈면역된 시가 독소 이펙터에 융합된 CD38 표적 항체의 라이브러리가 다양한 효능 및 안전성 모델로 선별검사가 실시되었다. 제일 먼저 50개 이상의 상이한 CD38 결합 단백질이 구성되었고 그리고 시험관내에서 CD38 양성 세포 골수종 및 림프종 세포에 대한 표적 세포독성을 위해 선별검사가 실시된다. 이 실시예의 실험에서 시험된 모든 결합 단백질은 박테리아 시스템에서 제조되었고 그리고, 예를 들어 결합 단백질에 폴리히스티딘 태그를 사용 그리고/또는 결합 단백질에 면역글로불린 도메인으로 결합된 박테리아 단백질 사용, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 L과 같은 박테리아 단백질을 사용하는, 키틴 결합 태그를 통한 인테인 매개 정제(예: 실시예 1에서 WO 2016/126950 참조)와 같이, 숙련자에게 알려진 기술을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제되었다.
[00475] 이 실시예에서 제조되고 시험된 예시적인 결합 단백질은 CD38 결합 단백질 #1(SEQ ID NO:76, 도 25a), CD38 결합 단백질 #2(SEQ ID NO:77, 도 25b), CD38 결합 단백질 #3(SEQ ID NO:78, 도 25c), CD38 결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79, 도 25d), CD38 결합 단백질 #5(SEQ ID NO:80), 및 CD38 결합 단백질 #6(SEQ ID NO:81)을 포함한다.
[00476] 처음에 25 세트의 항CD38 항체 가변 도메인 서열로부터 유래된 50개의 CD38 결합 단백질이 만들어졌다. 각각의 항CD38 항체에 있어서 단쇄 가변 단편(scFv)이 생성되었고 상기 항체의 CD38 결합 도메인 가변 영역은 아미노 말단에 경쇄(VL)가 더 가깝거나(VL-VH) 또는 아미노 말단에 중쇄(VH)가 더 가까운(VH-VL) 두 가지 배치 중 하나로 배열된다. 상기 scFv는 선별검사, 분석, 및 비교를 위해 50개 이상의 상이한 CD38 결합 단백질을 만들기 위해 탈면역된 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드에 융합되었다. 각각의 CD38 결합 단백질은 잠재적 CD38 결합 영역으로서 적어도 하나의 단쇄 가변 단편을 포함한다.
[00477] 50개의 CD38 결합 단백질이 인테인-키틴 결합 도메인(CBD) 태그를 사용하여 E. coli에서 제조되었고 그리고 키틴 친화성 및 디티오트레이톨(DTT) 용출법으로 정제되었다(앞서 WO 2016/126950에서 기술됨). 그 결과로 제조된 CD38 결합 단백질은 CD38 양성 세포에 대한 세포독성에 대해 선별검사가 실행되었다. 본 명세서에서 CD38 표적 기준 분자 #1(SEQ ID NO:83)로 지칭되는 기준 분자는 예를 들어 세포독성 역가 수준점을 설정하는 것으로 선별검사 결과를 평가하는 데에도 사용되었다.
2. II. CD38 양성 세포에 대한 세포독성에 대해 CD38 결합 단백질 선별검사
[00478] 예시적인 결합 단백질의 세포독성 활성은 조직 배양 세포 기반 독성 분석법을 사용하여 측청된다. 특정 결합 단백질에 있어서 균일한 세포 집단에서 세포 절반을 사멸시키는 외인적으로 투여된 결합 단백질의 농도(반최고치 세포독성 농도)가 계산되었다. 예시적인 결합 단백질의 세포독성은 각 결합 단백질의 결합 영역의 표적 생체분자에 관해 표적 생체분자 양성 또는 표적 생체분자 음성 세포 중 하나를 사용하는 분석법을 사용하여 시험된다.
[00479] 이 실시예에서 사용된 특정 CD38 발현 표적 세포(MOLP-8, H929, ST486, Daudi, ANBL6, MM.1S, LP-1, 및 RPMI8226)는 ATCC(Manassas VA, U.S.) 또는 DSMZ(The Leibniz Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture)(Braunschweig, DE)에서 구할 수 있는 무한증식 조양 세포이다.
[00480] 세포 사멸 분석법은 다음과 같이 실행되었다. 인간 종양 세포주 세포가 384 웰 플레이트에 20μL 세포 배양 배지에 플레이트되었다(일반적으로 각 웰 당 2x103 세포). 실험할 일련(일반적으로 10배 희석)의 단백질이 적절한 완충제로 제조되고, 그리고 5μL의 희석액 또는 음성제어로서 완충제만이 세포에 첨가되었다. 세포 배양 배지만을 함유하는 대조군 웰이 기준선 보정을 위해 사용되었다. 세포 샘플은 단백질과 함께 또는 완충제만 함유한 상태로 37℃ 그리고 5% 이산화탄소(CO2) 분위기에서 2 내지 3일 동안 배양되었다. 총 세포 생존율 또는 퍼센트 생존력(percent viability)은 제조사의 설명서에 따라 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 2.0(G7573 Promega Madison, WI, U.S.)을 사용하여 상대발광량(RLU)으로 측정된 발광 판독(readout)을 사용하여 측정되었다.
[00481] 실험 웰의 퍼센트 생존력은 다음의 방정식을 사용하여 계산되었다: (실험 RLU - 평균 배지 RLU)÷(평균 세포 RLU - 평균 배지 RLU)x100. 단백질 로그값 대 퍼센트 생존력은 Prism(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)에 플롯되었고(plotted), 그리고 log(억제제) 대 반응(3 파라미터) 분석이 실험된 단백질에 대한 반최고치 세포독성 농도(CD50)를 구하기 위해 사용되었다. 가능할 때는 각각의 예시적인 세포 표적 단백질에 대한 CD50이 계산되었다. CD50 값이 실험된 농도의 커브의 형태에 근거해 계산될 수 없을 때는, 최대 CD50 값이 최대 실험 값을 초과하는 것으로 표시되었다. 일부 실험에서 완충제 뿐인 대조군에 비해 결합 단백질의 최고 농도로 처리된 생체분자 표적 음성 세포는 생존력에 어느 변화도 보이지 않았다.
[00482] 주어진 CD38 결합 단백질의 세포독성 활성의 특이성은 유의한 양의 CD38을 발현하는 세포(표적 양성 세포)에 대한 세포 사멸 활성과 어느 세포 표면에 물리적으로 결합된 어느 유의한 양의 CD38을 보이지 않는 세포(표적 음성 세포)에 대한 세포 사멸 활성을 비교하는 것으로 구할 수 있다. 이는 분석되는 결합 단백질의 표적 생체분자의 세포 표면 발현에 대해 양성인 세포 집단에 대한 주어진 결합 단백질의 반최고치 세포독성 농도를 구하고, 그리고 나서 CD38 결합 단백질의 표적 생체분자의 세포 표면 발현에 대해 음성인 세포 집단에 대한 반최고치 세포독성 농도를 구하기 위해 동일한 결합 단백질 농도를 사용하는 것으로 달성되었다. 일부 실험에서 최대량의 시가 독소 함유 분자로 처리된 표적 음성 세포는 "완충제 유일(buffer only)" 음성 대조군에 비해 생존력에 어느 변화도 보이지 않았다. 또한 분리된 시가 독소 이펙터 영역 폴리펩티드가 비표적, 음성 대조군으로서 사용되었다.
[00483] 표 5의 데이터는 25개의 항CD38 항체 가변 도메인 서열로부터 유래된 50개의 CD38 결합 단백질에 있어서 CD38 양성 종양 세포에 대해 상기에서 기술된 세포 사멸 분석법을 사용한 결과를 나타낸다. CD38 표적 기준 분자 #1(SEQ ID NO:83)의 세포독성과 비교한 각각의 세포독성이 오른쪽 열에 표시되었다. 시험된 각각의 세포 유형에 있어서 CD38 표적 기준 분자 #1(SEQ ID NO:80)의 세포독성은 6개의 상이한 실험에서 분석되었고 그리고 평균값을 계산하여 비교에 사용되었다(예: 표 5에 표시된 배수 변화(fold-change) 계산). 도 2는 Cell Titer-Glo 생존력 분석법으로 구한 CD38 양성 H929 골수종 세포에 대한 이 51개의 CD38 결합 단백질의 세포독성 활성 선별검사의 결과를 나타낸다. 추가적인 세포독성 데이터는 표 7-9 및 13-14 그리고 도 3a-3c, 4a-4b 및 8a-8e에 보고되었다. 이 분석법에서 CD38 표적 기준 분자 #1(SEQ ID NO:83)의 대표적인 CD50 값은 ST486 세포에 대해 37pM 그리고 다우디(Daudi) 세포에 대해 44pM이다.
표 5. CD38 결합 단백질의 세포독성 활성
CD 50 (ng/mL) CD38 표적 기준 분자 #1에 비해 CD 50 배수 변화
단백질 MOLP-8 H929 ST486 Daudi MOLP-8 H929 ST486 Daudi
1 32.4 2.53 14.03 22.88 3.6 3.0 8.6 8.8
2 25.7 4.2 9.1 6.9 2.9 5.1 5.6 2.7
3 >20,000 1,918 1,661 >20,000 N/A 2310.8 1019.0 N/A
4 19.9 6.7 1.9 6.8 2.2 8.1 1.2 2.6
5 8.9 0.7 1.1 5.3 1.0 0.8 0.7 2.0
6 232.7 63.4 302.6 253.3 26.0 76.4 185.6 97.4
7 3023 914.1 1126 >20,000 337.4 1101.3 690.8 N/A
8 165 23.7 18.2 267.3 18.4 28.6 11.2 102.8
9 8090 2476 1768 13052 902.9 2983.1 1084.7 5020.0
10 35 17 3.9 41 3.9 20.5 2.4 15.8
11 8.54 0.55 4.13 0.88 1.0 0.7 2.5 0.3
12 8.26 0.84 0.25 5.47 0.9 1.0 0.2 2.1
13 91.8 53.6 9.5 93.2 10.2 64.6 5.8 35.8
14 >20,000 1,156 498 >20,000 N/A 1392.8 305.5 N/A
15 >20,000 >20,000 >20,000 >20,000 N/A N/A N/A N/A
16 57 40 13 66 6.4 48.2 8.0 25.4
17 1436 217.6 507.7 2593 160.3 262.2 311.5 997.3
18 55.57 21.14 3.34 56.16 6.2 25.5 2.0 21.6
19 >20,000 >20,000 >20,000 >20,000 N/A N/A N/A N/A
20 772 356 248 2,719 86.2 428.9 152.1 1045.8
21 30.66 3.03 9.86 2.18 3.4 3.7 6.0 0.8
22 2.26 0.54 ~ 0.014 ~ 0.2 0.3 0.7 NC NC
23 >20,000 >20,000 >20,000 >20,000 N/A N/A N/A N/A
24 73.76 63.48 7.94 119.5 8.2 76.5 4.9 46.0
25 >20,000 >20,000 >20,000 >20,000 N/A N/A N/A N/A
26 >20,000 10,635 6,056 >20,000 N/A 12813 3715.3 N/A
27 10,300 1,661 1,782 >20,000 1149.6 2001.2 1093.3 N/A
28 >20,000 6,411.0 >20,000 >20,000 N/A 7724.1 N/A N/A
29 6072 1270 1366 9346 677.7 1530.1 838.0 3594.6
30 160 119 28 208 17.9 143.4 17.2 80.0
31 266.8 93.22 110.1 120.3 29.8 112.3 67.5 46.3
32 730.2 88.2 238.8 602.1 81.5 106.3 146.5 231.6
33 >20,000 >20,000 >20,000 dnt N/A N/A N/A N/A
34 249.3 244.8 34.4 137.2 27.8 294.9 21.1 52.8
35 >20,000 >20,000 8,856 >20,000 N/A N/A 5433.1 N/A
36 4,395 1,189 3,516 >20,000 490.5 1432.5 2157.1 N/A
37 148.7 406.6 89.7 566.6 16.6 489.9 55.0 217.9
38 12,585.0 707.4 2,752.0 9,111.0 1404.6 852.3 1688.3 3504.2
39 >20,000 >20,000 >20,000 >20,000 N/A N/A N/A N/A
40 >20,000 5,846.0 7,902.0 >20,000 N/A 7043.4 4847.9 N/A
41 >20,000 >20,000 >20,000 >20,000 N/A N/A N/A N/A
42 2,528 421 551 4,741 282.1 507.2 338.0 1823.5
43 6,029.0 445.5 2,414.0 7,613.0 672.9 536.7 1481.0 2928.1
44 188.8 26.4 16.4 751.6 21.1 31.8 10.1 289.1
45 6.18 0.16 0.62 1.72 0.7 0.2 0.4 0.7
46 8.49 0.37 2.95 1.52 0.9 0.4 1.8 0.6
47 >20,000 7,925 12,282 >20,000 N/A 9548.2 7535.0 N/A
48 151 663 621 >20,000 16.9 798.8 381.0 N/A
49 844.7 452 286.35 698.25 94.3 544.6 175.7 268.6
50 12.4 8.4 1.3 5.5 1.4 10.1 0.8 2.1
기준 분자 8.96 0.83 1.63 2.6 1.0 1.0 1.0 1.0
* "dnt(did not test)"는 해당 세포 유형에 대해 데이터가 수집되지 않았음을 의미
"N/A"는 정확한 CD50 값을 얻지 못 했을 때(예: >20,000), 기준과 비교하는 상대적 변화가 해당 없음을 의미
[00484] 50개의 CD38 결합 단백질의 초기 풀(pool)은 이 세포 사멸 분석법을 사용하여 세포독성 역가로 18개의 분자로 좁혀졌다. 그런 다음 이 18개의 서브세트(subset)가 추가 시험을 위해 선택되었다. 표 6에서 동일한 CDR 서열을 공유하는 선별 라이브러리로부터의 단백질 세트는 군(families)으로 분류되었는데, 예를 들어 #1 군은 단백질 3 및 4를 포함하고, #2 군은 단백질 49 및 50을 포함하고, #3 군은 단백질 45 및 46을 포함하고, #5 군은 단백질 1 및 2를 포함하고, 그리고 #6 군은 단백질 7 및 8을 포함한다(표 2 참조). 각각의 이들 군에 있어서 CD38 결합 영역은 동일한 CDR 서열을 가져 구조적으로 유사하다. 각 군은 그의 CDR 세트에 의해 정의될 수 있다: #1 군은 SEQ ID NO:19-24에 의해 대표되는 6개의 CDR의 세트를 포함하고, #2 군은 SEQ ID NO:25-30에 의해 대표되는 6개의 CDR의 세트를 포함하고, #3 군은 SEQ ID NO:31-36에 의해 대표되는 6개의 CDR의 세트를 포함하는 등.
표 6. 동일한 CDR 세트를 포함하는 분자들로 군을 형성한다
CD38 결합 영역 군 중쇄 CDR1 중쇄 CDR2 중쇄 CDR3 경쇄 CDR1 경쇄 CDR2 경쇄 CDR3
#1 GFTFSDYY
(SEQ ID NO:110)		 ISGSGGST (SEQ ID NO:111) AREHSNYFYGMDV (SEQ ID NO:112) SSNIGSNY
(SEQ ID NO:114)		 GNS (SEQ ID NO:115) QSYDSSLSGSG (SEQ ID NO:116)
#2 GFTFSSYW (SEQ ID NO:118) ISGSGGGT
(SEQ ID NO:119)		 AREGETSFGLDV (SEQ ID NO:120) SSNIGGNY (SEQ ID NO:122) RNN (SEQ ID NO:123) QSYDSSLSVS
(SEQ ID NO:124)
#3 GYSFTSYW (SEQ ID NO:102) IYPGDSDT (SEQ ID NO:103) ARGPSTGFWSGNYFDY (SEQ ID NO:104) TGAVTSGFY (SEQ ID NO:106) ATN (SEQ ID NO:107) LVYYDGAW
(SEQ ID NO:108)
#5 GFTFNNYD (SEQ ID NO:210) ISYDGSDK (SEQ ID NO:211) ARVYYYGFSGPSMDV (SEQ ID NO:212) NSNIGSNT (SEQ ID NO:213) SDS (SEQ ID NO:214) QSYDSSLSGSR
(SEQ ID NO:215)
#6 GFTFSDYY (SEQ ID NO:216) ISSSSSYI (SEQ ID NO:217) ATEGPYYLYGFDI (SEQ ID NO:218) SSNIGSNY (SEQ ID NO:219) GNS (SEQ ID NO:220) QSYDNTLSGV
(SEQ ID NO:221)
#7 GFTFDDYG (SEQ ID NO:222) INWNGGST (SEQ ID NO:223) ARGGLFHDSSGYYFGH (SEQ ID NO:224) SSNIGNSY (SEQ ID NO:225) RNN (SEQ ID NO:226) SAWDDNLSV
(SEQ ID NO:227)
[00485] 도 2는 풀에 있는 다양한 분자에 있어서 CD38 양성 H929 골수종 세포에 대한 대표적인 CD50 값을 나타내고 특정 분자가 표지되었다: 1nM의 선별 절단값(cutoff)은 수직 점선으로 나타냈고, 좌측의 CD50 값은 절단값보다 더 강하고 그리고 좌측의 CD50 값은 절단값보다 덜 강하다. 20,000ng/mL 또는 그 이하의 CD50을 보이지 않은 분자는 도 2에 포함되지 않았다.
[00486] 도 2는 1-3 군 및 5-6 군의 단백질이 시험관내에서 CD38 양수 골수종 세포에 대해 강한 세포독성을 보였고 그리고 풀에 있는 많은 다른 분자보다 더 강했다는 것을 도시한다. 1-3 군 및 5-6 군의 CD38 결합 단백질의 특징은 하기에 더 기술된다.
3. 후보 선택 및 선별의 최고의 히트(best hits)의 추가 시험
[00487] 50개의 후보의 라이브러리는 특히 시험관내에서 CD38 양성 세포에 대한 세포독성 역가, 인간 및 시노몰구스 CD38 둘 다에 대한 결합 친화성, 단클론 CD38 항체와의 경쟁, 그리고 제조 가능성(manufacturability)을 고려해서 좁혀졌다. 선별 풀이 다양한 기분으로 좁혀지면서, 1-3 군 및 5-6 군에 있는 CD38 결합 영역이 다음의 분자를 사용하여 더 상세하게 연구되었다: CD38 결합 단백질 #1(SEQ ID NO:76), CD38 결합 단백질 #2(SEQ ID NO:77), CD38 결합 단백질 #3(SEQ ID NO:78), CD38 결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79), CD38 결합 단백질 #5(SEQ ID NO:80), 및 CD38 결합 단백질 #6(SEQ ID NO:81). 표 7은 선별로부터 유래된 이 5개의 예시적인 CD38 결합 단백질에 대한 초기 CD50 값을 보여준다. #1 군은 CD38 결합 단백질 #1(SEQ ID NO:76)을 포함하고, #2 군은 CD38 결합 단백질 #2(SEQ ID NO:77)를 포함하고, #3 군은 CD38 결합 단백질 #3(SEQ ID NO:78) 및 CD38 결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)를 포함하고, #5 군은 CD38 결합 단백질 #5(SEQ ID NO:80)를 포함하고, 그리고 #6 군은 CD38 결합 단백질 #6(SEQ ID NO:81)을 포함한다.
표 7. 다양한 CD38 양성 세포 유형에 대한 선택된 CD38 결합 단백질의 세포독성 역가
CD38 결합 단백질 세포독성 CD 50 (ng/mL)
MOLP-8 H929 ST486 Daudi U266
CD38 결합 단백질 #1 4.7 12.6 3.4 10.3 >20,000
CD38 결합 단백질 #2 7.3 13.8 2.4 8 >20,000
CD38 결합 단백질 #3 2.2 0.2 < 0.1 0.8 >20,000
CD38 결합 단백질 #5 16.8 17.9 3.9 26.8 >20,000
CD38 결합 단백질 #6 17.1 42.6 7.2 109 >20,000
CD38 표적 기준 분지 #1 3.5 0.8 2.3 2.2 >20,000
[00488] 스크린으로부터의 특정 후보의 단백질 생산 및 정제를 최적화한 후, 후보 CD38-결합 단백질을 추가로 평가하고 비교하기 위해 추가의 세포-사멸 분석을 수행하였다. CD38-결합 단백질은, 단백질 A 또는 단백질 L 크로마토그래피를 사용하는 것과 같은, 다른 방법을 통해 정제되었다. 일부 CD38-결합 단백질은 시가 독소 이펙터 폴리펩티드에서 추가 아미노산 잔기의 도입 또는 CD38-결합 scFv 영역의 경쇄에서 아미노산 치환에 의해 변경되었다.
[00489] 세포독성 분석은 상기에 개시되고 표 8 및 도 3a-3c에 보고된 바와 같은 다양한 CD38-결합 단백질을 사용하여 수행하였다. 추가로, CD38-발현 세포에 대한 세포독성의 특이성은 CD38 음성 세포주 U266으로부터의 세포로 세포독성 분석을 수행함으로써 나타났다. 시험된 조건하에서 CD38 음성 세포에 대해 현저한 세포독성 활성은 나타나지 않았다(예를 들어, 도 3c 및 표 7-8, 마지막 열 참조).
표 8. 인간 골수종 세포주에 대해 선택된 CD38-결합 단백질의 세포독성
　 세포독성 CD 50 (ng/mL)
CD38-결합 단백질 MOLP-8 H929 U266
CD38-결합 단백질 #3 0.27 0.015 > 2,000
CD38-결합 단백질 #4 0.17 0.005 > 2,000
CD38-표적화 참조 분자 #1 6.97 0.19 > 2,000
시가 독소 이펙터 폴리펩티드
대조군만		 > 2,000 > 2,000 > 2,000
[00490] CD38-결합 단백질 #6(SEQ ID NO:81)은 CD38 특이성과 높은 세포독성 효능을 나타내었지만, CD38-결합 단백질 #6(SEQ ID NO:81)의 상대적인 세포독성 활성은 많은 다른 후보만큼 높지 않았다.
[00491] CD38-결합 단백질은, 인간 또는 비인간 영장류 세포인, 영장류 세포에서 세포독성 활성에 대해 시험되었다. BLCL-C162는 CD38을 발현하는 레서스(rhesus) 세포주이다. 결과를 표 9a-9b, 도 4a(인간), 및 도 4b(원숭이)에 나타내었다.
Figure pct00002
[00492] ANBL6 세포에 대한 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 2시간 노출은 약 0.1 및 0.16 nM의 CD50 값을 특징으로 하는 세포독성을 초래하는 것으로 측정되었다.
[00493] ANBL6 세포에 대한 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 2시간 노출은 약 0.1 및 0.16 nM의 CD50 값을 특징으로 하는 세포독성을 초래하는 것으로 측정되었다.
[00494] CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)는 전혈 및 PBMC에서 CD38 양성 표적 세포에 대해 시험관내에서 세포독성이었고, 이는 적혈구의 존재가 이 분석에서 세포독성을 억제하지 않았음을 나타낸다.
[00495] CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)는 시험관내에서 다발성 골수종 대상 유래 샘플에 대해 세포독성이었다.
[00496] 특정 CD38-결합 단백질에 대한 촉매(리보솜 억제) 및 세포독성 활성을 시험하여 이들 세포독성 분자의 작용 기전을 조사하였다. CD38-결합 단백질의 리보솜 비활성화 능력은 TNT® Quick Coupled Transcription/Translation 키트(L1170 Promega Madison, WI, U.S.)를 사용하여 무세포 시험관내 단백질 번역 분석을 사용하여 결정되었다. 키트에는 Luciferase T7 Control DNA(L4821 Promega Madison, WI, U.S.) 및 TNT® Quick Master Mix가 포함되어 있다. 리보솜 활성 반응은 제조업체 지침에 따라 준비되었다. 일련의 희석액(일반적으로 10배)을 적절한 완충액에서 제조하고 각 희석액에 대해 일련의 동일한 TNT 반응 혼합물 성분을 생성하였다. 시험할 분자를 Luciferase T7 Control DNA와 함께 각 TNT 반응 혼합물과 결합하였다. 시험 샘플을 30℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, Luciferase Assay Reagent(E1483 Promega, Madison, WI, U.S.)를 모든 시험 샘플에 첨가하고 루시퍼라제 단백질 번역의 양을 제조업체 지침에 따라 발광에 의해 측정하였다. 번역 억제 수준은 로그-변환된 총 단백질 농도 대 상대적 발광 단위의 비-선형 회귀 분석에 의해 결정되었다. 소프트웨어(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)를 사용하여, IC50(half maximal inhibitory concentration) 값은 용량-반응-억제 표제하에서 log(억제제) 대 반응(3개의 매개변수)의 Prism 소프트웨어 함수 [Y = Bottom + ((Top-Bottom)/(1+10^(X-LogIC50)))]를 사용하여 각 샘플에 대해 계산되었다. 그 결과를 표 10 및 도 5에 나타내었다.
표 10. 선택된 CD38-결합 단백질의 리보솜 억제 활성
CD38-결합 단백질 단백질 합성 억제 IC 50 (ng/mL)
CD38-결합 단백질 #4 1.45
CD38-표적화 참조 분자 #1 1.16
시가 독소 이펙터 폴리펩티드 단독 대조군 1.97
[00497] CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 촉매 활성은 SLTA 이펙터 폴리펩티드 단독 및 CD38 표적화 참조 대조군 분자 #1(표 10)에 필적하였다.
4. 세포 결합 및 정제된 CD38-결합 분석을 사용하여 CD38 표적화를 위한 결합 단백질 시험
[00498] CD38-발현 세포에 대한 특정 CD38-결합 단백질에 대해 결합 친화성을 정량화하기 위해 세포 결합 친화성 분석을 수행하였다.
[00499] 재조합 인간 CD38 단백질 또는 재조합 시노몰구스 CD38 단백질(Sino Biological, Wayne, Pennsylvania, U.S.)에 대한 CD38-결합 단백질의 결합은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay) 결합 분석으로 측정하였다. Nunc® Maxisorp™ 플레이트는 4℃에서 밤새 PBS 중 재조합, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD38로 코팅되었다. 웰(well)을 세척하고 차단한 다음, 시험할 CD38-결합 단백질의 일련의 희석과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 CD38-결합 단백질은, 탈면역화 독소 도메인을 검출한 다음 항-쥐(anti-mouse) 겨자무과산화효소(HRP: horseradish peroxidase) 접합된 2차 항체를 검출하는, 뮤린 단클론 항체를 사용하는 2단계 방법에서 검출된다. TMB Ulttra로 HRP 신호를 감지하고 산(acid)으로 반응을 중단한 후, ELISA 신호(450나노미터(nm)에서 흡광도("Abs 450"))를 플레이트 리더(plate reader)로 판독하였다. 이 분석에서(표 11) 분자 CD38-결합 단백질 #2(SEQ ID NO:77), CD38-결합 단백질 #3(SEQ ID NO:78), 및 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79) 각각은 인간 및 원숭이 CD38에 모두 결합한 반면, CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)은 인간 CD38(도 6a)에는 결합하였지만 시노몰구스 CD38(도 6b)에는 결합하지 않았다. 다른 실험에서, CD38-결합 단백질 #1(SEQ ID NO:76)은 또한 인간 및 시노몰구스 CD38 단백질에 결합하는 것으로 나타났다.
표 11. 선택된 CD38-결합 단백질의 CD38-결합 친화도
CD38-결합의 K D (ng/mL)
CD38-결합 단백질 인간 CD38 시노몰구스 CD38
CD38-결합 단백질 #2 10.6 644
CD38-결합 단백질 #3 13.3 247
CD38-결합 단백질 #4 16.4 670
CD38-표적화 참조 분자 #1 7.7 결합 없음
[00500] 이 실험에서 시험된 모든 CD38-결합 단백질은 유사한 결합 친화도로 인간 CD38에 결합하였으나; 시노몰구스 CD38에 대한 결합은 분자마다 달랐다. 분자 CD38-결합 단백질 #1(SEQ ID NO:76), CD38-결합 단백질 #2(SEQ ID NO:77), CD38-결합 단백질 #3(SEQ ID NO:78), 및 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)는 각각 시노몰구스 CD38에 결합하였다. 인간 및 시노몰구스 CD38 둘 모두에 대한 결합은 시노몰구스 동물이, 예를 들어 약동학, 약력학, 및 독물학에 관한 것과 같이, CD38-결합 단백질의 생체내 효과 및 거동을 결정, 추정, 및 이해하는 것을 돕기 위해 인간 대상을 위한 모델로 사용될 수 있기 때문에 유용하고; 여기서 모델은 인간과 같은 관련 종으로 번역될 수 있는 결합 단백질에 의한 표적 결합 및 표적 세포 사멸을 가질 수 있다.
[00501] 또 다른 실험에서, CD38-표적화 기준 분자 #1(SEQ ID NO:83)의 결합 특성을 형광-기반 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. CD38 양성(CD38+) 세포(세포주 A 또는 F)를 함유하는 샘플을 1% 소 혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin)을 함유하는 1X PBS(Calbiochem, San Diego, CA, U.S.)(이하 "1X PBS+1% BSA"로 지칭함)에 현탁시켰고, CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)의 다양한 희석액 100μL와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 인큐베이션 후, 세포 샘플을 1X PBS+1%BSA로 2회 세척하였다. 세포 샘플을 α-SLT-1A pAb1을 함유하는 1X PBS+1%BSA 100μL로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 다시 세척하고 플루오레세인 이소티오시안산염(FITC)에 접합된 항-토끼 2차 항체를 함유하는 1X PBS+1%%BSA 용액 100μL로 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 샘플을 1X PBS+1%BSA로 두 번 세척하고, 200μL의 1X PBS에 재현탁하고 형광-기반 유세포 분석을 실시하여, 각 샘플의 세포에 대해 CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)의 결합 수준을 나타내는, 충분한 2차 항체에 의해 결합된 세포의 백분율을 분석하였다. 상대적 형광 단위의 MFI(Mean Fluorescence Intensity units)의 모든 샘플에 대한 데이터는 임의의 세포-표적 분자로 처리되지 않았지만 토끼 다클론 항체 α-SLT-1A(pAb1)(Harlan Laboratories, Inc. Indianapolis, IN, U.S.)와 그 다음 항-토끼 2차 항체로 배양된 세포의 음성 대조군 샘플을 사용하여 데이터를 게이팅하여(gating) 얻었다. 총 MFI(iMFI)는 양성 세포의 백분율을 MFI에 곱하여 계산되었다. 결합-포화라는 표제하의 원-사이트 결합(one-site binding)의 Prism 소프트웨어 함수 [Y = Bmax*X/(KD+X)]을 사용하여, 기준선 보정 데이터를 사용하여 Bmax 및 KD를 계산하였다. 2개의 CD38+ 세포 유형에 결합하는 CD38-표적화 기준 분자 #1에 대해 측정된 Bmax는 약 100,000iMFI인 것으로 측정되었으며, 이들 CD38+ 세포에 결합하는 CD38-표적화 기준 분자 #1(SEQ ID NO:83)의 KD 값은 약 2-7nM로 측정되었다. CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)은 개시된 조건하의 이 분석에서 CD38 음성에 대한 결합을 나타내지 않았다.
5. 결합 단백질의 CD38-결합 에피토프 맵핑(Mapping)
[00502] 풀(pool)로부터 CD38-결합 단백질 후보를 특징짓는 것을 촉진하기 위해, 추가 CD38-결합 연구가 수행되었다. CD38 세포외 도메인(ECD)에 결합하기 위한 접촉 잔기를 확인하기 위해 Integral Molecular, Inc.(Philadelphia, Pennsylvania, US)(인간에서 시노몰구스 잔기로 적절하게 아미노산을 변경하기 위해 알라닌 스캐닝(alanine scanning) 및 추가 돌연변이를 사용하여 표준 분석 설정)에서 에피토프 맵핑 서비스(샷건 돌연변이에 의한)를 수행하였다.
[00503] 분석은 다음과 같이 수행되었다. 야생형 또는 돌연변이된 CD38 ECD는 HEK293 세포의 세포 표면에서 발현되었고, 그 다음 특정 아미노산이 돌연변이되었을 때 목적 CD38-결합 단백질이 CD38-결합 단백질에 결합하는 능력을 유세포 분석에 의해 야생형 CD38 ECD에 대한 동일한 목적 CD38-결합 단백질의 결합과 비교하였다. 분석은 또한 CD38을 표적으로 하는 일련의 대조군 분자를 사용하여 분자의 발현 또는 일반적인 폴딩(folding)에 영향을 미치는 돌연변이에 대해 제어되었다. 표 12는 특이적 돌연변이를 갖는 표면 발현된 CD38 ECD 단백질에 대한 결합을 야생형 CD38에 대한 CD38-결합 단백질의 결합 백분율로서 나타낸다. 진하게 표시된 값은 결합 단백질에 대한 결합 및 표면 접근(공지된 CD38 구조 세부사항에 기반한)에 중요한 아미노산을 나타낸다.
표 12. 에피토프 맵핑(Mapping): 선택된 CD38-결합 단백질에 의한 결합에 대한 CD38 돌연변이의 효과
CD38 ECD CD38-결합 단백질 CD38-표적화 참조 분자 #1 다라투무맙
#1 #2 #4
위치 돌연변이 % 야생형 % 야생형 % 야생형 % 야생형 % 야생형
78 R78A 2% 3% 106% 80% 52%
81 D81A 8% 9% 109% 128% 292%
119 C119A 108% 108% 12% 83% 85%
124 L124A 84% 92% 23% 259% 169%
201 C201A 90% 58% 4% 130% 109%
216 F216A 89% 74% 18% 25% 140%
230 L230A 72% 111% 7% 17% 64%
254 C254A 48% 81% 7% 46% 67%
262 L262A 68% 97% 12% 33% 83%
272 Q272A 145% 135% 68% 191% 167%
272 Q272R 105% 101% 71% 14% 162%
273 F273A 157% 117% 89% 10% 197%
274 S274F 93% 134% 101% 155% 27%
274 S274F 150% 124% 80% 74% 14%
275 C275A 18% 37% 0.3% 14% 18%
[00504] 도 7은 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)에 의한 결합에 대한 중요한 잔기의 CD38에서의 위치를 도시한다. 도 7에서, 임계 표면 접근가능한 접촉 잔기 F216 및 L262는 빨간색으로 표시되고, 임계 구조 잔기 L124 및 L230은 보라색으로 표시되며, 이황화물 쌍 C119/C201 및 C254/C275에 관여하는 임계 구조 잔기는 회색으로 표시된다.
[00505] CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)에 대해 상기 기재된 바와 같이 에피토프 맵핑 분석을 수행하였다. CD38-표적화 참조 분자 #1에 의한 결합에 대한 CD38의 중요한 잔기는 F216, L262, Q272, 및 F273이었다.
6. 다라투무맙(Daratumumab) 존재하의 세포독성 활성
[00506] 세포-사멸 분석을, 항-CD38 단클론 항체 다라투무맙의 존재하에 상기 기재된 바와 같이 수행하여 다라투무맙이 시험되는 CD38-결합 단백질의 활성을 방해하는지 여부를 평가하였다. 다라투무맙은 다발성 골수종 치료제로 승인된 단클론 항체이다. 다라투무맙의 존재하에 CD38-발현 세포를 사멸시키는 CD38-결합 단백질을 구별하기 위해 세포독성 분석을 수행하였다.
[00507] 목적 CD38-결합 단백질을 다르투무맙의 존재하의 세포독성 활성에 대해 시험하였다. 이 실험에서, 세포 생존력 분석은 상기 설명한 것과 유사하게 수행되었다. CD38 양성 세포를 플레이팅한 후, 다라투무맙을 500㎍/mL(2ng/mL로 4배 희석)에서 시작하는 일련의 희석액의 세포에 첨가하였다. 다라투무맙은 CD38-결합 단백질을 첨가하기 1.5시간 전에 세포에 첨가하였고, 다라투무맙은 실험 내내 웰에 남겨두었다. CD38-결합 단백질을 500ng/mL의 일정한 농도로 웰에 첨가하였으므로(다라투무맙 첨가 후 1.5시간 및 실험 전반에 걸쳐 웰에 남겨둠), 다라투무맙의 최고 농도에서 다라투무맙은 CD38-결합 단백질에 대해 천배 과량이다. 세포 생존율 판독(CellTiter Glo2.0)을 72시간 후에 수행하였다. 이 분석의 일부 결과는 도 8a-8e에 도시되어 있다. 도 8a-8e는 다라투무맙이 CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)의 세포독성 활성을 완전히 차단할 수 있지만 CD38-결합 단백질 #1(SEQ ID NO:76) 및 CD38-결합 단백질 #2(SEQ ID NO:77)의 세포독성 활성에는 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 도시한다. H929 및 ST486 세포주와 관련하여, 다라투무맙의 존재하에 CD38-결합 단백질의 500ng/mL 처리한 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 세포독성 활성에는 변화가 없었다(모든 세포가 사멸됨). CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 경우, CD38-결합 단백질의 세포독성 활성은 고농도의 다라투무맙의 존재하에서 감소되었으나; 효능의 변화에도 불구하고, CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)는 다라투무맙의 존재하에, 다른 CD38-결합 단백질, 예를 들어, CD38-결합 단백질 #1(SEQ ID NO:76) 및 CD38-결합 단백질 #2(SEQ ID NO:77)에서 볼 수 있는 수준까지 세포 생존력에 여전히 영향을 미칠 수 있었다. 표 13은, CD38-결합 단백질보다 단클론 항체가 1000배 더 많은, 단일 농도(0.5㎍/mL)의 CD38-결합 단백질 및 단일 농도의 다라투무맙(500㎍/mL)에서 단클론 항체의 존재하에 선택된 CD38-결합 단백질의 세포독성 활성에 초점을 맞추고 있다.
[00508] 도 8a-8e는 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)가 다라투무맙 농도 범위에 걸쳐 다라투무맙의 존재하에 시험관 내에서 CD38-발현 세포에 대해 강력한 세포독성이 있음을 도시한다.
표 13. 과량의 항-CD38 단클론 항체 다라투무맙의 존재하에서 선택된 CD38-결합 단백질의 세포독성
단백질 0.5㎍/mL CD38-결합 단백질 처리 후 H929 세포 생존율 0.5㎍/mL CD38-결합 단백질 처리 후 MOLP-8 세포 생존율 0.5㎍/mL CD38-결합 단백질 처리 후 ST486 세포 생존율
다라투무맙 없음 500 μg/mL 다라투무맙 다라투무맙 없음 500 μg/mL 다라투무맙 다라투무맙 없음 500 μg/mL 다라투무맙
CD38-결합 단백질 #1 13.7% 45.6% 40.2% 86.5% 1.0% 2.3%
CD38-결합 단백질 #2 16.7% 57.5% 45.4% 90.6% 0.8% 0.9%
CD38-결합 단백질 #4 0.1% 3.7% 3.2% 59.4% 0.3% 0.7%
CD38-표적화 참조 분자 #1 1.4% 118.5% 13.7% 121.7% 3.5% 114.0%
CD38-결합 단백질 없음 118.6% 121.8% 115.5% 112.9% 118.0% 112.9%
표 14. 과량의 항-CD38 단클론 항체 다라투무맙의 존재하에서 선택된 CD38-결합 단백질의 세포독성
MOLP-8 CD 50 (ng/mL) ST486 CD 50 (ng/mL)
단백질 다라투무맙 없음 10 μg/mL 다라투무맙 배수 변화 다라투무맙 없음 10 μg/mL 다라투무맙 배수 변화
CD38-패밀리의 결합 단백질 #5 34.7 293.20 8.44 2.04 9.30 4.56
CD38-결합 단백질 #7 6.4 >20,000 >3,000 0.64 ~20,000 >30,000
CD38-표적화 참조 분자 #1 14.4 >20,000 >1,000 0.42 ~20,000 >30,000
[00509] 패밀리 #5 및 7의 CD38-결합 단백질 뿐만 아니라 CD38-표적화 참조 분자 #1은 모두 CD38 양성 MOLP-8 골수종 세포 및 ST486 림프종 세포에 대해 높은 효능을 나타냈다(표 14; 도 8c 참조).
[00510] 패밀리 #5의 CD38-결합 단백질은 다라투무맙이 존재하지 않는 유사한 샘플의 10배 이내의 CD50 값으로 다라투무맙의 존재하에 세포독성을 나타내었다(표 14; 도 8d 참조). 대조적으로, CD38-결합 단백질 #7 및 CD38-표적화 참조 분자 #1의 세포독성 활성은, 표적 세포가 10μg/mL 다라투무맙(다라투무맙은 희석액 계열(0.2~20,000ng/mL)로 CD38-결합 단백질을 추가하기 30분 전에 첨가하고 실험 내내 유지하였다)으로 전처리되었을 때 완전히 억제되었다.
[00511] CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)는, 다라투무맙에 대한 사전 노출이 있는 대상으로부터를 포함하는, 다발성 골수종 대상 유래 샘플에 대해 시험관내에서 세포독성이었다(표 15 참조). 골수 샘플은 6명의 다발성 골수종 대상으로부터 수집되었고 일반적인 기술을 사용하여 시험관내에서 배양되었다. 기준선에서 6개의 대상 샘플의 세포에 대한 세포 표면 CD38의 수준은 당업자에게 공지된 일반적인 기술을 사용하여 평가되었으며, CD38 밀도는 137,000에서 6,750,000 항체 결합 용량 단위까지 다양한 것으로 밝혀졌다(표 15: 열 2 참조). CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)를 세포에 다양한 농도로 투여한 후, 48시간 또는 72시간 동안 배양하였다. CD50 값은 상기 설명한 대로 계산되었으며 대표적인 결과는 표 15에 기록되어 있다.
표 15. 다발성 골수종 대상 유래 골수 종양 세포에 대한 CD38-결합 단백질 #4의 세포독성
대상 # 세포-표면 CD38 ㅁ밀도 CD 50 (nM)
48 시간		 CD 50 (nM)
72 시간
1 22.9 x 105 3.5 < 2.5
2 1.4 x 105 3.9 2.2
3 6.2 x 105 6.6 NA
4 19.7 x 105 8.5 3.0
5 44.0 x 105 6.5 3.3
6 67.5 x 105 5.0 4.6
[00512] CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)는 이 시험관 내 대상 세포 배양 코호트(cohort)에서 광범위한 CD38 수준을 발현하는 다양한 다발성 골수종 종양 세포를 고갈시켰다. CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)는 48시간 치료 후 0.38-0.85μg/mL 범위의 CD50 농도에서 종양 세포를 고갈시켰고, 72시간 치료 후 0.23-0.51μg/mL 범위에서 종양 세포를 고갈시켰다(72시간 시점에서 기술적으로 산정할 수 없는 하나의 대상 샘플을 사용하여).
[00513] CD38에 대한 예시적인 CD38-표적화 분자의 경쟁적 결합을 또한 시험하였다(도 23 참조). CTM#1(SEQ ID NO:228), CTM#2(SEQ ID NO:229), CTM#3(SEQ ID NO:230)이 항-CD38 항체 다라투무맙(Dara), HB-7, AT13-5, 또는 OKT-10의 존재하에 CD38에 결합할 수 있는지 여부를 시험하였다. 도 23a 및 23b에 도시된 바와 같이, CTM#1(SEQ ID NO:228) 및 CTM#2(SEQ ID NO:229)는 다라투무맙, HB-7, AT13-5, 및 OKT-10의 존재하에 CD38에 결합할 수 있었고, 이는 이들 분자가 다라투무맙, HB-7, AT13-5, 및 OKT-10에 의해 결합된 에피토프(들)와 다른 CD38의 에피토프에 결합할 수 있음을 나타낸다. CTM#3(SEQ ID NO:230)은 OKT-10의 존재하에 CD38에 결합할 수 있었지만, 다라투무맙, HB-7 및 AT13-5에는 결합할 수 없었으며, 이는 CTM#3(SEQ ID NO:230)이 OKT-10에 의해 결합된 에피토프와 다른 CD38의 에피토프에 결합할 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 CTM#3(SEQ ID NO:230)이 다라투무맙, HB-7, 및 AT13-5와 CD38 상의 에피토프를 공유하거나 부분적으로 공유(예를 들어, 부분적으로 중첩되는 에피토프)함을 제시한다.
[00514] CD38-발현 세포에 대한 경쟁적 결합 예시적인 CD38-표적화 분자를 또한 시험하였다(도 23c 참조). MOLP-8 세포를 20μg/mL의 CD38-표적 분자(~400nM) 또는 대조군 분자(시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 단독)와 함께 70분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 0.5㎍/mL의 항-CD38을 첨가하고 48시간 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. CD38 결합은 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 성분을 인식하는 1차 항체, 및 FITC 접합된 항-IgG 2차 항체에 이어 유세포 분석에 의해 검출되었다. CD38-표적화 분자의 평균 형광 강도(MFI)는 2차 항체 단독 대조군으로부터의 신호를 뺀 후 계산되었고, 대조군으로서 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 단독으로부터 측정된 MFI의 백분율로 플롯팅되었다. 도 23c 및 23d에서, CTM#1(SEQ ID NO:228) 및 CTM#2(SEQ ID NO:229)는, CD38 상의 동일한 에피토프에 결합한다는 사실과 일치하는, 경쟁 방식으로 CD38에 결합한다. CTM#3(SEQ ID NO:230)은 CTM#1(SEQ ID NO:228) 및 CTM#2(SEQ ID NO:229)와 반-경쟁(semi-competitively) 방식으로 CD38에 결합한다.
7. 인간 골수 흡인물의 결합 단백질 시험
[00515] 인간 다발성 골수종 세포에 대한 CTM#4의 세포독성을 추가로 평가하기 위해, 골수 흡인물(BMA)을, 다라투무맙(013)에 내성이 있는 하나의 대상을 포함하는, 다양한 다발성 골수종 대상(010, 011, 012, 013, 014, 및 015로 표시됨)으로부터 얻었다. BMA는 증가하는 농도의 CTM#4(약 0.053에서 33.33μg/mL 범위)로 처리되었다. 도 15에 도시된 바와 같이, CTM#4는 BMA 종양 세포에 대해 세포독성을 나타내었고, 이들 환자-유래 다발성 골수종 세포에 대해서는 48시간 후에 약 3.5 내지 8.5nM의 CD50 값을 나타내고, 72시간 후에는 약 0.23 내지 0.51㎍/mL의 CD50 값을 나타내었다. CD38 발현 수준과 CTM#4 세포독성 효능 사이의 엄격한 상관관계는 관찰되지 않았다.
8. 약력학적 모델
[00516] CTM#4 세포독성의 시간 경과를 측정하기 위해, CTM#4로 처리한 후 약 72시간 동안 다양한 고-CD38 발현(MOLP6, RPMI-8226) 및 배지-CD38 발현(ANBL6, NCI-H929) 세포주에서 실시간 Glo 분석을 사용하여 세포독성을 측정하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, 가장 민감한 라인(예: NCI-H929)에서 8시간 이내의 생존 효과가 관찰되었다.
[00517] 시험된 대부분의 다발성 골수종 세포 유형의 경우, CTM#4 CD50 값은 약 48시간 후에 점근선에 도달한다. 도 16에서, 표는 하단 2개 라인(CTM#4 또는 CD38TM4)의 CD50 값(pM)을 기록한다. 도 16에서, 표는 세포 표면 CD38의 발현 수준을 기록하고 CD38 발현 라인에서의 값을 높음 또는 중간으로 특징짓는다. CTM#4의 CD38-표적화 모이어티인 CD38TM4의 세포독성을 개별적으로(시가 독소 이펙터 폴리펩티드로부터 분리됨) 시험하였고 시험된 CD38TM4 농도 범위에 대해 정확한 CD50 값을 결정할 수 없었으나; CD50 값은 이 분석에서 ANBL-6, NCI-H929, MOLP-8, 및 HCT116 세포에 대해 180,000pM보다 큰 것으로 측정되었다(도 16. 표, 마지막 줄). CD38 발현 수준과 CTM#4 세포독성 효능 사이의 엄격한 상관관계는 관찰되지 않았다.
[00518] 2개의 세포주, NCI-H929 및 MOLP 8은 세포 사멸의 가장 짧은 유도를 나타내었고, 세포독성은 CTM#4 투여의 처음 8시간 이내에 관찰되었고, 각각 <0.038 및 0.081±0.018ng/mL의 CD50 값을 특징으로 하였다. 다발성 골수종 세포주 ANBL-6 및RPMI-8226은 CTM#4에 대해 NCI-H929 및 MOLP 8보다 덜 민감하였다(72시간에서 각각 1.949±0.0467 및 0.136±0.027 ng/mL의 CD50 값 및 각각 28시간 및 24시간에서 세포 사멸 유도). CTM#4는 이연구에서 CD38-음성 HCT 116 결장암 세포에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
[00519] CTM#4가 전혈(whole blood)에서 활성인지 여부를 측정하기 위해, 인간 및 시노몰구스 원숭이 전혈을 CTM#4로 72시간 동안 처리하였다. NK(Natural Killer) 세포 고갈은, 유세포 분석을 사용하여, 시험관 내에서 측정되었다. 도 18a-18b에 도시된 바와 같이, CTM#4는 인간 및시노몰구스 원숭이 전혈 모두에서 NK 세포 수를 감소시켰다.
[00520] 별도의 분석에서, ANBL-6 다발성 골수종 세포를 CTM#4로 48시간 또는 72시간 동안 연속적으로 처리하거나, CTM#4에 2시간 동안 노출시키고, 세척하고, 48시간 또는 72시간 시점까지 CTM#4가 없는 배지에 유지하였다. RealTime-Glo 생존력 분석을 사용하여 세포 생존력을 측정하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 2시간 처리와 세척은 48시간 시점에서 세포독성을 5배 증가시키고, 72시간 시점에서 세포독성을 10배 증가시킨다.
[00521] 9. 뮤린 모델(Murine Models)
[00522] 다른 종의 포유류 대상을 위해 뮤린 모델을 사용하여 선택된 CD38-결합 단백질을 평가하였다.
a. 생쥐 모델의 내약성(Tolerability)
[00523] 내약성, 독성, 및 안전성을 평가하기 위해, BALB/C 쥐에, 각각 PBS에 희석된 비히클(vehicle)(20mM 시트르산나트륨, 200mM 소르비톨, pH 5.5) 또는 CD38-결합 단백질로, 0.25~2mg/kg에서 12일에 걸쳐(1, 3, 5, 8, 10, 및 12일) 6회 투여하였다. 체중을 모니터링하고 연구 전반에 걸쳐 임상 관찰을 수행하였다. 이들 연구의 일부 결과는 표 16, 표 17, 및 도 17에 도시되어 있다. 평균 체중 감소가 >20% 또는 >10% 사망률인 임의의 그룹에서 투여를 중단하고, 동물을 안락사시키지 않고 회복을 가능하게 하였다. >20% 체중 감소가 있는 그룹 내에서, 각각의 체중 감소 종점에 도달한 개체는 안락사된다. CD38-결합 단백질은 표 16 및 17에 표시된 대로 다양한 연구에서 시험되었다. 다양한 농도의 여러 CD38-결합 단백질에 대한 데이터는 표 16에 제공된다. 또한, 간 효소 기능의 변화를 보여주는 일부 임상 화학(아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST: aspartate aminotransferase), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT: alanine aminotransferase), 알칼리 포스파타제(alk phos: alkaline phosphatase), 및 총 빌리루빈(bilirubin))은 4차 투여 후(8일째 투여후 12시간)에 수행되었고, 그 값은 표 17에 보고되어 있다.
표 16. 예시적인 CD38-결합 단백질의 생체내 비교: 체중 변화 및 연구중 사망
결합 단백질 연구 투여량 (mg/kg) 정해진 투여일
(6회 투여 계획) 		체중 최하점 연구중 사망
Nadir (%) 일 사망/총 수 평균 일수
CD38-결합 단백질 #1 1 2 1,3,5,8,10 -33.40% 12 2/6 12
CD38-결합 단백질 #2 1 2 1,3,5,8,10,12 -16.20% 12 0/6 N/A
CD38-결합 단백질 #3 1 2 1,3,5,8,10 -18.70% 8 5/6 11
CD38-표적화 참조 분자 #1 1 2 1,3,5,8,10,12 -0.90% 2 0/6 N/A
비히클 대조군 2 N/A 1,3,5,8,10,12 -2.10% 14 0/6 N/A
CD38-결합 단백질 #1 2 1 1,3,5,8,10,12 -18.50% 14 0/6 N/A
CD38-결합 단백질 #2 2 1 1,3,5,8,10,12 -13.70% 14 0/6 N/A
CD38-표적화 참조 분자 #1 2 1 1,3,5,8,10,12 -0.30% 7 0/6 N/A
비히클 대조군 3 N/A 1,3,5,8,10,12 -1.50% 14 0/6 N/A
CD38-표적화 대조군 분자 #1 3 0.5 1,3,5,8,10,12 -1.80% 2 0/6 N/A
CD38-결합 단백질 #1 3 0.5 1,3,5,8,10,12 -5.20% 9 0/6 N/A
CD38-결합 단백질 #2 3 0.5 1,3,5,8,10,12 -1.60% 11 0/6 N/A
CD38-결합 단백질 #3 3 0.5 1,3,5,8,10,12 -6.40% 7 0/6 N/A
CD38-결합 단백질 #3 3 1 1,3,5,8,10 -22.10% 18 3/6 11
CD38-결합 단백질 #4 3 0.5 1,3,5,8,10,12 0 N/A 0/6 N/A
CD38-결합 단백질 #4 3 1 1,3,5,8,10,12 -1.90% 10 0/6 N/A
CD38-표적화 참조 분자 #1 3 0.5 1,3,5,8,10,12 -2.50% 14 0/6 N/A
표 17. 예시적인 CD38-결합 단백질의 생체내 비교: 임상 화학
결합 단백질 연구 투여량 (mg/kg) AST ALT Alk Phos 빌리루빈
μg/μL 대조군의 % μg/μL 대조군의 % U/L 대조군의 % mg/dl 대조군의 %
비히클 대조군 2 N/A 72 100% 34 100% 118.67 100% 0.25 100%
CD38-표적화 대조군 분자 #1 2 0.5 127.83 178% 61.67 181% 88.33 74% 0.24 96%
CD38-결합 단백질 #1 2 0.5 188.17 261% 99.17 292% 77.17 65% 0.2 80%
CD38-결합 단백질 #2 2 0.5 94 131% 51.67 152% 79.33 67% 0.18 72%
CD38-결합 단백질 #3 2 0.5 244.67 340% 145.17 427% 80.67 68% 0.23 92%
CD38-결합 단백질 #3 2 1 251.33 349% 103.00 303% 64.83 55% 0.20 80%
CD38-결합 단백질 #4 2 0.5 92.17 128% 58.67 173% 105 88% 0.2 80%
CD38-결합 단백질 #4 2 1 156.50 217% 133.67 393% 110.33 93% 0.23 93%
CD38-표적화 참조 분자 #1 2 0.5 77.2 107% 36.67 108% 104.5 88% 0.28 112%
비히클 대조군 3 N/A 81.33 100% 29.67 100% 117.33 100% 0.20 100%
CD38-결합 단백질 #1 3 1 454.33 559% 524.67 1769% 101.00 86% 0.33 167%
CD38-결합 단백질 #2 3 1 172.67 212% 276.67 933% 128.00 109% 0.20 100%
CD38-표적화 참조 분자 #1 3 1 217.33 267% 49.00 165% 110.00 94% 0.17 83%
[00524] CD38-결합 단백질 #3(SEQ ID NO:78) 및 CD38-결합 영역에서 동일한 CDR을 갖는 관련 분자 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)를 단일연구 내에서 비교하고 치료된 쥐의 체중 변화를 표 16 및 도 9에 나타내었다. 둘 다 0.5mg/kg에서 내약성이 있었지만, CD38-결합 단백질#4(SEQ ID NO:79)는, 체중의 변화 및 사망 없는 것과 같이, 1mg/kg에서 더 나은 내약성이 있었던 반면, 1mg/kg의 CD38-결합 단백질#3(SEQ ID NO:78)은 체중 감소 및 3/6 사망과 관련이 있었다(표 16 참조). 생존한 CD38-결합 단백질 #3(SEQ ID NO:78) 치료군의 동물은 여섯 번째 예정된 투여를 받지 않았다. 두 분자 사이의 차이점은, 단백질L 정제를 촉진하기 위한 경쇄의 아미노산 변화이고, 이는 놀랍게도 독성이 덜하여 더 높은 투여량과 더 적은 빈도의 투여량을 허용할 수 있어, 상당한 이점이 있다.
b. 상대적 면역원성(Relative Immunogenicity)
[00525] 인간 면역계에 대한 포유동물 모델을 사용하여 특정 CD38-결합 단백질의 면역원성 잠재력을 연구하였다. 예시적인 결합 단백질의 상대적인 면역원성은, 여러 주의 기간에 걸친 반복 비경구 투여 후 결합 단백질에 대한 생체내 항체 반응에 대한 분석을 사용하여 측정하였다(예를 들어, WO 2015/113005 참조). 용액 내 ELISA를 사용하여 상이한 결합 단백질에 특이적인 혈청 뮤린 항체의 상대적인 양을 결정하였다.
[00526] 이 면역원성 분석은 일반적으로 포유동물에서 분자의 상대적 면역원성을 나타내는 쥐의 사용을 포함한다. BALB/c 쥐를 그룹당 6마리의 쥐로 구성된 치료 그룹에 무작위로 할당하고 다른 치료 그룹의 쥐에 다른결합 단백질을 투여한 쥐 연구를 수행하였다. 먼저, 결합 단백질에 노출되기 전에 각 쥐로부터 혈청 샘플을 수집하였다. 다음으로, 치료 그룹의 각 쥐에 2주 동안 주 3회 복강내 주사에 의해 샘플 결합 단백질의 투여량당 체중 킬로그램(mg/kg)당 샘플 분자 0.25mg을 투여하였다. 샘플을 투여하지 않은 1주일 후, 샘플 결합 단백질의 용량당 0.25mg/kg의 복강내 주사를 추가 2주 동안 주 3회 투여하여, 5주 간격에 걸쳐총 12회 용량의 결합 단백질을 투여하였다. 5주의 투여 간격 동안 및 후에, 용액 내 ELISA를 사용하여 투여된 결합 단백질을 표적으로 하는 항체를 관찰하기 위해 모든 쥐로부터 혈청을 수집하였다.
[00527] 투여된 결합 단백질을 인식하는 항체를 검출하기 위한 용액 내 ELISA를 다음과 같이 수행하였다. 각 CD38-결합 단백질 및 각각의 쥐-치료그룹에 대해, 동일한 일반 용액 내 ELISA 분석 설정을 사용했지만 다른 ELISA 분석을 수행하였다. 용액 내 ELISA 분석을 위해, ELISA 플레이트 웰을 CD38 재조합 인간 단백질로 코팅하였다. 쥐-치료 그룹에서 주사에 사용된 동일한 결합 단백질을 해당 그룹의 단일 쥐에서 수집한 혈청과 함께 용액에서 4ºC에서 밤새 배양한 다음, 형성된 모든 복합체(예: 혈청에 존재하는 결합 단백질 및 항체를 포함하는 복합체)가 코팅된 ELISA 플레이트 웰을 사용하여 포획되었다. 쥐의 면역글로불린 G 분자(IgG)를 포함하는 포획된 면역 복합체는 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)에 접합된 2차 항체인 항-쥐 IgG를 사용하여 검출되었다. HRP 활성은 발색 HRP 기질을 첨가한 후 화학발광의 결과로 발광을 검출함으로써 웰에서 검출되었다. HRP 활성 또는"ELISA 신호"는 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 측정되었다. ELISA 신호 값은 "무혈청" 음성 대조군 웰에서 측정된 배경 신호를 제외한 후 흡광도 값(Abs 450nm)으로 계산되었다. 혈청은 분석에 대한 포화 수준 미만의 흡광도 값 판독이 가능하도록 희석되었고, 희석비율은 정해진 날에 측정된 모든 치료 그룹의 모든 쥐에 대해 동일하였다. 대조군으로서, CD38-표적화 대조군 분자 #1(SEQ ID NO:80)과 동일한 scFv를 포함하지만 덜 면역화된 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함하는 CD38-표적화 대조군 분자 #1(SEQ ID NO:84)를 쥐에 투여하고 항-약물 항체 반응을 나타내기 위해 사용하였다.
[00528] 도 10은 탈면역화된 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 성분만을 포함하는 CD38-결합 단백질의 상대적 면역원성을 나타낸다: CD38-결합 단백질 #1(SEQ ID NO:76), CD38-결합 단백질 #2(SEQ ID NO:77), 및 CD38-표적화 대조군 분자 #1(SEQ ID NO:83)은 목적 분자의 저용량(0.25mg/kg) 투여의 2주기에 걸쳐 덜 탈면역화한 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 및 CD38-표적화 대조군 분자 #1(SEQ ID NO:80)과 동일한 scFv를 포함하는 CD38-표적화 대조군 분자(SEQ ID NO:84)와 비교하여 총 12회 투여함.
[00529] CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83) 및 또 다른 대조군 CD38-표적화 분자를 2주기 동안 비인간 영장류에게 0.05mg/kg의 용량으로 정맥내 투여하고 주기(투여 일 1, 3, 5, 8, 10, 12; 29, 31, 33, 36, 38, 및 40) 사이에 2주간 휴식을 가졌다. CD38-표적화 대조군 분자#1(SEQ ID NO:84)과 동일한 시가 독소 이펙터 폴리펩티드를 포함하는 덜 면역화된 CD38-표적화 대조군 분자와 비교하여, CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)을 수용한 동물에서 임의의 염증/면역 반응의 중증도가 감소되었다(글로불린 수준, IgG 수준, IgA 수준, 호중구 수치, 단핵구 수치, 알부민 감소로 측정). 또한, CD38-표적화 참조 분자#1(SEQ ID NO:83)은 6차 투여 후에 검출가능했지만 대조군 CD38-표적화 분자는, 추측상 더 많은 항-약물 항체의 제형으로 인해, 정량 한계미만이었다.
c. 효능
[00530] CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 이량체를 포함하는 조성물은, 피하 및 파종성 둘 다의, 여러 인간 골수종 이종이식 뮤린 모델에서 효과적이었다. 주 1회 및 격주 일정 모두를 사용하여 완전한 종양 퇴화가 관찰되었다. 또한, 인간 CD38을 발현하는 공통 유전자의 뮤린 세포주는 면역적격 쥐 모델에서 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79) 치료에 반응성인 것으로 나타났다.
(i) 뮤린 이종이식 모델: 피하 LP-1
[00531] CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 생체내 활성은 LP-1 인간 다발성 골수종 이종이식편을 갖는 암컷 CB17 중증 복합 면역결핍(SCID) 쥐를 포함하는 뮤린 이종이식 모델을 사용하여 평가되었다. 쥐를 LP-1 인간 다발성 골수종 세포로 오른쪽 옆구리에 피하로 접종하고 비히클의 정맥내 투여로 매주 1회(QW), 21일 동안 CD38-결합 단백질#4(SEQ ID NO:79)의 정맥내 투여로 매주 1회, 또는 14일 동안 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 정맥내 투여로 격주에 한 번(Q2W) 치료하였다. CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 용량은 5, 6, 또는 10mg/kg 체중이었다.
[00532] 종양 부피와 체중은 통상의 기술자에게 알려진 일반적인 기술을 사용하여 주당 2회 측정하고 평균 종양 부피(MTV)는 공식(0.5×[길이×너비2])을 사용하여 계산하였다. 평균 종양 부피가 약 94mm3에 도달했을 때, 쥐를 치료 그룹(그룹당 n=6마리)으로 무작위화하고, QW 일정에 따라 비히클(인산염 완충 식염수(PBS)) 또는 CD38-결합 단백질#4(SEQ ID NO:79)를 QW 일정에 따라 5.0 또는 6.0 mg/kg으로, 또는 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)를 Q2W 일정에 따라 10.0mg/kg으로 정맥내 투여하였다. QW 투여를 받은 쥐는 0, 7, 14, 및 21일에 치료되었다. Q2W 투여를 받은 쥐는 0 및 14일에 치료되었다. 모든 치료는 0일에 시작되었다. 종양 크기 및 체중은 주당 2회 측정되었고 연구는 대조군 종양이 28일째 약 1800mm3에 도달했을 때 종료되었다.
[00533] 성장률 억제는 28일째에 측정되었다. 종양 성장의 억제는 연구의 28일째까지 및 이를 포함한 데이터를 사용하여 퍼센트 GRI([대조군의 평균성장률 - 치료된 군의 평균 성장률] / 비히클 군의 평균 성장률)를 계산함으로써 측정되었다. 치료 그룹과 비히클 간의 종양 성장의 통계적 비교는 각 그룹의 동물의 지수 성장률에 적용되는 t-검정을 사용하여 수행되었다. 이들 연구의 일부 결과는 표 18(LP-1) 및 도 11a-11d에 제시되어 있다. 도 11a-11d는 각 그룹에 대한 시간(일)에 따른 평균 종양 부피(mm3)를 그래프로 도시한다. "BIW"라는 용어는 도 11a-11d에서 사용되어 투여 요법을 언급할 때 '격주'를 의미한다. "AUC"라는 용어는 곡선 아래의 면적을 나타낸다.
표 18. CD38-결합 단백질 #4는 이종이식 모델에서 CD38+ 종양 세포를 사멸시킴
세포주 CD38 발현 (x 103) 종양 배가 시간(days) 최고 % 종양 성장 억제
(AUCtreated - AUCbaseline) χ
(AUCvehicle - AUCbaseline) x 100%
MM1.S 18 6.1 d 90%
H929 88 5.6 d (종양 퇴행과 함께) 126%
LP-1 202 7.4 d (종양 퇴행과 함께) 109%
MOLP8 707 4.7 d 69%
[00534] 치료는 모든 투여 그룹에서 내약성이 있었다. 치료 및 측정 동안 동물이 죽거나 없어지지는 않았다. 모든 동물은 28일째 분석에 포함되었다.
[00535] LP-1 인간 다발성 골수종 이종이식편을 갖는 암컷 CB17 SCID 쥐를 5mg/kg 또는 6mg/kg의 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)로 일주일에 한 번 치료한 결과 비히클 치료와 비교하여 상당한 항종양 활성이 나타났다.
[00536] (ii) 뮤린 이종이식 모델: 피하 H929
[00537] CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 생체내 활성은 NCI-H929 인간 다발성 골수종 이종이식편을 보유하는 암컷 비비만성 당뇨병(NOD) 중증 복합형 면역부전증(SCID) 쥐를 포함하는 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 평가되었다. 쥐를 오른쪽 옆구리에 NCI-H929 인간 다발성 골수종 세포로 피하 접종하고 21일 동안 매주 1회(QW) 비히클(PBS) 또는 14일 동안 격주(Q2W)에 1회 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 정맥내 투여로 치료하였다. CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 용량은 5, 6, 또는 10mg/kg 체중이었다.
[00538] 종양 부피와 체중은 통상의 기술자에게 알려진 일반적인 기술을 사용하여 주당 2회 측정하고 평균 종양 부피(MTV)는 공식(0.5×[길이×너비2])을 사용하여 계산하였다. 평균 종양 부피가 약 121mm3에 도달했을 때, 쥐를 치료 그룹(그룹당 n=8마리)으로 무작위화하고, QW 일정에 따라 비히클(인산염 완충 식염수(PBS)) 또는 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)를 QW 일정에 따라 5.0, 6.0, 또는 10.0 mg/kg으로, 또는 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)를 Q2W 일정에 따라 10.0mg/kg으로 정맥내 투여하였다. QW 투여를 받은 쥐는 0, 7, 14, 및 21일에 치료되었다. Q2W 투여를 받은 쥐는 0 및 14일에 치료되었다. 모든 치료는 0일에 시작되었다. 종양 크기 및 체중은 주당 2회 측정되었고 연구는 대조군 종양이 29일째 약 1700mm3에 도달했을 때 종료되었다.
[00539] 29일째 성장률 억제를 측정하였다(상기 기재된 바와 같음). 이들 연구의 일부 결과를 표 18(H929) 및 도 11a-11d에 나타내었다.
[00540] 치료는 모든 투여 그룹에서 내약성이 있었다. 치료 및 측정 동안 동물이 죽거나 없어지지는 않았다. 모든 동물은 29일째 분석에 포함되었다.
[00541] 일주일에 1회 5mg/kg 또는 6mg/kg의 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79) 또는 격주에 1회 10mg/kg의 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)로 NCI-H929 인간 다발성 골수종 이종이식편을 보유하는 암컷 비비만성 당뇨병(NOD/SCID) 쥐의 치료는 비히클 치료와 비교하여 상당한 항종양 활성을 나타내었다.
[00542] 추가의 뮤린 피하 이종이식편 모델은 상기 설명한 것과 유사하고 당업자에게 공지된 기술을 사용하지만 예를 들어, MOLP8 세포와 같은, 다른 세포-유형을 사용하여 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 생체내 활성을 평가하는데 사용되었다. 이들 연구의 일부 결과는 표18(MOLP-8) 및 도 11d에 제시되어 있다.
(iii) 뮤린 이종이식 모델: 피하 MM1.S
[00543] CD38-결합 단백질 #4(CTM#4)의 생체내 활성은 MM1.S 인간 다발성골수종 이종이식편을 보유하는 암컷 CB17 중증 복합형 면역부전증(SCID) 쥐를 포함하는 뮤린 이종이식 모델을 사용하여 평가되었다. 쥐를 오른쪽 옆구리에 MM1.S 인간 다발성 골수종 세포를 피하로 접종하고 비히클의 정맥내 투여로 매주 1회(QW), 21일 동안 CD38-결합단백질 #4의 정맥내 투여로 매주 1회, 또는 14일 동안 CD38-결합 단백질 #4를 정맥내 투여로 격주에 1회 치료하였다. CD38-결합 단백질#4의 용량은 5, 6, 또는 10mg/kg 체중이었다.
[00544] 종양 부피와 체중은 당업자에게 알려진 일반적인 기술을 사용하여 주당 2회 측정하고 평균 종양 부피(MTV)는 공식(0.5×[길이×너비2])을 사용하여 계산하였다. 평균 종양 부피가 약 94mm3에 도달했을 때, 쥐를 치료 그룹으로 무작위화하고 QW 일정에 따라 비히클(인산염 완충식염수(PBS)), QW 일정에 따라 CD38-결합 단백질 #4, Q2W 일정에 따라 CD38-결합 단백질 #4, BIW 일정에 따라 CD38-표적화 항체(다라투무맙, SOC), QW 일정에 따라 CD38-결합 단백질 #4와 BIW 일정에 따라 SOC, 또는 Q2W 일정에 따라 CD38-결합 단백질 #4와 BIW 일정에 따라 SOC와 함께 정맥내 투여하였다. QW 투여를 받은 쥐는 0일, 7일, 14일, 및 21일에 치료받았다. Q2W 투여를 받은 쥐는 0일 및 14일에 치료받았다. 모든 치료는 0일에 시작되었다. 종양 크기 및 체중은 주당 2회 측정되었고 연구 대조군 종양이 28일째에 약 1800mm3에 도달했을 때 연구는 종료되었다.
[00545] 이 연구의 일부 결과는 도 12a-b 및 도 17에 도시되어 있다. 두 조합 부문(CTM#4+SOC)에서 완전한 퇴화가 관찰되었다.
D. 뮤린 이종이식 모델: 파종성(disseminated)
[00546] CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 생체내 활성은 MM1.S-Luc 인간 다발성 골수종 파종성 종양을 보유하는 암컷 SCID/Beige 쥐를 포함하는 뮤린 이종이식 모델을 사용하여 평가되었다.
[00547] SCID Beige 쥐에 MM1.S-Luc 종양 세포(루시퍼라제 발현으로 표지된 MM1.S 세포)를 당업자에게 공지된 일반적인 기술을 사용하여 꼬리 정맥 주사에 의해 접종하였다. 각 쥐에 대한 종양 부담이 당업자에게 알려진 일반적인 기술을 사용하여 생물발광 영상화(bioluminescence imaging)를 사용하여 일주일에 한 번 측정되었다. 종양 부담을 14, 21, 28, 35, 및 42일에 초당 광자로 측정하고 평균 생물발광 신호를 각 치료 그룹에 대해 계산하였다. 14일째에, 평균 생물발광 신호가 초당 약 1.11×107 광자에 도달했을 때, 동물을 치료그룹으로 무작위화하였다(n=8/그룹). 비히클 단독 또는 CD38-결합단백질 #4(SEQ ID NO:79)를, 다음 투여 주기를 시작하기 전에, 2주 동안 일주일에 3회(2일 중단 포함), 격일에 1회 2mg/kg을 복강내 투여한 후 1주일 동안 중단하였다(격일에 1회×3, 2회 중단; 1주 중단 시 2주). 추가로, CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)는 4, 6, 및 10mg/kg으로 매주 1회 투여되었다. 모든 그룹은 28일 동안 투여되었다. 격일에 1회×3, 2회 중단; 1주 중단 시 2주 일정으로 치료된 쥐에 14, 16, 18, 21, 23, 25, 35, 및 37일에 비히클(PBS) 또는 CD38-결합단백질을 투여하였다. 주 1회 일정으로 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)을 수용한 쥐는 14, 21, 27, 및 35일에 치료를 받았다.
[00548] %T/C를 계산하여 항종양 활성을 결정하였다. 퍼센트 T/C는 치료된 그룹의 평균 생물발광 신호(BLI)를 비히클 그룹의 평균 생물발광(BLI) 신호로 나눈 값 × 100으로 정의되고 42일째에 계산되었으며 일부 결과는 도 12a에 도시되어 있다. 도 12a에서, CD38-결합 단백질#4(SEQ ID NO:79)는 "CTM #4"로 나타내었고, 이는 비히클 단독 대조군과 함께 실험 데이터에 나타난 유일한 단백질이었다. 도 12b는 또한 이종이식 종양 세포에서 루시페라제 활성의 생물발광 영상화를 사용하여 수집된 쥐의 이미지를 도시한다: 비히클만을 투여한 쥐는 그의 몸 전체에 광범위하게 강한 신호를 나타내는 반면, CD38-결합 단백질#4(CTM #4)(SEQ ID NO:79)를 투여한 쥐는 이 방법으로 검출할 수 있는 종양 세포가 없는 것으로 나타났다.
[00549] MM1.S-Luc 인간 다발성 골수종 파종성 종양이 있는 암컷 SCID/Beige 쥐를 4mg/kg, 6mg/kg, 또는 10mg/kg의 CD38-결합 단백질#4로 일주일에 한 번 치료한 결과, 비히클 치료와 비교하여 유의한 항종양 활성이 나타났다. 상당한 항-종양 활성이 4mg/kg 이상의 투여량 및 주 1회 투여 일정에서 관찰되었다.
[00550] CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)의 생체내 활성은 Daudi-Luc 인간 다발성 골수종 파종성 종양을 보유하는 SCID/Beige 쥐를 포함하는 뮤린 이종이식 모델을 사용하여 평가되었다. CD38-표적화 참조분자 #1(SEQ ID NO:83)은 주기 사이에 1주일 휴식을 갖는 2주기 동안 쥐에 0.5mg/kg 또는 0.6mg/kg의 용량으로 투여되었다(투여 일 1, 3, 5, 8, 10, 12; 22, 24, 26, 29, 31, 및 33). 비히클-단독 대조군과 비교하여, CD38-표적화 참조 분자 #1(SEQ ID NO:83)을 수용한 쥐에서 Daudi-Luc 세포의 주사-후 4일 후에 감소된 종양 부담이 관찰되었다(도 12-c 참조).
[00551] (iv) 필리핀 원숭이(cynomolgus macaques)에서 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)의 독성 및 약력학
[00552] 체중당 약 0.2 내지 0.75mg/kg의 CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79)를 1 내지 4주 동안 매주 1회 정맥내 투여하여 비-인간 영장류에서 시험하였다. 항-약물 항체는 15일 및 22일에 관찰되었다. 2 또는 4회 투여 동안 ≤0.75mg/kg CD38-결합 단백질 #4(SEQ ID NO:79) QW의 투여는 관련된 임상 징후 없이 효과적이었다. 비-인간 영장류에서 시험한 결과 CD38-결합 단백질 #4 투여는 순환 CD38±NK 세포, B 세포, 및 T 세포의 수를 감소시킬 수 있음을 보여주었다.
B. 실시예 2. 시가 독소 A 서브유닛 유래 폴리펩티드를 포함하는 CD38-표적화 융합 단백질
[00553] 본 실시예의 CD38-표적화 융합 단백질은, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조된, CD38-결합 영역, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드 및 단백질성 링커(예를 들어, WO 2015/113005, WO 2016/196344, 및/또는 PCT/US2016/043902)를 포함하는 세포-표적화 결합 영역 폴리펩티드를 포함한다. 본 실시예의 세포-표적화 융합 단백질 중 일부는 각각이 세포-표적화 결합 영역 폴리펩티드 및 시가독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드를 포함하는 단일 연속 폴리펩티드를 포함하도록 구성된다.
[00554] 1. 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드를 포함하는 CD38-표적화 융합 단백질에 혼입 후 결합 기능 유지에 대한 CD38-결합 영역 시험
[00555] 본 실시예의 CD38-결합 단백질의 CD38-결합 특성은 형광-기반, 유세포-분석에 의해 측정된다. CD38 양성 세포에 대한 본 실시예의 특정 CD38-표적화 융합 단백질에 대한 Bmax는 0.01-100nM 범위 내의 KD를 갖는 약 50,000-200,000MFI로 측정된다.
2. 결합 영역 융합 후 시가 독소 기능 유지를 위한 CD38-결합 단백질 시험
[00556] 세포-표적 단백질이 이종 영역의 융합 후 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 기능의 유지에 대해 시험된다. 분석된 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 기능은: 진핵생물 리보솜의 촉매적 비활성화, 세포독성, 및 추론에 의한 세포질로의 자가-유도 세포내 라우팅(routing)이다.
3. 결합 단백질의 리보솜 억제 능력 테스트
[00557] 결합 단백질의 시가 독소 A 서브유닛 유래 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 영역의 촉매 활성은 리보솜 억제 분석을 사용하여 테스트된다.
[00558] 본 실시예의 세포-표적화 단백질의 리보솜 불활성화 능력은 TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Kit(L1170 Promega Madison, WI, U.S.)를 사용하는 무세포, 시험관내 단백질 번역 분석을 사용하여 결정된다. 키트에는 Luciferase T7 Control DNA(L4821 Promega Madison, WI, U.S.) 및 TNT® Quick Master Mix가 포함되어 있다. 리보솜 활성 반응은 제조업체의 지침에 따라 준비된다. 테스트할 시가 독소 유래 세포-표적 단백질의 일련의 10배 희석액이 적절한 완충액에서 준비되고 일련의 동일한 TNT 반응혼합물 성분이 각 희석액에 대해 생성되었다. 일련의 희석액의 각 샘플은 Luciferase T7 Control DNA와 함께 각 TNT 반응 혼합물과 화합된다. 테스트 샘플은 섭씨 30도(ºC)에서 1.5시간 동안 배양된다. 배양후, Luciferase Assay Reagent(E1483 Promega, Madison, WI, U.S.)를 모든 테스트 샘플에 첨가하고 루시퍼라제 단백질 번역의 양은 제조업체의 지침에 따라 발광에 의해 측정된다.
[00559] 번역 억제 수준은 로그-변환된 총 단백질 농도 대 상대 발광 단위의 비-선형 회귀 분석에 의해 결정된다. 통계 소프트웨어(GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.)를 사용하여, 투여-반응-억제 제목하에 log(억제제) 대 반응(3개 매개변수)의 Prism 소프트웨어 함수 [Y = 하단+((상단 하단)/(1+10^(X?LogIC50)))]를 사용하여 각 샘플에 대해 IC50(half maximal inhibitory concentration) 값을 계산한다. 하나 이상의 실험에서 얻은 각 시가 독소 유래 세포-표적화 단백질에 대한 IC50 값이 계산된다.
[00560] 4. CD38-발현 세포에 대한 CD38-결합 단백질의 세포독성 시험
[00561] 본 실시예의 CD38 세포-표적화 융합 단백질의 세포독성 특성은 이전 실시예에서 상기 기재된 바와 같이 일반적인 세포-사멸 분석에 의해 결정된다. 본 실시예의 결합 단백질의 CD50 값은 세포주에 따라 흑색종 세포에 대해 약 0.01-100nM이다.
C. 실시예 3: 재발성(Relapsed) 또는 불응성(Refractory) 다발성 골수종 환자에서 예시적인 CD38-결합 단백질의 안전성, 내약성, 약동학(PK), 및 효능을 평가하기 위한 연구
[00562] 이 연구(제1상 시험)의 목적은 예시적인 CD38-결합 단백질, CD38-결합 단백질 #4("CTM #4", SEQ ID NO:79)의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 이 연구는 최대 내약 용량(MTD: maximum tolerated dose) 및/또는 제2상 권장 용량(RP2D: recommended phase 2 dose)을 확립하고, 재발성 또는 불응성 다발성 골수종(RRMM)이 있는 참가자에서 CD38-표적화 분자 단일 요법의 예비 평가를 제공할 것이다.
[00563] 연구는 용량 증량 단계(파트 1) 및 확장 단계(파트 2)의 2단계로 수행된다. 이 연구에는 약 81~102명의 참가자(파트 1의 참가자 39~60명, 파트 2의 참가자 약 54명)가 등록된다.
[00564] 용량 증량 단계(파트 1)에서, 시작 용량 수준은 주 1회 50마이크로그램/킬로그램(mcg/kg)이다. 코호트 1에서 사용가능한 안전성, PK, 약력학, 및 효능 데이터를 검토한 후, 복용량을 후속 코호트에서 100, 200, 335, 500, 및 665mcg/kg으로 증량한 다음, 필요한 경우 665mcg/kg을 초과하여 1.25 증량한다. CTM #4가 2주에 한 번 투여되는 별도의 용량 증량도 발생할 수 있다.
[00565] 확장 단계(파트 2)에서, 연구는 2가지 유형의 RRMM 코호트를 평가할 것이다: 다라투무맙-재발성 또는 불응성(RR) 코호트(매주 1회 및 2주마다 1회 CTM #4 투여) 및 항-CD38 치료 나이브 코호트(Therapy Naive Cohort)(매주 1회 CTM #4 투여). 각 확장 코호트의 시작 용량은 연구의 용량 증량 단계에서 사용가능한 안전성, 효능, PK, 및 약력학 데이터를 검토한 후 파트 1에서 결정된 MTD/RP2D(매주 1회 및 2주마다 1회)일 것이다. 대상 투여 코호트는 하기 표 19에 기재되어 있다.
표 19: 부문 및 주입
파트 부문 주입 설명
1 50 mcg/kg, 매주 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 진행성 질환(PD: progressive disease), 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 28일 치료 주기에서 1일, 8일, 15일, 및 22일에 매주 1회, 정맥내 주입으로, 킬로그램당 50마이크로그램(mcg/kg) 투여.
1 100 mcg/kg, 매주 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 PD, 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 28일 치료 주기에서 1일, 8일, 15일, 및 22일에 매주 1회, 정맥내 주입으로, 100mcg/kg의 투여.
1 200 mcg/kg, 매주 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 PD, 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 28일 치료 주기에서 1일, 8일, 15일, 및 22일에 매주 1회, 정맥내 주입으로, 200mcg/kg의 투여.
1 335 mcg/kg, 매주 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 PD, 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 28일 치료 주기에서 1일, 8일, 15일, 및 22일에 매주 1회, 정맥내 주입으로, 335mcg/kg의 투여.
1 500 mcg/kg, 매주 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 PD, 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 28일 치료 주기에서 1일, 8일, 15일, 및 22일에 매주 1회, 정맥내 주입으로, 500mcg/kg의 투여.
1 665 mcg/kg, 매주 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 PD, 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 28일 치료 주기에서 1일, 8일, 15일, 및 22일에 매주 1회, 정맥내 주입으로, 665mcg/kg의 투여.
1 투여량 추후결정(TBD), 2주에 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 PD, 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 28일 치료 주기에서 1일 및 15일에 2주마다 1회 정맥내 주입으로 TBD 투여. CTM #4의 용량 증량은 이전 코호트에서 이용가능한 안전성, 약동학(PK), 약력학, 효능 데이터의 조사자 및 후원자 검토를 기반으로 할 것임.
2 다라투무맙RR, 투여량 TBD, 매주 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 PD, 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 다라투무맙에 대한 재발성 또는 불응성(RR)인 참가자의 경우 주 1회 정맥내 주입으로 TBD 투여. 파트 2의 용량은 본 연구 파트 1의 이용가능한 안전성, 효능, PK, 및 약력학 데이터의 검토를 기반으로 결정됨.
2 다라투무맙RR: 투여량 TBD, 2주에 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 PD, 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 다라투무맙에 대한 RR인 참가자의 경우 2주마다 1회 정맥내 주입으로 TBD 투여. 파트 2의 용량은 본 연구 파트 1의 이용가능한 안전성, 효능, PK, 및 약력학 데이터의 검토를 기반으로 결정됨.
2 항-CD38 요법 Naive MM: 투여량 TBD, 매주 1회 CTM #4, 정맥 주입으로 PD, 허용할 수 없는 독성, 또는 다른 이유로 인한 연구 중단까지 항-CD38 요법을 받은 적이 없는 MM 환자의 경우 주 1회 정맥내 주입으로 TBD 투여. 파트 2의 용량은 본 연구 파트 1의 이용가능한 안전성, 효능, PK, 및 약력학 데이터의 검토를 기반으로 결정됨
[00566] 전체 연구 기간은 약 34개월이다. 참가자는 추적 평가를 위해 연구 약물의 마지막 투여 후 30일 동안 추적 관찰된다.
[00567] 본 연구의 1차 결과 측정에는 다음이 포함된다:
1. 파트 1: 전체 및 용량 수준별 일시적 이상 반응(TEAE: treatment-emergent adverse events)이 있는 참가자 수[기간: 최대 12개월]
2. 파트 1: 각 용량 수준에서 용량-제한 독성(DLT: dose-limiting toxicities)이 있는 참가자 수[기간: 최대 12개월]. DLT는 조사자가 연구 약물을 사용한 요법과 최소한 관련될 수 있는 것으로 간주하는 임의의 결과로 정의된다. DLT는 혈액학적 또는 비-혈액학적 DLT일 수 있다. 혈액학적 DLT는 주기 1 동안 발생하는 등급 ≥4의 혈액학적 TEAE일 수 있으며, 다음의 예외가 있다: 명백히 외인성 원인으로 인한 혈액학적 AE, 등급 4 림프구 감소증, 등급 4 호중구 감소증(ANC <500cells/mm3) 연속 7일 미만 지속, 임의의 등급 및 기간의 열성 호중구 감소증, 임상적으로 의미 있는 출혈이 있는 등급 ≥3 혈소판 감소증, 임의의 기간의 등급 4 혈소판 감소증, 등급 ≥3 모세혈관 누출 증후군, 또는 기저 질환과 명백하게 관련이 없는 등급 ≥3 용혈(예: 음성 직접 Coombs 시험). 비-혈액학적 DLT는 주기 1 동안 발생하는 임의의 등급 ≥3 비혈액학적 TEAE일 수 있으며, 다음의 예외가 있다: 명백히 외인성 원인으로 인한 비혈액학적 AE, 72시간 이내에 성공적으로 가역적인(등급 4 → 등급 ≤2, 등급 3 → 등급 ≤1 또는 기준선) 무증상 실험실 변화(신장 및 간 실험실 값 및 등급 4 리파아제/아밀라제 수준 제외), 제토제로 관리가능한 등급 3 구역/구토, 72시간 미만 지속되는 등급 3 피로, 7일 이내에 등급 ≤1 또는 기준선으로 귀착되는 등급 3 ALT 또는 AST 상승, 등급 3 증상의 재발 없이 대증 요법(symptomatic treatment)(예: 항히스타민제, NSAID, 마약, IV 수액)에 반응하는 등급 3 IRR.
3. 독성은 National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events 버전 5.0(NCI CTCAE 5.0)에 따라 평가될 것이다.
4. 파트 1: 등급이 3 TEAE 이상(>=)인 참가자 수[기간: 최대 12개월]. 등급 >=3 TEAE는 NCI CTCAE 5.0에 따라 평가될 것이다.
5. 파트 1: 중대한 이상 반응(SAE: serious adverse event)이 있는 참가자 수[기간: 최대 12개월]
6. 파트 1: TEAE로 인해 CTM #4를 중단한 참가자 수[기간: 최대 12개월]
7. 파트 1: 투여 지연, 투여 중단, 및 투여 감소를 포함한 치료 관련 투여 변경이 있는 참가자 수[기간: 최대 12개월]
8. 파트 1: 실험실 값에 임상적으로 유의미한 변화가 있는 참가자 수[기간: 최대 12개월]
9. 파트 1: 바이탈 사인(vital sign) 측정에서 임상적으로 유의미한 변화가 있는 참가자 수[기간: 최대 12개월]
10. 파트 2: 전체 반응률(ORR: Overall response rate)[기간: 최대12개월]. IMWG(International Myeloma Working Group) 균일 반응 기준(Uniform Response Criteria)에 정의된 대로 연구 기간 동안 부분 관해(PR: partial response) 이상을 달성한 참가자의 비율. PR은 혈청 M 단백질의 >=50% 감소 및 24시간 요중 M 단백질(urinary M protein)의 >=90% 또는 24시간(h)당 200밀리그램 미만(<)의 감소이다. 혈청 및 요중 M 단백질을 측정할 수 없는 경우, M 단백질 기준대신 관련 유리 경쇄(FLC) 수준과 관련되지 않은 유리 경쇄(FLC) 수준 간의 차이가 50% 이상 감소해야 한다. 혈청 및 요중 M 단백질 및 혈청 FLC 분석을 측정할 수 없는 경우, 기준선 백분율이 >=30%인 경우, M 단백질 대신 골수 형질 세포의 50% 이상 감소가 필요하다. 또한, 기준선에 존재하는 경우, 연조직 형질세포종의 크기가 50% 이상 감소해야 한다. 두 번의 연속 평가가 필요하고; 방사선 연구를 수행한 경우의 진행성 또는 새로운 골 병변의 알려진 징후는 없다.
[1] 본 연구의 2차 결과 측정에는 다음이 포함된다:
1. 파트 1 및 파트 2, Cmax: CTM #4에 대한 최대 관찰 농도[기간: 주기 1 및 2, 1일: 투여-전, 및 투여-후 여러 시점(최대 168시간)에서(각 주기는 28일)].
2. 파트 1 및 파트 2, Tmax: CTM #4에 대한 최대 관찰 농도(Cmax)에 도달하는 시간[기간: 주기 1 및 2, 1일: 투여-전, 및 투여-후 여러 시점(최대 168시간)에서(각 주기는 28일)].
3. 파트 1 및 파트 2, AUClast: 시간 0에서 CTM #4에 대한 마지막 정량화 가능한 농도 시간까지의 농도-시간 곡선 아래 면적[기간: 주기 1 및 2, 1일: 투여-전, 및 투여-후 여러 시점(최대 168시간)에서(각 주기는 28일)].
4. 파트 1: 전체 반응률(ORR)[기간: 최대 12개월]. ORR은 IMWG Uniform Response Criteria에 정의된 대로 연구 기간 동안 PR 이상을 달성한 참가자의 백분율로 정의된다. PR은 혈청 M 단백질의 >=50% 감소 및 24시간 요중 M 단백질의 >=90% 또는 <200mg/24h의 감소이다. 혈청 및 요중 M 단백질을 측정할 수 없는 경우, M 단백질 기준 대신 관련 FLC 수준과 관련되지 않은 FLC 수준 간의 차이가 50% 이상 감소해야 한다. 혈청 및 요중 M 단백질 및 혈청 FLC 분석을 측정할 수 없는 경우, 기준선 백분율이 >=30%인 경우, M 단백질 대신 골수 형질 세포의 50% 이상 감소가 필요하다. 또한, 기준선에 존재하는 경우, 연조직 형질세포종의 크기가 50% 이상 감소해야 한다. 두 번의 연속 평가가 필요하고; 방사선 연구를 수행한 경우의 진행성 또는 새로운 골 병변의 알려진 징후는 없다.
5. 파트 1: 임상적 이점 비율(CBR)[기간: 최대 12개월]. CBR은 IMWG Uniform Response Criteria에 정의된 대로 연구 기간 동안 최소 반응(MR) 이상을 달성한 참가자의 백분율로 정의된다. MR은 혈청 M 단백질이 >=25%이지만 49% 이하(<=)이고 24시간 요중 M 단백질이 50~89% 감소하는 것으로 정의된다. 또한, 기준선에 존재하는 경우, 연조직 형질세포종의 크기가 25~49% 감소해야 한다. 용해성 골 병변의 크기나 수는 증가하지 않았다(압박 골절의 발생이 반응을 배제하지 않음).
6. 파트 1 및 파트 2: 무진행 생존율(PFS: Progression-free survival)[기간: 용량 투여일로부터 모든 원인으로 인한 사망까지(최대 12개월)]. PFS는 최초 투여일로부터, IMWG 기준에 따른 진행성 질병(PD) 시기, 또는 모든 원인으로 인한 사망일까지의 시간이다. PD: 다음 항목에서 최저 반응 값으로부터 25% 증가: 데시리터당 0.5그램(g/dL) 이상 절대 증가(absolute increase)하는 혈청 M 성분; 혈청 M 성분이 >=1g/dL 증가하여, M 성분 >=5g/dL로 시작하는 경우 재발을 나타냄; 요중 M 성분(절대 증가 >=200mg/24h); 측정가능한 혈청 및 요중 M 단백질 수준이 없는 참가자에만 해당: 관련 FLC 수준과 관련되지 않은 FLC 수준 간의 차이(절대 증가 >10mg/dL); 측정가능한 혈청 및 요중 M 단백질 수준이 없고 FLC 수준으로 측정가능한 질병이 없는 참가자에서만, 골수형질 세포%(절대% >=10%); 기존 골 병변 또는 연조직 형질세포종의 크기에서 새로운 또는 일정한 증가의 발생; 고칼슘혈증의 발병은 전적으로 형질 세포 증식 장애에 기인할 수 있음; 새로운 요법이 필요하기 전에 2회의 연속 평가.
7. 파트 1 및 파트 2: 반응 지속기간(DOR: Duration of response)[기간: 반응을 처음 기록한 일로부터 PD가 처음 기록된 일까지(최대 12개월)]. DOR은 반응의 첫 기록일로부터 첫 기록된 PD 일까지의 시간이다. PD는 다음의 최저 반응 값으로부터 25% 증가이다: 절대 증가가 >=0.5g/dL인 혈청 M 성분; 혈청 M 성분이 >=1g/dL 증가하여, M 성분 >=5g/dL로 시작하는 경우 재발을 나타냄; 요중 M 성분(절대 증가>=200mg/24h); 측정가능한 혈청 및 요중 M 단백질 수준이 없는 참가자에만 해당: 관련 FLC 수준과 관련되지 않은 FLC 수준 간의 차이(절대 증가 >10mg/dL); 측정가능한 혈청 및 요중 M 단백질 수준이 없고 FLC 수준으로 측정가능한 질병이 없는 참가자에서만, 골수 형질 세포%(절대% >=10%); 기존 뼈 병변 또는 연조직 형질세포종의 크기에서 새로운 또는 일정한 증가의 발생; 형질 세포 증식 장애에만 기인할 수 있는 고칼슘혈증의 발병; 새로운 요법이 필요하기 전에 2회의 연속평가.
8. 파트 1 및 파트 2: MR을 달성한 참가자의 비율[기간: 최대 12개월]. 25% 종양 감소로 정의된, MR을 달성한 참가자의 비율. MR은 IMWG Uniform Response Criteria에 의해 정의된 바와 같이 혈청 M 단백질의 >=25%, <=49% 감소 및 24시간 요중 M 단백질의 50%에서 89% 감소로 정의된다.
9. 파트 1 및 파트 2: CTM #4 투여 후 항-약물 항체가 있는 참가자 수[기간: 최대 12개월].
10. 파트 2: DLT 및 용량 조절, 치료 중단, 활력 징후를 포함한 기타 TEAE가 있는 참가자 수[기간: 최대 12개월]. DLT는, 조사자가 연구 약물을 사용한 요법과 최소한 관련될 수 있는 것으로 간주하는 임의의 결과로 정의된다. 독성은 NCI CTCAE 5.0에 따라 평가된다.
11. 파트 2: 전체 생존기간(OS: Overall survival)[기간: 용량 투여일부터 임의의 원인으로 인한 사망까지(최대 12개월)]. OS는 투여일로부터 임의의 원인으로 인한 사망까지의 기간으로 정의된다.
12. 파트 2: 반응 시간(TTR: Time to response)[기간: 연구 치료제의 첫 번째 투여일로부터 반응이 처음 기록된 일까지(최대 12개월)]. 연구 치료제의 첫 번째 투여일로부터 첫 번째 반응이 기록된 일까지의 기간(PR 또는 그 이상). PR은 혈청 M 단백질의 >=50% 감소 및 24시간 요중 M 단백질의 >=90% 또는 <200mg/24h의 감소이다. 혈청 및 요중 M 단백질을 측정할 수 없는 경우, M 단백질 기준 대신 관련 FLC 수준과 관련되지 않은 FLC 수준 간의 차이가 50% 이상 감소해야 한다. 혈청 및 요중 M 단백질 및 혈청 FLC 분석을 측정할 수 없는 경우, 기준선 백분율이 >=30%인 경우, M 단백질 대신 골수형질 세포의 50% 이상 감소가 필요하다. 또한, 기준선에 존재하는 경우, 연조직 형질세포종의 크기가 50% 이상 감소해야 한다. 두 번의 연속 평가가 필요하고; 방사선 연구를 수행한 경우의 진행성 또는 새로운 골 병변의 알려진 징후는 없다.
13. 파트 2: 완전 관해(CR:complete response) 또는 매우 좋은 부분 관해(VGPR: very good partial response)를 달성한 참가자의 비율[기간: 최대 12개월]. CR 또는 VGPR은 IMWG 기준에 의해 정의된다. CR은 혈청 및 소변의 음성 면역고정(negative immunofixation), 임의의 연조직 형질세포종의 소실, 골수 내 형질 세포 <5%로 정의되고; 측정가능한 질병만이 혈청 FLC 수준인 참가자의 경우, CR 기준에 더하여 0.26~1.65의 정상 FLC 비율이 요구되고; 두 번의 연속적인 평가가 필요하다. VGPR은 면역고정에 의해 검출가능한 혈청 및 요중 M 성분으로 정의되지만 전기영동에서는 검출되지 않거나 >=90% 감소의 혈청 M 성분 + 요중 M 성분의 <100mg/24h이고; 측정가능한 질병이 혈청 FLC 수준에 의한 것인 참가자의 경우, VGPR 기준에 더하여, 관련된 FLC 수준과 관련되지 않은 FLC 수준 간의 차이에서 >90% 감소가 요구되고; 두 번의 연속적인 평가가 필요하다.
[2] 연구에 참여하기 위해, 대상은 18세 이상(성인, 노인)이어야 하고, 남성 또는 여성일 수 있다. 연구의 파트 1에 대한 추가포함 기준은 다음과 같다:
1. MM 진단이 확인되었다.
2. RRMM이 있고 이 참가자 모집단에서 임상적 이점을 제공하는 것으로 알려진 이용가능한 치료법에 대한 치료에 실패했거나, 내약성이 없거나, 지원기(candidate)가 아니다.
3. 이전 치료법에 대해 다음 기준을 모두 충족해야 한다:
·최소 하나의 프로테아좀 억제제(PI), 최소 하나의 면역조절제(IMiD), 및 최소 1개의 스테로이드에 대해 불응성이어야 한다.
·이전의 3회 이상의 치료법을 받았어야 하거나, 해당 치료법 중 하나에 PI와 IMiD의 조합이 포함된 경우 최소 2회의 이전의 치료법을 받았어야 한다.
·항-CD38 치료법(다라투무맙 포함)을 사용한 이전 치료가 허용된다.
4. 다음 중 최소 하나로 정의되는 측정가능한 질병이 있다:
·혈청 단백질 전기영동(SPEP)에서 혈청 M-단백질 >=500mg/dL(>=5g/L).
·요중 단백질 전기영동(UPEP)에서 요중 M-단백질 >=200mg/24h.
·혈청 FLC 비율이 비정상인 경우, 관련 FLC 수준 >=10mg/dL(>=100밀리그램/리터[mg/L])인 혈청 FLC 분석 결과.
5. ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group) 성능 상태 점수가 0 또는 1이다.
6. 남성의 경우 <=450밀리초(ms) 또는 여성의 경우 <=470ms의 QTcF로 정의되는, 심전도(ECG) 스크리닝에서의 Fridericia 방법으로 보정된 정상적인 QT 간격(QTcF)이 있다.
7. 연구 시작 시 다음 임상 실험실 기준을 충족한다:
·총 빌리루빈 <=1.5*ULN(upper limit of the normal range), 단, 직접 빌리루빈이 <2.0*ULN이어야 하는 길버트증후군이 있는 참가자는 제외된다.
·혈청 알라닌 아미노전이효소(ALT) 및 아스파테이트 아미노전이효소(AST)는 <=2.5*ULN이어야 한다.
·추정 사구체 여과율(eGFR: Estimated glomerular filtration rate) >=분당 30밀리리터(mL/min/1.73제곱미터[m2], MDRD(modification of diet in renal disease) 공식 사용.
·절대 호중구 수(ANC: Absolute neutrophil count) >=1000/입방 밀리미터(/mm3)(>=1.0*109/리터[/L]); >=750/mm3(>=0.75*109/L)의 수는, 후원자와 논의한 후, 골수에 형질 세포가 >50%인 참가자에게 허용될 수 있다.
·혈소판 수 >=75,000/mm3(>=75*109/L); >=50,000/mm3(>=50*109/L)의 값은, 후원자와 논의한 후, 골수에 형질 세포가 >50%인 참가자에게 허용될 수 있다.
·헤모글로빈 >=7.5g/dL(이 수준에 도달하기 위해 참가자를 수혈하는 것은 허용되지 않음).
[3] 연구의 파트 2에 대한 추가 포함 기준은 다음과 같다:
1. MM 진단이 확인되었다.
2. 이전 치료법에 대해 다음 기준을 모두 충족해야 한다:
·최소 하나의 PI 및 최소 하나의 IMiD에 대해 불응성 또는 불내성이어야 한다.
·이전의 3회 이상의 치료법을 받았어야 하거나, 해당 치료법 중 하나에 PI와 IMiD의 조합이 포함된 경우 최소 2회의 이전 치료법을 받았어야 한다.
·항-CD38 치료법(다라투무맙 포함)을 사용한 이전 치료는, 항-CD38-요법 실험을 받은 적이 없는 확장 코호트에 등록된 참가자를 제외하고 허용된다.
·다라투무맙-RR 코호트(매주 1회 및 2주마다 1회 CTM #4 투여): 참가자는 치료 중 언제든지 다라투무맙에 대해 RR이어야 한다. 참고로, 다른 항-CD38 요법에 대한 참가자의 RR은 제외된다.
·항-CD38 요법 실험을 받은 적이 없는 코호트(주 1회 투여): 참가자는 이전에 항-CD38 요법을 받은 적이 없어야 한다.
3. 다음 중 최소 하나로 정의되는 측정가능한 질병이 있다:
·SPEP에서 혈청 M-단백질 >=500mg/dL(>=5g/L).
·UPEP에서 요중 M-단백질 >=200mg/24h.
·혈청 FLC 비율이 비정상인 경우, 관련 FLC 수준 >=10mg/dL(>=100mg/L)인 혈청 FLC 분석 결과.
4. ECOG 성능 상태 점수가 0 또는 1이다.
5. 남성의 경우 <=450ms 또는 여성의 경우 <=470ms의 QTcF로 정의되는, ECG 스크리닝에서의 정상적인 QTcF이 있다.
6. 연구 시작 시 다음 임상 실험실 기준을 충족한다:
·총 빌리루빈 <=1.5*ULN, 단, 직접 빌리루빈이 <2.0*ULN이어야 하는 길버트 증후군이 있는 참가자는 제외된다.
·혈청 ALT 및 AST는 <=2.5*ULN이어야 한다.
·eGFR >=30mL/min/1.73m2, MDRD 공식 사용.
·ANC >=1000mm3)(>=1.0*109/L); >=750/mm3(>=0.75*109/L)의 수는, 후원자와 논의한 후, 골수에 형질 세포가 >50%인 참가자에게 허용될 수 있다.
·혈소판 수 >=75,000/mm3(>=75*109/L); >=50,000/mm3(>=50*109/L)의 값은, 후원자와 논의한 후, 골수에 형질 세포가 >50%인 참가자에게 허용될 수 있다.
·헤모글로빈 >=7.5g/dL(이 수준에 도달하기 위해 참가자를 수혈하는 것은 허용되지 않음).
[4] 대상이 다음 기준 중 하나 이상을 충족하는 경우 연구에서 제외된다:
1. 다발신경병증, 장기비대, 내분비병증, 단클론 감마병증 및 피부 변화(POEMS: polyneuropathy, organomegaly, endocrinopathy, monoclonal gammopathy and skin changes) 증후군, 임상적 유의성이 불명확한 단클론 감마병증(monoclonal gammopathy of unknown significance), 무증상 골수종(smoldering myeloma), 고립성 형질세포종(solitary plasmacytoma), 아밀로이드증, 발덴스트룀 거대글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 또는 면역글로불린 M(IgM) 골수종이 있다.
2. NCI CTCAE 등급 >=3의 감각 또는 운동 신경병증이 있다.
3. CTM #4의 첫 번째 투여 전 다음 최소 간격 내에 다음 치료/절차 중 임의의 최종 투여를 받은 적이 있다:
·PI 및 IMiD을 포함한 골수종-특이 요법 - 14일.
·항-CD38 (a) 요법(MTD/RP2D가 정해지면, 항-CD38 요법을 받은 참가자에 대한 연구의 확장 단계(파트 2)에서 휴약 기간을 조정할 수 있음) - 90일.
·골수종에 대한 코르티코스테로이드 요법(Corticosteroid therapy) - 7일.
·국소 골 병변에 대한 방사선 요법 - 14일.
·대수술 - 30일.
·자가 조혈모세포 이식 - 90일.
·검사성 치료 - 30일.
4. 동종 조혈모세포 이식 또는 장기 이식을 받은 적이 있다.
5. 탈모증을 제외한 이전 골수종 치료 또는 절차(화학요법, 면역요법, 방사선 요법)에 대한 부작용으로부터 NCI CTCAE V5 등급 <=1 또는 기준선으로 회복되지 않았다.
6. MM의 중추신경계(CNS) 침범의 임상 징후가 있다.
7. 임의의 기관의 경쇄 아밀로이드증이 확신되거나 의심된다(아밀로이드증의 다른 징후 없이 골수 생검에서 아밀로이드의 존재가 용인됨).
8. 울혈성 심부전(NYHA(New York Heart Association)) 등급 >=II 또는 좌심실 박출률(LVEF(left ventricular ejection fraction) <40%, 심장 근육병증(cardiac myopathy), 활동성 허혈(active ischemia), 또는 지난 6개월 이내에 협심증 또는 심근 경색과 같은 기타 조절되지 않는 심장 상태, 항응고제를 포함한 치료가 필요한 임상적으로 유의한 부정맥 또는 임상적으로 유의한 조절되지 않는 고혈압이 있다.
9. 전신 요법이 필요한 만성 또는 활동성 감염과, 완전히 치유되지 않은 증상이 있는 바이러스 감염(예: 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 바이러스 B 또는 C형 간염)의 병력이 있다.
10. 임의의 단클론 항체 또는 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 요법으로 주입 후 전신 염증 반응 증후군(SIRS)/사이토카인 방출 증후군(CRS) 반응의 병력이 있다.
11. 프레드니손(prednisone) 또는 이에 상응하는 1일당 10밀리그램(mg/day) 초과의 용량으로 전신 코르티코스테로이드(systemic corticosteroid)를 사용해야 하는 만성 질환을 갖는다.
[00568] 본 발명의 일부 실시예가 예시의 방식으로 기재되었지만, 본 발명은, 본 발명의 사상을 벗어나거나 청구범위를 초과하지 않는 범위 내에서, 당업자의 범위 내에 있는 많은 변경, 변형 및 개조, 및 수많은 등가물 또는 대안 솔루션의 사용으로 실행될 수 있음이 명백할 것이다.
[00569] 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이, 전체를 참조로 포함하기 위해 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로, 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 국제특허출원 공개 WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, WO 2016/196344, WO 2017/019623, WO 2018/106895, 및 WO 2018/140427은 각각 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함된다. 미국 특허 출원 US2015/259428, US2016/17784, 및 US2017/143814의 발명은 각각 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 인용된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 대한 GenBank(National Center for Biotechnology Information, U.S.)로부터 전자적으로 이용가능한 모든 생물학적 서열 정보의 모든 발명은 각각 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
표 20: 서열
서열번호 텍스트 기재 생물학적 서열
SEQ ID NO:1 시가-유사 독소 1 서브유닛 A (SLT-1A) KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVARMASDEFPSMCPADGRVRGITHNKILWDSSTLGAILMRRTISS
SEQ ID NO:2 시가 독소 서브유닛 A (StxA) KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVARMASDEFPSMCPADGRVRGITHNKILWDSSTLGAILMRRTISS
SEQ ID NO:3 시가-유사 독소 2 서브유닛 A (SLT-2A) DEFTVDFSSQKSYVDSLNSIRSAISTPLGNISQGGVSVSVINHVLGGNYISLNVRGLDPYSERFNHLRLIMERNNLYVAGFINTETNIFYRFSDFSHISVPDVITVSMTTDSSYSSLQRIADLERTGMQIGRHSLVGSYLDLMEFRGRSMTRASSRAMLRFVTVIAEALRFRQIQRGFRPALSEASPLYTMTAQDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEEGVRIGRISFNSLSAILGSVAVILNCHSTGSYSVRSVSQKQKTECQIVGDRAAIKVNNVLWEANTIAALLNRKPQDLTEPNQ
SEQ ID NO:4 시가 독소 서브타입 2c 서브유닛 A (Stx2cA) 변이체 1 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:5 시가 독소 서브타입 2c 서브유닛 A (Stx2cA) 변이체 2 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFAHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:6 시가 독소 서브타입 2c 서브유닛 A (Stx2cA) 변이체 3 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDIYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:7 시가 독소 서브타입 2c 서브유닛 A (Stx2cA) 변이체 4 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPSVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:8 시가 독소 서브타입 2c 서브유닛 A (Stx2cA) 변이체 5 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYMAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPSVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:9 시가 독소 서브타입 2c 서브유닛 A (Stx2cA) 변이체 6 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQVLSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILSTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:10 시가 독소 서브타입 2d 서브유닛 A (Stx2dA) 변이체 1 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFAHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVIPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:11 시가 독소 서브타입 2d 서브유닛 A (Stx2dA) 변이체 2 REFMIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPEEVDLTLNWGRISNVLPEFRGEGGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:12 시가 독소 서브타입 2d 서브유닛 A (Stx2dA) 변이체 3 REFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTEISTPLEHISQGTTSVSVINHTPPGSYFAVDIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFTHISVPGVTTVSMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPGDVDLTLNWGRISNVIPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILSTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:13 시가 독소 서브타입 2e 서브유닛 A (Stx2eA) 변이체 1 QEFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTAISTPLEHISQGATSVSVINHTPPGSYISVGIRGLDVYQERFDHLRLIIERNNLYVAGFVNTTTNTFYRFSDFAHISLPGVTTISMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTRDASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRLALSETAPVYTMTPEDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEAGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:14 시가 독소 서브타입 2e 서브유닛 A (Stx2eA) 변이체 2 QEFTIDFSTQQSYVSSLNSIRTAISTPLEHISQGATSVSVINHTPPGSYISVGIRGLDVYQAHFDHLRLIIEQNNLYVAGFVNTATNTFYRFSDFAHISLPGVTTISMTTDSSYTTLQRVAALERSGMQISRHSLVSSYLALMEFSGNTMTREASRAVLRFVTVTAEALRFRQIQREFRQALSETAPVYTMTPEDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEDGVRVGRISFNNISAILGTVAVILNCHHQGARSVR
SEQ ID NO:15 시가 독소 서브타입 2f 서브유닛 A (Stx2fA) DEFTVDFSSQKSYVDSLNSIRSAISTPLGNISQGGVSVSVINHVPGGNYISLNVRGLDPYSERFNHLRLIMERNNLYVAGFINTETNTFYRFSDFSHISVPDVITVSMTTDSSYSSLQRIADLERTGMQIGRHSLVGSYLDLMEFRGRSMTRASSRAMLRFVTVIAEALRFRQIQRGFRPALSEASPLYTMTAQDVDLTLNWGRISNVLPEYRGEEGVRIGRISFNSLSAILGSVAVILNCHSTGSYSVR
SEQ ID NO:16 시가 독소 서브타입 c 서브유닛 A (Stx1cA) KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSVNAILGSVALILNCHHHASRVAR
SEQ ID NO:17 시가 독소 서브타입 d 서브유닛 A (Stx1dA) KEFTLDFSTAKKYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGTGDNLFAVDIMGLEPEEERFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTRAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSYSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSILPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASRVAR
SEQ ID NO:18 시가 독소 서브타입 e 서브유닛 A (Stx1eA) QDFTVDFSTAKKYVDSLNAIRSAIGTPLHSISSGGTSLLMIDNGTGDNLFAVDIRGLDPEEERFDNLRLIIERNNLYVTGFVNRTSNIFYRFADFSHVTFPGTRAVTLSGDSSYTTLQRVAGIGRTGMQINRHSLTTSYLDLMSYSGSSLTQPVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDVSGHSYTMTVEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGGVNAILGSVALILNCHHHTSRVSR
SEQ ID NO:19 패밀리 1경쇄 CDR1 SSNIGSNY
SEQ ID NO:20 패밀리 1경쇄 CDR2 GNS
SEQ ID NO:21 패밀리 1경쇄 CDR3 QSYDSSLSGSG
SEQ ID NO:22 Family 1heavy chain CDR1 GFTFSDYY
SEQ ID NO:23 패밀리 1중쇄 CDR2 ISGSGGST
SEQ ID NO:24 패밀리 1중쇄 CDR3 AREHSNYFYGMDV
SEQ ID NO:25 Family 2light chain CDR1 SSNIGGNY
SEQ ID NO:26 패밀리 2경쇄 CDR2 RNN
SEQ ID NO:27 패밀리 2경쇄 CDR3 QSYDSSLSVS
SEQ ID NO:28 Family 2heavy chain CDR1 GFTFSSYW
SEQ ID NO:29 패밀리 2중쇄 CDR2 ISGSGGGT
SEQ ID NO:30 패밀리 2중쇄 CDR3 AREGETSFGLDV
SEQ ID NO:31 패밀리 3경쇄 CDR1 TGAVTSGFY
SEQ ID NO:32 패밀리 3경쇄 CDR2 ATN
SEQ ID NO:33 패밀리 3경쇄 CDR3 LVYYDGAW
SEQ ID NO:34 패밀리 3중쇄 CDR1 GYSFTSYW
SEQ ID NO:35 패밀리 3중쇄 CDR2 IYPGDSDT
SEQ ID NO:36 패밀리 3중쇄 CDR3 ARGPSTGFWSGNYFDY
SEQ ID NO:37 경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSGVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:38 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREHSNYFYGMDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:39 경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSVSVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:40 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGETSFGLDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:41 경쇄 QTVVTQEPSLTVSPGETVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:42 중쇄 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:43 경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:44 중쇄 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:45 Shiga toxin effector polypeptide SLT-1A-DI AEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSATSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:46 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 SLT-1A-DI-1 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:47 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 SLT-1A-DI-2 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLALMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:48 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 SLT-1A-DI-3 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNAFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLALMSHSGTSLTQSAARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:49 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 SLT-1A-DI-4 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:50 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 SLT-1A-DI inactive AEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSATSLTQSVARAMLRFVTVTADALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:51 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 SLT-1A-DI-1 inactive KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTADALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:52 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 SLT-1A-DI-2 inactive KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLALMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTADALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:53 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 SLT-1A-DI-3 inactive KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNAFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLALMSHSGTSLTQSAARAMLRFVTVTADALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:54 시가 독소 이펙터 폴리펩티드 SLT-1A-DI-4 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTADALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:55 SLT-1A-콤보 변이체 1 KEFILRFSVAHKYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:56 SLT-1A-콤보 변이체 2 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDNLVPMVATVVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:57 SLT-1A-콤보 변이체 3 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSNLVPMVATVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:58 SLT-1A-콤보 변이체 4 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGILGFVFTLDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:59 SLT-1A-콤보 변이체 5 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVGILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:60 SLT-1A-콤보 변이체 6 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDILGFVFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:61 SLT-1A-콤보 변이체 7 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:62 SLT-1A-콤보 변이체 8 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVGILGFVFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:63 SLT-1A-콤보 변이체 9 KEFILDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDVRGIAPIEARFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSATSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLAALSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:64 SLT-1A-콤보 변이체 10 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVGILGFVFTLEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:65 SLT-1A-콤보 변이체 11 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVNLVPMVATVGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:66 SLT-1A-콤보 변이체 12 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTNLVPMVATVSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAA
SEQ ID NO:67 SLT-1A-콤보 변이체 13 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRGILGDVFTLSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAA
SEQ ID NO:68 SLT-1A-콤보 변이체 14 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHILRFSVAHKASAVAA
SEQ ID NO:69 SLT-1A-콤보 변이체 15 KEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHARNLVPMVATVASAVAA
SEQ ID NO:70 링커 1 EFPKPSTPPGSSGGAP
SEQ ID NO:71 링커 2 EFPKPSTPPGSSGGAPGILGFVFTL
SEQ ID NO:72 링커 3 GGGGSGG
SEQ ID NO:73 링커 4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:74 링커 5 GSTSGSGKPGSGEGS
SEQ ID NO:75 링커 6 GGGGS
SEQ ID NO:76 CD38-결합 단백질 #1 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSGVFGGGTKLTVLGGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREHSNYFYGMDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:77 CD38-결합 단백질 #2 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSVSVFGGGTKLTVLGGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGETSFGLDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:78 CD38-결합 단백질 #3 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSQTVVTQEPSLTVSPGETVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:79 CD38-결합 단백질 #4 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:80 CD38-결합 단백질 #5 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSNSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSDSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSRVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYDMTWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYYYGFSGPSMDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:81 CD38-결합 단백질 #6 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDNTLSGVIFGGGTKLTVLGGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMNWIRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEGPYYLYGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:82 CD38-결합 단백질 #7 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPQSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNSYVSWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSAWDDNLSVLFGGGTKLTVLGGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMTWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGLFHDSSGYYFGHWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO:83 CD38-표적화 참조 분자 1 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGIGDNLFAVDILGFDFTLGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSADSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGASYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNSHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSNPYTFGQGTKVEIKGGGGSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGRGLEWIGVMWRGGSTDYNAAFMSRLNITKDNSKNQVSLRLSSVTAADTAVYYCAKSMITTGFVMDSWGQGSLVTVSS
SEQ ID NO:84 CD38-표적화 대조군 분자 #1 MKEFTLDFSTAKTYVDSLNVIRSAIGTPLQTISSGGTSLLMIDSGSGDNLFAVDVRGIDPEEGRFNNLRLIVERNNLYVTGFVNRTNNVFYRFADFSHVTFPGTTAVTLSGDSSYTTLQRVAGISRTGMQINRHSLTTSYLDLMSHSGTSLTQSVARAMLRFVTVTAEALRFRQIQRGFRTTLDDLSGRSYVMTAEDVDLTLNWGRLSSVLPDYHGQDSVRVGRISFGSINAILGSVALILNCHHHASAVAAEFPKPSTPPGSSGGAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSNPYTFGQGTKVEIKGGGGSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGRGLEWIGVMWRGGSTDYNAAFMSRLNITKDNSKNQVSLRLSSVTAADTAVYYCAKSMITTGFVMDSWGQGSLVTVSS
SEQ ID NO:85 호모 사피엔스의 CD38 MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI
SEQ ID NO:86 호모 사피엔스의 CD38 세포 외 도메인 (ECD) VPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI
SEQ ID NO:87 필리핀 원숭이의 CD38 MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQVCLGVCLLVLLILVVVVAVVLPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI
SEQ ID NO:88 필리핀 원숭이의 CD38 세포 외 도메인 (ECD) LPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI
SEQ ID NO:101 VH 도메인 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGPSTGFWSGNYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:102 vhCDR1 GYSFTSYW
SEQ ID NO:103 vhCDR2 IYPGDSDT
SEQ ID NO:104 vhCDR3 ARGPSTGFWSGNYFDY
SEQ ID NO:105 VL 도메인 QTVVTQEPSLTVSPGETVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:106 vlCDR1 TGAVTSGFY
SEQ ID NO:107 vlCDR2 ATN
SEQ ID NO:108 vlCDR3 LVYYDGAW
SEQ ID NO:109 VH 도메인 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREHSNYFYGMDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:110 vhCDR1 GFTFSDYY
SEQ ID NO:111 vhCDR2 ISGSGGST
SEQ ID NO:112 vhCDR3 AREHSNYFYGMDV
SEQ ID NO:113 VL 도메인 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSGVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:114 vlCDR1 SSNIGSNY
SEQ ID NO:115 vlCDR2 GNS
SEQ ID NO:116 vlCDR3 QSYDSSLSGSG
SEQ ID NO:117 VH 도메인 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGETSFGLDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:118 vhCDR1 GFTFSSYW
SEQ ID NO:119 vhCDR2 ISGSGGGT
SEQ ID NO:120 vhCDR3 AREGETSFGLDV
SEQ ID NO:121 VL 도메인 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSVSVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:122 vlCDR1 SSNIGGNY
SEQ ID NO:123 vlCDR2 RNN
SEQ ID NO:124 vlCDR3 QSYDSSLSVS
SEQ ID NO:125 VL 도메인 QTVVTQEPSLTVSPGETVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYATNNKYSWTPARFSGSLLGDKAALTLSRVQPEDEADYYCLVYYDGAWVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO:126 VH 도메인 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGRGLEWIGVMWRGGSTDYNAAFMSRLNITKDNSKNQVSLRLSSVTAADTAVYYCAKSMITTGFVMDSWGQGSLVTVSS
SEQ ID NO:127 VL 도메인 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGKAPKLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYWSNPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:128 CD38 호모 사피엔스 MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI
SEQ ID NO:129 CD38 호모 사피엔스 세포 외 도메인(ECD) VPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI
SEQ ID NO:130 CD38 필리핀 원숭이 MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQVCLGVCLLVLLILVVVVAVVLPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI
SEQ ID NO:131 CD38 필리핀 원숭이 세포 외 도메인(ECD) LPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI
SEQUENCE LISTING <110> Molecular Templates, Inc. Millennium Pharmaceuticals, Inc. <120> CD38-BINDING PROTEINS COMPRISING DE-IMMUNIZED SHIGA TOXIN A SUBUNIT EFFECTORS <130> MTEM-009/01WO 333064-2024 <150> US 62/945,107 <151> 2019-12-06 <150> US 62/945,106 <151> 2019-12-06 <150> US 62/795,633 <151> 2019-01-23 <160> 233 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shiga-like toxin 1 Subunit A (SLT-1A) <400> 1 Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp Asn 35 40 45 Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60 Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80 Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95 His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140 His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190 Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205 Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile 210 215 220 Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu 225 230 235 240 Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255 Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His 260 265 270 Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg 275 280 285 Arg Thr Ile Ser Ser 290 <210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shiga toxin Subunit A (StxA) <400> 2 Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn 35 40 45 Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60 Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80 Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95 His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140 His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 180 185 190 Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser 195 200 205 Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile 210 215 220 Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu 225 230 235 240 Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu 245 250 255 Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His 260 265 270 Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg 275 280 285 Arg Thr Ile Ser Ser 290 <210> 3 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shiga-like toxin 2 Subunit A (SLT-2A) <400> 3 Asp Glu Phe Thr Val Asp Phe Ser Ser Gln Lys Ser Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Ser Ile Arg Ser Ala Ile Ser Thr Pro Leu Gly Asn Ile Ser 20 25 30 Gln Gly Gly Val Ser Val Ser Val Ile Asn His Val Leu Gly Gly Asn 35 40 45 Tyr Ile Ser Leu Asn Val Arg Gly Leu Asp Pro Tyr Ser Glu Arg Phe 50 55 60 Asn His Leu Arg Leu Ile Met Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Ala Gly 65 70 75 80 Phe Ile Asn Thr Glu Thr Asn Ile Phe Tyr Arg Phe Ser Asp Phe Ser 85 90 95 His Ile Ser Val Pro Asp Val Ile Thr Val Ser Met Thr Thr Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Ser Ser Leu Gln Arg Ile Ala Asp Leu Glu Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile 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<223> Shiga toxin subtype 2c Subunit A (Stx2cA) variant 5 <400> 11 Arg Glu Phe Thr Ile Asp Phe Ser Thr Gln Gln Ser Tyr Val Ser Ser 1 5 10 15 Leu Asn Ser Ile Arg Thr Glu Ile Ser Thr Pro Leu Glu His Ile Ser 20 25 30 Gln Gly Thr Thr Ser Val Ser Val Ile Asn His Thr Pro Pro Gly Ser 35 40 45 Tyr Phe Ala Val Asp Ile Arg Gly Leu Asp Val Tyr Gln Ala Arg Phe 50 55 60 Asp His Leu Arg Leu Ile Ile Glu Gln Asn Asn Leu Tyr Met Ala Gly 65 70 75 80 Phe Val Asn Thr Ala Thr Asn Thr Phe Tyr Arg Phe Ser Asp Phe Thr 85 90 95 His Ile Ser Val Pro Ser Val Thr Thr Val Ser Met Thr Thr Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Ala Leu Glu Arg Ser Gly Met 115 120 125 Gln Ile Ser Arg His Ser Leu Val Ser Ser Tyr Leu Ala Leu Met Glu 130 135 140 Phe Ser Gly Asn Thr Met Thr Arg Asp Ala Ser Arg Ala Val Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Glu Phe Arg Gln Ala Leu Ser Glu Thr Ala Pro Val Tyr Thr Met Thr 180 185 190 Pro Gly Asp Val Asp Leu Thr Leu 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<213> Artificial Sequence <220> <223> scFv linker <400> 194 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 195 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv linker <400> 195 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 196 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv linker <400> 196 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 197 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <400> 197 Ala Ser Gly Gly Pro Glu 1 5 <210> 198 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(6) <223> Up to 2 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(12) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(11) <223> Up to 2 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(17) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(16) <223> Up to 2 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(22) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(21) <223> Up to 2 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(26) <223> Up to 2 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(32) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(31) <223> Up to 2 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(37) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(36) <223> Up to 2 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(42) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(41) <223> Up to 2 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(47) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(46) <223> Up to 2 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(52) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(51) <223> Up to 2 residues may be absent <400> 198 Ala Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Ala Met 50 <210> 199 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(6) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(14) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(13) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(21) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(28) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(27) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(35) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(34) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE 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<222> (134)..(140) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (135)..(139) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (141)..(147) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (142)..(146) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (148)..(154) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (149)..(153) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (155)..(161) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (156)..(160) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (162)..(168) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (163)..(167) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (169)..(175) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (170)..(174) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (176)..(182) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (177)..(181) <223> Up to 5 residues may be absent <220> 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Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser 210 <210> 200 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(6) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(14) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(13) <223> Up to 5 residues may be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(21) <223> May be absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(20) <223> Up to 5 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Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser 35 40 45 Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser 65 70 75 80 Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser 85 90 95 Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly 100 105 110 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser 115 120 125 Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser 130 135 140 Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser 145 150 155 160 Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser 165 170 175 Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser 180 185 190 Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser 195 200 205 Ser Gly 210 <210> 201 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(30) <223> Up to 29 residues may be absent <400> 201 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 202 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <400> 202 Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser 1 5 10 <210> 203 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <400> 203 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe 1 5 10 <210> 204 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <400> 204 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly 1 5 10 <210> 205 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <400> 205 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 206 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <400> 206 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 207 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <400> 207 Ser Arg Ser Ser Gly 1 5 <210> 208 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <400> 208 Ser Gly Ser Ser Cys 1 5 <210> 209 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteinaceous linker <400> 209 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 210 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 210 Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Asp 1 5 <210> 211 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 211 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys 1 5 <210> 212 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 212 Ala Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Pro Ser Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 213 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 213 Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 214 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 214 Ser Asp Ser 1 <210> 215 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 215 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 216 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 216 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 217 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 217 Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile 1 5 <210> 218 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 218 Ala Thr Glu Gly Pro Tyr Tyr Leu Tyr Gly Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 219 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 219 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr 1 5 <210> 220 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 220 Gly Asn Ser 1 <210> 221 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 221 Gln Ser Tyr Asp Asn Thr Leu Ser Gly Val 1 5 10 <210> 222 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 222 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly 1 5 <210> 223 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 223 Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 224 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 224 Ala Arg Gly Gly Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Phe Gly His 1 5 10 15 <210> 225 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 225 Ser Ser Asn Ile Gly Asn Ser Tyr 1 5 <210> 226 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 226 Arg Asn Asn 1 <210> 227 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 227 Ser Ala Trp Asp Asp Asn Leu Ser Val 1 5 <210> 228 <211> 526 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38TM1 <400> 228 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ile Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Ile Leu Gly Phe Asp Phe Thr Leu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Ala Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Ala Val Ala Ala Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gln Ser Val Leu 260 265 270 Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile 275 280 285 Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr Trp 290 295 300 Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn 305 310 315 320 Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser 325 330 335 Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu 340 345 350 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Gly 355 360 365 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly 370 375 380 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 405 410 415 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 420 425 430 Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 435 440 445 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 450 455 460 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 465 470 475 480 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 485 490 495 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu His Ser Asn Tyr Phe Tyr Gly 500 505 510 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 515 520 525 <210> 229 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38TM2 <400> 229 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ile Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Ile Leu Gly Phe Asp Phe Thr Leu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Ala Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Ala Val Ala Ala Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gln Ser Val Leu 260 265 270 Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile 275 280 285 Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Tyr Val Tyr Trp 290 295 300 Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn 305 310 315 320 Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser 325 330 335 Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu 340 345 350 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Val Ser Val 355 360 365 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 385 390 395 400 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 405 410 415 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 420 425 430 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 435 440 445 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 450 455 460 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 465 470 475 480 Ala Arg Glu Gly Glu Thr Ser Phe Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly 485 490 495 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 500 <210> 230 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38TM3 <400> 230 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ile Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Ile Leu Gly Phe Asp Phe Thr Leu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Ala Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Ala Val Ala Ala Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gln Val Gln Leu 260 265 270 Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile 275 280 285 Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp 290 295 300 Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr 305 310 315 320 Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val 325 330 335 Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser 340 345 350 Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro 355 360 365 Ser Thr Gly Phe Trp Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 370 375 380 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val 385 390 395 400 Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu 405 410 415 Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Phe Tyr Pro Asn 420 425 430 Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Tyr Ala 435 440 445 Thr Asn Asn Lys Tyr Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu 450 455 460 Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Arg Val Gln Pro Glu Asp 465 470 475 480 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Val Tyr Tyr Asp Gly Ala Trp Val Phe 485 490 495 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 500 505 <210> 231 <211> 507 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38TM4 <400> 231 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ile Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Ile Leu Gly Phe Asp Phe Thr Leu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Ala Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Ala Val Ala Ala Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gln Val Gln Leu 260 265 270 Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile 275 280 285 Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp 290 295 300 Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr 305 310 315 320 Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val 325 330 335 Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser 340 345 350 Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro 355 360 365 Ser Thr Gly Phe Trp Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 370 375 380 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 385 390 395 400 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 405 410 415 Ile Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Phe Tyr Pro 420 425 430 Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Tyr 435 440 445 Ala Thr Asn Asn Lys Tyr Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 450 455 460 Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Arg Val Gln Pro Glu 465 470 475 480 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Val Tyr Tyr Asp Gly Ala Trp Val 485 490 495 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 500 505 <210> 232 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38TR1 <400> 232 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Cys His His His Ala Ser Ala Val Ala Ala Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Asp Ile Gln Met 260 265 270 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 275 280 285 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Thr Trp Tyr 290 295 300 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr 305 310 315 320 Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 325 330 335 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala 340 345 350 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln 355 360 365 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu 370 375 380 Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu 385 390 395 400 Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp 405 410 415 Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Met Trp 420 425 430 Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser Arg Leu Asn 435 440 445 Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Arg Leu Ser Ser 450 455 460 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser Met Ile 465 470 475 480 Thr Thr Gly Phe Val Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr 485 490 495 Val Ser Ser <210> 233 <211> 527 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38 binding protein monomer <400> 233 Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp 1 5 10 15 Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ile Gly Asp 35 40 45 Asn Leu Phe Ala Val Asp Ile Leu Gly Phe Asp Phe Thr Leu Gly Arg 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr 65 70 75 80 Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe 85 90 95 Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly 115 120 125 Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met 130 135 140 Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Ala Ser Tyr Val 180 185 190 Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser 195 200 205 Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg 210 215 220 Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile 225 230 235 240 Leu Asn Ser His His His Ala Ser Ala Val Ala Ala Glu Phe Pro Lys 245 250 255 Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gln Val Gln Leu 260 265 270 Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile 275 280 285 Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp 290 295 300 Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr 305 310 315 320 Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val 325 330 335 Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser 340 345 350 Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro 355 360 365 Ser Thr Gly Phe Trp Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 370 375 380 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 385 390 395 400 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 405 410 415 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 420 425 430 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser 435 440 445 Gly Phe Tyr Pro Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 450 455 460 Ala Leu Ile Tyr Ala Thr Asn Asn Lys Tyr Ser Trp Thr Pro Ala Arg 465 470 475 480 Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Arg 485 490 495 Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Val Tyr Tyr Asp 500 505 510 Gly Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 515 520 525

Claims (40)

  1. a) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드;
    b) 1) SEQ ID NO:34의 서열을 포함하는 vHCDR1;
    2) SEQ ID NO:35의 서열을 포함하는 vHCDR2; 및
    3) SEQ ID NO:36의 서열을 포함하는 vHCDR3;
    를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
    c) 1) SEQ ID NO:31의 서열을 포함하는 vLCDR1;
    2) SEQ ID NO:32의 서열을 포함하는 vLCDR2; 및
    3) SEQ ID NO:33의 서열을 포함하는 vLCDR3;
    를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD38-결합 단백질은 SEQ ID NO:79의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 VL은 SEQ ID NO:43의 서열을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 VL은 SEQ ID NO:43의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아미노산 동일성(amino acid identity)을 갖는 서열을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 VL은 SEQ ID NO:41의 서열을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 VL은 SEQ ID NO:41의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  7. a) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드;
    b) 1) SEQ ID NO:22의 서열을 포함하는 vHCDR1;
    2) SEQ ID NO:23의 서열을 포함하는 vHCDR2; 및
    3) SEQ ID NO:24의 서열을 포함하는 vHCDR3;
    를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
    c) 1) SEQ ID NO:19의 서열을 포함하는 vLCDR1;
    2) SEQ ID NO:20의 서열을 포함하는 vLCDR2; 및
    3) SEQ ID NO:21의 서열을 포함하는 vLCDR3;
    를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 VL은 SEQ ID NO:37의 서열을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:38의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 상기 VL은 SEQ ID NO:37의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:37의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  10. a) 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드;
    b) 1) SEQ ID NO:28의 서열을 포함하는 vHCDR1;
    2) SEQ ID NO:29의 서열을 포함하는 vHCDR2; 및
    3) SEQ ID NO:30의 서열을 포함하는 vHCDR3;
    를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
    c) 1) SEQ ID NO:25의 서열을 포함하는 vLCDR1;
    2) SEQ ID NO:26의 서열을 포함하는 vLCDR2; 및
    3) SEQ ID NO:27의 서열을 포함하는 vLCDR3;
    를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 VL은 SEQ ID NO:39의 서열을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:40의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  12. 제10항에 있어서, 상기 VL은 SEQ ID NO:39의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:40의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드와 CD38-결합 도메인 사이에 제1 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 링커는 단백질성(proteinaceous) 링커인 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1 링커는 약 1 내지 약 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 제1 링커는 SEQ ID NO:70의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 제1 링커는 SEQ ID NO:70-75 중 어느 하나의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 VH와 VL 사이에 제2 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제2 링커는 서열 (Gly4Ser)n(SEQ ID NO:195)을 포함하고, 상기 n은 1, 2, 3, 4, 또는 5인 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 n은 1인 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은, 그의 N-말단에서 C-말단으로, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드-제1 링커-VH-제2 링커-VL을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은, 그의 N-말단에서 C-말단으로, 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드-제1 링커-VL-제2 링커-VH를 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  23. 제21항에 있어서, 상기 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드는 SEQ ID NO:46의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드는 SEQ ID NO:45-69 중 어느 하나의 서열, 또는 그에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  25. 제1항에 있어서, 상기 시가 독소 A 서브유닛 이펙터 폴리펩티드는 SEQ ID NO:46의 서열을 포함하고, 상기 VL은 SEQ ID NO:43의 서열을 포함하고, 그리고 상기 VH는 SEQ ID NO:44의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  26. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO:79의 서열에 대해 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 동종이량체(homodimer)인 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  28. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 2개의 동일한 폴리펩티드를 포함하고, 각각의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:79의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  29. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 2개의 동일한 폴리펩티드를 포함하고, 각각의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:79에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD38-결합 융합 단백질.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 CD38-결합 단백질 융합체를 인코딩(encoding)하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  31. 제30항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  32. 제31항의 발현 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  33. (i) 제2항의 CD38-결합 융합 단백질 및 (ii) 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 부형제(excipient)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 CD38-결합 융합 단백질의 적어도 약 90%는 동종이량체의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 CD38-결합 융합 단백질의 적어도 약 95%는 동종이량체의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 CD38-결합 융합 단백질의 제조 방법으로서, 상기 CD38-결합 융합 단백질이 발현되는 조건하에 제32항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 CD38-결합 융합 단백질을 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 CD38-결합 융합 단백질을 박테리아 단백질 L과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 단백질 L은 P. 마그누스(P. magnus)로부터 단리되거나 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 단백질 L은 수지에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 CD38-결합 융합 단백질 또는 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다발성 골수종의 치료 방법.


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